JP2024500267A - 改善された細胞質侵入活性を有する抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、改善された細胞質侵入能を有する抗原結合分子（例えば、抗体）であって、軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3からなる群より選択される少なくとも1つにおいてアミノ酸置換を含む当該分子、またはその抗原結合断片（抗体断片）；ならびに、当該抗原結合分子を含む医薬組成物；当該抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法；当該抗原結合分子を用いて標的細胞特異的に細胞質抗原を除去、抑制、または活性化する方法；および当該抗原結合分子を含む、対象の疾患を診断、予防、または治療するための医薬組成物を提供する。

Description

本開示は、改善された細胞質侵入能を有する抗原結合分子（例えば、抗体）、ならびに軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3からなる群より選択される少なくとも1つにおいてアミノ酸変異を含む細胞質侵入抗原結合分子（例えば、抗体）、またはその抗原結合断片（抗体断片）；ならびに、当該抗原結合分子を含む医薬組成物；当該抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法；当該抗原結合分子を用いることによって標的細胞特異的に細胞質抗原を除去、抑制、または活性化する方法；および、当該抗原結合分子を含む、対象の疾患を診断、予防、または治療するための医薬組成物に関する。
抗体は高い親和性で特異的に抗原と結合するタンパク質である。低分子化合物からタンパク質まで様々な分子が抗原となることが知られている。モノクローナル抗体の作製技術が開発されて以降、抗体改変技術が発達し、特定の分子を認識する抗体の取得が容易となった。
抗体は、血漿中での安定性が高く副作用が少ないことから、医薬品として注目されている。抗体は、抗原に結合する作用、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用だけでなく、ADCC（Antibody Dependent Cytotoxicity：抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗体依存性細胞鈍食作用）、CDC（補体依存性細胞傷害活性）といったエフェクター細胞による細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。このような抗体の機能を利用して、癌、免疫疾患、慢性疾患、感染症等の医薬品が開発されている（Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223.（非特許文献１））。
一方、全長のIgG分子は分子量が約150kDaと大きく、一般には細胞透過性を示さないため、抗体医薬品の標的抗原は細胞膜上の抗原や細胞外抗原に限られている。そこで、細胞内で抗体または抗体フラグメントを発現させる intrabody や、細胞透過性ペプチド (cell penetrating peptide; CPP)を融合した抗体-CPP複合体、protein transfection法などが開発され、細胞内の抗原に対して抗体を作用させる技術として報告されている（MAbs. 2011 Jan-Feb;3(1):3-16. （非特許文献２））。
また、一部の天然の全長抗体が細胞内移行能を示すことが知られている。例えば、全身性エリテマトーデス (systemic lupus erythematosus; SLE)の患者やMRL-mpj/lpr lupusモデルマウスから同定された抗DNA自己抗体が、細胞内移行能を示すことも報告されている (Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12022.（非特許文献３）、Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt B):377-87.（非特許文献４）)。一部の抗DNA抗体は細胞質移行能だけでなく、DNAの加水分解活性やDNA修復阻害活性を有し、細胞障害活性を示す(WO2012135831（特許文献１）、Sci Rep. 2014 Aug 5;4:5958（非特許文献５）)。また、SLEのモデルマウスから単離されたエンドソームから細胞質へのエスケープ能を有する抗体をヒト化した後、活性型Rasに結合することができる重鎖可変領域と組み合わせた抗体も報告されている(WO2016013871A1（特許文献２）)。
WO2012/135831 WO2016/013871A1
Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223. MAbs. 2011 Jan-Feb;3(1):3-16. Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12022. Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt B):377-87. Sci Rep. 2014 Aug 5;4:5958
現在までに開発されているほとんどの抗体治療薬は、表面に露出した分子または分泌分子を標的とするだけであるため、細胞質分子を標的とすることができず、したがって、細胞膜を通して抗体を送達する方法の開発が必要とされている。非限定的な一態様において、本発明の目的は、効率的に標的細胞の細胞質に特異的に送達される抗原結合分子（例えば、抗体）、当該抗原結合分子を含む医薬組成物、当該抗原結合分子の使用方法、当該抗原結合分子の製造方法、および標的細胞の細胞質中に抗原結合分子を特異的に送達する方法、を提供することである。
本発明は、上述の必要性により導き出されており、改善された細胞質透過性を有する抗原結合分子（例えば、抗体）を提供し、当該抗原結合分子または抗体が細胞質への改善された透過性を有することを確認する。非限定的な一態様において、本発明は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、かつCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から、好ましくはCDRL1およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む軽鎖可変領域を含む、増強された細胞質侵入能または細胞質侵入活性を有する抗原結合分子（例えば、抗体）またはその断片に関する。
非限定的な一態様において、発明者らは、改善されたまたは増強された細胞質侵入能または細胞質侵入活性を有する一方で追加的に、(1)抗体発現レベル、(2)（インビボで半減期もしくは薬物動態を改善する）低減した細胞外マトリクス（ECM）結合プロファイル、および／または、(3)より低い凝集傾向によって示される良好な物理化学的特性、に関して優れた特性を有する、抗原結合分子（抗体）を特定した。
一局面において、本開示は以下を提供する。
[1] 配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む、細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片であって、該軽鎖可変領域が、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[2] 前記軽鎖可変領域が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～34位および89～97位に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、[1]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[3] 前記軽鎖可変領域が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～32位および93～97位に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、[2]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[4] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される、[3]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのA、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V、またはYでの置換；
(b) 25位のアミノ酸SのA、D、E、F、I、M、N、T、V、またはYでの置換；
(c) 26位のアミノ酸SのA、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T、またはVでの置換；
(d) 27位のアミノ酸QのA、D、E、F、H、I、L、M、S、またはYでの置換；
(e) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(f) 27b位のアミノ酸LのI、P、Q、T、またはVでの置換；
(g) 27c位のアミノ酸FのA、D、E、I、M、N、S、W、またはYでの置換；
(h) 27d位のアミノ酸NのA、D、E、F、H、N、またはQでの置換；
(i) 27e位のアミノ酸SのA、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V、またはYでの置換；
(j) 27f位のアミノ酸RのA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(k) 28位のアミノ酸TのE、H、I、Q、S、V、W、またはYでの置換；
(l) 29位のアミノ酸RのA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(m) 30位のアミノ酸KのA、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(n) 31位のアミノ酸NのD、M、S、またはTでの置換；
(o) 32位のアミノ酸YのD、E、G、H、またはQでの置換；
(p) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(q) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(r) 93位のアミノ酸YのI、L、M、N、P、Q、S、T、V、またはWでの置換；
(s) 94位のアミノ酸HのA、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(t) 95位のアミノ酸MのA、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(u) 96位のアミノ酸YのA、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T、またはVでの置換；および
(v) 97位のアミノ酸TのA、D、E、G、H、K、P、Q、R、S、またはVでの置換。
[4A] 前記軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3の各々が、[4](a)～(v)において定義される群から選択される2つ以上のアミノ酸置換を含む、[4]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[5] 前記アミノ酸置換が、該置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、抗体またはその断片の細胞質侵入活性を増強する、[1]～[4A]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[5A] 好ましくは参考実施例１に記載のSplit Nlucアッセイを用いて決定された場合に、前記置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、少なくとも1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、または500％、または1000％増強された細胞質侵入活性を示す、[1]～[5]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[5B] 前記細胞質侵入活性が、抗体もしくはその断片の細胞膜中への侵入、および／または、抗体もしくはその断片の細胞膜中への侵入後のエンドソーム脱出によって媒介される、[1]～[5A]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[5C] 参照抗体と比べて1つまたは複数の特性を示し、該1つまたは複数の特性が、以下からなる群より選択される、[1]～[5B]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
(a) 参照抗体と比べて増加した抗体発現レベル；
(b) 好ましくは参考実施例２に記載の方法によって決定された、参照抗体と比べて低減した細胞外マトリクス（ECM）に対する結合活性；および
(c) 好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）解析によって決定された、より高い単量体ピークパーセンテージによって示される、参照抗体と比べて改善された物理化学的特性。
[6] 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択される1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）を含む、[1]～[5C]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのNでの置換；
(b) 27位のアミノ酸QのEでの置換；
(c) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(d) 27d位のアミノ酸NのDまたはEでの置換；
(e) 27e位のアミノ酸SのDまたはEでの置換；
(f) 27f位のアミノ酸RのD、H、K、L、S、またはVでの置換；
(g) 28位のアミノ酸TのDでの置換；
(h) 29位のアミノ酸RのE、G、M、またはSでの置換；
(i) 30位のアミノ酸KのLまたはQでの置換；
(j) 32位のアミノ酸YのEでの置換；
(k) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(l) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(m) 93位のアミノ酸YのEでの置換；
(n) 94位のアミノ酸HのE、P、またはQでの置換；
(o) 95位のアミノ酸MのD、N、またはPでの置換；および
(p) 96位のアミノ酸YのEまたはPでの置換。
[6A] 前記軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3の各々が、[6](a)～(p)において定義される群から選択される2つ以上のアミノ酸置換を含む、[6]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[7] 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む、[6]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
(a) S27eD/R27fK；
(b) S27eD/R27fH；
(c) N27dE/S27eD；
(d) S27eD/T28D；
(e) S27eD/R29E；
(f) S27eD/R29S；
(g) K24N/S27eD；
(h) N27dD/R27fK；
(i) N27dE/R27fK；
(j) R27fK/T28D；
(k) R27fK/R29E；
(l) R27fK/R29S；
(m) K24N/R27fK；
(n) K24N/N27dD；
(o) N27dD/T28D；
(p) N27dD/R29E；
(q) N27dD/R29S；
(r) S27eD/Q89H；
(s) N27dD/Q89H；
(t) R27fK/Q89H；
(u) S27eD/Y91E；
(v) N27dD/Y91E；
(w) R27fK/Y91E；
(x) Q89H/H94P；
(y) Y91E/H94P；
(z) H94P/M95N；
(aa) H94P/M95D；
(bb) H94P/M95P；
(cc) H94E/Y96P；
(dd) H94E/M95N；
(ee) H94E/M95D；
(ff) H94E/M95P；
(gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；および
(ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
[8] 前記軽鎖可変領域が、ヒトフレームワーク領域（FR）を含む、[1]～[7]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[8A] 前記軽鎖可変領域が、Kabatナンバリングにしたがう、2位のアミノ酸I、および／または3位のアミノ酸Qを含む、[8]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[8B] 前記軽鎖可変領域が、ヒトVκ1 FR1配列を含む、[8]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[8C] 前記軽鎖可変領域が、ヒトVκ3 FR3配列を含む、[8]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[8D] 前記軽鎖可変領域が、ヒトVκ1 FR1、ヒトVκ1 FR2、およびヒトVκ3 FR3配列を含む、[8]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[8E] 前記軽鎖可変領域が、配列番号：１２３に含まれるFRドメイン（FR1、FR2、FR3、およびFR4）のうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む、[8]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[8F] 前記軽鎖可変領域が、CDRL2における1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換をさらに含む、[2]～[8E]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[9] 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択される1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）をさらに含む、[1]～[8F]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL2における
(a) 50位のアミノ酸WのA、G、I、T、またはVでの置換；
(b) 52位のアミノ酸SのFまたはIでの置換；
(c) 53位のアミノ酸TのNまたはYでの置換；および
(d) 54位のアミノ酸RのKまたはVでの置換。
[10] 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む、[9]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
配列番号：４のアミノ酸配列における
(a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；および
(m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
[11-1] 配列番号：１４～１５０および１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、[1]～[10]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[11-2] 配列番号：１２３～１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、[11-1]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[11-3] 配列番号：１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、[11-1]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[11A] FabまたはscFvの形態である、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[11B] 重鎖可変領域、任意で配列番号：１５８のアミノ酸を含む重鎖可変領域をさらに含む、[1]～[11A]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[11C] 多機能性抗体である、[1]～[11B]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[11D] 細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン、および細胞質侵入ドメインを含み、該細胞質侵入ドメインが、[1]～[11A]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域を含む、[11C]に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
[12] [1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
[13] [12]に記載の核酸を含む、ベクター。
[14] [12]に記載の核酸または[13]に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[15] [1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、a) [14]に記載の宿主細胞を、該抗体またはその断片の発現に好適な条件下で培養する工程、およびb) 該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
[16] [1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞質中への生理活性分子の送達のための、組成物または医薬組成物。
[17] 前記生理活性分子が、ペプチド、タンパク質、毒素、抗体、抗体断片、RNA、DNA、低分子薬物、ナノ粒子、およびリポソームからなる群より選択される少なくとも1つであり；該生理活性分子が、前記細胞質侵入抗体または抗原結合断片にコンジュゲートまたは融合されている、[16]に記載の組成物または医薬組成物。
[18] [1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片；および生理活性分子の、イムノコンジュゲート。
[19] 前記生理活性分子が、ペプチド、タンパク質、毒素、抗体、抗体断片、RNA、DNA、低分子薬物、ナノ粒子、およびリポソームからなる群より選択される、[18]に記載のイムノコンジュゲート。
[20] [1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体もしくはその抗原結合断片、または[18]もしくは[19]に記載のイムノコンジュゲートを、細胞膜を通して送達しかつそれを細胞質中に置く、方法。
[21] [1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を使用することによって、細胞質抗原を標的とするか、阻害するか、または活性化する方法であって、該抗体またはその断片が、該細胞質抗原に特異的に結合する、方法。
[21A] サンプル細胞中の細胞質抗原をイメージングするための方法であって、[1]～[11D]のいずれか1つに記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を該サンプル細胞と接触させることを含み、該抗体またはその断片が、標識され、かつ該細胞質抗原に特異的に結合する、方法。
[22] 以下を含む、細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を製造する方法：
(a) 配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、親細胞質侵入抗原結合分子を提供すること；
(b) 該親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を導入すること；ならびに
(c) 該親細胞質侵入抗原結合分子と比較して増強された細胞質侵入能を示す、該1つまたは複数のアミノ酸置換を含む細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を、特定および／または選択すること。
[22A] 親抗体と比べて1つまたは複数の特性を示す細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を特定および／または選択することをさらに含み、該1つまたは複数の特性が、以下からなる群より選択される、[22]に記載の方法：
(a) 増加した抗体発現レベル；
(b) 好ましくは参考実施例２に記載の方法によって決定された、低減した細胞外マトリクス（ECM）に対する結合活性；および
(c) 好ましくはサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）解析によって決定された、より高い単量体ピークパーセンテージによって示される、改善された物理化学的特性。
[23] 以下をさらに含む、[22]～[22A]のいずれか1つに記載の方法：
(d) [22]の方法によって製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子と、作動可能に連結された適切なプロモーターとを含む、発現ベクターを取得すること；
(e) 該ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養して、前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を生産させること；ならびに
(f) 宿主細胞培養物から、前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を回収すること。
[24] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～34位および89～97位に位置する、[22]～[23]のいずれか1つに記載の方法。
[25] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～32位および93～97位に位置する、[24]に記載の方法。
[26] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される、[22]～[25]のいずれか1つに記載の方法：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのA、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V、またはYでの置換；
(b) 25位のアミノ酸SのA、D、E、F、I、M、N、T、V、またはYでの置換；
(c) 26位のアミノ酸SのA、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T、またはVでの置換；
(d) 27位のアミノ酸QのA、D、E、F、H、I、L、M、S、またはYでの置換；
(e) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(f) 27b位のアミノ酸LのI、P、Q、T、またはVでの置換；
(g) 27c位のアミノ酸FのA、D、E、I、M、N、S、W、またはYでの置換；
(h) 27d位のアミノ酸NのA、D、E、F、H、N、またはQでの置換；
(i) 27e位のアミノ酸SのA、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V、またはYでの置換；
(j) 27f位のアミノ酸RのA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(k) 28位のアミノ酸TのE、H、I、Q、S、V、W、またはYでの置換；
(l) 29位のアミノ酸RのA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(m) 30位のアミノ酸KのA、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(n) 31位のアミノ酸NのD、M、S、またはTでの置換；
