ES2929416T3 - Nuevos compuestos para el tratamiento de la obesidad - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a una construcción que comprende un compuesto que se dirige a áreas del cerebro involucradas en la regulación del peso corporal y un ligando alostérico para un receptor ubicado en la barrera hematoencefálica (BBB). La invención también se refiere a composiciones y usos de dicha construcción, por ejemplo, en la prevención o el tratamiento del sobrepeso y la obesidad. Los compuestos preferidos para la regulación del peso corporal incluyen agonistas del receptor de GLP-1 (GLP-1RA), y los receptores preferidos ubicados en la BBB incluyen el receptor de transferrina (TfR). Las fusiones y conjugados ejemplares de GLP-1 RA y anti TfR-Fab exhiben una mayor unión a regiones cerebrales que expresan el receptor GLP-1 en comparación con fusiones o conjugados con Fab de control inactivo, en particular en áreas cerebrales protegidas por la BBB. Los estudios en ratones in vivo confirman una mayor reducción en la ingesta de alimentos, así como una pérdida de peso para la construcción activa en comparación con la inactiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevos compuestos para el tratamiento de la obesidad
Campo técnico
La presente invención se refiere a compuestos novedosos para el tratamiento de la obesidad y afecciones relacionadas.
Antecedentes
La obesidad es el resultado de un balance positivo de energía a largo plazo de manera que la ingesta de energía supera el gasto. El sistema nervioso central (CNS) desempeña un papel importante en el mantenimiento del peso corporal dentro de un intervalo estrecho mediante la regulación de la ingesta de energía. Para regular la ingesta de energía, las señales, tanto neuronales como humorales, que surgen de órganos periféricos involucrados en la ingestión de alimentos transmiten información sobre el hambre y/o la saciedad al cerebro. Las hormonas derivadas del intestino, tales como el péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1) secretado pandrialmente, se han identificado como participantes en la regulación de la alimentación mediante la transmisión de información relacionada con la comida sobre el estado nutricional al cerebro (Journal of Endocrinology (2014), vol. 221(1), p. T1-T16).
La presencia de receptores de GLP-1 en el CNS y los hallazgos de estudios en animales y humanos indican que los efectos de saciedad y peso inducidos por el agonista del receptor de GLP-1 (GLP-1RA) están, al menos en parte, mediados por sus acciones en el cerebro, sin embargo, la penetración en el cerebro de GLP-1 y GLP-1RA está severamente limitada por la barrera hematoencefálica (BBB) grandemente impermeable (Journal of Clinical Investigation (2014), vol. 124(10), p.4473-4488).
Un enfoque para facilitar el suministro de proteínas terapéuticas a través de la BBB es aprovechar la transcitosis mediada por el receptor, un proceso endocítico endógeno en el que un ligando se transporta a través de una barrera celular endotelial. Entre las muchas estrategias para superar este obstáculo está utilizar vías de tráfico de transcitosis de receptores endógenos expresados en el endotelio capilar cerebral, tal como el receptor de transferrina (TfR) (Science T ranslational Medicine (2011), vol. 3(84), p. 1 -8).
El documento WO 2004/019872 A2 se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína transferrina (Tf) que muestra una glicosilación reducida fusionada a al menos una proteína o péptido terapéutico y métodos para usar la misma. El Ejemplo profético 1 se titula "proteínas de fusión GLP-1-transferrina".
La preparación de las proteínas de fusión de la transferrina con análogos de GLP-1 y exendina-4 se describe en el artículo “Transferrin Fusion Technology: A Novel Approach to Prolonging Biological Half-Life of Insulinotropic Peptides" por Byung-Joon Kim y otros, in Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 334 No. 3 (2010), p. 682-691. Estas fusiones se denominan GLP-1-Tf y Ex-4-Tf, respectivamente, y se fabricaron con una forma no glicosilada de la transferrina humana. De acuerdo con el resumen, GLP-1-Tf activó el receptor de GLP-1, fue resistente a la inactivación por peptidasas y tuvo una vida media de aproximadamente 2 días. El resumen también deja claro que las proteínas de fusión no atraviesan la barrera hematoencefálica, mientras que, por ejemplo, el GLP-1-Tf retiene las propiedades secretoras de insulina agudas dependientes de la glucosa del GLP-1 natural en animales diabéticos y tuvo un profundo efecto sobre la proliferación de las células beta pancreáticas.
El documento US 2010/0077498 A1 se refiere a composiciones y métodos para el suministro a través de la barrera hematoencefálica en el ratón.
Resumen
La presente invención se refiere a compuestos novedosos y su uso para el tratamiento de la obesidad y afecciones relacionadas.
En un aspecto, la invención se refiere a un constructo que comprende un compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal y un ligando alostérico a un receptor que se localiza en la barrera hematoencefálica (BBB), así como también sales, amidas o ésteres farmacéuticamente aceptables de estos. En otros aspectos, la invención se refiere a una composición que comprende tal constructo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, el constructo para usar como un medicamento en general y específicamente en la prevención o el tratamiento de la obesidad y afecciones relacionadas.
En un aspecto, el constructo de la invención exhibe una unión mejorada a las áreas del cerebro que están involucradas en la regulación del peso corporal. La unión se mejora en particular en áreas que están protegidas por la BBB.
En un aspecto el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal es un agonista del receptor de GLP-1 (GLP-1RA).
Por lo tanto, en un aspecto, la invención sirve para aumentar la accesibilidad de un GLP-1RA dosificado sistemáticamente a las áreas de regulación del apetito en el cerebro.
Además, o alternativamente, la invención sirve para dirigirse a poblaciones adicionales del receptor de GLP-1 (GLP-1R) en el cerebro, por ejemplo, aquellas que están protegidas por la BBB.
En un aspecto, estos efectos sobre el apetito y el peso corporal se obtienen mientras se mantiene la homeostasis de la glucosa al mismo nivel que con el tratamiento sistémico con la terapia clásica con GLP-1 (por ejemplo, con derivados de GLP-1 como liraglutida y semaglutida).
Además, o alternativamente, el constructo de la invención aumenta la unión de un GLP-1 RA dosificado sistémicamente a regiones cerebrales que expresan el GLP-1R. Esto puede demostrarse, por ejemplo, mediante un estudio como se describió en el Ejemplo 16 (ver Figura 16A).
Además, o alternativamente, el constructo de la invención aumenta la unión de un GLP-1 RA dosificado sistémicamente a regiones cerebrales que expresan el GLP-1R que están protegidas por la BBB. Esto puede demostrarse, por ejemplo, mediante un estudio como se describió en el Ejemplo 16 (ver Figura 16C).
Además, o alternativamente, en un aspecto el constructo tiene el efecto de reducir la ingestión de alimentos. Esto puede, por ejemplo, demostrarse mediante un estudio como se describió en el Ejemplo 20, parte I.
Además, o alternativamente, en un aspecto el constructo tiene el efecto de causar pérdida de peso. Esto puede demostrarse, por ejemplo, mediante un estudio como se describió en el Ejemplo 20, parte III.
En un aspecto el receptor localizado en la BBB es el receptor de transferrina (TfR).
El TfR está altamente expresado en el endotelio de la BBB y es una proteína portadora de la transferrina. La transferrina es una glicoproteína plasmática que se une al hierro que controla el nivel de hierro libre (Fe) en los fluidos biológicos. La transferrina es necesaria para la importación de hierro en la célula y está regulada por la concentración de hierro intracelular. Importa hierro mediante la internalización del complejo transferrina-hierro a través de la endocitosis mediada por receptores. La transcitosis completa a través de esta ruta del receptor parece poco probable y este es uno de los desafíos a superar para usar TfR como sistema de suministro.
Breve descripción de los dibujos
Se obtendrá una mejor comprensión de las características de la invención con referencia a la siguiente descripción detallada y las figuras adjuntas de las cuales:
La Figura 1A muestra la estructura de un anti TfR-Fab, que se preparó como se describió en el Ejemplo 1, La Figura 1B muestra la estructura de una versión marcada con fluorescencia del Fab en la Figura 1A que se usa en el Ejemplo 19,
La Figura 2 muestra la estructura de un Fab de control que no se une al TfR, que se preparó como se describió en el Ejemplo 2,
La Figura 3 muestra la estructura de un anti TfR-Fab, que se preparó como se describió en el Ejemplo 3, La Figura 4 muestra la estructura de un Fab de control que no se une al TfR, que se preparó como se describió en el Ejemplo 4,
La Figura 5 muestra la estructura de una proteína de fusión de un Fab de control y un análogo de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 5,
La Figura 6 muestra la estructura de una proteína de fusión anti TfR-Fab de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 6,
La Figura 7 muestra la estructura de una proteína de fusión Fab de control de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 7,
La Figura 8 muestra la estructura de una proteína de fusión anti TfR-Fab de GLP-1, marcada con fluorescencia, que se preparó como se describió en el Ejemplo 8,
La Figura 9 muestra la estructura de una proteína de fusión Fab de control de GLP-1 marcada con fluorescencia, que se preparó como se describió en el Ejemplo 9,
La Figura 10 muestra la estructura de un análogo de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 10, La Figura 11 muestra la estructura de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 11,
La Figura 12 muestra la estructura de un conjugado Fab de control de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 12,
La Figura 13 muestra la estructura de un derivado de un análogo de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 13,
La Figura 14 muestra la estructura de un conjugado Fab de control de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 14,
La Figura 15 muestra la estructura de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1, que se preparó como se describió en el Ejemplo 15,
La Figura 16A muestra el resultado de la obtención de imágenes in vivo de proteínas de fusión de Fab de GLP-1 marcadas fluorescentemente después de la administración aguda a ratones, más particularmente la intensidad total de las señales de fluorescencia después de la cuantificación en todas las regiones cerebrales que expresan el GLP-1R, para un constructo "activo" que se une al TfR así como también para un constructo de control "inactivo" que no se une al TfR,
La Figura 16B muestra el resultado de la obtención de imágenes in vivo de las proteínas de fusión del Fab de GLP-1 marcadas fluorescentemente después de la administración aguda a ratones, más particularmente la intensidad total de las señales de fluorescencia después de la cuantificación en órganos circunventriculares que expresan el GLP-1R pero carecen de una BBB, para un constructo "activo" que se une al TfR así como también para un constructo de control "inactivo" que no se une al Tf,
La Figura 16C muestra el resultado de la obtención de imágenes in vivo de las proteínas de fusión Fab de GLP-1 marcadas fluorescentemente después de la administración aguda a ratones, más particularmente la intensidad total de las señales de fluorescencia después de la cuantificación en estructuras cerebrales ilustrativas que están protegidas por la BBB, para un constructo "activo" que se une al TfR así como también para un constructo de control "inactivo" que no se une al TfR,
La Figura 16D muestra el resultado de la obtención de imágenes in vivo de las proteínas de fusión Fab de GLP-1 marcadas fluorescentemente después de la administración aguda a ratones, más particularmente la intensidad total de las señales de fluorescencia después de la cuantificación en regiones cerebrales que no expresan el GLP-1R, para un constructo "activo" que se une al TfR así como también para un constructo de control "inactivo" que no se une al TfR,
La Figura 17A muestra el resultado de un estudio in vivo agudo en ratones magros, más particularmente la ingestión de alimentos (FI) acumulada en g durante un período de hasta 24 horas después de la administración de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo",
La Figura 17B muestra el resultado de un estudio in vivo agudo en ratones magros, más particularmente los niveles de exposición plasmática en pM medidos durante un período de hasta 24 horas después de la dosificación de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo",
La Figura 18A muestra el resultado de un estudio in vivo agudo en ratones magros, más particularmente la ingestión de alimentos (FI) acumulada en g durante un período de 24 horas después de la administración de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo" o un conjugado anti-Fab de GLP-1 "inactivo",
La Figura 18B muestra el resultado de un estudio in vivo agudo en ratones magros, más particularmente los niveles de exposición plasmática en pM medidos durante un período de hasta 24 horas después de la dosificación de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo" o un conjugado Fab de control de GLP-1 "inactivo", La Figura 19A muestra el resultado de un estudio in vivo subcrónico en ratones obesos inducidos por dieta (DIO), más particularmente la pérdida de peso en % medido durante el período de tratamiento de 19 días con la administración una vez al día de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo" o un conjugado Fab de control "inactivo" (para más detalles ver el Ejemplo 20, parte III), y
La Figura 19B muestra el resultado de un estudio in vivo subcrónico en ratones obesos inducidos por dieta (DIO), más particularmente la exposición plasmática en pM 2 horas después de la administración en el último día del período de tratamiento (19 días con administración una vez al día de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo" o un conjugado Fab de control "inactivo".
Descripción
En lo adelante, las letras griegas pueden representarse por sus símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; 8 = delta; o = omega; etcétera. Además, la letra griega de |i puede representarse por "u", por ejemplo, en |il=ul o en |iM= uM.
En lo adelante la terminología química es como de costumbre en la técnica, por ejemplo, la designación -C(O)- se refiere a un dirradical de un grupo carbonilo:
Quím. 7:
y (COOH) como se usa por ejemplo en la designación -CH(COOH)- se refiere a un monorradical de un grupo de ácido carboxílico del Quím. 8:
que se fija al átomo de carbono que se muestra a la izquierda (CH).
Cuando se usa en la presente descripción, la palabra “una” generalmente significa “un/una o más”. Por ejemplo, el constructo de la invención (que se define como que comprende "un" compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal y "un" ligando alostérico a un receptor localizado en la barrera hematoencefálica (BBB)) puede incorporar uno o más de tales compuestos y ligandos.
A menos que se indique de otra forma en la descripción, los términos presentados en forma singular generalmente también incluyen di radical la situación en plural.
La invención también se refiere a constructos, compuestos, ligandos, GLP-1 RA, análogos de GLP-1, métodos de preparación, composiciones y usos como se describe en la presente descripción, en donde los términos abiertos como “comprende” y ”que comprende” se reemplazan por términos cerrados tales como “consiste en”, “que consiste de”, y similares.
La presente invención se refiere a compuestos novedosos y su uso para el tratamiento de la obesidad y afecciones relacionadas. Los compuestos de la invención exhiben una unión mejorada a las áreas del cerebro que están involucradas en la regulación del peso corporal. La unión se mejora en particular en áreas que están protegidas por la barrera hematoencefálica (BBB).
En un aspecto la invención se refiere a un constructo que comprende un compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal y un ligando alostérico a un receptor localizado en la BBB, así como también sales, amidas o ésteres farmacéuticamente aceptables de este.
Constructo
El término "constructo" - que comprende un compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal y un ligando alostérico a un receptor localizado en la BBB - se refiere a una entidad química (molécula) en la que el compuesto y el ligando están conectados covalentemente, opcional mente a través de un enlazador.
En una modalidad el constructo consiste en un compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal, un ligando alostérico a un receptor localizado en la BBB y un enlazador opcional. En una modalidad el compuesto y el ligando se unen directamente entre sí (ausencia del enlazador).
En otra modalidad, el compuesto y el ligando se unen entre sí a través de un enlazador.
Proteína de fusión
En una modalidad, el constructo es una proteína de fusión.
