TWI787942B - 通過血腦障壁之抗人類運鐵蛋白受體抗體 - Google Patents

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高橋健一
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Abstract

揭示可用於將具有生理活性或藥理活性且無法通過血腦障壁的物質改變成能通過血腦障壁的形態的手段、以及此手段所致之改變物質。該手段為抗人類運鐵蛋白受體抗體，該改變物質為生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物、與抗人類運鐵蛋白受體抗體之分子的結合體。

Description

通過血腦障壁之抗人類運鐵蛋白受體抗體
本發明係關於一種抗人類運鐵蛋白(transferrin)受體抗體、其製造法及其使用法，該抗體係為了使投予血中而應於中樞神經系統(CNS)發揮機能的化合物(蛋白質、低分子化合物等)能夠通過血腦障壁，而使與彼等之化合物結合來使用的抗體。
除了包含腦室周圍器官(松果體、腦下垂體、最後區(area postrema)等)的幾個區域之外，對腦的大半組織供給血液的微血管係與存在於肌肉等其他組織的微血管不同，形成其內皮的內皮細胞彼此係藉由強固的細胞間接合而緊密接合。因此，自血液向腦的物質之被動輸送受妨礙，雖有例外，脂溶性高的物質，或分子量小(200～500道爾頓以下)且於生理pH附近電中性的物質以外，難以自微血管向腦移行。如此，介隔腦內之微血管內皮之限制血液與腦之組織液之間的物質交換的結構係被稱為血腦障壁(Blood-Brain Barrier，BBB)。又，血腦障壁係不僅限制腦，亦限制包含腦及脊髓的中樞神經系統的組織液與血液之間的物質交換。
由於血腦障壁之存在，中樞神經系統的大部份細胞並未受到血中賀爾蒙、淋巴激素(lymphokine)等之物質的濃度變動的影響，而保持其生化學的恒定性。
然而，血腦障壁之存在於藥劑開發上引發問題。例如，對於為起因於α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase)缺損的遺傳性代謝疾病之黏液多醣體病(mucopolysaccharidosis)I型(賀勒氏症候群(Hurler syndrome))，將重組α-L-艾杜糖醛酸酶作靜脈內補充的酵素補充療法係作為其治療法被施行，但對於賀勒氏症候群中所認定之顯著的中樞神經系統(CNS)之異常，因酵素無法通過血腦障壁而為無效。
為了使應於中樞神經系統發揮作用之此種蛋白質等之高分子物質通過血腦障壁的方法，已進行各種開發。例如，於神經成長因子的情形，已嘗試藉由將內包其之微脂體(liposome)與腦內微血管之內皮細胞的細胞膜融合，而使通過血腦障壁的方法，但未至實用化(非專利文獻1)。於α-L-艾杜糖醛酸酶的情形，已進行藉由使每1次投予的酵素量增加而提高其血中濃度，而提高血腦障壁中的酵素之被動輸送的嘗試，使用賀勒氏症候群之動物模式，藉由此手法，顯示了中樞神經系統(CNS)之異常有緩解(非專利文獻2)。
又，亦已進行迴避血腦障壁，將高分子物質直接投予至髓腔內或腦內的嘗試。例如，已報告對賀勒氏症候群(黏液多醣體病I型)之患者的髓腔內投予人類α-L-艾杜糖醛酸酶的方法(專利文獻1)、對尼曼－匹克二氏病(Niemann-Pick disease)之患者的腦室內投予人類酸性神經髓磷脂酶(sphingomyelinase)的方法(專利文獻2)、於韓特氏症候群(Hunter syndrome)之模式動物之腦室內投予艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)的方法(專利文獻3)。若依據此種手法，雖認為確實可於中樞神經系統使藥劑作用，但另一方面，又有所謂侵襲性極高的問題。
將以具有與腦內微血管之內皮細胞上存在的膜蛋白質之親和性的方式來修飾高分子物質的方法作為通過血腦障壁使高分子物質到達腦內的方法已有各種報告。就存在於腦內微血管之內皮細胞上的膜蛋白質而言，可列舉對胰島素、運鐵蛋白、類胰島素生長因子(IGF-I、IGF-II)、LDL、瘦素(leptin)等之化合物的受體。
例如，已報告將神經成長因子(NGF)以與胰島素之融合蛋白質的形式合成，而藉由與胰島素受體的結合，使此融合蛋白質通過血腦障壁的技術(專利文獻4～6)。又，已報告將神經成長因子(NGF)以與抗胰島素受體抗體之融合蛋白質的形式合成，而藉由與胰島素受體之結合，使此融合蛋白質通過血腦障壁的技術(專利文獻4及7)。又，已報告將神經成長因子(NGF)以與運鐵蛋白之融合蛋白質的形式合成，而藉由與運鐵蛋白受體(TfR)的結合，使此融合蛋白質通過血腦障壁的技術(專利文獻8)。又，已報告將神經成長因子(NGF)以與抗運鐵蛋白受體抗體(抗TfR抗體)之融合蛋白質的形式合成，而藉由與TfR的結合，使此融合蛋白質通過血腦障壁的技術(專利文獻4及9)。
進一步觀察使用抗TfR抗體的技術時，關於藉由使與抗TfR抗體結合而使藥劑通過血腦障壁的技術，已報告可使用單股抗體(非專利文獻3)。又，與hTfR的解離常數為比較大的抗hTfR抗體(低親和性抗hTfR抗體)，在作為藥劑使通過血腦障壁的技術中，已報告可適合地利用(專利文獻10及11，非專利文獻4)。再者，已報告與hTfR之親和性為pH依存性地變化的抗TfR抗體因可使藥劑通過血腦障壁，故可使用作為載體(專利文獻12，非專利文獻5)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2007-504166號公報 [專利文獻2]日本特表2009-525963號公報 [專利文獻3]日本特開2012-62312號公報 [專利文獻4]美國專利5154924號公報 [專利文獻5]日本特開2011-144178號公報 [專利文獻6]美國專利2004/0101904號公報 [專利文獻7]日本特表2006-511516號公報 [專利文獻8]日本特開H06-228199號公報 [專利文獻9]美國專利5977307號公報 [專利文獻10]WO2012/075037 [專利文獻11]WO2013/177062 [專利文獻12]WO2012/143379 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Xie Y. et al., J Control Release. 105. 106-19 (2005) [非專利文獻2] Ou L. et al., Mol Genet Metab. 111. 116-22 (2014) [非專利文獻3] Li JY. Protein Engineering. 12. 787-96 (1999) [非專利文獻4] Bien-Ly N. et al., J Exp Med. 211. 233-44 (2014) [非專利文獻5] Sada H. PLoS ONE. 9. E96340 (2014)
[發明欲解決之課題]
基於上述背景，本發明之目的係提供一種抗TfR抗體、其製造法及使用法，該抗體係可為了使投予至血中而應於中樞神經系統(CNS)發揮機能的化合物(蛋白質、低分子化合物等)能夠通過血腦障壁，而與彼等之化合物結合來使用的抗體。 [用以解決課題之手段]
於朝向上述目的的研究中，本發明者們不斷專心檢討的結果，發現藉由本說明書中詳述的抗體製作法而獲得之辨識hTfR的細胞外區域的抗人類運鐵蛋白受體抗體(抗hTfR抗體)，將其投予至活體內時，效率佳地通過血腦障壁，而完成本發明。即，本發明係提供以下。
1.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，該抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列係選自由以下之(1)～(14)所構成的群組者： (1)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號6或序列識別號7之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列或者胺基酸序列Trp-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號10之胺基酸序列者； (2)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號11或序列識別號12之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser、且於CDR3包含序列識別號15之胺基酸序列者； (3)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號16或序列識別號17之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號18或序列識別號19之胺基酸序列或者胺基酸序列Lys-Val-Ser、且於CDR3包含序列識別號20之胺基酸序列者； (4)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號21或序列識別號22之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號23或序列識別號24之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號25之胺基酸序列者； (5)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號26或序列識別號27之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號28或序列識別號29之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號30之胺基酸序列者； (6)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號31或序列識別號32之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號33或序列識別號34之胺基酸序列或者胺基酸序列Ala-Ala-Ser、且於CDR3包含序列識別號35之胺基酸序列者； (7)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號36或序列識別號37之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號38或序列識別號39之胺基酸序列或者胺基酸序列Gln-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號40之胺基酸序列者； (8)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號41或序列識別號42之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號43或序列識別號44之胺基酸序列或者胺基酸序列Gly-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號45之胺基酸序列者； (9)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號46或序列識別號47之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號48或序列識別號49之胺基酸序列或者胺基酸序列Phe-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號50之胺基酸序列者； (10)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號51或序列識別號52之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號53或序列識別號54之胺基酸序列或者胺基酸序列Ala-Ala-Ser、且於CDR3包含序列識別號55之胺基酸序列者； (11)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號56或序列識別號57之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號58或序列識別號59之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser、且於CDR3包含序列識別號60之胺基酸序列者； (12)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號61或序列識別號62之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號63或序列識別號64之胺基酸序列或者胺基酸序列Trp-Ser-Ser、且於CDR3包含序列識別號65之胺基酸序列者； (13)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號66或序列識別號67之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號68或序列識別號69之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser、且於CDR3包含序列識別號70之胺基酸序列者； (14)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號71或序列識別號72之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號73或序列識別號74之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser、且於CDR3包含序列識別號75之胺基酸序列者。 2.如上述1之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列為選自由以下之(1)～(14)所構成的群組者之抗體： (1)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號6之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號8之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號10之胺基酸序列者； (2)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號11之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號13之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號15之胺基酸序列者； (3)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號16之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號18之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號20之胺基酸序列者； (4)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號21之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號23之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號25之胺基酸序列者； (5)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號26之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號28之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號30之胺基酸序列者； (6)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號31之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號33之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號35之胺基酸序列者； (7)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號36之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號38之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號40之胺基酸序列者； (8)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號41之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號43之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號45之胺基酸序列者； (9)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號46之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號48之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號50之胺基酸序列者； (10)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號51之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號53之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號55之胺基酸序列者； (11)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號56之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號58之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號60之胺基酸序列者； (12)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號61之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號63之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號65之胺基酸序列者； (13)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號66之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號68之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號70之胺基酸序列者；及 (14)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號71之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號73之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號75之胺基酸序列者。 3.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中輕鏈之可變區的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列與上述1或2之任一者之輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列各自具有80%以上之同源性。 4.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中輕鏈之可變區的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列與上述1或2之任一者之輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列各自具有90%以上之同源性。 5.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於上述1或2之任一者之輕鏈的CDR之至少1者中，構成其之胺基酸序列中有1～5個胺基酸經取代、缺失或添加。 6.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於上述1或2之任一者之輕鏈的CDR之至少1者中，構成其之胺基酸序列中有1～3個胺基酸經取代、缺失或添加。 7.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中該抗體之重鏈的可變區之胺基酸序列係選自由以下之(1)～(14)所構成的群組者： (1)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號76或序列識別號77之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號78或序列識別號79之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號80或序列識別號81之胺基酸序列者； (2)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號82或序列識別號83之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號84或序列識別號85之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號86或序列識別號87之胺基酸序列者； (3)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號88或序列識別號89之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號90或序列識別號91之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號92或序列識別號93之胺基酸序列者； (4)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號94或序列識別號95之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號96或序列識別號97之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號98或序列識別號99之胺基酸序列者； (5)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號100或序列識別號101之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號102或序列識別號103之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號104或序列識別號105之胺基酸序列者； (6)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號106或序列識別號107之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號108之胺基酸序列或序列識別號278之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號109或序列識別號110之胺基酸序列者； (7)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號111或序列識別號112之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號113或序列識別號114之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號115或序列識別號116之胺基酸序列者； (8)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號117或序列識別號118之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號119之胺基酸序列或序列識別號279之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號120或序列識別號121之胺基酸序列者； (9)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號122或序列識別號123之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號124或序列識別號125之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號126或序列識別號127之胺基酸序列者； (10)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號128或序列識別號129之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號130或序列識別號131之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號132或序列識別號133之胺基酸序列者； (11)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號134或序列識別號135之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號136或序列識別號137之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號138或序列識別號139之胺基酸序列者； (12)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號140或序列識別號141之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號142或序列識別號143之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號144或序列識別號145之胺基酸序列者； (13)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號146或序列識別號147之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號148或序列識別號149之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號150或序列識別號151之胺基酸序列者；及 (14)胺基酸序列，其係於CDR1包含序列識別號152或序列識別號153之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號154或序列識別號155之胺基酸序列、且於CDR3包含序列識別號156或序列識別號157之胺基酸序列者。 8.如上述7之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該抗體之重鏈的可變區之胺基酸序列為選自由以下之(1)～(14)所構成的群組者之抗體： (1)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號76之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號78之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號80之胺基酸序列者； (2)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號82之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號84之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號86之胺基酸序列者； (3)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號88之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號90之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號92之胺基酸序列者； (4)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號94之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號96之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號98之胺基酸序列者； (5)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號100之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號102之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號104之胺基酸序列者； (6)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號106之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號108之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號109之胺基酸序列者； (7)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號111之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號113之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號115之胺基酸序列者； (8)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號117之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號119之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號120之胺基酸序列者； (9)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號122之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號124之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號126之胺基酸序列者； (10)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號128之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號130之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號132之胺基酸序列者； (11)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號134之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號136之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號138之胺基酸序列者； (12)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號140之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號142之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號144之胺基酸序列者； (13)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號146之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號148之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號150之胺基酸序列者；及 (14)胺基酸序列，其係分別於CDR1包含序列識別號152之胺基酸序列、於CDR2包含序列識別號154之胺基酸序列、及於CDR3包含序列識別號156之胺基酸序列者。 9.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中重鏈之可變區的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列與上述7或8之任一者之重鏈的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列各自具有80%以上之同源性。 10.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中重鏈之可變區的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列與上述7或8之任一者之重鏈的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列各自具有90%以上之同源性。 11.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其構成上述7或8之任一者之重鏈的CDR之至少1者的胺基酸序列中，有1～5個胺基酸經取代、缺失或添加。 12.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其構成上述7或8之任一者之重鏈的CDR之至少1者的胺基酸序列中，有1～3個胺基酸經取代、缺失或添加。 13.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中該抗體之輕鏈的可變區及重鏈的可變區係選自由以下之(1)～(14)所構成的群組者： (1)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號6或序列識別號7之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列或者胺基酸序列Trp-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號10之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號76或序列識別號77之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號78或序列識別號79之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號80或序列識別號81之胺基酸序列作為CDR3而成者； (2)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號11或序列識別號12之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser作為CDR2、及包含序列識別號15之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號82或序列識別號83之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號84或序列識別號85之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號86或序列識別號87之胺基酸序列作為CDR3而成者； (3)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號16或序列識別號17之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號18或序列識別號19之胺基酸序列或者胺基酸序列Lys-Val-Ser作為CDR2、及包含序列識別號20之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號88或序列識別號89之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號90或序列識別號91之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號92或序列識別號93之胺基酸序列作為CDR3而成者； (4)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號21或序列識別號22之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號23或序列識別號24之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號25之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號94或序列識別號95之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號96或序列識別號97之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號98或序列識別號99之胺基酸序列作為CDR3而成者； (5)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號26或序列識別號27之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號28或序列識別號29之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號30之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號100或序列識別號101之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號102或序列識別號103之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號104或序列識別號105之胺基酸序列作為CDR3而成者； (6)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號31或序列識別號32之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號33或序列識別號34之胺基酸序列或者胺基酸序列Ala-Ala-Ser作為CDR2、及包含序列識別號35之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號106或序列識別號107之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號108之胺基酸序列或序列識別號278之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號109或序列識別號110之胺基酸序列作為CDR3而成者； (7)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號36或序列識別號37之胺基酸序列作為CDR1之、包含序列識別號38或序列識別號39之胺基酸序列或者胺基酸序列Gln-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號40之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號111或序列識別號112之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號113或序列識別號114之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號115或序列識別號116之胺基酸序列作為CDR3而成者； (8)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號41或序列識別號42之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號43或序列識別號44之胺基酸序列或者胺基酸序列Gly-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號45之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號117或序列識別號118之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號119之胺基酸序列或序列識別號279之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號120或序列識別號121之胺基酸序列作為CDR3之而成者； (9)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號46或序列識別號47之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號48或序列識別號49之胺基酸序列或者胺基酸序列Phe-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號50之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號122或序列識別號123之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號124或序列識別號125之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號126或序列識別號127之胺基酸序列作為CDR3而成者； (10)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號51或序列識別號52之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號53或序列識別號54之胺基酸序列或者胺基酸序列Ala-Ala-Ser作為CDR2、及包含序列識別號55之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號128或序列識別號129之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號130或序列識別號131之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號132或序列識別號133之胺基酸序列作為CDR3而成者； (11)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號56或序列識別號57之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號58或序列識別號59之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser作為CDR2、及包含序列識別號60之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號134或序列識別號135之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號136或序列識別號137之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號138或序列識別號139之胺基酸序列作為CDR3而成者； (12)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號61或序列識別號62之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號63或序列識別號64之胺基酸序列或者胺基酸序列Trp-Ser-Ser作為CDR2、及包含序列識別號65之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號140或序列識別號141之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號142或序列識別號143之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號144或序列識別號145之胺基酸序列作為CDR3而成者； (13)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號66或序列識別號67之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號68或序列識別號69之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser作為CDR2、及包含序列識別號70之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號146或序列識別號147之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號148或序列識別號149之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號150或序列識別號151之胺基酸序列作為CDR3而成者；及 (14)輕鏈之可變區係各自包含序列識別號71或序列識別號72之胺基酸序列作為CDR1之、包含序列識別號73或序列識別號74之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser作為CDR2、及包含序列識別號75之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係各自包含序列識別號152或序列識別號153之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號154或序列識別號155之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號156或序列識別號157之胺基酸序列作為CDR3而成者。 14.如上述13之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該抗體之輕鏈的可變區及重鏈之可變區為選自由以下之(1)～(14)所構成的群組者之抗體： (1)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號6、於CDR2包含序列識別號8、及於CDR3包含序列識別號10之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號76、於CDR2包含序列識別號78、及於CDR3包含序列識別號80之胺基酸序列而成者； (2)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號11、於CDR2包含序列識別號13、及於CDR3包含序列識別號15之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號82、於CDR2包含序列識別號84、及於CDR3包含序列識別號86之胺基酸序列而成者； (3)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號16、於CDR2包含序列識別號18、及於CDR3包含序列識別號20之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號88、於CDR2包含序列識別號90、及於CDR3包含序列識別號92之胺基酸序列而成者； (4)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號21、於CDR2包含序列識別號23、及於CDR3包含序列識別號25之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號94、於CDR2包含序列識別號96、及於CDR3包含序列識別號98之胺基酸序列而成者； (5)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號26、於CDR2包含序列識別號28、及於CDR3包含序列識別號30之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號100、於CDR2包含序列識別號102、及於CDR3包含序列識別號104之胺基酸序列而成者； (6)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號31、於CDR2包含序列識別號33、及於CDR3包含序列識別號35之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號106、於CDR2包含序列識別號108、及於CDR3包含序列識別號109之胺基酸序列而成者； (7)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號36、於CDR2包含序列識別號38、及於CDR3包含序列識別號40之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號111、於CDR2包含序列識別號113、及於CDR3包含序列識別號115之胺基酸序列而成者； (8)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號41、於CDR2包含序列識別號43、及於CDR3包含序列識別號45之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號117、於CDR2包含序列識別號119、及於CDR3包含序列識別號120之胺基酸序列而成者； (9)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號46、於CDR2包含序列識別號48、及於CDR3包含序列識別號50之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號122、於CDR2包含序列識別號124、及於CDR3包含序列識別號126之胺基酸序列而成者； (10)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號51、於CDR2包含序列識別號53、及於CDR3包含序列識別號55之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號128、於CDR2包含序列識別號130、及於CDR3包含序列識別號132之胺基酸序列而成者； (11)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號56、於CDR2包含序列識別號58、及於CDR3包含序列識別號60之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號134、於CDR2包含序列識別號136、及於CDR3包含序列識別號138之胺基酸序列而成者； (12)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號61、於CDR2包含序列識別號63、及於CDR3包含序列識別號65之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號140、於CDR2包含序列識別號142、及於CDR3包含序列識別號144之胺基酸序列而成者； (13)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號66、於CDR2包含序列識別號68、及於CDR3包含序列識別號70之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號146、於CDR2包含序列識別號148、及於CDR3包含序列識別號150之胺基酸序列而成者；及 (14)輕鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號71、於CDR2包含序列識別號73、及於CDR3包含序列識別號75之胺基酸序列而成，且重鏈之可變區係分別於CDR1包含序列識別號152、於CDR2包含序列識別號154、及於CDR3包含序列識別號156之胺基酸序列而成者。 