(o) 32位のアミノ酸YのD、E、G、H、またはQでの置換；
(p) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(q) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(r) 93位のアミノ酸YのI、L、M、N、P、Q、S、T、V、またはWでの置換；
(s) 94位のアミノ酸HのA、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(t) 95位のアミノ酸MのA、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(u) 96位のアミノ酸YのA、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T、またはVでの置換；および
(v) 97位のアミノ酸TのA、D、E、G、H、K、P、Q、R、S、またはVでの置換。
[26A] 前記軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3の各々が、[26](a)～(v)において定義される群から選択される2つ以上のアミノ酸置換を含む、[26]に記載の方法。
[27] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、該置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、前記抗体またはその断片の細胞質侵入活性を増強する、[22]～[26]のいずれか1つに記載の方法。
[28] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される、[22]～[27]のいずれか1つに記載の方法：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのNでの置換；
(b) 27位のアミノ酸QのEでの置換；
(c) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(d) 27d位のアミノ酸NのDまたはEでの置換；
(e) 27e位のアミノ酸SのDまたはEでの置換；
(f) 27f位のアミノ酸RのD、H、K、L、S、またはVでの置換；
(g) 28位のアミノ酸TのDでの置換；
(h) 29位のアミノ酸RのE、G、M、またはSでの置換；
(i) 30位のアミノ酸KのLまたはQでの置換；
(j) 32位のアミノ酸YのEでの置換；
(k) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(l) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(m) 93位のアミノ酸YのEでの置換；
(n) 94位のアミノ酸HのE、P、またはQでの置換；
(o) 95位のアミノ酸MのD、N、またはPでの置換；および
(p) 96位のアミノ酸YのEまたはPでの置換。
[28A] 前記軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3の各々が、[28](a)～(p)において定義される群から選択される2つ以上のアミノ酸置換を含む、[28]に記載の方法。
[29] 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む、[22]～[28]のいずれか1つに記載の方法：
(a) S27eD/R27fK；
(b) S27eD/R27fH；
(c) N27dE/S27eD；
(d) S27eD/T28D；
(e) S27eD/R29E；
(f) S27eD/R29S；
(g) K24N/S27eD；
(h) N27dD/R27fK；
(i) N27dE/R27fK；
(j) R27fK/T28D；
(k) R27fK/R29E；
(l) R27fK/R29S；
(m) K24N/R27fK；
(n) K24N/N27dD；
(o) N27dD/T28D；
(p) N27dD/R29E；
(q) N27dD/R29S；
(r) S27eD/Q89H
(s) N27dD/Q89H；
(t) R27fK/Q89H；
(u) S27eD/Y91E；
(v) N27dD/Y91E；
(w) R27fK/Y91E；
(x) Q89H/H94P；
(y) Y91E/H94P；
(z) H94P/M95N；
(aa) H94P/M95D；
(bb) H94P/M95P；
(cc) H94E/Y96P；
(dd) H94E/M95N；
(ee) H94E/M95D；
(ff) H94E/M95P；
(gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P
(lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；および
(ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
[30] 前記軽鎖可変領域のフレームワーク領域（FR）を、ヒトフレームワーク領域（FR）によって置き換えることをさらに含む、[22]～[29]のいずれか1つに記載の方法。
[30A] 前記軽鎖可変領域が、Kabatナンバリングにしたがう、2位のアミノ酸I、および／または3位のアミノ酸Qを含む、[30]に記載の方法。
[30B] 前記軽鎖可変領域が、ヒトVκ1 FR1配列を含む、[30]に記載の方法。
[30C] 前記軽鎖可変領域が、ヒトVκ3 FR3配列を含む、[30]に記載の方法。
[30D] 前記軽鎖可変領域が、ヒトVκ1 FR1、ヒトVκ1 FR2、およびヒトVκ3 FR3配列を含む、[30]に記載の方法。
[30E] 前記軽鎖可変領域が、配列番号：１２３に含まれるFRドメイン（FR1、FR2、FR3、およびFR4）のうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む、[30]に記載の方法。
[30F] 前記軽鎖可変領域のCDRL2に1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換を導入することをさらに含む、[22]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[31] 以下からなる群より選択される1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）を導入することをさらに含む、[22]～[30F]のいずれか1つに記載の方法：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL2における、
(a) 50位のアミノ酸WのA、G、I、T、またはVでの置換；
(b) 52位のアミノ酸SのFまたはIでの置換；
(c) 53位のアミノ酸TのNまたはYでの置換；および
(d) 54位のアミノ酸RのKまたはVでの置換。
[32] 前記軽鎖可変領域中に導入されるアミノ酸置換が、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む、[22]～[31]のいずれか1つに記載の方法：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；および
(m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
[33-1] 前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片が、配列番号：１４～１５０および１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、[22]～[32]のいずれか1つに記載の方法。
[33-2] 前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片が、配列番号：１２３～１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、[33-1]に記載の方法。
[33-3] 前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片が、配列番号：１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、[33-1]に記載の方法。
[34] 前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片が、FabまたはscFvの形態である、[22]～[33-3]のいずれか1つに記載の方法。
[35] 前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片が、重鎖可変領域、任意で配列番号：１５８のアミノ酸を含む重鎖可変領域をさらに含む、[22]～[33-3]のいずれか1つに記載の方法。
別の非限定的な態様において、本発明は、細胞質侵入ドメイン、細胞表面抗原結合ドメイン、および／または細胞質抗原結合ドメインを、標的細胞特異的に細胞質中に送達され得る組み合わせで含む、多機能性抗原結合分子（抗体またはその抗原結合断片）に関する。非限定的な一態様において、各ドメインは、抗体に由来する。非限定的な一態様において、これらの抗原結合分子は、細胞表面抗原に結合することで、標的細胞特異的にインターナライズし、細胞質へ移行することが期待される。
具体的には、本開示は、例えば以下に記載する二重機能性または多機能性の抗原結合分子の態様を包含する。
[36] 細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン、および細胞質侵入ドメインを含む抗原結合分子であって、該細胞質侵入ドメインが、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[36A] 前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[36]に記載の抗原結合分子。
[36B] 前記細胞質抗原結合ドメインおよび前記細胞質侵入ドメインが、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[36]に記載の抗原結合分子。
[36C] 前記細胞質抗原結合ドメインおよび前記細胞質侵入ドメインが、細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[36]または[36B]に記載の抗原結合分子。
[36D] 多機能性抗体または多機能性抗体誘導体である、[36]～[36C]のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[37] 第一および第二のFab領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域が、細胞表面抗原に特異的に結合し、かつ
(b) 第二のFab領域が、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域（VH）と、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域（VL）とのペアを含む、
抗原結合分子。
[38] 第一および第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域が、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域が、細胞質侵入能を有し、
(c) 一本鎖ユニットが、細胞質抗原に特異的に結合し、かつ
第二のFab領域が、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域（VL）を含む、
抗原結合分子。
[39] 第一および第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域が、細胞質抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域が、細胞質侵入能を有し、
(c) 一本鎖ユニットが、細胞表面抗原に特異的に結合し、かつ
第二のFab領域が、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域（VL）を含む、
抗原結合分子。
[40] 第一および第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一および第二のFab領域が、(i) 細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域（VH）と、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域（VL）とのペアを含み、かつ
(b) 一本鎖ユニットが、細胞質抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
[41] 第一、第二、第三、および第四のFab領域ならびにFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一、第二、第三、および第四のFab領域から選択される1つのFab領域が、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) (a)以外の3つのFab領域が、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域と、[1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域とのペアを含み、
(c) Fc領域が、第一のFcサブユニットおよび第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、かつ第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[42] [1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域およびFc領域を含む抗原結合分子であって、該Fc領域が、該抗原結合分子の多量体形成を促進するための1つまたは複数のアミノ酸改変を含み、かつ該抗原結合分子が、該1つまたは複数のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加している、抗原結合分子。
[43] 第一および第二のFab領域ならびにFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域が、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域が、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域（VH）と、[1]～[11]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域（VL）とのペアを含み、かつ
(c) Fc領域が、該抗原結合分子の多量体形成を促進するための1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、
抗原結合分子。
[44] [1]～[11-3]のいずれか1つに記載の軽鎖可変領域を含むFab領域が、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[37]～[43]のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[45] 前記細胞表面抗原が、標的細胞に特異的に発現する抗原であり、かつ前記抗原結合分子が、該標的細胞の細胞質中に特異的に送達される、[37]～[44]のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[46] [37]～[45]のいずれか1つに記載の抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
[47] [37]～[45]のいずれか1つに記載の抗原結合分子を、標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法であって、前記細胞表面抗原が、該標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法。
[48] [37]～[45]のいずれか1つに記載の抗原結合分子を用いることによって、標的細胞特異的に細胞質抗原を除去、抑制、または活性化する方法であって、前記細胞表面抗原が、該標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法。
[49] 対象の疾患を診断、予防、または治療するための医薬組成物であって、疾患細胞が、[37]～[45]のいずれか1つに記載の抗原結合分子が特異的に結合する細胞表面抗原および細胞質抗原を発現し、該医薬組成物が、[37]～[45]のいずれか1つに記載の抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
代表的なhT4VL.FRv04変異体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）クロマトグラムを示す。高い単量体ピークパーセンテージおよび鋭い対称のピーク形状（狭いピーク幅）は、良好な物理化学的特性を示している。表６に列記した変異を有する変異体のすべては、図１に示すように、より良好な単量体ピークパーセンテージおよびより鋭いピーク形状を示した。 ASGPR発現HeLa細胞株（HeLa/ASGPR/BirA細胞）における二重機能性抗体の細胞質輸送のイメージング解析の結果を示す。抗ASGPR抗体（AGA0078）との二重機能性分子形式の選択された抗体は、抗KLH抗体（IC17＝対照）との二重機能性分子形式の抗体よりも高いAlexa488蛍光強度を示した。これは、選択された二重機能性抗体が、ASGPR依存的様式によってHeLa/ASGPR/BirA細胞中に送達され得ることを示し、Split-Nanolucアッセイによって観察される受容体依存的な細胞質輸送（ASGPR Abによって媒介されるASGPR発現細胞特異的な細胞質輸送）を支持する。 細胞表面上にIL6Rを内因性に発現するHepG2細胞における、hT4VL変異体および抗IL6R重鎖を含む二重機能性抗体の細胞質輸送についてのSplit Nlucアッセイの結果を示す。 本開示の抗原結合分子のコンセプトを示す模式図である。図４においては、本開示の抗原結合分子が標的細胞特異的にデリバリー（送達）されるコンセプトを示すために、一例として二重機能性抗体の形態の抗原結合分子を示している。 本開示の抗原結合分子の分子形の例として、多価抗体の分子形を示す模式図である。 本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含む。 本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む。 本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む。 本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、ＤＶＤ－Ｉｇ（登録商標）の分子形を有する。 本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一、第二及び第三のFab領域を含む。 本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一、第二、第三及び第四のFab領域を含む。 最適化された抗体変異体である3D8H/hT4VL.FRv40563と、同一の野生型ヒトIgG1定常領域を含む親3D8抗体（3D8H/hT4VL）のPKの比較を示す。 細胞質侵入ドメイン（FRv40563）および細胞表面抗原結合ドメイン（抗ASGPR抗体、AGA0078）を含む二重機能性抗体のPKを示す。FRv40563n//AGA0078pは、その対照抗体であるFRv40563n//IC17pと比較して、より速いクリアランスを示し、二重機能性抗体FRv40563n//AGA0078pが、ASGPR依存的様式によって肝臓に送達され得ることを示唆した。加えて、FRv40563n//AGA0078pは、IC17n//AGA0078pよりも速いクリアランスを示した。これにより、インビボでのASGPR依存的細胞質輸送を支持することができた。
Ｉ．定義
本明細書の趣旨での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン (VL) フレームワークまたは重鎖可変ドメイン (VH) フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。一態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、抗体の抗原結合断片、または抗体誘導体である。
「アフィニティ」は、分子（例えば、抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
「アフィニティ成熟」抗体は、改変を備えていない親抗体と比較して、1つまたは複数の超可変領域 (hypervariable region: HVR) 中に抗体の抗原に対するアフィニティの改善をもたらす1つまたは複数の改変を伴う、抗体のことをいう。
「結合活性（binding activity）」は、分子（例えば、抗体）の１個またはそれ以上の結合部位と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。ここで、「結合活性（binding activity）」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用に厳密に限定されない。例えば、結合対のメンバーが、１価での結合および多価での結合の両方が可能である場合、結合活性は、これらの結合力の総和となる。分子XのそのパートナーYに対する結合活性は、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。結合活性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多機能性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
本明細書で用いられる「アゴニスト」抗原結合分子または「アゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を有意に増強する抗体である。
本明細書で用いられる「阻止」抗原結合分子または「阻止」抗体、あるいは「アンタゴニスト」抗原結合分子または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を（部分的にまたは完全にのいずれでも）有意に阻害する抗体である。
用語「抗体断片」および「抗原結合断片」は、完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv（VHおよびVL）、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多機能性抗体、多重特異性抗体を含む。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および／または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／または変異体を含む）などの、毒素；および、以下に開示される、種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含む。
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量におけるおよび必要な期間にわたっての、量のことをいう。
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
本明細書において、Fc領域または定常領域中のアミノ酸改変または置換は、EUナンバリングシステムとアミノ酸との組合せによって表され得る。たとえば、S424Nは、EUナンバリング424位のセリン（Ser）のアスパラギン（Asn）への置換を表す。また、EU424Nは、424位のアミノ酸（種類を問わない）のアスパラギン（Asn）への置換を表す。
「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。Fc受容体は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、および肥満細胞などの免疫細胞の表面上のタンパク質である。Fc受容体は、感染細胞または侵入病原体に付着した抗体のFc(結晶性フラグメント)領域に結合し、食細胞または細胞傷害性細胞を刺激して、抗体媒介性食作用または抗体依存性細胞介在性細胞傷害によって微生物または感染細胞を破壊する。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
インビボでのヒトFcRnへの結合およびヒトFcRn高アフィニティ結合ポリペプチドの血漿半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株においてまたは変異Fc領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類において測定され得る。WO2000/42072 (Presta) は、FcRに対する結合が増加したまたは減少した抗体変異体を記載している。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
本明細書で用語「Fc領域含有抗体」は、Fc領域を含む抗体のことをいう。Fc領域のC末端リジン（EUナンバリングシステムにしたがえば残基447）またはFc領域のC末端グリシン－リジン（残基446-447）は、例えば抗体の精製の間にまたは抗体をコードする核酸の組み換え操作によって除去され得る。したがって、本開示によるFc領域を有する抗体を含む組成物は、G446-K447を伴う抗体、G446を伴いK447を伴わない抗体、G446-K447が完全に除去された抗体、または上記3つのタイプの抗体の混合物を含み得る。
本明細書で用語「Fcドメインのサブユニット」および「Fcサブユニット」は、二量体であるFc領域を形成する２つのポリペプチドの一つ、即ち、安定に自己会合可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、IgGのFcドメインのサブユニットは、IgGのCH2及びIgGのCH3定常ドメインを含む。
「Fcドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾」とは、ホモ二量体を形成するFcドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止するペプチド骨格の操作又はFcドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促進する修飾は、会合が望まれる２つのFcドメインサブユニット（すなわちFcドメインの第一及び第２サブユニット）のそれぞれに対して行われた別々の修飾を特に含み、該修飾は２つのFcドメインのサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、Fcドメインの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。従って、（ヘテロ）二量体化が、各サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同一ではないという意味で非同一であるかもしれない、第一Fcドメインサブユニットを含むポリペプチドと第二Fcドメインサブユニットを含むポリペプチドの間に生じる。幾つかの実施態様では、会合促進修飾は、Fcドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合修飾は、Fcドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
一態様において、前記修飾は、Fcドメインの２つのサブユニットの一方におけるノブ修飾及びFcドメインの2つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、いわゆるノブ・イントゥ・ホール(knob into hole)修飾である。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (CDRL1)、50-56 (CDRL2)、89-97 (CDRL3)、31-35b (CDRH1)、50-65 (CDRH2)、 および95-102 (CDRH3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種の分子にコンジュゲートされた抗体である（異種の分子は、これに限定されるものではないが、細胞傷害剤を含む）。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または対象は、ヒトである。