Una proteína de fusión es un compuesto que puede producirse mediante un proceso que involucra una etapa de expresión recombinante de toda la proteína de fusión en una célula hospedera.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión consiste únicamente en aminoácidos codificados.
En una modalidad la proteína que resulta de la etapa de expresión recombinante es idéntica a la proteína de fusión deseada, en cuyo caso la proteína de fusión se produce, o puede producirse, mediante un proceso "totalmente recombinante". En este caso no se necesitan más modificaciones químicas de la proteína de fusión, y la proteína de fusión expresada puede aislarse y purificarse y constituye el producto final conveniente.
Un ejemplo no limitante de una proteína de fusión es la proteína de fusión del Ejemplo 6 (Figura 6), en la que se fusiona un análogo de GLP-1, a través de un enlazador peptídico (4x(GlyGlyGlySer)), al extremo N del dominio Vl de un anti TfR-Fab. Cada una de las secuencias de aminoácidos de cada una de estas tres partes consiste completamente en aminoácidos codificados.
Conjugado
En una modalidad el constructo es un conjugado.
En una modalidad un "conjugado" no es una proteína de fusión.
En una modalidad, los enlaces covalentes entre el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas la regulación del peso corporal, el ligando alostérico y el enlazador opcional pueden formarse mediante cualquier proceso químico, excepto mediante un proceso totalmente recombinante.
En una modalidad, la fórmula estructural del conjugado incluye al menos un aminoácido no codificado. Un ejemplo no limitante de un aminoácido no codificado es el aminoácido Aib (ver, por ejemplo, el conjugado del Ejemplo 11 (Figura 11).
Además, o alternativamente, la fórmula estructural del conjugado incluye al menos un elemento que no es un aminoácido. Un ejemplo no limitante de tal elemento es un enlazador químico tal como el Quím. 1: -CH2-C(O)-(ver, por ejemplo, el conjugado del Ejemplo 11 (Figura 11) en el que un enlazador del Quím. 1 conecta el grupo épsilon amino de Lys 485 y el grupo tiol de Cys 377. Otro ejemplo no limitante de tal elemento es un enlazador químico del Quím. 2: -CH2-C(O)-Ado-gGlu-Ado (ver, por ejemplo, el conjugado del Ejemplo 15 en el que un enlazador del Quím.
2 conecta el grupo épsilon amino de Lys 438 y el grupo tiol de Cys 377.
En algunas modalidades, un conjugado puede producirse, o es, producido mediante un proceso parcialmente recombinante (por ejemplo, una parte de proteína de un conjugado deseado puede producirse, o es, producida en una etapa de expresión recombinante, y las partes restantes del conjugado deseado pueden añadirse, o se añade, en una o más etapas del proceso separadas, después de la etapa de expresión recombinante, en una o más etapas de reacción química fuera de la célula hospedera. Tales procesos de producción pueden denominarse procesos "semirrecombinantes".
Áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal
Los ejemplos no limitantes de áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal son mencionados por Bloemendaal y otros en "Effects of glucagon-like peptide 1 on appetite and body weight: focus on the CNS", Thematic Review, Journal of Endocrinology (2014), 221, T1-T16,, ver, por ejemplo, la Figura 1 en la p. T8.
En algunas modalidades, las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal incluyen, sin límite, el núcleo septal lateral (LS), el giro dentado (DG), la habénula medial (MH), y/o el núcleo parabraquial (PB) (ver Figura 16C y Ejemplo 16).
En algunas modalidades, las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal incluyen, sin límite, núcleo accumbens (ACB), núcleo dorsomedial del hipotálamo (DMH), área hipotalámica lateral (LHA) y/o habénula lateral (LH).
Regulación del peso corporal
En una modalidad, la regulación del peso corporal se refiere a la reducción del peso corporal.
En una modalidad la reducción del peso corporal puede deberse a uno o más de los siguientes: Reducción de la ingestión de alimentos, reducción de la ingestión calórica, reducción del apetito, aumento del gasto de energía y/o cambio en las preferencias alimentarias.
Por lo tanto, en algunas modalidades, la parte compuesta del constructo de la invención está dirigida a las áreas en el cerebro involucradas en a) la reducción de la ingestión de alimentos, b) la reducción de la ingestión calórica, c) la reducción del apetito, d) el aumento del gasto de energía, y/o e) el cambio en las preferencias alimentarias.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para controlar el peso. En algunas modalidades la invención se refiere a un método para reducir el apetito. En algunas modalidades la invención se refiere a un método para reducir la ingestión de alimentos.
Generalmente, todos los sujetos que padecen de obesidad se consideran, además, que sufren de sobrepeso. En algunas modalidades la invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención de la obesidad. En algunas modalidades la invención se refiere al uso de los constructos de la invención para el tratamiento o la prevención de la obesidad. En algunas modalidades el sujeto que padece de obesidad es un ser humano, tal como un ser humano adulto o un ser humano pediátrico (que incluye bebés, niños y adolescentes). El índice de Masa Corporal (IMC) es una medida de la grasa del cuerpo basada en la altura y el peso. La fórmula para su cálculo es IMC = peso en kilogramos/altura en metros2. Un sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >30; este sujeto puede referirse, además, como obeso. En algunas modalidades el sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >35 o un IMC en el intervalo de >30 a <40. En algunas modalidades la obesidad es obesidad severa u obesidad mórbida, en donde el sujeto humano puede tener un IMC de >40.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención del sobrepeso, opcionalmente en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades, la invención se refiere al uso de los constructos de la invención para el tratamiento o prevención del sobrepeso, opcionalmente en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades el sujeto que padece de sobrepeso es un ser humano, tal como un ser humano adulto o un ser humano pediátrico (que incluye bebés, niños y adolescentes). En algunas modalidades un sujeto humano que padece de sobrepeso puede tener un IMC de >25, tal como un IMC de >27. En algunas modalidades un sujeto humano que padece de sobrepeso tiene un IMC en el intervalo de 25 a <30 o en el intervalo de 27 a <30. En algunas modalidades la comorbilidad relacionada con el peso se selecciona del grupo que consiste en hipertensión, diabetes (tal como diabetes tipo 2), dislipidemia, colesterol alto y apnea obstructiva del sueño.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para la reducción del peso corporal. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del constructo de la invención para la reducción del peso corporal. Un ser humano que va a someterse a una reducción del peso corporal de acuerdo con la presente invención puede tener un IMC de >25, tal como un IMC de >27 o un IMC de >30. En algunas modalidades el ser humano que va a someterse a una reducción del peso corporal de acuerdo con la presente invención puede tener un IMC de >35 o un IMC de >40. El término “reducción del peso corporal” puede incluir el tratamiento o la prevención de la obesidad y/o el sobrepeso.
Compuestos
Los compuestos que se dirigen a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal incluyen, sin límite, hormonas derivadas del intestino que se han identificado como participantes en la regulación de la alimentación al transmitir información relacionada con las comidas sobre el estado nutricional al cerebro.
En una modalidad, el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal es una proteína. En una modalidad, el compuesto es un polipéptido. En una modalidad, el compuesto es un péptido.
En una modalidad, el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal es una hormona. En una modalidad, el compuesto es una hormona derivada del intestino. En una modalidad, la hormona se selecciona del grupo que consiste en eicosanoides, esteroides y derivados de aminoácidos/proteínas. En una modalidad, la hormona es un derivado de un aminoácido/proteína.
En una modalidad, el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal es un agonista del receptor de GLP-1 (GLP-1RA).
En una modalidad, el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal es un agente insulinotrópico. Este término se refiere a la capacidad de iniciar una vía de transducción de señales que resulta en acciones insulinotrópicas o efectos fisiológicos como se conoce en la técnica.
En una modalidad, el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal se dirige a las vías en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal. En una modalidad, el compuesto se dirige a los receptores en el cerebro involucrados en la regulación del peso corporal.
Receptor localizado en la BBB
Un receptor localizado en la barrera hematoencefálica (BBB) es un receptor endógeno que se expresa en el endotelio capilar cerebral.
En una modalidad, el receptor localizado en la BBB es el receptor de transferrina (TfR).
Alostérico/ortostérico
Un "ligando ortostérico" de un receptor es un ligando endógeno, o primario, que modula la activación del receptor. El sitio en el que un ligando ortostérico se une al receptor se designa como un "sitio ortostérico" del receptor.
Un "ligando alostérico" de un receptor se refiere a un ligando que se une en un sitio diferente al del ligando endógeno (ortostérico), a saber, a un "lugar alostérico" del receptor.
Como ejemplo, la transferrina (Tf) es el ligando ortostérico que modula la activación del receptor de transferrina (TfR), y Tf se une a un sitio ortostérico del TfR. Un ligando alostérico del TfR se une en un sitio diferente al del ligando ortostérico (Tf), a saber, a un sitio alostérico del TfR.
Agonista del receptor de GLP-1
Un agonista del receptor puede definirse como un compuesto que se une a un receptor y provoca una respuesta típica del ligando natural. Un agonista completo puede definirse como uno que provoca una respuesta de la misma magnitud que el ligando natural (ver, por ejemplo, “Principles of Biochemistry“, AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Segunda edición, Worth Publishers, 1993, página 763).
Por lo tanto, un “agonista del receptor de GLP-1” (GLP-1RA) puede definirse como un compuesto que puede unirse al receptor de GLP-1 (GLP-1R) y activarlo. Y un GLP-1RA "completo" puede definirse como un agonista del receptor de GLP-1 que puede inducir una magnitud de respuesta del receptor de GLP-1 que es similar al GLP-1 natural. En una modalidad el receptor de GLP-1 es el receptor de GLP-1 humano.
La capacidad de activar el receptor de GLP-1 humano puede determinarse adecuadamente en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano y/o en un ensayo con células completas que expresan el receptor de GLP-1 humano.
Por ejemplo, las membranas plasmáticas purificadas de una línea celular transfectada estable que expresa el receptor de GLP-1 humano pueden estimularse con el compuesto en cuestión y medirse la potencia de producción de cAMP, por ejemplo, basado en la competencia entre el cAMP formado endógenamente y el cAMP marcado con biotina añadida exógenamente, que puede capturarse mediante el uso de un anticuerpo específico.
También, o alternativamente, la respuesta del receptor de GLP-1 humano puede medirse en un ensayo de gen reportero, por ejemplo, en una línea celular BHK transfectada de forma estable que expresa el receptor de GLP-1 humano y contiene el ADN para el elemento de respuesta al cAMP (CRE) acoplado a un promotor y el gen para la luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando se produce cAMP como resultado de la activación del receptor de GLP-1 esto a su vez resulta en que se exprese la luciferasa. La luciferasa puede determinarse mediante la adición de luciferina, que mediante la enzima se convierte en oxiluciferina y produce bioluminiscencia, que se mide y es una medida de la potencia in vitro. Un ejemplo no limitante de tal ensayo se describe en el Ejemplo 17.
El término concentración efectiva semimáxima (EC50) se refiere generalmente a la concentración que induce la mitad de una respuesta entre el valor basal y el máximo, en referencia a la curva de respuesta a la dosis. La EC50 se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración en donde se observa el 50 % de su efecto máximo.
La potencia in vitro de los constructos y compuestos GLP-1RA de la invención puede determinarse como se describió anteriormente y la EC50 del compuesto o constructo en cuestión determinado. A menor valor de EC50, mejor será la potencia.
En algunas modalidades, el GLP-1RA del constructo de la invención es un análogo de GLP-1. En algunas modalidades, el GLP-1RA del constructo de la invención es un derivado de GLP-1.
Los ejemplos no limitantes de análogos de GLP-1 son aquellos de los Ejemplos 6, 10 y 13 (Figura 6, Figura 10, Figura 13), a saber, los aminoácidos 1-31 de la SEQ ID NO: 11, los aminoácidos 1-28 de la SEQ ID NO: 13, y los aminoácidos 1-31 de la SEQ ID NO: 15, respectivamente.
Un ejemplo no limitante de un derivado de GLP-1 se describe en los Ejemplos 10 y 13 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15). Estos son análogos de GLP-1 con un enlazador unido covalentemente.
Enlazador
El constructo de la invención puede incluir un enlazador que conecta el compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal con el ligando alostérico a un receptor localizado en la BBB. El enlazador es, en otras palabras, opcional.
En una modalidad el enlazador es peptídico. Un enlazador peptídico está compuesto de aminoácidos. En una modalidad el enlazador peptídico consiste en aminoácidos. En una modalidad el enlazador consiste en aminoácidos codificados.
Los ejemplos no limitantes de enlazadores peptídicos son: GQAPGQAPGQAPGQAPGQAPK (SEQ ID NO: 13) y GGGSGGGSGGGSGGGS (residuos 32-47 de la SEQ ID NO: 11), ver Ejemplos 11 y 6 (Figura 11 y Figura 6, respectivamente)).
En otra modalidad el enlazador es no peptídico o químico. Mientras que un enlazador no peptídico puede incluir residuos de aminoácidos, no consiste completamente en aminoácidos.
Los ejemplos no limitantes de enlazadores no peptídicos son: Quím. 1: -CH2-C(O)-, ver Ejemplo 11 (Figura 11), y el Quím. 2: -CH2-C(O)-Ado-gGlu-Ado-, donde Ado es un dirradical del ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, Quím. 3: -NH
(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-, y gGlu es un dirradical de ácido L-gamma-glutámico, Quím. 4: -NH-CH(COOH)-(CH2)2-C(0)-, ver Ejemplo 15 (Figura 15).
Aminoácido, péptido, proteína
Un aminoácido puede definirse como un compuesto que comprende un grupo amina y un grupo ácido carboxílico y, opcionalmente, uno o más grupos adicionales, frecuentemente referidos como una cadena lateral. El grupo amino puede, por ejemplo, ser un grupo amino primario o secundario. La prolina es un ejemplo no limitante de un aminoácido que comprende un grupo amino secundario.
Un subgrupo de aminoácidos son los a-aminoácidos donde el átomo de nitrógeno del grupo amino primario o secundario está unido al átomo de carbono a.
Un residuo de aminoácido es un radical de un aminoácido incorporado en un péptido o proteína.
Los péptidos se distinguen de los polipéptidos y las proteínas sobre la base del tamaño. En el presente contexto, a menos que se especifique de cualquier otra manera, un péptido consiste en hasta e incluye 50 residuos de aminoácidos, mientras que un polipéptido y una proteína consisten en más de 50 residuos de aminoácidos. Una proteína puede consistir en una o más cadenas de polipéptidos que pueden disponerse de una manera biológicamente funcional. En modalidades particulares, el péptido consiste en (i) al menos 2 residuos de aminoácidos, (ii) al menos 5 residuos de aminoácidos, (iii) al menos 10 residuos de aminoácidos, (iv) al menos 20 residuos de aminoácidos, (v) al menos 30 residuos de aminoácidos o (vi) al menos 40 residuos de aminoácidos. En modalidades particulares adicionales, el polipéptido consiste en (i) no más de 2000 residuos de aminoácidos, (ii) no más de 1500 residuos de aminoácidos, (iii) no más de 1000 residuos de aminoácidos o (iv) no más de 600 residuos de aminoácidos. Aún en modalidades particulares adicionales, la proteína consiste en (i) no más de 2000 residuos de aminoácidos, (ii) no más de 1500 residuos de aminoácidos, (iii) no más de 1000 residuos de aminoácidos, (iv) no más de 600 residuos de aminoácidos o (v) no más de 500 residuos de aminoácidos.