15.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中輕鏈及重鏈之各自中的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列與上述13或14之輕鏈及重鏈之組合之任一者中的輕鏈及重鏈之各自的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列具有80%以上之同源性。 16.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中輕鏈及重鏈之各自中的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列與上述13或14之輕鏈及重鏈的組合之任一者中的輕鏈及重鏈之各自的CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列具有90%以上之同源性。 17.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於上述13或14之輕鏈與重鏈之組合之任一者中的輕鏈及重鏈之各自每一者，於CDR之至少1個中，構成其之胺基酸序列中有1～5個經取代、缺失或添加。 18.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於上述13或14之輕鏈與重鏈之組合之任一者中的輕鏈及重鏈之各自每一者，於CDR之至少1個中，構成其之胺基酸序列中有1～3個經取代、缺失或添加。 19.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該抗體之輕鏈的可變區係包含選自由序列識別號158、序列識別號159、序列識別號160、序列識別號161、序列識別號162、及序列識別號163之胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含選自由序列識別號166、序列識別號167、序列識別號168、序列識別號169、序列識別號170、及序列識別號171之胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成者。 20.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該抗體之輕鏈的可變區係包含選自由序列識別號174、序列識別號175、序列識別號176、序列識別號177、序列識別號178、及序列識別號179之胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含選自由序列識別號182、序列識別號183、序列識別號184、序列識別號185、序列識別號186、及序列識別號187之胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成者。 21.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該抗體之輕鏈的可變區係包含選自由序列識別號190、序列識別號191、序列識別號192、序列識別號193、序列識別號194、及序列識別號195之胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含選自由序列識別號204、序列識別號205、序列識別號206、序列識別號207、序列識別號208、及序列識別號209之胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成者。 22.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係選自下列之(1)～(6)所構成的群組者： (1)該抗體之輕鏈的可變區係包含序列識別號163之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含序列識別號171之胺基酸序列而成者； (2)該抗體之輕鏈的可變區係包含序列識別號179之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含序列識別號187之胺基酸序列而成者； (3)該抗體之輕鏈的可變區係包含序列識別號191之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含序列識別號205之胺基酸序列而成者； (4)該抗體之輕鏈的可變區係包含序列識別號193之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含序列識別號205之胺基酸序列而成者； (5)該抗體之輕鏈的可變區係包含序列識別號194之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含序列識別號205之胺基酸序列而成者；及 (6)該抗體之輕鏈的可變區係包含序列識別號195之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區包含序列識別號205之胺基酸序列而成者。 23.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係選自下列之(1)～(10)所構成的群組者： (1)該抗體之輕鏈係包含序列識別號164之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號172之胺基酸序列而成者； (2)該抗體之輕鏈係包含序列識別號180之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號188之胺基酸序列而成者； (3)該抗體之輕鏈係包含序列識別號196之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號210之胺基酸序列而成者； (4)該抗體之輕鏈係包含序列識別號198之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號210之胺基酸序列而成者； (5)該抗體之輕鏈係包含序列識別號200之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號210之胺基酸序列而成者； (6)該抗體之輕鏈係包含序列識別號202之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號210之胺基酸序列而成者； (7)該抗體之輕鏈係包含序列識別號196之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號212之胺基酸序列而成者； (8)該抗體之輕鏈係包含序列識別號198之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號212之胺基酸序列而成者； (9)該抗體之輕鏈係包含序列識別號200之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號212之胺基酸序列而成者；及 (10)該抗體之輕鏈係包含序列識別號202之胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈係包含序列識別號212之胺基酸序列而成者。 24.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其與上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之間，關於輕鏈之可變區的胺基酸序列或/及重鏈之可變區的胺基酸序列，各自具有80%以上之同源性。 25.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其與上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之間，關於輕鏈之可變區的胺基酸序列或/及重鏈之可變區的胺基酸序列，各自具有90%以上之同源性。 26.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於構成上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1～10個的胺基酸經取代、缺失或添加。 27.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於構成上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1～3個的胺基酸經取代、缺失或添加。 28.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於構成上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1～10個的胺基酸經取代、缺失或添加。 29.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於構成上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1～3個的胺基酸經取代、缺失或添加。 30.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於構成上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列及重鏈可變區的胺基酸序列之各者的胺基酸序列中，各自有1～10個的胺基酸經取代、缺失或添加。 31.一種抗體，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體，其於構成上述19～23中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列及重鏈可變區的胺基酸序列之各者的胺基酸序列中，各自有1～3個之胺基酸經取代、缺失或添加。 32.如上述1～31中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係對人類運鐵蛋白受體之細胞外區域及猴運鐵蛋白受體之細胞外區域兩者具有親和性之抗體。 33.如上述32之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係與人類運鐵蛋白受體之細胞外區域的解離常數為1×10-8 M以下且與猴運鐵蛋白受體之細胞外區域的解離常數為5×10-8 M以下之抗體。 34.如上述1～33之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其為Fab抗體、F(ab’)2 抗體、或F(ab’)抗體。 35.如上述1～33中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其為選自由scFab、scF(ab’)、scF(ab’)2 及scFv所構成的群組的單股抗體。 36.如上述35之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係其輕鏈與重鏈係介隔連接子(linker)序列而結合之抗體。 37.如上述35之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係其輕鏈與重鏈係於輕鏈之C端側，介隔連接子序列而結合之抗體。 38.如上述35之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係其重鏈與輕鏈係於重鏈之C端側，介隔連接子序列而結合之抗體。 39.如上述36～38中任一者之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該連接子序列係由8～50個的胺基酸殘基所構成之抗體。 40.如上述39之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其係該連接子序列為選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列識別號3、序列識別號4、及序列識別號5之各胺基酸序列、及相當於序列識別號3之胺基酸序列之3個連續的胺基酸序列所構成的群組者之抗體。 41.一種融合蛋白質，其係包含如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體、與結合於其輕鏈之C端側或N端側的其他蛋白質A之胺基酸序列而成。 42.一種融合蛋白質，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質， 該抗人類運鐵蛋白受體抗體為如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體， 該其他蛋白質A係結合於該抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈之C端側或N端側。 43.如上述41或42之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係於該輕鏈之C端側或N端側介隔連接子序列而結合。 44.如上述43之融合蛋白質，其中該連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。 45.如上述44之融合蛋白質，其中該連接子序列係包含選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號3、序列識別號4、及序列識別號5之各胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成者。 46.一種融合蛋白質，其係包含如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體、與結合於其重鏈之C端側或N端側的其他蛋白質A之胺基酸序列而成。 47.一種融合蛋白質，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質，其中抗人類運鐵蛋白受體抗體為上述1～40中任一者，該其他蛋白質A為結合於該抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈之C端側或N端側者。 48.如上述46或47之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係於該重鏈之C端側或N端側介隔連接子序列而結合者。 49.如上述48之融合蛋白質，其中該連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。 50.如上述48之融合蛋白質，其中該連接子序列係以胺基酸序列Gly-Ser表示者。 51.如上述41～50中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係來自人類之蛋白質。 52.如上述41～51中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係選自由神經成長因子(NGF)、溶酶體(lysosome)酵素、睫狀體神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神經膠細胞株神經營養因子(glial cell neurotrophic factor，GDNF)、神經滋養素3(neurotrophin 3)、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1(neuregulin 1)、紅血球生成素(erythropoietin)、達依泊汀(darbepoetin)、活化素(activin)、鹼性纖維母細胞成長因子(bFGF)、纖維母細胞成長因子2(FGF2)、上皮細胞增殖因子(EGF)、血管內皮增殖因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、各種細胞介素(cytokine)、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、PD-1配位體(ligand)、具有分解beta-類澱粉(beta-amyloid)的活性的酵素、抗beta-類澱粉抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗HER2抗體、抗TNF-α抗體、及其他之抗體醫藥所構成的群組者。 53.如上述41～51中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為溶酶體酵素，該溶酶體酵素係選自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronic acid-2-sulfatase)、葡萄糖腦苷酶(glucocerebrosidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A(β-hexosaminidase A)、β-己醣胺酶B、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷轉移酶、α-甘露糖酶、β-甘露糖酶、半乳糖神經醯胺酶(galactosylceramidase)、鞘脂激活蛋白C(saposin C)、烯丙基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基葡萄糖胺酶(aspartyl glucosaminidase)、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶(α-N-acetyl-galactosaminidase)、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶、乙醯基CoAα-氨基葡糖苷N-乙醯基轉移酶(acetyl CoAα- glucosaminide N-acetyltransferase)、N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶(sialidase)、軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1、三肽基肽酶-1(Tripeptidyl Peptidase-1)、玻糖醛酸酶-1(hyaluronidase-1)、CLN1及CLN2所構成的群組者。 54.如上述41～51中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。 55.如上述50之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，其係選自以下之(1)～(3)的融合蛋白質： (1)融合蛋白質：該人類化抗hTfR抗體之輕鏈係具有序列識別號164之胺基酸序列者，該人類化抗hTfR抗體之重鏈係於其C端側，介隔連接子序列Gly-Ser，與人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合，且整體而言具有序列識別號247所示的胺基酸序列者； (2)融合蛋白質：該人類化抗hTfR抗體之輕鏈係具有序列識別號180之胺基酸序列者，該人類化抗hTfR抗體之重鏈係於其C端側，介隔連接子序列Gly-Ser，與人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合，且整體而言具有序列識別號249所示的胺基酸序列者；及 (3)融合蛋白質：該人類化抗hTfR抗體之輕鏈係具有序列識別號196之胺基酸序列者，該人類化抗hTfR抗體之重鏈係於其C端側，介隔連接子序列Gly-Ser，與人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合，且整體而言具有序列識別號251所示的胺基酸序列者。 56.如上述50之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，其係選自以下之(1)～(3)的融合蛋白質： (1)融合蛋白質：包含具有序列識別號164之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之輕鏈、以及於具有序列識別號172之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側，介隔連接子序列Gly-Ser，與序列識別號246所示的人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合者； (2)融合蛋白質：包含具有序列識別號180之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之輕鏈、以及於具有序列識別號188之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側，介隔連接子序列Gly-Ser，與序列識別號246所示的人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合者；及 (3)融合蛋白質：包含具有序列識別號196之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之輕鏈、以及於具有序列識別號210之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側，介隔連接子序列Gly-Ser，與序列識別號246所示的人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合者。 57.如上述50之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，其係選自以下之(1)～(3)的融合蛋白質： (1)由該人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶介隔連接子序列Gly-Ser於重鏈之C端側結合而成者、與輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號247所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者， (2)由該人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶介隔連接子序列Gly-Ser於重鏈之C端側結合而成者、與輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號249所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者，及 (3)由該人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶介隔連接子序列Gly-Ser於重鏈之C端側結合而成者、與輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號251所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。 58.一種DNA片段，其編碼如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體之胺基酸序列。 59.一種DNA片段，其編碼如上述41～57中任一項之融合蛋白質之胺基酸序列。 60.一種表現載體，其係併入如上述58或59之DNA片段而成。 61.一種哺乳動物細胞，其係經如上述60之表現載體轉形。 62.一種抗人類運鐵蛋白受體抗體-藥理活性物質複合體，其係使如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體之該輕鏈及/或重鏈之任一者與應使通過血腦障壁而於腦內發揮機能的低分子量之藥理活性物質結合者。 63.如上述62之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中該藥理活性物質係選自由抗癌劑、阿滋海默氏症(Alzheimer’s disease)治療劑、帕金森氏病(Parkinson’s disease)治療劑、亨汀頓氏症(Huntington’s disease)治療劑、思覺失調症治療劑、憂鬱症治療劑、多發性硬化症治療劑、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)治療劑、包含腦腫瘤的中樞神經系統的腫瘤治療劑、伴隨腦障礙的溶酶體病之治療劑、肝醣病(glycogenosis)治療劑、肌肉營養不良(muscular dystrophy)治療劑、腦缺血治療劑、普里昂疾病(prion disease)治療劑、外傷性之中樞神經系統障礙之治療劑、對病毒性及細菌性之中樞神經系統疾病的治療劑、腦外科手術後之回復所使用的藥劑、脊椎外科手術後之回復所使用的藥劑、siRNA、反義DNA(antisense DNA)、及胜肽所構成的群組的任一者。 64.一種如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體之用途，其係用於使其他蛋白質A或低分子量之藥理活性物質通過血腦障壁而於腦內發揮機能。 65.一種如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體之用途，其係用於中樞神經系統之疾病狀態的治療用的血中投予用藥劑之製造，係使與抗該疾病狀態的生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物之分子結合所致。 66.一種治療方法，其係中樞神經系統之疾病之治療方法，其包含將治療上有效量之抗該疾病之生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物，以與如上述1～40中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體分子之結合體的形態，對具有該疾病的患者進行血中投予。 67.如上述54～57中任一項之抗人類運鐵蛋白受體抗體之用途，其係用於使人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶通過血腦障壁並於腦內發揮機能。 68.如上述54～57中任一項之融合蛋白質之用途，其係用於血中投予用藥劑之製造，該血中投予用藥劑係用於治療伴隨韓特氏症候群之中樞神經系統的疾病狀態，且係使與抗該疾病狀態之生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物之分子結合所致。 69.一種治療方法，其係伴隨韓特氏症候群的中樞神經系統之疾病之治療方法，其包含將如上述54～57中任一項之融合蛋白質之治療上有效量，對具有該疾病的患者進行血中投予。 [發明之效果]
本發明係關於雖然是具有生理活性或藥理活性的蛋白質或低分子量之物質，但是由於幾乎或完全無法通過血腦障壁，而一直以來無法利用於血中投予的諸多物質，可將彼等作成可通過血腦障壁的形態，因此，作為用於中樞神經系統之疾病狀態之治療之血中投予用的新藥劑成為可能。
[用以實施發明的形態]
於本發明，「抗體」之用語係主要指人類抗體、小鼠抗體、人類化抗體、人類抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體、及小鼠抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體，但只要具有與特定抗原作特異性結合的性質者即可，並未限定於此等，又，對於抗體之動物種類亦未特別限制。
於本發明，「人類抗體」之用語係指其蛋白質全體係由來自人類的基因所編碼的抗體。於使基因的表現效率提升等之目的，在原本之人類基因中不對原本之胺基酸序列賦予變化地施加變異而成之基因所編碼的抗體，亦包含於「人類抗體」。又，將編碼人類抗體的2個以上之基因組合，而將某人類抗體之一部份與其他人類抗體之一部份置換的抗體亦包含於「人類抗體」。人類抗體具有免疫球蛋白輕鏈之3處所之互補決定區(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處所之互補決定區(CDR)。免疫球蛋白輕鏈之3處所之CDR係自N端側依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。免疫球蛋白重鏈之3處所之CDR亦自N端側依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。藉由將某人類抗體之CDR與其他人類抗體之CDR置換，而改變人類抗體之抗原特異性、親和性等的抗體，亦包含於人類抗體。
於本發明，藉由改變原本之人類抗體之基因，而對原本之抗體之胺基酸序列施加取代、缺失、添加等之變異的抗體，亦包含於「人類抗體」。將原本之抗體之胺基酸序列中的胺基酸以其他胺基酸取代的情形，取代的胺基酸的個數，較佳為1～20個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。於使原本之抗體之胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形，經缺失的胺基酸個數，較佳為1～20個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。又，施予將此等胺基酸之取代與缺失組合的變異的抗體，亦為人類抗體。添加胺基酸的情形，於原本抗體之胺基酸序列中或N端側或C端側，較佳為添加1～20個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個之胺基酸。施加將此等胺基酸之添加、取代及缺失組合的變異的抗體，亦為人類抗體。施加變異的抗體之胺基酸序列係與原本之抗體之胺基酸序列，較佳為顯示80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性，又更佳為顯示98%以上之同源性。因此，於本發明稱「來自人類之基因」時，除了包含來自人類之原本之基因之外，亦包含藉由對其施加改變而獲得的基因。
原本之抗體之胺基酸序列與施加變異之抗體之胺基酸序列的同源性，可使用周知之同源性計算演算法而容易地算出。例如，就此種演算法而言，有BLAST(Altschul SF. J Mol .Biol. 215. 403-10, (1990))、Pearson及Lipman之類似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))、Smith及Waterman之局部同源性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
稱「小鼠抗體」時，指其蛋白質全體係由與來自小鼠的基因所編碼的抗體相同之胺基酸序列所構成的抗體。因此，於使基因的表現效率提升等之目的，於原本之小鼠基因中，不對原本之胺基酸序列賦予變化地施加變異而成之基因所編碼的抗體，亦包含於「小鼠抗體」。又，組合編碼小鼠抗體的2個以上之基因，而將某小鼠抗體之一部分，取代為其他之小鼠抗體之一部份的抗體，亦包含於小鼠抗體。小鼠抗體具有免疫球蛋白輕鏈之3處所之互補決定區(CDR：complementary determining region的縮寫)與免疫球蛋白重鏈之3處所之互補決定區(CDR)。免疫球蛋白輕鏈之3處所之CDR係自N端側依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。免疫球蛋白重鏈之3處所之CDR係自N端側依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。例如，藉由將某小鼠抗體之CDR取代為其他之小鼠抗體之CDR，而改變小鼠抗體之抗原特異性、親和性等的抗體，亦包含於小鼠抗體。
於本發明，藉由改變原來的小鼠抗體之基因，於原本之抗體之胺基酸序列施加取代、缺失、添加等之變異的抗體，亦包含於「小鼠抗體」。將原本之抗體之胺基酸序列中之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，取代的胺基酸之個數，係較佳為1～20個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。使原本之抗體之胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸之個數係較佳為1～20個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。又，施予將此等胺基酸之取代與缺失組合的變異的抗體，亦為小鼠抗體。添加胺基酸的情形，於原本抗體之胺基酸序列中或N端側或C端側，較佳為添加1～20個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個之胺基酸。施加將此等胺基酸之添加、取代及缺失組合的變異的抗體，亦為小鼠抗體。施加變異的抗體之胺基酸序列係與原本之抗體之胺基酸序列，較佳為顯示80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性，又更佳為顯示98%以上之同源性。因此，於本發明稱「來自小鼠之基因」時，除了包含來自小鼠之原本之基因之外，亦包含藉由對其施加改變而獲得的基因。
於本發明，「人類化抗體」之用語係指可變區之一部份(例如，尤其是CDR之全部或一部份)之胺基酸序列為來自人類以外之哺乳動物，除此以外的區域係來自人類的抗體。例如，就人類化抗體而言，可列舉將構成人類抗體的免疫球蛋白輕鏈之3處所之互補決定區(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處所之互補決定區(CDR)，藉由經其他哺乳動物之CDR取代而製作的抗體。被移植至人類抗體之適當位置的成為CDR來源的其他哺乳動物的生物種類，係只要為人類以外之哺乳動物即可，並未特別限定，但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外之靈長類，更佳為小鼠及大鼠，例如小鼠。
於本發明，「嵌合抗體」之用語係指由來自2個以上不同種之2個以上之相異抗體的片段連結而成的抗體。
人類抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體係指人類抗體之一部份被取代為人類以外之哺乳動物的抗體之一部份的抗體。抗體係包含以下說明的Fc區域、Fab區域及鉸鏈部。就此種嵌合抗體之具體例而言，可列舉Fc區域為來自人類抗體而另一方面Fab區域為來自其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體。鉸鏈部係來自人類抗體或其他哺乳動物之抗體之任一者。相反地，可列舉Fc區域為來自其他哺乳動物而另一方面Fab區域為來自人類抗體的嵌合抗體。鉸鏈部可為來自人類抗體或其他哺乳動物之抗體之任一者。相反地，可列舉Fc區域為來自其他哺乳動物而另一方面Fab區域為來自人類抗體的嵌合抗體。此情形，鉸鏈部亦可為來自人類抗體或其他哺乳動物之抗體之任一者。
又，抗體亦可指包含可變區及恒定區者。就嵌合抗體之其他之具體例而言，可列舉重鏈之恒定區(CH )與輕鏈之恒定區(Cl )係來自人類抗體，另一方面，重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )係來自其他哺乳動物之抗體者，相反地，重鏈之恒定區(CH )與輕鏈之恒定區(Cl )係來自其他哺乳動物之抗體，另一方面，重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )係來自人類抗體者。本文中，其他哺乳動物之生物種類係只要為人類以外之哺乳動物即可，並未特別限定，但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外之靈長類，更佳為小鼠。
小鼠抗體與其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體係指小鼠抗體之一部份被取代為小鼠以外之哺乳動物之抗體之一部份的抗體。就此種嵌合抗體之具體例而言，可列舉Fc區域為來自小鼠抗體，而另一方面，Fab區域係來自其他哺乳動物之抗體的嵌合抗體，或相反地，Fc區域為來自其他哺乳動物，而另一方面，Fab區域為來自小鼠抗體的嵌合抗體。本文中，其他哺乳動物之生物種類係只要為小鼠以外之哺乳動物即可，並未特別限定，但較佳為大鼠、兔、馬、人類以外之靈長類，更佳為人類。
人類抗體與小鼠抗體之嵌合抗體尤其係指「人類/小鼠嵌合抗體」。人類/小鼠嵌合抗體可列舉，Fc區域為來自人類抗體而另一方面Fab區域為來自小鼠抗體的嵌合抗體，或相反地，Fc區域為來自小鼠抗體而另一方面Fab區域為來自人類抗體的嵌合抗體。鉸鏈部為來自人類抗體或小鼠抗體之任一者。就人類/小鼠嵌合抗體之其他之具體例而言，可列舉重鏈之恒定區(CH )與輕鏈之恒定區(Cl )為來自人類抗體而另一方面，重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )為來自小鼠抗體者，相反地，亦可列舉重鏈之恒定區(CH )與輕鏈之恒定區(Cl )為來自小鼠抗體而另一方面，重鏈之可變區(VH )及輕鏈之可變區(VL )為來自人類抗體者。
抗體原本具有包含2股免疫球蛋白輕鏈與2股免疫球蛋白重鏈之合計4股之多胜肽鏈的基本結構。惟，於本發明，稱「抗體」時係除了具有此基本結構之外，亦包含 (1)由1股之免疫球蛋白輕鏈與1股之免疫球蛋白重鏈之合計2股之多胜肽鏈所構成者，或如以下詳述般， (2)於免疫球蛋白輕鏈之C端側結合連接子序列，再進一步於其C端側結合免疫球蛋白重鏈而成的單股抗體，及 (3)於免疫球蛋白重鏈之C端側結合連接子序列，再進一步於其C端側結合免疫球蛋白輕鏈而成的單股抗體。又， (4)由自於原本之意義中之抗體之基本結構有缺失Fc區域的Fab區域所構成及由Fab區域與鉸鏈部之全部或一部分所構成者(包含Fab、F(ab’)及F(ab’)2 )，亦包含於本發明中的「抗體」。
本文中，Fab係指包含可變區與CL 區域(輕鏈之恒定區)之1股的輕鏈、與包含可變區與CH 1區域(重鏈之恒定區之部份1)之1股的重鏈，以各自存在的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵而結合的分子。於Fab，重鏈係除了可變區與CH 1區域(重鏈之恒定區之部份1)外，亦可包含鉸鏈部之一部份，但此情形之鉸鏈部係缺乏存在於鉸鏈部而將抗體之重鏈彼此結合的半胱胺酸殘基。於Fab，輕鏈與重鏈係藉由存在於輕鏈之恒定區的半胱胺酸殘基、與存在於重鏈之恒定區或鉸鏈部的半胱胺酸殘基之間所形成的雙硫鍵而結合。Fab因缺乏存在於鉸鏈部而結合抗體之重鏈彼此的半胱胺酸殘基，故由1股之輕鏈與1股之重鏈所構成。構成Fab的輕鏈係包含可變區與CL 區域。構成Fab的重鏈可為由可變區與CH 1區域所構成者，亦可為除了含有可變區、CH 1區域之外，含有鉸鏈部之一部份者。惟於此情形，於鉸鏈部，為了在2股之重鏈之間不形成雙硫鍵，鉸鏈部以不含有半胱胺酸殘基的方式被選擇。於F(ab’)，其重鏈係除了包含可變區及CH 1區域之外，還包含含有結合重鏈彼此之半胱胺酸殘基的鉸鏈部的全部或一部份。F(ab’)2 係指2個F(ab’) 藉由雙硫鍵將存在於彼此之鉸鏈部的半胱胺酸殘基彼此結合而成的分子。又，複數之抗體直接或介隔連接子而結合而成的二聚物、三聚物等之聚合物亦為抗體。而且，並未限定於此等，包含免疫球蛋白分子之一部份，且具有與抗原特異性結合的性質者之任一者皆包含於本發明中所謂的「抗體」。即，於本發明，稱免疫球蛋白輕鏈時，包含來自免疫球蛋白輕鏈且具有其可變區的全部或一部份之胺基酸序列者。又，稱免疫球蛋白重鏈時，包含來自免疫球蛋白重鏈且具有其可變區的全部或一部份之胺基酸序列者。因此，只要具有可變區之全部或一部份之胺基酸序列即可，例如，Fc區域缺失者亦為免疫球蛋白重鏈。
又，本文中Fc或Fc區域係指抗體分子中之主要包含由CH 2區域(重鏈之恒定區之部份2)、及CH 3區域(重鏈之恒定區之部份3)所構成的片段的區域。
此外，於本發明，稱「抗體」時，亦包含 (5)使構成上述(4)所示的Fab、F(ab’)或F(ab’)2 的輕鏈與重鏈，介隔連接子序列而結合，而各自作為單股抗體之scFab、scF(ab’)、及scF(ab’)2 。本文中，關於scFab、scF(ab’)、及scF(ab’)2 ，可為使連接子序列結合於輕鏈之C端側，更進一步使重鏈結合於其C端側而成者，又，亦可為使連接子序列結合於重鏈之C端側，更進一步使輕鏈結合於其C端側而成者。再者，使輕鏈之可變區與重鏈之可變區介隔連接子序列結合而作為單股抗體的scFv亦包含於本發明中的抗體。關於scFv，可為使連接子序列結合於輕鏈之可變區的C端側，更進一步使重鏈之可變區結合於其C端側而成者，又，可為使連接子序列結合於重鏈之可變區的C端側，更進一步使輕鏈之可變區結合於其C端側而成者。
再者，本說明書中所謂的「抗體」，除了包含完全長度的抗體、上述(1)～(5)所示者之外，亦包含較包含上述(4)及(5)更廣的概念之完全長度的抗體之一部份有缺失的抗原結合性片段(抗體片段(antibody fragment))之任一者的形態。
「抗原結合性片段」之用語係指保持與抗原之特異性結合活性的至少一部份的抗體之片段。就結合性片段之例而言，例如除了上述(4)及(5)所示者之外，包含Fab、Fab＇、F(ab＇)2 、可變區(Fv)、以適當連接子使重鏈可變區(VH )與輕鏈可變區(VL )連結的單股抗體(scFv)、為包含重鏈可變區(VH )與輕鏈可變區(VL )的多胜肽之二聚物的雙功能抗體(diabody)、為於scFv之重鏈(H鏈)有恒定區之一部份(CH 3)結合者的二聚物之微抗體(minibody)、其他的低分子化抗體等。惟，只要具有與抗原之結合能力即可，並未限定於此等之分子。又，於此等之結合性片段，不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用基因工程所改變的抗體基因而於適當宿主細胞所產生的蛋白質。
於本發明，稱「單股抗體」時，指於包含免疫球蛋白輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列之C端側結合有連接子序列，又於其C端側結合有包含免疫球蛋白重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列而成，且可與特定之抗原特異性結合的蛋白質。例如，上述(2)、(3)及(5)所示者包含於單股抗體。又，於包含免疫球蛋白重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列之C端側結合有連接子序列，又於其C端側結合有包含免疫球蛋白輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列而成，且可與特定之抗原特異性結合的蛋白質，亦為本發明中的「單股抗體」。關於於免疫球蛋白重鏈之C端側介隔連接子序列而與免疫球蛋白輕鏈結合的單股抗體，通常，免疫球蛋白重鏈係Fc區域有缺失。免疫球蛋白輕鏈之可變區具有3個參與抗體之抗原特異性的互補決定區(CDR)。同樣地，免疫球蛋白重鏈之可變區亦具有3個CDR。此等之CDR為決定抗體之抗原特異性的主要區域。因此，於單股抗體，較佳為包含免疫球蛋白重鏈之3個CDR之全部及免疫球蛋白輕鏈之3個CDR之全部。惟，只要維持了抗體之抗原特異的親和性即可，亦可作成使CDR之1個或複數個缺失的單股抗體。
於單股抗體，免疫球蛋白之輕鏈與重鏈之間所配置的連接子序列係較佳為2～50個，更佳為8～50個，進一步更佳為10～30個，又更佳為12～18個或15～25個，例如由15個或25個之胺基酸殘基所構成的胜肽鏈。此種連接子序列，只要藉此而兩鏈被連結而成的抗hTfR抗體保持對hTfR的親和性即可，並未限定於此胺基酸序列，但較佳為僅由甘胺酸或由甘胺酸與絲胺酸構成者，例如，胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有此等之胺基酸序列重複2～10次、或重複2～5次的序列者。例如，使免疫球蛋白輕鏈之可變區介隔連接子序列而結合於由免疫球蛋白重鏈之可變區的全部區域所構成的胺基酸序列之C端側的情形，由相當於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)之3個連續之合計15個的胺基酸所構成的連接子序列為適合的。
於本發明，「人類運鐵蛋白受體」或「hTfR」之用語係指具有序列識別號1所示的胺基酸序列的膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體係於其一實施態樣，對序列識別號1所示的胺基酸序列中自N端側起第89號之半胱胺酸殘基至C端之苯丙胺酸為止的部份(hTfR之細胞外區域)特異性結合者，但未被限定於此。又，於本發明「猴運鐵蛋白受體」或「猴TfR」之用語，特別是具有來自食蟹猴(Macaca fascicularis)之序列識別號2所示的胺基酸序列的膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體，於其一實施態樣中，係亦對序列識別號2所示的胺基酸序列中自N端側起第89號之半胱胺酸殘基至C端之苯丙胺酸為止的部份(猴TfR之細胞外區域)結合者，但未被限定於此。
就抗hTfR的抗體之製作方法而言，一般係使用導入了將hTfR基因併入的表現載體的細胞而製作重組人類運鐵蛋白受體(rhTfR)，並使用此rhTfR將小鼠等之動物進行免疫而得的方法。自免疫後之動物取出抗hTfR的抗體產生細胞，藉由使其與骨髓瘤細胞融合，可製作具有抗體產生能力的融合瘤細胞。
又，藉由將自小鼠等之動物所獲得的免疫系統細胞經體外免疫法以rhTfR進行免疫，亦可取得產生抗hTfR的抗體之細胞。使用體外免疫法的情形，其免疫系統細胞之來源的動物種類並未特別限定，但較佳為，小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、狗、貓、馬、及包含人類的靈長類、更佳為小鼠、大鼠及人類，進一步更佳為小鼠及人類。就小鼠之免疫系統細胞而言，可使用例如由小鼠之脾臟所製備的脾細胞。就人類之免疫系統細胞而言，可使用自人類之末梢血液、骨髓、脾臟等所製備的細胞。將人類之免疫系統細胞經體外免疫法進行免疫的情形，可獲得抗hTfR的人類抗體。
經體外免疫法將免疫系統細胞進行免疫後，藉由使細胞與骨髓瘤細胞融合，可製作具有抗體產生能力的融合瘤細胞。又，自免疫後之細胞抽出mRNA而合成cDNA，將此cDNA作為模板而經PCR反應，藉此將含編碼免疫球蛋白之輕鏈及重鏈的基因的DNA片段放大，使用此等亦可人工地再構築抗體基因。
於經上述方法所直接獲得之融合瘤細胞中，亦包含會產生將hTfR以外之蛋白質辨識為抗原之抗體的細胞。又，產生抗hTfR抗體的融合瘤細胞之全部，只要產生對hTfR顯示高親和性的抗hTfR抗體則亦未限制。
同樣地，於人工性再構築的抗體基因中，亦包含編碼將hTfR以外之蛋白質作為抗原以進行辨識的抗體的基因。又，編碼抗hTfR抗體的基因之全部，係只要具備編碼對hTfR顯示高親和性的抗hTfR抗體等之所欲特性即可，亦未限定。
因此，自上述所直接獲得之融合瘤細胞，選擇產生具有所欲特性(對hTfR的高親和性等)的抗體的融合瘤細胞的步驟成為必要。又，關於人工性再構築的抗體基因，自該抗體基因，選擇編碼具有所欲特性(抗hTfR的高親和性等)的抗體的基因的步驟成為必要。就產生對hTfR顯示高親和性的抗體(高親和性抗體)的融合瘤細胞，或就選擇編碼高親和性抗體的基因的方法而言，以下詳述的方法為有效的。又，對hTfR顯示高親和性的抗體係指藉由實施例7記載之方法所測量的與hTfR之解離常數(KD )，較佳為1×10-8 M以下，更佳為1×10-9 M以下，進一步更佳為1×10-10 以下，又進一步更佳為1×10-11 以下者。例如就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、1×10-13 M～1×10-10 者。
例如，選擇對於抗hTfR抗體產生高親和性之抗體的融合瘤細胞的情形，將重組hTfR添加至皿中而使保持於此後，添加融合瘤細胞之培養上清液，接著自皿去除未與重組hTfR結合的抗體，測量保持於皿的抗體之量的方法被使用。若依據此方法，添加於皿的融合瘤細胞之培養上清液所含的抗體之對hTfR的親和性越高，則保持於皿的抗體之量越多。因此，可測量保持於皿之抗體的量，將對應保持較多抗體的皿的融合瘤細胞，選擇作為產生對hTfR具有相對高的親和性的抗hTfR抗體的細胞株。自如此所選擇的細胞株，抽出mRNA而合成cDNA，將此cDNA作為模板，使用PCR法放大含編碼抗hTfR抗體的基因的DNA片段，藉此亦可單離編碼高親和性抗體的基因。
自上述之人工性再構築的抗體基因，選擇編碼具有高親和性的抗hTfR抗體的基因的情形，一旦將人工性再構築的抗體基因併入表現載體，則將此表現載體導入宿主細胞。此時，就使用作為宿主細胞的細胞而言，只要是可藉由將併入人工性再構築的抗體基因的表現載體導入而使抗體基因表現的細胞，則不論是原核細胞、真核細胞，並未特別限定，但人類、小鼠、中國倉鼠等之來自哺乳動物的細胞為較佳，尤其是來自中國倉鼠卵巢之CHO細胞，或來自小鼠骨髓瘤的NS/0細胞為較佳。又，使用於將編碼抗體基因的基因併入而使表現所使用的表現載體，導入哺乳動物細胞內時，只要使該基因表現，可未特別限定使用。被併入表現載體的該基因，係被配置於哺乳動物細胞內可調節基因轉錄的頻率的DNA序列(基因表現控制部位)的下游。就於本發明可使用的基因表現控制部位而言，可列舉例如，來自巨細胞病毒(cytomegalovirus)之啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α(EF-1α)啟動子，人類泛素(ubiquitin)C啟動子等。
