JPH07509444A - トランスフェリンセレプター特異的抗体−神経薬又は診断薬複合体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスフエリンセレブター特異的抗体−神経薬又は診断薬複合体の製造法 背景 脳の組織に血液を供給する毛細血管は血液脳関門を構成する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２５ ５ニア４−８３；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｗ、Ｍ。

（１９８６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、Ｒｅｖ、７：３１４−３３０）ｏ編毛細血管を 形成する内皮細胞は体の他の組織に存在するものと異なっている。編毛細血管内 皮細胞は堅い細胞内結合部により接合され、それが血液から脳への物質の受動的 移動に対する連続的な壁を形成する。これらの細胞は、他の組織において毛細血 管壁を横切るいくらか非選択的な輸送を許す飲作用小胞（ｐｉｎｏｃｙｔｉｃ　 ｖｅｓｉｃｌｅ）をほとんど持たないという点でも異なる。細胞を通って走り、 無制限の通過を許す連続した間隙又は溝もない。

血液脳関門機能は、脳の環境が絶えず制御されていることを保証する。

血液中の種々の物質、例えばホルモン、アミノ酸及びイオンの量は多くの場合、 飲食及び運動などの活動によりもたらされる小さな変動を受ける（Ｇｏｌｄｓｔ ｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、上記で引用）。脳が血液脳関門により血清組成におけるこ れらの変動から保護されていない場合、非制御神経活動という結果が起こる。

血流からの脳の単離は完全ではない。これがもし完全な場合は、脳は栄養の不足 により、及び体の他の部分と化学物質を交換する必要の故に正しく機能すること ができない。毛細血管内皮細胞内の特異的輸送系の存在は脳が正常な成長及び機 能に必要な化合物のすべてを制御された方法で受け取ることを保証する。多くの 場合これらの輸送系は細胞表面レセプター（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａ ｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔ。

ｒ）から成り、それはそのそれぞれのリガンドと結合すると細胞により取り込ま れる（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｗ、Ｍ、、上記で引用）。ソノ後レセプターーリガ ンド複合体を含む小胞は内皮細胞の腔（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）表面に移動し、そ こでリガンドが放出される。

血液脳関門により提起される問題は、脳の保護の過程でそれが多くの有用な治療 薬であり得るものを排除することである。現在十分に親油性である物質のみが血 液脳関門を貫通することができる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、上記で 引用；Ｐａｒｄｒ　ｉｄｇｅ、Ｗ、Ｍ、、上記で引用）。いくつかの薬物は修飾 してそれをより親油性とし、それにより血液脳関門を横切るその能力を増すこと ができる。しかし各薬物について各修飾が個別に調べられ、修飾は薬物の活性を 変化させ得る。修飾は又、化合物の編毛細血管内皮細胞の膜のみでな（すべての 細胞膜を横切る能力を増すという非常に普遍的効果も有する。

発明の概略 本発明は、神経薬又は診断薬を血液脳関門を横切って宿主の脳に配達する方法に 関する。方法は、治療的有効量の抗体−神経薬又は診断薬複合体を宿主に投与す ることを含み、ここで抗体はトランスフェリンレセプターと反応性であり、抗体 は１つの動物源からの可変領域及び異なる動物源からの定常領域の間のキメラで ある。複合体は、編毛細血管内皮細胞上のトランスフェリンレセプターへの抗体 の結合が起こり、神経薬が製薬学的に活性な形態で血液脳関門を横切りて転移さ れるような条件下で投与される。本発明の他の態様は、神経薬と結合したトラン スフェリンレセプターと反応性の抗体を含む配達系、及び神経障害を伴う疾患に 苦しむ宿主の処置の方法を含む。

本発明の実施態様において、トランスフェリンレセプターと反応性の抗体はキメ ラ抗体である。この抗体は１つの動物源から誘導されたトランスフェリンレセプ ターと免疫学的に反応性の可変領域、及び可変領域を与えたものと異なる動物源 から誘導された定常領域を含む。本発明のキメラ抗体は単離物として、又は血液 脳関門を横切る転移のための神経薬との複合体として存在することができる。後 者の様式の場合、キメラ抗体−神経薬複合体は血液脳関門を横切って神経薬を配 達するための配達系を形成する。