Los aminoácidos pueden clasificarse en base a su origen, como aminoácidos codificados o aminoácidos no codificados. El término aminoácidos "codificados" (a veces también denominados aminoácidos "naturales") puede definirse por referencia a IUPAC (Tabla 1 en la sección 3AA-1): (http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/AA1n2.html#AA1), que da estructura, nombre trivial, nombre sistemático, símbolos de una y tres letras para estos 20 aminoácidos. Estos son todos los a-aminoácidos.
Un ejemplo no limitante de un aminoácido no codificado es Aib, también conocido como ácido a-aminoisobutírico y con la siguiente estructura:
Quím. 6:
Péptidos y análogos de GLP-1
El término "péptido GLP-1", como se usa en la presente descripción, se refiere al Péptido 1 similar al Glucagón humano (GLP-1 (7-37)), cuya secuencia se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO: 16 o un análogo de esta. El péptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 16 también puede denominarse como GLP-1 "natural". El término “análogo GLP-1” o "análogo de GLP-1" como se usa en la presente descripción se refiere a un péptido o un compuesto que es una variante de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 16).
En el listado de secuencias, el primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 16 (histidina) se le asigna el núm. 1. Sin embargo, en lo adelante, de acuerdo con la práctica establecida en la técnica, este residuo de histidina se denomina como núm. 7 y los residuos de aminoácidos subsecuentes se numeran en consecuencia, terminando con glicina núm. 37. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripción a un número del residuo de aminoácido o a un número de la posición de la secuencia de GLP-1(7-37) es a la secuencia que comienza con His en la posición 7 y termina con Gly en la posición 37.
Los análogos de GLP-1 de los constructos y derivados de la invención pueden describirse con referencia a i) el número del residuo de aminoácido en el g LP-1(7-37) natural que corresponde al residuo de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 natural), y a ii) el cambio real.
En otras palabras, un análogo de GLP-1 es un péptido de GLP-1(7-37) en el que se han cambiado un número de residuos de aminoácidos cuando se compara con el GLP-1(7-37) natural (SEQ ID NO: 16). Estos cambios pueden representar, independientemente, una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos.
Como es evidente a partir de los ejemplos mencionados más arriba, los residuos de aminoácidos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes.
Las expresiones “una posición equivalente a” o "posición correspondiente" pueden usarse para caracterizar el sitio de cambio en una variante de secuencia de GLP-1(7-37) como referencia al GLP-1(7-37) natural (SEQ ID NO: 16). Las posiciones equivalentes o correspondientes, así como también la cantidad de cambios, se deducen fácilmente, por ejemplo, mediante simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "el alineamiento" que se basa en un algoritmo de Needleman-Wunsch. Este algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa de alineamiento por Myers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una brecha puede fijarse a -12 o preferentemente a -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una brecha a -2 o preferentemente en -0,5.
El término “péptido”, como se usa, por ejemplo, en el contexto de los análogos de GLP-1 de los derivados de la invención, se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoácidos interconectados mediante enlaces amida (o peptídicos).
Los péptidos GLP-1 de la invención comprenden al menos cinco aminoácidos constituyentes conectados mediante enlaces peptídicos. En modalidades particulares el péptido GLP-1 comprende al menos 10, preferentemente al menos 15, con mayor preferencia al menos 20, aún con mayor preferencia al menos 25 o con la máxima preferencia al menos 28 aminoácidos.
En modalidades particulares adicionales, el péptido a) se compone de, o b) consiste de, i) 29, ii) 30, iii) 31 o iv) 32 aminoácidos.
En aún otra modalidad particular el péptido consiste de aminoácidos interconectados mediante enlaces peptídicos. En lo adelante, todos los aminoácido del péptido GLP-1 para los cuales no se indica el isómero óptico, deben entenderse que se refiere al isómero L (a menos que se especifique de cualquier otra manera).
Sal farmacéuticamente aceptable, éster de amida
Los constructos de la invención pueden estar en la forma de una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable. Este es también el caso de su compuesto constituyente y partes de ligando tales como.
Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción química entre una base y un ácido, por ejemplo: 2 NH3 + H2SO4 ^ (NH4)2SO4.
La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir, una sal neutra). Las sales básicas producen iones de hidróxido y las sales ácidas iones de hidronio en agua.
Las sales pueden formarse con cationes o aniones añadidos entre grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden situarse en la parte compuesta, en la parte del ligando y/o en la parte enlazadora opcional de los constructos de la invención.
Los ejemplos no limitantes de grupos aniónicos de los constructos de la invención incluyen grupos carboxílicos libres, por ejemplo, un grupo de ácido carboxílico libre en un aminoácido en el extremo C del constructo y grupos carboxílicos libres en residuos de aminoácidos ácidos internos tales como Asp y Glu.
Los ejemplos no limitantes de grupos catiónicos incluyen un grupo amino libre en el extremo N, si está presente, así como también cualquier grupo amino libre de residuos de aminoácidos básicos internos tales como His, Arg y Lys. El éster del constructo de la invención puede, por ejemplo, formarse mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con un alcohol o un fenol, lo que conduce al reemplazo de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi.
La formación de éster puede involucrar al grupo carboxílico libre en el extremo C y/o cualquier grupo carboxílico libre internamente en el constructo.
La amida del constructo de la invención puede, por ejemplo, formarse mediante la reacción de un grupo ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.
La formación de amida puede involucrar el grupo carboxílico libre en el extremo C, cualquier grupo carboxílico libre internamente en el constructo, el grupo amino libre en el extremo N del constructo y/o cualquier grupo amino libre o sustituido internamente en el constructo.
En una modalidad particular, el constructo tiene forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad particular, el constructo tiene forma de amida farmacéuticamente aceptable, preferentemente con un grupo amida en el extremo C. Aún en una modalidad particular adicional, el constructo tiene forma de un éster farmacéuticamente aceptable.
Procesos de producción
La producción de proteínas y péptidos como los Fab de control, los anti TfR-Fab y los análogos de GLP-1 descritos en la presente descripción es bien conocida en la técnica.
Los análogos de GLP-1 pueden producirse, por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos clásica, por ejemplo, la síntesis de péptidos en fase sólida mediante el uso de la química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Editado por W.C. Chan y P. D. Blanco, Oxford University Press, 2000.
También, o alternativamente, pueden producirse mediante métodos recombinantes, respectivamente, mediante el cultivo de una célula hospedera que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos de células hospederas adecuadas para la expresión de estos péptidos no limitantes son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también líneas celulares de mamíferos BHK o CHO.
Aquellos constructos de la invención que incluyen aminoácidos no codificados pueden producirse, por ejemplo, como se describió en la parte experimental. O ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), páginas 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".
En la parte experimental se incluyen ejemplos específicos de métodos para preparar una serie de constructos. Composiciones farmacéuticas
En una modalidad, la composición de la invención es una composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un constructo de la invención o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptables de este y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden prepararse como se conoce en la técnica.
El término "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del (de los) ingrediente(s) terapéutico(s) activo(s). El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.
El excipiente puede servir para varios propósitos, por ejemplo, como portador, vehículo, diluyente, auxiliar para comprimidos, y/o para mejorar la administración y/o la absorción de la sustancia activa.
La formulación de ingredientes activos farmacéuticamente con varios excipientes es conocida en la técnica, ver, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, Edición 19 (1995), y cualquier edición posterior).
Los ejemplos no limitantes de excipientes son: Los solventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes quelantes, y estabilizadores.
Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones líquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulación líquida puede ser una solución, o una suspensión. Una formulación acuosa típicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.
Alternativamente, una composición farmacéutica puede ser una formulación sólida, por ejemplo, una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, o donde el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de usar.
Una composición farmacéutica puede comprender un tampón.
Una composición farmacéutica puede comprender un conservante.
Una composición farmacéutica puede comprender un agente quelante.
Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizador.
Una composición farmacéutica puede comprender uno o más surfactantes.
Una composición farmacéutica puede comprender uno o más inhibidores de la proteasa.
El constructo de la invención puede administrarse en la forma de una composición farmacéutica. Puede administrarse a un paciente que lo necesite en varios sitios.
La vía de administración puede ser, por ejemplo, parenteral.
Una composición puede administrarse en varias formas de dosificación, por ejemplo, como una solución; una suspensión; una emulsión; una microemulsión; múltiples emulsiones; una solución inyectable; una solución de infusión.
La administración sistémica o parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma, o por medio de una bomba de infusión.
El tratamiento con un constructo de acuerdo con la invención puede combinarse además con una o más sustancias adicionales farmacológicamente activas.
El tratamiento con un constructo de acuerdo con la invención también puede combinarse con una cirugía que influya en los niveles de glucosa y/o la homeostasis de los lípidos, tal como la banda gástrica o el bypass gástrico.
Ejemplos
Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas, y es seguida por una sección que incluye métodos generales para detectar y caracterizar los constructos de la invención. Después siguen una serie de ejemplos que se relacionan con la preparación de constructos y partes de constructos específicas, y al final se han incluido un número de ejemplos relacionados con la actividad y propiedades de estos análogos y derivados (sección encabezada por métodos farmacológicos).
Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.
Lista de abreviaturas
Ac acetil
ACB núcleo accumbens
ad lib ad libitum
Ado ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico
AOB bulbo olfatorio accesorio
AP área postrema
APN núcleo pretectal anterior
ARH núcleo hipotalámico arqueado
AU unidades arbitrarias
AUC área bajo la curva
BBB barrera hematoencefálica
BBB-R receptor de la barrera hematoencefálica
BGG gammaglobulina bovina
BHK riñón de hámster recién nacido
BMA núcleo amigdalar basomedial
BID bis in die (dos veces al día)
Boc í-butiloxicarbonilo
BrAc bromo acetamida
BST núcleos del lecho de la estría terminal
cAMP AMP cíclico
CeA núcleo central de la amígdala
Ch cadena pesada de región constante
CHO ovario de hámster chino
CL cadena ligera de región constante
CLND detección de nitrógeno quimioluminiscente
CNS sistema nervioso central
COA área amigdalar cortical
CRE elemento de respuesta cAMP
CU núcleo cuneiforme
CV coeficiente de variación
Da Dalton
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol
DBE éter dibencílico
DCM diclorometano
DF diafiltración
DG giro dentado
dH2O agua desmineralizada
DIC diisopropilcarbodiimida
DIO obesidad inducida por la dieta
DMEM medio Eagle modificado por Dulbecco
DMF dimetilformamida
DMH núcleo dorsomedial del hipotálamo
DMSO dimetilsulfóxido
DMX núcleo motor dorsal del nervio vago
DPP-4 dipeptidil peptidasa 4
DR núcleo dorsal del rafe
ECU núcleo cuneiforme externo
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
Fab fragmento de unión al antígeno (fragmento de unión al antígeno)
FI ingestión de alimentos
Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
G418 geneticina
GENd grupo geniculado, tálamo dorsal
gGlu ácido glutámico para incorporación/cuando se une a otra molécula a través de un enlace amida que involucra al grupo ácido carboxílico en la posición gamma de la cadena lateral de Glu GLP-1 péptido-1 similar al glucagón
GLP-1R receptor del péptido 1 similar al glucagón
GLP-1RA agonista del receptor del péptido 1 similar al glucagón
H horas
HBSS solución salina equilibrada de Hanks
HEK riñón embrionario humano
HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
HSA albúmina de suero humano
IgG4 subclase cuatro de inmunoglobulina G
IO complejo olivar inferior
i.v. intravenosa
L litro
LCMS espectroscopia de masas cromatografía líquida
LH habénula lateral
LHA área hipotalámica lateral
lib libitum
LOCI inmunoensayo de canalización de oxígeno por luminiscencia
LoQ límite inferior de cuantificación
LPO área preóptica lateral
LRNm núcleo reticular lateral, magnocelular
LS núcleo septal lateral
LSFM microscopía de fluorescencia de lámina de luz
ME eminencia mediana
MH habénula medial
MM núcleo mamilar medial
MPT área pretectal medial
MQ agua desionizada
dRN núcleo reticular del mesencéfalo
Mtt 4-metiltritilo
MV núcleo vestibular medial
NaP fosfato de sodio
NBF formalina tamponada neutra
NI núcleo incertus
NLL núcleo del lemnisco lateral
NTS núcleo del tracto solitario
OEG igual que Ado
O/N durante la noche
OtBu éster terc-butílico
OV órgano vascular de la lámina terminal
Oxyma Pure® éster etílico del ácido ciano-hidroxiimino-acético
PB núcleo parabraquial
Pbf 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
PBS solución salina tamponada con fosfato
Pen/strep Penicilina Estreptomicina
PFA paraformaldehído
QC control de calidad
QD quaque die (una vez al día)
QW quaque (una vez a la semana)
Rt tiempo de retención
RT temperatura ambiente
s.c. subcutáneo
SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
SEM error estándar de la media
SEC-HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño
SFO órgano subfornical
SPPS síntesis de péptidos en fase sólida
tBu terc. butilo
TCEP tris(2-carboxietil)fosfina
TEA trietanolamina
Tf transferrina
TFA ácido trifluoroacético
TfR receptor de transferrina
TFT filtración de flujo tangencial
THF tetrahidrofurano
TIC recuento total de iones
TIPS triisopropilsilano
TNP 2,4,6-trinitrofenol
Tris tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
Trt trifenilmetilo (tritilo)
Tween20 monolaurato de polietilenglicol sorbitán
UF ultrafiltración
ULoQ límite superior de cuantificación
Vl dominio variable de cadena ligera
WGA aglutinina del germen de trigo
Métodos generales de detección y caracterización
1. Métodos de LC-MS
Método: LCMS 34
Sistema Sistema de LC: Waters Acquity UPLC Clase H
Columna: : Waters Acquity BEH, C-18, 1,7 m, 2,1 mm x 50 mm Detector: : Waters Xevo G2-XS QTof
Configuración Método de ionización: ES
del detector Intervalo de barrido: 50 - 4000 amu
Modo de funcionamiento: Modo de resolución de MS
positivo/ne: modo positivo
Tensión: Capilar 3,00 kV
Cono de muestra 40 V
Fuente 80 V
Temperatura: Fuente 150C Desolvatación 500C Tiempo de escaneo 0,500 s Demora entre barridos: 0,014 s Condiciones Gradiente lineal: 5 % a 95 % de B
Tiempo de ejecución del gradiente: 4,0 minutos
Tiempo de ejecución total: 7,0 minutos
Régimen de flujo: 0,4 ml/min
Temperatura de la columna: 40C
Solvente A: Agua MQ al 99,90 %, ácido fórmico al 0,1 %
Solvente B: acetonitrilo al 99,90 %, ácido fórmico al 0,1 %
Solvente C: 99,90 % de agua MQ 0,1 % de
TFA
Gradiente: A 90-0 %
B 5-95 %
Resultados Cálculo de masa; Masa encontrada (m1/z; m2/z; Rt = xx,x mín
para cargar
Especificación La masa encontrada es la masa encontrada del compuesto
y validación La M/z encontrada es el ion molecular encontrado ((M+z)/z) del compuesto
de resultados La masa calculada es el peso molecular del compuesto deseado
La M/z calculada es el peso molecular (M+z)/z del compuesto deseado
Pureza: Corriente iónica total (TIC) AUC del pico del analito, en porcentaje del AUC total, con exclusión del pico del solvente, según lo informado por el programa informático del sistema. Identidad: La masa de cada pico de masa del analito se expresa como m/z de mayor a menor. El intervalo de barrido es el intervalo de barrido en el método usado. El método de detección es, por ejemplo, reflector lineal
Método: LCMS_36
Este protocolo describe el método de MS representado por el título del protocolo, y se usa para enlazar la descripción del método a los resultados del análisis. El método se usa para medir la pureza del analito mediante una separación cromatográfica de la muestra, y para identificar y cuantificar los componentes por sus espectros de masas y el recuento total de iones (TIC)
Sistema de LC: Waters Acquity UPLC H Class. Gradiente de etapa: del 5 % al 25 % de B 1 min 25-65 % de B 6 min
Sistema Sistema de LC: Waters Acquity UPLC Clase H
Columna: Waters Acquity BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm
Detector: Waters Xevo G2-XS QTof
Configuración Método de ionización: ES
del detector Intervalo de barrido: 50 - 4000 amu
Modo de funcionamiento: Modo de resolución
de MS
positivo/ne: modo positivo
Tensión: Capilar 3,00 kV
Cono de muestra 80 V
Fuente 60 V
Temperatura: Fuente 150 °C
Desolvatación 500 °C
Tiempo de barrido: 0,500 s
Demora entre barridos: 0,014 s
Condiciones Gradiente lineal: 5 % a 95 % de B
Tiempo de ejecución del gradiente: 4,0 minutos
Tiempo de ejecución total: 7,0 minutos
Régimen de flujo: 0,4 ml/min
Temperatura de la columna: 40 °C
Eluyentes Solvente A: Agua MQ al 99,90 %, ácido fórmico al 0,1 % Solvente B: acetonitrilo al 99,90 %, ácido fórmico al 0,1 % Solvente C: 99,99 % de agua MQ 0,01 % de TFA Gradiente: A 90-70 % 1 min 70-30 % 6 min, 30-0 %
0,5 min 0 % 0,5 min
B 5-25% 1 min 25-65 % 6 min 65-95 % 0,5 min 95 % 0,5 min
Resultados Cálculo de masa; Masa encontrada (m1/z; m2/z; ... Rt = xx,x min
para cargar
Especificación La masa encontrada es la masa encontrada del compuesto
y validación La M/z encontrada es el ion molecular encontrado ((M+z)/z) del compuesto
de resultados La masa calculada es el peso molecular del compuesto deseado
La Mz calculada es el peso molecular M+z z del compuesto deseado
Pureza: Corriente iónica total (TIC) AUC del pico del analito, en porcentaje del AUC total, con exclusión del pico del solvente, según lo informado por el programa informático del sistema. Identidad: La masa de cada pico de masa del analito se expresa como m/z de mayor a menor. El intervalo de barrido es el intervalo de barrido en el método usado. El método de detección es, por ejemplo, reflector lineal
Ejemplo 1:
Expresión transitoria de anti TfR-Fab
Este ejemplo describe la expresión transitoria del anti Tfr-Fab que se muestra en la Figura 1A (SEQ ID NO: 3). Cadena ligera (SEQ ID NO: 1):
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPS RFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Cadena pesada (SEQ ID NO: 2):
EVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNS LRSEDTAMYYCAVPTSHYVVDVWGQGVSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGCLTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK
El anti TfR-Fab se diseñó como un Fab quimérico con dominios variables, según se publicó en el documento US 2010/0077498 A1, y dominios Cl e IgG4 CH1 humanos. El dominio Ch 1 porta una mutación A158C para generar un conjunto de cisteína para la conjugación química.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anti TfR-Fab se clonaron en un vector de expresión derivado de pTT5. Para expresar el Fab, se cultivaron células HEK293 6E a una densidad celular de 1x10E6 células/ml y se transfectaron con el vector de expresión de ADN plasmídico mediante el uso de lipofectina (Invitrogen, núm. de catálogo 12347-500). El sobrenadante de la expresión se cosechó mediante centrifugación y filtrado del cultivo celular 5 días después de la transfección.