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。
「単離された」核酸は、そのもともとの環境の成分から分離された核酸分子のことをいう。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
「細胞質侵入抗原結合分子をコードする単離された核酸」は、細胞質侵入抗原結合分子をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。TR細胞質侵入抗原結合分子が抗体である場合、「細胞質侵入抗原結合分子をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本開示にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「裸抗体」は、異種の部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことをいう。裸抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
用語「細胞質侵入抗原結合分子」または「細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片」は、生きている細胞の細胞質中に侵入することができる抗原結合分子または細胞質侵入抗体もしくはその抗原結合断片をいう。細胞質中への侵入方法は特に限定されず、エンドサイトーシス（endocytosis）過程を介して取り込まれた後に、エンドソーム脱出（endosome escape）を経ても良いし、それ以外の方法であっても良い。エンドソーム脱出以外の例としては、抗原結合分子が、細胞膜を直接透過する場合が挙げられる。同一の抗原結合分子が、エンドソーム脱出と細胞膜の直接透過の両方の方法で、細胞質中に侵入してもよい。エンドソーム脱出とは異なる方法で、細胞質中に侵入することのできる抗原結合分子が報告されている（例えば、WO2013102659）。一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は抗体または抗体誘導体である。別の一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は、細胞質侵入ドメインを含む。
用語「細胞質侵入ドメイン」及び「細胞質侵入能／細胞質侵入活性を有する領域」は互換的に使用され、生きている細胞の細胞質中に侵入することができるドメインをいう。理論に縛られることを望むわけではないが、細胞質中への侵入方法は特に限定されず、エンドサイトーシス（endocytosis）過程を介して取り込まれた後に、エンドソーム脱出（endosome escape）を経ても良いし、それ以外の方法であっても良い。エンドソーム脱出方法は特に限定されず、例えば、酸性pHであるエンドソーム内で細胞質侵入ドメインがエンドソーム膜と相互作用し、エンドソーム膜上に孔を形成することで、細胞質への移行が達成される。エンドソーム脱出以外の例としては、抗原結合分子が、細胞膜を直接透過する場合が挙げられる。同一の抗原結合分子が、エンドソーム脱出と細胞膜の直接透過の両方の方法で、細胞質中に侵入してもよい。一態様において、細胞質侵入ドメインは、エンドソーム脱出能および細胞膜透過能のうちの一方または両方を有する。一態様において、細胞質侵入ドメインはエンドサイトーシス能を有しない。別の一態様において、細胞質侵入ドメインはエンドサイトーシス能を有する。細胞質侵入ドメインは、細胞質侵入能を有するものであればその種類を問わないが、好ましい一態様において、抗体またはその断片である。細胞質侵入ドメインが抗体又はその断片である場合、細胞質侵入ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）及び抗体重鎖可変領域（VH）の組合せ、または、重鎖抗体可変領域（VHH）、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体軽鎖可変領域（VL）、及び免疫グロブリン新抗原受容体（immunoglobulin new antigen receptor：IgNAR）の可変領域（VNAR）等の単一ドメイン抗体可変領域、の全部または一部を含む。細胞質侵入能を有する抗体又はその断片の例としては、例えば、細胞質侵入能を示す軽鎖可変領域を含むCytotransmab (Nat Commun. 2017 May 10;8:15090.)が挙げられる。細胞質侵入ドメインの異なる例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab')2」等が挙げられる。細胞質侵入ドメインは、細胞侵入活性を有するペプチド部分または核酸部分と組み合わせて使用されてもよい。細胞侵入活性を有するペプチド部分の例としては、細胞透過性ペプチド（CPP）、タンパク質形質導入ペプチド（PTD）などが挙げられる（例えば、WO2017156630参照）。細胞侵入活性を有する核酸部分の例としては、ホスホロチオアート骨格を有するオリゴ核酸が挙げられる（例えば、WO2015031837参照）。
関心対象のドメインが細胞質侵入ドメインであるか否か（関心対象のドメインが細胞質侵入能を有するか否か）は、当業者に公知の種々の方法により確認することができる。例えば、関心対象のドメインを、細胞質侵入能を有しない分子（例えば、抗原結合分子）と融合させ、当該融合分子を細胞に接触させた後に、当該細胞の細胞質において当該融合分子が検出されるかを見ることによって、評価することができる。細胞質における関心対象の分子の存在を検出するための種々の方法が公知であり、例えば、以下のそれぞれ参考実施例１および３に記載の、split NanoLuc（登録商標）システムを用いたアッセイおよび蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析が知られている。BirAアッセイおよびsplit GFPシステムを用いたアッセイもまた、細胞質における関心対象の分子の存在を検出するために使用することができる。
一態様において、細胞質侵入ドメインは、細胞表面抗原および／または細胞質抗原と相互作用してもよい。
抗原結合分子の「細胞質輸送」能とは、抗原結合分子が細胞質に輸送される能力を意味し、用語「侵入する」、「輸送する（traffic）」、または「輸送する（traffick）」は、互換的に用いられる。抗原結合分子の「細胞質侵入能／活性」、「細胞質輸送能／活性」、「細胞質透過性」、および「細胞質への透過性」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、抗原結合分子自体がエンドソームから細胞質へ移行する、または抗原結合分子が細胞質に輸送される能力をいう。
抗原結合分子（抗体）の「低減した細胞外マトリクス（ECM）結合」または「より低いECM結合」とは、抗原結合分子のECMに対する結合が参照抗体と比較して低減していることを意味する。ECM（細胞外マトリクス）は、細胞外構成要素であり、インビボで種々の部位に存在する。したがって、ECMに強く結合する抗体は、血中でのより不良な動態（より短い半減期）を有することが知られている（WO2012093704 A1）。したがって、細胞質侵入活性を増強するがECM結合を増大させないアミノ酸置換を含む抗原結合分子が、抗体ライブラリーに現れる抗原結合分子変異体として好ましくは選択される。
ECM（細胞外マトリクス）に対する各抗体の結合を、WO2012093704 A1を参照して以下の手順によって評価することができる：ECM Phenol red free（BD Matrigel #356237）をTBSで2 mg/mLに希釈し、5μLを、氷上で冷却したECLアッセイプレート（L15XB-3, MSD K.K., high bind）の各ウェルの中央に添加した。次いで、コーティングされたプレートを密封し、4℃で一晩保存した。次いで、翌日、アッセイを室温で実施した。150μLのECLブロッキング緩衝液（0.5％ BSAおよび0.05％ Tween 20を補給したPBS）を、コーティングされたプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で2時間以上静置した。次に、ブロッキング緩衝液を除去した。各抗体サンプルを、ACES-Tで9μg/mLに希釈し、さらにECLDB（0.1％ BSAおよび0.01％ Tween 20を補給したPBS）で3μg/mLに希釈した。50μLの希釈した抗体溶液を、各ウェルに添加して、600 rpmで振盪しながら30℃で1時間インキュベートした。次いで、逆さにしたプレートを軽くたたくことによって、サンプルを除去した。次に、50μLのグルタルアルデヒドを各ウェルに添加してサンプルを固定処理し、室温で10分間インキュベートした。次いで、ウェルをPBS-T（0.05％ Tween 20を補給したPBS）で3回洗浄した。二次抗体をECLDBで1μg/mLに希釈し、50μLの二次抗体溶液を、プレートの各ウェルに添加した。プレートを密封し、光から遮蔽しながら、600 rpm、30℃で1時間インキュベートした。次に、二次抗体溶液を除去した。プレートを再度PBS-Tで3回洗浄し、その後、READ緩衝液（MSD K.K.）を150μL/ウェルで添加し、続いて、Sector Imager 2400（MSD K.K.）を用いて発光シグナルを直ちに検出した。
抗原結合分子の「より低い凝集傾向」という用語は、抗原結合分子の相互の自己会合、すなわち単量体間の相互作用が、参照抗原結合分子のものと比較して低減していることを意味する。凝集プロファイルは、各変異体のUPLC（Acquity H-Class bio, Waters）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）解析によって評価した。50 mMリン酸/300 mM NaCl（pH 7.0）をランニング緩衝液に用い、BEH200カラム（Waters, #186005225）を分析カラムとして用いた。クロマトグラムを、220 nM UV吸収によって記録した。Empower3ソフトウェア（Waters）を用いてデータを処理し、単量体ピークパーセンテージおよび単量体ピークの半値全幅を計算した。高い単量体ピークパーセンテージおよび鋭い対称のピーク形状（狭いピーク幅）は、良好な物理化学的特性とみなされる。
「融合」とはその成分（例えば、Fab領域及びFcドメインサブユニット）が、直接または一つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されていることを意味する。
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：分率X／Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本開示の抗原結合分子は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
本明細書で用いられる表現「実質的に減少した」、「実質的に増加した」または「実質的に異なる」は、2つの数値の間（通常、ある分子に関するものと、参照／比較用分子に関するものの間）の差が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点で統計学的に有意であるとみなす程度に、充分に大きいことをいう。
本明細書で用いられる用語「実質的に類似の」、「実質的に変化しない」または「実質的に同じ」は、2つの数値の間（例えば、本開示の抗原結合分子に関するものと、参照／比較用抗原結合分子に関するものの間）の類似性が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点でほとんどまたはまったく生物学的および／または統計学的に有意性がないとみなす程度に、充分高いことをいう。
本明細書で用いられる表現「実質的に検出されない」は、当業者に公知の標準的な検出技術（例えば、ウェスタンブロッティング、キャピラリーイムノアッセイ、蛍光顕微鏡によるイメージングなど）の検出限界以下であることを意味し、全く検出されないか、または検出されたとしてもバックグラウンド程度もしくはノイズ程度の検出であることを意味する。具体的には、例えば、本開示の抗原結合分子の測定値がネガティブコントロールの測定値と実質的に類似であるかまたは実質的に同じである（例えば、統計学的に有意性が見られない）場合に、本開示の抗原結合分子は実質的に検出されないという。
「実質的に送達されない」とは、当該送達が、それを検出するための標準的な検出技術において実質的に検出されないことを意味する。例えば、細胞の細胞質中への送達に関して、本開示の抗原結合分子またはその複合体と接触させた細胞の細胞質中の当該抗原結合分子またはその複合体の存在量が、当該接触のない細胞の細胞質中の当該存在量と実質的に類似であるか実質的に同じである（例えば、統計学的に有意性が見られない）場合に、当該抗原結合分子は当該細胞の細胞質中に実質的に送達されないという。
同様に、実質的に除去、抑制、または活性化しないとは、当該除去、抑制、活性化が、それらを検出するための標準的な検出技術において実質的に検出されないことを意味する。例えば、細胞質抗原の除去、抑制、活性化に関して、本開示の抗原結合分子またはその複合体を用いた場合の測定値が、コントロールの測定値と実質的に類似であるか実質的に同じである（例えば、統計学的に有意性が見られない）場合に、細胞質抗原は実質的に除去、抑制又は活性化しないという。
ＩＩ．組成物および方法
一局面において、本開示は、既存の細胞質侵入抗体軽鎖可変領域（h3D8抗体のVL：WO2016/013870に開示されているhT4VL）と比較して改善された細胞質侵入能または細胞質侵入活性を有する軽鎖可変領域を含む抗原結合分子（例えば、抗体）の知見に一部基づくものである。本開示はさらに、改善された細胞質侵入抗体を有する抗原結合分子（抗体）が、改善された発現レベル、低減したECM（細胞外マトリクス）結合、および／または、より低い凝集傾向によって示される改善された物理化学的特性をさらに示すという知見に一部基づくものである。特定の態様において、本明細書で提供される細胞質侵入抗原結合分子（抗体）またはその断片は、ヒトVκ1 FR3の代わりにヒトVκ3（VK3）FR3を有することによってのみhT4VLと異なる、hT4VL.FRv4（配列番号：４）のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、かつCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から、好ましくはCDRL1およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、軽鎖可変領域を含む。別の一局面において、本明細書で提供される多機能性抗原結合分子は、細胞質侵入抗体もしくは当該抗体の断片、細胞表面抗原に結合する抗体もしくは当該抗体の断片、および／または細胞質抗原に結合する抗体もしくは当該抗体の断片を、組み合わせて含む。多機能性抗原結合分子は、標的細胞特異的に細胞質中に送達される。特定の態様において、本明細書で提供される多機能性抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン、および、前述の軽鎖可変領域を含む細胞質侵入ドメインを含む。本開示の抗原結合分子は、例えば、細胞質抗原に起因する疾患の診断、予防、または治療のために有用である。
Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）
一態様において、本開示の抗原結合分子は、改善された（増強された）細胞質侵入能（活性）を有する抗原結合分子である。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞侵入抗体と比較して、より効率的に細胞質に送達（移行）される。一態様において、一定量の本開示の細胞質侵入抗原結合分子を対象に投与しまたは細胞と接触させた場合、同量の既存の細胞質侵入抗体の場合と比較して、より多い量の抗原結合分子が、標的細胞の細胞質に送達される。一態様において、本開示の抗原結合分子は、既存の細胞侵入抗体と比較して、改善された発現レベル、低減したECM（細胞外マトリクス）結合、および／または、より低い凝集傾向によって示される改善された物理化学的特性をさらに示す。
好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3（すなわち、配列番号：４に示されるアミノ酸配列に含まれるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3）を含む軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。さらに好ましい一態様において、軽鎖可変領域は、CDRL1およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
好ましい一態様において、軽鎖可変領域は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～34位および89～97位に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。より好ましくは、1つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～32位および93～97位に位置する。
好ましい一態様において、本開示の抗原結合分子の軽鎖可変領域は、以下からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）を含む：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのA、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V、またはYでの置換；
(b) 25位のアミノ酸SのA、D、E、F、I、M、N、T、V、またはYでの置換；
(c) 26位のアミノ酸SのA、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T、またはVでの置換；
(d) 27位のアミノ酸QのA、D、E、F、H、I、L、M、S、またはYでの置換；
(e) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(f) 27b位のアミノ酸LのI、P、Q、T、またはVでの置換；
(g) 27c位のアミノ酸FのA、D、E、I、M、N、S、W、またはYでの置換；
(h) 27d位のアミノ酸NのA、D、E、F、H、N、またはQでの置換；
(i) 27e位のアミノ酸SのA、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V、またはYでの置換；
(j) 27f位のアミノ酸RのA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(k) 28位のアミノ酸TのE、H、I、Q、S、V、W、またはYでの置換；
(l) 29位のアミノ酸RのA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(m) 30位のアミノ酸KのA、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(n) 31位のアミノ酸NのD、M、S、またはTでの置換；
(o) 32位のアミノ酸YのD、E、G、H、またはQでの置換；
(p) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(q) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(r) 93位のアミノ酸YのI、L、M、N、P、Q、S、T、V、またはWでの置換；
(s) 94位のアミノ酸HのA、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(t) 95位のアミノ酸MのA、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(u) 96位のアミノ酸YのA、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T、またはVでの置換；および
(v) 97位のアミノ酸TのA、D、E、G、H、K、P、Q、R、S、またはVでの置換。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域における前述の1つまたは複数のアミノ酸置換は、当該置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、抗体またはその断片の細胞質侵入活性を増強する。さらに好ましい一態様において、本開示の抗体またはその断片は、好ましくは参考実施例１に記載のSplit Nlucアッセイを用いて決定された場合に、前記置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、少なくとも1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、または500％、または1000％増強された細胞質侵入活性を示す。一態様において、細胞質侵入活性は、抗体もしくはその断片の細胞膜中への侵入、および／またはエンドソーム脱出によって媒介される。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域は、以下からなる群より選択される1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）を含む：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのNでの置換；
(b) 27位のアミノ酸QのEでの置換；
(c) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(d) 27d位のアミノ酸NのDまたはEでの置換；
(e) 27e位のアミノ酸SのDまたはEでの置換；
(f) 27f位のアミノ酸RのD、H、K、L、S、またはVでの置換；
(g) 28位のアミノ酸TのDでの置換；
(h) 29位のアミノ酸RのE、G、M、またはSでの置換；
(i) 30位のアミノ酸KのLまたはQでの置換；
(j) 32位のアミノ酸YのEでの置換；
(k) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(l) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(m) 93位のアミノ酸YのEでの置換；
(n) 94位のアミノ酸HのE、P、またはQでの置換；
(o) 95位のアミノ酸MのD、N、またはPでの置換；および
(p) 96位のアミノ酸YのEまたはPでの置換。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域は、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む：
(a) S27eD/R27fK；
(b) S27eD/R27fH；
(c) N27dE/S27eD；
(d) S27eD/T28D；
(e) S27eD/R29E；
(f) S27eD/R29S；
(g) K24N/S27eD；
(h) N27dD/R27fK；
(i) N27dE/R27fK；
(j) R27fK/T28D；
(k) R27fK/R29E；
(l) R27fK/R29S；
(m) K24N/R27fK；
(n) K24N/N27dD；
(o) N27dD/T28D；
(p) N27dD/R29E；
(q) N27dD/R29S；
(r) S27eD/Q89H；
(s) N27dD/Q89H；
(t) R27fK/Q89H；
(u) S27eD/Y91E；
(v) N27dD/Y91E；
(w) R27fK/Y91E；
(x) Q89H/H94P；
(y) Y91E/H94P；
(z) H94P/M95N；
(aa) H94P/M95D；
(bb) H94P/M95P；
(cc) H94E/Y96P；
(dd) H94E/M95N；
(ee) H94E/M95D；
(ff) H94E/M95P；
(gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；および
(ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（FR）を含む。特定の態様において、軽鎖可変領域は、Kabatナンバリングにしたがう、2位のアミノ酸I、および／または3位のアミノ酸Qを含む。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域は、ヒトVκ1、Vκ2、またはVκ3 FR1配列を含んでもよい。より好ましくは、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1 FR1配列を含む。好ましい一態様において、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1、Vκ2、またはVκ3 FR2配列を含んでもよい。より好ましくは、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1 FR2配列を含む。好ましい一態様において、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1、Vκ2、またはVκ3 FR3配列を含んでもよい。より好ましくは、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1 FR3配列を含む。さらに好ましい一態様において、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1 FR1、ヒトVκ1 FR2、およびヒトVκ3 FR3配列を含む。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域は、配列番号：１２３に含まれるFRドメイン（FR1、FR2、FR3、およびFR4）のうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む。
好ましい一態様において、本開示の軽鎖可変領域は、CDRL2における1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換をさらに含む。好ましい一態様において、1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング50～56位に位置する。具体的な態様において、CDRL2における1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換は、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 50位のアミノ酸WのA、G、I、T、またはVでの置換；
(b) 52位のアミノ酸SのFまたはIでの置換；
(c) 53位のアミノ酸TのNまたはYでの置換；および
(d) 54位のアミノ酸RのKまたはVでの置換。
いくつかの態様において、本開示の軽鎖可変領域は、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む：
配列番号：４のアミノ酸配列における、
(a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；および
(m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、配列番号：１４～１５０および１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２３～１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
さらに好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、scFv（一本鎖Fv）、一本鎖抗体、Fv、scFv2（一本鎖Fv2）、Fab、またはF(ab')2の形態であることができる。さらに好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、FabまたはscFvの形態であることができる。
好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入分子は、重鎖可変領域をさらに含む。本開示の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、VHHなどの単一ドメイン抗体可変領域をさらに含んでもよい。
Ａ－２．細胞質侵入能を有する例示的な多機能性抗原結合分子
いくつかの態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、多機能性抗原結合分子（抗体）である。一態様において、多機能性抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン、および、前述の軽鎖可変領域を含む細胞質侵入ドメインを含む。