被導入此種表現載體的哺乳動物細胞，變得會表現被併入表現載體之上述人工性再構築的抗體。自如此所獲得之表現人工性再構築的抗體的細胞，選擇產生對抗hTfR抗體具有高親和性的抗體的細胞的情形，係使用將重組hTfR添加於皿而使保持於此後，使與重組hTfR與細胞之培養上清液接觸，接著，自皿去除未與重組hTfR結合的抗體，而測量被保持於皿的抗體之量的方法。若依據此方法，細胞之培養上清液所含的抗體之對hTfR的親和性越高，則被保持於皿的抗體之量越多。因此，可測量被保持於皿之抗體的量，選擇對應保持較多抗體的皿的細胞，作為產生對hTfR具相對高的親和性的抗hTfR抗體的細胞株，進而可選擇編碼對hTfR具高親和性的抗hTfR抗體的基因。自如此所選擇的細胞株，將含編碼抗hTfR抗體的基因的DNA片段，使用PCR法而放大，藉此可單離編碼高親和性抗體的基因。
自上述之人工性再構築的抗體基因之編碼具有高親和性的抗hTfR抗體的基因的選擇，亦可將人工性再構築的抗體基因併入表現載體，將此表現載體導入大腸桿菌，而使用培養此大腸桿菌所獲得的培養上清液或使用含將大腸桿菌溶解而獲得的抗體的溶液，以與上述之選擇融合瘤細胞的情形之同樣方法，藉此選擇具有所冀望的基因的大腸桿菌。經選擇的大腸桿菌株係表現編碼對hTfR具有相對高的親和性的抗hTfR抗體的基因者。自此細胞株，可選擇編碼對hTfR具有相對高的親和性的抗hTfR抗體的基因。於大腸桿菌之培養上清液中使抗體分泌的情形，以於N端側結合有分泌訊息序列的方式將抗體基因併入表現載體即可。
就選擇編碼具有高親和性的抗hTfR抗體的基因之另一方法而言，有使上述之人工性再構築的抗體基因所編碼的抗體保持於噬菌體粒子上而表現的方法。此時，抗體基因係被再構築作為編碼單股抗體的基因。將抗體保持於噬菌體粒子上的方法係記載於國際公開公報(WO1997/09436、WO1995/11317)等，為周知。自保持人工性再構築的抗體基因所編碼的抗體的噬菌體，選擇保持對抗hTfR抗體具有高親和性的抗體的噬菌體的情形，係使用將重組hTfR添加於皿而使保持後，使噬菌體接觸，接著自皿去除未與重組hTfR結合的噬菌體，而測量被保持於皿的噬菌體之量的方法。若依據此方法，被保持於噬菌體粒子上的抗體之對hTfR的親和性越高，則被保持於皿的噬菌體之量越多。因此，可測量被保持於皿之噬菌體的量，選擇對應保持較多噬菌體的皿的噬菌體粒子，作為產生對hTfR具有相對高的親和性的抗hTfR抗體的噬菌體粒子，進而，可選擇編碼對hTfR具有高親和性的抗hTfR抗體的基因。自如此所選擇的噬菌體粒子，將含編碼抗hTfR抗體的基因的DNA片段，使用PCR法而放大，藉此可單離編碼高親和性抗體的基因。
自產生上述之對抗hTfR抗體具有高親和性的抗體的融合瘤細胞等之細胞，或自具有對抗hTfR抗體具有高親和性的抗體的噬菌體粒子，製備cDNA或噬菌體DNA，將其作為模板，可將含編碼抗hTfR抗體之輕鏈、抗hTfR抗體之重鏈、或為抗hTfR抗體的單股抗體之全部或其一部份的基因之DNA片段，藉由PCR法等進行放大而單離。同樣地，亦可將含編碼抗hTfR抗體之輕鏈可變區的全部或其一部份的基因的DNA片段、含編碼抗hTfR抗體之重鏈的可變區之全部或其一部份的基因的DNA片段，藉由PCR法等進行放大而單離。
將編碼具有此高親和性的抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈的基因之全部或其一部份併入表現載體，使用此表現載體而將哺乳動物細胞等之宿主細胞進行轉形，培養所獲得的轉形細胞，藉此可使產生具有高親和性的抗hTfR抗體。自經單離的編碼抗hTfR抗體的基因之鹼基序列，轉譯抗hTfR抗體之胺基酸序列，亦可人工性合成編碼此胺基酸序列的DNA片段。人工性合成DNA片段的情形，藉由選擇適當密碼子，可使宿主細胞中的抗hTfR抗體之表現量增加。
為了於原本之抗hTfR抗體中對胺基酸序列加入取代、缺失、添加等之變異，亦可於經單離的DNA片段所含的編碼抗hTfR抗體的基因中加入適宜變異。加入變異後之編碼抗hTfR抗體的基因係與原本之基因較佳為具有80%以上之同源性者，更佳為具有90%以上之同源性者，但對同源性並未有特別限制。藉由於胺基酸序列加入變異，改變了與抗hTfR抗體結合的糖鏈之數目、糖鏈之種類，亦可使活體內的抗hTfR抗體之穩定性增加等。
關於對編碼抗hTfR抗體之輕鏈可變區的全部或其一部份的基因加入變異的情形，加入變異後之基因係與原本基因較佳為具有80%以上之同源性，更佳為具有90%以上之同源性，但對同源性並未有特別限制。使輕鏈之可變區的胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，取代的胺基酸的個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使輕鏈之可變區的胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入將此等胺基酸之取代及缺失加以組合的變異。於輕鏈之可變區添加胺基酸的情形，輕鏈之可變區的胺基酸序列１中或於N端側或C端側，較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸被添加。亦可加入將此等胺基酸之添加、取代及缺失加以組合的變異。加入變異的輕鏈之可變區的胺基酸序列係與原本之輕鏈可變區的胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。尤其，使CDR之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，取代的胺基酸個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個。使CDR之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個。又，亦可加入將此等胺基酸之取代及缺失加以組合的變異。添加胺基酸的情形，該胺基酸序列中或於N端側或C端側，較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個之胺基酸被添加。亦可加入將此等胺基酸之添加、取代及缺失加以組合的變異。加入變異的各CDR之各自胺基酸序列係與原本之各CDR之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
關於在編碼抗hTfR抗體之重鏈的可變區之全部或其一部份的基因中加入變異的情形，加入變異後之基因係與原本之基因，較佳為具有80%以上之同源性者，更佳為具有90%以上之同源性者，但對同源性並未有特別限制。使重鏈之可變區的胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使重鏈之可變區的胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使於重鏈之可變區添加胺基酸的情形，重鏈之可變區的胺基酸序列中或於N端側或C端側，較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸被添加。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的重鏈之可變區的胺基酸序列，係與原本之重鏈的可變區之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。尤其，使CDR之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，取代的胺基酸之個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個。使CDR之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸之個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使添加胺基酸的情形，該胺基酸序列中或於N端側或C端側，較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個之胺基酸被添加。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的各CDR之各自之胺基酸序列，係與原本之各CDR之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
亦可組合上述之對於抗hTfR抗體之輕鏈的可變區的變異、與上述之對於抗hTfR抗體之重鏈的可變區的變異，而於抗hTfR抗體之輕鏈與重鏈之可變區兩者加入變異。
就上述之抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列中之胺基酸之向其他之胺基酸的取代而言，可列舉例如，為酸性胺基酸的天冬胺酸與麩胺酸之相互取代；為醯胺型胺基酸的天冬醯胺酸與麩醯胺酸之相互取代；為鹼性胺基酸的離胺酸與精胺酸之相互取代；為分枝胺基酸的纈胺酸、與白胺酸及異白胺酸之相互取代；為脂肪族胺基酸的甘胺酸與丙胺酸之相互取代；為羥基胺基酸的絲胺酸與蘇胺酸之相互取代；為芳香族胺基酸的苯丙胺酸與酪胺酸之相互取代等。
又，於抗hTfR抗體加入變異而於C端或N端添加胺基酸的情形，藉由該胺基酸而使抗hTfR抗體與其他蛋白質A融合時，該胺基酸係於融合蛋白質構成抗hTfR抗體之一部份或構成連接子之一部份。關於使抗hTfR抗體與其他蛋白質A融合時被配置於抗hTfR抗體與其他蛋白質A之間的連接子，係詳述於後。
培養產生相對於藉由上述之方法等而被選擇的hTfR具有比較高的親和性的抗hTfR抗體的細胞而獲得的抗hTfR抗體、及使編碼具有高親和性的抗hTfR抗體的基因表現而獲得的抗hTfR抗體，亦可藉由於其胺基酸序列導入取代、缺失、添加等之變異，而使具有所冀望特性的抗體改變。對於抗hTfR抗體之胺基酸序列之變異之導入，可藉由於對應其胺基酸序列的基因加入變異而進行。
抗hTfR抗體係藉由於其抗體之可變區的胺基酸序列加入取代、缺失、添加等之變異，而可適當調整抗體之對hTfR的親和性。例如，抗體與抗原之親和性高且於水性液中之解離常數為顯著低的情形，將其投予至活體內時，抗體未與抗原解離，其結果，有產生功能上不便的可能性。於如此情形，藉由於抗體之可變區導入變異，可將解離常數逐步地調整為原本抗體之2～5倍、5～10倍、10～100倍等，而獲得與目的一致的最佳抗體。相反地，藉由該變異之導入，亦可將解離常數逐步地調整為原本抗體之1/2～1/5倍、1/5～1/10倍、1/10～1/100倍等。
對於抗hTfR抗體之胺基酸序列之取代、缺失、添加等之變異的導入，可藉由例如，將編碼抗hTfR抗體的基因作為模板，藉由PCR等之方法，於基因之鹼基序列的特定部位導入變異，或隨機地導入變異來進行。
以抗體與hTfR之親和性的調整為目的之對於抗hTfR抗體之胺基酸序列的變異的導入，可藉由例如，將編碼為單股抗體的抗hTfR抗體的基因併入噬菌體質體(phagemid)，使用此噬菌體質體而製作於蛋白衣(capsid)表面上使單股抗體表現的噬菌體，藉由使變異原等作用而於編碼單股抗體的基因上一邊導入變異一邊使噬菌體增殖，自經增殖的噬菌體，藉由上述方法選擇表現具有所冀望之解離常數的單股抗體的噬菌體，或可藉由於一定條件下使用抗原管柱進行純化而獲得。
藉由選擇上述之產生高親和性抗體的細胞的方法而獲得之對hTfR具有相對高的親和性的抗體，較佳為藉由實施例7記載之方法所測量之與hTfR之解離常數(KD )，較佳為1×10-8 M以下，更佳為1×10-9 M以下，進一步更佳為1×10-10 以下，又進一步更佳為1×10-11 以下。例如就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、1×10-13 M～1×10-10 者。 即使抗體為單股抗體亦為同樣的。暫獲的抗體，能導入變異等，以具有所冀望特性的方式，進行適宜改變。
自藉由選擇產生上述之高親和性抗體的細胞的方法而獲得之具有相對高的親和性的抗體，藉由選擇對猴TfR具有親和性的抗體，可獲得對人類及猴之TfR之任一者皆具有親和性的抗體。對猴TfR具有親和性的抗體係可藉由例如，藉由使用基因重組技術而製作的重組猴TfR的ELISA法來選擇。以此ELISA法，將重組猴TfR添加於皿而使其保持於其中後，使抗hTfR抗體接觸，接著自皿去除未與重組猴TfR結合的抗體，而測量被保持於皿之抗體的量。因對重組猴TfR的親和性越高，則被保持於皿的抗體之量越多的緣故，可選擇對應保持較多抗體的皿的抗體，作為對猴TfR具有親和性的抗體。又，本文中所謂的「猴」係較佳為除了人類之外被分類為真猿類者，更佳為被分類為獼猴科(Cercopithecidae)者，進一步更佳為被分類為獼猴屬(Macaca)，例如，食蟹猴或恆河獼猴(Macaca mulatta)，尤其，在用於評價方面而言，食蟹猴係方便的。
人類及猴之hTfR的任一者皆具有親和性的抗體，具有可使用猴來觀察投予此抗體時之活體內的動態的有利效果。例如，利用本發明之抗hTfR抗體而開發醫藥的情形，因該醫藥之藥物動態試驗可使用猴來實施，故可顯著地促進該醫藥之開發。
關於係對hTfR具有相對高的親和性的抗體且為對人類及猴之TfR之任一者皆具有親和性的抗體，係藉由實施例7記載之方法所測量的與猴TfR之解離常數，較佳為5×10-8 M以下者，更佳為2×10-8 M以下者，進一步更佳為1×10-8 M以下者。例如就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～2×10-8 M、1×10-13 M～2×10-8 M。抗體即使為單股抗體亦相同。
藉由選擇產生上述之高親和性抗體的細胞的方法而獲得之對hTfR具有相對高的親和性的抗體，在為人類以外之動物的抗體的情形，可作為人類化抗體。人類化抗體係指維持對抗原的特異性，同時藉由人類以外之動物的抗體之可變區的一部份(例如，尤其CDR之全部或一部份)之胺基酸序列而將人類抗體之適當區域取代(移植)所獲得的抗體。例如，就人類化抗體而言，可列舉將構成人類抗體的免疫球蛋白輕鏈之3處所之互補決定區(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處所之互補決定區(CDR)，以其他哺乳動物之CDR取代的抗體。被併入人類抗體的CDR的來源生物種係只要為人類以外之哺乳動物即可，並未特別限定，但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、人類以外之靈長類，更佳為小鼠及大鼠，進一步更佳為小鼠。
人類化抗體之製作法係為該技術領域中所周知，最一般的是基於Winter等人所設計之將人類抗體之可變區中的互補決定區(CDR)之胺基酸序列，以非人類哺乳動物之抗體之CDR取代的方法(Verhoeyen M. Science. 239. 1534-1536 (1988))。於此，不僅非人類哺乳動物之抗體之CDR，為了再現捐贈者抗體原有的活性，有需要藉由參與CDR之結構保持或與抗原之結合的CDR外的區域之胺基酸序列，將成為接受者(acceptor)的人類抗體之對應處加以取代的情形，此亦為周知(Queen C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86. 10029-10033 (1989)。其中，CDR外的區域亦稱為架框區(framework，FR)。
即，人類化抗體之製作係包含將非人類哺乳動物之抗體之CDR(及依情況其周邊的FR)移植來替代人類抗體之可變區的CDR(及依情況其周邊的FR)的作業。於此作業，成為原本的人類抗體之可變區的架框區係可由包含生殖細胞系列抗體基因序列之公共的DNA資料庫等而獲得。例如，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖細胞系列DNA序列及胺基酸序列係可由「VBase」人類生殖細胞系序列資料庫(於網際網路www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase可取得)選擇。此外，亦可由公開的文獻，例如記載於「Kabat EA. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版,美國衛生與公共服務部, NIH Publication No. 91-3242 (1991)」、「Tomlinson IM. J. fol. Biol. 227. 776-98 (1992)」、「Cox JPL. Eur. J Immunol. 24：827-836 (1994)」等之DNA序列及胺基酸序列來選擇。
如上述，於人類化抗體，被移植於原本之人類抗體之可變區的非人類哺乳動物之抗體之區域，一般而言，包含CDR其本身、或與CDR之周邊的FR。惟，因與CDR同時被移植的FR，亦參與CDR之結構保持或與抗原之結合，且被認為實質上具有決定抗體之互補性的機能，故於本發明，「CDR」之用語於製作人類化抗體的情形，指自非人類哺乳動物之抗體被移植至人類化抗體、或可被移植的區域。即，即使為一般被稱為FR的區域，只要其被認為參與CDR之結構保持或與抗原之結合，實質上具有決定抗體之互補性的機能，於本發明皆包含於CDR。
本發明之抗hTfR抗體係藉由靜脈注射等而將其投予至活體內的情形，可與存在於腦內之微血管內皮細胞上的hTfR效率佳地結合。與hTfR結合的抗體係藉由胞吞作用(endocytosis)、胞吞轉送(transcytosis)等之機制，通過血腦障壁而被併入腦內。因此，藉由將應使於腦內發揮機能的蛋白質、低分子化合物等，使與本發明之抗hTfR抗體結合，可使此等之物質效率佳地通過血腦障壁而到達腦內。又，本發明之抗hTfR抗體係在通過血腦障壁後，到達大腦之腦實質、海馬迴的類神經細胞、小腦的普爾欽細胞(Purkinje cell)等，或至少此等之任一者。而且，亦可預料會到達大腦之紋狀體(corpus striatum)的類神經細胞及中腦之黑質的類神經細胞。因此，藉由使作用於此等組織或細胞的蛋白質、低分子化合物等與本發明之抗hTfR抗體結合，可使到達此等組織或細胞。
基於使通常無法通過血腦障壁而因此以靜脈內投予幾乎或完全無法在腦內發揮生理、藥理的作用的物質(蛋白質、低分子化合物等)，自血中到達腦內而發揮作用，本發明之抗hTfR抗體可成為有效的手段。尤其，本發明之抗hTfR抗體通過血腦障壁後，到達大腦之腦實質、海馬迴之類神經細胞、小腦之普爾欽細胞等，或至少到此等之任一者。而且，亦可預料會到達大腦之紋狀體的類神經細胞及中腦之黑質的類神經細胞。因此，藉由將彼等之物質與本發明之抗hTfR抗體分子結合的形態經靜脈內投予等而投予血中，於此等腦之組織或細胞使彼等之作用發揮或強化係成為可能的。
就使抗hTfR抗體與如此物質(蛋白質、低分子化合物等)結合的方法而言，有使介隔非胜肽連接子或胜肽連接子而結合的方法。就非胜肽連接子而言，可使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖類、聚葡糖(dextran)、聚乙烯醚、生物分解性高分子、脂質聚合物、幾丁質類、及透明質酸、或此等之衍生物、或者組合此等者。胜肽連接子係由胜肽鍵結的1～50個之胺基酸所構成的胜肽鏈或其衍生物，藉由其N端與C端各自與抗hTfR抗體或蛋白質、低分子化合物等之任一者形成共價鍵，使抗hTfR抗體與蛋白質、低分子化合物等結合。
使用PEG作為非胜肽連接子而使本發明之抗hTfR抗體與所冀望之其他蛋白質A結合者，特稱為抗hTfR抗體-PEG-蛋白質。抗hTfR抗體-PEG-蛋白質係可藉由使抗hTfR抗體與PEG結合而製作抗hTfR抗體-PEG，接著，使抗hTfR抗體-PEG與其他蛋白質A結合而製造。或者，抗hTfR抗體-PEG-蛋白質亦可藉由使其他蛋白質A與PEG結合而製作蛋白質-PEG，接著，藉由使蛋白質-PEG與抗hTfR抗體結合亦可製造。使PEG與抗hTfR抗體及其他蛋白質A結合之際，可使用經碳酸酯、羰基咪唑、羧酸之活性酯、吖內酯(azlactone)、環狀醯亞胺硫酮(cyclic imide thione)、異氰酸酯、異硫氰酸酯、亞胺酸酯、或醛等之官能基所修飾的PEG。此等PEG所導入的官能基係主要與抗hTfR抗體及其他蛋白質A分子內之胺基進行反應，藉此PEG與hTfR抗體及其他蛋白質A會共價鍵結。此時使用的PEG之分子量及形狀並未特別限定，但其平均分子量(MW)係較佳為MW＝500～60000，更佳為MW＝500～20000。例如，平均分子量為約300、約500、約1000、約2000、約4000、約10000、約20000等之PEG，可適合地使用作為非胜肽連接子。使抗hTfR抗體與所冀望之低分子化合物結合的情形亦相同。
例如，抗hTfR抗體-PEG，係藉由以相對於該抗體之ALD-PEG-ALD的莫耳比成為11、12.5、15、110、120等之方式，混合抗hTfR抗體與具有醛基作為官能基的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)，並於其中添加NaCNBH3 等之還原劑而使其反應所獲得。其次，將抗hTfR抗體-PEG，於NaCNBH3 等之還原劑的存在下，使與其他蛋白質A進行反應，藉此獲得抗hTfR抗體-PEG-蛋白質。相反地，藉由先使其他蛋白質A與ALD-PEG-ALD結合而製作蛋白質-PEG，接著使蛋白質-PEG與抗hTfR抗體結合，亦可獲得抗hTfR抗體-PEG-蛋白質。
抗hTfR抗體與其他蛋白質A，亦可於抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈之C端側或N端側，介隔連接子序列或直接地，藉由胜肽鍵而分別使其他蛋白質A之N端或C端結合。如此使抗hTfR抗體與其他蛋白質A結合而成的融合蛋白質，可藉由將DNA片段併入哺乳動物細胞用之表現載體，並培養導入此表現載體的哺乳動物細胞而獲得，其中該DNA片段係將編碼其他蛋白質A的cDNA，直接或包夾編碼連接子序列的DNA片段，以框(inframe)配置於編碼抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈的cDNA之3’末端側或5’末端側之DNA片段。於此哺乳動物細胞，於使編碼其他蛋白質A的DNA片段與重鏈結合的情形中，併入編碼抗hTfR抗體之輕鏈的cDNA片段的哺乳動物細胞用之表現載體，亦被導入相同宿主細胞，又，於使編碼其他蛋白質A的DNA片段與輕鏈結合的情形，併入編碼抗hTfR抗體之重鏈的cDNA片段的哺乳動物細胞用之表現載體，亦被導入相同宿主細胞。抗hTfR抗體為單股抗體的情形，使抗hTfR抗體與其他蛋白質A結合的融合蛋白質，係將於編碼其他蛋白質A的cDNA之5’末端側或3’末端側，直接、或包夾編碼連接子序列的DNA片段地連結有編碼單鏈抗hTfR抗體的cDNA的DNA片段，併入(哺乳動物細胞、酵母等之真核生物或大腸桿菌等之原核生物細胞用之)表現載體，並使於導入此表現載體的此等之細胞中表現，藉此而可獲得。
使其他蛋白質A結合於抗hTfR抗體之輕鏈之C端側的形式之融合蛋白質，其抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含：包含輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、與包含重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者，其他蛋白質A係與此抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈之C端側結合者。其中，抗hTfR抗體之輕鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子結合。
使其他蛋白質A結合於抗hTfR抗體之重鏈之C端側的形式之融合蛋白質，其抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含：包含輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、與包含重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者，其他蛋白質A係與此抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈之C端側結合者。其中，抗hTfR抗體之重鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子結合。
使其他蛋白質A結合於抗hTfR抗體之輕鏈之N端側的形式之融合蛋白質，其抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含：包含輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、與包含重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者，其他蛋白質A係與此抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈之N端側結合者。其中，抗hTfR抗體之輕鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子結合。
使其他蛋白質A結合於抗hTfR抗體之重鏈之N端側的形式之融合蛋白質，其抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含：包含輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、與包含重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者，其他蛋白質A係與此抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈之N端側結合者。其中，抗hTfR抗體之重鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子結合。
此時抗hTfR抗體與其他蛋白質A之間所配置的連接子序列係由較佳為1～50個，更佳為1～17個，進一步更佳為1～10個，又更佳為1～5個之胺基酸所構成的胜肽鏈，但依據應使與抗hTfR抗體結合的其他蛋白質A，構成連接子序列的胺基酸之個數可適當調整為1個、2個、3個、1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。如此連接子序列，藉此而被連結的抗hTfR抗體保持與hTfR之親和性，且藉由該連接子序列而被連結的其他蛋白質A係於生理的條件下可發揮該蛋白質之生理活性即可，其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任1種之胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個之胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之合計27個之胺基酸序列者，可適合使用作為連接子序列。
於抗hTfR抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質中，抗hTfR抗體為單股抗體的情形，包含免疫球蛋白輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列與包含免疫球蛋白重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列，一般係介隔連接子序列而結合。此時，只要對hTfR的抗hTfR抗體之親和性被保持，來自輕鏈之胺基酸序列之C端側與連接子序列結合，再者，於其C端側可與來自重鏈之胺基酸序列結合，又與此相反地，於來自重鏈之胺基酸序列之C端側可與連接子序列結合，再者，於其C端側可與來自輕鏈之胺基酸序列結合。
免疫球蛋白之輕鏈與重鏈之間所配置的連接子序列，係較佳為由2～50個胺基酸所構成的胜肽鏈，更佳為8～50個，進一步更佳為10～30個，又更佳為12～18個或15～25個，例如由15個或25個之胺基酸所構成的胜肽鏈。此種連接子序列，只要藉此兩鏈被連結而成的抗hTfR抗體保持與hTfR的親和性且與該抗體結合的其他蛋白質A於生理的條件下可發揮其生理活性即可，其胺基酸序列並無限定，但較佳為僅由甘胺酸或由甘胺酸與絲胺酸所構成者，例如，胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(序列識別號5)、或者具有此等之胺基酸序列2～10個、或2～5個連續而成的序列者。就連接子序列之較佳一態樣而言，可列舉由3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)連續而成的15個胺基酸所構成的序列。
於抗hTfR抗體為單股抗體的情形中，就本發明之人類化抗hTfR抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質之具體的態樣之一例而言，可例示於其他蛋白質A之C端側，介隔由於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸所構成的第1連接子序列，而結合有單股抗體者。就其中所使用之單股抗體之較佳一態樣而言，可列舉於具有序列識別號205所記載之胺基酸序列的抗hTfR抗體重鏈之可變區的C端，介隔由3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)連續而成之共計15個之胺基酸所構成的第1連接子序列，而結合有具有序列識別號191所記載之胺基酸序列的抗hTfR抗體輕鏈之可變區的具有序列識別號277所記載之胺基酸序列者。
抗hTfR抗體為單股抗體的情形中之此種融合蛋白質，例如可藉由下列製造：利用併入具有編碼融合蛋白質的鹼基序列的DNA片段之表現載體，使哺乳動物細胞等之宿主細胞轉形，並培養此宿主細胞。
又，於本發明中，於1個胜肽鏈含有複數個連接子序列的情形，為方便起見，各連接子序列係自N端側依序命名為第1連接子序列、第2連接子序列。
抗hTfR抗體為Fab的情形中，就本發明之人類化抗hTfR抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質之具體的態樣之一例而言，可列舉於其他蛋白質A之C端側，介隔由於Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸所構成的連接子序列，使包含抗hTfR抗體重鏈之可變區與CH 1區域的區域融合者。此時除了CH 1區域之外，亦可包含鉸鏈部之一部份，但該鉸鏈部不包含形成雙硫鍵的半胱胺酸殘基。
應使與抗hTfR抗體結合之其他蛋白質A，並未特別限定，但其係可於活體內發揮生理活性者，尤其，亦不限於應到達腦內而發揮機能者，其係因無法直接通過血腦障壁，故無法期待以靜脈內投予便能在腦內發揮機能的蛋白質。就此種蛋白質而言，可列舉例如，神經成長因子(NGF)、或α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡萄糖腦苷酶、β-半乳糖苷酶、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷轉移酶、α-甘露糖酶、β-甘露糖酶、半乳糖神經醯胺酶、鞘脂激活蛋白C、烯丙基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基葡萄糖胺酶、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基葡萄糖胺、乙醯基CoAα-氨基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1、6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬胺醯基葡萄糖胺酶(PPT1)、三肽基肽酶-1、玻糖醛酸酶-1、CLN1、CLN2等之溶酶體酵素。
使與抗hTfR抗體結合的神經成長因子(NGF)，可使用作為阿滋海默氏症之痴呆症治療藥；使與抗hTfR抗體融合的α-L-艾杜糖醛酸酶，可使用作為賀勒氏症候群或賀勒氏・施艾氏症候群(Hurler・Scheie syndrome)中的中樞神經障礙治療劑；使與抗hTfR抗體融合的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，可使用作為韓特氏症候群中的中樞神經障礙治療劑；葡萄糖腦苷酶，可使用作為高雪氏症(Gaucher's disease)中的中樞神經障礙治療劑；β半乳糖苷酶，可使用作為GM1-神經節醣苷病(GM1-gangliosidosis)1～3型中的中樞神經障礙治療劑；GM2活性化蛋白質，可使用作為GM2-神經節醣苷病AB異型中的中樞神經障礙治療劑；β-己醣胺酶A，可使用作為山德霍夫症(Sandhoff's disease)及泰-歇克斯症(Tay-Sachs disease)中的中樞神經障礙治療劑；β-己醣胺酶B，可使用作為山德霍夫症中的中樞神經障礙治療劑；N-乙醯葡萄糖胺-1-磷轉移酶，可使用作為I-細胞病中的中樞神經障礙治療劑；α-甘露糖酶，可使用作為α-甘露醣儲積症(α-mannosidosis)中的中樞神經障礙治療劑；β-甘露糖酶，可使用作為β-甘露醣儲積症中的中樞神經障礙治療劑；半乳糖神經醯胺酶，可使用作為克拉伯病(Krabbe disease)中的中樞神經障礙治療劑；鞘脂激活蛋白C，可使用作為類高雪氏症(gaucher-like disease)中的中樞神經障礙治療劑；烯丙基硫酸酯酶A，可使用作為異染性白質失養症(異染性腦白質退化症(metachromatic leukodystrophy))中的中樞神經障礙治療劑；α-L-岩藻糖苷酶，可使用作為岩藻糖沉積症(fucosidosis)中的中樞神經障礙治療劑；天冬胺醯基葡萄糖胺酶，可使用作為天冬胺醯葡萄糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)中的中樞神經障礙治療劑；α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶(α-N-acetylgalactosaminidase)，可使用作為辛德勒病(Schindler disease)及川崎病中的中樞神經障礙治療劑；酸性神經髓磷脂酶，可使用作為尼曼匹克症(Niemann-Pick disease)中的中樞神經障礙治療劑；α-半乳糖苷酶A，可使用作為法布瑞氏症(Fabry disease)中的中樞神經障礙治療劑；β-葡萄糖醛酸苷酶，可使用作為Sly症候群(Sly syndrome)中的中樞神經障礙治療劑；乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基葡萄糖胺、乙醯基CoAα-氨基葡糖苷N-乙醯基轉移酶及N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶，可使用作為聖菲利柏氏症(Sanfilippo syndrome)中的中樞神經障礙治療劑；酸性神經醯胺酶，可使用作為法韋爾病(Farber's disease)中的中樞神經障礙治療劑；澱粉-1,6-葡萄糖苷酶，可使用作為克芮氏症(Cori's disease)(法韋爾・克芮氏症)中的中樞神經障礙治療劑；唾液酸酶，可使用作為唾液酸酶缺損症中的中樞神經障礙治療劑；天冬胺醯基葡萄糖胺酶，可使用作為天冬氨醯葡萄糖胺尿症中的中樞神經障礙治療劑；軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1(PPT-1)，可使用作為神經性類蠟脂褐質病(neuronal ceroid lipofuscinosis)或桑-哈二氏病(Santavuori-Haltia disease)中的中樞神經障礙治療劑；三肽基肽酶-1(TPP-1)，可使用作為神經性類蠟脂褐質病或詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)中的中樞神經障礙治療劑；玻糖醛酸酶-1，可使用作為玻糖醛酸酶缺損症中的中樞神經障礙治療劑；CLN1及2，可使用作為巴登氏病(Batten disease)中的中樞神經障礙治療劑。尤其，本發明之抗hTfR抗體，因在通過血腦障壁後，會到達大腦之腦實質、海馬迴之類神經細胞、小腦之普爾欽細胞(Purkinje cell)等，故藉由使與應會在此等組織或細胞發揮藥效機能的蛋白質融合，可強化其蛋白質之藥效。惟，醫藥用途並未限於此等之疾病。
此外，就使與抗hTfR抗體結合而可發揮藥效的蛋白質而言，可列舉：溶酶體酵素、睫狀體神經營養因子(CNTF)、來自神經膠細胞株的神經營養因子(GDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1、紅血球生成素、達依泊汀、活化素、鹼性纖維母細胞成長因子(bFGF)、纖維母細胞成長因子2(FGF2)、上皮細胞增殖因子(EGF)、血管內皮增殖因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、各種細胞介素、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、PD-1配位體、具有分解beta-類澱粉的活性的酵素、抗beta-類澱粉抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗HER2抗體、抗TNF-α抗體、及其他之抗體醫藥等。
使與抗hTfR抗體結合的溶酶體酵素，可使用作為溶酶體病中的中樞神經障礙治療劑；CNTF，可使用作為肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之治療劑；GDNF、神經滋養素3及神經滋養素4/5，可作為腦缺血之治療劑；GDNF，可使用作為帕金森氏病之治療劑；神經調節蛋白1，可使用作為思覺失調症之治療劑；紅血球生成素及達依泊汀，可使用作為腦缺血之治療劑；bFGF及FGF2，可使用作為外傷性之中樞神經系統障礙之治療劑；腦外科手術、脊椎外科手術後之回復中，具有分解beta-類澱粉的活性之酵素、抗beta-類澱粉抗體及抗BACE抗體，可使用作為阿滋海默氏症之治療劑；抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、及抗HER2抗體，可使用作為包含腦腫瘤的中樞神經系統腫瘤之治療劑；TNFαR-抗hTfR抗體可使用作為腦缺血及腦炎症性疾病之治療劑。
對阿滋海默氏症、帕金森氏病、亨汀頓氏症等之神經變性疾病、思覺失調症、憂鬱症等之精神障礙、多發性硬化症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、包含腦腫瘤的中樞神經系統之腫瘤、伴隨腦障礙的溶酶體病、肝醣病、肌肉營養不良、腦缺血、腦炎症性疾病、普里昂疾病、外傷性之中樞神經系統障礙等之疾病的治療劑，一般而言係可成為應使與抗hTfR抗體融合之其他蛋白質A。又，對病毒性及細菌性之中樞神經系統疾病的治療劑，一般而言亦可成為應使與抗hTfR抗體融合之其他蛋白質A。再者，亦可使用於腦外科手術、脊椎外科手術後之回復的藥劑，一般而言亦可成為應使與抗hTfR抗體融合之其他蛋白質A。
就應使與抗hTfR抗體結合之其他蛋白質A而言，除了上述之蛋白質之天然型(野生型)者之外，天然型(野生型)之此等蛋白質之1個或複數個之胺基酸被取代為其他之胺基酸、被缺失等的類似物，只要完全地或部份具有作為此等蛋白質之機能即可，亦包含於此等蛋白質。使胺基酸取代為其他胺基酸的情形，經取代的胺基酸之個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。使胺基酸缺失的情形，經缺失的胺基酸之個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。又，組合此等胺基酸之取代及缺失，亦可作成所冀望的類似物。再者，於天然型(野生型)之蛋白質或其類似物之胺基酸序列中或者N端側或C端側，經添加1個或複數個胺基酸者，只要完全或部份地具有作為此等蛋白質之機能，亦包含於此等蛋白質。此時所添加的胺基酸之個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。組合此等胺基酸之添加、取代及缺失，亦可作成所冀望的此等蛋白質之類似物。
又，於此等其他蛋白質A加入變異而於C端或N端添加胺基酸的情形，其添加的胺基酸，於使此等蛋白質與抗hTfR抗體融合時，成為位於此等蛋白質與抗hTfR抗體之間的情形，該添加的胺基酸可作為構成抗hTfR抗體之一部份，又亦可作為構成連接子之一部份。
天然型之人類I2S(hI2S)係由序列識別號246所示的525個胺基酸所構成的溶酶體酵素之一種。本發明中，作為抗hTfR抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質之具體的態樣之一例，可列舉於抗hTfR抗體重鏈之C端介隔作為連接子序列之胺基酸序列Gly-Ser而使天然型之人類I2S融合之型式者。就此種融合蛋白質而言，可例示： (1)輕鏈係由序列識別號164記載之胺基酸序列所構成且於C端側藉由胜肽鍵介隔連接子序列Gly-Ser與人類I2S結合的重鏈係由序列識別號247記載之胺基酸序列所構成， (2)輕鏈係由序列識別號180記載之胺基酸序列所構成且於C端側藉由胜肽鍵介隔連接子序列Gly-Ser與人類I2S結合的重鏈係由序列識別號249記載之胺基酸序列所構成，及 (3)輕鏈係由序列識別號196記載之胺基酸序列所構成且於C端側藉由胜肽鍵介隔連接子序列Gly-Ser與人類I2S結合的重鏈係由序列識別號251記載之胺基酸序列所構成。
於本發明中，「人類I2S」或「hI2S」之用語係尤其指具有與天然型之hI2S相同之胺基酸序列的hI2S，但並未限於此等，只要具有I2S活性即可，於天然型之hI2S之胺基酸序列加入取代、缺失、添加等之變異者亦包含於hI2S。使hI2S之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hI2S之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。於hI2S添加胺基酸的情形，於hI2S之胺基酸序列中或N端側或C端側，較佳添加1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hI2S之胺基酸序列係與原本之hI2S之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
又於此，稱hI2S具有I2S活性時，係指使與抗hTfR抗體融合時，相對於天然型之hI2S本來具有的活性，具有3%以上之活性者。惟，其活性相對於天然型之hI2S本來具有的活性，10%以上為較佳，20%以上為更佳，50%以上為進一步更佳，80%以上為又更佳。使與抗hTfR抗體融合的hI2S係經加入變異者的情形亦相同。
抗hTfR抗體與人類I2S之融合蛋白質，可藉由例如下述方法製造：藉由併入具有編碼序列識別號249所示的胺基酸序列的序列識別號250所示的鹼基序列的DNA片段之表現載體、與具有編碼具有序列識別號180所示的胺基酸序列的抗hTfR抗體輕鏈的序列識別號181所示的鹼基序列的DNA片段之表現載體，而使哺乳動物細胞等之宿主細胞轉形，並培養此宿主細胞。所製造的融合蛋白質，可使用作為韓特氏病(Hunter's disease)之治療劑，尤其是作為韓特氏病中的中樞神經障礙治療劑。
又，於抗hTfR抗體或人類I2S加入變異而於C端或N端添加胺基酸的情形，其添加的胺基酸被配置於抗hTfR抗體與人類I2S之間時，該添加的胺基酸可構成抗hTfR抗體或人類I2S之一部份，又亦可構成連接子之一部份。
如上述雖例示抗hTfR抗體與人類I2S之融合蛋白質，但於抗hTfR抗體與人類I2S之融合蛋白質之較佳實施形態中，抗hTfR抗體之重鏈及輕鏈之CDR之胺基酸序列係只要抗體對hTfR具有特異的親和性即可，並未特別限制。惟，本發明之抗hTfR抗體較佳為，藉由實施例7記載之方法所測量之與hTfR的解離常數(KD )較佳為1×10-8 M以下者，更佳為1×10-9 M以下者，進一步更佳為1×10-10 以下者。例如，就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、為1×10-13 M～1×10-10 M者。抗體即使為單股抗體亦相同。又，本發明之抗hTfR抗體對猴TfR亦具有親和性的情形，藉由實施例7記載之方法所測量之抗hTfR抗體之與猴TfR的解離常數，較佳為5×10-8 M以下，更佳為2×10-8 M以下，進一步更佳為1×10-8 M以下。例如，就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～2×10-8 M者、為1×10-13 M～2×10-8 M者。即使抗體為單股抗體亦相同。
於抗hTfR抗體，藉由與使其他蛋白質A結合至抗hTfR抗體之相同手法，亦可使比較短的胜肽鏈結合。應使與抗hTfR抗體結合的胜肽鏈，只要係其胜肽鏈具有所冀望之生理活性即可，並未限定，可列舉例如，具有發揮各種蛋白質之生理活性的領域之胺基酸序列的胜肽鏈。胜肽鏈之鏈長並未特別限定，但較佳為由2～200個之胺基酸所構成者，例如由5～50個之胺基酸構成者。
使低分子物質結合至抗hTfR抗體的情形，成為候補的低分子物質並未特別限定，亦不限於為應到達腦內而發揮其機能者，而為因無法直接通過血腦障壁，故在以靜脈內投予時無法期待可在腦內發揮機能的低分子物質。例如，就該低分子物質而言，可列舉環磷醯胺(cyclophosphamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、黴法蘭(melphalan)、硫酸布他卡因(busulfan)、沙奧特帕(thiotepa)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴仁(dacarbazine)、甲芐肼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、卡莫司汀(carmustine)、鏈佐黴素(streptozotocin)、苯達莫司汀(bendamustine)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、益樂鉑(oxaliplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲異噁唑(sulfamethoxazole)、氨甲蝶呤(methotrexate)、曲美普林(trimethoprim)、吡利美胺(pyrimethamine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟胞嘧啶(flucytosine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、噴司他丁(pentostatin)、羥基脲(hydroxyurea)、氟達拉濱(fludarabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、阿黴素(doxorubicin)、依妥普賽(etoposide)、左氧氟沙星(levofloxacin)、賽普沙辛(ciprofloxacin)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、絲裂黴素C(mitomycin C)、阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)等之抗癌劑。此外，作為應使與抗hTfR抗體結合的低分子物質，可列舉siRNA、反義DNA、短胜肽。
使抗hTfR抗體與低分子物質結合的情形，低分子物質可僅與輕鏈或重鏈之任一者結合，又，亦可與輕鏈及重鏈各別結合。又，抗hTfR抗體只要係具有對hTfR的親和性者即可，可為包含含有輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、及/或含有重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者。
對於阿滋海默氏症、帕金森氏病、亨汀頓氏症等之神經變性疾病、思覺失調症、憂鬱症等之精神障礙、多發性硬化症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、包含腦腫瘤的中樞神經系統之腫瘤、伴隨腦障礙的溶酶體病、肝醣病、肌肉營養不良、腦缺血、腦炎症性疾病、普里昂疾病、外傷性之中樞神經系統障礙等之疾病的治療劑，一般而言，應使與抗hTfR抗體融合的低分子物質可為候選。又，對於病毒性及細菌性之中樞神經系統疾病的治療劑，一般而言，應使與抗hTfR抗體融合的低分子物質亦可為候選。再者，於腦外科手術、脊椎外科手術後之回復中亦可使用的藥劑，一般而言，應使與抗hTfR抗體融合的低分子物質亦可為候選。
抗hTfR抗體為人類以外之動物的抗hTfR抗體的情形，將其投予至人類時，會引發對該抗體的抗原抗體反應，產生不良副作用的可能性高。人類以外之動物的抗體，藉由作成人類化抗體，可減少此種抗原性，可抑制起因於投予至人類時的抗原抗體反應之副作用的發生。又，若依據使用猴的實驗，已有報告指出，與小鼠抗體相比，人類化抗體於血中較安定，並認為治療效果可更為長期間持續。藉由使用人類抗體作為抗hTfR抗體，亦可抑制起因於抗原抗體反應之副作用的發生。
關於抗hTfR抗體為人類化抗體或人類抗體的情形，以下進一步詳細說明。人類抗體之輕鏈中，有λ鏈及κ鏈。構成抗hTfR抗體的輕鏈，可為λ鏈及κ鏈之任一者。又，人類之重鏈中，有γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈，各自對應IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。構成抗hTfR抗體的重鏈，可為γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈之任一者，但較佳為γ鏈。再者，人類之重鏈之γ鏈中，有γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈，各自對應IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。構成抗hTfR抗體的重鏈為γ鏈的情形，其γ鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者，但較佳為γ1鏈或γ4鏈。抗hTfR抗體為人類化抗體或人類抗體，且為IgG的情形，人類抗體之輕鏈可為λ鏈與κ鏈之任一者，人類抗體之重鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者，但較佳為γ1鏈或γ4鏈。例如，就較佳抗hTfR抗體之一個態樣而言，可列舉輕鏈為λ鏈且重鏈為γ1鏈者。
抗hTfR抗體為人類化抗體或人類抗體的情形，抗hTfR抗體與其他蛋白質A，係可於抗hTfR抗體之重鏈或輕鏈之N端(或C端)，介隔連接子序列或直接地，使其他蛋白質A之C端(或N端)，各自藉由胜肽鍵而結合。使其他蛋白質A結合於抗hTfR抗體之重鏈之N端側(或C端側)的情形，於抗hTfR抗體之γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈或ε鏈之N端(或C端)，介隔連接子序列或直接地，藉由胜肽鍵各自結合其他蛋白質A之C端(或N端)。使其他蛋白質A結合於抗hTfR抗體之輕鏈之N端側(或C端側)的情形，於抗hTfR抗體之λ鏈與κ鏈之N端(或C端)，介隔連接子序列或直接地，藉由胜肽鍵各自結合其他蛋白質A之C端(或N端)。惟，抗hTfR抗體為欠缺Fc區域而由Fab區域所構成者(Fab)、或由Fab區域及鉸鏈部之全部或一部份所構成者(F(ab’)2 及F(ab’))的情形，其他蛋白質A，可各自藉由胜肽鍵，介隔連接子序列或直接地，使其C端(或N端)結合於構成Fab、F(ab’)2 及F(ab’)的重鏈或輕鏈之N端(或C端)。
在使其他蛋白質A結合至為人類化抗體或人類抗體之抗hTfR抗體之輕鏈之C端側的融合蛋白質中，抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含含有輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者。其中，抗hTfR抗體之輕鏈與其他蛋白質A可直接鍵結，亦可介隔連接子而結合。