El sobrenadante de cultivo celular que contenía anti TfR-Fab secretado se aplicó a una columna de afinidad de la proteína G Sepharose 4FF (GE Healthcare) equilibrada en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El Fab unido se eluyó con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,8. Las fracciones se recolectaron y neutralizaron inmediatamente con 1/20 de volumen Tris-HCl 2 M, pH 9,0. Las fracciones agrupadas se diluyeron después en NaOAc 25 mM pH 5,0 y se aplicaron a una columna SP HP (GE Healthcare). El Fab unido se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 100 400 mM en NaOAc 25 mM pH 5,0 y se intercambió el tampón por PBS en una columna de desalinización G25 (GE Healthcare). La proteína purificada se esterilizó mediante filtración a través de una unidad de filtro de 0,2 mm (Sartorius). La pureza de anti TfR-Fab se analizó mediante SDS-PAGE y HPLC por exclusión de tamaño. La identidad del Fab se confirmó mediante espectrometría de masas.
La pureza fue superior al 95 % mediante SDS-PAGE y al 99,1 % mediante SEC-HPLC (A280 nm). La masa observada fue de 47198,3 Da, que es consistente con la masa teórica (47 198,5 Da).
Ejemplo 2:
Expresión transitoria del Fab de control
Este ejemplo describe la expresión transitoria de un Fab de control que se muestra en la Figura 2, que no se une al TfR. El Fab de control de la Figura 2 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
Cadena ligera (SEQ ID NO: 4):
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Un Fab de control se diseñó para tener los dominios variables de la cadena ligera del anticuerpo anti-TNP (SEQ ID NO: 4) y la misma cadena pesada que en el anticuerpo anti-TfR del Ejemplo 1 (SEQ ID NO: 2).
Un procedimiento similar como se describió en el Ejemplo 1 se usó para clonar y expresar el Fab de control.
La pureza fue superior al 95 % mediante SDS-PAGE y al 99,2 % mediante SEC-HPLC (A280 nm). La masa observada fue de 47787,4 Da, que es consistente con la masa teórica (477877,0 Da).
Ejemplo 3:
Generación de una línea celular estable que expresa el anti TfR-Fab
Este ejemplo describe la generación de una línea celular estable que expresa el anti TfR-Fab que se muestra en la Figura 3 (igual que se muestra en la Figura 1A, SEQ ID NO: 3).
Se generó una línea celular estable que expresa el anti TfR-Fab del Ejemplo 1 mediante el uso de una línea celular CHO K1SV GS KO con selección GS (Lonza). La cadena ligera de Fab (s Eq ID NO: 1) y la cadena pesada (SEQ ID NO: 2) con un péptido señal del extremo N de CD33 (SEQ ID NO: 17) se subclonaron en un vector pEE17.4 (Lonza). El ADN se linealizó y se transfectó en líneas celulares CHO K1SV GS KO mediante electroporación. Las celulares transfectadas en micropocillos se propagaron en medio CD CHO (Thermo Fisher Scientific) con una concentración de MSX (Sigma-Aldrich) de 25 pM durante dos semanas. Después, las células se transfirieron a placas de 96 pocillos profundos sin MSX y los 24 micropocillos con mayor expresión se seleccionaron mediante el análisis de Fortebio mediante el uso del sensor de la proteína G (Fortebio).
Para lograr una mayor estabilidad de la expresión, se aislaron clones de células individuales con los micropocillos de alta expresión seleccionadas mediante diluciones limitadas. Las células se cultivaron durante 2-3 semanas y los 96 clones individuales se recogieron y se seleccionaron mediante Foterbio. Los 24 clones principales se propagaron además en placas de 24 pocillos y se clasificaron mediante Fortebio con sensor de proteína G y análisis SdS PAGE. Se usaron seis clones de células con la mayor expresión cada uno para una prueba de estabilidad adicional. Las células antes y después de 30 días de propagación se cultivaron en cultivo de lotes alimentados para la evaluación del nivel de expresión mediante HPLC (el cultivo de lotes alimentado es un cultivo de 12 días con dos suministros de nutrientes en los días 3 y 7). Dos clones individuales fueron estables con niveles de expresión después del pase de los 30 días por encima del 70 %.
Las líneas celulares estables que expresaban los Fab se revivieron y propagaron. El cultivo celular se inoculó después en un biorreactor Sartorius de 13 L con el volumen inicial de 10,5 L en medio CD-CHO y una densidad celular de 0,3x10E6 células/ml. El cultivo de células de lotes alimentado se mantuvo a 36,5 °C, un nivel de Oxígeno Disuelto del 40 % y un pH de 7 (± 0,3). La alimentación con nutrientes se realizó en base a la densidad celular y el nivel de glucosa. El cultivo celular se cosechó después de 13 días mediante el uso del filtro de profundidad Millipore MD0HC054H1.
El Fab anti-TfR se purificó, esterilizó y analizó como se describió en el Ejemplo 1.
La pureza fue superior al 95 % mediante SDS-PAGE y al 96,7 % mediante SEC-HPLC (A280 nm). La masa observada fue de 47199,3 Da, que es consistente con la masa teórica (47198,5 Da).
Ejemplo 4:
Generación de una línea celular estable que expresa el Fab de control
Este ejemplo describe la generación de una línea celular estable que expresa el Fab de control que se muestra en la Figura 4 (igual que se muestra en la Figura 2, SEQ ID NO: 5).
Una línea celular estable que expresa el Fab de control del Ejemplo 2 se generó como se describió en el Ejemplo 3, excepto que la cadena ligera del Fab de la SEQ ID NO: 4 se usó en lugar de la SEQ ID NO: 1. También se siguieron las medidas para lograr una mayor estabilidad de expresión descritas en el Ejemplo 3. Tres clones individuales fueron estables con niveles de expresión superiores al 70 % después del pase de 30 días.
Las líneas celulares estables que expresan los Fab de control se cultivaron además en un biorreactor Sartorius de 13 L como se describió en el Ejemplo 3.
El sobrenadante de cultivo celular que contenía el Fab de control secretado se concentró y el tampón se intercambió a NaOAc 25 mM pH 5,0 mediante el uso de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) en un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (Millipore), y después se aplicó a una columna SP HP (GE Healthcare). El Fab unido se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0-350 mM en NaOAc a 25 mM pH 5,0 y se intercambió a PBS mediante el uso de UF/DF en el sistema TFF (Millipore).
El Fab de control purificado se esterilizó mediante filtración a través de una unidad de filtro de 0,2 mm (Sartorius). La pureza se analizó mediante SDS-PAGE y HPLC por exclusión de tamaño. La identidad del Fab se confirmó mediante espectrometría de masas.
La pureza fue superior al 95 % mediante SDS-PAGE y al 98,7 % mediante SEC-HPLC (A280 nm). La masa observada fue de 47787,5 Da, que es consistente con la masa teórica (47787,0 Da).
Ejemplo 5:
Expresión transitoria de la proteína de fusión anti-TNP-Fab de GLP-1
Este ejemplo describe la expresión de una proteína de fusión que se muestra en la Figura 5 (SEQ ID NO: 8) de un Fab de control y un análogo de GLP-1. El Fab de control es un Fab anti-TNP, donde TNP se refiere a 2,4,6-trinitrofenol.
Cadena ligera (SEQ ID NO: 6):
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKGRPGGGSGGGSGGGSGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYL HWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC
Cadena pesada (SEQ ID NO: 7):
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGYWNWIRQPPGKGLEWIGTISYSGDTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSV TAADTAVYYCARYGSYVFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKHHHHHHHHHH
La proteína de fusión Fab de dos cadenas está compuesta de una cadena ligera (SEQ ID NO: 6) y una cadena pesada (SEQ ID NO: 7). En la cadena ligera, un análogo de GLP-1 activo se fusiona a través de un enlazador 4x(GlyGlyGlySer) flexible, al extremo N del dominio Vl del anti TNP-Fab del Ejemplo 2 (SEQ ID NO: 4). En la cadena pesada, el extremo C del dominio Ch 1 se extiende para incluir un etiqueta de purificación 10xHistidine. Por lo tanto, la cadena ligera puede denominarse "cadena ligera GLP-1-(GGGS)4-aTNP” y la cadena pesada como "cadena pesada aTNP-(His)10”.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la fusión anti TNP-Fab se clonaron en un vector de expresión derivado de pTT como se describió en el Ejemplo 1.
Para expresar la proteína de fusión, las células Expi293F (ThermoFisher Scientific, catálogo núm. A14527) se cultivaron en cultivo en suspensión en medio Expi293 ExpressionTM (ThermoFisher Scientific, catálogo núm. A1435101) hasta una densidad celular de 3x10E6 células/ml. La transfección transitoria se realizó con una mezcla de Reactivo ExpiFectamineTM 293 (Kit de Transfección ExpiFectamineTM 293, ThermoFisher Scientific, catálogo núm. A14525) y ADN de plásmido que codifica las dos cadenas de proteínas. Los potenciadores de transfección 1 y 2 del Kit de Transfección ExpiFectamine™ 293 se añadieron el día después de la transfección. El sobrenadante de la expresión se cosechó mediante centrifugación y filtrado del cultivo celular 4 días después de la transfección. El sobrenadante de cultivo celular que contiene la proteína de fusión GLP-1 secretada anti TNP-Fab se aplicó a 2 columnas HisTrap Excel de 5 ml (Ge Healthcare) equilibradas en NaP (fosfato de sodio) 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 10 mM, pH 7,5. La proteína de fusión unida se eluyó con NaP 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM pH 7,5. Las fracciones se agruparon y se aplicaron a una columna Superdex 200 16_600 (GE Healthcare) equilibrada en PBS. La proteína purificada se esterilizó mediante filtración a través de una unidad de filtro de 0,2 pm. La pureza de la proteína de fusión se analizó mediante SDS-PAGE no reductora y produjo una única banda que indicaba >90 % de pureza y la HPLC por exclusión de tamaño mostró 12 % de especies de alto peso molecular. La identidad de la proteína de fusión se confirmó mediante espectrometría de masas. La masa promedio intacta medida 52977 Da y el mapeo de masa de péptidos trípticos (datos no mostrados) mostraron que el ácido glutámico del extremo N en el dominio Vh 1 (SEQ ID NO: 7) era de hecho un ácido piroglutámico en la proteína purificada.
Ejemplo 6:
Expresión transitoria de la proteína de fusión anti TfR-Fab de GLP-1
Este ejemplo describe la expresión de una proteína de fusión mostrada en la Figura 6 (SEQ ID NO: 11) de un anti TfR-Fab y un análogo de GLP-1.