好ましい一態様において、本開示における多機能性抗原結合分子は、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞表面上に発現する抗原に結合しない。好ましい一態様において、前記細胞質抗原結合ドメイン及び／または前記細胞質侵入ドメインは、(i) 前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞表面上に発現する抗原に結合しないか、または(ii) 細胞表面上に発現するいかなる抗原にも結合しない。
ここで、既存の細胞内移行抗体（Tmab4（重鎖:3D8、軽鎖:hT4VL））は、細胞表面のへパラン硫酸プロテオグリカン (Heparan sulfate proteoglycan: HSPG)依存的なエンドサイトーシスにより細胞内エンドソームに取り込まれ、酸性pHであるエンドソーム内で、軽鎖の構造が変化することによりエンドソーム膜と相互作用し、膜上に孔を形成することで、細胞質への移行を達成していることが知られている。（J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175）。また、HSPGへの結合を減弱させた抗体（Tmab4-03（重鎖:3D8、軽鎖:hT4VL.03））は、pH5.5での孔形成能は維持しつつも、エンドサイトーシス能は損なわれていることも報告されている（J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175）。すなわちTmab4-03は、このままでは細胞特異的な細胞内移行を達成できないことを意味している。さらに、エンドソーム膜上に孔を形成するためには、Tmab4とエンドソーム膜上の分子とが相互作用して膜を歪めることが重要であると予想される（PNAS,2011 Oct.108;41;16883-16888）。したがって、一態様において、細胞質侵入能を向上させるためにはエンドソーム膜と相互作用する細胞質侵入ドメインは多価であることが望ましい。
他方で、前述の通り、Tmab4は上皮細胞に普遍的に発現しているHSPGを介してエンドサイトーシスされるため、標的細胞特異的に細胞質抗原結合抗体を送達することが困難である。すなわち、全身に投与された際に、標的組織への細胞質抗原結合抗体の送達が低くなることが予想される。そこで発明者らは、一態様において、細胞質侵入ドメインを一価にすることで非特異的な取り込みを抑え、さらに標的細胞表面結合ドメインを加えることで標的特異性を向上させると同時に、抗体とエンドソーム膜との相互作用が多価である状態をつくり、細胞質侵入能を維持又は向上させることを考えた。
上述の既存抗体と異なり、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む。したがって、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞の細胞表面抗原に結合することで、標的細胞特異的にエンドサイトーシスされ、その後、エンドソームから細胞質へ移行することが期待される。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞質侵入抗体と比較して、より選択的に標的細胞の細胞質中に送達される。一態様において、一定量の本開示の細胞質侵入抗原結合分子を対象に投与しまたは接触させた場合、同量の既存の細胞質侵入抗体と比較して、より多くの抗原結合分子が標的細胞の細胞質中に送達される。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞の細胞質中に特異的に送達され、当該抗原結合分子が特異的に結合する細胞表面抗原を発現しない細胞には実質的に送達されない。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子が医薬として用いられる場合、当該細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞質侵入抗体と比較して、より強い薬効を発揮し、及び／又は、より少ない副作用を生じる。また、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子を含む医薬組成物は、既存の細胞質侵入抗体を含む医薬組成物と比較して、少ない投与量、及び／又は、投与回数で薬効を発揮することができる。
さらに好ましい一態様において、本開示の多機能性細胞質侵入抗原結合分子は、次の１～８の分子形のいずれかであってよい。
１．第一及び第二のFab領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図４、図６）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含む。
特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含む。
別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み；(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含む。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子は、Fc領域をさらに含んでもよく、当該Fc領域は、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域（VL）は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りである。
２．第一及び第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む細胞質侵入抗原結合分子（図７）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む。
特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する。
別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞表面抗原に特異的に結合する。
また別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞質侵入能を有する。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一及び第二のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み；(b) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する。
また特定の態様において、一本鎖ユニットは、(i) 前記第一のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端；(ii) 前記第一のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端；あるいは(iii) 前記第一のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端に融合されている。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域をさらに含んでもよく、一本鎖ユニットは、(i) 第一のFcサブユニットのC末端、又は(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端に融合されていてもよい。第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる一本鎖ユニットは、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）であってもよい。単一ドメイン抗体可変領域の例には、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域（VL）は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りである。これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる、細胞質侵入能を有するFab領域および細胞質侵入能を有する一本鎖ユニットもまた、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域を含む。
３．第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む細胞質侵入抗原結合分子（図８）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む。
特定の態様において、(a) 第一の単一ドメイン抗体可変領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二の単一ドメイン抗体可変領域は、細胞質侵入能を有し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する。特定の態様において、一本鎖ユニットは、第一の単一ドメイン抗体可変領域のN末端、及び／又は、前記第二の単一ドメイン抗体可変領域のN末端、に融合されている。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域をさらに含んでもよく、一本鎖ユニットは、(i) 第一のFcサブユニットのC末端、又は(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端に融合されていてもよい。第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる一本鎖ユニットは、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）であってもよい。単一ドメイン抗体可変領域の例には、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する単一ドメイン抗体可変領域は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りの、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。
４．ＤＶＤ－Ｉｇ（登録商標）の分子形を有する細胞質侵入抗原結合分子（図９）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第1と第2のポリペプチド鎖を含み、ＤＶＤ－Ｉｇ（登録商標）の分子形を有する。
特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；
(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である。別の特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質侵入能を有する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質侵入能を有する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である。
さらに別の特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞質抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞質侵入能を有する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りである。
５．第一、第二及び第三のFab領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図１０）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一、第二及び第三のFab領域を含む。
特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二及び第三のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペアを含み；(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
別の特定の態様において、(a) 第一及び第三のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペアを含み；(b) 第二のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第2のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一及び第二のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペアを含み；(b) 第三のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第2のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
また特定の態様において、第一及び／又は第二のFab領域は、(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換；(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換；及び(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域は同一の置換を含まない。
これらの態様において、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域（VL）は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りである。
６．第一、第二、第三及び第四のFab領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図１１）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一、第二、第三及び第四のFab領域を含む。
特定の態様において、(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる1個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 上記(a)以外の3個のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペアを含み；(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
別の特定の態様において、(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる2個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 上記(a)以外の2個のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペアを含み；(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる3個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 上記(a)以外の1個のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペアを含み；(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
また特定の態様において、第一及び／又は第二のFab領域は、(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換；(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換；及び(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域は同一の置換を含まない。
また別の特定の態様において、第三及び／又は第四のFab領域は、(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換；(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換；及び(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第三のFab領域と第四のFab領域は同一の置換を含まない。
これらの態様において、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域（VL）は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りである。
７．多量体形成を促進する改変Fc領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図５）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、細胞質侵入能を有する領域及びFc領域を含み、当該Fc領域は当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含み、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加している。当該細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質抗原結合ドメインをさらに含んでもよい。
特定の態様において、前記細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域、ならびにFc領域を含み、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み；(c) Fc領域は、当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む。このような改変Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子は、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加しており、複数個の当該細胞質侵入抗原結合分子を含む多量体の細胞質侵入抗原結合分子複合体を形成することができる。
前記多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体であってもよい。前記アミノ酸改変は、E345R/E430G/S440Yの組合せまたはT437R/K248Eの組合せであってもよい（数字がEUナンバリングであらわされる置換の位置を示す）。
これらの態様において、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域（VL）は、Ａ－１．例示的な細胞質侵入抗原結合分子（抗体）において定義される通りである。
８．異種の部分にコンジュゲートされた細胞質侵入抗原結合分子
一局面において、本開示の抗原結合分子は、異種の部分にコンジュゲートされている細胞質侵入抗原結合分子である。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含み、細胞質抗原結合ドメインを含まない。好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞の表面上に発現する抗原に結合しない。好ましい一態様において、細胞質侵入ドメイン及び／又は異種の部分は、(i) 前記細胞表面抗原と異なる抗原であって細胞の表面上に発現する抗原に結合しないか、又は(ii) 細胞の表面上に発現するいかなる抗原にも結合しない。
一局面において、前述の通り、発明者らは、細胞質侵入ドメインを一価にすることで非特異的な取り込みを抑え、さらに標的細胞表面結合ドメインを加えることで標的特異性を向上させると同時に、抗体とエンドソーム膜との相互作用が多価である状態をつくり、細胞質侵入能を維持又は向上させることを考えた。
一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む。したがって、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞上の細胞表面抗原に結合することで、標的細胞特異的にエンドサイトーシスされ、その後、エンドソームから細胞質へ移行し、それにより、異種の部分を細胞質中に送達することが期待される。
一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞質侵入抗体と比較して、より選択的に標的細胞の細胞質中に送達され、そのため、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、異種の部分をより選択的に標的細胞の細胞質中に送達することができる。一態様において、一定量の本開示の細胞質侵入抗原結合分子を対象に投与しまたは接触させた場合、同量の、既存の細胞質侵入抗体にコンジュゲートされた異種の部分と比較して、より大量の、細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分が、標的細胞の細胞質に送達される。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分は、標的細胞の細胞質中に特異的に送達されるが、当該抗原結合分子が特異的に結合する細胞表面抗原を発現しない細胞には実質的に送達されない。
一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子が医薬として用いられる場合、当該細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分は、既存の細胞質侵入抗体にコンジュゲートされた異種の部分と比較して、より強い薬効を発揮し、及び／又は、より少ない副作用を生じる。一態様において、細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分を含む医薬組成物は、既存の細胞質侵入抗体にコンジュゲートされた異種の部分を含む医薬組成物と比較して、少ない投与量、及び／又は、投与回数で薬効を発揮することができる。
一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含み、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、かつ当該抗原結合分子は、異種の部分にコンジュゲートされている。好ましい一態様において、異種の部分は、抗原結合分子のL鎖のC末端（好ましくは、ビオチン標識されたC末端）にコンジュゲートされている。
一態様において、細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分は、ペプチド、核酸、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはその断片）、又は放射性同位体である。一態様において、異種の部分はペプチドである。
Ａ－３．
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗原結合分子は、下記の任意の特徴を組み入れてもよい。
用語「抗原結合ドメイン」および「（抗体の）抗原結合断片」は、本明細書において互換的に用いられ、抗原の全部または一部に特異的に結合しかつ相補的である領域を含む、抗原結合分子（抗体）の部分をいう。抗原の分子量が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましい一態様において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）及び抗体重鎖可変領域（VH）の組合せ、または、重鎖抗体可変領域（VHH）、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体軽鎖可変領域（VL）、及び免疫グロブリン新抗原受容体（immunoglobulin new antigen receptor：IgNAR）の可変領域（VNAR）等の単一ドメイン抗体可変領域、の全部または一部を含む。抗原結合ドメインの異なる例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab')2」等が挙げられる。
本明細書で用語「単一ドメイン抗体」、「単一ドメイン抗体可変領域」、「単ドメイン抗体」および「単ドメイン抗体可変領域」は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できるかぎりその構造は限定されない。IgG抗体等で例示される通常の抗体は、VHとVLのペアリングにより可変領域を形成された状態では抗原結合活性を示すのに対し、単ドメイン抗体は他のドメインとペアリングすることなく、単ドメイン抗体自身のドメイン構造単独で抗原結合活性を発揮できると知られている。単ドメイン抗体は通常比較的に低分子量を有し、単量体の形態で存在する。
単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物のVHH、サメのVNAR（免疫グロブリン新抗原受容体（immunoglobulin new antigen receptor：IgNAR）の可変領域）のような、先天的に軽鎖を欠如する抗原結合分子、または抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH／VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製された単ドメイン抗体が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、1つの単ドメイン抗体は3つのCDR（CDR1、CDR2及びCDR3）を有する。
単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を産生できる動物から、または単ドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得し得る。単ドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物（transgenic animals）が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得した単ドメイン抗体のフレームワーク配列をヒト生殖系列配列あるいはそれに類似した配列とすることで、ヒト化した単ドメイン抗体を取得することも出来る。ヒト化した単ドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）はまた、本発明の単ドメイン抗体の一実施態様である。「ヒト化単ドメイン抗体」は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ単ドメイン抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化単ドメイン抗体は、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体において、ＦＲ中の残基の一部がヒト抗体のものと対応しない場合も、実質的にすべてのＦＲはヒト抗体のものに対応する一例として考えられる。たとえば、単ドメイン抗体の一態様であるＶＨＨをヒト化する場合、ＦＲ中の残基の一部をヒト抗体のものと対応しない残基にする必要がある（C Vinckeら、The Journal of Biological Chemistry 284, 3273-3284.）。
単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリから、ELISA、パニング等により取得し得る。単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリの例として、それだけに限定されないが、例えば、各種動物若しくはヒトから取得したナイーブ抗体ライブラリ（例：Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)）、各種動物を免疫することで取得した抗体ライブラリ（例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)）、または各種動物若しくはヒトの抗体遺伝子より作成した合成抗体ライブラリ（例：Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701)）が挙げられる。
本明細書において「特異的に結合する」とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態で結合することをいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
