ES2864160T3 - Módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica monovalentes - Google Patents

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Jens Niewoehner
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Francesca Ros
Gang Xu
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Abstract

Un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica que comprende una molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica, opcionalmente un conector y exactamente un anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo, en el que el conector, si está presente, acopla la molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica al anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.

Description

DESCRIPCIÓN
Módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica monovalentes
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica que tiene una especificidad de unión que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica (RBHE) y que es monovalente con respecto a esta especificidad de unión y procedimientos de uso de esta construcción como lanzadera de la barrera hematoencefálica y en el tratamiento de trastornos neurológicos.
ANTECEDENTES
La penetración cerebral de fármacos para trastornos neurológicos tales como, por ejemplo, fármacos bioterápicos grandes o fármacos de moléculas pequeña que tienen una penetración cerebral baja, está estrictamente limitada por la barrera hematoencefálica (BHE) extensa e impermeable conjuntamente con el otro componente celular de la unidad neurovascular (UNV). Se han sometido a prueba muchas estrategias para superar este obstáculo y una es utilizar vías de transcitosis mediadas por receptores endógenos expresados en el endotelio capilar cerebral (receptor de la barrera hematoencefálica). Se han diseñado proteínas recombinantes tales como anticuerpos monoclonales o péptidos frente a estos receptores para posibilitar el suministro de bioterápicos mediado por receptores al cerebro. Sin embargo, las estrategias para maximizar la captación cerebral mientras se minimiza la clasificación errónea dentro de las células endoteliales cerebrales (BEC) y el grado de acumulación dentro de determinados orgánulos (especialmente los orgánulos que dan lugar a la degradación del bioterápico) en las BEC, permanecen sin explorar.
Los anticuerpos monoclonales y otros productos bioterápicos tienen un enorme potencial terapéutico para el tratamiento de patologías en el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, su vía hacia el cerebro se impide por la BHE. Estudios previos han ilustrado que un porcentaje muy pequeño (aproximadamente un 0,1 %) de una IgG inyectada en la circulación sanguínea puede penetrar en el compartimento del SNC (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164). Esto ciertamente limitará cualquier efecto farmacológico debido a la baja concentración dentro del SNC del anticuerpo.
Por lo tanto, existe la necesidad de sistemas de suministro de fármacos para trastornos neurológicos a través de la BHE para transportar los fármacos al cerebro eficazmente.
En el documento WO 2014/033074 se informa de una lanzadera de la barrera hematoencefálica.
El anticuerpo anti-transferrina 8D3 de ratón y la variante del dominio variable de la cadena ligera (VL) (L596V y L598I) del mismo se informa por Boado, R.J., et al. (Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258).
El documento WO 2008/022349 divulgó agentes para su suministro a través de la barrera hematoencefálica. El documento WO 2007/044323 divulgó proteínas de fusión para su suministro a través de la barrera hematoencefálica. El documento WO 2012/143379 divulgó un procedimiento y construcciones para el paso dependiente del pH de la barrera hematoencefálica.
Boado, R. et al. divulgaron el direccionamiento del fármaco de eritropoyetina a través de la barrera hematoencefálica de primates con un caballo de Troya molecular de IgG (J. Pharmacol. Exp. Therap. 333 (2010) 961-969. Boado, R., et al., divulgaron el direccionamiento selectivo de una sustancia farmacéutica receptora de señuelo de TNFR al cerebro de primates como una proteína de fusión de IgG específica de receptor (J. Biotechnol. 146 (2010) 84-91).
El documento WO 93/10819 divulgó el anticuerpo 128.1 anti-receptor de transferrina humano de ratón (para las secuencias de la región variable, véanse las SEQ ID NO: 11 y 12). El documento WO 2012/075037 divulgó el receptor anti-transferrina de baja afinidad y su uso para transferir scfv terapéuticos a través de la barrera hematoencefálica.
Boado, R.J. et al., divulgaron la genomanipulación y la expresión de un anticuerpo monoclonal del receptor de transferrina quimérico para su suministro a través de la barrera hematoencefálica en el ratón (Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258). Hust, M., et al., divulgaron un fragmento Fab monocatenario (scFab) (Biotechnol. 7 (2007) 14). Pardridge, W.M., divulgó el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (J. Cerebr. Blood Flow Metabol. 32 (2012) 1959-1972). Yu, Y.J., et al. divulgaron el desarrollo de anticuerpos terapéuticos para enfermedades neurodegenerativas (Neurotherapeut. 10 (2013) 459-472). SUMARIO
La invención se define por las reivindicaciones.
En el presente documento se divulga un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica que comprende una entidad efectora cerebral, un conector y una entidad de unión monovalente que se une a un receptor de la barrera hematoencefálica, en el que el conector acopla la entidad efectora a la entidad de unión monovalente, que se une al receptor de la barrera hematoencefálica, en el que la entidad de unión monovalente no comprende los dominios variables del anticuerpo anti-receptor de transferrina 8D3 (SEQ ID NO: 01 y SEQ ID NO: 02) o del anticuerpo anti­ receptor de transferrina variante 8D3v (SEQ ID NO: 01 y s Eq ID NO: 03).
El anticuerpo anti-receptor de transferrina 8D3 tiene un dominio variable de la cadena pesada con la siguiente secuencia de aminoácidos:
EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMMY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAM YYCAVPT
Sh y w d v wGQ GvSvtvSS
(SEQ ID NO: 01).
El anticuerpo anti-receptor de transferrina 8D3 tiene un dominio variable de la cadena ligera con la siguiente secuencia de aminoácidos:
DIQMTQSPAS L SASLE EIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK
(SEQ ID NO: 02).
El anticuerpo anti-receptor de transferrina variante 8D3v tiene el mismo dominio variable de la cadena pesada que el anticuerpo 8D3 y un dominio variable de la cadena ligera con los mutantes L104V y L106I que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG JSIWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYWTPWTFGG
gt kv e i k
(SEQ ID NO: 03).
Un aspecto de acuerdo con la invención es un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica que comprende una molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica, opcionalmente un conector y exactamente un anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo, en el que el conector, si está presente, acopla la molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica al anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad de unión monovalente que se une al receptor de la barrera hematoencefálica comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en un scFv, un Fv y un scFab.
En un modo de realización, el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina.
En un modo de realización, la entidad de unión monovalente se une específicamente al receptor de transferrina humano y al receptor de transferrina de macaco cangrejero.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad de unión monovalente que se une al receptor de la barrera hematoencefálica comprende un scFab dirigido al receptor de transferrina, más en particular, un scFab que se une específicamente a un epítopo en el receptor de transferrina comprendido dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 04, 05 o 06.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad efectora cerebral se selecciona del grupo que consiste en fármacos para trastornos neurológicos, factores neurotróficos, factores de crecimiento, enzimas, agentes citotóxicos, anticuerpos dirigidos a una diana cerebral, anticuerpos monoclonales dirigidos a una diana cerebral, péptidos dirigidos a una diana cerebral.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la diana cerebral se selecciona del grupo que consiste en p-secretasa 1, Ap (Abeta), factor de crecimiento epidérmico, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico, tau, tau fosforilada, tau(pS422) fosforilada, apolipoproteína E4, alfa sinucleína, fragmentos oligoméricos de alfa sinucleína, CD20, huntingtina, proteína priónica, cinasa 2 de repetición rica en leucina, parkina, presenilina 2, gamma secretasa, receptor de muerte 6, proteína precursora amiloidea, receptor de neurotrofina p75 y caspasa 6.
En un modo de realización particular del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad efectora cerebral es un polipéptido.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad de unión monovalente que se une al receptor hematoencefálico es un polipéptido y la entidad de unión monovalente se conjuga con el extremo C terminal de la entidad efectora cerebral directamente o bien por medio de un conector.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad efectora cerebral comprende un anticuerpo de longitud completa dirigido a una diana cerebral. En un modo de realización, el anticuerpo de longitud completa es una IgG.
En un modo de realización preferente del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la lanzadera de la barrera hematoencefálica comprende un anticuerpo IgG de longitud completa como entidad efectora cerebral, un conector y un scFab como entidad de unión monovalente que se une al receptor de la barrera hematoencefálica, en el que el scFab se conjuga con el extremo C terminal de la región Fc de una de las cadenas pesadas del anticuerpo IgG por medio del conector.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la primera cadena pesada del anticuerpo de la lanzadera de la barrera hematoencefálica dirigida a una diana cerebral comprende un primer módulo de dimerización y la segunda cadena pesada del anticuerpo de la lanzadera de la barrera hematoencefálica a una diana cerebral comprende un segundo módulo de dimerización que permite la heterodimerización de las dos cadenas pesadas.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, el primer módulo de dimerización de la primera cadena pesada del anticuerpo de la lanzadera de la barrera hematoencefálica dirigido a la diana cerebral comprende "botones" y el módulo de dimerización de la segunda cadena pesada del anticuerpo de la lanzadera de la barrera hematoencefálica dirigido a la diana cerebral comprende "ojales" de acuerdo con la estrategia de botón en ojal.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, el conector es un conector peptídico. En un modo de realización, el conector peptídico tiene una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 25 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico tiene una secuencia de aminoácidos con una longitud de 30 a 50 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico es (G4S)6G2 (SEQ ID NO: 07) o (G4S)4 (SEQ ID NO: 08).
Los siguientes tres modos de realización están dirigidos a un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica en el que la entidad efectora cerebral es un polipéptido con la condición de que la entidad efectora cerebral no sea un anticuerpo de longitud completa, en particular no una IgG de longitud completa.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad de unión monovalente que se une al receptor de la barrera hematoencefálica comprende una entidad de Ig CH2-CH3 y un scFab (que comprende un primer conector), que se une al receptor de la barrera hematoencefálica, en el que el scFab se acopla a un extremo C terminal de la entidad de Ig CH2-CH3 por un segundo conector.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la lanzadera de la barrera hematoencefálica comprende una entidad efectora cerebral, un conector, un dominio CH2-CH3 de Ig, un segundo conector y un scFab, que se une al receptor de la barrera hematoencefálica, en el que la entidad efectora cerebral se conjuga por un primer conector con un extremo N terminal del dominio CH2-CH3 de Ig y el scFab se conjuga con un extremo C terminal del dominio CH2-CH3 de Ig por un segundo conector.
En un modo de realización del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica, la entidad de Ig CH2-CH3 es una entidad de IgG CH2-CH3.
El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica como se describe en el presente documento se puede usar como un medicamento, en particular se puede usar para el tratamiento de un trastorno neurológico tal como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.
El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento se puede usar para transportar la entidad efectora cerebral a través de la barrera hematoencefálica.
En un modo de realización particular, la cadena pesada del anticuerpo IgG del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento conjugado en su extremo C terminal de la región Fc con el scFab como entidad de unión monovalente, que se une al receptor de la barrera hematoencefálica, tiene la siguiente estructura:
- cadena pesada de IgG,
- conector que conjuga el extremo C terminal de la región Fc de la cadena pesada de IgG con el extremo N terminal del dominio VL del scFab,
- dominio variable de la cadena ligera (VL) y dominio C-kappa de la cadena ligera del scFab,
- conector que conjuga el extremo C terminal del dominio C-kappa de la cadena ligera del scFab con el extremo N terminal del dominio VH del scFab,
- dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo scFab y dominio CH1 de la cadena pesada de IgG.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un polipéptido de fusión para transportar una entidad efectora cerebral a través de la barrera hematoencefálica que comprende una entidad de Ig CH2-CH3, un conector y un scFab que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica, en el que el scFab se conjuga con un extremo C terminal de la entidad de Ig CH2-CH3 por el conector, en el que scFab comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un polipéptido de fusión para transportar una entidad efectora cerebral a través de la barrera hematoencefálica que comprende una entidad de Ig CH2-CH3, un conector y un scFv que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica, en el que el scFv se conjuga con un extremo C terminal de la entidad de Ig CH2-CH3 por el conector, en el que scFv comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En un modo de realización, el polipéptido de fusión comprende además un conector en el extremo N terminal de la entidad de Ig CH2-CH3 para conjugar la entidad efectora cerebral con el extremo N terminal de la entidad de Ig CH2-CH3.
En un modo de realización del polipéptido de fusión, la entidad efectora cerebral se selecciona del grupo que consiste en fármacos para trastornos neurológicos, factores neurótrofos, factores de crecimiento, enzimas, agentes citotóxicos, fragmentos de anticuerpo o péptidos dirigidos a una diana cerebral seleccionada del grupo que consiste en scFv, Fv, scFab, Fab, F(ab')2.
En un modo de realización del polipéptido de fusión, el scFab o el scFv que se une específicamente al receptor de la barrera hematoencefálica se une específicamente al receptor de transferrina.
En un modo de realización del polipéptido de fusión, el conector es un conector peptídico. En un modo de realización, el conector peptídico tiene una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 15 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico tiene una longitud de 20 a 50 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico tiene la secuencia de aminoácidos (G4S)6G2, (SEQ ID NO: 07) o (G4S)4 (SEQ ID NO: 08).