Cadena ligera (SEQ ID NO: 9):
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKGRPGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQ KPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSE QLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKS FNRNEC
Cadena pesada (SEQ ID NO: 10):
EVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNS LRSEDTAMYYCAVPTSHYVVDVWGQGVSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHT FPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGHHHHHHHHHH
La proteína de fusión Fab de dos cadenas está compuesta de una cadena ligera (SEQ ID NO: 9) y una cadena pesada (SEQ ID NO: 10). En la cadena ligera, un análogo de GLP-1 activo se fusiona a través de un enlazador 4x(GlyGlyGlySer) flexible al extremo N del dominio Vl de un anti TfR-Fab. En la cadena pesada el extremo C del dominio Fab de Ch 1 se extiende para incluir una etiqueta para la purificación 10xHistidine. Por lo tanto, la cadena ligera puede denominarse "cadena ligera GLP-1-(GGGS)4-aTfR” y la cadena pesada como "cadena pesada aTfR-(His)10”.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican la fusión anti TfR-Fab se clonaron en un vector de expresión derivado de pTT como se describió en el Ejemplo 1.
La proteína de fusión se expresó en las células expi293F y el sobrenadante se cosechó como se describió en el Ejemplo 5.
El sobrenadante de cultivo celular que contiene la proteína de fusión GLP-1 anti TfR-Fab secretada se aplicó a 2x columnas de HisTrap Excel de 5 ml (GE Healthcare) y se purificó y se esterilizó adicionalmente como se describió en el Ejemplo 5 con la adición de un lavado riguroso con NaP (fosfato de sodio) 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 30 mM pH 7,5 antes de la elución de las columnas de HisTrap Excel.
La pureza de la proteína de fusión se analizó mediante SDS-PAGE y HPLC por exclusión de tamaño que mostró una pureza superior al 95 %. La identidad de la proteína de fusión se confirmó mediante espectrometría de masas. La masa intacta promedio se midió para ser 53 243,7 Da mediante espectrometría de masas, de esta manera confirmando la identidad de la proteína purificada.
Ejemplo 7:
Expresión transitoria de la proteína de fusión Fab de control de GLP-1
Este ejemplo describe la expresión de una proteína de fusión mostrada en la Figura 7 (SEQ ID NO: 12) de otro Fab de control y un análogo de GLP-1.
El plásmido de ADN que codifica la cadena ligera (SEQ ID NO: 6), de esta esta proteína es el mismo que se usó en el Ejemplo 5 y el plásmido de ADN que codifica la cadena pesada (SEQ ID NO: 10) de esta proteína es el mismo que se usó en el Ejemplo 6. Esto conduce a un constructo híbrido sin unión a TfR aunque todavía con un elemento GLP-1 activo similar al Fab anti-TfR de GLP-1 del Ejemplo 6 (SEQ ID NO: 11).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican la fusión del Fab de control se clonaron en un vector de expresión derivado de pTT como se describió en el Ejemplo 1.
La proteína de fusión se expresó en las células expi293F y el sobrenadante se cosechó como se describió en el Ejemplo 5.
El sobrenadante de cultivo celular que contiene la proteína de fusión secretada se aplicó a 2x columnas HisTrap Excel de 5 ml (GE Healthcare) y se purificó y se esterilizó adicionalmente como se describió en el Ejemplo 5.
La pureza de la proteína de fusión Fab se analizó mediante SDS-PAGE y HPLC por exclusión de tamaño que mostró una pureza superior al 95 %. La identidad de la proteína de fusión se confirmó mediante espectrometría de masas. La masa intacta promedio se midió para ser 53 662,9 Da mediante espectrometría de masas, de esta manera confirmando la identidad de la proteína purificada.
Ejemplo 8:
Preparación de la proteína de fusión anti TfR-Fab de GLP-1 marcada con fluorescencia
Este ejemplo describe el marcado de fluorescencia de la proteína de fusión anti TfR-Fab de GLP-1 del Ejemplo 6 (SEQ ID NO: 11). El compuesto marcado con fluorescencia se muestra en la Figura 8 (favor considere que el marcado se une aleatoriamente y no solo en el extremo N como se representa).
A 2 ml de la proteína de fusión anti TfR-Fab de GLP-1 del Ejemplo 6 (que contiene aproximadamente 92 nmol) se añadió 120 nmol de VivoTag750-NHS, que es un fluorocromo cercano al infrarrojo con una amina reactiva (éster
NHS) con el propósito de marcar biomoléculas para aplicaciones de imágenes in vivo, disponible comercialmente de PerkinElmer.
Usualmente, este marcaje con fluorescencia está unido cuantitativamente a Fab, pero en este caso solo se obtuvo un marcado muy limitado. Se añadió 600 nmol de VivoTag750-NHS y el acoplamiento procedió durante toda la noche. El día siguiente, la solución se aplicó a una columna PD-10 (GE Healthcare) que se ejecutaba en PBS y el material marcado se recolectó en 1,6 ml de PBS. La mayoría del color azul se eluyó después como etiqueta hidrolizada. La concentración se determinó a 32 nmol/ml mediante CLND (Detección de Nitrógeno Quimioluminiscente) y la solución se alicuotó en 5 tubos Eppendorf con 320 pL en cada uno y se congeló.
La LCMS mostró una mezcla de 0,1,2,3 marcas por molécula (promedio de aproximadamente 1).
Ejemplo 9:
Preparación de la proteína de fusión Fab de control de GLP-1 marcada con fluorescencia
Este ejemplo describe el marcado con fluorescencia de la proteína de fusión Fab de control de GLP-1 del Ejemplo 7 (SEQ ID NO: 12). El compuesto marcado con fluorescencia se muestra en la Figura 9 (favor considere que el marcado se une aleatoriamente y no solo en el extremo N como se representa).
A 2 ml de la proteína de fusión Fab de control de GLP-1 del Ejemplo 7 (SEQ ID NO: 12) (que contiene aproximadamente 138 nmol) se añadió 160 nmol de VivoTag750-NHS (PerkinElmer).
Como se describió en el Ejemplo 8 tuvo que añadirse una cantidad adicional del fluorocromo, en este caso 900 nmol. El acoplamiento y la recolección del material marcado fue como se describió en el Ejemplo 8 (en este caso el material marcado se recolectó en 2 ml de PBS). La mayoría del color azul se eluyó después como etiqueta hidrolizada. La concentración se determinó a 49 nmol/ml mediante CLND como se describió en el Ejemplo 8, y la solución se alicuotó en 5 tubos Eppendorf con 400 pL en cada uno y se congeló.
La LCMS mostró una mezcla de 0,1,2,3 marcas por molécula (promedio de aproximadamente 1).
Ejemplo 10:
Síntesis del péptido GLP-1 usado para la conjugación
Este ejemplo describe la síntesis de un péptido GLP-1 que se muestra en la Figura 10.
El péptido de la Figura 10 sin la derivatización de bromo acetamida (BrAc) en el grupo épsilon amino del residuo de Lys del extremo C en la posición 58 tiene la SEQ ID NO: 13 (la posición 58 corresponde a la posición 52 de la SEQ ID NO: 13).
El péptido de la SEQ ID NO: 13 puede definirse como el análogo (8Aib, 22E, 26R, 34R) de GLP-1(7-37) con un enlazador peptídico del extremo C (a saber, residuos núm. 38-58 añadidos al GLP-1(7-37), donde los residuos 38-58 corresponden a los residuos 32-52 de la SEQ ID NO: 13). El enlazador peptídico es: G-Q-A-P-G-Q-A-P-G-Q-A-P-G-Q-A-P-G-Q-A-P-K y tiene la SEQ ID NO: 14.
Los derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc usados fueron el estándar recomendado: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)- OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH y Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Aib-OH suministrado de, por ejemplo, Anaspec, Bachem, Iris Biotech o NovabioChem. Donde no se especifica nada más, se usó la forma L natural de los aminoácidos. El aminoácido en el extremo N se empleó con protección en el extremo N con un Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, Boc-His(Trt)-OH). SPPS se realizó mediante el uso de química basada en Fmoc en un sintetizador de péptidos en fase sólida SymphonyX de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 Estados Unidos). Se usó resina Fmoc-Lys(Mtt)-wang LL precargada (Novabiochem, carga de 0,33 mmol/g) para la síntesis de péptidos. La desprotección del Fmoc se logró con piperidina al 20 % en DMF. En los primeros 20 ciclos se realizaron acoplamientos dobles de péptidos durante 1 h y acoplamientos simples durante 2 h con protección con casquete (mediante el uso de anhídrido de ácido acético) en el resto. Se usó una mezcla de soluciones de Aminoácidos/Oxyma Pure/DIC (0,3 M/0,3 M/0,3 M en DMF con un exceso molar de 4 veces) para todos los acoplamientos.
La resina se transfirió a un reactor de vidrio equipado con un filtro. Se añadió solución HFIP/DCM/TIPS 75:22:3 (70 ml), se agitó durante 20 min, se filtró y se repitió 1X con 60 ml adicionales, y se lavó con DCM (3x65 ml) y DMF (3 x 65 ml).
Una mezcla de ácido bromoacético (3,0 g, 12 eq, 22 mmol) y DIC (1,39 g, 6 eq, 11 mmol) en DMF/DCM 1:1 (50 ml) se dejó reposar durante 10 minutos y se vertió sobre la resina.
En reposo O/N, agitación. Se filtró y se lavó con DMF (4x60 ml) y DCM (4 x 60 ml).
El péptido se escindió de la resina mediante agitación en una mezcla de (95 TFA: 2,5 TIPS: 2,5 agua, 80 ml) durante 3 horas a RT. Se filtró y la resina se lavó con una pequeña cantidad de TFA.
La solución se dividió en 12 viales plásticos, y se añadió éter dietílico enfriado con hielo seco (25 ml) a cada vial y se llenó con aproximadamente 20 ml adicionales de éter. El precipitado se centrifugó.
El sobrenadante se retiró y el producto se purificó en HPLC preparativa.
LCMS_34: Rt = 2,37 min, M/4 = 1378,3
Ejemplo 11:
Síntesis del conjugado anti TfR-Fab de GLP-1
Este ejemplo describe la síntesis de un conjugado de un péptido GLP-1 y un anti TfR-Fab. La estructura del conjugado se muestra en la Figura 11.
El elemento
se refiere al tripéptido de His-Aib-Glu (residuos 434-436 de la Figura 11).
La parte del extremo N de la Figura 11 (residuos 1-433) es idéntica a la anti TfR-Fab de la SEQ ID NO: 3 (ver Ejemplos 1 y 3).
La parte del extremo C de la Figura 11 (residuos 434-485) es idéntica a la SEQ ID NO: 13 (ver Ejemplo 10).
Como se muestra en la Figura 11, el grupo épsilon amino de Lys 485 y el grupo tiol de Cys 377 se interconectan a través del Quím. 1: -CH2-C(O)-.
A una solución del anti TfR-Fab del Ejemplo 3 (41 ml con 252,4 mg, 5348 nmol de anti TfR-Fab) disuelta en tampón de PBS, pH 7,4 se añadió 522 ul de un tampón EDTA 200 mM.
Se añadió TCEP (5,05 pmol/ml, 1,05 eq., 1112 pL, 5615 nmol) a la solución proteica.
Preparación de la solución TCEP: TCEp, 0,5 M, pH 7, MW: 286 g/mol.
Se diluyeron 25 pL de la solución TCEP 0,5 M con 2475 pL de tampón (tampón TEA 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8,5). Reposar aproximadamente 2-3 h o hasta la reducción completa.
El péptido del Ejemplo 10, 3,6 eq, se disolvió en DMSO (1,5 ml) y se añadió a la solución Fab y el matraz se enjuagó con un poco de tampón TRIS pH 9. El pH se ajustó con el tampón TRIS pH 9 a pH 8,3 (pH inicial = 6,5), en reposo O/N.
La mezcla de reacción se concentró al centrifugar en un filtro Vivaspin 20, 10K para dar 13 ml y se purificó en una purificadora Ákta de GE Healthcare.
Columna: Hiload 26/600, superdex 200 pg SEC
Tampón: Tampón PBS, pH 7,4
Se determinaron las siguientes características del producto resultante: LCMS_36: Rt = 3,52 min; m/30 = 1751,4; m/32 = 1642,0
Ejemplo 12:
Síntesis del conjugado Fab de control de GLP-1
Este ejemplo describe la síntesis de un conjugado de un péptido GLP-1 y un Fab de control. La estructura del conjugado se muestra en la Figura 12.
El elemento
se refiere al tripéptido de His-Aib-Glu (residuos 439-441 de la Figura 12).
Este conjugado se preparó mediante la alquilación en Cys del Fab de control del Ejemplo 4 con el péptido bromo acetil del Ejemplo 10 (Figura 10) mediante el uso del mismo protocolo como se describió en el Ejemplo 11.
La parte del extremo N de la Figura 12 (residuos 1-438) es idéntica al Fab de control de la SEQ ID NO: 5 (ver Ejemplos 2 y 4).
La parte del extremo C de la Figura 12 (residuos 439-490) es idéntica a la SEQ ID NO: 13 (ver Ejemplo 10).
Como se muestra en la Figura 12, el grupo épsilon amino de Lys 490 y el grupo tiol de Cys 382 se interconectan a través del Quím. 1: -CH2-C(O)-.
Se determinaron las siguientes características del producto resultante: LCMS_36: Rt = 3,01 min; m/29 = 1832,1; m/31 = 1713,9
Ejemplo 13:
Síntesis del péptido GLP-1 usado para la conjugación
Este ejemplo describe la síntesis de un derivado peptídico de GLP-1 de la Figura 13.
La Figura 13 incorpora el análogo de GLP-1 (8G, 22E, 26R, 34R, 36K) de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 15).
La Figura 13 incorpora además un enlazador no peptídico que puede definirse como Quím. 5: -Ado-gGlu-Ado-, donde Ado se refiere al ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico y gGlu al aminoácido Glu cuando se une a otra molécula a través de un enlace amida que involucra al grupo de ácido carboxílico en la posición gamma de la cadena lateral de Glu. Un dirradical de Ado tiene la fórmula de Quím. 3: -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-. Un dirradical de gGlu tiene la fórmula de Quím. 4: -NH-CH(COOH)-(CH2)2-C(O)-). Un Ado del enlazador se une al grupo épsilon amino del residuo de Lys en la posición 36 del análogo de GLP-1. El otro Ado del enlazador se derivatiza con bromoacetamida, para su posterior conjugación a un Fab anti-TfR o un Fab de control, como se describió en los Ejemplos 15 y 14, respectivamente.
Los derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc usados fueron el estándar recomendado: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)- OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH y Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Aib-OH suministrado de, por ejemplo, Anaspec, Bachem, Iris Biotech o NovabioChem. Donde no se especifica nada más, se usó la forma L natural de los aminoácidos. El aminoácido del extremo N se empleó con protección en el extremo N con un Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, Boc-Tyr(tBu)-OH para péptidos con Tyr en el extremo N). SPPS se realizó mediante el uso de química basada en Fmoc en un sintetizador de péptidos en fase sólida SymphonyX de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 Estados Unidos). Las resinas empleadas para la preparación del péptido del extremo C fueron la resina Fmoc-Gly-wang LL (Novabiochem, carga por ejemplo 0,29 mmol/g). La desprotección del Fmoc se logró con piperidina al 20 % en DMF. Los acoplamientos de péptidos se realizaron durante 1 h mediante el uso de soluciones de aminoácido/Oxyma Pure/DIC (0,3 M/0,3 M/0,3 M en DMF en un exceso molar de 4 veces). El grupo Mtt se eliminó mediante el lavado de la resina con HFIP/TIS/DCM (75:2,5:22,5, v/v/v) (3 x 10 ml x 30 min) antes del lavado con DCM (5 x 10 ml). La síntesis se continuó con Fmoc-Ado-OH y Fmoc-gGlu(OtBu)-OH como se describió anteriormente. La resina se transfirió a un reactor de vidrio equipado con un filtro.