本開示の抗原結合分子における「細胞表面抗原結合ドメイン」は、細胞表面に発現する抗原中に存在するエピトープに結合することができる。「細胞表面抗原」は、細胞によって発現され、かつ抗原結合ドメインがアクセスできるようその細胞表面上に存在する抗原構造を表す。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメインを含むことから、当該細胞表面抗原を発現している細胞（標的細胞）に特異的に取り込まれる。これにより、細胞質侵入抗原結合分子の標的細胞への特異的な送達が可能となる。一態様において、細胞表面抗原結合ドメインは、一または複数の抗体の可変ドメインより提供されることができ、上述の「抗原結合ドメイン」として例示される形態のいずれであってもよい。
本開示の抗原結合分子における「細胞質抗原結合ドメイン」は、細胞質中に発現する抗原中に存在するエピトープに結合することができる。「細胞質抗原」は、細胞によって発現され、細胞質内に存在する抗原構造を表す。細胞質抗原は、タンパク質であっても良いし、DNAやRNA等の核酸であっても良いし、細胞核やミトコンドリアなどの細胞小器官に発現している分子であってもよい。本開示の細胞質抗原結合分子は、細胞質抗原結合ドメインを含むことから、標的細胞の細胞質中において当該細胞質抗原に結合し、当該抗原の機能を中和・阻害・活性化すること等が可能となる。一態様において、細胞質抗原結合ドメインは、一または複数の抗体の可変ドメインより提供されることができ、上述の「抗原結合ドメイン」として例示される形態のいずれであってもよい。さらなる一態様において、細胞質抗原結合ドメインは、酵素やshRNAなどであってもよい。
本明細書において、句「抗原結合分子が改善された（増強された）細胞質侵入能（活性）を有する」は、抗原結合分子を細胞と接触させた後の、a) 任意の時点における細胞の細胞質中の抗原結合分子量が、b) 同時点における細胞の細胞質中に存在する参照抗原結合分子量と比較して、少なくとも1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、または500％、または1000％、またはそれより多く増加していることを意味する。一態様において、参照抗原結合分子は、CDRL2、CDRL2、およびCDRL3におけるいかなる置換も含まない、配列番号：４に示されるアミノ酸配列に含まれるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む。一態様において、参照抗原結合分子は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量をHRP発光シグナルまたは蛍光シグナルまたは発光シグナルであらわす場合、抗原結合分子を細胞と接触させた後の、a) 任意の時点におけるHRP発光シグナル強度または蛍光シグナル強度または発光シグナル強度は、b) 同時点における参照抗原結合分子により得られたHRP発光シグナル強度または蛍光シグナル強度または発光シグナル強度の、0.01倍以上、0.05倍以上、0.08倍以上、0.1倍以上、0.12倍以上、0.15倍以上、0.18倍以上、0.2倍以上、0.25倍以上、0.3倍以上、0.35倍以上、0.4倍以上、0.5倍以上、0.6倍以上、0.7倍以上、0.8倍以上、0.9倍以上、1倍以上、2倍以上、5倍以上、または10倍以上である。一態様において、ビオチンライゲース（BirA）を発現する細胞を含む方法が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、HRP発光シグナルであらわすことができる。異なる一態様において、イメージング解析（実施例４に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、蛍光シグナルであらわすことができる。異なる一態様において、スプリットタンパク質システム（参考実施例１に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、発光シグナルであらわすことができる。一態様において、参照抗原結合分子は、CDRL2、CDRL2、およびCDRL3におけるいかなる置換も含まない、配列番号：４に示されるアミノ酸配列に含まれるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む。一態様において、参照抗原結合分子は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一態様において、細胞質侵入抗原結合分子が、標的細胞特異的に細胞質中に送達されるとは、細胞質侵入抗原結合分子を、標的細胞及び非標的細胞と接触させた後の、a)任意の時点における非標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量が、b)同時点における標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量と比較して、少ないこと又は実質的に減少していることをいう。好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子を非標的細胞と接触させた後、当該非標的細胞の細胞質中から当該細胞質侵入抗原結合分子は実質的に検出されない。好ましい一態様において、当該細胞は、Hela細胞株、CHO細胞株、MDCK細胞、又はHepG2細胞株に由来する、細胞表面抗原を発現する又は発現しない細胞である。細胞に接触させる細胞質侵入抗原結合分子の量は、任意に決定されてよいが、前記a)における細胞質侵入抗原結合分子量と前記b)における細胞質侵入抗原結合分子量は同量である。細胞質侵入抗原結合分子と細胞との接触は、インキュベーションを含む任意の方法で行われる。
一態様において、細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、当該細胞質侵入抗原結合分子を細胞と接触させた後、0時間後、0.25時間後、0.5時間後、1時間後、1.5時間後、2時間後、2.5時間後、3時間後、3.5時間後、4時間後、4.5時間後、5時間後、5.5時間後、6時間後、6.5時間後、7時間後、7.5時間後、8時間後、8.5時間後、9時間後、9.5時間後、10時間後、11時間後、12時間後、13時間後、14時間後、15時間後、および／または16時間後に測定される。細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、当該細胞質侵入抗原結合分子を細胞と接触させた後、一度だけ測定しても良いし、複数回測定しても良い。細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量を複数回測定することによって、時間の経過に伴う、細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量の変化を観察することが可能である。
好ましい一態様において、細胞質侵入抗原結合分子を非標的細胞及び標的細胞と接触させた後の、a)任意の時点における非標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、b)同時点における標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量の、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、または５％以下である。
一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量をHRP発光シグナルまたは蛍光シグナルまたは発光シグナルであらわす場合、細胞質侵入抗原結合分子を非標的細胞及び標的細胞と接触させた後の、a)任意の時点における非標的細胞のHRP発光シグナル強度または蛍光シグナル強度または発光シグナル強度は、b)同時点における標的細胞のHRP発光シグナル強度または蛍光シグナル強度または発光シグナル強度の、0.5倍以下、0.4倍以下、0.3倍以下、0.2倍以下、0.1倍、または0.05倍以下である。一態様において、ビオチンライゲース（BirA）を発現する細胞を含む方法が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子の量は、HRP発光シグナルであらわすことができる。異なる一態様において、イメージング解析（実施例４および参考実施例３に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子の量は、蛍光シグナルであらわすことができる。異なる一態様において、スプリットタンパク質システム（参考実施例１に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子の量は、発光シグナルであらわすことができる。
本発明の一実施態様において、細胞表面抗原結合ドメインと細胞質侵入ドメイン、細胞表面抗原結合ドメインと細胞質抗原結合ドメイン、細胞質侵入ドメインと細胞質抗原結合ドメイン、細胞表面抗原結合ドメインとFcサブユニット、細胞質侵入ドメインとFcサブユニット、細胞質抗原結合ドメインとFcサブユニットを融合するため、ペプチドリンカーを使用してもよい。また、後述する１～７の分子形を有する抗原結合分子において、1つのFab領域を別のFab領域に融合し、またはFab領域をFcサブユニットに融合するために、ペプチドリンカーを使用してよい。例えば、Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなどが含まれる。
好適なペプチドリンカーは当業者が容易に選択可能であり、１アミノ酸（Ｇｌｙなど）から２１アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸あるいは、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸または７アミノ酸から８アミノ酸をはじめとして３アミノ酸から１２アミノ酸など、異なる長さのうちからの好適なものを選択できる。
ペプチドリンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ：配列番号：１８４）ｎおよび（ＧＧＧＳ：配列番号：１７５）ｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、従来技術において周知の他の可動リンカーが挙げられる。
このうちグリシンおよびグリシン－セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
Ser
Gly・Ser（GS）
Ser・Gly（SG）
Gly・Gly・Ser（GGS）
Gly・Ser・Gly（GSG）
Ser・Gly・Gly（SGG）
Gly・Ser・Ser（GSS）
Ser・Ser・Gly（SSG）
Ser・Gly・Ser（SGS）
Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS：配列番号：１７５）
Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG：配列番号：１７６）
Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG：配列番号：１７７）
Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG：配列番号：１７８）
Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG：配列番号：１７９）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS：配列番号：１８０）
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG：配列番号：１８１）
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG：配列番号：１８２）
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG：配列番号：１８３）
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS：配列番号：１８４）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG：配列番号：１８５）
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG：配列番号：１８６）
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG：配列番号：１８７）
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG：配列番号：１８８）
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG：配列番号：１８９）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS：配列番号：１９０）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG：配列番号：１９１）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS：配列番号：１９２）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG：配列番号：１９３）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS：配列番号：１９４）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG：配列番号：１９５）)n［nは１以上の整数である］
等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
本明細書に記載のアミノ酸配列に含有されるアミノ酸は、翻訳後修飾を受けてもよい（例えば、ピログルタミル化によるN末端グルタミンのピログルタミン酸への修飾は、当業者によく知られている）。当然、翻訳後修飾されたアミノ酸を有するそのような配列もまた、本明細書に記載のアミノ酸配列に含まれる。
Ｂ．抗体
本開示のさらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗原結合分子は抗体であり、好ましい一態様において、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様において、抗原結合分子は、例えば、Fv、Fab、Fab’、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2断片などの、抗体断片（抗原結合断片）である。別の態様において、抗体は、例えば、完全IgG1抗体や、本明細書で定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプの、全長抗体である。
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗体は、単独または組み合わせで、以下の項目1～7に記載の任意の特徴を組み入れてもよい。
１．抗体の結合活性およびアフィニティ
特定の態様において、本明細書で提供される抗体の結合活性（binding activity）またはアフィニティは、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば10-9M～10-13M）の解離定数 (KD) である。
２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、およびscFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。
抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌 (E. coli) またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
３．キメラおよびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティを維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性またはアフィニティを回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体およびその作製方法は、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において総説されており、また、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)； Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)； 米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域 (specificity determining region: SDR) グラフティングを記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （リサーフェイシングを記載）； Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （FRシャッフリングを記載）；ならびに、Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （FRシャッフリングのための「ガイドセレクション」アプローチを記載）において、さらに記載されている。
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
５．ライブラリ由来抗体
本開示の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)； Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)； Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) に記載されている。
６．多機能性抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多機能性抗体である。多機能性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に、それぞれ異なる機能を有する、モノクローナル抗体である。例えば、多機能性抗体は、(i)結合特異性および(ii)結合特異性とは異なる機能、の2つの機能を有する、モノクローナル抗体である。結合特異性とは異なる機能の例として、細胞質侵入能が挙げられる。一態様において、多機能性抗体は、二重機能性抗体（抗原結合特異性および細胞質侵入能の二つの機能を有する）である。一態様において、多機能性抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。一態様において、多機能性抗体は、抗原に対する結合特異性および細胞質侵入能を有する。一態様において、多機能性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性および細胞質侵入能を有する。
多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
多機能性抗体を作製するために、上述の多重特異性抗体を作製するための手法と同様の手法が用いられ得ることが、理解されよう。
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。
本明細書で抗体または断片は、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）。
７．抗体変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性、例えば細胞質侵入能を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表１の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
Figure 2024500267000001
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
置換変異体の1つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。
改変（例えば、置換）は、例えば抗体のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望のアフィニティを有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。
変異導入のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗体の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。
ｂ）グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
抗体がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本開示の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作り出すために行われてもよい。
一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗体間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位～300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。
例えば抗体のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)； およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。
ｃ）Fc領域変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に、1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。
特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本開示の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗体がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗体がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。
減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。
FcRsへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと。）
特定の態様において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。
Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。
ｄ）システイン改変抗体変異体
特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
ｅ）抗体誘導体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
別の態様において、抗体と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗体‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。
Ｃ．組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗原結合分子をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、本開示の抗原結合分子の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗原結合分子を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗原結合分子を作製する方法が提供される。
本開示の抗原結合分子の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗原結合分子をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
本開示の抗原結合分子が抗体である場合、当該抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR－ CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
Ｄ．測定法（アッセイ）
本明細書で提供される抗原結合分子は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。
１．結合活性（binding activity）およびアフィニティの測定
一態様において、抗体の結合活性（binding activity）またはアフィニティの測定には、表面プラズモン共鳴分析法を測定原理とするBIACORE（登録商標）T200またはBIACORE（登録商標）4000（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を用いたリガンド捕捉法が用いられる。機器操作にはBIACORE（登録商標）Control Softwareが用いられる。一態様においてアミンカップリングキット（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を供給元の指示にしたがって使用し、カルボキシメチルデキストランをコーティングしたセンサーチップ（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）にリガンド捕捉用分子、たとえば抗タグ抗体、抗IgG抗体、プロテインAなど、を固相化する。リガンド捕捉分子は適切なpHの10 mM酢酸ナトリウム溶液を用いて希釈され、適切な流速および注入時間で注入される。結合活性測定は0.05％ポリソルベート20（その他の名称としてTween（登録商標）-20）含有緩衝液を測定用緩衝液として使用し、流速は10- 30 μL/分、測定温度は好ましくは25℃や37℃で測定される。リガンド捕捉用分子に抗体をリガンドとして捕捉させて測定を実施する場合は、抗体を注入して目的量を捕捉させたのち、測定用緩衝液を用いて調製された抗原およびまたはFc受容体の段階希釈物（アナライト）が注入される。リガンド捕捉用分子に抗原およびまたはFc受容体をリガンドとして捕捉させて測定を実施する場合は、抗原およびまたはFc受容体を注入して目的量を捕捉させたのち、測定用緩衝液を用いて調製された抗体の段階希釈物（アナライト）が注入される。
一態様において、測定結果はBIACORE（登録商標）Evaluation Softwareを用いて解析される。例えば、速度論的パラメータ（kinetics parameter）は1:1 Bindingのモデルを用いて、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって実施され、結合速度 (konもしくはka) 、解離速度 (koffもしくはkd)、平衡解離定数 (KD)が計算され得る。結合活性が弱い、特に解離が早く速度論的パラメータ算出が困難な場合はSteady stateモデルを用いて平衡解離定数 (KD)を計算しても良い。結合活性の他のパラメータとしては特定の濃度のアナライトの結合量（RU）をリガンドの捕捉量（RU）で除して「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」も算出され得る。
２．細胞質中の抗原結合分子の測定