En un modo de realización del polipéptido de fusión, la entidad de Ig CH2-CH3 es una entidad de IgG CH2-CH3.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un conjugado que comprende un polipéptido de fusión como se informa en el presente documento y una entidad efectora cerebral conjugada con un extremo N terminal de la entidad de Ig CH2-CH3 del polipéptido de fusión como se informa en el presente documento por medio de un conector.
En un modo de realización del conjugado, la entidad efectora cerebral es un factor neurotrófico y el conector que conjuga el factor neurotrófico con el extremo N terminal de la entidad de Ig CH2-CH3 es un conector peptídico.
Otros aspectos, como se informa en el presente documento, son una formulación farmacéutica que comprende el conjugado como se informa en el presente documento y un vehículo farmacéutico.
La entidad de unión monovalente que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica se puede conjugar con cualquier extremo de la cadena ligera o pesada del anticuerpo, directamente o bien por medio de un conector peptídico. En un modo de realización, la entidad de unión monovalente se conjuga con un extremo C terminal de la cadena pesada.
El extremo C de una cadena pesada de un anticuerpo puede ser un extremo C completo que termina con los residuos aminoacídicos PGK. El extremo C de la cadena pesada puede ser un extremo C acortado en el que se han retirado uno o dos de los residuos aminoacídicos C terminales. En un modo de realización, el extremo C de la cadena pesada es un extremo C acortado que termina con los residuos aminoacídicos PG.
La entidad de unión monovalente se puede conjugar con la cadena de anticuerpo respectiva directamente o bien por medio de un conector peptídico. En un modo de realización, el conector peptídico tiene la secuencia de aminoácidos GGSCGGGSGGGG SGCGGS (SEQ ID NO: 09).
La entidad de unión monovalente puede ser un fragmento scFv de anticuerpo. En un modo de realización, la entidad de unión monovalente es un scFv que comprende en orden de N a C terminal un dominio variable de la cadena ligeraun dominio constante de la cadena ligera-un conector peptídico-un dominio variable de la cadena pesada-el dominio constante de la cadena pesada 1.
En un modo de realización, la entidad de unión monovalente es un fragmento scFv de un anticuerpo anti-receptor de transferrina con un conector peptídico (G4S)6 (SEQ ID NO: 10).
En un modo de realización, el receptor de la barrera hematoencefálica es un receptor de la barrera hematoencefálica humano. En un modo de realización, el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina y el anticuerpo no inhibe la unión del receptor de transferrina a la transferrina. En un modo de realización, el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina humano.
En un modo de realización, el conector peptídico que conjuga la entidad de unión monovalente con la entidad efectora cerebral es una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 15 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico tiene una longitud de 18 a 25 aminoácidos.
En un modo de realización, la entidad efectora cerebral es un anticuerpo de longitud completa. En un modo de realización, la entidad efectora cerebral es un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 o IgG4.
En un modo de realización, la entidad de unión monovalente es un anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica o un fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo. En un modo de realización, el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica o fragmento del mismo no altera la unión del receptor de la barrera hematoencefálica a uno o más de sus ligandos naturales. En otro modo de realización, el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica se une específicamente al receptor de transferrina humano de tal manera que no inhibe la unión del receptor de transferrina humano a la transferrina humana.
En un modo de realización, el módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica es un efector silencioso.
En un modo de realización, la entidad efectora cerebral es un anticuerpo de longitud completa que comprende una región Fc, en el caso de que la región Fc sea de la subclase humana IgG1, la región Fc comprende las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), o en el caso de que la región Fc sea de la subclase humana IgG4, la región Fc comprende las mutaciones S228P, L235E y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
I. DEFINICIONES
Una "región estructural humana aceptadora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptadora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptadora de VL tiene una secuencia idéntica a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.
Un anticuerpo "de afinidad madurada" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, y y H, respectivamente.
Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión de C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (Cd C); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región de extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), NIH Publication 91-3242.
"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que se producen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, vols. 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3).
Las HVR en el presente documento incluyen
(a) los bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) las CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50­ 65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), publicación NIH 91-3242,);
(c) los contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y
(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48­ 56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha archivado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos de B. Se apreciará que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y se puede realizar para profilaxis o bien durante la evolución de la enfermedad clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera del anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt, T.J. etal., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
El término "barrera hematoencefálica" (BHE) indica la barrera fisiológica entre la circulación periférica y el cerebro y la médula espinal que está formada por uniones herméticas dentro de las membranas plasmáticas endoteliales capilares del cerebro, creando una barrera hermética que restringe el transporte de moléculas hacia el cerebro, incluso moléculas muy pequeñas tales como la urea (60 dalton). La BHE del cerebro, la barrera hematomedular de la médula espinal y la barrera hematorretiniana de la retina son barreras capilares contiguas del SNC, y se denominan conjuntamente en el presente documento barrera hematoencefálica o BHE. La BHE también engloba la barrera hematocefalorraquídea (plexo coroideo) donde la barrera está compuesta por ependimocitos en lugar de células endoteliales capilares.
El término "sistema nervioso central" (SNC) indica el complejo de tejidos nerviosos que controlan la función corporal e incluye el cerebro y la médula espinal.
El término "receptor de la barrera hematoencefálica" (RBHE) indica una proteína receptora extracelular enlazada a la membrana expresada en células endoteliales cerebrales que puede transportar moléculas a través de la BHE o usarse para transportar moléculas administradas exógenas. Los ejemplos de RBHE incluyen, pero no se limitan a, el receptor de transferrina (TfR), el receptor de insulina, el receptor del factor de crecimiento insulínico (IGF-R), los receptores de lipoproteínas de baja densidad que incluyen, sin limitación, la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1) y la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP8) y el factor de crecimiento similar al factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF). Un RBHE ejemplar es el receptor de transferrina (TfR).
El término "entidad efectora cerebral" indica una molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la BHE. La entidad efectora tiene típicamente una actividad terapéutica característica que se desea suministrar al cerebro. Las entidades efectoras incluyen fármacos para trastornos neurológicos y agentes citotóxicos tales como, por ejemplo, polipéptidos y anticuerpos, en particular, anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos dirigidos a una diana cerebral.
El término "entidad de unión monovalente" indica una molécula que se puede unir específicamente y en un modo de unión monovalente a un RBHE. El módulo lanzadera hematoencefálica y/o conjugado como se informa en el presente documento se caracterizan por la presencia de una única unidad de una entidad de unión monovalente, es decir, el módulo lanzadera hematoencefálica y/o conjugado de la presente invención comprenden exactamente una unidad de la entidad de unión monovalente. La entidad de unión monovalente incluye, pero no se limita a, polipéptidos, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo que incluyen fragmentos Fab, Fab', Fv, moléculas de anticuerpo monocatenario tales como, por ejemplo, Fab monocatenario, scFv. La entidad de unión monovalente puede ser, por ejemplo, una proteína de armazón genomanipulada usando tecnologías del estado de la técnica como la presentación en fagos o la inmunización. La entidad de unión monovalente también puede ser un polipéptido. En determinados modos de realización, la entidad de unión monovalente comprende un dominio CH2-CH3 de Ig y un Fab monocatenario (scFab) dirigido a un receptor de la barrera hematoencefálica. El scFab se acopla al extremo C terminal del dominio CH2-CH3 de Ig por un conector. En determinados modos de realización, el scFab se dirige al receptor de transferrina.
El término "modo de unión monovalente" indica una unión específica al RBHE donde la interacción entre la entidad de unión monovalente y el RBHE tiene lugar a través de un único epítopo. El modo de unión monovalente evita cualquier dimerización/multimerización del RBHE debido a un único punto de interacción de epítopo.
El modo de unión monovalente evita que se altere la distribución intracelular del RBHE.
El término "epítopo" indica cualquier determinante polipeptídico que se puede unir específicamente a un anticuerpo. En determinados modos de realización, los determinantes epitópicos incluyen agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales glucídicas, fosforilo o sulfonilo y, en determinados modos de realización, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo.
El "receptor de transferrina" (TfR) es una glucoproteína transmembranaria (con un peso molecular de aproximadamente 180.000 Da) que se compone de dos subunidades unidas por enlaces disulfuro (cada una con un peso molecular aparente de aproximadamente 90.000 Da) y está implicada en la captación de hierro en los vertebrados. En un modo de realización, el TfR en el presente documento es TfR humano que comprende la secuencia de aminoácidos como se informa en Schneider et al. (Nature 311 (1984) 675-678).
El término "trastorno neurológico" indica una enfermedad o trastorno que afecta al SNC y/o que tiene origen en el SNC. Los ejemplos de enfermedades o trastornos del SNC incluyen, pero no se limitan a, neuropatía, amiloidosis, cáncer, una enfermedad o trastorno ocular, infección vírica o microbiana, inflamación, isquemia, enfermedad neurodegenerativa, convulsiones, trastornos del comportamiento y una tesaurismosis lisosómica. Para los propósitos de la presente solicitud, se entenderá que el SNC incluye el ojo, que normalmente está separado del resto del cuerpo por la barrera hematorretiniana. Los ejemplos específicos de trastornos neurológicos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas (incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de cuerpos de Lewy, síndrome de pospoliomielitis, síndrome de Shy-Draeger, atrofia olivopontocerebelosa, enfermedad de Parkinson, atrofia sistémica múltiple, degeneración estriatonígrica, tauopatías (incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear), enfermedades priónicas (incluyendo, pero sin limitarse a, encefalopatía espongiforme bovina, encefalopatía espongiforme ovina, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, kuru, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad consuntiva crónica e insomnio familiar letal), parálisis bulbar, enfermedad de la motoneurona y trastornos heterodegenerativos del sistema nervioso (incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de Canavan, enfermedad de Huntington, lipofuscinosis ceroide neuronal, enfermedad de Alexander, síndrome de Tourette, síndrome del cabello acerado de Menkes, síndrome de Cockayne, síndrome de Halervorden-Spatz, enfermedad de Lafora, síndrome de Rett, degeneración hepatolenticular, síndrome de Lesch-Nyhan y síndrome de Unverricht-Lundborg), demencia (incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de Pick y ataxia espinocerebelosa), cáncer (por ejemplo, del SNC y/o el cerebro, incluyendo las metástasis cerebrales resultantes de cáncer en otras partes del cuerpo).
El término "fármaco para trastornos neurológicos" indica un fármaco o agente terapéutico que trata uno o más trastornos neurológicos. Los fármacos para trastornos neurológicos de la invención incluyen, pero no se limitan a, compuestos de molécula pequeña, anticuerpos, péptidos, proteínas, ligandos naturales de una o más dianas del SNC, versiones modificadas de ligandos naturales de una o más dianas del SNC, aptámeros, ácidos nucleicos inhibidores (es decir, ARN inhibidores pequeños (ARNip) y ARN de horquilla corta (ARNhc)), ribozimas y moléculas pequeñas o fragmentos activos de cualquiera de los anteriores. Se describen en el presente documento fármacos para trastornos neurológicos ejemplares e incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos, aptámeros, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos inhibidores y moléculas pequeñas y fragmentos activos de cualquiera de los anteriores que son por sí mismos o bien reconocen específicamente y/o actúan sobre (es decir, inhiben, activan o detectan) un antígeno o molécula diana del SNC tales como, pero sin limitarse a, proteína precursora amiloidea o partes de la misma, amiloide beta, betasecretasa, gamma-secretasa, tau, alfa-sinucleína, parkina, huntingtina, DR6, presenilina, ApoE, glioma u otros marcadores de cáncer del SNC y neurotrofinas. Ejemplos no limitantes de fármacos para trastornos neurológicos y los trastornos correspondientes en los que se pueden usar como tratamiento: factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), lesión cerebral crónica (neurogénesis), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), cáncer cerebral del anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico, anticuerpo de (EGFR), factor neural derivado de la línea celular glial (GDNF)-enfermedad de Parkinson, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)-esclerosis lateral amiotrófica, depresión, enzima lisosómica-tesaurismosis lisosómicas del cerebro, factor neurotrófico ciliar (CNTF)-esclerosis lateral amiotrófica, neuregulina-1-esquizofrenia, anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzumab)-metástasis cerebrales por cáncer HER2 positivo.
El término "agente para formación de imágenes" indica un compuesto que tiene una o más propiedades que permiten que su presencia y/o localización se detecte directa o indirectamente. Los ejemplos de dichos agentes para formación de imágenes incluyen proteínas y compuestos de molécula pequeña que incorporan una entidad marcada que permite la detección.
Los términos "antígeno del SNC" y "diana cerebral" indican un antígeno y/o molécula expresada en el SNC, incluyendo el cerebro, que se puede seleccionar con un anticuerpo o molécula pequeña. Los ejemplos de dicho antígeno y/o molécula incluyen, sin limitación, beta-secretasa 1 (BACE1), amiloide beta (Abeta), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, CD20, huntingtina, proteína priónica (PrP), cinasa 2 de repetición rica en leucina (LRRK2), parkina, presenilina 1, presenilina 2, gamma-secretasa, receptor de muerte 6 (DR6), proteína precursora amiloidea (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) y caspasa 6. En un modo de realización, el antígeno es BACE1.