Una mezcla de ácido bromoacético (0,840 g, 12 eq, 6 mmol) y DIC (0,400 ml, 5,2 eq, 2,6 mmol) en DMF (16 ml) se dejó reposar durante 10 minutos y se vertió sobre la resina. En reposo O/N. Se filtró y se lavó con DMF (4x6 ml) y DCM (4x6 ml).
El péptido se escindió de la resina mediante agitación en una mezcla de (95 TFA: 2,5 TIPS: 2,5 agua, 80 ml) durante 3 horas a RT. Se filtró y la resina se lavó con una pequeña cantidad de TFA. La solución se dividió en 12 viales de plástico y se añadió éter dietílico enfriado con hielo seco (25 ml) a cada vial y se llenó con aproximadamente 20 ml adicionales de éter. El precipitado se centrifugó. El sobrenadante se retiró y el producto se purificó en HPLC preparativa. LCMS_34: Rt = 2,45 min, M/3 = 1328,2
Ejemplo 14:
Síntesis del conjugado Fab de control de GLP-1
Este ejemplo describe la síntesis de un conjugado de un péptido GLP-1 y un Fab de control. La estructura del conjugado se muestra en la Figura 14.
Este conjugado se preparó mediante alquilación con Cys del Fab de control del Ejemplo 4 con el derivado peptídico de bromoacetilo del Ejemplo 13 (Figura 13) mediante el uso del mismo protocolo como se describió en el Ejemplo 11, excepto que en su lugar se usó el derivado peptídico del Ejemplo 13, en una cantidad de 3,6 eq.
La parte del extremo N de la Figura 14 (residuos 1-438) es idéntica al Fab de control de la SEQ ID NO: 5 (ver Ejemplos 2 y 4).
La parte del extremo C de la Figura 14 (residuos 439-469) es idéntica a la Figura 13, excepto por el hecho del Ado distal del enlazador del Quím. 5: -Ado-gGlu-Ado- que es bromo acetamida derivatizada en la Figura 13, se conecta aquí al grupo tiol de Cys 382 a través de un enlazador químico Quím. 1 (Quím. 1: -CH2-C(O)-). Por lo tanto, el enlazador completo es Quím. 2: -CH2-C(O)-Ado-gGlu-Ado-.
Se determinaron las siguientes características del producto resultante: LCMS_36: Rt = 3,14 min; m/30 = 1720,0; m/32 = 1612,6
Ejemplo 15: Síntesis del conjugado anti TfR-Fab de GLP-1
Este ejemplo describe la síntesis de un conjugado de un péptido GLP-1 y un anti TfR-Fab. La estructura del conjugado se muestra en la Figura 15.
Este conjugado se preparó mediante alquilación con Cys del anti TfR-Fab del Ejemplo 3 con el derivado peptídico de bromoacetilo del Ejemplo 13 (Figura 13) mediante el uso del mismo protocolo como se describió anteriormente para el Ejemplo 14.
La parte del extremo N de la Figura 15 (residuos 1-433) es idéntica a la anti TfR-Fab de la SEQ ID NO: 3 (ver Ejemplos 1 y 3).
La parte del extremo C de la Figura 15 (residuos 434-464) es idéntica a la Figura 13, excepto por el hecho del Ado distal del enlazador del Quím. 5: -Ado-gGlu-Ado- que fue bromo acetamida derivatizada en la Figura 13 se conecta aquí al grupo tiol de Cys 377 a través de un enlazador químico (Quím. 1: -CH2-C(O)-). Por lo tanto, el enlazador completo es Quím. 2: -CH2-C(O)-Ado-gGlu-Ado-.
Se determinaron las siguientes características del producto resultante:
LCMS_36: Rt = 3,55 min; m/30 = 1700,4; m/32 = 1594,2
Métodos farmacológicos
Ejemplo 16:
Imágenes in vivo de proteínas de fusión GLP-1 TfR marcadas con fluorescencia
Este ejemplo examina el acceso a varias áreas del cerebro que expresan el receptor de GLP-1 de una proteína de fusión GLP-1-Fab "activa" e "inactiva" ("activa" en el sentido de que se une al TfR, "inactiva" en el sentido de que no se une al TfR). Las dos proteínas de fusión incluyen uno y el mismo compuesto agonista del receptor de GLP-1 pero difieren en la parte del Fab. Esto tiene el propósito de determinar si existe una diferencia sustancial entre la proteína de fusión activa y la inactiva en su acceso a las áreas cerebrales que están protegidas por la barrera hematoencefálica (BBB). El estudio es un estudio agudo en ratones.
Administración de compuestos:
Los ratones (C57BL/6J, macho, Taconic, n=4/grupo) recibieron una dosis i.v. única de la proteína de fusión GLP-1 anti TfR-Fab marcada con fluorescencia del Ejemplo 8 ("GLP-1 TfR Activa"), 120 nmol/kg, o de la proteína de fusión Fab de control de GLP-1 marcada con fluorescencia del Ejemplo 9 ("GLP-1-TfR Inactiva"), 120 nmol/kg. Los ratones se anestesiaron con isoflurano 6 horas ("6H") después de la administración del compuesto y se sacrificaron mediante perfusión transcardíaca con 10 ml de solución salina heparinizada (10 U/ml) seguido de 10 ml de formalina 10 % neutra tamponada (NBF). Los cerebros se extrajeron y se sumergieron en NBF al 10 % y se almacenaron a 4 °C O/N hasta su posterior procesamiento.
Eliminación del tejido:
Los cerebros se deshidrataron y se saturaron en éter dibencílico (DBE) para minimizar la dispersión de la luz durante el escaneo mediante la eliminación del agua, y por coincidencia del índice refractivo. El tejido cerebral se deshidrató a temperatura ambiente en tetrahidrofurano graduado (THF) diluido en H2O desmineralizad (p/v) 50/80/96/99 % /2 x 100 % 6-12 horas para cada etapa. A continuación, los cerebros se eliminaron a temperatura ambiente en 3 x DBE durante 6-12 horas cada etapa.
Escaneo con Microscopía de Fluorescencia de Láminas Ligeras (LSFM):
Las muestras de cerebro se escanearon mediante el uso de un sistema UltraMicroscope II LSFM (Lavision Biotec, Bielefeld, Alemania) en una resolución isotrópica de 10,32 |jm. La adquisición de datos se realizó mediante el uso de un filtro de excitación de 620/60 nm y un filtro de emisión de 680/30 nm para la autofluorescencia de imágenes, y un filtro de excitación de 710/75 nm y un filtro de emisión de 780/40 nm para las señales específicas de imágenes. Análisis de imágenes:
Las imágenes son imágenes de un solo plano de un plano z (2D). Se realizó un desmezclado espectral para minimizar la contribución de la autofluorescencia del tejido en las imágenes de las señales específicas presentadas. EL desmezclado se realizó en Imaris (Versión 7.6.5, Zúrich, Suiza) sobre archivos tiff importados. La contribución de autofluorescencia estimada en el canal específico se calculó y eliminó en base a las relaciones de intensidades de vóxel entre los vóxeles seleccionados en la grabación inespecífica y los vóxeles correspondientes en el canal específico. Se calculó una relación para 40 conjuntos de vóxeles seleccionados en función del histograma de la grabación inespecífica. El algoritmo de desmezclado se escribió en Matlab (Versión 2012b, MathWorks, Natick, Massachusetts, Estados Unidos) y se aplicó como un complemento XT en Imaris.
Las imágenes se registraron en un espacio de atlas de referencia común para la visualización y cuantificación mediante el uso de la biblioteca del programa informático Elastix versión 4 (Klein, Stefan, y otros "Elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration." IEEE transactions on medical imaging 29.1 (2010): 196-205). Se registró una imagen de origen Is (x) en la imagen de atlas objetivo It (x) al encontrar una T(x) de transformación de coordenadas que hacía que Is (T(x)) se alineara espacialmente con It (x). Usamos una transformación de coordenadas afines para la inicialización seguido de una transformación de coordenadas b-spline no rígida que se optimizó iterativamente con respecto a la información mutua entre la fuente y el objetivo. Los parámetros de registro para el mapeo de los datos de LSFM fueron similares a aquellos que se usaron en Renier y otros Tras el registro de imágenes, se realizó una verificación de calidad manual para el registro correcto. Si partes de los cerebros registrados estaban fuera de alineación, se eliminaron las mediciones conectadas a estas regiones individuales. Por lo tanto, para algunas regiones cerebrales, el número de muestras varió entre 3 y 4 dentro de cada grupo. La cuantificación se realizó mediante la suma del valor de intensidad no mezclado de todos los vóxeles dentro de las regiones cerebrales individuales, lo que indica la señal de fluorescencia total de los compuestos en estas regiones. La señal total se informó en unidades arbitrarias (“AU”). La señal total es una suma de los valores de intensidad de vóxeles no mezclados en regiones cerebrales individuales. La señal total indica, por lo tanto, la señal de fluorescencia total de los compuestos en estas regiones. (Renier, Nicolas, y otros "Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes." Cell (2016)).
Resultados:
Los resultados de los análisis de imágenes se muestran en las Figuras 16A, 16B, 16C y 16D.
En la Figura 16A, la intensidad total de los compuestos marcados con fluorescencia ("TfR GLP-1 Activo" y "TfR GLP-1 Inactivo") se cuantificó en regiones cerebrales que expresaban el receptor de GLP-1 (GLP-1R). La señal total se informó en unidades arbitrarias (AU) y representa los promedios. La Figura 16B muestra la intensidad de compuestos marcados con fluorescencia en ejemplos de órganos circunventriculares que expresan el GLP-1R pero desprovistos de una BBB. La Figura 16C muestra la intensidad de compuestos marcados con fluorescencia en ejemplos de estructuras cerebrales que expresan el GLP-1R que están protegidas por la BBB. La Figura 16D muestra la intensidad de compuestos marcados con fluorescencia en ejemplos de regiones cerebrales que no expresan el GLP-1R. Las abreviaturas usadas para las diversas regiones cerebrales se definen en la lista de abreviaturas.
La Figura 16A muestra que en las regiones de expresión de GLP-1R las señales de fluorescencia fueron mayores a partir del TfR GLP-1 Activo en comparación con el TfR GLP-1 Inactivo.
Las diferencias entre los compuestos TfR activos e inactivos fueron más pequeñas en los órganos circunventriculares que expresan el GLP-1R pero desprovistos de una BBB (Figura 16B). El TfR se expresa tanto en los capilares como en el parénquima cerebral. Por lo tanto, la contribución ligeramente mayor del compuesto TfR activo en estas regiones indica la contribución de la unión del TfR de los compuestos además de la unión por el GLP-1R.
Las señales también se cuantificaron en regiones cerebrales que no expresan el GLP-1R (Figura 16D). Aquí las señales fueron casi las mismas con ambos compuestos donde la contribución ligeramente mayor del compuesto TfR activo nuevamente indica la contribución de la unión del TfR de los compuestos.
Un ejemplo de estructuras cerebrales que están protegidas por la BBB se da en la Figura 16C. Aquí la señal altamente incrementada desde el TfR GLP-1 Activo en comparación con el TfR GLP-1 Inactivo que indica que el componente de GLP-1 se llevó a regiones no fácilmente accesibles para GLP-1 por sí mismo. Aunque la unión al TfR también puede contribuir a esta señal, la diferencia entre los dos compuestos en las regiones que expresan el GLP-1R es mucho mayor que en las regiones sin el GLP-1R (Figura 16D). Esto sugiere que la mayoría de la señal se originó a partir de la unión al GLP-1 R.
Conclusión:
La clara y marcada diferencia en la intensidad de la señal entre los compuestos TfR activos e inactivos que se observa en las estructuras cerebrales que están protegidas por la BBB (Figura 16C) muestra que el acoplamiento de un agonista de GLP-1R a un Fab anti-TfR puede usarse como un medio para dirigir los agonistas de GLP-1R a las áreas del cerebro que no son fácilmente accesibles por los agonistas de GLP-1R. Algunas de estas áreas, tales como la ACB, DMH, LHA y LH, se han mostrado ser importantes en la regulación del peso corporal y en la recompensa asociada la ingestión de alimentos relacionada.
Ejemplo 17: Potencia de GLP-1 in vitro
El propósito de este ejemplo es evaluar la actividad de GLP-1 de las fusiones y conjugados de GLP-1 activos e inactivos descritos en la presente descripción (donde los términos activo/inactivo se refieren a la capacidad de unirse/no unirse, respectivamente, al receptor de transferrina (TfR)). La actividad de GLP-1 se determina como potencia in vitro de GLP-1 y es la medida de la activación del receptor de GLP-1 humano en un ensayo de células completas.
Principio:
La potencia in vitro se determinó mediante la medición de la respuesta del receptor de GLP-1 humano en un ensayo de gen reportero. El ensayo se realizó en una línea celular BHK transfectada de manera estable que expresa el receptor de GLP-1 humano y contiene el ADN para el elemento de respuesta al cAMP (CRE) acoplado a un promotor y el gen para la luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando el receptor de GLP-1 humano se activa esto da como resultado la producción de cAMP, que a su vez resulta en la expresión de la proteína luciferasa. Cuando se completa la incubación del ensayo, se añade el sustrato de luciferasa (luciferina) y la enzima convierte la luciferina en oxiluciferina para producir bioluminiscencia. La luminiscencia se mide como la lectura para el ensayo. Para evaluar la unión de los compuestos a la albúmina, el ensayo puede realizarse en ausencia de albúmina sérica así como también en presencia de una concentración considerablemente mayor de albúmina sérica (concentración final en el ensayo de 1,0 %). Un aumento de la potencia in vitro, valor de EC50, en presencia de albúmina sérica indicaría una afinidad a la albúmina sérica y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales.
Cultivo celular y preparación:
Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A/KZ10-1) eran células BHK con BHKTS13 como una línea celular original. Las células se derivaron de un clon (FCW467-12A) que expresa el receptor de GLP-1 humano y se establecieron mediante transfección adicional con CRE luciferasa para obtener el clon actual. Las células se cultivaron en CO2 al 5 % en Medio de Cultivo Celular. Se alicuotaron y se almacenaron en nitrógeno líquido. Antes de cada ensayo se tomó una alícuota y se lavó dos veces en PBS antes de suspenderse en la concentración deseada en el tampón específico del ensayo. Para placas de 96 pocillos la suspensión se preparó para dar una concentración final de 5x103 células/pocillo.