在使其他蛋白質A結合至為人類化抗體或人類抗體之抗hTfR抗體之重鏈之C端側的融合蛋白質中，抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含含有輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者。其中，抗hTfR抗體之重鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子而結合。
在使其他蛋白質A結合至為人類化抗體或人類抗體之抗hTfR抗體之輕鏈之N端側的融合蛋白質中，抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含含有輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者。其中，抗hTfR抗體之輕鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子而結合。
在使其他蛋白質A結合至為人類化抗體或人類抗體之抗hTfR抗體之重鏈之N端側的融合蛋白質中，抗人類運鐵蛋白受體抗體係包含含有輕鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區的全部或一部份的胺基酸序列者。其中，抗hTfR抗體之重鏈與其他蛋白質A可直接結合，亦可介隔連接子而結合。
於抗hTfR抗體與其他蛋白質A之間配置連接子序列的情形，抗hTfR抗體與其他蛋白質A之間所配置的連接子序列係較佳為由1～50個胺基酸所構成的胜肽鏈，但依據應使與抗hTfR抗體結合的其他蛋白質A，構成連接子序列的胺基酸之個數可適宜調整為1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個等。此種連接子序列，只要藉由該連接子序列而連結的抗hTfR抗體與其他蛋白質A保持各自之機能(對hTfR的親和性、及生理的條件下之活性或機能)即可，其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任1個的胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有此等之胺基酸序列連續1～10個、或2～5個而成的序列者。例如，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個的胺基酸序列者，可適合地使用作為連接子序列。
其中，稱使與抗hTfR抗體融合的其他蛋白質A係於該其他蛋白質A之生理的條件下保持活性或機能時或僅稱具有活性時，係指天然型的其他蛋白質A相對於本來具有的活性，保持3%以上之活性或機能。惟，其活性或機能，相對於天然型之其他蛋白質A本來具有的活性，係10%以上為較佳，20%以上為更佳，50%以上為進一步較佳，80%以上為又更佳。使與抗hTfR抗體融合的其他蛋白質A為經加入變異者的情形亦相同。
就本發明中之人類化抗hTfR抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質的更具體的態樣之一例而言，可列舉於抗hTfR抗體重鏈之C端側，介隔由於Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸所構成的連接子序列，而使其他蛋白質A融合者。
就抗hTfR抗體為Fab的情形中的本發明之人類化抗hTfR抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質之具體的態樣之一例而言，可列舉於其他蛋白質A之C端側，介隔由於Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸所構成的連接子序列，使含有抗hTfR抗體重鏈之可變區與CH 1區域的區域融合者。此時除了CH 1區域，亦可包含鉸鏈部之一部份，但該鉸鏈部並不包含形成雙硫鍵的半胱胺酸殘基。
抗hTfR抗體之對hTfR的特異親和性，主要依存於抗hTfR抗體之重鏈及輕鏈之CDR之胺基酸序列。彼等CDR之胺基酸序列只要係抗hTfR抗體具有對hTfR的特異親和性者即可，並無特別限制。惟，本發明之抗hTfR抗體較佳為，藉由實施例7記載之方法所測量之與hTfR的解離常數(KD )較佳為1×10-8 M以下者，更佳為1×10-9 M以下者，進一步更佳為1×10-10 以下者，又進一步更佳為1×10-11 以下者。例如，就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、為1×10-13 M～1×10-10 M者。即使抗體為單股抗體亦相同。又，本發明之抗hTfR抗體對猴TfR亦具有親和性的情形，藉由實施例7記載之方法所測量之抗hTfR抗體之與猴TfR的解離常數，較佳為5×10-8 M以下，更佳為2×10-8 M以下，進一步更佳為1×10-8 M以下。例如，就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～2×10-8 M者、為1×10-13 M～2×10-8 M者。即使抗體為單股抗體亦相同。
就對hTfR具有親和性的抗體之較佳實施形態而言，可例示抗體之輕鏈之CDR為具有以下所示之(1)～(14)記載之胺基酸序列者。即： (1)作為CDR1之序列識別號6或序列識別號7之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列、或胺基酸序列Trp-Thr-Ser，及作為CDR3之序列識別號10之胺基酸序列； (2)作為CDR1之序列識別號11或序列識別號12之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列、或胺基酸序列Tyr-Ala-Ser；，及作為CDR3之序列識別號15之胺基酸序列； (3)作為CDR1之序列識別號16或序列識別號17之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號18或序列識別號19之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser，及作為CDR3之序列識別號20之胺基酸序列； (4)作為CDR1之序列識別號21或序列識別號22之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號23或序列識別號24之胺基酸序列、或胺基酸序列Asp-Thr-Ser，及作為CDR3之序列識別號25之胺基酸序列； (5)作為CDR1之序列識別號26或序列識別號27之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號28或序列識別號29之胺基酸序列、或胺基酸序列Asp-Thr-Ser，及作為CDR3之序列識別號30之胺基酸序列； (6)作為CDR1之序列識別號31或序列識別號32之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號33或序列識別號34之胺基酸序列、或胺基酸序列Ala-Ala-Ser，及作為CDR3之序列識別號35之胺基酸序列； (7)作為CDR1之序列識別號36或序列識別號37之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號38或序列識別號39之胺基酸序列、或胺基酸序列Gln-Th-Ser，及作為CDR3之序列識別號40之胺基酸序列； (8)作為CDR1之序列識別號41或序列識別號42之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號43或序列識別號44之胺基酸序列、或胺基酸序列Gly-Thr-Ser，及作為CDR3之序列識別號45之胺基酸序列； (9)具有作為CDR1之序列識別號46或序列識別號47之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號48或序列識別號49之胺基酸序列、或胺基酸序列Phe-Thr-Ser，及作為CDR3之序列識別號50之胺基酸序列的輕鏈； (10)作為CDR1之序列識別號51或序列識別號52之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號53或序列識別號54之胺基酸序列、或胺基酸序列Ala-Ala-Ser，及作為CDR3之序列識別號55之胺基酸序列； (11)作為CDR1之序列識別號56或序列識別號57之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號58或序列識別號59之胺基酸序列、或胺基酸序列Tyr-Ala-Ser，及作為CDR3之序列識別號60之胺基酸序列； (12)作為CDR1之序列識別號61或序列識別號62之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號63或序列識別號64之胺基酸序列、或胺基酸序列Trp-Ser-Ser，及作為CDR3之序列識別號65之胺基酸序列； (13)作為CDR1之序列識別號66或序列識別號67之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號68或序列識別號69之胺基酸序列、或胺基酸序列Tyr-Ala-Ser，及作為CDR3之序列識別號70之胺基酸序列； (14)作為CDR1之序列識別號71或序列識別號72之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號73或序列識別號74之胺基酸序列、或胺基酸序列Asp-Thr-Ser，及作為CDR3之序列識別號75之胺基酸序列。
就對hTfR具有親和性的抗體之更具體的實施形態而言，可例示抗體之輕鏈之CDR為具有以下所示的(1)～(14)記載之胺基酸序列者。即： (1)作為CDR1之序列識別號6、作為CDR2之序列識別號8、及作為CDR3之序列識別號10記載之胺基酸序列； (2)作為CDR1之序列識別號11、作為CDR2之序列識別號13、及作為CDR3之序列識別號15記載之胺基酸序列； (3)作為CDR1之序列識別號16、作為CDR2之序列識別號18、及作為CDR3之序列識別號20記載之胺基酸序列； (4)作為CDR1之序列識別號21、作為CDR2之序列識別號23、及作為CDR3之序列識別號25記載之胺基酸序列； (5)作為CDR1之序列識別號26、作為CDR2之序列識別號28、及作為CDR3之序列識別號30記載之胺基酸序列； (6)作為CDR1之序列識別號31、作為CDR2之序列識別號33、及作為CDR3之序列識別號35記載之胺基酸序列； (7)作為CDR1之序列識別號36、作為CDR2之序列識別號38、及作為CDR3之序列識別號40記載之胺基酸序列； (8)作為CDR1之序列識別號41、作為CDR2之序列識別號43、及作為CDR3之序列識別號45記載之胺基酸序列； (9)作為CDR1之序列識別號46、作為CDR2之序列識別號48、及作為CDR3之序列識別號50記載之胺基酸序列； (10)作為CDR1之序列識別號51、作為CDR2之序列識別號53、及作為CDR3之序列識別號55記載之胺基酸序列； (11)作為CDR1之序列識別號56、作為CDR2之序列識別號58、及作為CDR3之序列識別號60記載之胺基酸序列； (12)作為CDR1之序列識別號61、作為CDR2之序列識別號63、及作為CDR3之序列識別號65記載之胺基酸序列； (13)作為CDR1之序列識別號66、作為CDR2之序列識別號68、及作為CDR3之序列識別號70記載之胺基酸序列； (14)作為CDR1之序列識別號71、作為CDR2之序列識別號73、及作為CDR3之序列識別號75記載之胺基酸序列。
就對hTfR具有親和性的抗體之較佳實施形態而言，可例示抗體之重鏈之CDR為具有以下所示的(1)～(14)記載之胺基酸序列者。即： (1)作為CDR1之序列識別號76或序列識別號77之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號78或序列識別號79之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號80或序列識別號81之胺基酸序列； (2)作為CDR1之序列識別號82或序列識別號83之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號84或序列識別號85之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號86或序列識別號87之胺基酸序列； (3)作為CDR1之序列識別號88或序列識別號89之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號90或序列識別號91之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號92或序列識別號93之胺基酸序列； (4)作為CDR1之序列識別號94或序列識別號95之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號96或序列識別號97之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號98或序列識別號99之胺基酸序列； (5)作為CDR1之序列識別號100或序列識別號101之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號102或序列識別號103之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號104或序列識別號105之胺基酸序列； (6)作為CDR1之序列識別號106或序列識別號107之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號108之胺基酸序列或序列識別號278之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號109或序列識別號110之胺基酸序列； (7)作為CDR1之序列識別號111或序列識別號112之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號113或序列識別號114之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號115或序列識別號116之胺基酸序列； (8)作為CDR1之序列識別號117或序列識別號118之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號119之胺基酸序列或序列識別號279之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號120或序列識別號121之胺基酸序列； (9)作為CDR1之序列識別號122或序列識別號123之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號124或序列識別號125之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號126或序列識別號127之胺基酸序列； (10)作為CDR1之序列識別號128或序列識別號129之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號130或序列識別號131之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號132或序列識別號133之胺基酸序列； (11)作為CDR1之序列識別號134或序列識別號135之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號136或序列識別號137之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號138或序列識別號139之胺基酸序列； (12)作為CDR1之序列識別號140或序列識別號141之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號142或序列識別號143之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號144或序列識別號145之胺基酸序列； (13)作為CDR1之序列識別號146或序列識別號147之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號148或序列識別號149之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號150或序列識別號151之胺基酸序列；及 (14)作為CDR1之序列識別號152或序列識別號153之胺基酸序列，作為CDR2之序列識別號154或序列識別號155之胺基酸序列，及作為CDR3之序列識別號156或序列識別號157之胺基酸序列。
就對hTfR具有親和性的抗體之更具體的實施形態而言，可例示抗體之重鏈之CDR為具有以下所示的(1)～(14)記載之胺基酸序列者。即： (1)作為CDR1之序列識別號76、作為CDR2之序列識別號78、及作為CDR3之序列識別號80記載之胺基酸序列； (2)作為CDR1之序列識別號82、作為CDR2之序列識別號84、及作為CDR3之序列識別號86記載之胺基酸序列； (3)作為CDR1之序列識別號88、作為CDR2之序列識別號90、及作為CDR3之序列識別號92記載之胺基酸序列； (4)作為CDR1之序列識別號94、作為CDR2之序列識別號96、及作為CDR3之序列識別號98記載之胺基酸序列； (5)作為CDR1之序列識別號100、作為CDR2之序列識別號102、及作為CDR3之序列識別號104記載之胺基酸序列； (6)作為CDR1之序列識別號106、作為CDR2之序列識別號108、及作為CDR3之序列識別號109記載之胺基酸序列； (7)作為CDR1之序列識別號111、作為CDR2之序列識別號113、及作為CDR3之序列識別號115記載之胺基酸序列； (8)作為CDR1之序列識別號117、作為CDR2之序列識別號119、及作為CDR3之序列識別號120記載之胺基酸序列； (9)作為CDR1之序列識別號122、作為CDR2之序列識別號124、及作為CDR3之序列識別號126記載之胺基酸序列； (10)作為CDR1之序列識別號128、作為CDR2之序列識別號130、及作為CDR3之序列識別號132記載之胺基酸序列； (11)作為CDR1之序列識別號134、作為CDR2之序列識別號136、及作為CDR3之序列識別號138記載之胺基酸序列； (12)作為CDR1之序列識別號140、作為CDR2之序列識別號142、及作為CDR3之序列識別號144記載之胺基酸序列； (13)作為CDR1之序列識別號146、作為CDR2之序列識別號148、及作為CDR3之序列識別號150記載之胺基酸序列；及 (14)作為CDR1之序列識別號152、作為CDR2之序列識別號154、及作為CDR3之序列識別號156記載之胺基酸序列。
就對hTfR具有親和性的抗體之較佳輕鏈與重鏈之組合而言，可例示CDR具有以下所示的(1)～(14)記載之胺基酸序列者。即： (1)具有作為CDR1之序列識別號6或序列識別號7之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列或者胺基酸序列Trp-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號10之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號76或序列識別號77之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號78或序列識別號79之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號80或序列識別號81之胺基酸序列的重鏈之組合； (2)具有作為CDR1之序列識別號11或序列識別號12之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列或者胺基酸序列(Tyr Ala Ser)、及作為CDR3之序列識別號15之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號82或序列識別號83之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號84或序列識別號85之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號86或序列識別號87之胺基酸序列的重鏈之組合； (3)具有作為CDR1之序列識別號16或序列識別號17之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號18或序列識別號19之胺基酸序列或者胺基酸序列Lys-Val-Ser、及作為CDR3之序列識別號20之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號88或序列識別號89之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號90或序列識別號91之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號92或序列識別號93之胺基酸序列的重鏈之組合； (4)具有作為CDR1之序列識別號21或序列識別號22之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號23或序列識別號24之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號25之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號94或序列識別號95之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號96或序列識別號97之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號98或序列識別號99之胺基酸序列的重鏈之組合； (5)具有作為CDR1之序列識別號26或序列識別號27之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號28或序列識別號29之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號30之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號100或序列識別號101之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號102或序列識別號103之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號104或序列識別號105之胺基酸序列的重鏈之組合； (6)具有作為CDR1之序列識別號31或序列識別號32之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號33或序列識別號34之胺基酸序列或者胺基酸序列Ala-Ala-Ser、及作為CDR3之序列識別號35之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號106或序列識別號107之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號108或序列識別號278之胺基酸序列之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號109或序列識別號110之胺基酸序列的重鏈之組合； (7)具有作為CDR1之序列識別號36或序列識別號37之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號38或序列識別號39之胺基酸序列或者胺基酸序列Gln-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號40之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號111或序列識別號112之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號113或序列識別號114之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號115或序列識別號116之胺基酸序列的重鏈之組合； (8)具有作為CDR1之序列識別號41或序列識別號42之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號43或序列識別號44之胺基酸序列或者胺基酸序列Gly-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號45之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號117或序列識別號118之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號119之胺基酸序列或序列識別號279之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號120或序列識別號121之胺基酸序列的重鏈之組合； (9)具有作為CDR1之序列識別號46或序列識別號47之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號48或序列識別號49之胺基酸序列或者胺基酸序列Phe-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號50之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號122或序列識別號123之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號124或序列識別號125之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號126或序列識別號127之胺基酸序列的重鏈之組合； (10)具有作為CDR1之序列識別號51或序列識別號52之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號53或序列識別號54之胺基酸序列或者胺基酸序列Ala-Ala-Ser、及作為CDR3之序列識別號55之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號128或序列識別號129之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號130或序列識別號131之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號132或序列識別號133之胺基酸序列的重鏈之組合； (11)具有作為CDR1之序列識別號56或序列識別號57之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號58或序列識別號59之胺基酸序列或者胺基酸序列Tyr-Ala-Ser、及作為CDR3之序列識別號60之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號134或序列識別號135之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號136或序列識別號137之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號138或序列識別號139之胺基酸序列的重鏈之組合； (12)具有作為CDR1之序列識別號61或序列識別號62之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號63或序列識別號64之胺基酸序列或者胺基酸序列Trp-Ser-Ser、及作為CDR3之序列識別號65之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號140或序列識別號141之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號142或序列識別號143之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號144或序列識別號145之胺基酸序列的重鏈之組合； (13)具有作為CDR1之序列識別號66或序列識別號67之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號68或序列識別號69之胺基酸序列、或胺基酸序列Tyr-Ala-Ser、及作為CDR3之序列識別號70之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號146或序列識別號147之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號148或序列識別號149之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號150或序列識別號151之胺基酸序列的重鏈之組合；及 (14)具有作為CDR1之序列識別號71或序列識別號72之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號73或序列識別號74之胺基酸序列或者胺基酸序列Asp-Thr-Ser、及作為CDR3之序列識別號75之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號152或序列識別號153之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號154或序列識別號155之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號156或序列識別號157之胺基酸序列的重鏈之組合。
就於hTfR具有親和性的抗體之輕鏈與重鏈之組合的具體態樣而言，可例示CDR為具有以下所示的(1)～(14)記載之胺基酸序列者。即： (1)具有作為CDR1之序列識別號6、作為CDR2之序列識別號8、及作為CDR3之序列識別號10記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號76、作為CDR2之序列識別號78、及作為CDR3之序列識別號80記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (2)具有作為CDR1之序列識別號11、作為CDR2之序列識別號13、及作為CDR3之序列識別號15記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號82、作為CDR2之序列識別號84、及作為CDR3之序列識別號86記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (3)具有作為CDR1之序列識別號16、作為CDR2之序列識別號18、及作為CDR3之序列識別號20記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號88、作為CDR2之序列識別號90、及作為CDR3之序列識別號92記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (4)具有作為CDR1之序列識別號21、作為CDR2之序列識別號23、及作為CDR3之序列識別號25記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號94、作為CDR2之序列識別號96、及作為CDR3之序列識別號98記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (5)具有作為CDR1之序列識別號26、作為CDR2之序列識別號28、及作為CDR3之序列識別號30記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號100、作為CDR2之序列識別號102、及作為CDR3之序列識別號104記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (6)具有作為CDR1之序列識別號31、作為CDR2之序列識別號33、及作為CDR3之序列識別號35記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號106、作為CDR2之序列識別號108、及作為CDR3之序列識別號109記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (7)具有作為CDR1之序列識別號36、作為CDR2之序列識別號38、及作為CDR3之序列識別號40記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號111、作為CDR2之序列識別號113、及作為CDR3之序列識別號115記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (8)具有作為CDR1之序列識別號41、作為CDR2之序列識別號43、及作為CDR3之序列識別號45記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號117、作為CDR2之序列識別號119、及作為CDR3之序列識別號120記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (9)具有作為CDR1之序列識別號46、作為CDR2之序列識別號48、及作為CDR3之序列識別號50記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號122、作為CDR2之序列識別號124、及作為CDR3之序列識別號126記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (10)具有作為CDR1之序列識別號51、作為CDR2之序列識別號53、及作為CDR3之序列識別號55記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號128、作為CDR2之序列識別號130、及作為CDR3之序列識別號132記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (11)具有作為CDR1之序列識別號56、作為CDR2之序列識別號58、及作為CDR3之序列識別號60記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號134、作為CDR2之序列識別號136、及作為CDR3之序列識別號138記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (12)具有作為CDR1之序列識別號61、作為CDR2之序列識別號63、及作為CDR3之序列識別號65記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號140、作為CDR2之序列識別號142、及作為CDR3之序列識別號144記載之胺基酸序列的重鏈之組合； (13)具有作為CDR1之序列識別號66、作為CDR2之序列識別號68、及作為CDR3之序列識別號70記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號146、作為CDR2之序列識別號148、及作為CDR3之序列識別號150記載之胺基酸序列的重鏈之組合；及 (14)具有作為CDR1之序列識別號71、作為CDR2之序列識別號73、及作為CDR3之序列識別號75記載之胺基酸序列的輕鏈，與具有作為CDR1之序列識別號152、作為CDR2之序列識別號154、及作為CDR3之序列識別號156記載之胺基酸序列的重鏈之組合。
就對hTfR具有親和性的人類化抗體之較佳實施形態而言，可列舉使用序列識別號218～序列識別號245所示的小鼠抗人類TfR抗體之輕鏈及重鏈之可變區的胺基酸序列作為CDR而製作的人類化抗體。人類化抗體係可藉由將此等小鼠抗人類TfR抗體之輕鏈及重鏈之可變區的CDR之胺基酸序列於人類抗體之適當位置取代而製作。
例如，於序列識別號218記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之由第24號～第34號之任意之連續的3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之由第50號～第56號之任意之連續的3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之由第89號～第97號之任意之連續的3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號219記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之由第26號～第35號之任意之連續的3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之由第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之由第97號～第105號之任意之連續3個以上或7個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
又例如，於序列識別號220記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之由第24號～第34號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之由第50號～第56號之任意之連續的3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之由第89號～第97號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號221記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之由第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之由第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之由第97號～第112號之任意之連續3個以上或14個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號222記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第39號之任意之連續3個以上或11個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第55號～第61號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第94號～第102號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號223記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第107號之任意之連續3個以上或9個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號224記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第33號之任意之連續3個以上或5個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第49號～第55號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第88號～第96號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號225記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第111號之任意之連續3個以上或13個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號226記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第33號之任意之連續3個以上或5個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第49號～第55號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第88號～第95號之任意之連續3個以上或7個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號227記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第107號之任意之連續3個以上或9個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號228記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第34號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第56號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第89號～第97號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號229記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第65號之任意之連續3個以上或7個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第96號～第101號之任意之連續3個以上或4個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號230記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第33號之任意之連續3個以上或5個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第49號～第55號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第88號～第96號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號231記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第109號之任意之連續3個以上或11個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號232記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第33號之任意之連續3個以上或5個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第49號～第55號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第88號～第96號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號233記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第65號之任意之連續3個以上或7個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第96號～第101號之任意之連續3個以上或4個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號234記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第33號之任意之連續3個以上或5個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第49號～第55號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第88號～第96號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號235記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第106號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號236記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第34號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第56號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第89號～第97號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號237記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第109號之任意之連續3個以上或11個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號238記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第34號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第56號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第89號～第97號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號239記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第107號之任意之連續3個以上或9個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號240記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第34號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第56號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第89號～第97號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號241記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第108號之任意之連續3個以上或10個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號242記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第34號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第56號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第89號～第97號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號243記載之胺基酸序列中，可將作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第107號之任意之連續3個以上或9個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
再者，例如，於序列識別號244記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第24號～第33號之任意之連續3個以上或5個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第49號～第55號之任意之連續3個以上或6個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第88號～第96號之任意之連續3個以上或9個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之輕鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之輕鏈；於序列識別號245記載之胺基酸序列中，可將藉由作為CDR1之第26號～第35號之任意之連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、作為CDR2之第50號～第66號之任意之連續3個以上或8個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列、及作為CDR3之第97號～第107號之任意之連續3個以上或9個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列取代人類抗體之重鏈之對應的CDR之胺基酸序列者，作成人類化抗體之重鏈。可組合如此獲得的人類化抗體之輕鏈及重鏈而製作人類化抗體。
就對hTfR具有親和性的人類化抗體之較佳實施形態而言，可例示具有以下所示的(1)～(3)記載之胺基酸序列者。即： (1)一種抗hTfR抗體，其係抗hTfR抗體，其中輕鏈之可變區係包含選自由序列識別號158、序列識別號159、序列識別號160、序列識別號161、序列識別號162、及序列識別號163所示的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成，重鏈之可變區係包含選自由序列識別號166、序列識別號167、序列識別號168、序列識別號169、序列識別號170、及序列識別號171所示的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成； (2)一種抗hTfR抗體，其係抗hTfR抗體，其中輕鏈之可變區係包含序列識別號174、序列識別號175、序列識別號176、序列識別號177、序列識別號178、及序列識別號179之任一者之胺基酸序列而成，重鏈之可變區係包含序列識別號182、序列識別號183、序列識別號184、序列識別號185、序列識別號186、及序列識別號187之任一者之胺基酸序列而成； (3)一種抗hTfR抗體，其係抗hTfR抗體，其中輕鏈之可變區係包含選自由序列識別號190、序列識別號191、序列識別號192、序列識別號193、序列識別號194、及序列識別號195所示的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成，重鏈之可變區係包含選自由序列識別號204、序列識別號205、序列識別號206、序列識別號207、序列識別號208及序列識別號209所示的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成。