El término "que se une específicamente" indica un anticuerpo que se une selectiva o preferentemente a un antígeno. La afinidad de unión se determina, en general, usando un ensayo estándar, tal como análisis de Scatchard, o la técnica de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, usando BIACORE®).
El término "entidad de Ig CH2-CH3", como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad proteica derivada de los dominios CH2 o CH3 de inmunoglobulina. La "entidad de Ig CH2-CH3" comprende dos polipéptidos "CH2-CH3" que forman un dímero. La inmunoglobulina puede ser IgG, IgA, IgD, IgE o IgM. En un modo de realización, la entidad de Ig CH2-CH3 se derivaba de una inmunoglobulina IgG y se denomina en el presente documento "entidad de IgG CH2-CH3". El término incluye la secuencia natural de los dominios CH2-CH3 y los dominios CH2-CH3 variantes. En un modo de realización, la "entidad de Ig CH2-CH3" se deriva del dominio CH2-CH3 de IgG de la cadena pesada humana que se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región del dominio CH2-CH3 o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Un "conjugado" es una proteína de fusión de la presente invención conjugada con una o más moléculas heterólogas incluyendo, pero no limitada a, un marcador, fármaco para trastorno neurológico o agente citotóxico.
El término "conector" indica un conector químico o un conector peptídico monocatenario que conecta de forma covalente diferentes entidades del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica y/o el polipéptido de fusión y/o el conjugado como se informa en el presente documento. El conector conecta, por ejemplo, la entidad efectora cerebral a la entidad de unión monovalente. Por ejemplo, si la entidad de unión monovalente comprende una entidad de Ig CH2-CH3 y un scFab dirigido al receptor de la barrera hematoencefálica, entonces el conector conecta el scFab al extremo C terminal de la entidad de Ig CH3-CH2. El conector que conjuga la entidad efectora cerebral con la entidad de unión monovalente (primer conector) y el conector que conecta el scFab al extremo C terminal del dominio CH2-CH3 de Ig (segundo conector) puede ser el mismo o diferente.
Se pueden usar conectores peptídicos monocatenarios, que comprenden de desde uno a veinte residuos aminoacídicos unidos por enlaces peptídicos. En determinados modos de realización, los aminoácidos se seleccionan de los veinte aminoácidos naturales. En otros modos de realización determinados, uno o más de los aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En otros modos de realización, el conector es un conector químico. En determinados modos de realización, el conector es un conector peptídico monocatenario con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 25 residuos aminoacídicos, en un modo de realización preferente, con una longitud de 32 a 50 residuos aminoacídicos. En un modo de realización, el conector peptídico es un conector (GxS)n con G = glicina, S = serina, (x=3, n=8, 9 o 10) o (x=4 y n=6, 7 u 8), en un modo de realización, con x=4, n=6 o 7, en un modo de realización preferente, con x=4, n=7. En un modo de realización, el conector es (G4S)4 (SED ID NO: 08). En un modo de realización, el conector es (G4S)6G2 (SEQ ID NO: 07).
La conjugación se puede realizar usando una variedad de conectores químicos. Por ejemplo, la entidad de unión monovalente o el polipéptido de fusión y la entidad efectora cerebral se pueden conjugare usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de W-succinimidilo (SPDP), 4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-acido (tales como bis(p-acidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de la entidad efectora tras su suministro al cerebro. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, un conector de dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; documento US 5.208.020).
La conjugación covalente puede ser directa o bien por medio de un conector. En determinados modos de realización, la conjugación directa se realiza por construcción de una fusión polipeptídica (es decir, por fusión genética de los dos genes que codifican la entidad de unión monovalente hacia el RBHE y la entidad efectora y expresada como un único polipéptido (cadena)). En determinados modos de realización, la conjugación directa se realiza por formación de un enlace covalente entre un grupo reactivo en una de las dos partes de la entidad de unión monovalente frente al RBHE y un grupo correspondiente o aceptador en la entidad efectora cerebral. En determinados modos de realización, la conjugación directa se realiza por modificación (es decir, modificación genética) de una de las dos moléculas que se va a conjugar para incluir un grupo reactivo (como ejemplos no limitantes, un grupo sulfhidrilo o un grupo carboxilo) que forma una unión covalente con la otra molécula que se va a conjugar en las condiciones apropiadas. Como un ejemplo no limitante, una molécula (es decir, un aminoácido) con un grupo reactivo deseado (es decir, un residuo de cisteína) se puede introducir en, por ejemplo, la entidad de unión monovalente hacia el anticuerpo del RBHE y un enlace disulfuro formado con el fármaco neurológico. Los procedimientos para la conjugación covalente de los ácidos nucleicos con proteínas también son conocidos en la técnica (es decir, fotorreticulación, véase, por ejemplo, Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95). La conjugación también se puede realizar usando una variedad de conectores. Por ejemplo, una entidad de unión monovalente y una entidad efectora se pueden conjugar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-acido (tales como bis(pacidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). También se pueden usar conectores peptídicos, compuestos por de uno a veinte residuos aminoacídicos unidos por enlaces peptídicos. En dichos modos de realización determinados, los residuos aminoacídicos se seleccionan de los veinte aminoácidos naturales. En otros de dichos modos de realización determinados, uno o más de los residuos aminoacídicos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de la entidad efectora tras su suministro al cerebro. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, un conector de dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; documento US 5.208.020).
II. COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS
En un aspecto, la invención se basa, en parte, en el hallazgo de que los módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento se pueden usar para suministrar una entidad efectora cerebral a través de la barrera hematoencefálica hacia el cerebro. En determinados modos de realización, el módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica comprende una entidad de unión monovalente que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica, tal como el receptor de transferrina. Los módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de trastornos neurológicos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer concomitante con enfermedad de Parkinson.
A. Anticuerpos anti-receptor de la barrera hematoencefálica ejemplares
Las entidades de unión monovalentes que se unen específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica se pueden caracterizar con respecto a sus propiedades de unión y transcitosis:
- unión celular eficaz de células que expresan el RBHE como entidad de unión monovalente,
- transcitosis in vitro eficaz como entidad de unión monovalente,
- reactividad cruzada humano-macaco cangrejero (por ejemplo, en experimentos con BIAcore y FACS).
El cribado de transcitosis se realizó en un ensayo basado en hCMEC/D3. El ensayo se realizó en modo de pulso-caza. Las células endoteliales cerebrales hCMEC/D3 se incubaron con la entidad de unión monovalente durante 1 hora, después de esto se lavaron y se determinaron los siguientes parámetros 0 horas y 4 horas después del lavado:
i) cantidad de entidad de unión monovalente absorbida en las células durante la fase de carga,
ii) cantidad basolateral de entidad de unión monovalente 4 horas después de la carga y el lavado;
iii) cantidad apical de entidad de unión monovalente 4 horas después de la carga y el lavado;
iv) cantidad de entidad de unión monovalente en las células (por lisis celular) 0 horas y 4 horas después de la carga y el lavado;
v) cantidad total de entidad de unión monovalente 0 horas y 4 horas después de la carga y el lavado.
Para ser elegible como entidad de unión monovalente en un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento, la entidad de unión monovalente tiene que i) absorberse por las células hCMEC/D3 (endocitosis), ii) transportarse fuera de las células hCMEC/D3 (exocitosis), y iii) ser estable dentro de las células hCMEC/D3 (transporte bajo o nulo al endosoma para su degradación).
Por tanto, en un modo de realización, la entidad de unión monovalente se caracteriza en un ensayo basado en hCMEC/D3 por i) una captación (sustancial) en las células hCMEC/D3 durante un período de carga de una hora, ii) una liberación en el compartimento apical y/o basolateral después del período de carga y una etapa de lavado dentro de las 4 horas después del lavado, y iii) una tasa de degradación baja (intracelular).
En un modo de realización, la carga está a una concentración de aproximadamente 2,67 pg/ml de entidad de unión monovalente durante una hora.
Se ha descubierto que una entidad de unión monovalente para ser elegible como entidad de unión monovalente de un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento tiene que mostrar en el ensayo basado en hCMEC/D3 descrito anteriormente los siguientes valores umbrales:
i) una cantidad de entidad de unión monovalente absorbida en las células durante la fase de carga de 400 pg o más,
ii) cantidad basolateral de entidad de unión monovalente 4 horas después de la carga y el lavado de 100 pg o más, y
iii) cantidad apical de entidad de unión monovalente 4 horas después de la carga y el lavado de 150 pg o más.
El anticuerpo 128.1 anti-receptor de transferrina humano de ratón (para las secuencias de la región variable, véanse el documento WO 93/10819 y las SEQ ID NO: 11 y 12) se puede tomar como referencia. En este caso, la entidad de unión monovalente para ser elegible como entidad de unión monovalente de un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica como se informa en el presente documento tiene que mostrar en el ensayo basado en hCMEC/D3 descrito anteriormente los siguientes valores umbrales:
i) una cantidad de entidad de unión monovalente absorbida en las células durante la fase de carga de un 20 % o más de la carga del anticuerpo 128.1,
ii) cantidad basolateral de entidad de unión monovalente 4 horas después de la carga y el lavado de un 15 % o más de la cantidad basolateral de anticuerpo 128.1; y
iii) cantidad apical de entidad de unión monovalente 4 horas después de la carga y el lavado de un 15 % o más de la cantidad apical de anticuerpo 128.1.
El ensayo basado en hCMEC/D3 se realizó como sigue (este es un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento):
El medio y los complementos para hCMEC/D3 (véase el documento WO 2006/056879 y Weksler, B.B., et al., FASEB J. 19 (2005) 1872-1874) se pueden obtener de Lonza. Las células hCMEC/D3 (pases 26-29) se cultivan/se pueden cultivar hasta la confluencia en cubreobjetos recubiertos de colágeno (microscopía) o matraces en medio EBM2 que contiene FBS al 2,5 %, una cuarta parte de los factores de crecimiento suministrados y se complementaron completamente con hidrocortisona, gentamicina y ácido ascórbico suministrados.
Para todos los ensayos de transcitosis, se usan/se pueden usar insertos de filtro de membrana de PET (0,4 pm de tamaño de poro, 12 mm de diámetro) con alta densidad de poros (1 x 108 poros/cm2) en placas de cultivo celular de 12 pocillos. Los volúmenes de los medios se calculan para que sean 400 pl y 1600 pl para las cámaras apical y basolateral, respectivamente. Las cámaras apicales de los insertos de filtro se recubren/se pueden recubrir con colágeno I de cola de rata (7,5 pg/cm2) seguido de fibronectina (5 pg/ml), durando cada incubación 1 h a TA. Las células hCMEC/D3 se cultivan/se pueden cultivar hasta monocapas confluentes (~2 x 105 células/cm2) durante 10-12 días en medio EBM2. Los filtros vacíos se bloquean/se pueden bloquear en PBS que contiene BSA al 1 % durante 1 hora o durante la noche (o/n) antes del ensayo y a continuación, se calibran durante al menos 1 hora en EBM2 antes del ensayo.
El ensayo (para el esquema de ensayo, véase la figura 1) se realizó en medio EBM2 sin suero que, de otro modo, se reconstituyó como se describe en el presente documento. El día del ensayo, las células se privan de suero durante 60 min para agotar el ligando natural del receptor de la barrera hematoencefálica en cuestión. Los insertos de filtro con o sin (pero bloqueados durante la noche en medio completo) células se incubaron apicalmente con los anticuerpos monoclonales en cuestión (entidad de unión monovalente) durante 1 hora a 37 °C. Las monocapas se lavaron a temperatura ambiente (TA) en medio sin suero apicalmente (400 pl) y basolateralmente (1600 pl) tres veces durante 3-5 min, cada una. Se añadió medio precalentado a la cámara apical y los filtros se transfirieron a una placa nueva de 12 pocillos (bloqueada durante la noche con PBS que contenía BSA al 1 %) que contenía 1600 pl de medio precalentado. En este punto, los filtros con o sin células se lisaron en 500 pl de tampón RIP A para determinar la captación de anticuerpos específicos (entidad de unión monovalente). Los filtros restantes se incubaron a 37 °C o a 4 °C y se recogieron muestras en diversos puntos de tiempo para determinar la liberación apical y/o basolateral del anticuerpo (entidad de unión monovalente). El contenido de anticuerpo en las muestras se puede cuantificar usando un ELISA de IgG altamente sensible (véase el ejemplo 10). Para cada punto de tiempo, se deben generar los datos a partir de dos filtros vacíos y tres cultivos de células de filtro.
Los resultados para 69 anticuerpos anti-receptor de transferrina se muestran en la tabla a continuación. Se usó como referencia el anticuerpo 128.1.
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
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El anticuerpo 299 muestra una carga de transcitosis de 705 pg, de la que después de 4 horas se pueden encontrar 170 pg (= 24 % de carga) en el compartimento basolateral y 294 pg (= 42 % de carga) en el compartimento apical. El anticuerpo 494 muestra una carga de transcitosis de 3510 pg, de la que después de 4 horas se pueden encontrar 748 pg (= 21 % de carga) en el compartimento basolateral y 1503 pg (= 43 % de carga) en el compartimento apical. Los anticuerpos que cumplen los criterios como se explica anteriormente son modos de realización de la presente invención.