Materiales:
Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Pluronic F-68 (10 % v/v) (Gibco 2404), albúmina de suero humano (HSA) (Sigma A9511), ovoalbúmina (Sigma A5503), DMEM sin rojo fenol (Gibco 11880-028), Hepes 1 M (Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050) y steadylite plus (PerkinElmer 6016757).
Tampones:
El Medio de Cultivo Celular consistió en medio DMEM con 10 % p/v de FBS (Suero Bovino Fetal; Invitrogen 16140 071), 1 mg/ml de G418 (Invitrogen 15140-122), 240 nM de MTX (metotrexato; Sigma M9929) y 1 % p/v de Pen/Strep (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122).
El Medio de Ensayo consistió en DMEM sin rojo de fenol, Hepes 10 mM y Glutamax 1x. El Tampón de Ensayo al 1 % consistió en 2 % de ovoalbúmina, 0,2 % de Pluronic F-68 y 2 % de HSA en Medio de Ensayo. El Tampón de Ensayo al 0 % consistió en 2 % p/v de ovoalbúmina y 0,2 % v/v de Pluronic F-68 en Medio de Ensayo.
Procedimiento:
1. Las reservas de células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C.
2. Las células se lavaron tres veces en PBS.
3. Las células se contaron y se ajustaron a 5 x 103 células/50 pl (1x105 células/ml) en Medio de Ensayo. Se transfirió una alícuota de 50 pl de células a cada pocillo en la placa de ensayo.
4. Las reservas de los compuestos de ensayo se diluyeron a una concentración de 0,2 pM en Tampón de Ensayo al 0 % para el ensayo de luciferasa HSA CRE al 0 % y Tampón de Ensayo al 1 % para el ensayo de luciferasa HSA CRE al 1 %. Los compuestos se diluyeron 10 veces para dar las siguientes concentraciones: 2x10-7 M, 2x10-8 M; 2x10-9 M, 2x10-10 M, 2x10-11 M, 2x10-12 M, 2x10-13 M y 2x10-14 M.
5. Se transfirió una alícuota de 50 pl del compuesto o blanco de la placa de dilución a la placa de ensayo. Los compuestos se evaluaron en las siguientes concentraciones finales: 1x10-7 M, 1x10-8 M; 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M y 1x10-14 M.
6. La placa de ensayo se incubó durante 3 h en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C.
7. La placa de ensayo se retiró de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
8. Se añadió una alícuota de 100 pl de reactivo steadylite plus a cada pocillo de la placa de ensayo (el reactivo era sensible a la luz).
9. Cada placa de ensayo se cubrió con papel de aluminio para protegerla de la luz y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente.
10. Cada placa del ensayo se leyó en un lector de placas de microtitulación.
Cálculos y Resultados:
Los datos del lector de placas se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático realizó una regresión no lineal (log(agonista) frente a respuesta). Los valores de EC50 que se calcularon mediante el programa informático y se informaron en pM se muestran en la Tabla 1 más abajo. Se midió un mínimo de dos réplicas para cada muestra en placas de ensayo separadas. Los valores informados son promedios de los duplicados. Para algunos ejemplos se corrió más de un ensayo y, en este caso, los datos informados son los promedios de los duplicados promediados.
Tabla 1: Potencia in vitro
Todos los compuestos tienen datos de potencia que confirman que son agonistas del receptor de GLP-1. Todos los compuestos tenían una buena potencia in vitro de GLP-1 correspondiente a una EC50 en HSA al 0 % por debajo de 1000 pM.
Ejemplo 18: Unión al receptor de GLP-1
El propósito de este ejemplo es evaluar la actividad de unión al receptor de GLP-1 in vitro de las fusiones y conjugados de GLP-1 activos e inactivos descritos en la presente descripción (donde los términos activo/inactivo se refieren a la capacidad de unirse/no unirse, respectivamente, al receptor de transferrina (TfR)). La unión al receptor es una medida de la afinidad de los compuestos por el receptor de g LP-1 humano.
Principio:
La unión al receptor de GLP-1 humano se midió en un ensayo de unión competitiva. En este tipo de ensayo se unió al receptor un ligando marcado (en este caso, 125I-GLP-1). Cada compuesto de ensayo se añadió en una serie de concentraciones a membranas aisladas que contenían el receptor de GLP-1 humano y se monitoreó el desplazamiento del ligando marcado. La unión al receptor se informó como la concentración a la que la mitad del ligando marcado se desplazó del receptor, el valor IC50. Para evaluar la unión de los derivados a la albúmina, el
ensayo puede realizarse en una concentración muy baja de albúmina sérica (máximo 0,001 % (p/v) de concentración final del ensayo, así como también en presencia de una concentración considerablemente mayor de albúmina sérica (2,0 % (p/v) de concentración final del ensayo). Un aumento del valor EC50 en presencia de albúmina sérica indica una afinidad por la albúmina sérica.
Materiales:
Los siguientes químicos se usaron en el ensayo: albúmina de suero humano (HSA) (Sigma A1653), DMEM sin rojo fenol (Gibco 11880-028), Pen/strep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), HEPES 1 M (Gibco 15630), EDTA (Invitrogen 15575-038), PBS (Invitrogen 14190-094), suero fetal de ternero (Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl2 (Merck 1.05832.1000), Tween 20 (Amresco 0850C335), partículas SPA (aglutinina de germen de trigo (WGA) perlas SPA, Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (producido internamente), OptiPlateTM-96 (Packard 6005290).
El tampón 1 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 10 mM y el pH se ajustó a 7,4. El tampón 2 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 0,1 mM y el pH se ajustó a 7,4. El tampón de ensayo consistió en HEPES 50 mM suplementado con EGTA 5 mM, MgCh 5 mM, Tween 20 al 0,005 % p/v y el pH se ajustó a 7,4. Una reserva de albúmina al 8 % consistió en HSA disuelta al 8 % (p/v) en tampón de ensayo. Una reserva de albúmina al 0,02 % consistió en HSA disuelta al 0,02 % (p/v) en tampón de ensayo.
Cultivo celular y preparación de membranas:
Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular original. Las células expresan el receptor de GLP-1 humano. Las células se cultivaron en CO2 al 5 % en DMEM, suero fetal de ternero al 10 % p/v, Pen/Estrep (Penicilina/Estreptomicina) al 1 % p/v. Para fabricar una preparación de membrana, las células se cultivaron a aproximadamente 80 % de confluencia. Las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y se cosecharon. Las células se sedimentaron mediante el uso de una centrifugación breve y el sedimento celular se mantuvo en hielo. El sedimento celular se homogenizó con un instrumento de dispersión ULTRA-THURRAX™ durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de tampón 1 (por ejemplo, 10 ml). El homogeneizado se centrifugó durante 15 minutos. El sedimento se suspendió nuevamente (homogeneizó) en 10 ml de tampón 2 y se centrifugó. Esta etapa se repitió una vez más. El sedimento resultante se suspendió nuevamente en el tampón 2 y se determinó la concentración de proteínas. Las membranas se alicuotaron y se almacenaron a menos 80°C.
Procedimiento:
1. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA baja (0,001 %) se añadieron 50 pl del tampón de ensayo a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la Etapa 3.
2. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA alta (2,0 %) se añadieron 50 pl de la reserva de albúmina al 8 % a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la Etapa 3.
3. Los compuestos de prueba se diluyeron en serie para dar las siguientes concentraciones: 8x10' 7 M, 8x10' 8 M, 8x10' 9 M, 8x10' 10 M, 8x10_11 M, 8x10' 12 M and 8x10' 13 M. Se añadieron veinticinco pl a los pocillos apropiados en la placa de ensayo.
4. Las alícuotas de membrana celular se descongelaron y se diluyeron a su concentración de trabajo. Se añadieron cincuenta pl a cada pocillo en la placa de ensayo.
5. Las perlas SPA WGA se suspendieron en tampón de ensayo a 20 mg/ml. La suspensión se diluyó a 10 mg/ml en tampón de ensayo justo antes de la adición a la placa de ensayo. Se añadieron cincuenta pl a cada pocillo en la placa de ensayo.
6. La incubación se inició mediante la adición de 25 pl de solución de [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 480 pM a cada pocillo de la placa de ensayo. Se reservó una alícuota de 25 pl para medir los recuentos totales/pocillo.
7. La placa de ensayo se incubó durante 2 h a 30 °C.
8. La placa de ensayo se centrifugó durante 10 minutos.
9. La placa de ensayo se leyó en un instrumento Packard TopCount NXT.
Cálculos:
Los datos del instrumento TopCount se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático promedió los valores para las réplicas y realizó una regresión no lineal. Los valores de IC50 se calcularon mediante el programa informático y se informaron en nM.
Resultados:
Se obtuvieron los siguientes resultados:
-
Todos los derivados tenían una IC50 (albúmina baja) por debajo de 60 nM.
Ejemplo 19: Inhibición de la captación del receptor de transferrina
El propósito de este ejemplo es evaluar la actividad de unión al receptor de transferrina in vitro de fusiones y conjugados de GLP-1 activos e inactivos ilustrativos descritos en la presente descripción (donde los términos activo/inactivo se refieren a la capacidad de unirse/no unirse, respectivamente, al receptor de transferrina (TfR)). La unión al receptor de transferrina es una medida de la afinidad de un compuesto para el receptor de transferrina de ratón.
Principio:
La capacidad de los conjugados de los Ejemplos 11-12 y 14-15 para inhibir la captación de un anticuerpo dirigido al receptor de transferrina se midió en un ensayo de captación competitivo. Los dos compuestos en cada conjunto de conjugados Fab (Ejemplos 11 y 12; y Ejemplos 15 y 14) incluyen la misma parte agonista de GLP-1R pero difieren cuando se trata de la parte Fab, que es "activa" e "inactiva", respectivamente, con respecto a la unión al TfR.
Cada compuesto se añadió en una serie de concentraciones a una línea celular de fibroblastos de ratón (MEF-1) disponible comercialmente junto con una concentración establecida de un fragmento Fab marcado con fluorescencia (descrito más abajo). La inhibición de la captación celular del fragmento Fab marcado por cada compuesto se informó como la concentración a la que se obtuvo la señal medio máxima (valor IC50).
Materiales:
Preparación del fragmento Fab marcado con fluorescencia:
El fragmento Fab marcado con fluorescencia se fabricó mediante marcado con Cy5 del anti TfR-Fab del Ejemplo 1. El anti TfR-Fab marcado con Cy5 se muestra en la Figura 1B, donde el colorante Cy5 se muestra unido a Cys en la posición 377.
Se añadió 226 uL de un tampón EDTA 200 mM a una solución del anti TfR-Fab del Ejemplo 1 (6,15 mg/ml, 17,5 ml). Se diluyó 25 uL de una solución TCEP (0,5 M, pH 7,0) con tampón 2475 ul (TEA 20 mM, EdTa 2 mM, pH 8,5). Se añadió 517 uL (1,25 eq, 2,9 umol) de la solución TCEP diluida a la solución anti TfR-Fab. La solución se almacenó a menos 80 °C.
Se burbujeó con argón una alícuota de 1 mL (6,15 mg, 131 nmol) de la solución producida más abajo y se añadió 1 mg de Cy5 (Amersham Cy5 Tinte Monorreactivo de Maleimida) disuelto en 100 uL de DMF seca. La mezcla se mantuvo bajo argón O/N a 5 °C.
El producto se purificó en una columna de desalinización Zeba Spinn, MWCO 7K, 5 ml mediante el uso del siguiente protocolo: Centrifugación en columna a 1000G durante 2 minutos 2,4 ml lavados. Se lavó 3 veces con tampón de PBS 2,4 ml, cada vez se centrifugó a 1000G durante 2 minutos. Después de la 3ra vez, el producto (1 ml 0,7 ml de lavado) se colocó en la parte superior de la columna y se centrifugó a 1000G durante 2 minutos. Se recolectó el producto (1,7 ml). Calc. masa exacta (m+z)/z (adimensional): 47859,88. Se ha encontrado una masa exacta (m+z)/z (adimensional): 47859,83.
Se usaron los siguientes químicos adicionales en el ensayo:
DMEM (Gibco 31966-026), Pen/strep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), HEPES 1 M (Gibco 15630), EDTA (Invitrogen 15575-038), suero fetal de ternero (Invitrogen 16140-071), PFA 4% (Chem Cruz Sc-281692), albúmina de suero humano (Sigma A9511), placa de imagen recubierta de colágeno (Becton Dickinson 734-0319), DAPI Hoechst 33342 (Sigma B2261), aglutinina de germen de trigo Alexa 488 (Invitrogen W32464), HBSS (Gibco 14025).
Procedimiento:
1. Antes de sembrar en las placas de células las células MEF-1 se cultivaron en 5 % de CO2 en DMEM, suero fetal de ternero 10 % p/v y penicilina/estreptomicina 1 % p/v. El día anterior a cada ensayo las células se sembraron en placas a 5000 células/pocillo.
2. El día del ensayo las células se lavaron con HBSS que contenía HSA 0,1 % (p/v).
3. Los compuestos de prueba se diluyeron en serie para dar las siguientes concentraciones: 2x10-6 M, 2x10-7 M, 2x10-8 M, 2x10-9 M, 2x10-10 M, 2x10-11 M, 2x10' 12 M y 2x10-13 M. Se añadieron 100 pl a los pocillos apropiados en la placa de ensayo.
4. A cada uno de los pocillos se añadió el fragmento Fab marcado con fluorescencia a una concentración final de 5 nM.
5. Las placas se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Después de la incubación, se eliminó el tampón y las células se lavaron con HBSS que contenía HSA 0,1 % (p/v).
6. Se añadieron cincuenta pl de PFA 4 % frío en una campana de extracción. Las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se eliminó el PFA.
7. Se añadieron cincuenta pl de una solución de marcaje a las placas y se incubaron durante 10 minutos. La solución de marcaje que contenía DAPI a 1:200 (v/v; de la reserva de 10 mg/ml) y WGA-Alexa488 a 1:200 (v/v; de la reserva de 5 mg/ml). La placa de ensayo se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
8. La placa de ensayo se lavó tres veces con 100 pl de HBSS y se añadió 100 pl de HBSS a cada pocillo después de las etapas de lavado.
9. La placa de ensayo se leyó en un instrumento de imágenes de alto contenido (instrumento IN Cell 2200, GE). Cálculos:
Los datos del instrumento IN Cell se analizaron mediante el uso del programa informático suministrado con el instrumento. Los núcleos se definieron mediante el uso de los núcleos teñidos con DAPI y los límites celulares se construyeron en base a las tinciones con WGA-Alexa488. La cantidad de fluorescencia que se internalizó se calculó mediante la definición de gránulos visibles en el canal Cy5 del instrumento y correspondió al fragmento Fab marcado con Cy5 internalizado. Se calcularon el número y la intensidad de los gránulos en cada célula. La lectura del instrumento que se usó para cálculos adicionales fue el área total de los gránulos dividido por el número de células en cada campo de adquisición. Un experimento típico contenía 32 campos mediante el uso de un objetivo de microscopio de 20x por pocillo. Los datos se transfirieron al programa informático GraphPad Prism y se trazaron como curvas de respuesta de concentración con el logaritmo M (M es la molaridad de los compuestos de prueba) en el eje x y el área total de gránulos por células en el eje y. El programa informático realizó una regresión no lineal. Los valores de IC50 se calcularon mediante el programa informático y se informaron en nM.