一態様において、細胞質中の抗原結合分子は、当該抗原分子を細胞と接触させた後、任意の時点において測定される。抗原結合分子と細胞との接触は、インキュベーションを含む任意の方法で行われる。抗原結合分子と細胞との接触をインキュベーションによって行う場合、インキュベーション時間およびインキュベーション後、細胞質中の抗原結合分子の測定までの時間は任意に決定される。例えば、細胞質中に存在する抗原結合分子を、当該抗原結合分子を細胞と接触させた後一度だけ測定する場合は、抗原結合分子と細胞を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間インキュベートした後、抗原結合分子を含む培地を除去し、直ちに細胞質中の抗原結合分子を測定してよい。例えば、細胞質中に存在する抗原結合分子を、当該抗原結合分子を細胞と接触させた後、複数回測定する場合は、抗原結合分子と細胞を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間インキュベートした後、抗原結合分子を含む培地を除去し、抗原結合分子を含まない新たな培地で0時間、0.25時間、0.5時間、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、4.5時間、5時間、5.5時間、6時間、6.5時間、7時間、7.5時間、8時間、8.5時間、9時間、9.5時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、および／または16時間インキュベートした後、細胞質中の抗原結合分子を測定してよい。細胞質中の抗原結合分子を、当該抗原結合分子を細胞と接触させた後、任意の時点において検出することによって、当該抗原結合分子の細胞質侵入能もまた、検出するか又は評価することができる。したがって、本開示はまた、抗原結合分子の細胞質侵入能を検出する方法も提供することが、理解されよう。
a) BirA assay
一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、BirA アッセイにおいて、ビオチン化されたAvi tagと抗原結合分子の融合体を、標識されたビオチン結合タンパク質で検出することにより評価することができる。ビオチン標識されたAvi tagは、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定される。例えば、ビオチン化されたAvi tagをストレプトアビジンHRP（Streptavidin－HRP）で検出する場合、細胞質中に存在する抗原結合分子量は、HRPの発光シグナルの強度により表すことができる。BirAアッセイは当業者に公知の方法であり、例えば、W.P.R. Verdurmen et al., Journal of Controlled Release 200 (2015) 13-22、および本開示の実施例に記載されている。細胞質中に存在する抗原結合分子量を決定するためのアッセイにおいて用いられる条件は、当業者によって適宜選択され得、したがって特に限定されない。また、細胞質中においてビオチン化されたAvi tagと抗原結合分子の融合体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質でも標識され得る。具体的には、放射性標識または蛍光標識などが公知である。BirAアッセイにおける、標識されたビオチン結合タンパク質の検出（例えば、ストレプトアビジンHRPにおけるHRP発光シグナルの検出）は、当業者に公知の方法によって適宜行われ得る。具体的には、ウェスタンブロッティング（western blotting）またはキャピラリーイムノアッセイ（capillary immuno assay）（ProteinSimple社）などが公知である。
b) 蛍光顕微鏡によるイメージング
別の一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、当該抗原結合分子に結合する標識されたタンパク質で検出することにより評価することができる。例えば、抗原結合分子がIgG抗体を含む場合、細胞質中に存在する抗原結合分子を、標識された抗IgG抗体で検出することができる。標識は、例えば、放射性標識または蛍光標識などが公知である。標識された抗原結合分子の検出は、当業者に公知の方法によって適宜行われ得る。例えば、本明細書および本開示の実施例に記載されているように、蛍光顕微鏡を用いて蛍光シグナルをイメージングすることにより、標識された抗原結合分子を検出することができる。
c) Split-GFP
別の一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、split-GFP相補的システムにおいて、GFP蛍光シグナルを検出することにより評価することができる。具体的な方法は当業者に公知であり、例えば、WO2016/013870に記載されている。具体的には、緑色蛍光タンパク質であるGFPを1～10番の断片と11番の断片に分けると、蛍光を示す特性が除去されて、もし二つの断片の距離が近くなって結合すると、蛍光を示す特性を回復することができる（Cabantous et al.,2005）。このような特性を利用して、GFP1～10番の断片は、細胞質に発現させて、GFP11番の断片は、抗原結合分子の任意の部位に融合させる。この方法において、GFP蛍光が観察されれば、GFPの2つの断片が結合していること、すなわち抗原結合分子が細胞質中に存在することが示される。
d) 改善されたスプリットタンパク質システム
別の一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、スプリットタンパク質システムにおいて発光及び／又は蛍光シグナルを検出することにより評価することができる。一態様において、スプリットタンパク質システムは、(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチド、及び(ii) 発光タンパク質の第二の断片、を含み、当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片は全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する。スプリットタンパク質システムにおいて、発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片は、発光を示す特性を有さないが、ペプチドに含まれる発光タンパク質の第一の断片が発光タンパク質の第二の断片に結合すると、発光を示す特性が回復する。Nanoluc補完を用いて細胞質侵入能を評価する方法（Schaub et al., Cancer Res. (2015) 75(23):5023、Dixon et al., ACS Chem Biol. (2016) 11(2):400）が報告されたが、方法のバックグラウンドの発光及び／又は蛍光シグナルは依然として高かった。これらを考慮して、一態様において、発明者らは、ミトコンドリア外膜タンパク質をスプリットタンパク質システムにおいて用いることでバックグラウンドシグナルを低減させることを考えた。
一態様において、スプリット発光タンパク質は、Split NanoLuc（登録商標）である。NanoLucは、深海発光エビから遺伝子操作で作製された小さな19kDaのルシフェラーゼ酵素である。Split NanoLucアッセイは、2つのサブユニット：小さな1.3 kDaのSmall BiT（SmBiT）（配列番号：２０２）及びより大きな18kDaのLarge BiT（LgBiT）（配列番号：２０３）へと切断されるNanoLucを利用する。LgBiTとSmBiTとの補完は、NanoLuc Live Cell Assay System（Promega）の使用により生細胞中で、基質上での酵素反応からの発光として観察される。Split NanoLucアッセイにおいては、NanoLuc LgBiTを細胞内で安定に発現するように、HeLa細胞を遺伝子改変した。通常、NanoLuc LgBiTは、フリーの細胞質タンパク質として発現され得る。しかし、一態様において、NanoLuc LgBiTは、細胞質内の細胞内構造、例えば、ミトコンドリア外膜に係留される。発明者らは、驚くべきことに、NanoLuc LgBiTのミトコンドリア外膜への係留が、NanoLuc LgBiTがフリーの細胞質タンパク質として発現された場合と比較して、有意に低いバックグラウンドシグナル及び良好なアッセイ感度をもたらすことを発見した。他方で、SmBiTコンジュゲートを、抗原結合分子上の任意の部位に融合させることができる。好ましくは、抗原結合分子は抗体であり、発光タンパク質の第二の断片が、当該抗体の重鎖のC末端に融合されている。抗原結合分子-SmBiTコンジュゲートは、細胞質中に侵入し、それによりNanoLuc LgBiTを補完してルシフェラーゼ酵素を形成し、これは発光の促進によって検出することができる。
一例では、本開示は、(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチド、及び(ii) 発光タンパク質の第二の断片を含む、改善されたスプリットタンパク質システムであって、当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、改善されたスプリットタンパク質システムを提供する。別の一例では、本開示は、改善されたスプリットタンパク質システムにおいて用いられるペプチドであって、当該ペプチドが、ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含み、かつ当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、ペプチドを提供する。
発光タンパク質の第一の断片の例は、NanoLuc Large BiT（LgBiT）である。発光タンパク質の第二の断片の例は、NanoLuc SmBiT（SmBiT）である。さらなる一態様において、ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドは、さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体を含む。好ましくは、ミトコンドリア外膜タンパク質と、発光タンパク質の第一の断片と、GFP変異体とを含むペプチドは、配列番号：１９６のアミノ酸配列を含む。
改善されたスプリットタンパク質システムにおいて用いられるミトコンドリア外膜タンパク質は、ミトコンドリア外膜上に局在化している任意のタンパク質であることができる。ミトコンドリア外膜タンパク質は、例えば、AKAP1、BAK1、FIS1、CYB5B、FISS、FUNDC1、GDAP1、MARC1、MARC2、MFN1、MFN2、MFN3、MIEF1、MIEF2、MID49、MID51、MIGA1、MIGA2、MIRO1、MIRO2、MSTO1、MTX1、MTX2、MTX3、PGAM5、PLD6、RAB32、RMDN3、SYNJ2BP、TOM5、TOM6、TOM7、TOM20、TOM22、TOM34、TOM70、TSPO、及び／又はUBP30であることができる。
好ましい一態様において、ミトコンドリア外膜タンパク質は、追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（AKAP1；A-キナーゼアンカータンパク質1としても知られる）である。好ましい一態様において、ミトコンドリア外膜タンパク質は、配列番号：１９７のアミノ酸配列を含む。好ましい一態様において、発光タンパク質の第一の断片を含むペプチドは、配列番号：１９６のアミノ酸配列（AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit）を含む。
一態様において、本開示は、ミトコンドリア外膜タンパク質と蛍光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドをコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該核酸もしくは当該ベクターを含む細胞、又は当該タンパク質、核酸、ベクター、もしくは細胞を含むキットを提供する。さらなる態様において、本開示は、細胞質中に存在する標的分子を検出する方法であって、(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と蛍光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供すること、(ii) 蛍光タンパク質の第二の断片にコンジュゲートされた標的分子を提供すること、(iii) (i)の細胞及び(ii)の標的分子を接触させること、ならびに(iv) (iii)の細胞における発光シグナルを検出することを含み、当該蛍光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、蛍光タンパク質の完全な補完物を含有する、方法を提供する。本明細書で提供される方法は、(i)のペプチドがミトコンドリア外膜タンパク質を含まないこと以外は同じである方法と比較して、より低いバックグラウンド発光シグナルを有する。好ましい一態様において、標的分子は、細胞質侵入抗原結合分子である。
別の一態様において、改善されたスプリットタンパク質システムにおいては、細胞質内の任意の細胞内構造上に局在化している任意のタンパク質を、ミトコンドリア外膜タンパク質の代わりに用いることができる。細胞内構造上に局在化したタンパク質の例は、核外膜タンパク質であり、当該核外膜タンパク質は、核外膜上に局在化している任意のタンパク質であることができる。核外膜タンパク質は、例えば、NUP37、NUP43、NUP96、NUP85、NUP88、NUP107、NUP133、NUP160、NUP214、及び／又はNUP358であることができる。
Ｅ．抗原結合分子の製造方法およびスクリーニング方法ならびに細胞質抗原のイメージング方法
１．抗原結合分子の製造方法
一局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子の製造方法を提供する。
一態様において、前記製造方法は、
(a) 抗原結合分子をコードする遺伝子と作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクターを取得すること、
(b) 当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して前記抗原結合分子を生産させること、
(c) 宿主細胞培養物から前記抗原結合分子を回収すること
を含む。
一態様において、前記方法は、
(d) 製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子と、作動可能に連結された適切なプロモーターとを含む、発現ベクターを取得すること、
(e) 当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して、前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を生産させること、ならびに
(f) 宿主細胞培養物から、前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を回収すること
をさらに含む。
別の一態様において、前記製造方法は、
(a) 親細胞質侵入抗原結合分子を提供すること、
(b) 当該親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を導入すること、ならびに
(c) 当該親細胞質侵入抗原結合分子と比較して増強された細胞質侵入能を示す、当該1つまたは複数のアミノ酸置換を含む細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を、特定および／または選択すること
を含む。好ましい一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む。別の好ましい態様において、親細胞質侵入抗原結合分子は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域中に導入される1つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～34位および89～97位に位置する。好ましい一態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号：４に示されるアミノ酸配列におけるKabatナンバリング24～32位および93～97位に位置する。
一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域中に導入される1つまたは複数のアミノ酸置換は、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのA、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V、またはYでの置換；
(b) 25位のアミノ酸SのA、D、E、F、I、M、N、T、V、またはYでの置換；
(c) 26位のアミノ酸SのA、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T、またはVでの置換；
(d) 27位のアミノ酸QのA、D、E、F、H、I、L、M、S、またはYでの置換；
(e) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(f) 27b位のアミノ酸LのI、P、Q、T、またはVでの置換；
(g) 27c位のアミノ酸FのA、D、E、I、M、N、S、W、またはYでの置換；
(h) 27d位のアミノ酸NのA、D、E、F、H、N、またはQでの置換；
(i) 27e位のアミノ酸SのA、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V、またはYでの置換；
(j) 27f位のアミノ酸RのA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(k) 28位のアミノ酸TのE、H、I、Q、S、V、W、またはYでの置換；
(l) 29位のアミノ酸RのA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(m) 30位のアミノ酸KのA、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
(n) 31位のアミノ酸NのD、M、S、またはTでの置換；
(o) 32位のアミノ酸YのD、E、G、H、またはQでの置換；
(p) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(q) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(r) 93位のアミノ酸YのI、L、M、N、P、Q、S、T、V、またはWでの置換；
(s) 94位のアミノ酸HのA、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(t) 95位のアミノ酸MのA、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
(u) 96位のアミノ酸YのA、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T、またはVでの置換；および
(v) 97位のアミノ酸TのA、D、E、G、H、K、P、Q、R、S、またはVでの置換。
一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域中に導入される1つまたは複数のアミノ酸置換は、当該置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、抗体またはその断片の細胞質侵入活性を増強する。
一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域中に導入される1つまたは複数のアミノ酸置換は、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) 24位のアミノ酸KのNでの置換；
(b) 27位のアミノ酸QのEでの置換；
(c) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
(d) 27d位のアミノ酸NのDまたはEでの置換；
(e) 27e位のアミノ酸SのDまたはEでの置換；
(f) 27f位のアミノ酸RのD、H、K、L、S、またはVでの置換；
(g) 28位のアミノ酸TのDでの置換；
(h) 29位のアミノ酸RのE、G、M、またはSでの置換；
(i) 30位のアミノ酸KのLまたはQでの置換；
(j) 32位のアミノ酸YのEでの置換；
(k) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
(l) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
(m) 93位のアミノ酸YのEでの置換；
(n) 94位のアミノ酸HのE、P、またはQでの置換；
(o) 95位のアミノ酸MのD、N、またはPでの置換；および
(p) 96位のアミノ酸YのEまたはPでの置換。
一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域中に導入される1つまたは複数のアミノ酸置換は、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む：
(a) S27eD/R27fK；
(b) S27eD/R27fH；
(c) N27dE/S27eD；
(d) S27eD/T28D；
(e) S27eD/R29E；
(f) S27eD/R29S；
(g) K24N/S27eD；
(h) N27dD/R27fK；
(i) N27dE/R27fK；
(j) R27fK/T28D；
(k) R27fK/R29E；
(l) R27fK/R29S；
(m) K24N/R27fK；
(n) K24N/N27dD；
(o) N27dD/T28D；
(p) N27dD/R29E；
(q) N27dD/R29S；
(r) S27eD/Q89H
(s) N27dD/Q89H；
(t) R27fK/Q89H；
(u) S27eD/Y91E；
(v) N27dD/Y91E；
(w) R27fK/Y91E；
(x) Q89H/H94P；
(y) Y91E/H94P；
(z) H94P/M95N；
(aa) H94P/M95D；
(bb) H94P/M95P；
(cc) H94E/Y96P；
(dd) H94E/M95N；
(ee) H94E/M95D；
(ff) H94E/M95P；
(gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P
(lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；および
(ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
一態様において、前記方法は、軽鎖可変領域のフレームワーク領域（FR）を、ヒトフレームワーク領域（FR）によって置き換えることをさらに含む。
一態様において、前記方法は、Kabatナンバリングにしたがう、2位のアミノ酸LのIでの置換、および／または3位のアミノ酸VのQでの置換を導入することをさらに含む。
好ましい一態様において、軽鎖可変領域のFR1配列は、ヒトVκ1、Vκ2、またはVκ3 FR1配列で、より好ましくはヒトVκ1 FR1配列で置き換えられる。好ましい一態様において、軽鎖可変領域のFR2配列は、ヒトVκ1、Vκ2、またはVκ3 FR2配列で、より好ましくはヒトVκ1 FR2配列で置き換えられる。好ましい一態様において、軽鎖可変領域のFR3配列は、ヒトVκ1、Vκ2、またはVκ3 FR3配列で、より好ましくはヒトVκ3 FR3配列で置き換えられる。一態様において、軽鎖可変領域は、ヒトVκ1 FR1、ヒトVκ1 FR2、およびヒトVκ3 FR3配列を含む。
一態様において、改善された細胞質侵入能を有する抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：１２３に含まれるFRドメイン（FR1、FR2、FR3、およびFR4）のうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む。
一態様において、前記方法は、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域のCDRL2に1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換を導入することをさらに含む。好ましい一態様において、CDRL2に導入される置換は、以下からなる群（位置はKabatナンバリングにしたがう）より選択される：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL2における、
(a) 50位のアミノ酸WのA、G、I、T、またはVでの置換；
(b) 52位のアミノ酸SのFまたはIでの置換；
(c) 53位のアミノ酸TのNまたはYでの置換；および
(d) 54位のアミノ酸RのKまたはVでの置換。
好ましい一態様において、親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域中に導入されるアミノ酸置換は、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む：
配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
(a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；および
(m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１４～１５０および１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２３～１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、FabまたはscFvの形態である。一態様において、製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域をさらに含む。
２．細胞質侵入抗原結合分子のスクリーニング方法
一局面において、本開示は、細胞質侵入抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する。
一態様において、前記スクリーニング方法は、
(a) 配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む親細胞質侵入抗原結合分子を提供すること、
(b) 当該親細胞質侵入抗原結合分子の軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3から選択される少なくとも1つにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を導入すること、ならびに
(c) 当該親細胞質侵入抗原結合分子と比較して増強された細胞質侵入能を示す、当該1つまたは複数のアミノ酸置換を含む細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を、特定および／または選択すること
を含む。
一態様において、前記方法は、
(c) 製造される細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子と、作動可能に連結された適切なプロモーターとを含む、発現ベクターを取得すること、
(d) 当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して、前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を生産させること、ならびに
(e) 宿主細胞培養物から、前記細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片を回収すること
をさらに含む。
３．細胞質抗原のイメージング方法
別の一局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子、上記製造方法によって製造された抗原結合分子、または上記スクリーニング方法によって好適な分子として特定された細胞質侵入抗原結合分子を使用することを含む、細胞質抗原のイメージング方法を提供する。
別の一局面において、本開示は、サンプル細胞中の細胞質抗原のイメージングにおいて使用するための、本開示の抗原結合分子、上記製造方法によって製造された抗原結合分子、または上記スクリーニング方法によって好適な分子として特定された細胞質侵入抗原結合分子を提供する。
また別の一局面において、本開示は、細胞質抗原のイメージング剤の製造における、本開示の抗原結合分子、上記製造方法によって製造された抗原結合分子、または上記スクリーニング方法によって好適な分子として特定された細胞質侵入抗原結合分子の使用を提供する。
これらの局面の特定の態様において、使用される抗原結合分子は、標識されている。
Ｆ．イムノコンジュゲート
本開示はまた、生理活性分子にコンジュゲートされた本明細書の抗原結合分子を含むイムノコンジュゲートも提供する。一態様において、生理活性分子は、ペプチド、タンパク質、毒素、抗体、抗体断片、RNA、DNA、低分子薬物、ナノ粒子、およびリポソームからなる群より選択される。一態様において、イムノコンジュゲートは、1つまたは複数の細胞傷害剤、例えば、化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片）、または放射性同位体にコンジュゲートされた本明細書の抗原結合分子を含む。
Ｇ．抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法及び細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能を向上させる方法