序列識別號158、序列識別號159、序列識別號160、序列識別號161、序列識別號162、及序列識別號163記載之輕鏈可變區的胺基酸序列，係於CDR1包含序列識別號6、於CDR2包含序列識別號8、及於CDR3包含序列識別號10之胺基酸序列者。惟，於序列識別號158～162記載之輕鏈可變區的胺基酸序列中，稱CDR時，CDR之序列並未限定於此等，包含此等CDR之胺基酸序列的區域、包含此等CDR之胺基酸序列之任意之連續3個以上之胺基酸的胺基酸序列亦可作為CDR。
序列識別號166、序列識別號167、序列識別號168、序列識別號169、序列識別號170、及序列識別號171記載之重鏈的可變區之胺基酸序列，係於CDR1包含序列識別號76、於CDR2包含序列識別號78、及於CDR3包含序列識別號80之胺基酸序列者。惟，於序列識別號166～171記載之重鏈的可變區之胺基酸序列中，稱CDR時，CDR之序列並未限定於此等，包含此等CDR之胺基酸序列的區域、包含此等CDR之胺基酸序列之任意之連續3個以上之胺基酸的胺基酸序列亦可作為CDR。
序列識別號174、序列識別號175、序列識別號176、序列識別號177、序列識別號178、及序列識別號179記載之輕鏈可變區的胺基酸序列，係於CDR1包含序列識別號11、於CDR2包含序列識別號13、及於CDR3包含序列識別號15之胺基酸序列者。惟，於序列識別號174～179記載之輕鏈可變區的胺基酸序列中，稱CDR時，CDR之序列並未被限定於此等，包含此等CDR之胺基酸序列的區域、包含此等CDR之胺基酸序列之任意之連續3個以上之胺基酸的胺基酸序列亦可作為CDR。
序列識別號182、序列識別號183、序列識別號184、序列識別號185、序列識別號186、及序列識別號187記載之重鏈的可變區之胺基酸序列，係於CDR1包含序列識別號82、於CDR2包含序列識別號84、及於CDR3包含序列識別號86之胺基酸序列者。惟，於序列識別號182～187記載之重鏈的可變區之胺基酸序列中，稱CDR時，CDR之序列並未被限定於此等，包含此等CDR之胺基酸序列的區域、包含此等CDR之胺基酸序列之任意之連續3個以上之胺基酸的胺基酸序列亦可作為CDR。
序列識別號190、序列識別號191、序列識別號192、序列識別號193、序列識別號194、及序列識別號195記載之輕鏈可變區的胺基酸序列，係於CDR1包含序列識別號16、於CDR2包含序列識別號18、及於CDR3包含序列識別號20之胺基酸序列者。惟，於序列識別號190～195記載之輕鏈可變區的胺基酸序列中，稱CDR時，CDR之序列並未被限定於此等，包含此等CDR之胺基酸序列的區域、包含此等CDR之胺基酸序列之任意之連續3個以上之胺基酸的胺基酸序列亦可作為CDR。
序列識別號204、序列識別號205、序列識別號206、序列識別號207、序列識別號208及序列識別號209記載之重鏈的可變區之胺基酸序列，係於CDR1包含序列識別號88、於CDR2包含序列識別號90、及於CDR3包含序列識別號92之胺基酸序列者。惟，於序列識別號204～209記載之重鏈的可變區之胺基酸序列中，稱CDR時，CDR之序列並未被限定於此等，包含此等CDR之胺基酸序列的區域、包含此等CDR之胺基酸序列之任意之連續3個以上之胺基酸的胺基酸序列亦可作為CDR。
就對hTfR具有親和性的人類化抗體之更具體的實施形態而言，可列舉： 輕鏈之可變區包含序列識別號163之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列識別號171之胺基酸序列者、 輕鏈之可變區包含序列識別號179之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列識別號187之胺基酸序列者、 輕鏈之可變區包含序列識別號191之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列識別號205之胺基酸序列者、 輕鏈之可變區包含序列識別號193之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列識別號205之胺基酸序列者、 輕鏈之可變區包含序列識別號194之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列識別號205之胺基酸序列者、及 輕鏈之可變區包含序列識別號195之胺基酸序列且重鏈之可變區包含序列識別號205之胺基酸序列者。
就對hTfR具有親和性的人類化抗體之更具體的實施形態而言，可列舉： 輕鏈包含序列識別號164之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號172之胺基酸序列者、 輕鏈包含序列識別號180之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號188之胺基酸序列者、 輕鏈包含序列識別號196之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號210之胺基酸序列者、 輕鏈包含序列識別號198之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號210之胺基酸序列、 輕鏈包含序列識別號200之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號210之胺基酸序列者、 輕鏈包含序列識別號202之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號210之胺基酸序列、 輕鏈包含序列識別號196之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號212之胺基酸序列者、 輕鏈包含序列識別號198之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號212之胺基酸序列者、 輕鏈包含序列識別號200之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號212之胺基酸序列者、及 輕鏈包含序列識別號202之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號212之胺基酸序列者。
對hTfR具有親和性的抗體之較佳實施形態如上述例示。此等之抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈，可基於將抗hTfR抗體與hTfR之親和性調整為所冀望者等的目的，而於其可變區之胺基酸序列中，適當加入取代、缺失、添加等之變異。
於使輕鏈之可變區的胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。於使輕鏈之可變區的胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。
於輕鏈之可變區添加胺基酸的情形，於輕鏈之可變區的胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的輕鏈之可變區的胺基酸序列與原本之輕鏈可變區的胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
尤其，使CDR之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個，又更佳為1個。於使CDR之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個，又更佳為1個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。
於使胺基酸添加的情形，於該胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個的胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的各CDR之各自的胺基酸序列與原本之各CDR之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
於使重鏈之可變區的胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使重鏈之可變區的胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。
於使胺基酸添加至重鏈之可變區的情形，於重鏈之可變區的胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的重鏈之可變區的胺基酸序列與原本之重鏈的可變區之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
尤其，使CDR之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個，又更佳為1個。使CDR之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個，又更佳為1個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。
使胺基酸添加的情形，於該胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～5個，更佳為1～3個，進一步更佳為1～2個，又更佳為1個之胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的各CDR之各自的胺基酸序列與原本之各CDR之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
就上述之抗hTfR抗體之可變區的胺基酸序列中之胺基酸取代為其他胺基酸而言，可列舉例如，為酸性胺基酸之天冬胺酸與麩胺酸的相互取代；為醯胺型胺基酸之天冬醯胺酸與麩醯胺酸的相互取代；為鹼性胺基酸之離胺酸與精胺酸的相互取代；為分枝胺基酸之纈胺酸、白胺酸及異白胺酸的相互取代；為脂肪族胺基酸之甘胺酸與丙胺酸的相互取代；為羥基胺基酸之絲胺酸與蘇胺酸的相互取代；為芳香族胺基酸之苯丙胺酸與酪胺酸的相互取代等。
又，在抗hTfR抗體加入變異而於C端或N端添加胺基酸的情形中，當使抗hTfR抗體與其他蛋白質A融合之際其添加的胺基酸成為位於抗hTfR抗體與其他蛋白質A之間時，該添加的胺基酸有構成抗hTfR抗體或其他蛋白質A之一部份的情形，又亦有構成連接子之一部份的情形。
在包含上述例示的對hTfR具有親和性的人類化抗體之抗體的較佳實施形態中，抗hTfR抗體之重鏈及輕鏈之CDR之胺基酸序列係只要抗體具有對hTfR的特異親和性即可，並無特別限制。惟，本發明之抗hTfR抗體係較佳為，藉由實施例7記載之方法所測量之與hTfR之解離常數(KD )，較佳為1×10-8 M以下者，更佳為1×10-9 M以下者，進一步更佳為1×10-10M 以下者，又進一步更佳為1×10-11M 以下者。例如就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～1×10-9 M者、為1×10-13 M～1×10-10 M者。即使抗體為單股抗體亦相同。又，本發明之抗hTfR抗體對猴TfR亦具有親和性的情形，藉由實施例7記載之方法所測量之抗hTfR抗體之與猴TfR的解離常數，較佳為5×10-8 M以下，更佳為2×10-8 M以下，進一步更佳為1×10-8 M以下。例如就適合者而言，可列舉解離常數為1×10-13 M～2×10-8 M者、為1×10-13 M～2×10-8 M者。即使抗體為單股抗體亦相同。
就作為上述之具體實施形態所示的對hTfR具有親和性的人類化抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質的具體實施形態而言，其他蛋白質A可列舉人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)、人類紅血球生成素(hEPO)、人類烯丙基硫酸酯酶A(hARSA)、人類PPT-1(hPPT-1)、人類TPP-1(hTPP-1)、人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)、人類TNFα受體(hTNFαR)、及人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(hSGSH)。 就其他蛋白質A為hI2S的融合蛋白質之具體實施例而言，可例示： (1)由hI2S介隔連接子序列Gly-Ser而於hTfR之重鏈之C端側結合而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號247所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hI2S介隔連接子序列Gly-Ser而於hTfR之重鏈之C端側結合而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號249所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)hI2S為介隔連接子序列Gly-Ser而於hTfR之重鏈之C端側結合而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號251所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
其中，於上述(1)中，序列識別號247所含的hTfR之重鏈之胺基酸序列係序列識別號172所示者。亦即，上述(1)之融合蛋白質係包含作為人類化抗體之輕鏈包含序列識別號164之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號172之胺基酸序列者。於上述(2)中，序列識別號249所含的hTfR之重鏈之胺基酸序列係序列識別號188所示者。即，上述(2)之融合蛋白質係包含作為人類化抗體之輕鏈包含序列識別號180之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號188之胺基酸序列者。於上述(3)中，序列識別號251所含的hTfR之重鏈之胺基酸序列係序列識別號210所示者。即，上述(3)之融合蛋白質係包含作為人類化抗體之輕鏈包含序列識別號196之胺基酸序列且重鏈包含序列識別號210之胺基酸序列者。
就其他蛋白質A為人類紅血球生成素(hEPO)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示： (1)由hEPO介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hEPO介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)由hEPO介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
其中，於上述(1)～(3)之任一者中，hEPO與hTfR之重鏈可直接或介隔連接子序列而作成胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語係與「直接或介隔連接子序列」同意義。本文所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。其胺基酸序列並未限定，但較佳為由甘胺酸及絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個之胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列為1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個之胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
就人類化抗體與hEPO之更具體的實施形態而言，可例示由hEPO介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號257所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類EPO」或「hEPO」之用語，尤其指具有與序列識別號256所示的天然型之hEPO相同之胺基酸序列的hEPO，但並未限定於此，只要具有EPO活性，於天然型之hEPO之胺基酸序列中加入取代、缺失、添加等之變異者亦包含於hEPO。使hEPO之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hEPO之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hEPO的情形，於hEPO之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。添加變異的hEPO之胺基酸序列與原本之hEPO之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。就於天然型之hEPO加入變異者而言，可列舉達依泊汀。
就其他蛋白質A為人類烯丙基硫酸酯酶A(hARSA)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示： (1)由hARSA介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hARSA介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)由hARSA介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
於上述(1)～(3)之任一者中，hARSA與hTfR之重鏈亦可直接或介隔連接子序列而作成胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語係與「直接或介隔連接子序列」同意義。其中所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成。其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸及絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任1個的胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
就人類化抗體及hARSA之更具體的實施形態而言，可例示由hARSA介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR的重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號260所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類ARSA」或「hARSA」之用語，尤其是指具有與序列識別號259所示的天然型之hARSA相同之胺基酸序列的hARSA，但未限於此，只要具有ARSA活性即可，於天然型之hARSA之胺基酸序列加入取代、缺失、添加等變異者亦包含於hARSA。使hARSA之胺基酸序列的胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hARSA之胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hARSA的情形，於hARSA之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hARSA之胺基酸序列與原本之hARSA之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
就其他蛋白質A為人類PPT-1(hPPT-1)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示： (1)由hPPT-1介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hPPT-1介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)由hPPT-1介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
於上述(1)～(3)之任一者中，hPPT-1與hTfR之重鏈亦可直接或介隔連接子序列而作胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語亦與「直接或介隔連接子序列」同意義。其中所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸及絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個之胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
就人類化抗體與hPPT-1之更具體的實施形態而言，可例示由hPPT-1介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR的重鏈之C端側而成者、及hTfR的輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號263所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類PPT-1」或「hPPT-1」之用語，尤其是指具有與序列識別號262所示的天然型之hPPT-1相同之胺基酸序列的hPPT-1，但並未限於此，只要具有PPT-1活性，於天然型之hPPT-1之胺基酸序列加入取代、缺失、添加等之變異者亦包含於hPPT-1。使hPPT-1之胺基酸序列的胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hPPT-1之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hPPT-1中的情形，於hPPT-1之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hPPT-1之胺基酸序列與原本之hPPT-1之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
就其他蛋白質A為人類TPP-1(hTPP-1)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示： (1)由hTPP-1介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hTPP-1介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)由hTPP-1介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
於上述(1)～(3)之任一者中，hTPP-1與hTfR之重鏈亦可直接或介隔連接子序列而作成胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語亦與「直接或介隔連接子序列」同意義。其中所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成。其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個的胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成的共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
就人類化抗體與hTPP-1之更具體的實施形態而言，可例示由hTPP-1介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR的重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號266所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類TPP-1」或「hTPP-1」之用語，尤其是指具有與序列識別號265所示的天然型之hTPP-1相同之胺基酸序列的hTPP-1，但並未限於此，只要具有TPP-1活性，於天然型之hTPP-1之胺基酸序列中加入取代、缺失、添加等之變異者亦包含於hTPP-1。使hTPP-1之胺基酸序列之胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hTPP-1之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hTPP-1中的情形，於hTPP-1之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hTPP-1之胺基酸序列與原本之hTPP-1之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
就其他蛋白質A為人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示： (1)由hIDUA介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hIDUA介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)由hIDUA介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
於上述(1)～(3)之任一者中，hIDUA與hTfR之重鏈亦可直接或介隔連接子序列而作成胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語亦與「直接或介隔連接子序列」同意義。其中所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸及絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個的胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個之胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成的共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
人類化抗體與hIDUA之更具體的實施形態而言，可例示由hIDUA介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR的重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號269所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類IDUA」或「hIDUA」之用語，尤其是指具有與序列識別號268所示的天然型之hIDUA相同之胺基酸序列的hIDUA者，但並未限於此等，只要具有IDUA活性者即可，於天然型之hIDUA之胺基酸序列加入取代、缺失、添加等之變異者亦包含於hIDUA。使hIDUA之胺基酸序列的胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hIDUA之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hIDUA的情形，於hIDUA之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hIDUA之胺基酸序列與原本之hIDUA之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
就其他蛋白質A為人類TNFα受體(hTNFαR)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示：
(1)由hTNFαR介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR的輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hTNFαR介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR的輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示者；及 (3)由hTNFαR介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR的輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
於上述(1)～(3)之任一者中，hTNFαR與hTfR之重鏈亦可直接或介隔連接子序列而作成胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語係與「直接或介隔連接子序列」同意義。其中所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸及絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個的胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個之胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成之共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
就人類化抗體與hTNFαR之更具體的實施形態而言，可例示由hTNFαR介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR的重鏈之C端側而成者、及hTfR的輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號272所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類TNFαR」或「hTNFαR」之用語，尤其是指具有與序列識別號271所示的天然型之hTNFαR相同之胺基酸序列的hTNFαR，但未限於此，只要具有作為hTNFαR之活性或機能者即可，於天然型之hTNFαR之胺基酸序列中加入取代、缺失、添加等之變異者亦包含於hTNFαR。使hTNFαR之胺基酸序列的胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hTNFαR之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hTNFαR的情形，於hTNFαR之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hTNFαR之胺基酸序列與原本之hTNFαR之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
就其他蛋白質A為人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(hSGSH)之融合蛋白質的具體實施例而言，可例示： (1)由hSGSH介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之hTfR的重鏈之胺基酸序列為序列識別號172所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號164所示者； (2)由hSGSH介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號188所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號180所示；及 (3)由hSGSH介隔胜肽鍵而結合於hTfR之重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號210所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
於上述(1)～(3)之任一者中，hSGSH與hTfR之重鏈亦可直接或介隔連接子序列而作成胜肽鍵。亦即，於上述(1)～(3)之任一者中，「介隔胜肽鍵」之用語亦與「直接或介隔連接子序列」同意義。其中所使用的連接子序列係由1～50個之胺基酸殘基所構成者。其胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸及絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個的胺基酸所構成者；胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號5)、或者具有由此等之胺基酸序列1～10個、或2～5個連續而成的1～50個之胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、或27個之胺基酸所構成的序列等者。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者可適合地使用作為連接子序列。又，具有於胺基酸序列Gly-Ser接續連續5個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號3)而成的共計27個之胺基酸序列者可適合地使用作為連接子序列。
就人類化抗體與hSGSH之更具體的實施形態而言，可例示由hSGSH介隔連接子序列Gly-Ser而結合於hTfR的重鏈之C端側而成者、及hTfR之輕鏈所構成，前者之胺基酸序列為序列識別號275所示者，後者之胺基酸序列為序列識別號196所示者。
又，於本發明中，「人類SGSH」或「hSGSH」之用語，尤其是指具有與序列識別號274所示的天然型之hSGSH相同之胺基酸序列的hSGSH，但未限於此，只要具有SGSH活性即可，於天然型之hSGSH之胺基酸序列中加入取代、缺失、添加等變異者亦包含於hSGSH。使hSGSH之胺基酸序列的胺基酸取代為其他胺基酸的情形，使取代的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。使hSGSH之胺基酸序列中之胺基酸缺失的情形，使缺失的胺基酸個數係較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個。又，亦可加入組合此等胺基酸之取代及缺失的變異。使胺基酸添加至hSGSH中的情形，於hSGSH之胺基酸序列中或N端側或C端側，添加較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步更佳為1～3個，又更佳為1～2個胺基酸。亦可加入組合此等胺基酸之添加、取代及缺失的變異。加入變異的hSGSH之胺基酸序列與原本之hSGSH之胺基酸序列，較佳為具有80%以上之同源性，更佳為顯示90%以上之同源性，進一步更佳為顯示95%以上之同源性。
又其中，於使與抗hTfR抗體融合的其他蛋白質A為具有人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)、人類紅血球生成素(hEPO)、人類烯丙基硫酸酯酶A(hARSA)、人類PPT-1(hPPT-1)、人類TPP-1(hTPP-1)、人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)、人類TNFα受體(hTNFαR)、及人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(hSGSH)之任一者的情形中，當使與抗hTfR抗體融合的其他蛋白質A係稱為於該其他蛋白質A之生理的條件下保持活性或機能時或僅稱具有活性或機能時，係指相對於對應的天然型之此等蛋白質本來具有的活性或機能，保持3%以上之活性或機能。惟，其活性或機能，相對於對應的天然型之此等其他蛋白質A本來具有的活性或機能，較佳為10%以上，更佳為20%以上，進一步較佳為50%以上，又更佳為80%以上。使與抗hTfR抗體融合的此等之其他蛋白質A加入變異的情形亦相同。
本發明之抗hTfR抗體係藉由使與生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物之分子結合，而可使用在用於中樞神經系統之疾病狀態的治療的血中投予用藥劑之製造用。又，使與生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物之分子結合的抗hTfR抗體，可使用於一種治療方法，該治療方法包含將生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至中樞神經系統之疾病的患者。經血中投予之使與生理活性蛋白質或藥理活性低分子化合物之分子結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
尤其，本發明之抗hTfR抗體係藉由使與人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)結合，而可使hI2S通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨韓特氏症候群的中樞神經系統之疾病狀態的治療之血中投予用藥劑的製造用。又，使與hI2S結合的抗hTfR抗體可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨韓特氏症候群的中樞神經系統之疾病狀態的治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至韓特氏症候群之患者。經血中投予之使與hI2S結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
又，本發明之抗hTfR抗體係藉由使與人類紅血球生成素(hEPO)結合，而可使hEPO通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨腦缺血的中樞神經系統之治療的血中投予用藥劑之製造用。又，使與hEPO結合的抗hTfR抗體係可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨腦缺血的中樞神經系統之疾病狀態之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至腦缺血之患者。經血中投予之使與hEPO結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。將人類紅血球生成素替換為人類達依泊汀亦可謂相同的。
又，本發明之抗hTfR抗體係藉由使與人類烯丙基硫酸酯酶A(hARSA)結合，而可使hARSA通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨異染性白質失養症(異染性腦白質退化症)的中樞神經系統之疾病狀態的治療之血中投予用藥劑之製造用。又，使與hARSA結合的抗hTfR抗體係可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨異染性白質失養症(異染性腦白質退化症)的中樞神經系統之疾病狀態之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至該疾病之患者。經血中投予之使與hARSA結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
又，本發明之抗hTfR抗體係藉由與人類PPT-1(hPPT-1)結合，而可使hPPT-1通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨神經性類蠟脂褐質病或桑-哈二氏病的中樞神經系統之疾病狀態之治療的血中投予用藥劑之製造用。又，使與hPPT-1結合的抗hTfR抗體係可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨神經性類蠟脂褐質病或桑-哈二氏病的中樞神經系統之疾病狀態之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至該疾病之患者。經血中投予之使與hPPT-1結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
又，本發明之抗hTfR抗體係藉由使與人類TPP-1(hTPP-1)結合，而可使hTPP-1通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨神經性類蠟脂褐質病或詹-比二氏病的中樞神經系統之疾病狀態之治療之血中投予用藥劑的製造用。又，使與hPPT-1結合的抗hTfR抗體係可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨神經性類蠟脂褐質病或詹-比二氏病的中樞神經系統之疾病狀態之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至該疾病之患者。經血中投予之使與hTPP-1結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
又，本發明之抗hTfR抗體係藉由使與人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)結合，而可使hIDUA通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨賀勒氏症候群或賀勒氏・施艾氏症候群的中樞神經系統之疾病狀態的治療之血中投予用藥劑之製造用。又，使與hIDUA結合的抗hTfR抗體係可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨賀勒氏症候群或賀勒氏・施艾氏症候群的中樞神經系統之疾病狀態的治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至該疾病之患者。經血中投予之使與hIDUA結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
又，本發明之抗hTfR抗體，係藉由使與人類TNFα受體(hTNFαR)結合，可使hTNFαR通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨腦缺血或腦炎症性疾病的中樞神經系統之疾病狀態的治療之血中投予用藥劑之製造用。又，使與hTNFαR結合的抗hTfR抗體可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨腦缺血或腦炎症性疾病的中樞神經系統之疾病狀態之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至該疾病之患者。經血中投予之使與hTNFαR結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
又，本發明之抗hTfR抗體係藉由使與人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(hSGSH)結合，可使hSGSH通過血腦障壁而於腦內發揮機能，故可使用在用於伴隨聖菲利柏氏症的中樞神經系統之疾病狀態的治療之血中投予用藥劑之製造用。又，使與hSGSH結合的抗hTfR抗體，可使用於一種治療方法，該治療方法包含將伴隨聖菲利柏氏症的中樞神經系統之疾病狀態之治療上有效量，血中投予(包含靜脈滴注等之靜脈注射)至該疾病之患者。經血中投予之使與hSGSH結合的抗hTfR抗體，除了到達腦內之外，亦可到達表現hTfR的其他臟器、器官。
使與本發明之抗hTfR抗體結合的蛋白質、低分子化合物等，可使用作為投予至血中而應使於中樞神經系統(CNS)中發揮藥效的藥劑。該藥劑一般而言係藉由利用靜脈點滴注射等的靜脈注射、皮下注射、肌肉注射而被投予至患者，但投予路徑並無特別限定。
使與本發明之抗hTfR抗體結合的蛋白質、低分子化合物等，可以冷凍乾燥品、或水性液劑等之形態作為藥劑而供給至醫療機關。水性液劑的情形，可將藥劑事先溶解於含有安定化劑、緩衝劑、等張化劑的溶液者，作為封入至小瓶或注射器的製劑而供給。被封入注射器的製劑，一般被稱為預充式注射劑(prefilled syringe)。藉由作成預充式注射劑，可簡化患者自行進行的藥劑投予。 作為水性液劑被供給的情形，使與水性液劑所含有之抗hTfR抗體結合的蛋白質、低分子化合物等之濃度，應依據用法用量而被適當調整，但例如為1～4mg/mL。又，水性液劑所含有之安定化劑，只要為藥劑學上可容許者即可，並無特別限定，但可適合使用非離子性界面活性劑。就此種非離子性界面活性劑而言，可單獨使用聚山梨醇酯(Polysorbate)、泊洛沙姆(Poloxamer)等或組合此等來使用。就聚山梨醇酯而言，特別適合為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，就泊洛沙姆而言，特別適合為泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。又，水性液劑所含有之非離子性界面活性劑的濃度，係較佳為0.01～1mg/mL，更佳為0.01～0.5mg/mL，進一步較佳為0.1～0.5mg/mL。就安定化劑而言，亦可使用組胺酸、精胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸等之胺基酸。作為安定化劑使用的情形之水性液劑所含有之胺基酸的濃度係較佳為0.1～40mg/mL，更佳為0.2～5mg/mL，進一步較佳為0.5～4mg/mL。水性液劑所含有之緩衝劑係只要為藥劑學上可容許者即可，並無特別限定，但較佳為磷酸鹽緩衝劑，特佳為磷酸鈉緩衝劑。使用磷酸鈉緩衝劑作為緩衝劑的情形，磷酸鈉之濃度係較佳為0.01～0.04M。又，依據緩衝劑而被調整之水性液劑的pH係較佳為5.5～7.2。水性液劑所含有之等張化劑係只要藥劑學上可容許者即可，並無特別限定，但可適合地單獨使用氯化鈉、甘露醇或組合此等作為等張化劑。 [實施例]
以下，參照實施例而進一步詳細說明本發明，但本發明並無意圖限定於實施例。
〔實施例1〕hTfR表現用載體之構築 將人類脾臟Quick Clone cDNA(Clontech公司)作為模板，使用引子hTfR5’(序列識別號214)及引子hTfR3’(序列識別號215)，藉由PCR使編碼人類運鐵蛋白受體(hTfR)的基因片段放大。將經放大的編碼hTfR的基因片段以MluI及NotI消化，而插入至pCI-neo載體(Promega公司)之MluI與NotI之間。將獲得的載體，命名為pCI-neo(hTfR)。接著，將此載體，以MluI及NotI消化，將編碼hTfR的基因片段切出，併入至為國際公開公報(WO2012/063799)記載的表現載體之pE-mIRES-GS-puro的MluI與NotI之間，藉此構築為hTfR表現用載體之pE-mIRES-GS-puro(hTfR)。
〔實施例2〕重組hTfR之製作 藉由電穿孔法，將pE-mIRES-GS-puro(hTfR)導入至CHO-K1細胞後，使用含甲硫胺酸磺醯亞胺(methionine sulfoximine，MSX)及嘌呤黴素(puromycin)的CD OptiCHOTM 培養基(Invitrogen公司)進行細胞之選擇培養，而獲得重組hTfR表現細胞。培養此重組hTfR表現細胞，而製備重組hTfR。
〔實施例3〕使用重組hTfR的小鼠免疫 將實施例2所製備的重組hTfR作為抗原使用而將小鼠免疫。免疫係將抗原靜脈內投予或腹腔內投予至小鼠來進行。
〔實施例4〕融合瘤之製作 最後，於投予細胞之日之約1週後，將小鼠的脾臟摘出並均質化，將脾細胞分離。使用小鼠骨髓瘤細胞株(P3．X63．Ag8．653)與聚乙二醇法，使獲得的脾細胞進行細胞融合。細胞融合結束後，使細胞懸浮於含(1X)HAT Supplement(Life Technologies公司)及10% Ultra low IgG胎牛血清(Life Technologies公司)的RPMI1640培養基，將細胞懸浮液以200μL/孔各分注於96孔盤20盤。以碳酸氣體培養器(37℃，5%CO2 )培養細胞10日後，於顯微鏡下觀察各孔，選擇存在單一之群落的孔。
於各孔之細胞幾乎成為匯合(confluent)的時間點，回收培養上清液，將其作為融合瘤之培養上清液，供給至以下之篩選。
〔實施例5〕高親和性抗體產生細胞株之篩選 將重組hTfR溶液(Sino Biologics公司)以50mM碳酸鈉緩衝液(pH9.5～9.6)稀釋而調整為5μg/mL之濃度，將其作為固相溶液。將固相溶液以各50μL添加於Nunc MaxiSorpTM 平底96孔盤(基材：聚苯乙烯，Nunc公司製)之各孔後，將平盤於室溫靜置1小時，使重組hTfR吸附而固定於平盤。捨棄固相溶液，將各孔以250μL之洗淨液(含有0.05% Tween20的PBS)洗淨3次後，於各孔中各添加封阻液(含有1% BSA的PBS)200μL，將平盤於室溫靜置1小時。
捨棄封阻液，將各孔以250μL之洗淨液(含有0.05% Tween20的PBS)洗淨3次後，於各孔中各添加融合瘤之培養上清液50μL，將平盤於室溫靜置1小時，使培養上清液中所含的小鼠抗hTfR抗體與重組hTfR結合。此時，作為對照，設置將不產生小鼠抗hTfR抗體的融合瘤之培養上清液50μL添加於孔中者。又，在添加各培養上清液的孔的旁邊的孔中，設置添加有50μL融合瘤之培養用培養基者，將其作為模擬孔(mock well)。測量係以n＝2來實施。接著，捨棄溶液，將各孔以250μL之洗淨液(含有0.05% Tween20的PBS)洗淨3次。
於上述之各孔中添加100μL之HRP標識山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體溶液(Promega公司)，將平盤於室溫靜置1分鐘。接著，捨棄溶液，各孔以250μL之洗淨液(含有0.05% Tween20的PBS)洗淨3次。接著，於各孔中添加50μL之顯色用基質液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase(Promega公司)，於室溫靜置10～20分鐘。接著，於各孔中添加100μL之停止液(2N硫酸)後，使用平盤讀數計測量各孔之450nm中的吸光度。取各培養上清液及對照之2個孔的平均値，自此等之平均値，分別減去各設置各培養上清液及對照的2個模擬孔之平均値者作為測定值。
將對應於添加於顯示高測量値的孔的培養上清液的14種類之融合瘤細胞，選擇作為產生對hTfR顯示高親和性的抗體(高親和性抗hTfR抗體)的細胞株(高親和性抗體產生細胞株)。將此等14種的細胞株編號為選殖株1～選殖株14。又，將選殖株1～選殖株14所產生的抗hTfR抗體，各自作為抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號14。
〔實施例6〕高親和性抗hTfR抗體之可變區的胺基酸序列之解析 由實施例5所選擇的選殖株1～選殖株14來調製cDNA，將此等之cDNA作為模板，使編碼抗體之輕鏈及重鏈的基因放大。將經放大的基因之鹼基序列轉譯，針對各細胞株之產生的抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號14之抗體，各自決定輕鏈及重鏈之可變區的胺基酸序列。