脳に治療薬を配達するために現在利用できる手段はそれらが侵入性であるという 点で限られている。本発明の配達系は非侵入性であり、神経薬のキャリヤーとし て、トランスフェリンレセプターと反応性で容易に入手できる抗体を利用するこ とができる。配達系は、血液脳関門の脳−側に達する前の早期の神経薬の放出を 許さずに抗体が血液脳関門を横切って神経薬を輸送できる点で有利である。さら に脳に配達されるべき薬剤の治療活性がリンカ−の付加により変化しなければ、 抗体への神経薬の結合に非切断性リンカ−を用いることができる。

図面の説明 図１はラットにおけるラットトランスフェリンレセプターへの１４０−標識ネズ ミモノクローナル抗体（ＯＸ−２６）のラット脳吸収のグラフであり、脳当たり 及び血液５５μｍ当たりの放射性標識抗体のパーセント注入投薬量を注入後の時 間に対してプロットしである。

図２は脳実質及び血管の間の放射性標識０Ｘ−２６の配置における時間依存性変 化を示すヒストグラムである。

図３は０Ｘ−２６との複合体として投与した場合のメトトレキセートの血液脳関 門を横切る配達の増加を示すヒストグラムである。

図４は０Ｘ−２６−ＡＺＴ複合体の抗体及びＡＺＴ成分の両方の脳における分布 を３つのヒストグラム（ＡＳＢ及びＣ）で示す。

図５は○Ｘ−２６との複合体の形態のタンパク質、西洋ワサビパーオキシダーゼ のラット脳における血液脳関門を横切る配達の実験結果を示すヒストグラムであ る。

図６は０Ｘ−２６との複合体の形態のＣＤ４を用いて可溶性ＣＤ４をラット脳実 質に配達する実験結果を示すヒストグラムである。

図７はジノモルガスモンキー（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ）におけ る抗体１２８．１及び標準ＩｇＧの生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ ｎ）を示すヒストグラムである。

図８はＰＣＲによって得た免疫グロブリン可変領域遺伝子の発現のための一般的 戦略の工程系統図である。

図９はＶ領域の最初のクローニング及び配列決定、及びその後の最終的発現ベク ター中へのクローニングの両方の場合の可変領域増幅に用いられるプライマーを 示す。

図１０は１２８．１重鎮可変領域のクローニングを示す。

図１１はγ−１イソタイプ定常領域を含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４６０２の抗 体コード配列を示す。

図１２は１２８．１軽鎖可変領域のクローニングを示す。

図１３は軽鎖発現ベクターｐＡＧ４６１１の抗体コード配列である。

図１４はγ−２イソタイプを含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４６２５のプラスミド 地図を示す。

図１５はγ−３イソタイプを含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４８０７のプラスミド 地図を示す。

図１６はγ−４イソタイプを含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４８０８のプラスミド 地図を示す。

図１７はγ−２イソタイプ定常領域を含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４６２５の抗 体コード配列である。

図１８はγ−３イソタイプ定常領域を含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４８０７の抗 体コード配列である。

図１９はγ−４イソタイプ定常領域を含む重鎮発現ベクターｐＡＨ４８０８の抗 体コード領域である。

詳細な説明 血液脳関門を横切って宿主の脳に神経薬を配達する方法は、治療的有効量の抗体 −神経薬複合体の宿主への投与を含み、ここで抗体は編毛細血管内皮細胞上に存 在するトランスフェリンレセプターと反応性である。

方法は、抗体が編毛細血管内皮細胞上のトランスフェリンレセプターと結合し、 神経薬が製薬学的活性形態で血液脳関門を横切って転移されるような条件下で行 われる。

宿主は神経障害を起こし易い動物（すなわち脳を有する動物）であることができ る。宿主の例にはヒト、家畜（例えばイヌ、ネコ、ウシ又はウマ）、マウス及び ラットなどの哺乳類が含まれる。

神経薬は神経障害又は中枢神経系の生物学的機能に影響する状態に治療的あるい は予防的効果を有する薬剤であることができる。神経障害の例には癌（例えば脳 腫瘍）、自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、脳卒中、てんかん、パーキンソン病 、多発性硬化症、神経退行疾患（ｎｅｕｒ。

ｄｅｇｅｍｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）、外傷、うつ病、アルツハイマー 病、片頭痛、疼痛又はａ章疾患（ｓｅｉｚｕｒｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が含まれ る。本発明で用いることができる神経薬の種類にはタンパク質、抗体、アドレナ リン作動薬、抗痙彎薬、小分子、ヌクレオチド類似体、化学療法薬、坑外傷薬、 ペプチド及び神経障害の処置又は予防に用いられる他の種類の薬剤が含まれる。