Por tanto, en el presente documento se informa de un anticuerpo anti-receptor de transferrina o fragmento de unión al receptor de transferrina del mismo que comprende
(1) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o
(2) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o
(3) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o
(4) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o
(5) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o
(6) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o
(7) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(8) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, o
(9) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, o
(10) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, o
(11) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, o
(12) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o
(13) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, o
(14) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, o
(15) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, o
(16) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o
(17) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(18) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(19) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, o
(20) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o
(21) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, o
(22) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o
(23) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, o
(24) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o
(25) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, o
(26) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, o
(27) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, o
(28) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, o
(29) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o
(30) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, o
(31) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, o
(32) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, o
(33) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, o
(34) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, o
(35) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, o
(36) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84, o
(37) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, o
(38) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, o
(39) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, o
(40) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92.
(41) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, o
(42) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, o
(43) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98.
En el presente documento se informa de un anticuerpo anti-receptor de transferrina o fragmento de unión al receptor de transferrina del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
Un aspecto preferente, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo anti-receptor de transferrina o fragmento de unión al receptor de transferrina del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92.
Las respectivas secuencias de aminoácidos se representan en la siguiente tabla.
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
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En el presente documento se informa de un anticuerpo anti-receptor de transferrina humanizado o fragmento de unión al receptor de transferrina del mismo que comprende
(1) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o
(2) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o
(3) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o
(4) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o
(5) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o
(6) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o
(7) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(8) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, o
(9) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, o
(10) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, o
(11) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, o
(12) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o
(13) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, o
(14) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, o
(15) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, o
(16) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o
(17) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(18) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(19) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, o
(20) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o
(21) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, o
(22) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o
(23) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, o
(24) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o
(25) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, o
(26) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, o
(27) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, o
(28) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, o
(29) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o
(30) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, o
(31) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, o
(32) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, o
(33) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, o
(34) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, o
(35) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, o
(36) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84, o
(37) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, o
(38) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, o
(39) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, o
(40) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92.
(41) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, o
(42) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, o
(43) un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98.
Un aspecto preferente, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo anti-receptor de transferrina humanizado o fragmento de unión al receptor de transferrina del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
En el presente documento se informa de un anticuerpo anti-receptor de transferrina humano humanizado que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En un modo de realización, el anticuerpo comprende además (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En el presente documento se informa de un anticuerpo anti-receptor de transferrina humano humanizado que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En un modo de realización, el anticuerpo comprende además (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En el presente documento se informa de un anticuerpo anti-receptor de transferrina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En el presente documento se informa de un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En un modo de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. En otro modo realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112, una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. En otro modo realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.
En el presente documento se informa de un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. En un modo realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En el presente documento se informa de un anticuerpo que comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y (iii) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 112; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En el presente documento se informa de un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 115.
Un aspecto preferente, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo anti-receptor de transferrina humanizado o fragmento de unión al receptor de transferrina del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada humanizado derivado del dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 y un dominio variable de la cadena ligera humanizado derivado del dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo anti-receptor de transferrina humano humanizado que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119. En un modo de realización, el anticuerpo comprende además (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo anti-receptor de transferrina humano humanizado que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119. En un modo de realización, el anticuerpo comprende además (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-receptor de transferrina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En un aspecto, el anticuerpo comprende al menos una, o al menos dos secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119. En un modo de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122. En otro modo realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 y una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118. En otro modo realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, o al menos dos secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122. En un modo realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En otro aspecto, el anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, o al menos dos secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, y (iii) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 119; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, o al menos dos secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
En otro aspecto, la invención proporciona un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica que comprende un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 122.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un módulo lanzadera de transferrina que comprende un anticuerpo IgG de longitud completa como entidad efectora cerebral, un conector y un scFab como entidad de unión monovalente, que se une al receptor de transferrina, en el que el scFab se conjuga con el extremo C terminal de la región Fc de una de las cadenas pesadas del anticuerpo IgG por medio del conector.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un módulo lanzadera de transferrina que comprende un anticuerpo IgG de longitud completa como entidad efectora cerebral, un conector y un scFv como entidad de unión monovalente, que se une al receptor de barrera de transferrina, en el que el scFv se conjuga con el extremo C terminal de la región Fc de una de las cadenas pesadas del anticuerpo IgG por medio del conector.
En un modo de realización preferente, la entidad de unión monovalente comprende las HVR de SEQ ID NO: 116, 117, 119, 120, 121 y 122.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-receptor de transferrina de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las Secciones 1-6 a continuación:
1. Afinidad de anticuerpos
En un aspecto, se mide Kd por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En un aspecto, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando a continuación el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (t W e EN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se hayan secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otro aspecto, se mide Kd usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial en BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con matrices CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un aspecto, se activan matrices de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de W-etil-W'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un modelo simple de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kd¡s/kas (véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Si la tasa de asociación excede l06 M'1 s_1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; véanse también los documentos WO 93/16185; US 5.571.894 y US 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo véase el documento US 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de un dominio único es un anticuerpo de un dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, el documento US 6.248.516).
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en el documento US 4.816.567; y en Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 81 (1984) 6851-6855. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o partes de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante humana. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR de un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen además, por ejemplo, en Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; los documentos US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 y US 7.087.409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describen el injerto en la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489­ 498 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68; y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Cárter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678­ 10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).
4. Anticuerpos derivados de colecciones
En el módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de la invención, los anticuerpos se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 y se describen además, por ejemplo, en McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. y Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; y Lee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de los genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para determinar los fagos de unión a antígeno como se describe en Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, a partir de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos de V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagosanticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: los documentos US 5.750.373 y US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 y US 2009/0002360.
5. Anticuerpos multiespecíficos
En determinados modos de realización, un anticuerpo empleado en el módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de la invención es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por el receptor de transferrina y la otra es por cualquier otro antígeno. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan el receptor de transferrina. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, el documento WO 93/08829 y Traunecker, A., et al., e Mb O J.
10 (1991) 3655-3659) y la genomanipulación "botón en ojal" (véase, por ejemplo, el documento US 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticular dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, el documento US4.676.980 y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y usando dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
Los anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de acción dual" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une al receptor de transferrina, así como a otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.
En un aspecto, como se informa en el presente documento, el anticuerpo anti-receptor de transferrina es un anticuerpo biespecífico.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí,
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.
En el anticuerpo en b)
dentro de la cadena ligera
el dominio variable de la cadena ligera VL se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH de dicho anticuerpo,
y
dentro de la cadena pesada
el dominio variable de la cadena pesada VH se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL de dicho anticuerpo.
En un aspecto
i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera en a) el aminoácido en la posición 124 (numeración de acuerdo con Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y en el que en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado negativamente,
o
ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 (numeración de acuerdo con Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado negativamente.
En un aspecto preferente
i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el que en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
o
ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada, los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CH1 de la segunda cadena ligera, los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto preferente, en el dominio constante CL de la primera cadena ligera, los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K, y en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada, los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada, los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K, y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena ligera, los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E, y en el dominio variable VL de la primera cadena ligera, el aminoácido en la posición 38 se sustituye por K, en el dominio variable VH de la primera cadena pesada, el aminoácido en la posición 39 se sustituye por E, en el dominio variable VL de la segunda cadena pesada, el aminoácido en la posición 38 se sustituye por K, y en el dominio variable VH de la segunda cadena ligera, el aminoácido en la posición 39 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí, y en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí,
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.
En el anticuerpo en b)
dentro de la cadena ligera
el dominio variable de la cadena ligera VL se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH de dicho anticuerpo, y el dominio constante de la cadena ligera CL se reemplaza por el dominio constante de la cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo;
y
dentro de la cadena pesada
el dominio variable de la cadena pesada VH se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL de dicho anticuerpo, y el dominio constante de la cadena pesada CH1 se reemplaza por el dominio constante de la cadena ligera CL de dicho anticuerpo.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí,
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.
En el anticuerpo en b)
dentro de la cadena ligera
el dominio constante de la cadena ligera CL se reemplaza por el dominio constante de la cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo;
y dentro de la cadena pesada
el dominio constante de la cadena pesada CH1 se reemplaza por el dominio constante de la cadena ligera CL de dicho anticuerpo.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo multiespecífico que comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo y dos cadenas ligeras del anticuerpo, y
b) uno, dos, tres o cuatro fragmentos Fab monocatenarios que se unen específicamente a de uno a cuatro antígenos adicionales (es decir, un segundo y/o tercer y/o cuarto y/o quinto antígeno, preferentemente que se unen específicamente a un antígeno adicional, es decir, un segundo antígeno),
en el que dichos fragmentos Fab monocatenarios en b) se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa en a) por medio de un conector peptídico en el extremo C o N de la cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo de longitud completa,
en el que el primer antígeno o uno de los antígenos adicionales es el receptor de transferrina humano.
En un aspecto, uno o dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de las cadenas pesadas o ligeras de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, uno o dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de las cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, uno o dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de las cadenas ligeras de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de cada cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de cada cadena pesada de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan con dicho anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de cada cadena ligera de dicho anticuerpo de longitud completa.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico trivalente que comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo y dos cadenas ligeras del anticuerpo,
b) un primer polipéptido que consiste en
ba) un dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo,
o
bb) un dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo y un dominio constante 1 (CH1) del anticuerpo,
en el que dicho primer polipéptido se fusiona con el extremo N de su dominio VH por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, c) un segundo polipéptido que consiste en
ca) un dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo,
o
cb) un dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) del anticuerpo,
en el que dicho segundo polipéptido se fusiona con el extremo N del dominio VL por medio de un conector peptídico al extremo C de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, y
en el que el dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo del primer polipéptido y el dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo del segundo polipéptido juntos forman un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno,
y
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
En un aspecto, el dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo del polipéptido en b) y el dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo del polipéptido en c) están enlazados y estabilizados por medio de un puente disulfuro intercatenario por la introducción de un enlace disulfuro entre las siguientes posiciones:
i) posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a posición 100 del dominio variable de la cadena ligera, o
ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o
iii) posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización se describen, por ejemplo, en el documento WO 94/029350, Rajagopal, V. et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H. et al., Nuclear Medicine & Biology, vol. 25, (1998) 387-393; o Schmidt, M. et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721. En un aspecto, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos en b) y c) está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera. En un aspecto, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos en b) y c) está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera. (numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) En un aspecto, es preferente un anticuerpo biespecífico trivalente sin dicha estabilización disulfuro opcional entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab monocatenarios.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, que comprende
a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera (modificada) y una segunda cadena pesada (modificada) de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y/o en el que los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, y c) en el que de uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales (es decir, a un tercer y/o cuarto antígeno) se fusionan por medio de un conector peptídico con el extremo C o N de las cadenas ligeras o cadenas pesadas de a) y/o b),
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno o uno de los antígenos adicionales es el receptor de transferrina humano.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.
En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) uno o dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos antígenos adicionales.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno se seleccionan del grupo de un fragmento scFv y un fragmento scFab. En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno son fragmentos scFv.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno son fragmentos scFab.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno se fusionan con el extremo C de las cadenas pesadas de a) y/o b). En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) uno o dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno adicional.
En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) dos péptidos de unión a antígeno idénticos que se unen específicamente a un tercer antígeno. En un aspecto preferente, dichos dos péptidos de unión a antígeno idénticos se fusionan ambos por medio del mismo conector peptídico con el extremo C de las cadenas pesadas de a) y b). En un aspecto preferente, los dos péptidos de unión a antígeno idénticos son un fragmento scFv o bien un fragmento scFab.
En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a un tercer y un cuarto antígeno. En un aspecto, dichos dos péptidos de unión a antígeno se fusionan por medio del mismo conector peptídico con el extremo C de las cadenas pesadas de a) y b). En un aspecto preferente, dichos dos péptidos de unión a antígeno son un fragmento scFv o bien un fragmento scFab.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo tetravalente biespecífico que comprende a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo, que se unen específicamente a un primer antígeno (y comprenden dos fragmentos Fab),
b) dos fragmentos Fab adicionales de un anticuerpo, que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico con los extremos C o N de las cadenas pesadas de a),
y
en el que en los fragmentos Fab se realizaron las siguientes modificaciones
i) en ambos fragmentos Fab de a), o en ambos fragmentos Fab de b), los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y/o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí,
o
ii) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí,
y
en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí,
o
iii) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí,
y
en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí,
o
iv) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí,
o
v) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí,
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
En un aspecto, dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico con los extremos C de las cadenas pesadas de a), o bien con los extremos N de las cadenas pesadas de a).
En un aspecto, dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico con los extremos C de las cadenas pesadas de a).
En un aspecto, dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico con los extremos N de las cadenas pesadas de a).