一局面において、本開示は、抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的にデリバリー（送達）する方法であって、抗原結合分子が結合する細胞表面抗原は標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法を提供する。一態様において、前記方法は、抗原結合分子を標的細胞と接触させることを含む。一態様において、抗原結合分子は、細胞質侵入抗体若しくはその断片、標的細胞の細胞表面抗原に結合する抗体若しくはその断片、及び／又は、細胞質中抗原に結合する抗体若しくはその断片、を組み合わせた多機能性抗原結合分子である。特定の態様において、前記方法は、細胞表面抗原を発現しない細胞には、抗原結合分子を実質的に送達しない。特定の態様において、抗原結合分子は、標的細胞に特異的な細胞表面抗原に結合することで、当該標的細胞に特異的にインターナライズし、細胞質へ移行する。特定の態様において、抗原結合分子は、多量体を形成し、高い細胞質侵入能を呈する。
別の一局面において、本開示は、Fc領域に多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入することを含む、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能を向上させる方法を提供する。
別の一局面において、本開示は、異種の部分を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法であって、当該異種の部分が、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む抗原結合分子にコンジュゲートされている、方法を提供する。好ましくは、抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含み、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、かつ当該抗原結合分子は、異種の部分にコンジュゲートされている。より好ましくは、抗原結合分子は、二重機能性抗体であり、かつ細胞質抗原結合ドメインを含まない。一態様において、抗原結合分子が結合する細胞表面抗原は、標的細胞上に特異的に発現する抗原である。一態様において、方法は、前記異種の部分にコンジュゲートされた抗原結合分子を標的細胞と接触させることを含む。好ましい一態様において、方法は、異種の部分を標的細胞の細胞質中に特異的に送達することを含む。好ましい一態様において、方法は、細胞表面抗原を発現しない細胞には、異種の部分を実質的に送達しない。
Ｈ．細胞質抗原のターゲティングのための方法
特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、標的細胞中の細胞質抗原を除去または抑制するための、増大した能力を有する。したがって、本明細書で提供される抗原結合分子は、標的細胞中の細胞質抗原をタンパク質レベルでノックダウンするのに有用である。本明細書で用いられる用語「ノックダウン」は、特定のタンパク質の発現量または存在量が低減することを意味する。具体的には、細胞質抗原がタンパク質レベルでノックダウンされると、一細胞あたりの細胞質抗原量が低減する。別の特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、標的細胞中の細胞質抗原を活性化するための、増大した能力を有する。
Ｉ．診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、生物学的サンプルにおける標的細胞中の細胞質抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。
一態様において、診断方法または検出方法において使用するための、抗原結合分子が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプルにおける標的細胞中の細胞質抗原の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、細胞質抗原への抗原結合分子の結合が許容される条件下で本明細書に記載の抗原結合分子と生物学的サンプルを接触させること、および抗原結合分子と細胞質抗原の間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロの方法またはインビボの方法であり得る。異なる一態様において、本開示の抗原結合分子は、細胞質抗原をイメージング等の方法で検出するのに有用である。
特定の態様において、標識されている、本開示の抗原結合分子が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。
Ｊ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗原結合分子の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗原結合分子を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗原結合分子を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。
生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。
Ｋ．治療的方法および治療用組成物
一局面において、本明細書で提供される抗原結合分子は、治療的な方法において使用されてよい。
一態様において、医薬品としての使用のための、本開示の抗原結合分子が提供される。特定の態様において、治療方法における使用のための、本開示の抗原結合分子が提供される。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
さらなる局面において、本開示は医薬品の製造または調製における本開示の抗原結合分子の使用を提供する。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる局面において、本開示は、本明細書で提供される抗原結合分子の任意のものを含む、薬学的製剤を提供する（例えば上述の治療的方法の任意のものにおける使用のための）。一態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗原結合分子の任意のものと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗原結合分子の任意のものと、少なくとも1つの追加治療剤とを含む。
本開示の抗原結合分子（および、任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および経鼻投与、また局所的処置のために望まれる場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か長期かに一部応じて、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるなど、任意の好適な経路によってなされ得る。これらに限定されるものではないが、単回投与または種々の時点にわたる反復投与、ボーラス投与、および、パルス注入を含む、種々の投薬スケジュールが本明細書の考慮の内である。
本開示の抗原結合分子は、優良医療規範 (good medical practice) に一致したやり方で、製剤化され、投薬され、また投与される。この観点から考慮されるべきファクターは、治療されているその特定の障害、治療されているその特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、剤を送達する部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他のファクターを含む。抗原結合分子は、必ずしもそうでなくてもよいが、任意で、問題の障害を予防するまたは治療するために現に使用されている1つまたは複数の剤とともに、製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗原結合分子の量、障害または治療のタイプ、および上で論じた他のファクターに依存する。これらは通常、本明細書で述べたのと同じ用量および投与経路で、または本明細書で述べた用量の約1から99%で、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量および任意の経路で、使用される。
疾患の予防または治療のために、本開示の抗原結合分子の適切な用量（単独で用いられるときまたは1つまたは複数の他の追加治療剤とともに用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、本開示の抗原結合分子が抗体である場合は当該抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗原結合分子が予防的目的で投与されるのか治療的目的で投与されるのか、薬歴、患者の臨床歴および抗原結合分子に対する応答、ならびに、主治医の裁量に依存するだろう。抗原結合分子は、患者に対して、1回で、または一連の処置にわたって、好適に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1回または複数回の別々の投与によるにしても連続注入によるにしても、約1μg/kgから15 mg/kg（例えば、0.1mg/kg～10mg/kg）の抗原結合分子が、患者に対する投与のための最初の候補用量とされ得る。1つの典型的な1日用量は、上述したファクターに依存して、約1μg/kgから100mg/kg以上まで、幅があってもよい。数日またはより長くにわたる繰り返しの投与の場合、状況に応じて、治療は通常疾患症状の所望の抑制が起きるまで維持される。抗原結合分子の1つの例示的な用量は、約0.05mg/kg から約 10mg/kgの範囲内である。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、もしくは 10mg/kgの1つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）が、患者に投与されてもよい。このような用量は、断続的に、例えば1週間毎にまたは3週間毎に（例えば、患者が約2から約20、または例えば約6用量の抗原結合分子を受けるように）、投与されてもよい。高い初回負荷用量の後に、1回または複数回の低用量が投与されてもよい。この療法の経過は、従来の手法および測定法によって、容易にモニタリングされる。
上述の製剤または治療的方法のいずれについても、抗原結合分子の代わりにまたはそれに追加して、本開示のイムノコンジュゲートを用いて実施してもよいことが、理解されよう。
Ｌ．製品
本開示の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本開示の抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第一の容器であって、その中に収められた本開示の抗原結合分子を含む組成物を伴う、第一の容器；および、(b)第二の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第二の容器を含んでもよい。本開示のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
上述の製品のいずれについても、抗原結合分子の代わりにまたはそれに追加して、本開示のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが、理解されよう。
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
実施例１：親軽鎖可変領域（VL）hT4VL.FRv4の細胞質輸送能および抗体発現レベルを改善するための包括的変異導入アプローチ
本発明は、以前に報告された細胞質侵入抗体h3D8、特に、WO2016013870に開示されているh3D8の軽鎖可変領域（VL）（すなわちhT4VL）を上回る改善された細胞質透過性を有する細胞質侵入抗体、特にVLを提供し；かつ、抗原結合分子または抗体が、細胞質への改善された透過性を有することを確認した。
発明者らは、最初に、hT4VL（配列番号：１７４）の各フレームワーク（FR）を、表２に列記したように、ヒトVκ1またはVκ3の生殖系列配列に変換した。結果として、ヒトVκ3（VK3）FR3を有することによってのみhT4VLと異なるhT4VL.FRv4（配列番号：４）を、発現収率、単一のSECピークによって明らかになる凝集プロファイル、および細胞質侵入活性の組み合わせに関する最良のVL候補として、さらなる改善のために最終的に選択した。続いて、hT4VL.FRv4（配列番号：４）を、細胞質輸送能および抗体発現レベルを改善することができる変異を見出すためにCDRL1およびCDRL3におけるすべての位置にシステイン以外のアミノ酸改変を包括的に導入するための親VLとして選択した。VL変異体をコードする遺伝子を、軽鎖定常領域（KT0、配列番号：１２）と組み合わせて、Expi293細胞株（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA）を用いて重鎖発現ベクター（3D8H-SG1.SmBiTb、配列番号：１３）とともに一過性に発現させた。発現および精製は、当業者に公知の方法によって実施した。変異体の発現レベルを、表３に要約した。hT4VL.FRv4を有する親抗体と比較して発現レベルが改善された変異体を、太字で示した。細胞質輸送能を評価するために、発明者らは、参考実施例１に記載のSplit Nanoluc（Split Nluc）アッセイを実施した。
Figure 2024500267000002
Figure 2024500267000003
Figure 2024500267000004
実施例２：hT4VL.FRv4の細胞質侵入特性および他の特性を改善するアミノ酸変異を有する変異体
実施例１の結果に基づいて、複数の変異体を選択してさらなるアミノ酸変異を導入し（表５）、Ab発現レベル、細胞質輸送能、および細胞外マトリクス（ECM）結合を試験した。高いECM結合は抗体薬物動態を悪化させ得る（US2014/0080153）ため、低いECM結合を有する抗体が、より好適とみなされた。ECM結合研究は、参考実施例２に記載のように行った。結果を、表５ならびに表６－１および６－２に要約した。親抗体hT4VL.FRv4のものと比較して、より良好な抗体発現レベル、より高いsplit Nanolucシグナル、およびより低いECM結合を有する変異体を、太字で示した。酸性残基（DまたはE）は、27、27a、27d、27e、および28位（Kabatナンバリング）においてより良好であるように見え、27f位（Kabatナンバリング）のリジンまたはセリン、および94位（Kabatナンバリング）のプロリンまたはグルタミンは、それぞれの位置における有望なアミノ酸残基であるように見える。重要なことに、表６－１および６－２に列記した組み合わせ変異体のほとんどは、親Ab（hT4VL.FRv4）よりも良好なプロファイルを示した。特に、変異の組み合わせS27eD/R27fK、N27dE/R27fK、N27dD/Q89H、R27fK/Y91E、H94E/M95P、N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P、N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P、N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P、N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P、S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P、S27eD/R27fK/Y91F/H94Q、およびS27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P（Kabatナンバリング）は、低いECM結合を示す一方で、他の組み合わせと比較して、より高いSplit Nlucシグナルを示した。
Figure 2024500267000005
Figure 2024500267000006
Figure 2024500267000007
Figure 2024500267000008
実施例３：FR1変異を有する変異体
以前の報告において、hT4VLは、ヒトVK1のFR1に2つの非ヒト生殖系列残基（マウスVK1のFR1に対応する2位のロイシンおよび3位のバリン）を有するヒト化VLであり、マウス残基である2位のロイシンは、細胞質輸送活性に必要とされることが報告された（Dong-Ki Choi et al., mAbs 6:6, 1402--1414; November/December 2014；WO2016013870）。本出願の実施例１および実施例２では、同じ改変されたヒトVK1 FR1を、FRの再選択中に使用した。
実施例２において特定された28変異体を選択して、当該変異体が野生型ヒト生殖系列VK1 FR1配列を有するように、2位のロイシンのイソロイシンへの置換（L2I）および3位のバリンのグルタミンへの置換（V3Q）をFR1中に追加的に導入した（すなわち、マウス残基の、ヒトVK1 FR1の対応するヒト残基への復帰変異）（表７）。発明者らは、完全ヒトVK1 FR1を有するそのような抗体変異体が、ヒト生殖系列により近く、その結果として、より低い免疫原性リスクを有することを構想した。Ab発現レベル、細胞質輸送能、ECM結合、およびまたSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）プロファイルも、表７に示す変異体について評価された。
凝集プロファイルを、各変異体についてUPLC（Acquity H-Class bio, Waters）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）解析によって評価した。50 mMリン酸/300 mM NaCl（pH 7.0）をランニング緩衝液に用い、BEH200カラム（Waters, #186005225）を分析カラムとして用いた。クロマトグラムを、220 nM UV吸収によって記録した。Empower3ソフトウェア（Waters）を用いてデータを処理し、単量体ピークパーセンテージおよび単量体ピークの半値全幅を計算した。高い単量体ピークパーセンテージおよび鋭い対称のピーク形状（狭いピーク幅）は、良好な物理化学的特性とみなされる。SEC解析の結果を、表７に要約した（元のhT4VLと比較して、より良好なプロファイルを示した変異体を、太字で示した）。元のhT4VLの単量体ピークパーセンテージは70％よりも低く、かつその非対称のピーク形状のためにピーク幅を計算できなかったが、表７に列記した変異を有する変異体のすべては、図１に示すように、より良好な単量体ピークパーセンテージおよびより鋭いピーク形状を示した。
特に、その細胞質輸送能を保持するのにVK1 FR1の非ヒト生殖系列残基を必要とするhT4VLの場合とは対照的に、L2I/V3Q変異（野生型完全ヒトVK1 FR1配列に対応する）を有する変異体は、驚くべきことに、改善されたまたは強い細胞質輸送能（表７）、ならびに改善されたAb発現レベル、より低いECM結合、およびより良好なSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）プロファイルを示す。
すべての結果に基づいて、hT4VL.FRv40563（L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91F/H94Q、配列番号：１４５）を、さらなるCDRL2最適化のための鋳型抗体として選択した。CDRL2領域に対する包括的変異導入の結果として、いくつかの変異（例えば、W50A/G/I/T/V、S52F/I、T53N/Y、R54K/V、およびそれらの組み合わせ）は、低いECM結合を保持しながら、鋳型抗体と比較してSplit Nlucシグナルを有意に改善した（表８）。
Figure 2024500267000009
Figure 2024500267000010
Figure 2024500267000011
実施例４：細胞質侵入ドメインおよび細胞表面抗原結合ドメインを含む二重機能性抗体の調製；ならびにASGPR発現細胞株における二重機能性抗体の細胞質輸送のイメージング解析
WO2020022262に報告されているような細胞表面抗原依存的様式で二重機能性抗体を標的細胞の細胞質に特異的に送達するために、二重機能性かつ多価の抗体を、実施例３において特定された細胞質侵入抗体および細胞表面抗原に対する抗体から構築する試みを行った。
イメージング解析を実施して、受容体依存的様式での二重機能性抗体の細胞質侵入能を評価した。抗体を、Expi293細胞株（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA）を用いて一過性に発現させ、当業者に公知の方法によって精製した。表９に列記した抗体を用いて、表１０に列記した二重機能性抗体を調製した。二重機能性抗体は、当業者に公知の方法によって調製した。ASGPRを標的とするために、抗ASGPR抗体AGA0078（VH：配列番号：１５９、VL：配列番号：１５６）を用いた。
イメージング解析においては、参考実施例３に記載のASGPR発現HeLa細胞株（HeLa/ASGPR/BirA）を用いた。HeLa/ASGPR/BirA細胞を、10％ FBS（Sigma Aldrich, Cat# 172012-500ML）、Penicillin-Streptomycin（Gibco, Cat# 15140-122）、750μg/mL Geneticin（Thermo Fisher Scientific, Cat# 10131-027）、および100μg/mLのzeocin（Thermo Fisher Scientific, Cat# R25001）を含有するMinimum Essential Medium Eagle（Sigma, Cat# M4655-500ML）中で培養した。HeLa/ASGPR/BirAの懸濁物を、BioCoat Collagen I Multiwell Plates 96-well Black/clear（Corning, Cat# 354649）に50μL/ウェル（6×103細胞/ウェル）で播種した。次いで、細胞を、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で一晩培養した。培養上清を除去した後、細胞を、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で3時間、50μL/ウェルの培養培地中の3μMの抗体とインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、200 mMグリシン（Wako Pure Chemical Industries, Cat# 077-00735）-HCl（Wako Pure Chemical Industries, Cat# 083-01095）、150 mM NaCl（Wako Pure Chemical Industries, Cat# 191-01665）、pH 2.5において2回洗浄した。次いで、細胞を、4％パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝液（Nacalai Tesque, Cat# 09154-56）により室温で15分間、固定処理し、0.5％ Triton X-100（Bio-Rad, Cat# 161-0407）および5％ FBSを含有するPBSにより透過処理した。透過処理に用いた溶液は、その後の二次抗体とインキュベートする工程および洗浄する工程にも用いた。細胞を、1/500希釈したGoat Anti-Human IgG-AF488（SouthernBiotech, Cat# 2040-30）および1/2000希釈したHoechst33342（Thermo Fisher Scientific, Cat# H3570）と30分間、室温でインキュベートした。2回洗浄した後、細胞を、Operetta CLS High-Content Analysis System（Perkin Elmer）を用いたイメージング解析に供した。Alexa488の蛍光強度は、Harmonyソフトウェア（Perkin Elmer）を用いることによって評価した。
結果として、実施例３において選択した、抗ASGPR抗体（AGA0078）との二重機能性分子形式の抗体は、抗KLH抗体（IC17）との二重機能性分子形式のものよりも高いAlexa488蛍光強度を示した（図２）。これは、二重機能性抗体がASGPR依存的様式によってHeLa/ASGPR/BirA細胞中に送達され得ることを示し、実施例３においてSplit-NanoLucアッセイによって観察された受容体依存的細胞質輸送を支持する。
Figure 2024500267000012
Figure 2024500267000013
Figure 2024500267000014
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実施例５：細胞質輸送能を3D8ではない重鎖を用いて確認した
同一の3D8の重鎖（配列番号：１３）を、上記の実施例１～４に用いたが、発明者らは、実施例１～４において新しく特定された軽鎖（VL）変異体が、3D8ではない他の重鎖と組み合わせた場合にその細胞質輸送能を保持し続けるかどうかをさらに評価した。この目的のために、抗IL6R重鎖であるAL1W8P226（配列番号：１５１）を対照として用いて、実施例１～４において特定されたVL変異体と組み合わせた。抗IL6R重鎖および実施例１～４において特定されたVL変異体を含む二重機能性抗体を調製し、細胞表面上にIL6Rを内因性に発現するHepG2細胞を用いたSplit Nlucアッセイによって細胞質輸送能を試験した。結果として、AL1W8P226とともにVL変異体を含む抗体は、二価抗IL6R抗体（重鎖は配列番号：１５２、軽鎖は配列番号：１５３）と比較して、および陰性対照軽鎖IC17L（配列番号：１５４）とともにAL1W8P226を含む抗体と比較しても、より高いSplit Nlucシグナルを示し、これは、VL変異体が細胞質輸送活性を示すこと、および標的細胞（IL6R）特異的細胞質輸送が、IL6R結合によって媒介され得ることを示唆した（図３）。
実施例６：最適化された変異体の抗体薬物動態（PK）プロファイル
実施例２および実施例３において実証されるように、発明者らは、抗体PKに影響を及ぼし得るECM結合およびSECプロファイルなどの、物理化学的特性が劇的に改善された細胞侵入抗体の特定に成功した。選択された変異体のうちの1つである3D8H/hT4VL.FRv40563（VH：配列番号：１５８、VL：配列番号：１４５）を、マウス静脈内投与試験に供した。抗体投与後に、血液を経時的にサンプリングし、血漿を取得した。次いで、投与された抗体の血漿中濃度を、ELISA法によって測定した。血漿中の抗体濃度の時間経過データを、WinNonlin ver 7.0（Certara）で解析して、抗体クリアランス（CL）を計算した。結果として、新しく特定された変異体（3D8H/hT4VL.FRv40563）の抗体PKプロファイルは、3D8（3D8H/hT4VL）と比較して顕著に改善された（図１２）。さらに、細胞質侵入ドメイン（FRv40563）および細胞表面抗原結合ドメイン（抗ASGPR抗体、AGA0078）を含む二重機能性抗体のPKもまた、評価した。ASGPRは、主に肝臓において発現しており、二価抗ASGPR抗体は、非常に速い排出を示した。図１３に示すように、FRv40563n//AGA0078pは、その対照抗体FRv40563n//IC17pと比較して、より速いクリアランスを示し、二重機能性抗体FRv40563n//AGA0078pが、ASGPR依存的様式によって肝臓に送達され得ることを示唆した。加えて、FRv40563n//AGA0078pは、IC17n//AGA0078pよりも速いクリアランスを示した。これにより、インビボでのASGPR依存的な細胞質輸送を支持することができた。
参考実施例１：細胞質輸送能を評価するためのSplit NanoLucアッセイ
（１）Split NanoLucアッセイのコンセプト
NanoLucは、深海発光エビから遺伝子操作で作製された小さな19kDaのルシフェラーゼ酵素である。Split NanoLucアッセイは、2つのサブユニット：小さな1.3kDaのSmall BiT（SmBiT）及びより大きな18kDaのLarge BiT（LgBiT）へと切断されるNanoLucを利用する。LgBiTとSmBiTとの補完は、NanoLuc Live Cell Assay System（Promega）の使用により生細胞中で、基質上での酵素反応からの発光として観察される。Split NanoLucアッセイにおいては、NanoLuc LgBiTを細胞内で安定に発現するように、HeLa細胞を遺伝子改変した。NanoLuc LgBiTは、フリーの細胞質タンパク質として発現されるか、又は細胞質内の細胞内構造、例えば、ミトコンドリア外膜に係留されるかのいずれかであった。NanoLuc LgBiTのミトコンドリア外膜への係留は、NanoLuc LgBiTがフリーの細胞質タンパク質として発現された場合と比較して、有意に低いバックグラウンドシグナル及び良好なアッセイ感度をもたらした。係留されたNanoLuc LgBiTは、GFPにより測定した時、全体的により低い発現を有していたにもかかわらず、そうであった。SmBiTを、試験した抗体と融合またはコンジュゲートさせた。抗体-SmBiTコンジュゲートの細胞質中への侵入は、NanoLuc LgBiTを補完してルシフェラーゼ酵素を形成すると考えられ、これは、発光の促進によって検出することができた。