抗hTfR抗體編號1係於輕鏈之可變區包含序列識別號218記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號219記載之胺基酸序列者。又，輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號6或7、於CDR2包含序列識別號8或9、及於CDR3包含序列識別號10記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號76或77、於CDR2包含序列識別號78或79、及於CDR3包含序列識別號80或81記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號2係於輕鏈之可變區包含序列識別號220記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號221記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號11或12、於CDR2包含序列識別號13或14、及於CDR3包含序列識別號15記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號82或83、於CDR2包含序列識別號84或85、及於CDR3包含序列識別號86或87記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號3係於輕鏈之可變區包含序列識別號222記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號223記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號16或17、於CDR2包含序列識別號18或19、及於CDR3包含序列識別號20記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號88或89、於CDR2包含序列識別號90或91、及於CDR3包含序列識別號92或93記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號4係於輕鏈之可變區包含序列識別號224記載之胺基酸序列、於重鏈之可變區包含序列識別號225記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號21或22、於CDR2包含序列識別號23或24、及於CDR3包含序列識別號25記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號94或95、於CDR2包含序列識別號96或97、及於CDR3包含序列識別號98或99記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、含此等之胺基酸序列的一部份的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號5係於輕鏈之可變區包含序列識別號226記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號227記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號26或27、於CDR2包含序列識別號28或29、及於CDR3包含序列識別號30記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號100或101、於CDR2包含序列識別號102或103、及於CDR3包含序列識別號104或105記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號6係於輕鏈之可變區包含序列識別號228記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號229記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號31或32、於CDR2包含序列識別號33或34、及於CDR3包含序列識別號35記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號106或107、於CDR2包含序列識別號108或278、及於CDR3包含序列識別號109或110記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號7係於輕鏈之可變區包含序列識別號230記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號231記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號36或37、於CDR2包含序列識別號38或39、及於CDR3包含序列識別號40記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號111或112、於CDR2包含序列識別號113或114、及於CDR3包含序列識別號115或116記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號8係於輕鏈之可變區包含序列識別號232記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號233記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號41或42、於CDR2包含序列識別號43或44、及於CDR3包含序列識別號45記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號117或118、於CDR2包含序列識別號119或279、及於CDR3包含序列識別號120或121記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號9係於輕鏈之可變區包含序列識別號234記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號235記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號46或47、於CDR2包含序列識別號48或49、及於CDR3包含序列識別號50記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號122或123、於CDR2包含序列識別號124或125、及於CDR3包含序列識別號126或127記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號10係於輕鏈之可變區包含序列識別號236記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號237記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號51或52、於CDR2包含序列識別號53或54、及於CDR3包含序列識別號55記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號128或129、於CDR2包含序列識別號130或131、及於CDR3包含序列識別號132或133記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號11係於輕鏈之可變區包含序列識別號238記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號239記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號56或57、於CDR2包含序列識別號58或59、及於CDR3包含序列識別號60記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號134或135、於CDR2包含序列識別號136或137、及於CDR3包含序列識別號138或139記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號12係於輕鏈之可變區包含序列識別號240記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號241記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號61或62、於CDR2包含序列識別號63或64、及於CDR3包含序列識別號65記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號140或141、於CDR2包含序列識別號142或143、及於CDR3包含序列識別號144或145記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號13係於輕鏈之可變區包含序列識別號242記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號243記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號66或67、於CDR2包含序列識別號68或69、及於CDR3包含序列識別號70記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號146或147、於CDR2包含序列識別號148或149、及於CDR3包含序列識別號150或151記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
抗hTfR抗體編號14係於輕鏈之可變區包含序列識別號244記載之胺基酸序列、及於重鏈之可變區包含序列識別號245記載之胺基酸序列者。又，其輕鏈之可變區係於CDR1包含序列識別號71或72、於CDR2包含序列識別號73或74、及於CDR3包含序列識別號75記載之胺基酸序列者，其重鏈的可變區係於CDR1包含序列識別號152或153、於CDR2包含序列識別號154或155、及於CDR3包含序列識別號156或157記載之胺基酸序列者。惟，CDR並未限於上述之胺基酸序列，包含此等之胺基酸序列的區域、包含此等之胺基酸序列之一部分的連續3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
將抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號14之輕鏈及重鏈之可變區所含的胺基酸序列之序列識別號整理於表1。
[表1] 表1 抗hTfR抗體編號1～14之輕鏈及重鏈之可變區所含的胺基酸序列之序列識別號
抗體編號 輕鏈之可變區 重鏈之可變區
1 218 219
2 220 221
3 222 223
4 224 225
5 226 227
6 228 229
7 230 231
8 232 233
9 234 235
10 236 237
11 238 239
12 240 241
13 242 243
14 244 245
將抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號14之輕鏈之可變區的CDR1～3及重鏈之可變區的CDR1～3所包含的胺基酸序列之序列識別號整理於表2。惟，表2為例示各CDR之胺基酸序列者，各CDR之胺基酸序列並未限於表2記載之胺基酸序列，含此等之胺基酸序列的區域之胺基酸序列、含此等之胺基酸序列之一部分的連續的3個以上之胺基酸所構成的胺基酸序列亦被認為可作為CDR。
[表2] 表2 抗hTfR抗體編號1～14之輕鏈及重鏈之可變區的CDR1〜3所包含的胺基酸序列之序列識別號(各CDR之胺基酸序列的例示)
抗體編號 輕鏈之可變區 重鏈之可變區
   CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
1 6、7 8、9 10 76、77 78、79 80、81
2 11、12 13、14 15 82、83 84、85 86、87
3 16、17 18、19 20 88、89 90、91 92、93
4 21、22 23、24 25 94、95 96、97 98、99
5 26、27 28、29 30 100、101 102、103 104、105
6 31、32 33、34 35 106、107 108、278 109、110
7 36、37 38、39 40 111、112 113、114 115、116
8 41、42 43、44 45 117、118 119、279 120、121
9 46、47 48、49 50 122、123 124、125 126、127
10 51、52 53、54 55 128、129 130、131 132、133
11 56、57 58、59 60 134、135 136、137 138、139
12 61、62 63、64 65 140、141 142、143 144、145
13 66、67 68、69 70 146、147 148、149 150、151
14 71、72 73、74 75 152、153 154、155 156、157
〔實施例7〕抗hTfR抗體之對人類TfR及猴TfR之親和性的測量 抗hTfR抗體對人類TfR及猴TfR之親和性的測量係使用為利用生物薄層干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)的活體分子相互作用解析系統之OctetRED96(ForteBio公司，Pall公司的一部門)來實施。簡單地說明關於生物薄層干涉法之基本原理。對被固定於傳感器晶片表面的活體分子之層(layer)投射特定波長的光時，自活體分子之層與成為內部之參考的層之兩個表面有光反射，而產生光的干涉波。藉由測量試料中之分子與傳感器晶片表面之活體分子結合，傳感器先端之層的厚度增加，於干涉波產生波長位移。藉由測量此波長位移的變化，可以即時地進行與被固定於傳感器晶片表面的活體分子結合的分子數之定量及速度論的解析。測量係大略按照OctetRED96所附的操作手冊來實施。就人類TfR而言，使用具有附加於N端的組胺酸標誌之序列識別號1所示的胺基酸序列之中自N端側之第89號的半胱胺酸殘基至C端之苯丙胺酸為止之hTfR的細胞外區域之胺基酸序列的重組人類TfR(r人類TfR：Sino Biological公司)。就猴TfR而言，使用具有附加於N端的組胺酸之序列識別號2所示的胺基酸序列之中自N端側第89號之半胱胺酸殘基至C端之苯丙胺酸為止之食蟹猴的TfR之細胞外區域之胺基酸序列的重組猴TfR(r猴TfR：Sino Biological公司)。
將實施例5所選擇的選殖株1～選殖株14，以各自細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，使用含(1X)HAT Supplement(Life Technologies公司)及10% Ultra low IgG胎牛血清(Life Technologies公司)的RPMI1640培養基進行稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養上清液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。將回收的培養上清液，裝載(loading)於預先以含150mM NaCl的管柱體積3倍容積之20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的Protein G管柱(管柱體積：1mL，GE HEALTHCARE公司)。接著，藉由管柱體積之5倍容積的相同緩衝液將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容積的50mM甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的抗體溶出，採取溶出劃分。將溶出劃分添加1MTris緩衝液(pH8.0)而調整為pH7.0。將此作為抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號14之純化品而用於以下之實驗。
將經純化的各抗體(抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號14)，各自以HBS-P＋(含150mM NaCl、50μM EDTA及0.05% Surfactant P20的10mM HEPES)作2階段稀釋，調製0.78125～50nM(0.117～7.5μg/mL)之7段階濃度的抗體溶液。將此抗體溶液作為樣品溶液。將r人類TfR與r猴TfR，各自以HBS-P＋稀釋，調製25μg/mL之溶液，各自作為r人類TfR-ECD(Histag)溶液及r猴TfR-ECD(Histag)溶液。
將上述2階段稀釋而調製的樣品溶液，各以200μL/孔添加於96孔盤，黑色(greiner bio-one公司)。又，將上述調製的r人類TfR-ECD(Histag)溶液及r猴TfR-ECD(Histag)溶液，各自各添加200μL/孔於指定孔。於基線、解離用及洗淨用之孔中，以200μL/孔各添加HBS-P＋。於再生用之孔中，以200μL/孔各添加10mM Glycine-HCl，pH1.7。於活性化用之孔中，各添加200μL/孔之0.5mM NiCl2 溶液。將此平盤及生物感應器(Biosensor/Ni-NTA：ForteBio公司，Pall Corporation之一部門)，設置於OctetRED96之指定位置。
使OctetRED96於下述之表3所示條件下操作而取得資料後，使用OctetRED96附屬的解析軟體，將結合反應曲線擬合至1：1結合模型或2：1結合模型，測量對抗hTfR抗體、r人類TfR及r猴TfR之會合速度常數(kon )及解離速度常數(koff )，而算出解離常數(Kd)算出。又，測量係於25～30℃之溫度下實施。
[表3] 表3 OctetRED96之操作條件
   步驟 接觸時間 (sec) 速度 (rpm) 閾値
1 基線1 60 1000 -
2 裝載 600 1000 1.5～2.0
3 基線2 60 1000 -
4 會合 180 1000 -
5 解離 540 1000 -
6 再生 5 1000 -
7 洗淨 5 1000 -
將上述6～7之步驟重複6～7次。
8 活性化 60 1000 -
至全部的樣品測量結束為止，重複1～8之步驟來進行。
於表4呈示抗hTfR抗體編號1～14(表中，各自對應抗體編號1～14)之對人類TfR的會合速度常數(kon )及解離速度常數(koff )之測量結果、及解離常數(kD )。
[表4] 表4 抗hTfR抗體之對人類TfR的親和性
抗體編號 kon(M-1 s-1 ) koff(s-1 ) KD (M)
1 5.00×105 2.55×10-6 5.09×10-12
2 1.11×106 1.23×10-5 1.12×10-11
3 6.53×105 ＜1.0 ×10-7 ＜1.0×10-12
4 1.91×106 2.29×10-4 1.20×10-10
5 6.71×105 2.44×10-5 3.64×10-11
6 7.54×105 7.23×10-4 9.58×10-10
7 3.69×105 3.03×10-5 8.22×10-11
8 6.96×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
9 7.82×105 9.46×10-5 1.21×10-10
10 6.79×105 7.66×10-4 1.13×10-9
11 2.72×105 2.28×10-5 8.37×10-11
12 7.54×105 7.23×10-4 4.32×10-10
13 8.35×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
14 9.61×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
於表5呈示抗hTfR抗體編號1～14(表中，各自對應抗體編號1～14)之對猴TfR的會合速度常數(kon )及解離速度常數(koff )之測量結果、及解離常數(kD )。
[表5] 表5 抗hTfR抗體之對猴TfR的親和性
抗體編號 kon(M-1 s-1 ) koff(s-1 ) KD (M)
1 2.80×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
2 4.18×105 1.75×10-6 4.18×10-11
3 3.89×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
4 7.54×105 1.21×10-4 1.61×10-10
5 5.19×105 7.58×10-4 1.46×10-9
6 4.95×105 2.36×10-4 1.23×10-10
7 2.66×105 4.54×10-6 1.71×10-11
8 5.52×105 5.07×10-3 9.18×10-9
9 6.99×105 1.47×10-4 2.10×10-9
10 3.87×105 1.22×10-2 3.16×10-8
11 1.24×105 4.21×10-4 3.38×10-9
12 5.05×105 1.26×10-4 2.49×10-10
13 5.91×105 7.29×10-5 1.23×10-10
14 7.00×105 3.61×10-5 5.16×10-11
抗hTfR抗體之對人類TfR的親和性測量的結果，於全部的抗體，與人類TfR之解離常數係1×10-8 M以下，除了抗體編號10之外，13種類之抗體與人類TfR之解離常數係1×10-9 M以下，尤其是抗體編號3、8、13及14，與人類TfR之解離常數係1×10-12 M以下(表4)。此等之結果顯示14種類之抗體全部為具有與人類TfR之高親和性的抗體。接著，由抗hTfR抗體之對猴TfR之親和性測量結果來看，全部之抗體與猴TfR之解離常數係5×10-8 M以下，尤其是抗體編號1及3，與猴TfR之解離常數係1×10-12 M以下(表5)。此等之結果顯示14種類之抗體全部不僅具有與人類TfR之高親和性，亦具有與猴TfR之高親和性的抗體。
〔實施例7-2〕使用抗hTfR抗體之小鼠的腦移行評價 接著，關於抗hTfR抗體編號1～9及11～14之13種類之抗體，使用將編碼小鼠運鐵蛋白受體之細胞外區域的基因取代為編碼人類運鐵蛋白受體基因之細胞外區域的基因的hTfR基因置入(knock-in)小鼠(hTfR-KI小鼠)來評價各抗體通過BBB而移行至腦內。hTfR-KI小鼠係約略以下述之方法來製作。又，就抗hTfR抗體而言，使用實施例7記載之抗體之純化品。
於編碼細胞內區域為小鼠hTfR之胺基酸序列、細胞外區域為人類hTfR之胺基酸序列的嵌合hTfR的cDNA之3’側，配置以loxP序列包夾的新黴素耐性基因，化學地合成具有序列識別號253所示的鹼基序列的DNA片段。將此DNA片段，藉由通常方法，併入至具有作為5’臂序列之序列識別號254所示的鹼基序列、作為3’臂序列之序列識別號255所示的鹼基序列的標定載體，藉由電穿孔法將其導入至小鼠ES細胞。將基因導入後之小鼠ES細胞，於新黴素存在下進行選擇培養，選擇標定載體藉由同源重組而併入至染色體的小鼠ES細胞。將獲得的基因重組小鼠ES細胞，注入至ICR小鼠之8細胞期胚(宿主胚)，移植至藉由與進行精管結紮的小鼠交配而獲得的假孕小鼠(授予者小鼠)。針對獲得之幼體(嵌合小鼠)，進行毛色判定，篩選ES細胞高效率地有助於活體之形成的個體，即白色毛相對於全體毛所佔的比率高的個體。將此嵌合小鼠個體與ICR小鼠交配而獲得F1小鼠。篩選白色之F1小鼠，解析自尾巴的組織抽出的DNA，將於染色體上小鼠運鐵蛋白受體基因置換為嵌合hTfR的小鼠作為hTfR-KI小鼠。
將上述13種類之抗hTfR抗體，使用Fluorescein Labeling Kit-NH2 (同仁化學研究所)，按照所附的操作手冊，利用異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)作螢光標識。各自調製含此FITC螢光標識的13種類之抗hTfR抗體的PBS溶液。將此抗體溶液，以被投予的抗hTfR抗體之用量成為3mg/kg的方式，各自靜脈注射至1隻hTfR-KI小鼠(雄，10～12週齡)。又，作為對照，同樣地將含調製的FITC螢光標識的小鼠IgG1(Sigma公司)的PBS溶液，以3mg/kg之用量，靜脈注射至1隻hTfR-KI小鼠(雄，10～12週齡)。靜脈注射約8小時後，以生理食鹽液作全身灌流，採取腦(含大腦與小腦的部份)。測量摘出的腦重量(濕重量)後，添加含蛋白酶抑制劑雞尾酒(Protease Inhibitor Cocktail(Sigma公司))的T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)而將腦組織加以均質化。將均質物離心而回收上清液，藉由以下方法測量上清液中所含之經FITC螢光標識的抗體之量。首先，將抗FITC Antibody(Bethyl公司)各添加10μL於High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔，使靜置1小時而固定於平盤。接著，於各孔各添加150μL之SuperBlock Blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)，振盪1小時而將平盤封阻。接著，於各孔各添加腦組織之均質物之上清液25μL，振盪1小時。接著，於各孔各添加25μL之SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Goat) (Meso Scale Diagnostics公司)，振盪1小時。接著，於各孔各添加150μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000 reader自各孔測量發光量。自濃度已知之經FITC螢光標識的抗hTfR抗體之標準試料之測量値作成校正線，藉由於此將各檢體之測量値進行內插，算出每單位腦之公克重量(濕重量)所含的抗體之量(腦組織中之抗hTfR抗體之濃度)。將其結果示於表5-2。
與對照比較，抗hTfR抗體編號1～9及11～14之抗體之腦組織中的濃度係任一者皆為25倍以上。於抗hTfR抗體編號5及6，其濃度與對照比較為100倍以上，尤其是於抗hTfR抗體編號6達到約160倍。此等之結果顯示，抗hTfR抗體編號1～9及11～14之抗體係顯示具有積極地通過BBB而移行至腦內的性質者。
[表5-2] 表5-2 腦組織中之抗hTfR抗體之濃度
抗體編號 腦組織 (μg/g濕重量) 相對於對照組 之相對値
對照 0.003 1
1 0.141 47.0
2 0.126 42.0
3 0.0833 27.8
4 0.221 73.7
5 0.335 112
6 0.492 164
7 0.0855 28.5
8 0.133 44.3
9 0.112 37.3
11 0.103 34.3
12 0.215 71.7
13 0.127 42.3
14 0.213 71.0
〔實施例8〕使用抗hTfR抗體之猴的藥物動態解析 將抗hTfR抗體編號1～3之抗體，各自以5.0mg/kg之用量，各別單次靜脈內投予至雄性食蟹猴，投予8小時後以生理食鹽液來實施全身灌流。又，作為陰性對照，將非投予抗hTfR抗體之1隻個體同樣地全身灌流。灌流後，摘出含延髓的腦組織。使用此腦組織，進行以下之抗hTfR抗體之濃度測量及免疫組織化學染色。又，就抗hTfR抗體而言，使用實施例7記載之抗體之純化品。
腦組織中之抗hTfR抗體之濃度測量係大略以下列順序進行。將採取的組織，先將腦組織分成大腦、小腦、海馬迴及延髓，再各自以含蛋白酶抑制劑雞尾酒(Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich公司))的RIPA Buffer(和光純藥工業股份有限公司)加以均質化而進行離心並回收上清液。將Affinipure Goat Anti mouse IgG Fcγ pAb(Jackson ImmunoResearch公司)各添加10μL於High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔，靜置1小時而固定於平盤。接著，於各孔各添加150μL SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)，振盪1小時，將平盤封阻。接著，於各孔中各添加25μL之腦組織的均質物的上清液，振盪1小時。接著，於各孔中各添加Affinipure Goat Anti mouse IgG Fab-Biotin(Jackson ImmunoResearch公司)25μL，振盪1小時。接著，於各孔中各添加SULFO-Tag-Streptavidin(Meso Scale Diagnostics公司)25μL，振盪0.5小時。於各孔中各添加Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)150μL，使用SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics公司)，測量來自各孔之發光量。自濃度已知的抗hTfR抗體之標準試料之測量値作成校正線，藉由將各檢體之測量値進行內插，算出各腦組織之每公克重量(濕重量)所含的抗體量(腦組織中之抗hTfR抗體之濃度)。
將腦組織中之抗hTfR抗體之濃度測量結果示於表6。於抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號3之抗體皆觀察到大腦、小腦、海馬迴及延髓之蓄積，但其量係抗hTfR抗體編號1＜抗hTfR抗體編號3＜抗hTfR抗體編號2，抗hTfR抗體編號1最少，抗hTfR抗體編號2最多。於hTfR抗體編號2，與抗hTfR抗體編號1比較，觀察到於大腦約4.3倍、於小腦約6.6倍、於海馬迴約4.6倍、及於延髓約2倍之抗體之蓄積。此等之結果顯示此等3種類之抗體具有通過血腦障壁而蓄積於腦組織的性質，藉由將應於腦組織內發揮機能的藥劑與此等之抗體結合，可使其藥劑效率佳地蓄積於腦組織。
[表6] 表6 腦組織中之抗hTfR抗體之濃度(μg/g濕重量)
抗體編號 大腦 小腦 海馬迴 延髓
1 0.18 0.15 0.12 0.22
2 0.78 0.99 0.56 0.43
3 0.72 0.6 0.33 0.31
腦組織中之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色係約略以下列順序進行。使用Tissue-Tek Cyro 3DM(Sakura Finetek股份有限公司)，將採取的組織急速冷凍至-80℃，而製作組織之冷凍塊。將此冷凍塊薄切成4μm後，貼附於MAS塗布的玻片(松浪硝子股份有限公司)。使組織薄片與4%多聚甲醛(paraformaldehyde)(和光純藥工業股份有限公司)於4℃反應5分鐘，將組織薄片固定於玻片上。接著，使組織薄片與含0.3%過氧化氫水的甲醇溶液(和光純藥工業股份有限公司)反應30分鐘，使內因性過氧化酶失活。接著將玻片與SuperBlock blocking buffer in PBS於室溫反應30分鐘而進行封阻。接著，使組織薄片與小鼠IgG-重鏈及輕鏈抗體(Bethyl Laboratories公司)於室溫反應1小時。使組織薄片以DAB基質(3,3’-二胺基聯苯胺，Vector Laboratories公司)顯色，以梅爾蘇木素(Mayer’s Hematoxylin)(Merck公司)進行對比染色，在脱水、透明化後進行封片，以光學顯微鏡觀察。
於圖1呈示大腦皮質之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。投予抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號3的猴之大腦皮質中，確認到血管之特異性的染色(分別於圖1(b)～(d))。尤其，於投予抗hTfR抗體編號2的猴與投予抗hTfR抗體編號3的猴之大腦皮質(各自為圖1(c)及圖1(d))，確認到於腦血管外之腦實質區域亦有廣泛地特異性染色。又，於作為對照之抗hTfR抗體非投予之猴大腦皮質中未觀察到染色，顯示幾乎沒有背景的染色(圖1(a))。
於圖2呈示海馬迴之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。於投予抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號3的猴大腦中，確認到血管之特異性染色(各自為圖2(b)～(d))。尤其，於投予抗hTfR抗體編號2的猴與投予抗hTfR抗體編號3的猴之海馬迴(各自為圖2(c)及圖2(d))中，於類神經細胞亦確認到特異性染色，再者，於腦血管外之腦實質區域亦確認廣泛地特異性染色。又，於作為對照之未投予抗hTfR抗體的猴之海馬迴中，未觀察到染色，顯示幾乎沒有背景的染色(圖2(a))。
於圖3呈示小腦之抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。於投予抗hTfR抗體編號1～抗hTfR抗體編號3的猴之小腦中，確認到血管之特異性染色(各自為圖3(b)～(d))。尤其，於投予抗hTfR抗體編號2的猴及投予抗hTfR抗體編號3的猴之小腦(各自為圖3(c)及圖3(d))中，於普爾欽細胞亦確認到特異性染色。又，於作為對照之未投予抗hTfR抗體的猴之小腦中，未觀察到染色，顯示幾乎沒有背景的染色(圖3(a))。
由以上之大腦、海馬迴及小腦之免疫組織化學染色的結果，認為抗hTfR抗體編號1可與存在於腦血管內皮表面的hTfR結合，但與抗hTfR抗體編號2及3比較，向腦實質的移行量係較少。另一方面，可知抗hTfR抗體編號2及3可與存在於腦血管內皮表面的hTfR結合，且對hTfR之結合後，通過血腦障壁而移行至腦實質內，進而於海馬迴被併入自腦實質內至類神經細胞為止，於小腦被併入至普爾欽細胞為止。
〔實施例9〕人類化抗hTfR抗體之製作 嘗試表1所示的抗hTfR抗體編號1～3之輕鏈及重鏈之可變區所含的胺基酸序列之人類化。於抗hTfR抗體編號1，獲得具有序列識別號158～序列識別號163所示的胺基酸序列的經人類化的輕鏈之可變區、及具有序列識別號166～序列識別號171所示的胺基酸序列的經人類化的重鏈之可變區。於抗hTfR抗體編號2，獲得具有序列識別號174～序列識別號179所示的胺基酸序列的經人類化的輕鏈之可變區、及具有序列識別號182～序列識別號187所示的胺基酸序列的經人類化的重鏈之可變區。於抗hTfR抗體編號3，獲得具有序列識別號190～序列識別號195所示的胺基酸序列的經人類化的輕鏈之可變區、及具有序列識別號204～序列識別號209所示的胺基酸序列的經人類化的重鏈之可變區。
〔實施例10〕編碼人類化抗hTfR抗體的基因之構築 於上述之抗hTfR抗體編號1～3，各自人工地合成包含編碼含人類化抗hTfR抗體之輕鏈及重鏈之可變區的輕鏈及重鏈之全長的基因之DNA片段。此時，於編碼輕鏈全長的基因之5’側，依序自5’端導入MluI序列及編碼領導子胜肽的序列，於3’側導入NotI序列。又，於編碼重鏈全長的基因之5’側，依序自5’端導入MluI序列及編碼領導子胜肽的序列，於3’側導入NotI序列。又，於其中導入的領導子胜肽，係於使人類化抗體之輕鏈及重鏈於為宿主細胞之哺乳動物細胞中表現時，以輕鏈及重鏈被分泌至細胞外的方式，作為分泌訊息而發揮機能者。
關於抗hTfR抗體編號1之輕鏈，合成包含編碼於可變區具有序列識別號163所示的胺基酸序列之序列識別號164所示的胺基酸序列的輕鏈(人類化抗hTfR抗體編號1之輕鏈)全長的基因的DNA片段(序列識別號165)。關於抗hTfR抗體編號1之重鏈，合成包含編碼於可變區具有序列識別號171所示的胺基酸序列之序列識別號172所示的胺基酸序列的重鏈(人類化抗hTfR抗體編號1之重鏈)全長的基因的DNA片段(序列識別號173)。序列識別號173所示的DNA片段所編碼的人類化抗hTfR抗體之重鏈係IgG1。
關於抗hTfR抗體編號2之輕鏈，合成包含編碼於可變區具有序列識別號179所示的胺基酸序列之序列識別號180所示的胺基酸序列之輕鏈(人類化抗hTfR抗體編號2之輕鏈)全長的基因的DNA片段(序列識別號181)。關於抗hTfR抗體編號2之重鏈，合成包含編碼於可變區具有序列識別號187所示的胺基酸序列之序列識別號188所示的胺基酸序列之重鏈(人類化抗hTfR抗體編號2之重鏈)全長的基因的DNA片段(序列識別號189)。序列識別號189所示的DNA片段所編碼的人類化抗hTfR抗體之重鏈係IgG1。
關於抗hTfR抗體編號3之輕鏈，合成編碼於可變區具有序列識別號191所示的胺基酸序列之序列識別號196所示的胺基酸序列之輕鏈(人類化抗hTfR抗體編號3之輕鏈)全長的DNA片段(序列識別號197)。關於抗hTfR抗體編號3之重鏈，合成編碼於可變區具有序列識別號205所示的胺基酸序列之序列識別號210所示的胺基酸序列之重鏈(人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈)全長的DNA片段(序列識別號211)。序列識別號211所示的DNA片段所編碼的人類化抗hTfR抗體之重鏈係IgG1。
關於抗hTfR抗體編號3之輕鏈，亦合成編碼於可變區具有序列識別號193所示的胺基酸序列之序列識別號198所示的胺基酸序列之輕鏈(人類化抗hTfR抗體編號3-2之輕鏈)全長的DNA片段(序列識別號199)、編碼於可變區具有序列識別號194所示的胺基酸序列之序列識別號200所示的胺基酸序列之輕鏈(人類化抗hTfR抗體編號3-3之輕鏈)全長的DNA片段(序列識別號201)、及編碼於可變區具有序列識別號195所示的胺基酸序列之序列識別號202所示的胺基酸序列之輕鏈(人類化抗hTfR抗體編號3-4之輕鏈)全長的DNA片段(序列識別號203)。
再者，關於抗hTfR抗體編號3之重鏈，合成編碼於可變區具有序列識別號205所示的胺基酸序列之序列識別號212所示的胺基酸序列之重鏈(人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈IgG4)全長的DNA片段(序列識別號213)。此序列識別號213所示的DNA片段所編碼的人類化抗hTfR抗體之重鏈係IgG4。
〔實施例11〕人類化抗hTfR抗體表現載體之構築 將pEF/myc/nuc載體(Invitrogen公司)，以KpnI及NcoI消化，切出含EF-1α啟動子及其第一內含子(intron)的區域，將其以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。將pCI-neo(Invitrogen公司)，以BglII及EcoRI消化，切除含CMV之增強子/啟動子及內含子的區域後，以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。於此，插入含上述EF-1α啟動子及其第一內含子的區域，而構築pE-neo載體。將pE-neo載體，以SfiI及BstXI消化，切除含新黴素耐性基因的約1kbp之區域。將pcDNA3.1/Hygro(＋)(Invitrogen公司)作為模板，使用引子Hyg-Sfi5＇(序列識別號216)及引子Hyg-BstX3’(序列識別號217)，藉由PCR反應來放大潮黴素(hygromycin)基因。將經放大的潮黴素基因，以SfiI及BstXI消化，插入至經切除上述之新黴素耐性基因的pE-neo載體，而構築pE-hygr載體。
將pE-hygr載體及pE-neo載體各自以MluI及NotI消化。將實施例10所合成的編碼人類化抗hTfR抗體編號1之輕鏈的DNA片段(序列識別號165)與編碼重鏈的DNA片段(序列識別號173)以MluI及NotI消化，各自插入pE-hygr載體與pE-neo載體之MluI-NotI間。將獲得的載體，各自作為人類化抗hTfR抗體編號1之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC1)與人類化抗hTfR抗體編號1之重鏈表現用載體之pE-neo(HC1)而用於以下之實驗。
同樣地，將實施例10所合成之編碼人類化抗hTfR抗體編號2之輕鏈的DNA片段(序列識別號181)與編碼重鏈的DNA片段(序列識別號189)以MluI及NotI消化，各自插入pE-hygr載體與pE-neo載體之MluI-NotI間。將獲得的載體，各自作為人類化抗hTfR抗體編號2之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC2)、人類化抗hTfR抗體編號2之重鏈表現用載體之pE-neo(HC2)而用於以下之實驗。
再者，同樣地，將實施例10合成之編碼人類化抗hTfR抗體編號3之輕鏈的DNA片段(序列識別號197)與編碼重鏈的DNA片段(序列識別號211)以MluI及NotI消化，各自插入pE-hygr載體與pE-neo載體之MluI-NotI間。將獲得的載體，各自作為人類化抗hTfR抗體編號3之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3)、人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈表現用載體之pE-neo(HC3)而用於以下之實驗。
再者，關於抗hTfR抗體編號3之輕鏈，將實施例10合成的編碼人類化抗hTfR抗體編號3-2之輕鏈的DNA片段(序列識別號199)、編碼人類化抗hTfR抗體編號3-3之輕鏈的DNA片段(序列識別號201)、及編碼人類化抗hTfR抗體編號3-4之輕鏈的DNA片段(序列識別號203)以MluI及NotI消化，插入pE-hygr載體之MluI-NotI間，各自構築人類化抗hTfR抗體編號3-2之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3-2)、人類化抗hTfR抗體編號3-3之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3-3)、及人類化抗hTfR抗體編號3-4之輕鏈表現用載體之pE-hygr(LC3-4)。
再者，同樣地，關於抗hTfR抗體編號3之重鏈，將實施例10合成的編碼人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈IgG4的DNA片段(序列識別號213)以MluI及NotI消化，插入pE-neo載體之MluI-NotI間，而構築人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈IgG4表現用載體之pE-neo(HC3-IgG4)。
〔實施例12〕人類化抗hTfR抗體表現用細胞之構築 將CHO細胞(CHO-K1：獲自American Type Culture Collection)，藉由下述之方法，使用GenePulser(Bio-Rad公司)，以實施例11構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC1)及重鏈表現用載體pE-neo(HC1)進行轉形。細胞之轉形係大致以下列之方法進行。將5×105 個之CHO-K1細胞接種於已添加CD OptiCHOTM 培養基(Life technologies公司)的3.5cm培養皿，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晩。將培養基與Opti-MEMTM I培養基(Life technologies公司)交換，將細胞以成為5×106 個細胞/mL之密度的方式懸浮。採取細胞懸浮液100μL，於其中各添加以Opti-MEMTM I培養基稀釋成100μg/mL的pE-hygr(LC1)及pE-neo(HC1)質體DNA溶液5μL。使用GenePulser(Bio-Rad公司)，實施電穿孔法，將質體導入至細胞中。將細胞於37℃、5%CO2 之條件下培養一晩後，以已添加0.5mg/mL之潮黴素及0.8mg/mL之G418的CD OptiCHOTM 培養基作選擇培養。
接著，藉由臨界稀釋法，以每1孔1個以下之細胞被播種的方式，於96孔盤上接種經選擇培養所選擇的細胞，以各細胞形成單株菌落的方式培養約10日。採取有單株菌落形成的孔之培養上清液，以ELISA法調查培養上清液中之人類化抗體含量，而選擇人類化抗體高表現細胞株。
此時之ELISA法係大致以下列之方法實施。於96孔微量滴定平盤(Nunc公司)之各孔，各添加100μL之將山羊抗人類IgG多株抗體溶液以0.05M碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)稀釋成4μg/mL者，於室溫至少靜置1小時而使抗體吸附於平盤。接著，以於磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)中添加0.05% Tween20之(PBS-T)將各孔洗淨3次後，將Starting Block (PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific公司)各添加200μL於各孔，將平盤於室溫靜置30分鐘。將各孔以PBS-T洗淨3次後，將已於PBS中添加0.5%BSA及0.05%Tween20者(PBS-BT)稀釋成適當濃度的培養上清液或人類IgG標準品，各添加100μL於各孔，將平盤於室溫至少靜置1小時。將平盤以PBS-T洗淨3次後，將以PBS-BT稀釋的HRP標識抗人類IgG多株抗體溶液，各添加100μL於各孔，將平盤於室溫至少靜置1小時。以PBS-T將各孔洗淨3次後，各添加100μL之含磷酸-檸檬酸緩衝液(pH5.0)的0.4mg/mLo-伸苯二胺於各孔，並於室溫靜置8～20分鐘。接著，於各孔中各添加100μL之1mol/L硫酸而使反應停止，使用96孔盤讀數計，測量各孔之490nm中的吸光度。將對應顯示高測量値的孔之細胞，作為人類化抗hTfR抗體編號1之高表現細胞株。將此作為抗體編號1表現株。
同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC2)及重鏈表現用載體pE-neo(HC2)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號2之高表現細胞株。將此作為抗體編號2表現株。
再者同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號3之高表現細胞株。將此作為抗體編號3表現株。
再者同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-2)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號3-2之高表現細胞株。將此作為抗體編號3-2表現株。
再者同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-3)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號3-3之高表現細胞株。將此作為抗體編號3-3表現株。
再者同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-4)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號3-4之高表現細胞株。將其作為抗體編號3-4表現株。
再者同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3-IgG4)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)之高表現細胞株。將其作為抗體編號3(IgG4)表現株。
再者同樣地，使用實施例11所構築的輕鏈表現用載體pE-hygr(LC3-2)及重鏈表現用載體pE-neo(HC3-IgG4)，而使CHO細胞轉形，獲得人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之高表現細胞株。將其作為抗體編號3-2(IgG4)表現株。
〔實施例13〕人類化抗hTfR抗體之純化 將實施例12所獲得的抗體編號1表現株、抗體編號2表現株、抗體編號3表現株、抗體編號3-2表現株、抗體編號3-3表現株及抗體編號3-4表現株，以各自細胞濃度成為約2×105 個/mL的方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養上清液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。於回收的培養上清液中，添加含150mM NaCl的5倍容積的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以含150mM NaCl的管柱體積3倍容積之20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡的ProteinA管柱(管柱體積：1mL，Bio-Rad公司)。接著，藉由管柱體積之5倍容積的相同緩衝液將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容積的50mM甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的人類化抗體溶出，採取溶出劃分。於溶出劃分中添加1M Tris緩衝液(pH8.0)而中和，將其作為抗體之純化品。
其中，將自抗體編號1表現株之培養上清液純化的抗體，作為人類化抗hTfR抗體編號1。將自抗體編號2表現株之培養上清液純化的抗體，作為人類化抗hTfR抗體編號2。將自抗體編號3表現株之培養上清液純化的抗體，作為人類化抗hTfR抗體編號3。將自抗體編號3-2表現株之培養上清液純化的抗體，作為人類化抗hTfR抗體編號3-2。將自抗體編號3-3表現株之培養上清液純化的抗體，作為人類化抗hTfR抗體編號3-3。又，將自抗體編號3-4表現株之培養上清液純化的抗體，作為人類化抗hTfR抗體編號3-4。
又，關於實施例12所獲得的抗體編號3(IgG4)表現株、及抗體編號3-2(IgG4)表現株，亦與上述同樣地培養，自其培養上清液，各自獲得經純化的人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。此等2種之抗體係用於實施例15記載的使用猴的藥物動態解析。
〔實施例14〕人類化抗hTfR抗體之對人類TfR及猴TfR的親和性測量 將實施例13所獲得的人類化抗hTfR抗體之對人類TfR及猴TfR的親和性，以實施例7記載之方法測量。於表7呈示人類化抗hTfR抗體編號1～3-4(表中，各自對應No.1～3-4)之對人類TfR的會合速度常數(kon )及解離速度常數(koff )之測量結果，及解離常數(kD )。
[表7] 表7 人類化抗hTfR抗體之對人類TfR的親和性
抗體編號 kon(M-1 s-1 ) koff(s-1 ) KD (M)
1 3.93×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
2 1.97×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
3 1.19×106 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
3-2 6.06×105 1.45×10-5 2.39×10-11
3-3 6.00×105 1.25×10-5 2.09×10-11
3-4 1.01×106 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
於表8呈示人類化抗hTfR抗體編號1～3-4(表中，各自對應抗體編號1～3-4)之對猴TfR的會合速度常數(kon )及解離速度常數(koff )之測量結果，及解離常數(kD )。
[表8] 表8 人類化抗hTfR抗體之對猴TfR的親和性
抗體編號 kon(M-1 s-1 ) koff(s-1 ) KD (M)
1 2.53×105 ＜1.0×10-7 ＜1.0×10-12
2 4.87×105 3.67×10-5 7.55×10-11