En un aspecto, en los fragmentos Fab se realizan las siguientes modificaciones:
i) en ambos fragmentos Fab de a), o en ambos fragmentos Fab de b), los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí,
y/o
los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
En un aspecto, en los fragmentos Fab se realizan las siguientes modificaciones:
i) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí,
y/o
los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
En un aspecto, en los fragmentos Fab se realizan las siguientes modificaciones:
i) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
En un aspecto, en los fragmentos Fab se realizan las siguientes modificaciones:
i) en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí,
y/o
los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
En un aspecto, en los fragmentos Fab se realizan las siguientes modificaciones:
i) en ambos fragmentos Fab de b) los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo tetravalente biespecífico que comprende:
a) una cadena pesada (modificada) de un primer anticuerpo, que se une específicamente a un primer antígeno y comprende un primer par de dominios VH-CH1, en el que con el extremo C de dicha cadena pesada se fusiona por medio de un conector peptídico el extremo N de un segundo par de dominios VH-CH1 de dicho primer anticuerpo,
b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo de a),
c) una cadena pesada (modificada) de un segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno y comprende un primer par de dominios VH-CL, en el que con el extremo C de dicha cadena pesada se fusiona por medio de un conector peptídico el extremo N de un segundo par de dominios VH-CL de dicho segundo anticuerpo, y
d) dos cadenas ligeras (modificadas) de dicho segundo anticuerpo de c), comprendiendo cada una un par de dominios CL-CH1,
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico que comprende
a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, y
b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el extremo N de la cadena pesada está conectado al extremo C de la cadena ligera por medio de un conector peptídico,
en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera son cadenas aisladas.
Un aspecto, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico que comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo y dos cadenas ligeras del anticuerpo, y
b) un fragmento Fv que se une específicamente a un segundo antígeno que comprende un dominio VH2 y un dominio VL2, en el que ambos dominios están conectados entre sí por medio de un puente disulfuro, en el que solo el dominio VH2 o bien el dominio VL2 se fusiona por medio de un conector peptídico con la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, en el que el primer antígeno o el segundo antígeno es el receptor de transferrina humano.
En el biespecífico, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras en a) son cadenas aisladas.
En un aspecto, el otro del dominio VH2 o el dominio VL2 no está fusionado por medio de un conector peptídico con la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno. En todos los aspectos como se informa en el presente documento, la primera cadena ligera comprende un dominio VL y un dominio CL y la primera cadena pesada comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.
En un aspecto de todos los aspectos, el anticuerpo, como se informa en el presente documento, es un anticuerpo multiespecífico que requiere la heterodimerización de al menos dos polipéptidos de la cadena pesada, y en el que el anticuerpo se une específicamente al receptor de transferrina humano y un segundo antígeno del receptor de transferrina no humano.
Se han descrito varios enfoques para modificaciones de CH3 para respaldar la heterodimerización, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291. Típicamente, en los enfoques conocidos en la técnica, el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada se genomanipulan de manera complementaria de modo que la cadena pesada que comprende un dominio CH3 genomanipulado ya no se pueda homodimerizar con otra cadena pesada de la misma estructura (por ejemplo, una primera cadena pesada con CH3 genomanipulado ya no se puede homodimerizar con otra primera cadena pesada con CH3 genomanipulado; y una segunda cadena pesada con CH3 genomanipulado ya no se puede homodimerizar con otra segunda cadena pesada con CH3 genomanipulado). De este modo, la cadena pesada que comprende un dominio CH3 genomanipulado se ve forzada a heterodimerizarse con otra cadena pesada que comprende el dominio CH3, que se genomanipula de manera complementaria. Para este modo de realización de la invención, el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada se genomanipulan de manera complementaria por sustituciones aminoacídicas, de modo que la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada se ven forzadas a heterodimerizarse, mientras que la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada ya no se pueden homodimerizar (por ejemplo, por motivos estéricos).
Los diferentes enfoques para respaldar la heterodimerización de cadenas pesadas conocidos en la técnica, que se citaron e incluyeron anteriormente, se contemplan como diferentes alternativas usadas en un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que comprende una "región Fab no cruzada" derivada de un primer anticuerpo, que se une específicamente a un primer antígeno, y una "región Fab cruzada" derivada de un segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno, en combinación con las sustituciones aminoacídicas particulares descritas anteriormente para la invención.
Los dominios CH3 del anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento se pueden alterar por la tecnología de "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, el documento WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; y Merchant, A.M. et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. En este procedimiento, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza además los heterodímeros (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e incrementa el rendimiento.
En un aspecto preferente, el anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). También se puede usar un puente disulfuro intercatenario adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por ejemplo, introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena de ojales". Por tanto, en otro aspecto preferente, el anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (formando la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación E356C o S354C adicional en el otro dominio CH3 un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Pero también se pueden usar de forma alternativa o adicionalmente otras tecnologías de botón en ojal, como se describe por el documento EP 1870459A1. En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, comprende las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357k en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" y, adicionalmente, las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice Eu de Kabat).
Además de la "tecnología de botón en ojal", son conocidas en la técnica otras técnicas para modificar los dominios CH3 de las cadenas pesadas de un anticuerpo multiespecífico para forzar la heterodimerización. Estas tecnologías, especialmente las descritas en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 y WO 2013/096291 se contemplan en el presente documento como alternativas a la "tecnología de botón en ojal" en combinación con un anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento.
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, el enfoque descrito en el documento EP 1870459 se usa para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de los dominios CH3/CH3 entre ambas cadenas pesadas, la primera y la segunda.
En consecuencia, este aspecto se refiere a un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo, el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que está localizada entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que está localizado dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, en el que del conjunto de aminoácidos que está localizado en la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye por un aminoácido cargado positivamente y del conjunto de aminoácidos que está localizado en la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye por un aminoácido cargado negativamente. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con este aspecto también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)" (en el que la abreviatura representa los aminoácidos con carga opuesta que se introdujeron en los respectivos dominios CH3).
En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-), como se informa en el presente documento, el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K, R y H, y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.
En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-), como se informa en el presente documento, el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K y R, y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.
En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-), como se informa en el presente documento, el aminoácido cargado positivamente es K, y el aminoácido cargado negativamente es E.
En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-), como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido R en la posición 409 se sustituye por D y el aminoácido K en la posición se sustituye por E, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 399 se sustituye por K y el aminoácido E en la posición 357 se sustituye por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, el enfoque descrito en el documento WO 2013/157953 se usa para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K y el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K y el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Adicionalmente, al menos una de las siguientes sustituciones está comprendida en el dominio CH3 de la otra cadena pesada: el aminoácido Y en la posición 349 se sustituye por E, el aminoácido Y en la posición 349 se sustituye por D y el aminoácido L en la posición 368 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el aminoácido L en la posición 368 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, el enfoque descrito en el documento WO 2012/058768 se usa para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por Y y el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por A y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) y 392 (originalmente K) se sustituye (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Las sustituciones preferentes son:
- sustitución del aminoácido T en la posición 411 por un aminoácido seleccionado de N, R, Q, K, D, E y W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
- sustitución del aminoácido D en la posición 399 por un aminoácido seleccionado de R, W, Y y K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
- sustitución del aminoácido S en la posición 400 por un aminoácido seleccionado de E, D, R y K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
- sustitución del aminoácido F en la posición 405 por un aminoácido seleccionado de I, M, T, S, V y W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat);
- sustitución del aminoácido N en la posición 390 por un aminoácido seleccionado de R, K y D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y
- sustitución del aminoácido K en la posición 392 por un aminoácido seleccionado de V, M, R, L, F y E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, (genomanipulado de acuerdo con el documento WO2012/058768), en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por Y y el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por V y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por A y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En dicho último aspecto mencionado anteriormente, en el dominio CH3 de dicha otra cadena pesada, el aminoácido K en la posición 392 se sustituye por E, el aminoácido T en la posición 411 se sustituye por E, el aminoácido D en la posición 399 se sustituye por R y el aminoácido S en la posición 400 se sustituye por R (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, el enfoque descrito en el documento WO 2011/143545 se usa para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, las modificaciones de aminoácidos en los dominios CH3 de ambas cadenas pesadas se introducen en las posiciones 368 y/o 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 se usa para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. El documento WO 2011/090762 se refiere a modificaciones de aminoácidos de acuerdo con la tecnología de "botón en ojal". En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH), como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por W, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH), como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por Y, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por T (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, que es de isotipo IgG2, se usa el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico.
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, se usa el enfoque descrito en el documento WO 2009/089004 para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K o N en la posición 392 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (en un aspecto preferente por E o D, en un aspecto preferente por D), y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 399, el aminoácido E o D en la posición 356 o el aminoácido E en la posición 357 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (en un aspecto preferente, K o R, en un aspecto preferente, por K, en un aspecto preferente, los aminoácidos en las posiciones 399 o 356 se sustituyen por K) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de la cadena pesada, el aminoácido K o R en la posición 409 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (en un aspecto preferente por E o D, en un aspecto preferente por D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Incluso en otro aspecto, además de o de forma alternativa a las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de la una cadena pesada, el aminoácido K en la posición 439 y/o el aminoácido K en la posición 370 se sustituyen, independientemente el uno del otro, por un aminoácido cargado negativamente (en un aspecto preferente, por E o D, en un aspecto preferente, por D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, se usa el enfoque descrito en el documento WO 2007/147901 para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto de dicho anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K en la posición 253 se sustituye por E, el aminoácido D en la posición 282 se sustituye por K y el aminoácido K en la posición 322 se sustituye por D, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 239 se sustituye por K, el aminoácido E en la posición 240 se sustituye por K y el aminoácido K en la posición 292 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto de un anticuerpo multiespecífico, como se informa en el presente documento, se usa el enfoque descrito en el documento WO 2007/110205 para respaldar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico.
En un aspecto, como se informa en el presente documento, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico. En un aspecto preferente, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico.
En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo bivalente o trivalente. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo bivalente.
En un aspecto, como se informa en el presente documento, el anticuerpo multiespecífico tiene una estructura de dominio constante de un anticuerpo de tipo IgG. En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG1 humana o de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A y L235A. En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG2 humana. En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG3 humana. En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG4 humana o de la subclase IgG4 humana con la mutación adicional S228P. En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG1 humana o de la subclase IgG4 humana. En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A y L235A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P y L235E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, el anticuerpo multiespecífico se caracteriza por que dicho anticuerpo multiespecífico es de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, comprende un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, comprende un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
6. Variantes de anticuerpo
En determinados aspectos, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a) Variantes de sustitución, inserción y deleción
En determinados aspectos, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. En la tabla 1 se muestran sustituciones conservadoras bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad o mejora en ADCC o CDC.
TABLA 1
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento de afinidad, reducción en inmunogenicidad) con respecto al anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpos. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad por la construcción y reselección de colecciones secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. En algunos aspectos de la maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular CDR-H3 y CDR-L3.
En determinados aspectos, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, en las HVR se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados aspectos de las secuencias de Vh y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se puede seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe en Cunningham, B.C. y Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. En este procedimiento se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.
b) Variantes de glucosilación
En determinados aspectos, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede conseguir convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que se une en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc (véase, por ejemplo, Wright, A. y Morrison, S.L., TIBTECH15 (1997) 26-32). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.
En un aspecto, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función ADCC. Véanse, por ejemplo, los documentos US2003/0157108; US2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; los documentos US 2003/0157108; y WO 2004/056312, en especial en el ejemplo 11) y líneas celulares con inactivación génica, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con inactivación génica (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; y el documento WO 2003/085107).
Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2003/011878; US 6.602.684; y US 2005/0123546.
También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.
c) Variantes de la región Fc
En determinados modos de realización, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por consiguiente, probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las principales células para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch, J.V. y Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en el documento US 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; y Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499­ 1502); el documento US 5.821.337 (véase Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivo (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y por consiguiente carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión de C1q y C3c en los documentos Wo 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). También se pueden realizar determinaciones de unión al FcRn y depuración/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
Los anticuerpos con una reducción en la función efectora incluyen aquellos con una sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (documento US 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con la sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (documento US 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o una disminución en la unión a los FcR. (Véanse, por ejemplo, los documentos US 6.737.056, WO 2004/056312 y Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591­ 6604).
En determinados aspectos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos).
En algunos aspectos, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión de C1q alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en los documentos US 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
Se describen anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) en el documento US 2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (documento US 7.371.826).
Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.
d) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína
En determinados aspectos, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En aspectos particulares, se producen los residuos sustituidos en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conectar-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados aspectos, se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en el documento US 7.521.541.
e) Derivados de anticuerpos
En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otro aspecto, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un aspecto, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
B. Procedimientos y composiciones recombinantes
Los anticuerpos se pueden producir usando composiciones y procedimientos recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-receptor de transferrina descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En otro aspecto, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En uno aspecto de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un aspecto, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un aspecto, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-receptor de transferrina, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-receptor de transferrina, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no son necesarias la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y además se puede purificar.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adaptan para el cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216­ 4220); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-receptor de transferrina proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayo de unión
En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, alphaLISA, inmunoelectrotransferencia, anticuerpo o matriz de fase inversa, etc.
En un ensayo ELISA o alphaLISA ejemplar, el receptor de transferrina en solución (sobrenadante celular, lisados de células o tejidos, líquidos corporales, etc.) se une por un anticuerpo de captura, que se une específicamente a un primer epítopo en el receptor de transferrina, o receptor de transferrina en una determinada conformación y un anticuerpo de detección acoplado a una entidad de detección, que se une específicamente a un segundo epítopo o conformación del receptor de transferrina. La lectura se basa en la entidad de detección (quimioluminiscencia, fluorescencia, luminiscencia inducida por transferencia de energía, etc.).