Resultados:
Se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 3: Inhibición de la ca tación del rece tor de transferrina
Todos los derivados con un Fab activo (TfR-Fab) tenían un valor IC50 por debajo de 20 nM, mientras que todos los derivados con un Fab inactivo (Fab de control) tenían un IC50 de > 1000 nM.
Ejemplo 20: Estudios in vivo en ratones
El propósito de este ejemplo es evaluar si los conjugados anti TfR-Fab de GLP-1 son biológicamente activos in vivo, con énfasis en las características relacionadas con la obesidad.
La Parte I del presente ejemplo informa de un estudio de la capacidad de reducción de la ingestión de alimentos de un conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 "activo" de la invención en ratones magros, dosificados de forma aguda i.v. La Parte II informa de una comparación de este conjugado "activo" con un conjugado Fab de control de GLP-1 "inactivo", para determinar si el brazo TfR contribuye a los resultados obtenidos en la Parte I.
La Parte III informa de un estudio en ratones obesos inducidos por la dieta, tratados de manera subcrónica, con el fin de investigar si la reducción de la ingestión de alimentos observada en las Partes I y II se traduce en una pérdida de peso.
I. Estudio in vivo del conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 del Ejemplo 11
Diseño del estudio:
La ingestión de alimentos se estudió en ratones C57Bl6J machos magros (Taconic, Dinamarca) dosificados de manera aguda i.v. (0-100 nmol/kg) con el conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 del Ejemplo 11 durante un período de 24 horas mediante el uso de un sistema de monitoreo automatizado biodaq (Research Diets, New Brunswick, NJ, Estados Unidos). Brevemente, los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de 12 horas de luz oscura con comida (Altromin, núm. de catálogo 1314, Lippe, Alemania) y agua del grifo disponible ad lib. Antes de la administración, los ratones (n = 4-6 por grupo) se asignaron a 1 de 5 grupos de tratamiento que se emparejaron de manera uniforme para el peso corporal y se colocaron en el sistema biodaq 8 días antes de la dosificación para aclimatarse a los procedimientos de prueba y manipulación. El día del experimento, los ratones se dosificaron i.v. en el tiempo 0 con un vehículo o con el compuesto del Ejemplo 11 de acuerdo con la tabla siguiente:
Tabla 4: Grupos
Grupos Dosis nmol/kg Concentración nmol/ml Volumen de dosis ml/kg n
*PBS+0,05 % de polisorbato 80
Exposición en plasma:
Después de 24 h, las muestras de sangre se tomaron a través del plexo sublingual en tubos con EDTA que contenían un cóctel inhibidor de la proteasa (3,097 g K3EDTA (MW 406,53), Fluka 03665, disuelto en 50 ml de Trasilol, 10000 KIU (unidades inactivadoras de la calicreína), 0,5 ml de Val-Pyr 20 mM (16,48 mg de Val-pirir/4 ml H2O, el pH se regula a 7,4 con HCL 1M) Posteriormente, los animales se sacrificaron mediante exanguinación seguido de dislocación cervical mientras se encontraban bajo anestesia. Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo y se centrifugaron (4 min x 4000 g) en el plazo de 30 minutos, a 4 °C. A continuación, se alicuotaron 50 pl de plasma en tubos debidamente marcados, se colocaron en hielo seco y se almacenaron a menos 80 °C, hasta el análisis.
Las concentraciones plasmáticas del compuesto del Ejemplo 11 (y para las Partes II y III, además el compuesto del Ejemplo 12) se midieron mediante LOCI (Inmunoensayo de Canalización de Oxígeno por Luminiscencia). En resumen, los reactivos LOCI incluyeron dos reactivos de perlas de látex (perlas donantes y aceptadoras) y un anticuerpo monoclonal biotinilado que reconoce un epítopo del extremo N del GLP-1. El reactivo de perlas donantes, que contiene un tinte fotosensible, se recubrió con estreptavidina. El segundo reactivo de perlas, las perlas aceptoras, se conjugó con un anticuerpo monoclonal específico para el extremo C de GLP-1, que formaba el sándwich. Durante el ensayo, los tres reactivos se combinaron con el compuesto del Ejemplo 11 (o, en la parte II y III, ya sea el compuesto del Ejemplo 11 o el compuesto del Ejemplo 12) en el plasma para formar un inmunocomplejo de agregado de perlas. Las excitaciones del complejo liberaron moléculas de oxígeno singlete de las perlas donantes, que se canalizaron hacia las perlas aceptoras y desencadenaron una respuesta de quimioluminiscencia que se midió en el lector de placas EnVision. La cantidad de luz generada, informada como recuentos por segundo (cps), fue proporcional a la concentración del analito.
Todos los calibradores, muestras de QC y muestras desconocidas en plasma con EDTA se analizaron en determinaciones por cuadruplicados.
El procedimiento analítico fue el siguiente:
Las soluciones de trabajo de las perlas aceptoras/anticuerpo biotinilado y las perlas de donante se prepararon en tampón LOCI.
Se aplicó una muestra de plasma/calibrador/QC de un pL por pocillo.
Se añadieron a cada pocillo 15 pL de la solución de trabajo que contiene un anticuerpo monoclonal biotinilado que reconoce un epítopo del extremo N de GLP-1 y perlas aceptoras recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para el extremo C de GLP-1.
Las placas estaban selladas y recubiertas con una tapa negra.
El ensayo se dejó incubar durante 1 hora a 18-22 °C.
Se añadieron 30 pL de perlas de donante recubiertas con estreptavidina diluidas en tampón LOCI bajo la luz verde. La placa se recubrió con una tapa negra y se incubó durante 30 minutos a 18-22 °C.
Finalmente, la placa se leyó en Envision.
El análisis se llevó a cabo mediante el uso de un lector Envision controlado mediante el programa informático Envision. La respuesta del instrumento (recuentos por segundos) se exportó a la calculadora LOCI, donde se calcularon las concentraciones plasmáticas.
Calibradores: Se preparó una línea de dilución del compuesto del calibrador del Ejemplo 11 (y para las partes II y III también del compuesto del calibrador del Ejemplo 12) en una mezcla de plasma de ratón que cubría un intervalo de 400 000 a 42 pmol/L. El plasma de ratón agrupado se incluyó como el calibrador de 0 pM (en blanco). Los calibradores se almacenaron en un tubo Micronic a menos 18 °C.
Rendimiento:
Se determinó que el límite inferior de cuantificación (LoQ) era 40 pmol/l. El límite superior de cuantificación (ULoQ) se determinó a 25 000 pM. La imprecisión (CV) se evaluó mediante la medición de tres muestras en 12 corridas analíticas consecutivas y 21 determinaciones de cada una de las tres muestras en la misma corrida analítica; el CV general fue <10 %.
Materiales:
Reactivos:
Tampón LOCI: Hepes 25 mM (Sigma H-3375), NaCl 50 mM (Merck 8.22184), K-EDTA 10 mM (Fluka 03664), Dextrano 2 mg/ml (Pharmacosmos 551005009007), ovoalbúmina OA 0,5 % (Sigma-A 5573), BGG 0,05 % (Sigma G-7516), Tween20 0,1 % (Merck 8.22184), Proclin 300 0,01 % (Sigma-Aldrich 48912-U), Gentamicina 0,01 % (Biol. Indust. 03-035-1), HBR1 0,2 mg/ml (Scan. Lab. 3KC533), pH 7,4
Plasma de ratón para diluciones y calibradores:
Plasma de ratón hembra (C57BL/6) de Bioreclamation, K2 EDTA, Catálogo MSEPLEDTA2-C57-F
Placas de ensayo:
Perkin Elmer, PPN 6005359.
Análisis de datos:
El programa informático Graph Pad® se usó para todos los análisis; los datos se presentan como la media. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de ANOVA de 2 vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni que comparó todos los grupos.
Resultados:
Los resultados se muestran en la Figura 17, donde la Figura 17A muestra la ingestión de alimentos (FI) acumulada en g, y la Figura 17B los niveles de exposición al plasma en pM medidos 24 horas después de la dosificación. Los datos se muestran como valores de la media.
De la Figura 17A está claro que el compuesto del Ejemplo 11 redujo la ingestión de alimentos de una manera dependiente de la dosis. Y la Figura 17B muestra que cuanto mayor sea la dosis, mayor será la exposición al plasma. Esto confirma que el compuesto es biológicamente activo in vivo.
II. Estudio directo in vivo de compuestos "activos" e "inactivos" de los Ejemplos 11 y 12
Para determinar si el brazo TfR en el conjugado anti TfR-Fab de GLP-1 del Ejemplo 11 contribuyó a la capacidad de reducción de la ingestión de alimentos como se determinó anteriormente, se realizó una comparación directa con el conjugado Fab de control de GLP-1 del Ejemplo 12, en el que el mismo agonista de GLP-1R se conjuga a un Fab inactivo, para servir como un compuesto de control.
Brevemente, los ratones magros C57Bl6J se mantuvieron bajo un ciclo de luz oscura de 12 horas (luces apagadas las 11 a.m.), con comida y agua disponibles ad lib, como en la parte I anterior. Además, de manera similar a la parte
I anterior, los ratones se habituaron al sistema de monitoreo de la ingestión de alimentos biodaq durante 7 días antes de ser asignados a 1 de 3 grupos de tratamiento que se emparejaron uniformemente para el peso corporal. El día del experimento, los ratones se dosificaron con un vehículo o 100 nmol/kg del compuesto del Ejemplo 11 o el compuesto del Ejemplo 12 de acuerdo con la tabla más abajo:
Tabla 5: Gru os
La ingestión de alimentos se monitoreó cada hora durante las 24 horas siguientes, después de lo cual los ratones se sacrificaron mediante exanguinación seguido de dislocación cervical mientras estaban bajo anestesia.
Se usó un grupo satélite de ratones para generar perfiles de exposición de cada compuesto. Se tomaron muestras de sangre a través del plexo sublingual en tubos con EDTA que contenían un cóctel inhibidor de la proteasa y se recolectó plasma y se analizó la exposición, como se describió en la parte I anterior. Para cada compuesto, las extracciones de sangre se obtuvieron a través de un muestreo disperso, n=3 ratones por punto de tiempo, después de 1 h, 4 h, 8 h, 10 h, 16 h, 18 h y 24 h después de la dosificación i.v. Las muestras de plasma se analizaron para determinar la exposición como se describió en la parte I anterior.
Análisis de datos:
El programa informático Graph Pad® se usó para todos los análisis; los datos se presentan como la media. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de ANOVA de 2 vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni que comparó todos los grupos.
Resultados:
Los resultados se muestran en la Figura 18, donde la Figura 18A muestra la ingestión de alimentos (FI) acumulada en g, y la Figura 18B muestra los niveles de exposición plasmática (concentración plasmática en pM) medidos durante 24 horas.
De la Figura 18A está claro que ambos compuestos de GLP-1 redujeron la ingestión de alimentos con relación a los ratones tratados con el vehículo durante 24 horas de observación. Sin embargo, la reducción de la ingestión de alimentos fue significativamente mayor en los ratones tratados con el compuesto del Ejemplo 11 con relación a los ratones tratados con el compuesto del Ejemplo 12. La Figura 18B muestra que los niveles de exposición plasmática fueron similares o mayores en ratones tratados con el compuesto de control del Ejemplo 12 lo que implica que las diferencias en la reducción de la ingestión de alimentos entre los análogos no se relacionaron con las diferencias en la PK. Más bien, estos datos demuestran que el Fab TfR activo en el compuesto del Ejemplo 11 contribuyó a una mayor reducción en la ingestión de alimentos.
III. Estudio in vivo subcrónico en ratones obesos inducidos por la dieta con compuestos "activos" e "inactivos" de los Ejemplos 11 y 12, determinación de la pérdida de peso
Para determinar si las reducciones en la reducción de la ingestión de alimentos aguda se traducen en pérdida de peso en un modelo preclínico de obesidad, a continuación comparamos los compuestos usados en las Partes I y II anteriores en ratones DIO tratados subcrónicamente durante 19 días. Brevemente, los ratones Machos C57Bl6J (Charles River, Francia) (n=79) se mantuvieron con una dieta rica en grasas al 60 % (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ, Estados Unidos) a partir de aproximadamente 4 semanas de edad. Los ratones obesos se enviaron al centro de prueba a aproximadamente 20 semanas de edad, y se alojaron en un entorno controlado por temperatura y humedad, n=10 por jaula, bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12-12 horas (luces apagadas a las 11:00 p.m.). Después de 4 días, los ratones en el grupo alimentado con dieta rica en grasas cambiaron de una dieta rica en grasas del 60 % al 45 % (HFD D12451, Research Diets, New Brunswick, NJ, Estados Unidos) para prevenir el desmoronamiento y el derrame y medir con más precisión la ingestión de alimentos. Todos los ratones se alojaron individualmente en este momento y se les permitió aclimatarse a su nuevo entorno durante dos semanas adicionales. La comida y el agua estaban disponibles ad lib en todo momento.
La composición corporal (Echo MRI 700, Houston, TX, Estados Unidos) se midió en el día 5 antes de la dosificación, y en el día 3 antes de la dosificación se asignaron a los ratones en 1 de 3 grupos de tratamiento emparejados uniformemente para la masa de tejido magro y graso.
Claims (14)
1. Un constructo que comprende un compuesto que se dirige a las áreas en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal y un ligando alostérico a un receptor localizado en la barrera hematoencefálica (BBB); o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este;
en donde el compuesto es un agonista del receptor de GLP-1 (GLP-1RA); en donde el receptor localizado en la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina (TfR).
2. El constructo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto se dirige a las vías en el cerebro involucradas en la regulación del peso corporal.
3. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el compuesto se dirige a los receptores en el cerebro involucrados en la regulación del peso corporal.
4. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el compuesto es una hormona derivada del intestino.
5. El constructo de acuerdo con la reivindicación 1-4, en donde el ligando alostérico que se une al TfR es un péptido, un polipéptido o una proteína.
6. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es una proteína de fusión o un conjugado.
7. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además un enlazador.
8. El constructo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el enlazador es peptídico o no peptídico.
9. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que reduce la ingestión de alimentos.
10. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que causa la pérdida de peso.
11. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que exhibe un aumento de la unión a GLP-1R que se expresa en las regiones cerebrales que están protegidas por la BBB en comparación con un constructo de control que solo se diferencia del constructo al incorporar un ligando que no se une al TfR, en donde las regiones cerebrales protegidas por la BBB que expresan el GLP-1R son una o más regiones seleccionadas de (i) el núcleo septal lateral (LS), giro dentado (DG), habénula medial (MH), y el núcleo parabraquial (PB); y/o a partir de (ii) el núcleo accumbens (ACB), núcleo dorsomedial del hipotálamo (DMH), área hipotalámica lateral (LHA), y habénula lateral (LH).
12. Una composición que comprende un constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o la composición de acuerdo con la reivindicación 12 para usar como un medicamento.
14. El constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o la composición de acuerdo con la reivindicación 12 para usar en la prevención o el tratamiento de la obesidad.
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