3 6.03×105 6.76×10-4 1.12×10-9
3-2 4.95×105 8.76×10-4 1.77×10-9
3-3 4.88×105 9.32×10-4 1.91×10-9
3-4 5.19×105 1.35×10-4 2.60×10-10
人類化抗hTfR抗體編號1～3-4之對人類TfR的親和性測量的結果，係於人類化抗hTfR抗體編號1、2、3、及3-4抗體，與人類TfR之解離常數為低於1×10-12 M(表7)。又，人類化抗hTfR抗體編號3-2及3-3之與人類TfR之解離常數係各自為2.39×10-11 M及2.09×10-11 M。另一方面，對應此等抗體的人類化前之抗hTfR抗體之與人類TfR之解離常數，於抗體編號1為5.09×10-12 M，於抗體編號2為1.12×10-11 M，於抗體編號3為低於1×10-12 M(表4)。此等之結果顯示，於將抗體人類化之前及之後，抗hTfR抗體之對人類TfR的高親和性被維持，而於抗hTfR抗體編號4～14，將抗體人類化後，亦顯示對人類TfR之親和性可被維持。
接著，由人類化抗hTfR抗體之對猴TfR之親和性測量的結果來看時，人類化抗hTfR抗體編號1係於將抗體人類化的前後，解離常數為低於1×10-12 M且親和性被維持，人類化抗hTfR抗體編號2亦為人類化前之解離常數為4.18×10-11 M者，但人類化後之解離常數為7.55×10-11 M且親和性被維持(表5、表8)。另一方面，人類化抗hTfR抗體編號3～3-4，對應人類化前之此等抗體的抗hTfR抗體編號3之與猴TfR的解離常數係低於1×10-12 M，但人類化後為2.60×10-10 M～1.91×10-9 M，觀察到對猴TfR的親和性降低。於人類化抗hTfR抗體編號3，雖觀察到對猴TfR之親和性的降低，但此等之結果顯示，抗hTfR抗體之對猴TfR的高親和性，於將抗體人類化的前後並未喪失而大致被維持，於抗hTfR抗體編號4～14，將抗體人類化後，亦顯示對猴TfR之親和性可被維持。
〔實施例15〕人類化抗hTfR抗體之使用猴的藥物動態解析 使用人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之4種抗體，進行使用猴的藥物動態解析。又，人類化抗hTfR抗體編號3係重鏈為IgG1，人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)係將人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈將可變區直接作為IgG4。又，人類化抗hTfR抗體編號3-2係重鏈為IgG1，人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)係將人類化抗hTfR抗體編號3-2之重鏈將可變區直接作為IgG4。此等4種抗體各自以5.0mg/kg之用量，單次靜脈內投予至食蟹猴，投予前、投予後2分鐘、30分鐘、2小時、4小時及8小時後，採取末梢血，採血後實施全身灌流。又，作為陰性對照，將為抗HER2蛋白的人類化抗體之曲妥珠單抗(賀癌平TM ，中外製藥)，同樣地投予一隻個體，投予前、投予後2分鐘、30分鐘、2小時、4小時及8小時後採取末梢血，採血後實施全身灌流。灌流後，摘出含延髓的腦組織、脊髓組織及其他之組織(包含肝臟、心臟、脾臟及骨髓)。使用此腦組織、脊髓組織及其他之組織，進行以下之人類化抗hTfR抗體之濃度測量及免疫組織化學染色。
組織中及末梢血中之人類化抗hTfR抗體之濃度測量係大致以下列順序進行。又，關於腦，係將採取的組織分成大腦皮質、小腦、海馬迴及延髓後進行人類化抗hTfR抗體之濃度測量。將採取的組織各自以含蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma-Aldrich公司)的RIPA Buffer(和光純藥工業股份有限公司)加以均質化而離心並回收上清液。關於末梢血，係將血清分離。將Affinipure Goat Anti mouse IgG Fcγ pAb(Jackson ImmunoResearch公司)各添加10μL於High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔，靜置1小時而固相化。接著，於各孔各添加150μL之SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)，振盪1小時，將平盤封阻。接著，於各孔各添加25μL之均質物的上清液或血清，振盪1小時。接著，於各孔各添加25μL之Affinipure Goat Anti mouse IgG Fab-Biotin(Jackson ImmunoResearch公司)，振盪1小時。接著，於各孔各添加25μL之SULFO-Tag-Streptavidin(Meso Scale Diagnostics公司)，振盪0.5小時。於各孔各添加150μL之Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000 reader而測量來自各孔的發光量。由濃度已知的抗hTfR抗體之標準試料之測量値作成校正線，藉由於其中內插各檢體之測量値，算出各組織中及末梢血中所含的抗體之量。濃度之測量係對各樣品重複進行3次。
將腦組織及脊髓組織中之人類化抗hTfR抗體之濃度測量結果示於表9。
[表9] 表9 腦組織中之人類化抗hTfR抗體之濃度(μg/g濕重量)
抗體編號 大腦皮質 小腦 海馬迴 延髓 脊髓
3 0.67±0.12 0.61±0.02 0.49±0.02 0.59±0.10 0.46±0.17
3-2 1.05±0.07 0.72±0.04 0.72±0.07 0.69±0.03 0.46±0.02
3(IgG4) 0.65±0.05 0.59±0.03 0.56±0.02 0.59±0.02 0.46±0.07
3-2(IgG4) 0.76±0.02 0.57±0.07 0.62±0.05 0.73±0.16 0.48±0.03
陰性對照 0.0082±0.0032 0.0090±0.0067 0.0053±0.0009 0.011±0.003 0.15±0.04
人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)之抗體，皆觀察到於大腦皮質、小腦、海馬迴、延髓及脊髓之蓄積(表9)。其量係於人類化抗hTfR抗體編號3，與陰性對照之曲妥珠單抗(賀癌平TM )比較，於大腦皮質約82倍，於小腦約68倍，於海馬迴約92倍，於延髓約54倍，於脊髓約3.1倍；於人類化抗hTfR抗體編號3-2，與陰性對照之曲妥珠單抗比較，於大腦皮質約128倍，於小腦80倍，於海馬迴約136倍，於延髓約63倍，於脊髓約3.1倍；於人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，與陰性對照之曲妥珠單抗比較，於大腦皮質約79倍，於小腦約66倍，於海馬迴106倍，於延髓約54倍，於脊髓約3.1倍；於人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)，與陰性對照之曲妥珠單抗比較，於大腦皮質約93倍，於小腦約63倍，於海馬迴約117倍，於延髓約66倍，於脊髓約3.2倍(表10)。此等之結果顯示，此等4種之人類化抗hTfR抗體，具有通過血腦障壁而於腦組織蓄積的性質，顯示藉由使應使於腦組織內發揮機能的藥劑與此等之抗體結合，可使其藥劑效率佳地蓄積於腦組織。
[表10] 表10 腦組織中之人類化抗hTfR抗體之蓄積量(與陰性對照比較的蓄積量之倍率)
抗體編號 大腦皮質 小腦 海馬迴 延髓 脊髓
3 82 68 92 54 3.1
3-2 128 80 136 63 3.1
3(IgG4) 79 66 106 54 3.1
3-2(IgG4) 93 63 117 66 3.2
陰性對照 1 1 1 1 1
接著，將肝臟、心臟、脾臟及骨髓之各組織中的人類化抗hTfR抗體之濃度測量之結果示於圖4。於肝臟及脾臟，於4種類之人類化抗hTfR抗體及陰性對照的曲妥珠單抗之任一者皆觀察到蓄積，但其量係於人類化抗hTfR抗體與曲妥珠單抗為同等。於心臟，人類化抗hTfR抗體，與陰性對照之曲妥珠單抗比較，蓄積量有多的傾向，但其量僅為陰性對照之1.5倍～2.8倍左右。於骨髓，人類化抗hTfR抗體，與陰性對照之曲妥珠單抗比較，有顯著地蓄積量多的傾向，其量為陰性對照之3.5～16倍。人類化抗hTfR抗體於骨髓之蓄積，被認為係因於為造血器官之骨髓中TfR的表現量多，藉由與TfR結合，與陰性對照相比之下，較多的人類化抗hTfR抗體蓄積。此等之資料顯示，此等4種之人類化抗hTfR抗體具有特異性地蓄積於為中樞神經系統之大腦、小腦、海馬迴及延髓的性質，藉由使應於腦組織內發揮機能的藥劑與此等之抗體結合，可使其藥劑效率佳地蓄積於腦組織。
接著，將人類化抗hTfR抗體之血中動態的測量結果示於表11。4種類之人類化抗hTfR抗體，與陰性對照之曲妥珠單抗同樣地，於投予後8小時亦顯示血中濃度為60μg/mL以上之高値，於血中為安定的。
[表11] 表11 人類化抗hTfR抗體之血中動態(μg/mL血液)
抗體編號 投予後時間
2分鐘 30分鐘 2小時 4小時 8小時
3 173 147 128 117 97.5
3-2 124 99.5 78.5 76.5 61
3(IgG4) 141 113 99 95 83
3-2(IgG4) 132 111 98.5 99 95.5
陰性對照 124 92.5 96 75.5 60.5
腦組織中之人類化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色係大致以下列之順序進行。使用Tissue-Tek Cyro 3DM(Sakura Finetek股份有限公司)，將採取的組織急速冷凍至-80℃，將冷凍塊薄切成4μm後，貼附於MAS塗覆的玻片(松浪硝子股份有限公司)。使組織薄片於4%多聚甲醛(和光純藥工業股份有限公司)於4℃反應5分鐘，將組織薄片固定於玻片上。接著，使組織薄片與含0.3%過氧化氫水的甲醇溶液(和光純藥工業股份有限公司)反應30分鐘，使內因性過氧化酶失活。接著將玻片於SuperBlock blocking buffer in PBS中使於室溫反應30分鐘而封阻。接著，使組織薄片與小鼠IgG-重鏈及輕鏈抗體(Bethyl Laboratories)於室溫反應1小時。將組織薄片以DAB基質(3,3’-二胺基聯苯胺，Vector Laboratories公司)顯色，以梅爾蘇木素(Merck公司)進行對比染色，在脱水、透明化後封片，以光學顯微鏡觀察。
於圖5呈示大腦皮質之人類化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。於投予人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)的猴之大腦皮質，確認到血管及類神經細胞之特異性染色(分別於圖5(b)～(e))。尤其，於投予人類化抗hTfR抗體編號3-2的猴之大腦皮質(圖5(c))，確認腦血管外之腦實質區域亦有廣範圍特異性染色。又，於作為對照之投予賀癌平的猴之大腦皮質，未觀察到染色，表示於圖5(b)～(e)所觀察的組織染色係對人類化抗hTfR抗體為特異性者(圖5(a))。
於圖6呈示海馬迴之人類化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。於投予人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)的猴之海馬迴，確認到血管及類神經細胞之特異性染色(分別於圖6(b)～(e))。又，作為對照之投予賀癌平的猴之海馬迴未觀察到染色，表示於圖6(b)～(e)所觀察到的組織染色係對人類化抗hTfR抗體為特異性者(圖6(a))。
於圖7呈示小腦之人類化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果。於投予人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)的猴之小腦，確認到血管及普爾欽細胞之特異性染色(分別於圖7(b)～(e))。又，於作為對照組投予賀癌平的猴之小腦未觀察到染色，表示於圖7(b)～(e)觀察到的組織染色係對人類化抗hTfR抗體為特異性者(圖7(a))。
於圖8呈示延髓之人類化抗hTfR抗體之免疫組織化學染色的結果。於投予人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)的猴之延髓，確認血管及類神經細胞之特異性的染色(分別於圖8(b)～(e))。又，於作為對照投予賀癌平的猴之延髓未觀察到染色，表示於圖8(b)～(e)觀察到的組織染色係對人類化抗hTfR抗體為特異性者(圖8(a))。
由實施例8之大腦及小腦之免疫組織化學染色的結果，認為為人類化前的小鼠抗體之抗hTfR抗體編號1，可與存在於腦血管內皮表面的hTfR結合，但移行至腦實質的量為少。另一方面，為人類化前的小鼠抗體之抗hTfR抗體編號2及3，可與存在於腦血管內皮表面的hTfR結合，且，與hTfR之結合後，通過血腦障壁而移行至腦實質內，再者顯示於海馬迴中被併入自腦實質內至類神經細胞，於小腦中被併入至普爾欽細胞。
由此實施例15之大腦、海馬迴、小腦及延髓之免疫組織化學染色的結果可知，將供給至實驗之抗hTfR抗體編號3進行人類化而獲得的4種類之人類化抗hTfR抗體，係與存在於腦血管內皮表面的hTfR結合，且，與hTfR結合後，通過血腦障壁而向腦實質內移行，進一步於大腦皮質中被併入至類神經細胞，於海馬迴中被併入自腦實質內至類神經細胞，於小腦中被併入至普爾欽細胞，於延髓中被併入至類神經細胞。
〔實施例16〕hI2S-人類化抗hTfR抗體融合蛋白質表現用細胞之製作 將pEF/myc/nuc載體(Invitrogen公司)以KpnI及NcoI消化，切出含EF-1α啟動子及其第一內含子的區域，將其以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。將pCI-neo(Invitrogen公司)以BglII及EcoRI消化，切除含CMV之增強子/啟動子及內含子的區域後，以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。於此，插入上述之含EF-1α啟動子及其第一內含子的區域，而構築pE-neo載體。將pE-neo載體以SfiI及BstXI消化，切除含新黴素耐性基因的約1kbp之區域。以pcDNA3.1/Hygro(＋)(Invitrogen公司)作為模板，使用引子Hyg-Sfi5’(序列識別號216)及引子Hyg-BstX3’(序列識別號217)，利用PCR反應將潮黴素基因放大。將經放大的潮黴素基因，以SfiI及BstXI消化，插入至上述之切除新黴素耐性基因的pE-neo載體，而構築pE-hygr載體。
人工地合成包含編碼於具有序列識別號172所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列(Gly Ser)與具有序列識別號246所示的胺基酸序列的hI2S結合的蛋白質的基因之具有序列識別號248所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號247所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈介隔連接子序列(Gly Ser)而結合hI2S的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、及編碼作為分泌訊息之機能的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入至pE-neo載體之MluI及NotI之間，而構築pE-neo(HC-I2S-1)。
人工地合成包含編碼於具有序列識別號188所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列(Gly Ser)而與具有序列識別號246所示的胺基酸序列的hI2S結合的蛋白質之基因之具有序列識別號250所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號249所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈介隔連接子序列(Gly Ser)而與hI2S結合的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、及編碼作為分泌訊息之機能的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入至pE-neo載體之MluI及NotI之間，而構築pE-neo(HC-I2S-2)。
人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列(Gly Ser)而與具有序列識別號246所示的胺基酸序列的hI2S結合的蛋白質的基因之具有序列識別號252所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號251所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈介隔連接子序列(Gly Ser)而結合hI2S的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼作為分泌訊息之機能的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI及NotI之間，而構築pE-neo(HC-I2S-3)。
將CHO細胞(CHO-K1：獲自American Type Culture Collection)，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-I2S-1)及實施例11構築的pE-hygr(LC1)進行轉形，獲得表現hI2S及人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株作為hI2S-抗hTfR抗體表現株1。將此細胞株表現的hI2S與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為I2S-抗hTfR抗體1。
同樣地，將CHO細胞以pE-neo(HC-I2S-2)及實施例11所構築的pE-hygr(LC2)進行轉形，獲得表現hI2S與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株作為hI2S-抗hTfR抗體表現株2。將此細胞株所表現的hI2S與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為I2S-抗hTfR抗體2。
再者同樣地，將CHO細胞以pE-neo(HC-I2S-3)與實施例11構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hI2S與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株作為hI2S-抗hTfR抗體表現株3。將此細胞株表現的hI2S與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為I2S-抗hTfR抗體3。
〔實施例17〕I2S-抗hTfR抗體之製造 將I2S-抗hTfR抗體，以下列之法製造。將實施例16所獲得的hI2S-抗hTfR抗體表現株1、2、及3，以各自細胞濃度成為約2×105 個/mL的方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中加入200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養上清液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。於回收的培養上清液中，添加管柱體積之5倍容積的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積之3倍容積之含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積：1mL，Bio-Rad公司)。接著，供給管柱體積之5倍容積的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容積之50mM甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的I2S-抗hTfR抗體溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)而將含此I2S-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，接著使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將此作為I2S-抗hTfR抗體之純化品。
如此製造的I2S-抗hTfR抗體之對人類TfR及猴TfR的親和性，可藉由例如實施例7記載之方法來測量。又，靜脈內投予時之I2S-抗hTfR抗體之藥物動態解析，可藉由例如實施例8記載之方法來測量。又，I2S-抗hTfR抗體之藥效係例如可使為韓特氏症候群模式小鼠之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶基因剔除小鼠(I2S-KO小鼠)與實施例7-2記載之hTfR-KI小鼠交配，對獲得的I2S-KO/hTfR KI小鼠靜脈注射I2S-抗hTfR抗體，測量蓄積於腦內的醣胺聚醣之減少量，藉此進行評價。
〔實施例18〕I2S-抗hTfR抗體之腦移行評價1 將實施例17所製造的I2S-抗hTfR抗體3之純化品，以1mg/kg之用量，對以實施例7-2記載之方法所製作的hTfR-KI小鼠作靜脈注射(I2S-抗hTfR抗體投予組)。作為對照，將重組hI2S(rhI2S)，以1mg/kg之用量，對hTfR-KI小鼠作靜脈注射(對照組)。對I2S-抗hTfR抗體投予組15隻、對照組3隻之hTfR-KI小鼠(雄性，15～18週齡)進行投予。其中所使用的rhI2S係按照為周知手法之國際專利公報(WO2012/102998)記載的方法來製造。又，作為rhI2S，亦可使用作為醫療用醫藥品被販售的Elaprase(註冊商標)。
關於I2S-抗hTfR抗體投予組，於I2S-抗hTfR抗體3投予後、15分鐘後、1小時後、4小時後、8小時後、及24小時後，各自將3隻小鼠以生理食鹽液作全身灌流處理，採取腦(大腦及小腦)。關於對照組，於rhI2S投予1小時後，以生理食鹽液作全身灌流處理後採取腦(大腦及小腦)。測量摘出的大腦及小腦之重量(濕重量)後，將大腦及小腦，以含蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma公司)的T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)作均質化，回收離心後之上清液。分別藉由實施例20及實施例21記載之ECL法，測量於I2S-抗hTfR抗體投予組之均質物上清液中所含的I2S-抗hTfR抗體之量、於對照組之均質物上清液中所含的rhI2S之量，，算出腦每公克重量(g濕重量)所含之I2S-抗hTfR抗體之量(腦組織中之I2S-抗hTfR抗體之濃度)及rhI2S之量(腦組織中之rhI2S之濃度)。將其結果示於表12。
投予1小時後之腦組織中之I2S-抗hTfR抗體與rhI2S之濃度，係各自為0.368±0.019μg/g濕重量及0.00134±0.00232μg/g濕重量，I2S-抗hTfR抗體之濃度係達到rhI2S之濃度的約270倍。此結果顯示，通常幾乎不通過血腦障壁而不移行至腦組織中的rhI2S，藉由與抗hTfR抗體結合，可通過血腦障壁而移行至腦組織中。又，I2S-抗hTfR抗體之腦組織中之濃度，在投予後僅15分鐘，為0.263±0.038μg/g濕重量，到達投予1小時後之rhI2S之腦組織中的濃度的約200倍。此結果顯示，藉由使與抗hTfR抗體結合，hI2S可快速地移行至腦組織中。
[表12] 表12 腦組織中之I2S-抗hTfR抗體及rhI2S之濃度(μg/g濕重量)
投予後時間(小時) I2S-抗hTfR抗體 rhI2S
0.25 0.263±0.038 -
1 0.368±0.019 0.00134±0.00232
4 0.440±0.033 -
8 0.382±0.011 -
24 0.245±0.012 -
〔實施例19〕I2S-抗hTfR抗體之腦移行評價2 將實施例17製造的I2S-抗hTfR抗體3之純化品以5mg/kg之用量對雄性食蟹猴進行單次靜脈內投予(I2S-抗hTfR抗體投予組)。同樣地，將rhI2S以5mg/kg之用量對雄性食蟹猴進行單次靜脈內投予(rhI2S組)。其中使用的rhI2S係按照為周知手法之國際專利公報(WO2012/102998)記載之方法而製造。又，作為rhI2S，亦可使用作為醫療用醫藥品販售的Elaprase(註冊商標)。各組皆對2隻猴進行投予。投予8小時後各組皆實施全身灌流。灌流後，摘出含頸髓的腦組織。將摘出的腦組織分成大腦皮質、小腦、海馬迴、及頸髓後，將各腦組織以含蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma公司)的T-PER (Thermo Fisher Scientific公司)作均質化，回收離心後之上清液。分別藉由實施例20及實施例21記載之ECL法，測量於I2S-抗hTfR抗體投予組之均質物上清液中所含的I2S-抗hTfR抗體之量、於對照組之均質物上清液中所含的rhI2S之量。由測量値，算出大腦皮質、小腦、海馬迴、及頸髓每公克重量(g濕重量)所含之I2S-抗hTfR抗體之量(此等腦組織中之I2S-抗hTfR抗體之濃度)及rhI2S之量(此等腦組織中之rhI2S之濃度)。將其結果示於圖9。
相對於大腦皮質中的I2S-抗hTfR抗體之濃度為約0.22μg/g，rhI2S則為0.035μg/g。相對於小腦中的I2S-抗hTfR抗體之濃度為約0.18μg/g，rhI2S則為0.02μg/g。相對於海馬迴中的I2S-抗hTfR抗體之濃度為約0.25μg/g，rhI2S則為0.017μg/g。又，相對於頸髓中的I2S-抗hTfR抗體之濃度為約0.15μg/g，rhI2S則為0.039μg/g。即，於大腦皮質、小腦、海馬迴、及頸髓中，I2S-抗hTfR抗體之濃度係顯示各自為rhI2S之濃度之約6.3倍、約9.0倍、約14.7倍、及約3.8倍之値。此等之結果顯示，藉由使hI2S與抗hTfR抗體結合，可使積極地通過血腦障壁而使hI2S效率佳地到達腦內。尤其，海馬迴中的I2S-抗hTfR抗體之濃度與rhI2S相比高達約12.5倍，藉由投予I2S-抗hTfR抗體，尤其於海馬迴可使I2S活性發揮。韓特氏症候群之患者之腦障礙，於通常使用rhI2S的酵素補充療法中，因rhI2S幾乎無法通過血腦障壁而未被改善。另一方面，因I2S-抗hTfR抗體通過血腦障壁，藉由投予I2S-抗hTfR抗體，可於大腦皮質、海馬迴、小腦等之腦組織中補充I2S活性。因此，I2S-抗hTfR抗體(尤其，I2S-抗hTfR抗體3)可被使用作為用以於韓特氏症候群之患者之腦內補充I2S活性的治療藥。因此，藉由投予I2S-抗hTfR抗體(尤其，I2S-抗hTfR抗體3)，於通常使用rhI2S的酵素補充療法中為困難之韓特氏症候群之患者的腦障礙的預防及治療為可能的。尤其，有希望作為於海馬迴具有障礙的韓特氏症候群之患者的治療藥。
〔實施例20〕利用ECL法之I2S-抗hTfR抗體之定量 於為經鏈黴抗生物素塗覆的平盤之Streptavidin Gold Plate 96well(Meso Scale Diagnostics公司)之各孔中，添加150μL之SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)而靜置1小時，將平盤封阻。將為生物素標識抗體之Anti-Human Kappa Light Chain Goat IgG Biotin(Monkey Absorbed)(IBL公司)，藉由SuperBlock blocking buffer in PBS稀釋成0.5μg/mL之濃度。將SULFO標識抗人類I2S抗體藉由SuperBlock blocking buffer in PBS稀釋成1.0μg/mL之濃度。將生物素標識抗體及SULFO標識抗體之稀釋溶液各25μL與25μL之各檢體混合，培育1小時，將此作為抗體反應試料。
將封阻後之平盤的各孔，以200μL之PBS-T(Sigma公司)洗淨後，於各孔中各添加抗體反應試料25μL，培育1小時。培育後，將平盤之各孔以200μL之PBS-T洗淨，接著，添加Read buffer T(Meso scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000(Meso scale Diagnostics公司)測量自各孔的發光量。自濃度已知的I2S-抗hTfR抗體之標準試料之測量値作成檢量線，藉由於其中內插各試料之測量値而定量I2S-抗hTfR抗體。
又，其中使用的抗人類I2S抗體，係將按照為周知手法之國際專利公報(WO2012/102998)記載之方法所製造的rhI2S作為抗原，將小鼠進行免疫而獲得的單株抗體。單株抗體係獲得複數個。作為SULFO標識抗人類I2S抗體，使用利用MSD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics公司)並按照添附的操作手冊而將抗人類I2S抗體進行SULFO標識所製作而成者。
〔實施例21〕利用ECL法之hI2S的定量 於為經鏈黴抗生物素塗覆的平盤之Streptavidin Gold Plate 96well(Meso scale Diagnostics公司)之各孔中，添加150μL之SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)而靜置1小時，將平盤封阻。將生物素標識抗人類I2S抗體，藉由SuperBlock blocking buffer in PBS稀釋成0.5μg/mL之濃度。將SULFO標識抗人類I2S抗體，藉由SuperBlock blocking buffer in PBS稀釋成1.0μg/mL之濃度。將生物素標識抗體及SULFO標識抗體之稀釋溶液各25μL與25μL之檢體混合，培育1小時，將其作為抗體反應試料。
將封阻後之平盤之各孔，以200μL之PBS-T(Sigma公司)洗淨後，於各孔中各添加25μL之抗體反應試料，培育1小時。培育後，將平盤之各孔以200μL之PBS-T洗淨，接著，添加Read buffer T(Meso scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000(Meso scale Diagnostics公司)測量來自各孔之發光量。由濃度已知之hI2S之標準試料的測量値作成校正線，藉由於其中內插各試料之測量値而將rhI2S定量。
又，其中使用的抗人類I2S抗體，係將按照為周知手法之國際專利公報(WO2012/102998)記載之方法所製造的rhI2S作為抗原，將小鼠進行免疫而獲得的單株抗體。作為SULFO標識抗人類I2S抗體，使用利用MSD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics公司)並按照所附的操作手冊而將抗人類I2S抗體進行SULFO標識所製作而成者。又，作為生物素標識抗人類I2S抗體，使用利用Biotin Labelling Kit-NH2 (同仁化學研究所)並按照所附的操作手冊而將與SULFO標識所使用者不同之另一種抗人類I2S抗體進行生物素標識所製作而成者。
〔實施例22〕I2S-抗hTfR抗體之藥效評價 藉由測量已知會蓄積於基因性缺少hI2S活性的韓特氏症候群患者之臟器的醣胺聚醣(GAG)的濃度，來評價I2S-抗hTfR抗體之藥效。將實施例17所製造的I2S-抗hTfR抗體3之純化品，以0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg之用量，靜脈注射至I2S-KO/hTfR-KI小鼠(0.5mg/kg投予組、1.0mg/kg投予組、及2.0mg/kg投予組)。投予係以每週1次的頻率進行4週，於初次投予後第4週，藉由麻醉下放血而使小鼠安樂死，將腦、肝臟、肺及心臟摘出。將摘出的各臟器以冷凍乾燥機(EYELA公司)進行冷凍乾燥而破碎後，測量乾燥重量。於各臟器之乾燥品中，相對於乾燥重量100mg，添加1mL之0.5M Tris緩衝液(pH7.5)，並於約100℃加熱10分鐘。接著，以成為相對於乾燥重量50mg而為1mg之鏈酶蛋白E添加量之方式，添加50mg/mL之鏈酶蛋白E(actinase E)溶液(科研製藥公司)，於約60℃培育16小時而使蛋白質分解後，於約100℃加熱10分鐘。以15,000rpm實施10分鐘離心分離，回收上清液。將上清液中所含之GAG的量，使用WieslabTM sGAG quantitative kit(EURO-DIAGNOSTICA公司)來測量，算出各臟器之每公克重量(g乾燥重量)所含之GAG的量。又，作為對照組，設置非投予I2S-抗hTfR抗體之I2S-KO/hTfR-KI小鼠。又同時地，測量野生型小鼠之各臟器中的GAG之濃度。又，此實驗係於各測量組各使用3隻I2S-KO/hTfR-KI小鼠(雄雌，19-25週齡)來進行。又，於野生型小鼠，使用雄雌19-25週齡者3隻。
將其結果示於圖10。腦、肝臟、肺及心臟皆觀察到，對投予的I2S-抗hTfR抗體之用量呈依存性地，GAG的濃度有意義地降低(圖10(a)～(d))。
就腦來看時，對照組中腦組織中的GAG之濃度為約2.66μg/g，但腦組織中的GAG之濃度，於0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg投予組，各自為約2.23μg/g、約2.15μg/g、約2.10μgg之用量依存性地降低(圖10(a))。I2S-KO/hTfR-KI小鼠之腦組織內的異常GAG量，自對照組之腦組織中的GAG之濃度(約2.66μg/g)減去野生型小鼠之腦組織中的GAG之濃度(約1.76μg/g)可作成約0.90μg/g。因此，藉由將I2S-抗hTfR抗體以0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg之用量投予，可謂藉由I2S-抗hTfR抗體，I2S-KO/hTfR-KI小鼠之腦組織中異常蓄積的GAG之各自約48%、約57%、及約62%被分解。此結果顯示，藉由對韓特氏症候群之患者投予I2S-抗hTfR抗體，可將患者腦組織中異常蓄積的GAG分解、去除，顯示I2S-抗hTfR抗體(尤其，I2S-抗hTfR抗體3)，可發揮預防及治療於以GAG或其片段的蓄積等為原因的韓特氏症候群之患者中可見的腦病變的效果。
就肝臟來看時，對照組中肝臟組織中的GAG之濃度為約10.3μg/g，但肝臟組織中的GAG之濃度，於0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg投予組中，各自為約2.2μg/g、約2.0μg/g、約1.9μg/g之用量依存性地降低(圖10(b))。I2S-KO/hTfR-KI小鼠之肝臟組織內的異常GAG量，自對照組之肝臟組織中的GAG之濃度(約10.3μg/g)減去野生型小鼠之肝臟組織中的GAG之濃度(約0.3μg/g)可作成約10μg/g。因此，藉由將I2S-抗hTfR抗體以0.5～2.0mg/kg之用量投予，可謂藉由I2S-抗hTfR抗體，於I2S-KO/hTfR-KI小鼠之肝臟組織中異常蓄積的GAG之80%以上被分解。
就肺來看時，對照組中肺組織中的GAG之濃度為約10.5μg/g，但肺組織中的GAG之濃度，於0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg投予組中，各自為約7.8μg/g、約6.7μg/g、約5.7μg/g之用量依存性地降低(圖10(c))。於I2S-KO/hTfR-KI小鼠之肺組織內的異常GAG量，自對照組之肺組織中的GAG之濃度(約10.5μg/g)減去野生型小鼠之肺組織中的GAG之濃度(約1.5μg/g)可作成約9.0μg/g。因此，藉由將I2S-抗hTfR抗體以0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg之用量投予，可謂藉由I2S-抗hTfR抗體，於I2S-KO/hTfR-KI小鼠之肺組織中異常蓄積的GAG之各自約30%、約42%、及約53%被分解。
就心臟來看時，對照組中心臟組織中的GAG之濃度為約4.6μg/g，但心臟組織中的GAG之濃度於0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg投予組中，各自為約2.2μg/g、約2.0μg/g、約1.5μg/g之用量依存性地降低(圖10d)。I2S-KO/hTfR-KI小鼠之心臟組織中的異常GAG量，自對照組之心臟組織中的GAG之濃度(約4.6μg/g)減去野生型小鼠之心臟組織中的GAG之濃度(約0.8μg/g)可作成約3.8μg/g。因此，藉由將I2S-抗hTfR抗體以0.5mg/kg、1.0mg/kg、及2.0mg/kg之用量投予，可謂藉由I2S-抗hTfR抗體，於I2S-KO/hTfR-KI小鼠之心臟組織中異常蓄積的GAG之各自約63%、約70%、及約81%被分解。
於上述之肝臟、肺及心臟之結果，顯示I2S-抗hTfR抗體除了於腦組織內之GAG，亦分解於其他臟器、器官蓄積的GAG。即，將I2S-抗hTfR抗體(尤其，I2S-抗hTfR抗體3)作為對韓特氏症患者的酵素補充療法之藥劑而投予時，顯示可對包含患者之腦的全身臟器、器官補充酵素。I2S-抗hTfR抗體顯示，藉由靜脈內投予，可對包含腦的全身臟器、器官補充酵素。
〔實施例23〕GAG之測量法 GAG之測量係使用Wieslab™ sGAG quantitative kit(EURO-DIAGNOSTICA公司)，按照所附的操作手冊，大致以下列之方法來實施。採檢體或標準液(空白組為水)各50μL於1.5mL試管中。將GuHCl溶液各50μL加入至各試管，於室溫使反應15分鐘。將SAT溶液各50μL加入至各試管，並於室溫使反應15分鐘。調製水：SAT溶液：Alcian Blue stock solution＝9：5：1之混合液，將調製的混合液各添加750μL於各試管，於室溫使反應15分鐘。將此反應液以12500g離心15分鐘，移除上清液。於各試管各添加500μL 之DMSO，於室溫15分鐘，振盪而混合後，以12500g離心15分鐘而分離，移除上清液。於各試管各添加500μL 之Gu-Prop溶液，於室溫15分鐘，振盪而混合。將此混合後之溶液，各分注200μL於96孔盤之各孔，以平盤讀數計測量各孔之600nm中的吸光度。自已知濃度之GAG溶液之測量値作成校正線，於其內插各試料之測量値而將GAG濃度定量。
〔實施例24〕人類化抗hTfR抗體與各種生理活性胜肽之融合蛋白質之製造 藉由以上之實施例22為止的實驗，顯示與人類化抗hTfR抗體結合的人類I2S會通過血腦障壁而到達腦組織中，於腦內發揮I2S活性。因此，製作人類化抗hTfR抗體與各種生理活性胜肽之融合蛋白質，檢討此等之融合蛋白質是否會通過BBB而到達腦組織內。其中，作為生理活性胜肽，選擇人類紅血球生成素、人類烯丙基硫酸酯酶A、人類PPT-1、人類TPP-1、人類α-L-艾杜糖醛酸酶、人類TNFα受體、及人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(N-sulphoglucosamine sulphohydrolase)(乙醯肝素N-硫酸酯酶)作為與人類化抗hTfR抗體結合的生理活性胜肽。用以使人類化抗hTfR抗體與各自之生理活性胜肽之融合蛋白質表現的表現載體、及此等融合蛋白質，係利用以下之實施例25～31記載之方法來調製。
〔實施例25〕人類化抗hTfR抗體與人類紅血球生成素之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser與具有序列識別號256所示的胺基酸序列的人類紅血球生成素(hEPO)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號258所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號257所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而結合hEPO的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI及NotI之間，而構築pE-neo(HC-hEPO)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hEPO)及實施例11構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hEPO與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株作為hEPO-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株表現的hEPO與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為EPO-抗hTfR抗體。
將hEPO-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，於由5%CO2 及95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm之攪拌速度培養6～7日。藉由離心操作而回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，而作成培養上清液。於經回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的EPO-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此EPO-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為EPO-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例26〕人類化抗hTfR抗體與人類烯丙基硫酸酯酶A之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而與具有序列識別號259所示的胺基酸序列的人類烯丙基硫酸酯酶A(hARSA)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號261所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號260所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而結合hARSA的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構築pE-neo(HC-hARSA)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hARSA)及實施例11所構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hARSA與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株，作為hARSA-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株所表現的hARSA與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為ARSA-抗hTfR抗體。
將hARSA-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。於回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的ARSA-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此ARSA-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為ARSA-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例27〕人類化抗hTfR抗體與人類PPT-1之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而與具有序列識別號262所示的胺基酸序列的人類PPT-1(hPPT-1)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號264所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號263所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而結合hPPT-1的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構築pE-neo(HC-hPPT-1)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hPPT-1)及實施例11所構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現與hPPT-1人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株，作為hPPT-1-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株所表現的hPPT-1與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為PPT-1-抗hTfR抗體。
將hPPT-1-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。於回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的PPT-1-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此PPT-1-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為PPT-1-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例28〕人類化抗hTfR抗體與人類TPP-1之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser與具有序列識別號265所示的胺基酸序列的人類TPP-1(hTPP-1)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號267所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號266所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而結合hTPP-1的融合蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI及NotI之間，而構築pE-neo(HC-hTPP-1)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hTPP-1)及實施例11構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hTPP-1與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株，作為hTPP-1-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株表現的hTPP-1與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為TPP-1-抗hTfR抗體。
將hTPP-1-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 及95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm之攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，而作成培養上清液。於經回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的TPP-1-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此TPP-1-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為TPP-1-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例29〕人類化抗hTfR抗體與人類α-L-艾杜糖醛酸酶之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而與具有序列識別號268所示的胺基酸序列的人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號270所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號269所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而結合hIDUA的融合蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入至pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構築pE-neo(HC-hIDUA)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hIDUA)及實施例11構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hIDUA與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株，作為hIDUA-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株所表現的hIDUA與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為IDUA-抗hTfR抗體。