En el caso de matriz de anticuerpos, se colocan anticuerpos sobre chips de vidrio o nitrocelulosa. Se bloquean los portaobjetos y se incuban con una solución que contiene el receptor de transferrina, se lavan para retirar los anticuerpos no unidos y se detectan los anticuerpos unidos con un anticuerpo secundario correspondiente marcado con fluorescencia. Se mide la señal de fluorescencia con un escáner para portaobjetos de fluorescencia. De forma similar, para una matriz de fase inversa, el receptor de transferrina recombinante, el sobrenadante celular, los lisados de células o tejidos, los líquidos corporales, etc., se colocan sobre chips de vidrio o nitrocelulosa. Los portaobjetos se bloquean y se incuban las matrices individuales con un anticuerpo frente a un epítopo específico en el receptor de transferrina. Se separan por lavado los anticuerpos no unidos y se detectan los anticuerpos unidos con un anticuerpo secundario correspondiente marcado con fluorescencia. Se mide la señal de fluorescencia por un escáner para portaobjetos de fluorescencia (Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331).
D. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección
En determinados aspectos, cualquiera de los anticuerpos anti-receptor de transferrina proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de receptor de transferrina humano en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados aspectos, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como tejido cerebral.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-receptor de transferrina para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia del receptor de transferrina en una muestra biológica. En determinado aspecto, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-receptor de transferrina, como se describe en el presente documento, en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-receptor de transferrina al receptor de transferrina, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-receptor de transferrina y el receptor de transferrina. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un aspecto, se usa un anticuerpo anti-receptor de transferrina para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con un anticuerpo anti-receptor de transferrina, por ejemplo, donde el receptor de transferrina es un biomarcador para la selección de pacientes.
Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la divulgación incluyen neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro de tipo 1 (NBIA1), insuficiencia neuroautonómica pura, síndrome de Down, complejo de Guam y varios trastornos por cuerpos de Lewy, tales como enfermedad difusa por cuerpos de Lewy (EDCL), la variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (vEACL), determinadas formas de enfermedad de Gaucher y demencia de la enfermedad de Parkinson (DEP).
En determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos anti-receptor de transferrina marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
E. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-receptor de transferrina como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además, agentes de dispersión intersticial del fármaco tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en los documentos US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un aspecto, una sHASe Gp se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en el documento US 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en los documentos US 6.171.586 y WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando estas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
III. Artículos de fabricación
En otro aspecto de la divulgación se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-receptor de transferrina.
VI. EJEMPLOS
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Materiales y procedimientos
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Síntesis de genes y oligonucleótidos
Se prepararon los segmentos génicos deseados por síntesis química en Geneart GmbH (Ratisbona, Alemania). Los fragmentos génicos sintetizados se clonaron en un plásmido de E. coli para su propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de fragmentos génicos subclonados se verificaron por secuenciación de ADN. De forma alternativa, se ensamblaron fragmentos cortos de ADN sintético hibridando oligonucleótidos sintetizados químicamente o por medio de PCR. Los oligonucleótidos respectivos se prepararon por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).
Reactivos
Todos los productos químicos comerciales, anticuerpos y kits se usaron como se proporcionaron de acuerdo con el protocolo del fabricante, si no se indica de otro modo.
Ejemplo 1
Inmunización de conejos y ratones
Inmunización de ratones
Los ratones NMRI se inmunizaron genéticamente, usando un vector de expresión plasmídico que codifica TfR humano o de macaco cangrejero de longitud completa por aplicación intradérmica de 100 |jg de ADN vector, seguido de electroporación (2 pulsos cuadrados de 1000 V/cm, duración de 0,1 ms, intervalo de 0,125 s; seguido de 4 pulsos cuadrados de 287,5 V/cm, duración de 10 ms, intervalo de 0,125 s. Los ratones recibieron 6 o bien 7 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 42, 56, 70 y 84. La cuarta y sexta inmunizaciones se realizaron con el vector que codifica TfR de macaco cangrejero; el vector que codifica TfR humano se usó para todas las demás inmunizaciones. Se extrajo sangre los días 36, 78 y 92 y se preparó suero, que se usó para la determinación de valores por ELISA (véase a continuación). Se seleccionaron los animales con los valores más altos para el refuerzo al día 96, por inyección intravenosa de 106 células TF-1 humanas o bien 50 jg de TfR soluble humano recombinante que carece del dominio helicoidal (dominio extracelular del TfR humano que comienza en Leu122, que termina en Asn608, expresado en células HEK293F como una fusión N terminal con la región Fc humana y purificado por cromatografía de afinidad con proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño, y se aislaron los anticuerpos monoclonales por tecnología de hibridoma, en base a su capacidad para unirse al receptor de transferrina humano y de macaco cangrejero expresado en la superficie de células CHO-K1 transfectadas de forma estable (véase el ejemplo 4).
Inmunización de conejos
Se inmunizaron genéticamente conejos blancos de Nueva Zelanda o conejos transgénicos que expresaban un repertorio de anticuerpos humanizados, usando un vector de expresión plasmídico que codifica TfR humano o de macaco cangrejero de longitud completa, por aplicación intradérmica de 400 jg de ADN vector, seguido de electroporación (5 pulsos cuadrados de 750 V/cm, duración de 10 ms, intervalo de 1 s.). Los conejos recibieron 6 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 56, 84 y 112. La cuarta y sexta inmunizaciones se realizaron con el vector que codifica TfR de macaco cangrejero; el vector que codifica TfR humano se usó para todas las demás inmunizaciones. Se extrajo sangre (10 % de la volemia total estimada) los días 35, 63, 91 y 119. Se preparó suero, que se usó para la determinación de los valores por ELISA (véase a continuación), y se aislaron leucocitos monomorfonucleares periféricos, que se usaron como fuente de linfocitos B específicos de antígeno en el procedimiento de clonación con linfocitos B (véase el ejemplo 2).
Determinación de valores séricos (ELISA)
Se inmovilizó TfR soluble recombinante humano (R&D Systems n.° de cat. 2474-TR) en una placa NUNC Maxisorb de 96 pocillos a 3 jg/ml, 100 jl/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con CroteinC al 2 % en PBS, 200 jl/pocillo; aplicación de diluciones seriadas de antisueros, por duplicado, en CroteinC al 0,5 % en PBS, 100 jl/pocillo; detección con (1) anticuerpo de cabra antimurino conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000) para todos los sueros de ratón, (2) anticuerpo de burro anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000) para todos los sueros de conejo, (3) anticuerpo de conejo anti-IgG humana (Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000) solo para sueros de conejos transgénicos, (4) anticuerpo de cabra anti-kappa humano biotinilado (Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5 000) y estreptavidina-HRP solo para sueros de conejos transgénicos; diluido en CroteinC al 0,5 % en PBS, 100 jl/pocillo. Para todas las etapas, se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 jl/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 jl/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.
Ejemplo 2
Clonación de linfocitos B de conejos
Aislamiento de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de conejo
Se extrajeron muestras de sangre de, en resumen, 6 animales (2 conejos naturales (wt) y 4 conejos transgénicos (tg)). Estos conejos se derivaron de 2 campañas de inmunización diferentes: una primera campaña con 2 conejos wt y 2 tg y una segunda campaña con 2 conejos tg (véase también el ejemplo "Inmunización de conejos"). Se diluyó dos veces la sangre entera que contenía EDTA con 1x PBS (PAA, Pasching, Austria) antes de la centrifugación por densidad usando Lympholyte Mammal (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se lavaron los PBMC dos veces con 1x PBS.
Medio EL-4 B5
RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.), glutamina 2 mM, solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (PAA, Pasching, Austria), piruvato de sodio 2 mM, HEPES 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) y p-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escocia).
Disminución del número de células
Primera campaña de inmunización: Se usaron placas estériles de 6 pocillos (con calidad de cultivo celular) cubiertas con una monocapa confluente de células CHO para disminuir el número de macrófagos/monocitos a través de adhesión inespecífica, así como linfocitos de unión no específica.
Segunda campaña de inmunización: Se omitió la etapa de disminución usando pocillos cubiertos con células CHO, puesto que no se excluir que disminuyera el número de leucocitos B que producían anticuerpos que tienen reactividad cruzada con los anticuerpos del receptor de transferrina de hámster. Por lo tanto, se usaron placas de 6 pocillos estériles blancas (con calidad de cultivo celular) para disminuir el número de macrófagos y monocitos a través de adhesión inespecífica, lo que posibilitó que los linfocitos B potenciales que producían anticuerpos de superficie de reacción cruzada de hámster (y posiblemente de reacción cruzada de ratón) alcanzasen la siguiente etapa en el flujo de trabajo.
Para cada campaña de inmunización: cada pocillo se llenó como un máximo de 4 ml de medio y hasta 6x106 PBMC del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Se usaron las células en el sobrenadante (linfocitos en la sangre periférica (PBL)) para la etapa de fijación de antígeno.
Enriquecimiento de linfocitos B en el receptor de transferrina humano
Se sembraron placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos cubiertas con una monocapa de células CHO positivas para el receptor de transferrina humano con hasta 6x106 PBL por 4 ml de medio y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Se retiraron las células no adherentes por lavado cuidadoso de los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adherentes restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C en la incubadora. Se detuvo la tripsinización con medio EL-4 B5. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción de inmunofluorescencia.
Tinción con inmunofluorescencia y citometría de flujo
Se usó anti-IgG con FITC (AbD Serotec, Dusseldorf, Alemania) para la separación de células individuales. Para la tinción superficial, se incubaron las células de la etapa de disminución y enriquecimiento con el anticuerpo anti-IgG con FITC en PBS y se incubaron durante 45 min en la oscuridad a 4 °C. Después de la tinción, se lavaron dos veces las PBMC con PBS enfriado en hielo. Finalmente, se resuspendieron las PBMC en PBS helada y se sometieron de inmediato a los análisis FACS. Se añadió yoduro de propidio en una concentración de 5 pg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.) antes de los análisis FACS para distinguir entre células vivas y muertas.
Se usaron un Becton Dickinson FACSAria equipado con un ordenador y el programa informático FACSDiva (BD Biosciences, EE. UU.) para la separación de células individuales.
Cultivo de linfocitos B
El cultivo de los linfocitos B de conejo se preparó por un procedimiento similar al descrito por Zubler et al. (1985). En resumen, se incubaron linfocitos B de conejo separados individualmente en placas de 96 pocillos con 200 pl/pocillo de medio EL-4 B5 que contenía células Pansorbin (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % (carga TSN-M13 (10242), MicroCoat, Bemried, Alemania) y células de timoma EL-4-B5 murino irradiadas con rayos gamma (2,5 x 104/pocillo) durante 7 días a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 en la incubadora. Los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B se retiraron para su cribado y se recogieron de inmediato las células restantes y se congelaron a -80 °C en 100 pl de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).
Ejemplo 3
Presentación en fagos para la selección y producción de IgG anti-TfR monovalentes
Selección por presentación en fagos
La generación de anticuerpos que se unen a TfR humano y de macaco cangrejero se llevó a cabo por presentación en fagos usando protocolos estándar (Silacci et al, Proteomics, 5 (2005) 2340-2350). Se clonó un gen sintetizado para el antígeno hTfR-Fc(KiH)-Avi (KiH = botón en ojal, Avi = marca Avi) conectando el ECD de hTfR a la bisagra N terminal de una región Fc de ojal humana, que llevaba una marca Avi C terminal (SEQ ID NO: 99), y ligación en un vector de expresión de mamífero. Todo el presente vector de expresión de mamífero lleva un promotor MPSV para el inicio de la transcripción y la traducción, donde la transcripción se finaliza por una secuencia señal de poliA sintética localizada en dirección 3' del ORF. Además, el vector contiene una secuencia oriP de EBV para la replicación autónoma en líneas celulares que expresan EBV-EBNA. El ORF correcto se verificó por secuenciación. Este vector se usó para la expresión en células en suspensión HEK293 de EBNA, por coexpresión con una región Fc de botón vacía y la proteína BirA, y añadiendo 1 mM de biotina al medio de cultivo. La proteína biotinilada resultante se purificó por cromatografía de afinidad con proteína A, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. Se produjo el antígeno cyTfR-Fc(KiH)-Avi respectivamente (SEQ ID NO: 100).