タンパク質の例にはＣＤ４（その可溶性タンパク質を含む）、成長因子（例えば 神経成長因子及びインターフェロン）、ドーパミンデカルボキシラーゼ及びトリ コサンチンが含まれる。抗体の例にはアンフォテリシンＢ１ゲンタマイシンサル フェート及びピリメタミンが含まれる。アドレナリン作動薬（遮断薬を含む）の 例にはドーパミン及びアテノロールが含まれる。化学療法薬の例にはアドリアマ イシン、メトトレキセート、シクロホスファミド、エトポシド及びカーポプラチ ンが含まれる。用いることができる抗痙章薬の例はパルプロエートであり、用い ることができる坑外傷薬はスーパーオキシドジスムターゼである。ペプチドの例 はソマトスフチン類似体及びエンケファリナーゼ阻害剤である。用いることがで きるヌクレオチド類似体にはアシドチミジン（後文ではＡＺＴ）、ジデオキシイ ノシン（ｄｄＩ）及びジデオキシイノン（ｄ　ｄ　ｅ）が含まれる。

脳毛細血管内皮細胞上に存在するトランスフェリンレセプターと反応性の抗体は 診断薬にも複合させることができる。本方法及び配達系において、神経薬−抗ト ランスフェリンレセプター複合体の神経薬を診断薬と置き換えた。か（して診断 薬は血液脳関門を横切って宿主の脳に配達される。その後診断薬は診断薬が意図 された生理学的状態の存在の指標として検出される。例えば診断薬はアミロイド プラークに対する抗体であることができる。脳毛細血管内皮細胞上に存在するト ランスフェリンレセプターと反応性の抗体と複合化されると、この診断薬抗体は 血液脳関門を横切って転移され、その後アミロイドプラークと免疫反応すること ができる。そのような免疫反応はアルツハイマー病の指標となる。

血清トランスフェリンは循環系において鉄と結合し、それを種々の組織に輸送す る分子量がｇｏ、ｏｏｏダルトンのモノマー糖タンパク質である（Ａｉｓｅｎ　 ｅｔ　ａｌ、（１９８０）Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、４９：３５７−３９３；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ　ｅｔ−見±、（ １９８１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：３５４３−３５５３）。個々の細 胞による鉄の吸収は、ジスルフィド結合により結合した２つの同一の９５，００ ０ダルトンのサブユニットを含む内在性脱糖タンパク質であるトランスフェリン レセプターにより媒介される。細胞の表面上のレセプターの数は細胞増殖と関連 し、活発に成長する細胞上に最高数があり、最低数は休止及び末端に分化した細 胞上にあると思われる。Ｊｅｆｆｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ　（Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏ ｌ、３１２（１９８４年１１月）ｐｐ。１６７−１６８）はモノクローナル抗体 を用い、編毛細血管内皮細胞がその表面上に高密度のトランスフェリンレセプタ ーを有することを示した。

本発明内で用いることができる抗体はトランスフェリンレセプターと反応性であ る。抗体という用語はポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含むもの とする。好ましい抗体はトランスフェリンレセプターと反応性のモノクローナル 抗体である。抗体という用語はトランスフェリンレセプターと反応性の１ｍより 多い抗体の混合物（例えばトランスフェリンレセプターと反応性の異なる種類の モノクローナル抗体の反応混液）も含むものとする。抗体という用語はさらに全 抗体、生物学的に機能性のその断片、及び１つより多い種からの１部分、二価抗 体などを含むキメラ抗体も含むものとする。用いることができる生物学的に機能 性の抗体断片は、抗体断片のトランスフェリンレセプターへの結合が起こるのに 十分な断片である。

キメラ又は他の抗体は特定のイソタイプに制限されると考える必要はない。いず れの抗体イソタイプも本発明の範囲内である。例えば同一の軽鎖を有するが重鎮 が異なる抗体は含まれるものとする。さらに抗体のある領域、例えばγ鎖におけ る突然変異も含まれるものとする。これらの突然変異、特に点突然変異は、トラ ンスフェリンレセプターと反応性の抗体の機能が保持されていれば、いずれで起 こっても良い。

キメラ抗体は２つの異なる種から誘導された部分（例えばヒト定常領域及びネズ ミ可変又は結合領域）を含むことができる。２つの異なる種から誘導された部分 は、従来の方法により化学的に結合することができ、あるいは遺伝子工学法を用 いて１つの連続的タンパク質として製造することができる。キメラ抗体の軽鎖及 び重鎮部分の両方のタンパク質をコードする］）ＮＡを連続的タンパク質として 発現することができる。