將hIDUA-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。於回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的IDUA-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此IDUA-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為IDUA-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例30〕人類化抗hTfR抗體與人類TNFα受體之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser與具有序列識別號271所示的胺基酸序列的人類TNFα受體(hTNFαR)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號273所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號272所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而結合hTNFαR的蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI及NotI之間，而構築pE-neo(HC-hTNFαR)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hTNFαR)及實施例11構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hTNFαR與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株，作為hTNFαR-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株表現的hTNFαR與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為TNFαR-抗hTfR抗體。
將hTNFαR-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，於由5%CO2 及95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm之攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，而作成培養上清液。於經回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的hTNFαR-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此TNFαR-抗hTfR抗體的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為TNFαR-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例31〕人類化抗hTfR抗體與人類乙醯肝素N-硫酸酯酶之融合蛋白質之製造法 人工地合成包含編碼於具有序列識別號210所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而與具有序列識別號274所示的胺基酸序列的人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(hSGSH)結合的蛋白質的cDNA之具有序列識別號276所示的鹼基序列的DNA片段。此DNA片段係編碼於具有序列識別號275所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而使與hSGSH結合的融合蛋白質。又，此DNA片段係於5’側，自5’端依序具有MluI序列、編碼機能為分泌訊息的領導子胜肽的序列，於3’側具有NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化，併入於pE-neo載體之MluI與NotI之間，而構築pE-neo(HC-hSGSH)。
將CHO細胞，藉由實施例12記載之方法，以pE-neo(HC-hSGSH)及實施例11所構築的pE-hygr(LC3)進行轉形，獲得表現hSGSH與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質的細胞株。將此細胞株，作為hSGSH-抗hTfR抗體表現株。將此細胞株所表現的hSGSH與人類化抗hTfR抗體之融合蛋白質作為SGSH-抗hTfR抗體。
將hSGSH-抗hTfR抗體表現株，以細胞濃度成為約2×105 個/mL之方式，以CD OptiCHOTM 培養基稀釋，於1L之三角燒瓶中添加200mL之細胞懸浮液，於37℃，在由5%CO2 與95%空氣所組成的濕潤環境下，以約70rpm的攪拌速度，培養6～7日。藉由離心操作而回收培養液，以0.22μm過濾器(Millipore公司)過濾，作為培養上清液。於回收的培養上清液中，添加管柱體積5倍容量的含150mL NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)，裝載於事先以管柱體積3倍容量的含150mM NaCl的20mM Tris緩衝液(pH8.0)平衡化的ProteinA管柱(管柱體積1mL；Bio-Rad公司)。其次，供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而將管柱洗淨後，以含150mM NaCl的管柱體積之4倍容量的50mM 甘胺酸緩衝液(pH2.8)，使吸附的SGSH-抗hTfR溶出。添加1M Tris緩衝液(pH8.0)，將含此SGSH-抗hTfR的溶出液之pH調整為pH7.0，其次，使用Amicon Ultra 30kDa膜(Millipore公司)，緩衝液交換成PBS。將其作為SGSH-抗hTfR抗體之純化品。
〔實施例32〕人類化抗hTfR抗體與各種生理活性胜肽之融合蛋白質的腦移行評價 將實施例25～實施例31所獲得之EPO-抗hTfR抗體、ARSA-抗hTfR抗體、PPT-1-抗hTfR抗體、TPP-1-抗hTfR抗體、IDUA-抗hTfR抗體、TNFαR-抗hTfR抗體及SGSH-抗hTfR抗體之純化品，各自以3mg/kg之用量對hTfR-KI小鼠進行單次靜脈內投予。又，作為對照，將人類免疫球蛋白製劑(人免疫球蛋白 球蛋白肌注「VENESIS」，田邊三菱製藥股份有限公司)以3mg/kg之用量對hTfR-KI小鼠(17-28週齡)進行單次靜脈注射。於各自之融合蛋白質及對照之投予，各使用hTfR-KI小鼠(雄雌，17-28週齡)1隻。
自進行靜脈注射投予8小時後，以生理食鹽水實施全身灌流，灌流後，摘出各小鼠之腦組織。接著將摘出的腦組織以含蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma公司)的T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)加以均質化，回收離心後之上清液。將經回收的均質物的上清液所含的融合蛋白質之濃度，利用以下所示方法測量。又，生物素標識化山羊抗人類IgG Fc多株抗體，係使用利用Biotin Labelling Kit-NH2 (同仁化學研究所)並按照所附的操作手冊而將山羊抗人類IgG Fc多株抗體(Bethyl公司)進行生物素標識所製作而成者。又，SULFO標識化山羊抗人類IgG Fc多株抗體，係使用利用MSD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics公司)並按照所附的操作手冊而將山羊抗人類IgG Fc多株抗體(Bethyl公司)進行SULFO標識所製作而成者。
於Streptavidin Gold Plate 96 well(Meso scale Diagnostics公司)之各孔中，添加150μL之SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)而靜置1小時，將平盤封阻。將生物素標識化山羊抗人類IgG Fc多株抗體，藉由SuperBlock blocking buffer in PBS稀釋成0.5μg/mL之濃度。將SULFO標識化山羊抗人類IgG Fc多株抗體，藉由SuperBlock blocking buffer in PBS稀釋成1.0μg/mL之濃度。將生物素標識抗體及SULFO標識抗體之稀釋溶液各25μL與25μL之各檢體混合，培育1小時，將其作為抗體反應試料。
將封阻後的平盤之各孔，以200μL之PBS-T(Sigma公司)洗淨後，於各孔中各添加25μL抗體反應試料，培育1小時。培育後，將平盤之各孔以200μL之PBS-T洗淨，接著，添加Read buffer T(Meso scale Diagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000(Meso scale Diagnostics公司)測量由各孔之發光量。由濃度已知的標準試料之測量値作成校正線，藉由於其中內插各試料之測量値，算出腦組織每公克重量(g濕重量)所含之各別的融合蛋白質之量(針對腦組織中之各自的融合蛋白質之濃度)。將其結果示於表13。
將作為對照的人類免疫球蛋白之腦組織中的濃度設為1時，腦組織中的EPO-抗hTfR抗體、ARSA-抗hTfR抗體、PPT-1-抗hTfR抗體、TPP-1-抗hTfR抗體、IDUA-抗hTfR抗體、TNFαR-抗hTfR抗體及SGSH-抗hTfR抗體之濃度的相對値係各自為4.33、3.39、4.87、6.48、5.62、7.44、及2.24，顯示使與抗hTfR抗體結合的此等之生理活性胜肽積極地移行至腦組織中。即，此等之結果顯示，藉由使與抗hTfR抗體融合，可使通常不通過血腦障壁的此等之生理活性蛋白質，通過血腦障壁而到達腦組織中。
即，顯示可各自使用EPO-抗hTfR抗體作為腦缺血之治療劑、使用ARSA-抗hTfR抗體為烯丙基硫酸酯酶A作為異染性白質失養症(metachromatic leukodystrophy)中的中樞神經障礙治療劑、使用PPT-1-抗hTfR抗體作為神經元蠟樣脂褐質沉著症(neuronal ceroid-lipofuscinosis)或Santavuori-Haltia病中的中樞神經障礙治療劑、使用TPP-1-抗hTfR抗體作為神經元蠟樣脂褐質沉著症或Jansky-Bielschowsky病中的中樞神經障礙治療劑、使用IDUA-抗hTfR抗體作為賀勒氏症候群(Hurler syndrome)或胡-射二氏症候群(Hurler‐Scheie syndrome)中的中樞神經障礙治療劑、使用SGSH-抗hTfR抗體作為聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo syndrome)中的中樞神經障礙治療劑、使用IDUA-抗hTfR抗體作為賀勒氏症候群或胡-射二氏症候群中的中樞神經障礙治療劑、使用TNFαR-抗hTfR抗體作為腦缺血及腦炎症性疾病之治療劑。又未限於此等，係顯示藉由與抗hTfR抗體融合，可使通常不通過血腦障壁的所冀望之生理活性蛋白質通過血腦障壁而到達腦組織中者。
[表13] 表13 腦組織中之各種融合蛋白質的濃度(μg/g濕重量)
融合蛋白質 濃度 相對於對照的 相對値
對照 0.0199 1
EPO-抗hTFR抗體 0.0862 4.33
ARSA-抗hTFR抗體 0.0675 3.39
PPT-1-抗hTFR抗體 0.0970 4.87
TPP-1-抗hTFR抗體 0.129 6.48
IDUA-抗hTFR抗體 0.112 5.62
TNFaR-抗hTFR抗體 0.148 7.44
SGSH-抗hTFR抗體 0.0445 2.24
[產業上利用之可能性]
本發明之抗hTfR抗體，因藉由與其融合，可使所冀望之生理活性蛋白質、低分子物質等通過血腦障壁，故作為提供將應使於中樞神經系統中作用的生理活性蛋白質、低分子物質等送達至腦內的手段而言，有用性高。
1:血管 2:腦實質 3:類神經細胞 4:普爾欽細胞 [序列表非關鍵詞文字(Sequence Listing Free Text)]
序列識別號3：連接子例1之胺基酸序列 序列識別號4：連接子例2之胺基酸序列 序列識別號5：連接子例3之胺基酸序列 序列識別號6：小鼠抗hTfR抗體編號1之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列識別號7：小鼠抗hTfR抗體編號1之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 序列識別號8：小鼠抗hTfR抗體編號1之輕鏈CDR2之胺基酸序列1 序列識別號9：小鼠抗hTfR抗體編號1之輕鏈CDR2之胺基酸序列2 序列識別號10：小鼠抗hTfR抗體編號1之輕鏈CDR3之胺基酸序列 序列識別號11：小鼠抗hTfR抗體編號2之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列識別號12：小鼠抗hTfR抗體編號2之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 序列識別號13：小鼠抗hTfR抗體編號2之輕鏈CDR2之胺基酸序列1 序列識別號14：小鼠抗hTfR抗體編號2之輕鏈CDR2之胺基酸序列2 序列識別號15：小鼠抗hTfR抗體編號2之輕鏈CDR3之胺基酸序列 序列識別號16：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列識別號17：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 序列識別號18：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR2之胺基酸序列1 序列識別號19：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR2之胺基酸序列2 序列識別號20：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈CDR3之胺基酸序列 序列識別號21：小鼠抗hTfR抗體編號4之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列識別號22：小鼠抗hTfR抗體編號4之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 序列識別號23：小鼠抗hTfR抗體編號4之輕鏈CDR2之胺基酸序列1 序列識別號24：小鼠抗hTfR抗體編號4之輕鏈CDR2之胺基酸序列2 序列識別號25：小鼠抗hTfR抗體編號4之輕鏈CDR3之胺基酸序列 序列識別號26：小鼠抗hTfR抗體編號5之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列識別號27：小鼠抗hTfR抗體編號5之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 序列識別號28：小鼠抗hTfR抗體編號5之輕鏈CDR2之胺基酸序列1 序列識別號29：小鼠抗hTfR抗體編號5之輕鏈CDR2之胺基酸序列2 序列識別號30：小鼠抗hTfR抗體編號5之輕鏈CDR3之胺基酸序列 序列識別號31：小鼠抗hTfR抗體編號6之輕鏈CDR1之胺基酸序列1 序列識別號32：小鼠抗hTfR抗體編號6之輕鏈CDR1之胺基酸序列2 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序列識別號194：人類化抗hTfR抗體編號3之輕鏈可變區的胺基酸序列5 序列識別號195：人類化抗hTfR抗體編號3之輕鏈可變區的胺基酸序列6 序列識別號196：人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列2作為可變區的輕鏈之胺基酸序列 序列識別號197：編碼人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列2作為可變區的輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號198：人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列4作為可變區的輕鏈之胺基酸序列 序列識別號199：編碼人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列4作為可變區的輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號200：含人類化抗hTfR抗體編號3之輕鏈可變區的胺基酸序列5的輕鏈之胺基酸序列 序列識別號201：編碼人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列5作為可變區的輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號202：人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列6作為可變區的輕鏈之胺基酸序列 序列識別號203：編碼人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列6作為可變區的輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號204：人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列1 序列識別號205：人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列2 序列識別號206：人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列3 序列識別號207：人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列4 序列識別號208：人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列5 序列識別號209：人類化抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列6 序列識別號210：人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列2作為可變區的重鏈之胺基酸序列 序列識別號211：人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列2作為可變區的重鏈之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號212：人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列2作為可變區的重鏈(IgG4)之胺基酸序列 序列識別號213：編碼人類化抗hTfR抗體編號3之含胺基酸序列2作為可變區的重鏈(IgG4)之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號214：引子hTfR5’，合成序列 序列識別號215：引子hTfR3’，合成序列 序列識別號216：引子Hyg-Sfi5’，合成序列 序列識別號217：引子Hyg-BstX3’，合成序列 序列識別號218：小鼠抗hTfR抗體編號1之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號219：小鼠抗hTfR抗體編號1之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號220：小鼠抗hTfR抗體編號2之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號221：小鼠抗hTfR抗體編號2之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號222：小鼠抗hTfR抗體編號3之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號223：小鼠抗hTfR抗體編號3之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號224：小鼠抗hTfR抗體編號4之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號225：小鼠抗hTfR抗體編號4之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號226：小鼠抗hTfR抗體編號5之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號227：小鼠抗hTfR抗體編號5之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號228：小鼠抗hTfR抗體編號6之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號229：小鼠抗hTfR抗體編號6之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號230：小鼠抗hTfR抗體編號7之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號231：小鼠抗hTfR抗體編號7之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號232：小鼠抗hTfR抗體編號8之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號233：小鼠抗hTfR抗體編號8之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號234：小鼠抗hTfR抗體編號9之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號235：小鼠抗hTfR抗體編號9之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號236：小鼠抗hTfR抗體編號10之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號237：小鼠抗hTfR抗體編號10之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號238：小鼠抗hTfR抗體編號11之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號239：小鼠抗hTfR抗體編號11之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號240：小鼠抗hTfR抗體編號12之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號241：小鼠抗hTfR抗體編號12之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號242：小鼠抗hTfR抗體編號13之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號243：小鼠抗hTfR抗體編號13之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號244：小鼠抗hTfR抗體編號14之輕鏈可變區的胺基酸序列 序列識別號245：小鼠抗hTfR抗體編號14之重鏈的可變區之胺基酸序列 序列識別號247：抗hTfR抗體編號1之重鏈(人類化6)與hI2S之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號248：編碼抗hTfR抗體編號1之重鏈(人類化6)與hI2S之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號249：抗hTfR抗體編號2之重鏈(人類化6)與hI2S之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號250：編碼抗hTfR抗體編號2之重鏈(人類化6)與hI2S之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號251：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hI2S之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號252：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hI2S之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號253：於編碼嵌合hTfR的cDNA之3’側配置以loxP序列包夾的新黴素耐性基因的DNA之鹼基序列，合成序列 序列識別號254：標定載體之5’臂的鹼基序列，合成序列 序列識別號255：標定載體之3’ 臂的鹼基序列，合成序列 序列識別號257：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hEPO之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號258：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hEPO之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號260：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hARSA之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號261：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hARSA之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號263：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hPPT-1之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號264：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hPPT-1之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號266：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hTPP-1之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號267：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hTPP-1之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號269：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hIDＵA之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號270：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hIDＵA之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號272：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hTNFαR之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號273：編碼抗hTfRα抗體編號3之重鏈(人類化2)與hTNFαR之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號275：抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hSGSH之融合蛋白質之胺基酸序列 序列識別號276：編碼抗hTfR抗體編號3之重鏈(人類化2)與hSGSH之融合蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列，合成序列 序列識別號277：單股抗hTfR抗體之胺基酸序列 序列識別號278：小鼠抗hTfR抗體編號6之重鏈CDR2之胺基酸序列2 序列識別號279：小鼠抗hTfR抗體編號8之重鏈CDR2之胺基酸序列2
圖1 係呈示將抗hTfR抗體單次靜脈內投予後之食蟹猴的大腦皮質之對於抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖式代用照片。(a)非投予抗hTfR抗體，(b)為投予抗hTfR抗體編號1，(c)投予抗hTfR抗體編號2，(d)投予抗hTfR抗體編號3。各照片之右下的長條係表示50μm的標尺(gauge)。 圖2 係呈示將抗hTfR抗體單次靜脈內投予後之食蟹猴的海馬迴之對於抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖。(a)非投予抗hTfR抗體，(b)投予抗hTfR抗體編號1，(c)投予抗hTfR抗體編號2，(d)投予抗hTfR抗體編號3。各照片之右下的長條係表示50μm的標尺。 圖3 係呈示將抗hTfR抗體單次靜脈內投予後之食蟹猴的小腦之對於抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖式代用照片。(a)非投予抗hTfR抗體，(b)投予抗hTfR抗體編號1，(c)投予抗hTfR抗體編號2，(d)投予抗hTfR抗體編號3。各照片之右下的長條係表示50μm的標尺。 圖4 係呈示單次靜脈內投予後之向食蟹猴的腦以外之各種臟器的人類化抗hTfR抗體之蓄積量的圖。縱軸表示各臟器之每單位濕重量的人類化抗hTfR抗體之量(μg/g濕重量)。白長條係自左依序表示，各自投予人類化抗hTfR抗體編號3、人類化抗hTfR抗體編號3-2、人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)、及人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。黑長條表示於投予曲妥珠單抗(trastuzumab)(賀癌平(Herceptin)TM )的猴之各臟器中的蓄積量。ND意指未測量。 圖5 係呈示單次靜脈內投予後之食蟹猴的大腦皮質之對於人類化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖式代用照片。(a)投予賀癌平，(b)投予人類化抗hTfR抗體編號3，(c)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2，(d)投予人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下的長條係表示20μm的標尺。 圖6 係呈示單次靜脈內投予後之食蟹猴的海馬迴之對於人類化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖。(a)投予賀癌平，(b)投予人類化抗hTfR抗體編號3，(c)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2，(d)投予人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下的長條係表示20μm的標尺。 圖7 係呈示單次靜脈內投予後之食蟹猴的小腦之對於人類化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖。(a)投予賀癌平，(b)投予人類化抗hTfR抗體編號3，(c)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2，(d)投予人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下的長條係表示20μm的標尺。 圖8 係呈示單次靜脈內投予後之食蟹猴的延髓之對於人類化抗hTfR抗體的免疫組織化學染色之結果的圖。(a)投予賀癌平，(b)投予人類化抗hTfR抗體編號3，(c)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2，(d)投予人類化抗hTfR抗體編號3(IgG4)，(e)投予人類化抗hTfR抗體編號3-2(IgG4)。各照片之右下的長條係表示20μm的標尺。 圖9 係呈示於食蟹猴單次靜脈內投予後之I2S-抗hTfR抗體及rhI2S向腦組織蓄積量的圖。縱軸表示腦組織之每單位濕重量之I2S-抗hTfR抗體及rhI2S之量(μg/g濕重量)。網點長條表示食蟹猴之腦組織中的rhI2S的蓄積量。橫線長條係表示食蟹猴之腦組織中的I2S-抗hTfR抗體之蓄積量。縱線段表示標準偏差。 圖10 係呈示經靜脈注射人類化抗hTfR抗體或rhI2S之I2S基因剔除小鼠(I2S-KO小鼠)中的各種臟器中的醣胺聚醣(glycosaminoglycan)(GAG)之量的圖。(a)腦、(b)肝臟、(c)肺、(d)心臟。各圖全部中，長條自左依序表示野生型小鼠(WT)、對照組(非投予組)、0.5mg/kg投予組、1.0mg/kg投予組、及2.0mg/kg投予組。縱軸表示各臟器之乾燥單位重量之GAG量(μg/g乾燥重量)。又，縱線段表示標準偏差，**表示於將對照組作為對照的Dunnet檢定之P＜0.01。
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無。

Claims (42)

  1. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其輕鏈之可變區係分別包含序列識別號17之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號19之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號20之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係分別包含序列識別號88之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號91之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號93之胺基酸序列作為CDR3而成者。
  2. 如請求項1之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中該抗體之輕鏈的可變區係包含選自由序列識別號190、序列識別號191、序列識別號192、序列識別號193、序列識別號194、及序列識別號195之胺基酸序列所構成的群組之任一胺基酸序列而成，且該抗體之重鏈的可變區係包含選自由序列識別號204、序列識別號205、序列識別號206、序列識別號207、序列識別號208、及序列識別號209之胺基酸序列所構成的群組之任一胺基酸序列而成者。
  3. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其在構成如請求項2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1~10個之胺基酸取代、缺失或添加，且輕鏈之可變區係分別包含序列識別號17之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號19之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號20之胺基酸序列作為CDR3而成。
  4. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其在構成如請求項2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1~3個之胺基酸取代、缺失或添加，且輕鏈之可變區係分別包含序列識別號17之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號19之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號20之胺基酸序列作為CDR3而成。
  5. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其在構成如請求項2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1~10個之胺基酸取代、缺失或添加，且重鏈之可變區係分別包含序列識別號88之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號91之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號93之胺基酸序列作為CDR3而成。
  6. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其在構成如請求項2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列中，有1~3個之胺基酸取代、缺失或添加，且重鏈之可變區係分別包含序列識別號88之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號91之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號93之胺基酸序列作為CDR3而成。
  7. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其在構成如請求項2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列及重鏈可變區的胺基酸序列之各者的胺基酸序列中，各自有1~10個之胺基酸取代、缺失或添加， 並且輕鏈之可變區係分別包含序列識別號17之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號19之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號20之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係分別包含序列識別號88之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號91之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號93之胺基酸序列作為CDR3而成。
  8. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體，其在構成如請求項2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列及重鏈可變區的胺基酸序列之各者的胺基酸序列中，各自有1~3個之胺基酸取代、缺失或添加，並且輕鏈之可變區係分別包含序列識別號17之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號19之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號20之胺基酸序列作為CDR3而成，且重鏈之可變區係分別包含序列識別號88之胺基酸序列作為CDR1、包含序列識別號91之胺基酸序列作為CDR2、及包含序列識別號93之胺基酸序列作為CDR3而成。
  9. 如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其對人類運鐵蛋白受體之細胞外區域及猴運鐵蛋白受體之細胞外區域兩者具有親和性。
  10. 如請求項9之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其與人類運鐵蛋白受體之細胞外區域的解離常數為1×10-8M以下，與猴運鐵蛋白受體之細胞外區域的解離常數為5×10-8M以下。
  11. 如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其為Fab抗體、F(ab’)2抗體、或F(ab’)抗體。
  12. 如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其為選自由scFab、scF(ab’)、scF(ab’)2及scFv所構成的群組的單股抗體。
  13. 如請求項12之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其輕鏈與重鏈係介隔連接子(linker)序列而結合者。
  14. 如請求項12之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其輕鏈與重鏈係於輕鏈之C端側，介隔連接子序列而結合者。
  15. 如請求項12之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其輕鏈與重鏈係於重鏈之C端側，介隔連接子序列而結合者。
  16. 如請求項13之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中該連接子序列係由8~50個之胺基酸殘基所構成者。
  17. 如請求項16之抗人類運鐵蛋白受體抗體，其中該連接子序列係選自由胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列識別號3、序列識別號4、及序列識別號5之各胺基酸序列、及相當於連續3個序列識別號3之胺基酸序列的胺基酸序列所構成的群組者。
  18. 一種融合蛋白質，其係包含如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體、及結合於其輕鏈之C端 側或N端側的其他蛋白質A之胺基酸序列而成。
  19. 一種融合蛋白質，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體與其他蛋白質A的融合蛋白質，其中該抗人類運鐵蛋白受體抗體係如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體，該其他蛋白質A係結合於該抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈之C端側或N端側者。
  20. 如請求項18之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係於該輕鏈之C端側或N端側介隔連接子序列而結合者。
  21. 如請求項20之融合蛋白質，其中該連接子序列係由1~50個之胺基酸殘基所構成者。
  22. 如請求項21之融合蛋白質，其中該連接子序列係包含選自由1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號3之胺基酸序列、序列識別號4之胺基酸序列、序列識別號5之胺基酸序列及1~10個此等胺基酸序列連續而成的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成者。
  23. 一種融合蛋白質，其係包含如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體、及結合於其重鏈之C端側或N端側的其他蛋白質A之胺基酸序列而成者。
  24. 一種融合蛋白質，其係抗人類運鐵蛋白受體抗體與其他蛋白質A之融合蛋白質，其中該抗人類運鐵蛋白受體抗體係如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體， 該其他蛋白質A係結合於該抗人類運鐵蛋白受體抗體之重鏈之C端側或N端側者。
  25. 如請求項23之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係於該重鏈之C端側或N端側介隔連接子序列而結合者。
  26. 如請求項25之融合蛋白質，其中該連接子序列係由1~50個之胺基酸殘基所構成者。
  27. 如請求項25之融合蛋白質，其中該連接子序列係包含選自由1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號3之胺基酸序列、序列識別號4之胺基酸序列、序列識別號5之胺基酸序列及1~10個此等胺基酸序列連續而成的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列而成者。
  28. 如請求項23之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係來自人類之蛋白質。
  29. 如請求項23之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A係選自由神經成長因子(NGF)、溶酶體(lysosome)酵素、睫狀體神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神經膠細胞株神經營養因子(glial cell neurotrophic factor，GDNF)、神經滋養素3(neurotrophin 3)、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1(neuregulin 1)、紅血球生成素(erythropoietin)、達依泊汀(darbepoetin)、活化素(activin)、鹼性纖維母細胞成長因子(bFGF)、纖維母細胞成長因子2(FGF2)、上皮細胞增殖因子(EGF)、血管內 皮增殖因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、PD-1配位體(PD-1 ligand)、具有分解beta-類澱粉(beta-amyloid)的活性的酵素、抗beta-類澱粉抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗HER2抗體、及抗TNF-α抗體所構成的群組者。
  30. 如請求項23之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為溶酶體酵素，該溶酶體酵素係選自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronic acid-2-sulfatase)、葡萄糖腦苷酶(glucocerebrosidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A(β-hexosaminidase A)、β-己醣胺酶B、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷轉移酶、α-甘露糖酶、β-甘露糖酶、半乳糖神經醯胺酶(galactosylceramidase)、鞘脂激活蛋白C(saposin C)、烯丙基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基葡萄糖胺酶(aspartyl glucosaminidase)、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶(α-N-acetyl-galactosaminidase)、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶、乙醯基CoAα-氨基葡糖苷N-乙醯基轉移酶(acetyl CoAα-glucosaminide N-acetyltransferase)、N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶 (sialidase)、軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1、三肽基肽酶-1(Tripeptidyl Peptidase-1)、玻糖醛酸酶-1(hyaluronidase-1)、CLN1及CLN2所構成的群組者。
  31. 如請求項23之融合蛋白質，該其他蛋白質A為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
  32. 如請求項27之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且該融合蛋白質係下述者：該人類化抗hTfR抗體之輕鏈具有序列識別號196之胺基酸序列，該人類化抗hTfR抗體之重鏈係於其C端側介隔連接子序列Gly-Ser而與人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合，且整體而言具有序列識別號251所示的胺基酸序列者。
  33. 如請求項27之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且該融合蛋白質包含：具有序列識別號196之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之輕鏈、以及於具有序列識別號210之胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈之C端側介隔連接子序列Gly-Ser而與序列識別號246所示的人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合者。
  34. 如請求項27之融合蛋白質，其中該其他蛋白質A為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且該融合蛋白質係：由該人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶介隔連接子序列Gly-Ser而於重鏈之C端側結合而成的結合體、及輕鏈所構成，該結合體之胺基酸序列為序列識別號251所示者，該輕鏈之胺基酸序列為序列識別號196所示 者。
  35. 一種DNA片段，其編碼如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之胺基酸序列。
  36. 一種DNA片段，其編碼如請求項23之融合蛋白質之胺基酸序列。
  37. 一種DNA片段，其編碼如請求項28之融合蛋白質之胺基酸序列。
  38. 一種表現載體，其係併入如請求項37之DNA片段而成。
  39. 一種哺乳動物細胞，其係經如請求項38之表現載體而轉形。
  40. 一種抗人類運鐵蛋白受體抗體-藥理活性物質複合體，其係使如請求項1或2之抗人類運鐵蛋白受體抗體之輕鏈及/或重鏈之任一者與應使通過血腦障壁而於腦內發揮機能的低分子量之藥理活性物質結合者。
  41. 如請求項40之抗人類運鐵蛋白受體抗體-藥理活性物質複合體，其中該藥理活性物質係選自由抗癌劑、阿滋海默氏症(Alzheimer’s disease)治療劑、帕金森氏病(Parkinson’s disease)治療劑、亨汀頓氏症(Huntington’s disease)治療劑、思覺失調症治療劑、憂鬱症治療劑、多發性硬化症治療劑、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)治療劑、包含腦腫瘤的中樞神經系統的腫瘤治療劑、伴隨腦障礙的溶酶體病之治療劑、肝醣病(glycogenosis)治療劑、肌肉營 養不良(muscular dystrophy)治療劑、腦缺血治療劑、普里昂疾病(prion disease)治療劑、外傷性之中樞神經系統障礙之治療劑、對病毒性及細菌性之中樞神經系統疾病的治療劑、腦外科手術後之回復所使用的藥劑、脊椎外科手術後之回復所使用的藥劑、siRNA、反義DNA、及胜肽所構成的群組的任一者。
  42. 一種如請求項31之融合蛋白質之用途，其係用於伴隨韓特氏症候群(Hunter syndrome)之中樞神經系統的疾病狀態的治療之血中投予用藥劑之製造。
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