La colección usada era una colección completamente sintética que usa regiones estructurales humanas de las familias 3, 4 y 5 del VH1, así como V-kappa1, -2 y -3, y V-lambda3. Los aminoácidos aleatorizados estaban en CDR-H3 y CDR-L3. Se generaron grupos de colecciones, usando cada VH de la cadena pesada conjuntamente con todas las colecciones de las cadenas ligeras diferentes. Las selecciones se llevaron a cabo en solución de acuerdo con el siguiente procedimiento: 1. unión de aprox. 1012 partículas de fagómidos de cada colección a TfR-avi-his biotinilados 100 nM durante 0,5 h en un volumen total de 1 ml, 2. captura de TfR-avi-his biotinilados y específicamente las partículas de fagos unidas por la adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min, 3. lavado de microesferas usando 5-10x 1 ml de PBS/Tween 20 y 5-10x 1 ml de PBS, 4. elución de las partículas de fagos por adición de 1 ml de TEA (trietilamina) 100 mM durante 10 min y neutralización por adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M, pH 7,4 y 5. Reinfección de bacterias TG1 de E. coli de crecimiento exponencial, infección con el fago cooperador VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de las partículas de fagómidos que se van a usar en rondas de selección posteriores. Las selecciones se llevaron a cabo en 3-5 rondas usando concentraciones de antígeno constantes o bien decrecientes (de 10'7 M a 2*10'9 M). En la ronda 2, se realizó la captura de los complejos antígeno-fago usando placas de neutravidina en lugar de microesferas de estreptavidina. Puesto que las proteínas de unión generadas frente el antígeno soluble recombinante a menudo solo mostraban una unión débil en las células, se introdujeron dos etapas de selección adicionales usando células que presentaban el antígeno natural después de la segunda o tercera ronda de enriquecimiento en el antígeno recombinante. Aquí, se usaron las dos líneas celulares TL-1 y NCI-H460 (ambas disponibles en ATCC). En resumen, se incubaron 1*106 células con aprox. 1012 partículas de fagos durante 1 h en hielo para evitar la internalización mediada por receptores. Se realizó el lavado por 5-10 etapas de centrifugación usando tampón PBST (PBS que contenía Tween-20 al 1 %). Se usaron células completas para infectar las bacterias TG1 para el rescate de fagos.
Las proteínas de unión específicas se identificaron por ELISA como sigue: Se recubrieron 100 pl de TfR-avi-his biotinilado 10 nM por pocillo sobre placas de neutravidina. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas FLAG usando un anticuerpo secundario anti-LAG/HRP. Los clones positivos en ELISA se expresaron de forma bacteriana como fragmentos Fab solubles en formato de 96 pocillos y los sobrenadantes se sometieron a un experimento de cribado cinético por análisis SPR usando ProteOn XPR36 (BioRad). Se identificaron los clones que expresan Fab con las constantes de afinidad más altas y se secuenciaron los fagómidos correspondientes.
Purificación de anticuerpos Fab
Las 10 células superiores se transfectaron individualmente con el plásmido fagómido de todos los clones positivos en ELISA celular. Las células se cultivaron en medios y se indujo la producción de anticuerpos Fab. Los anticuerpos Fab se aislaron por preparación periplásmica y se purificaron usando IMAC.
Análisis FACS
Se aplicaron anticuerpos Fab purificados a células TF-1 en diversas concentraciones. Los anticuerpos Fab unidos a células se detectaron usando un anticuerpo anti-Fab marcado con fluorescencia y se realizaron las mediciones por FACS. Se calcularon los valores de CE50.
Producción y caracterización de los clones seleccionados
Conversión al formato de IgG
Los clones seleccionados con una semivida (t1/2) del complejo entre 6 a 20 minutos o una CE50 en células entre 10 nM y 500 nM, con una señal de unión celular clara en FACS o bien ELISA celular, y de unión de reacción cruzada frente a tanto el antígeno hTfR-Fc(KiH)-Avi como al cyTfR-Fc(KiH)-Avi se eligieron para su conversión al formato de IgG.
Por lo tanto, el dominio VL se amplificó por PCR y se clonó en un vector de expresión de mamífero, como se describe anteriormente, directamente en dirección 5' de un dominio CL. Además, el dominio VH se amplificó por PCR y se clonó directamente en dirección 5' de un dominio CH-Fc. Se determinaron las secuencias de ambos vectores de expresión.
Producción de anticuerpos IgG
Se transfectaron células en suspensión HEK293 de EBNA con plásmidos que codifican tanto LC como HC y se cultivaron durante 7 días. El sobrenadante se depuró por filtración estéril. La concentración de IgG se determinó por cromatografía con proteína A.
Determinación de CE50 usando la tecnología TagLite
El gen del ECD de hTfR o cyTfR, respectivamente, incluyendo el dominio transmembranario, se fijó en dirección 3' a la marca SNAP en un vector de expresión de mamífero. Este vector se usó para transfectar las células en suspensión HEK293 de EBNA, lo que dio como resultado la presentación del TfR con una fusión de marca SNAP C terminal ((SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102). La marca SNa P se marcó específicamente con SNAP-Lumi4Tb (Cisbio). La eficacia de marcaje se determinó midiendo la emisión de terbio a 615 nm. Las células marcadas se almacenaron a -80 °C.
En presencia de anticuerpo IgG anti-Fc-d2 humano, se incubaron las células marcadas con sobrenadante de IgG en diversas diluciones y se midieron las señales FRET (emisión de tinte donante Lumi4Tb: 615 nM y tinte aceptador d2: 665 nM) después de 4 horas. Se calcularon los valores de CE50, lo que resultó en 25 IgG, que se unieron tanto a hTfR como a cyTfR.
Determinación de la unión celular por FACS
El gen de hTfR o cyTfR de longitud completa, respectivamente, se clonó en un vector de expresión de mamífero. Este vector se usó para la transfección de células en suspensión CHO de EBNA. Se aplicó directamente sobrenadante de IgG a las células que presentaban TfR. Después de lavar con PBST, se detectó el complejo antígeno-anticuerpo usando un conjugado de anticuerpo IgG-HRP anti-huFc, seguido de generación con 3,3'-5,5'-tetrametilbencidina. La presentación funcional se verificó usando un anticuerpo anti-TfR disponible comercialmente. Los 25 clones positivos TagLite presentaron una fuerte señal de unión.
Producción y purificación de moléculas similares a IgG monovalentes
El dominio VH se clonó en un vector de expresión de mamífero que codifica la HC de IgG1 botón humana, que lleva las mutaciones L234A, L235A y P329G. Este vector se usó para la expresión en células en suspensión HEK293 de EBNA, coexpresando la LC (vector descrito anteriormente) y un dominio de ojal-Fc vacío que lleva las mutaciones L234A, L235A, P329G, H435R e Y436F. La proteína resultante se purificó por cromatografía de afinidad con proteína A. En los casos de proteína monomérica fue >95 %, determinada por cromatografía de exclusión por tamaño analítica, la proteína además se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño.
Ejemplo 4
identificación de anticuerpos de unión a TfR humano y de macaco cangrejero por ELISA celular
Para cribar sobrenadantes de hibridoma de ratón o de linfocitos B de conejo para determinar anticuerpos que reconozcan TfR humano y de macaco cangrejero, se empleó un ELISA celular usando células CHO-K1 transfectadas de forma estable. Se obtuvieron transfectantes estables transfectando células CHO-K1 con plásmidos de expresión que contenían casetes de expresión para el TfR humano o de macaco cangrejero, así como para neomicinafosfotransferasa. Después de la transfección, las células se diluyeron en medio de cultivo que contenía 500 pg/ml de G418 (Life Technologies). Después de la aparición de clones en crecimiento, las células se desprendieron, se tiñeron con MEM-75 (Abeam) o 13E4 (Life Technologies) y anticuerpos secundarios marcados con PE para TfR humano o de macaco cangrejero, y las células altamente fluorescentes se separaron como células individuales en pocillos de placas de 96 pocillos (FACS Aria). Después de 7 días de crecimiento, se comprobó de nuevo la expresión de TfR en los clones y se seleccionaron los clones con la mejor expresión para los experimentos de ELISA celular.
En resumen, se sembraron 15.000 células por pocillo de una placa de 384 pocillos y se incubaron durante 18 h a 37 °C, 5 % de CO2. Se retiró el sobrenadante usando un lavador automático (BIOTEK) y se añadieron 30 pl de sobrenadante que contenía anticuerpos a cada pocillo, seguido de 24 pl de medio de crecimiento. Después de 2 horas de incubación, se vaciaron los pocillos y se añadieron 30 pl de glutaraldehído al 0,05 % en PBS durante 45 min a TA. Después de 3 lavados con PBS/Tween20 al 0,025 % (PBST), se añadieron 30 pl de anticuerpos anti-conejo-HRP o anti-ratón-HRP (Southern Biotech) diluidos 1:5000 en tampón de bloqueo y se incubaron las placas durante 1 hora a TA. Los pocillos se lavaron 6 veces con PBST y la señal se generó usando 30 pl de TMB por pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm.
Ejemplo 5
Clonación y expresión de anticuerpos anti-TfR
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Síntesis de genes y oligonucleótidos
Se prepararon los segmentos génicos deseados por síntesis química en Geneart GmbH (Ratisbona, Alemania). Los fragmentos génicos sintetizados se clonaron en un plásmido de E. coli para su propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de fragmentos génicos subclonados se verificaron por secuenciación de ADN. De forma alternativa, se ensamblaron fragmentos cortos de ADN sintético hibridando oligonucleótidos sintetizados químicamente o por medio de PCR. Los oligonucleótidos respectivos se prepararon por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).
Amplificación por PCR de dominios V
Se preparó ARN total a partir de lisado de linfocitos B (resuspendido en tampón RLT - Qiagen - n.° de cat. 79216) usando el kit de ARN NucleoSpin 8/96 (Macherey & Nagel; 740709.4, 740698) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se eluyó el ARN con 60 pl de agua sin RNasa. Se usaron 6 pl de ARN para generar ADNc por reacción con retrotranscriptasa usando SuperMix de síntesis de primera hebra Superscript III (Invitrogen 18080-400) y un cebador oligo-dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las etapas se realizaron en un sistema Hamilton ML Star. Se usaron 4 pl de ADNc para amplificar las regiones variables de la cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina (VH y VL) con AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040) en un volumen final de 50 pl usando los cebadores rbHC.up y rbHC.do para la cadena pesada, rbLC.up y rbLC.do para la cadena ligera de linfocitos B de conejo natural y BcpCR_FHLC_leader.fw y BcPCR_huCkappa.rev para la cadena ligera de linfocitos B de conejo transgénico (véase la tabla a continuación). Todos los cebadores directos eran específicos para el péptido señal (de VH y VL respectivamente) mientras que los cebadores inversos eran específicos para las regiones constantes (de VH y VL respectivamente). Las condiciones de PCR para RbVH+RbVL fueron como sigue: Arranque en caliente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 70 °C, 45 s a 68 °C, y una extensión final a 68 °C durante 7 min. Las condiciones de PCR para HuVL fueron como sigue: Arranque en caliente a 94 °C durante 5 min; 40 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 52 °C, 45 s a 68 °C, y una extensión final a 68 °C durante 7 min.
Figure imgf000054_0001
Se cargaron 8 pl de 50 pl de solución de PCR en un 48 E-Gel al 2 % (Invitrogen G8008-02). Las reacciones de PCR positivas se limpiaron usando el kit NucleoSpin Extract II (Macherey & Nagel; 740609250) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se eluyeron en 50 pl de tampón de elución. Todas las etapas de limpieza se realizaron en un sistema Hamilton ML Starlet.
Expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo
Para la expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo, los productos de PCR que codifican VH o VL se clonaron como ADNc en vectores de expresión por el procedimiento de clonación con salientes (RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Los vectores de expresión contenían un casete de expresión que consistía en un promotor de CMV en 5' que incluía el intrón A y una secuencia de poliadenilación de BGH en 3'. Además del casete de expresión, los plásmidos contenían un origen de replicación derivado de pUC18 y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina para la amplificación del plásmido en E. coli. Se usaron tres variantes del plásmido básico: un plásmido que contenía la región constante de IgG de conejo diseñado para aceptar las regiones VH mientras que dos plásmidos adicionales contenían la región constante LC kappa humana o de conejo para aceptar las regiones VL.
Los plásmidos de expresión linealizados que codifican la región constante kappa o gamma y los insertos VL/VH se amplificaron por PCR usando cebadores superpuestos.
Se incubaron productos de PCR purificados con ADN-polimerasa T4 que generaba salientes monocatenarios. Se detuvo la reacción por adición de dCTP.
En la siguiente etapa, se combinaron el plásmido y el inserto y se incubaron con recA, lo que indujo la recombinación específica de sitio. Los plásmidos recombinados se transformaron en E. coli. Al día siguiente, se recogieron las colonias cultivadas y se sometieron a prueba para determinar el plásmido recombinado correcto por preparación de plásmidos, análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Para la expresión de anticuerpos, se cotransfectaron de forma transitoria los plásmidos de HC y LC aislados en células HEK293 y se recogieron los sobrenadantes después de 1 semana.
Generación de vectores para la expresión de anticuerpos monovalentes monoclonales de conejo
Para la expresión recombinante de candidatos seleccionados como anticuerpos monovalentes monoclonales, las regiones constantes de conejo de todas las cadenas de VH se convirtieron en regiones constantes humanas que encierran la mutación de botón en el segmento CH3. Para las cadenas de VL derivadas de linfocitos B naturales de conejo, las regiones constantes kappa C de conejo se convirtieron en humanas. Se usaron 4 pl de ADNc de los candidatos seleccionados para amplificar las regiones variables de la cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina con AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040) en un volumen final de 50 pl con cebadores directos específicos para el péptido señal y cebadores inversos específicos para la región CDR3-J con (en el extremo 3') la secuencia de superposición (20 pb) homóloga a las regiones constantes humanas (respectivamente de VH y VL). Las condiciones de PCR para la amplificación de las cadenas de VH y VL fueron como sigue: Arranque en caliente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 68 °C, 45 s a 68 °C, y una extensión final a 68 °C durante 7 min.