トランスフェリンレセプターと反応性のキメラ抗体の生産又はクローニングに用 いることができる１つの遺伝子工学的方法は、機能性抗体の可変領域をコードす るＤＮＡを、特定のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによる増幅のためにブラ イミング（ｐｒ　ｉｍｅ）することである。

機能性抗体の可変領域は、抗体においてトランスフェリンレセプター抗原と免疫 学的に反応する部分である。抗体の重鎮及び軽鎖の両方が可変領域に寄与する。

か（して可変領域をコードするＤＮＡは、可変領域重鎮をコードするポリヌクレ オチド配列及び可変領域重鎮をコードするポリヌクレオチド配列の２つの部分を 有する。ブライミングされた可変領域をその後、抗体の定常領域をコードするＤ ＮＡを含むベクター中にクローニングする。特に有用なベクターは、他の供給源 からの免疫グロブリン可変領域も発現するように設計されたヒト抗体の定常領域 をコードするＤＮＡを含むものである。定常領域をコードするＤＮＡは通常、そ のＤＮＡが可変領域をコードする供給源以外の別の供給源からのものである。同 一種からの異なる動物が可変領域と定常領域をコードするＤＮＡの供給源である ことができるが、通常の状況では動物の種が異なる（例えばヒト定常領域とネズ ミ可変領域）。ブライミングされた可変領域を、定常領域を含むベクター中にク ローニングした後、キメラ抗体をそのようなベクターから発現することができる 。

免疫グロブリン可変領域の増幅に用いることができる一般的戦略は以前に記載が ある（○ｒｌａｎｄｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、 、８６：３８３３−３８３７　（１９８９）；Ｌａｒｒｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ユニ９３４−９３８（１９８９）；Ｇａｖｉｌ ｏｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、９　（５）：　４０７−４１７ 　（１９９０））　。一般的戦略では２つの方法が用いられてきた。１つの方法 の場合、５°プライマーを可変領域の第１フレームワーク領域をブライミングす るように設計する。

３°プライマーはＪ領域又は定常領域のいずれかをブライミングするように設計 する。フレームワークにおけるブライミング（Ｏｒｌａｎｄｉ）はこれらの配列 の保存性を利用する。これは、可変領域の大半をクローニングするために比較的 少量の縮重プライマーを用いることを可能にする。この方法の欠点は抗体の親和 性に影響を与えるアミノ酸置換がフレームワーク領域に導入され得ることである 。

第２の方法の場合（Ｌａｒｒｉｃｋ、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ）、５’プライマーは リーダー配列のある部分をブライミングするように設計される。３゛プライマー は第１の方法と同様にＪ領域又は定常領域のいずれかをブライミングするように 設計される。第２の方法はリーダー配列の比較的保存された性質を利用し、この 部位のブライミングに１組の縮重オリゴヌクレオチドを用いる。リーダーペプチ ドは成熟抗体分子から除去され、この配列における変異は抗体の親和性に影響を 与えないので、リーダー配列におけるブライミングは一般により強力な方法であ る。多（の異なるリーダーペプチド配列が、小胞体への成熟抗体分子のターゲテ ィングに有効である。この第２の方法が本開示において好ましい実施態様である 。

トランスフェリンレセプターという用語は全レセプター又はその一部を含むもの とする。トランスフェリンレセプターの一部は、抗−トランスフェリンレセプタ ー抗体へのレセプターの結合が起こるのに十分な部分を含む。

少なくともトランスフェリンレセプターの一部と反応性のモノクローナル抗体は 入手できる（例えばＯＸ’−２６、Ｂ３／２５　（ｏｍａｒｙｅｔ　ａ↓　、（ １９８０）Ｎａｔｕｒｅ　λ８６，８８８−８９１）、Ｔ５６／１４（Ｇａｔｔ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｍｍｕｎｏｉｏｇｙ　（１９８５）５４：３３３−３４１）　、０ＫＴ−９（ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）Ｐｒｏｃ、ＮａとＬノエ工虹 」工よＵＳＡ　７８：４５１５−４５１９）、Ｌ５゜１　（Ｒｏｖｅｒａ、Ｃ， （１９８２）Ｂｌｏｏｄ　５９：６７１−６７８）Ｓ５Ｅ−９（Ｈａｙｎｅｓ　 ｅｔ　ａｌ、（１９８１）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２７：３４７−３５１）、Ｒ Ｉ７　２１７　（Ｔｒｏｗｂｒ−且±、上記で引用）が、あるいは従来の体細胞 ハイブリッド形成法を用いて製造することができる（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ ｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７）、少な （ともトランスフェリンレセプターの一部を含む粗又は精製タンパク質あるいは ペプチドを免疫原として用いることができる。動物に免疫原を用いてワクチン注 射し、抗−トランスフェリンレセプター抗体−生産膵臓細胞を得る。免疫化する 動物の種は所望のモノクローナル抗体の種に依存して変えられる。抗体生産細胞 を不死細胞（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｉｎｇｃｅｌｌ）（例えば骨髄腫細胞）と融 合し、抗−トランスフェリンレセプター抗体を分泌することができるハイブリド ーマを創造する。非融合の残留抗体−生産細胞及び不死細胞を除去する。抗トラ ンスフェリンレセプター抗体を生産するハイブリドーマを従来の方法を用いて選 択し、選択された抗−トランスフェリンレセプター抗体生産ハイブリドーマをク ローニングし、培養する。