（２）細胞株の構築
ヒトASGPRを安定に発現するHeLa細胞を生成するために、Lipofectamine 3000（Invitrogen）を用いて、細胞に、それぞれ2:1の比でヒトASGPR-H1（配列番号：１９８）及びASGPR-H2（配列番号：１９９）サブユニットをコードするプラスミドをトランスフェクトした。CAGプロモーターを使用しかつネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXND3中に、ASGPR-H1およびASGPR-H2をクローニングした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria III（BD）での細胞選別により、ASGPRの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察（Solentim, Cell Metric CLD）により単一細胞クローンとして特定した。ASGPR及びeGFP-Nanoluc LgBiTの両方を発現する細胞、ならびにASGPR及びAKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiTを発現する細胞を生成するために、HeLa用のプリセットヌクレオフェクションプログラムを用いて、ASGPRを安定に発現するHeLa細胞に、Cell Line Optimization 4D-Nucleofector（商標） X Kit （Lonza）ならびに4D-Nucleofector Core unit及び4D-Nucleofector X unit（Lonza）を用いてヌクレオフェクションした。CAGプロモーターを使用しzeocin抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXZD1中に、LgBiT構築物をクローニングした。始めは、eGFPのC末端にコンジュゲートされたNanoLuc LgBiT（eGFP-NanoLuc LgBit；配列番号：２００）であった。次は、eGFPのN末端にコンジュゲートされた追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（AKAP1）を伴うもの（AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit；配列番号：１９６）であった。抗生物質耐性細胞を、FACSAria III（BD）での細胞選別により、eGFPの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察（Solentim, Cell Metric CLD）により単一細胞クローンとして特定した。
HeLa細胞を、10％ v/v胎児ウシ血清、1％ v/v MEM Non-Essential Amino Acids Solution（Gibco）、1％ v/vピルビン酸ナトリウム（Gibco）、及び1％ v/v Penicillin-Streptomycin（Gibco）を含むMinimum Essential Media（Gibco）の標準的な培養培地中で培養した。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）を発現するHeLaクローンを、1 mg/mL Geneticin（G418硫酸塩）（Gibco）を補給した標準的な培養培地で培養した。ASGPR及びeGFP-NanoLuc LgBiT、又はASGPR及びAKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiTを発現するHeLa細胞を、1 mg/mL Geneticin及び600μg/mL Zeocin（Invivogen）を含む標準的な培養培地中で培養した。すべての細胞タイプは、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で培養した。
（３）アッセイセット条件
ASGPR及びeGFP-NanoLuc LgBiTを発現するHeLa細胞（以下HeLa-Nlucと呼ぶ）、ならびにASGPR及びAKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiTを発現するHeLa細胞（以下HeLa-AKAP1_Nlucと呼ぶ）を、DPBS, no calcium, no magnesium（Gibco）でリンスした。次いで、細胞を、培養フラスコから剥離するまで、室温で0.25％ Trypsin-EDTA（Gibco）を用いてトリプシン処理した。次いで、10％ FBSを含有する過剰な培養培地中で、トリプシンを中和した。細胞を、200×gで5分間、4℃での遠心分離によってペレットにして、冷却Opti-MEM（Gibco）で2回リンスした。細胞を、1×106細胞/mLの濃度で冷却Opti-MEMに懸濁し、使用の最長30分間前から冷たく保った。試験されるべき抗体を、ヒスチジン緩衝液、20 mM His-HCl＋150 mM NaCl（ナカライテスク）において、試験濃度の11倍に希釈した。NanoLuc Live Cell Assay System（Promega, Cat#N2011）由来の5倍基質を、室温で調製した。1×105細胞を、ウェル（Perkin Elmer, Cat#6005688）当たり100μLで移動させ、10μLの11倍抗体を、細胞に直接添加して、ピペットで混合した。次いで、混合の直後に、5倍基質を細胞及び抗体の混合物に添加した。
プレートを直ちに、予め温めた37℃発光プレートリーダー（Promega, Glomax Explorer）に置いた。2ステップリードサイクルを5分おきに12サイクル行い、プレートを1分間、400 rpmで振盪した後、発光を読んだ。緩衝液ウェルに対する倍率変化を、表４～８に要約した。親抗体と比較して優れた倍率変化を示す変異体を、太字で示した。
参考実施例２：抗体の細胞外マトリクス（ECM）結合の特徴決定
ECM（細胞外マトリクス）に対する各抗体の結合を、WO2012093704 A1を参照して以下の手順によって評価した：ECM Phenol red free（BD Matrigel #356237）をTBSで2 mg/mLに希釈し、5μLを、氷上で冷却したECLアッセイプレート（L15XB-3, MSD K.K., high bind）の各ウェルの中央に添加した。次いで、コーティングされたプレートを密封し、4℃で一晩保存した。次いで、翌日、アッセイを室温で実施した。150μLのECLブロッキング緩衝液（0.5％ BSAおよび0.05％ Tween 20を補給したPBS）を、コーティングされたプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で2時間以上静置した。次に、ブロッキング緩衝液を除去した。各抗体サンプルを、ACES-Tで9μg/mLに希釈し、さらに、ECLDB（0.1％ BSAおよび0.01％ Tween 20を補給したPBS）で3μg/mLに希釈した。50μLの希釈した抗体溶液を、各ウェルに添加して、600 rpmで振盪しながら30℃で1時間インキュベートした。次いで、逆さにしたプレートを軽くたたくことによって、サンプルを除去した。次に、50μLのグルタルアルデヒドを各ウェルに添加してサンプルを固定処理し、室温で10分間インキュベートした。次いで、ウェルをPBS-T（0.05％ Tween 20を補給したPBS）で3回洗浄した。二次抗体をECLDBで1μg/mLに希釈し、50μLの二次抗体溶液を、プレートの各ウェルに添加した。プレートを密封し、光から遮蔽しながら、600 rpm、30℃で1時間インキュベートした。次に、二次抗体溶液を除去した。プレートを再度PBS-Tで3回洗浄し、その後、READ緩衝液（MSD K.K.）を150μL/ウェルで添加し、続いて、Sector Imager 2400（MSD K.K.）を用いて発光シグナルを直ちに検出した。
参考実施例３：イメージング解析のための細胞株構築
ヒトASGPRを安定に発現するHeLa細胞（HeLa/ASGPR）を生成するために、Lipofectamine 3000（Theromo Fisher Scientific）を用いて、細胞に、それぞれ2:1の比でヒトASGPR-H1（配列番号：１９８）およびASGPR-H2（配列番号：１９９）タンパク質サブユニットをコードするプラスミドをトランスフェクトした。ASGPR-H1およびASGPR-H2は、CAGプロモーターを使用しかつネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXND3中にクローニングした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria III（Beckton Dickinson）での細胞選別により、ASGPRの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈およびプレーティングによって単離し、顕微鏡観察（Solentim, Cell Metric CLD）により単一細胞クローンとして特定した。
BirAタンパク質（配列番号：２０１）をコードする遺伝子を、CAGプロモーターを使用しかつzeocin抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXZD1中にクローニングした。Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）を用いて、HeLa/ASGPR細胞に、pCXZD1 BirAプラスミドをトランスフェクトした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria IIu sorter（Beckton Dickinson）での細胞選別により、BirAの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈およびプレーティングによって単離し、顕微鏡観察により単一細胞クローンとして特定した。次いで、選択されたクローンを増大させた。抗ASGPR抗体およびGoat Anti-Human IgG-Alexa Fluor 647（Southern Biotech, Cat# 2040-31）とともにFACS Verse（Beckton Dickinson）を用いたフローサイトメトリー解析により、ASGPR発現を確認した。BirA発現もまた、Simple Western Wes（Protein Simple）を用いたキャピラリーイムノアッセイによって確認した。このASGPRおよびBirAを安定に発現するHeLa細胞株（HeLa/ASGPR/BirA）を、イメージング解析に用いた。
アッセイのために、HeLa/ASGPR/BirA細胞を、10％ FBS（Sigma Aldrich, Cat# 172012-500ML）、Penicillin-Streptomycin（Gibco, Cat# 15140-122）、750μg/mL Geneticin（Thermo Fisher Scientific, Cat# 10131-027）、および100μg/mLのzeocin（Thermo Fisher Scientific, Cat# R25001）を含有するMinimum Essential Medium Eagle（Sigma, Cat# M4655-500ML）中で培養した。

Claims (15)

  1. 配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む、細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片であって、該軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）を含む、細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
    配列番号：４に示されるアミノ酸配列における、
    (a) 24位のアミノ酸KのA、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V、またはYでの置換；
    (b) 25位のアミノ酸SのA、D、E、F、I、M、N、T、V、またはYでの置換；
    (c) 26位のアミノ酸SのA、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T、またはVでの置換；
    (d) 27位のアミノ酸QのA、D、E、F、H、I、L、M、S、またはYでの置換；
    (e) 27a位のアミノ酸SのDでの置換；
    (f) 27b位のアミノ酸LのI、P、Q、T、またはVでの置換；
    (g) 27c位のアミノ酸FのA、D、E、I、M、N、S、W、またはYでの置換；
    (h) 27d位のアミノ酸NのA、D、E、F、H、N、またはQでの置換；
    (i) 27e位のアミノ酸SのA、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V、またはYでの置換；
    (j) 27f位のアミノ酸RのA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
    (k) 28位のアミノ酸TのE、H、I、Q、S、V、W、またはYでの置換；
    (l) 29位のアミノ酸RのA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
    (m) 30位のアミノ酸KのA、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはYでの置換；
    (n) 31位のアミノ酸NのD、M、S、またはTでの置換；
    (o) 32位のアミノ酸YのD、E、G、H、またはQでの置換；
    (p) 89位のアミノ酸QのH、I、T、またはYでの置換；
    (q) 91位のアミノ酸YのE、F、またはNでの置換；
    (r) 93位のアミノ酸YのI、L、M、N、P、Q、S、T、V、またはWでの置換；
    (s) 94位のアミノ酸HのA、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
    (t) 95位のアミノ酸MのA、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYでの置換；
    (u) 96位のアミノ酸YのA、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T、またはVでの置換；および
    (v) 97位のアミノ酸TのA、D、E、G、H、K、P、Q、R、S、またはVでの置換。
  2. 前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、該置換を含まずかつ配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体またはその断片と比較して、前記抗体またはその断片の細胞質侵入活性を増強する、請求項1に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記軽鎖可変領域におけるCDRL1およびCDRL3の各々が、請求項1(a)～(v)において定義される群から選択される2つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1または2に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
    (a) S27eD/R27fK；
    (b) S27eD/R27fH；
    (c) N27dE/S27eD；
    (d) S27eD/T28D；
    (e) S27eD/R29E；
    (f) S27eD/R29S；
    (g) K24N/S27eD；
    (h) N27dD/R27fK；
    (i) N27dE/R27fK；
    (j) R27fK/T28D；
    (k) R27fK/R29E；
    (l) R27fK/R29S；
    (m) K24N/R27fK；
    (n) K24N/N27dD；
    (o) N27dD/T28D；
    (p) N27dD/R29E；
    (q) N27dD/R29S；
    (r) S27eD/Q89H；
    (s) N27dD/Q89H；
    (t) R27fK/Q89H；
    (u) S27eD/Y91E；
    (v) N27dD/Y91E；
    (w) R27fK/Y91E；
    (x) Q89H/H94P；
    (y) Y91E/H94P；
    (z) H94P/M95N；
    (aa) H94P/M95D；
    (bb) H94P/M95P；
    (cc) H94E/Y96P；
    (dd) H94E/M95N；
    (ee) H94E/M95D；
    (ff) H94E/M95P；
    (gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
    (hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
    (ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
    (jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
    (kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
    (ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
    (mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
    (nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
    (oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
    (pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
    (qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
    (rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
    (ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
    (tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
    (uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
    (vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
    (ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
    (xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
    (yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
    (zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
    (aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
    (bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
    (ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
    (ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
    (eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
    (fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
    (ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
    (hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
    (iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
    (jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
    (kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P；
    (lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
    (mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
    (nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
    (ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
    (ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
    (qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
    (rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
    (sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；および
    (ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
  5. 前記軽鎖可変領域が、ヒトフレームワーク領域（FR）を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記軽鎖可変領域が、Kabatナンバリングにしたがう、2位のアミノ酸I、および／または3位のアミノ酸Qを含む、請求項5に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  7. 前記軽鎖可変領域が、配列番号：１２３に含まれるFRドメイン（FR1、FR2、FR3、およびFR4）のうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む、請求項5に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  8. 前記軽鎖可変領域が、CDRL2における1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換をさらに含む、請求項1～7のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  9. 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択される1つ、2つ、3つ、またはそれより多いアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）をさらに含む、請求項1～8のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
    配列番号：４に示されるアミノ酸配列のCDRL2における、
    (a) 50位のアミノ酸WのA、G、I、T、またはVでの置換；
    (b) 52位のアミノ酸SのFまたはIでの置換；
    (c) 53位のアミノ酸TのNまたはYでの置換；および
    (d) 54位のアミノ酸RのKまたはVでの置換。
  10. 前記軽鎖可変領域が、以下からなる群より選択されるアミノ酸置換（位置はKabatナンバリングにしたがう）の組み合わせを含む、請求項1～9のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片：
    配列番号：４のアミノ酸配列における、
    (a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
    (b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
    (c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
    (d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
    (e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
    (f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
    (g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
    (h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
    (i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
    (j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
    (k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
    (l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；および
    (m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
  11. 配列番号：１４～１５０および１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項1～10のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  12. 配列番号：１２３～１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項11に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  13. 配列番号：１６１～１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項11に記載の細胞質侵入抗体またはその抗原結合断片。
  14. 細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン、および細胞質侵入ドメインを含む多機能性抗体であって、該細胞質侵入ドメインが、請求項1～13のいずれか一項に記載の軽鎖可変領域を含む、多機能性抗体。
  15. 請求項1～13のいずれか一項に記載の細胞質侵入抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項14に記載の多機能性抗体を含む、細胞質中への生理活性分子の送達のための組成物または医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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AU2017271189B2 (en) * 2016-05-27 2020-02-20 Orum Therapeutics Inc. Cytosol-penetrating antibody and use thereof
US20210292409A1 (en) * 2018-07-23 2021-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target cell specific cytosol-penetrating antigen-binding molecules
WO2020149613A1 (ko) * 2019-01-15 2020-07-23 오름테라퓨틱 주식회사 세포질 침투성이 증진된 항체

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