Los productos de PCR que codifican VH o VL se clonaron como ADNc en vectores de expresión por el procedimiento de clonación con salientes (RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Los vectores de expresión contenían un casete de expresión que consistía en un promotor de CMV en 5' que incluía el intrón A y una secuencia de poliadenilación de BGH en 3'. Además del casete de expresión, los plásmidos contenían un origen de replicación derivado de pUC18 y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina para la amplificación del plásmido en E. coli. Se usaron dos variantes del plásmido básico: un plásmido que contenía la región constante de IgG humana diseñado para aceptar la nueva cadena de VH amplificada y un segundo plásmido que contenía la región constante kappa LC humana para aceptar la cadena de VL.
Los plásmidos de expresión linealizados que codifican la región constante kappa o gamma y los insertos VL/VH se amplificaron por PCR usando cebadores superpuestos.
Se incubaron productos de PCR purificados con ADN-polimerasa T4 que generaba salientes monocatenarios. Se detuvo la reacción por adición de dCTP.
En la siguiente etapa, se combinaron el plásmido y el inserto y se incubaron con recA, lo que indujo la recombinación específica de sitio. Los plásmidos recombinados se transformaron en E. coli. Al día siguiente, se recogieron las colonias cultivadas y se sometieron a prueba para determinar el plásmido recombinado correcto por preparación de plásmidos, análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Ejemplo 6
Expresión transitoria de los anticuerpos anti-TfR monovalentes
Los anticuerpos se generaron in vivo en células HEK293 transfectadas de forma transitoria (derivadas de la línea 293 de células de riñón embrionario humano) cultivadas en medio F17 (Invitrogen Corp.). Para la transfección se usó el reactivo de transfección "293-Free" (Novagen). Los anticuerpos y las moléculas modificadas basadas en anticuerpos, como se describe anteriormente, se expresaron a partir de plásmidos de expresión individuales. Las transfecciones se realizaron como se especifica en las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes de cultivos celulares que contenían proteína recombinante se recogieron de tres a siete días después de la transfección. Se almacenaron los sobrenadantes a temperatura reducida (por ejemplo, -80 °C) hasta su purificación.
La información general con respecto a la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas, por ejemplo, en células HEK293 se da en: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.
Ejemplo 7
Purificación de anticuerpos del receptor de transferrina de un brazo en alto rendimiento
Se cargaron los 50 ml de sobrenadantes depurados que contenían anticuerpos de un brazo en placas de 96 pocillos profundos en columnas MabSelectSuRe de 200 pl. Después de las etapas de lavado con PBS a pH 7,4, se eluyeron las proteínas con HCl 2,5 mM usando el sistema Tecan/Atoll dando como resultado 0,5 ml de eluato. El eluato se neutralizó con Tris 2 M, pH 8. Las proteínas purificadas se cuantificaron usando un espectrofotómetro Nanodrop y se analizaron por CE-SDS en condiciones de desnaturalización y reducción y SEC analítica. Para obtener proteína con alta pureza (>95 %), una gran proporción de los anticuerpos se debe purificar además con cromatografía de exclusión por tamaño para separar semianticuerpos, anticuerpos botón-botón y agregados superiores. En lo que sigue, se inyectaron 500 |jl de las muestras en Superdex200 10/300GL en histidina 20 mM que contenía NaCI 140 mM, pH 6,0 usando Dionex UltiMate 3000. Este procedimiento permite fraccionar 25-30 muestras/día y, por lo tanto, permite pulir una gran cantidad de resultados positivos de cribado en formato de un brazo. Las fracciones se agruparon y analizaron de nuevo como se describe anteriormente.
Ejemplo 8
Cultivo de células hCMEC/D3 para ensayos de transcitosis
El medio y los complementos para hCMEC/D3 (Weksler, B.B. et al., FASEB J. 19 (2005), 1872-1874) se obtuvieron de Lonza. Las células hCMEC/D3 (pases 26-29) se cultivaron hasta la confluencia en cubreobjetos recubiertos de colágeno (microscopía) o matraces en medio EBM2 que contenía FBS al 2,5 %, una cuarta parte de los factores de crecimiento suministrados y se complementaron completamente con hidrocortisona, gentamicina y ácido ascórbico suministrados.
Para todos los ensayos de transcitosis, se usaron insertos de filtro de membrana de PET (0,4 jM , 12 mm de diámetro) con alta densidad de poros (1x108 poros/cm2) en placas de cultivo celular de 12 pocillos. Los volúmenes óptimos de los medios se calcularon para que fueran 400 j l y 1600 j l para las cámaras apical y basolateral, respectivamente. Las cámaras apicales de los insertos de filtro se recubrieron con colágeno I de cola de rata (7,5 jg/cm 2) seguido de fibronectina (5 jg/ml), durando cada incubación 1 hora a TA. Las células hCMEC/D3 se cultivaron hasta monocapas confluentes (aprox. 2x105 células/cm2) durante 10-12 días en medio EMB2.
Ejemplo 9
Ensayo de transcitosis de anticuerpos monovalentes
El ensayo completo se realizó en medio EBM2 sin suero que de otro modo se reconstituyó como se describe en el ejemplo 1. Los insertos de filtro con células se incubaron apicalmente con anticuerpos monovalentes (concentración: 2,67 jg/m l) durante 1 hora a 37 °C, tras lo que se recogieron los medios completos apicales y basolaterales. A partir de estos valores, se calculó el flujo paracelular. Las monocapas se lavaron a TA en medio sin suero apicalmente (400 j l) y basolateralmente (1600 j l) 3 x 3-5 min, cada uno. Todos los lavados se recogieron para supervisar la eficacia de la retirada del anticuerpo no unido. Se añadió medio precalentado a la cámara apical y los filtros se transfirieron a una placa nueva de 12 pocillos (bloqueada durante la noche con PBS que contenía BSA al 1 %) que contenía 1600 j l de medio precalentado. En este punto, se lisaron las células en los filtros en 500 j l de tampón RIPA para determinar la captación de anticuerpos específicos. Los filtros restantes se incubaron a 37 °C y se recogieron muestras en diversos puntos de tiempo para determinar la liberación apical y/o basolateral del anticuerpo. El contenido de anticuerpo en las muestras se cuantificó usando un ELISA de IgG altamente sensible (véase el ejemplo 3). Para cada punto de tiempo, se generaron datos a partir de tres cultivos de células de filtro.
Ejemplo 10
ELISA de IgG sensible después del ensayo de transcitosis
El procedimiento completo se realizó a TA usando un lavador automático para las etapas de lavado. Se recubrió una placa de 384 pocillos con 30 jl/pocillo de 1 jg/m l de anticuerpos anti-IgG humana/de ratón, específico de Fcy en PBS durante 2 horas, seguido de 1 hora de incubación en tampón de bloqueo PBS que contenía BSA al 1 % o CroteínaC al 1 % para ensayos de IgG humana y de ratón, respectivamente). Se añadieron a la placa muestras diluidas seriadas del ensayo de transcitosis y las concentraciones estándar del anticuerpo usado en el ensayo de transcitosis y se incubaron durante 2 horas. Después de cuatro lavados, se añadieron 30 jl/pocillo de 50 ng/ml de anti-F(ab)2-biotina humano/de ratón en tampón de bloqueo y se incubó durante 2 horas adicionales. Después de 6 lavados, se añadieron 30 jl/pocillo de 50 ng/ml (ensayo de huIgG) o 100 ng/ml (ensayo de mIgG) de poli-HRP40-estreptavidina (Fitzgerald; en PBS que contenía BSA al 1 % y Tween-20 al 0,05 %) y se incubó durante 30 min. Después de 4 lavados, se detectaron los complejos inmunitarios por la adición de 30 jl/pocillo de sustrato de quimioluminiscencia BM (Roche). La señal de luminiscencia se midió usando un lector de placas de luminiscencia y la concentración se calculó usando la curva estándar ajustada. La sensibilidad del ensayo varió de 10 pg/ml a 10 ng/ml.
Ejemplo 11
Cartografía de epítopos por ELISA celular de células CHO transfectadas con mutantes de hTfR
Para poder determinar las regiones del epítopo en el receptor de transferrina humano (hTfR), se introdujeron mutaciones en la secuencia de hTfR en las posiciones donde una agrupación de aminoácidos expuestos a la superficie tenía diferentes aminoácidos en la secuencia de TfR de ratón alineada (véase la tabla a continuación), siguiendo el razonamiento de que a pesar de la importante homología entre el TfR humano y de ratón (77 % de identidad), no son conocidos anticuerpos dirigidos a la parte extracelular que muestren una buena reactividad cruzada entre ambos ortólogos. La clonación de plásmidos con las mutaciones correspondientes se describe anteriormente. Para cartografiar la unión de las proteínas de unión del TfR humano a esos epítopos, se transfectaron de forma transitoria células CHO-K1 con los plásmidos descritos y se midió la unión de anticuerpos en un ELISA celular. En resumen, se sembraron 104 células por pocillo de una placa de 96 pocillos el día antes del experimento en medio de crecimiento normal (RPMI/FCS al 10 %). Al otro día, se cambió el medio a medio de suero reducido OPTI-MEM (Gibco), y se añadieron a los pocillos 10 pl de una mezcla de 1200 pl de OPTI-MEM, 12 pg de ADN plasmídico y 12 pl de reactivo de transfección XtremeGENE (Roche) después de 30 minutos de preincubación. Las células se incubaron durante 2 días a 37 °C/7,5 % de CO2, a continuación, se retiró el medio y se añadieron los anticuerpos de TfR a concentraciones entre 1 nM y 100 nM en medio de crecimiento, seguido de 2 h de incubación a 4 °C. Posteriormente, se reemplazaron las soluciones de anticuerpos por glutaraldehído al 0,05 % en PBS y se fijaron las células durante 15 min a TA, a continuación, se lavó dos veces con PBS y se incubó con anticuerpo secundario anti-Fc humano conjugado con HRP (BioRad; 1:2000 en reactivo de bloqueo de ELISA (Roche)) durante 1,5 horas a TA. La señal se generó después de 3 lavados con PBS usando 50 pl de TMB por pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm.
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Ejemplo 12
Ensayo de unión basado en resonancia de plasmón superficial para la interacción TfR humano-anticuerpo
El experimento de unión se llevó a cabo en un BIAcore B4000 (GE Healthcare) equipado con chip sensor C1 (GE Healthcare, n.° de cat. BR1005-35) pretratado con anticuerpo anti-Fab humano (GE Healthcare, n.° de cat. 28-9583­ 25) usando un procedimiento químico de acoplamiento de aminas estándar de acuerdo con el manual del proveedor.
Para las mediciones cinéticas, la muestra de anticuerpo se inmovilizó aplicando un tiempo de contacto de 60 segundos y un caudal de 10 pl/min en solución salina de tampón fosfato, pH 7,4, Tween 20 al 0,05 % a 25 °C. Se aplicó receptor de transferrina humano recombinante marcado con His6 (R&D systems, n.° de cat. 2474-TR-050) en concentraciones crecientes y se supervisó la señal a lo largo del tiempo. Se registró un lapso de tiempo promedio de 150 segundos de tiempo de asociación y 600 segundos de tiempo de disociación a un caudal de 30 pl/min. Los datos se ajustaron usando un modelo de unión 1:1 (isoterma de Langmuir).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica que comprende una molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica, opcionalmente un conector y exactamente un anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo, en el que el conector, si está presente, acopla la molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica al anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122.
2. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti­ receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en un scFv, un Fv y un scFab.
3. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo se une específicamente al receptor de transferrina humano y al receptor de transferrina de macaco cangrejero.
4. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo comprende un scFab dirigido al receptor de transferrina.
5. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo comprende un scFv dirigido al receptor de transferrina.
6. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica se selecciona del grupo que consiste en fármacos para trastornos neurológicos, factores neurotróficos, factores de crecimiento, enzimas, agentes citotóxicos, anticuerpos dirigidos a una diana cerebral, anticuerpos monoclonales dirigidos a una diana cerebral, péptidos dirigidos a una diana cerebral.
7. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la diana cerebral se selecciona del grupo que consiste en P-secretasa 1, Ap (Abeta), factor de crecimiento epidérmico, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico, tau, tau fosforilada, tau(pS422) fosforilada, apolipoproteína E4, alfa sinucleína, fragmentos oligoméricos de alfa sinucleína, CD20, huntingtina, proteína priónica, cinasa 2 de repetición rica en leucina, parkina, presenilina 2, gamma secretasa, receptor de muerte 6, proteína precursora amiloidea, receptor de neurotrofina p75 y caspasa 6.
8. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo anti-receptor de la barrera hematoencefálica monovalente o fragmento de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del mismo se conjuga al extremo C terminal de la entidad efectora cerebral directamente o bien por medio de un conector.
9. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la molécula que se ha de transportar al cerebro a través de la barrera hematoencefálica comprende un anticuerpo de longitud completa dirigido a una diana cerebral.
10. Una formulación farmacéutica que comprende un módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso como medicamento.
12. El módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el medicamento es para el tratamiento de un trastorno neurológico.
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