ポリクローナル抗体は、少なくともトランスフェリンレセプターの一部を含む粗 又は精製タンパク質あるいはペプチドを用いて動物を免疫化することにより製造 できる。トランスフェリンレセプターと反応性の抗体が生産される条件下に動物 を保持する。抗体の所望の力価に達したら動物から血液を集める。ポリクローナ ル抗体を含む血清（抗血清）を他の血液成分から分離する。ポリクローナル抗体 −含有血清は、場合により特定の種類の抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ）の画分に さらに分離することができる。

神経薬は標準的化学的複合化法を用いて抗体に結合することができる。

一般に結合はアミン又はスルフヒドリル基を介して形成される。結合は、神経薬 がその本来の形態に遊離した時により有効であるか、又は薬剤の製薬学的活性が 抗体に結合している間、保持されているかに依存して切断可能結合あるいは切断 不可能結合であることができる。切断可能又は切断不可能結合のいずれを用いる かの決定は、本来の、及び結合形態の両方の薬物の活性を測定することにより不 必要な実験をせずに行うことができ、いくつかの薬物の場合は本来の、及び結合 形態の両方における薬物の既知の活性に基づいて決定することができる。

タンパク質又はペプチドの脳への配達を含むいくつかの場合、タンパク質又はペ ブ升ドの生物学的に活性な部分が結合により影響を受けなければ、遊離のタンパ ク質又はペプチドの放出は必要ではない。その結果、抗体−タンパク質又は抗体 −ペプチド複合体は、切断不可能リンカ−を用いて構築することがてきる。その ようなタンパク質又はペプチドの例にはＣＤ４、スーパーオキシドジスムターゼ 、インターフェロン、神経成長因子、トリコサンチン、ドーパミンデカルボキシ ラーゼ、ソマトスフチン類似体、及びエンケファリナーゼ阻害剤が含まれる。Ｃ Ｄ４”などの用語は天然分子の改変物、例えば可溶性ＣＤ４、短縮ＣＤ４などを 含んで本明細書で用いられる。本発明で用いることができる切断不可能リンカ− 系の例には、カーポジイミド（ＥＤＣ）　、スルフヒドリル−マレイミド、Ｎ− スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ　； 　Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）及び過ヨウ素酸塩が含まれる。カーポジイミド系の 場合、水溶性カーポジイミドがタンパク質上のカルボン酸基と反応し、カルボキ シル基を活性化する。カルボキシル基が第２のタンパク質のアミノ基とカップリ ングする。この反応の結果は２つのタンパク質の間の切断不可能アミド結合であ る。

スルフヒドリル−マレイミド系の場合、スルフヒドリル基をＴｒａｕｔ試薬など の化合物を用いてタンパク質の１つのアミン基上に導入する。

他のタンパク質をＮＨＳエステル（例えばガンマ−マレイミド酪酸ＮＨＳエステ ル（ＣＭＢＳ））と反応させ、スルフヒドリル基と反応性のマレイミド誘導体を 形成する。２つの修飾タンパク質をその後反応させて切断不可能な共有結合を形 成する。

５ＰＤＰは複素２官能基性架橋剤であり、チオール−反応性基をモノクローナル 抗体又は神経薬のいずれかに導入する。チオール−反応性基は遊離のスルフヒド リル基と反応してジスルフィド結合を形成する。

過ヨウ素酸塩カンプリングにはキャリヤー又は配達されるべきタンパク質のいず れかにオリゴ糖基が存在していることが必要である。これらの基が配達するべき タンパク質上で得られる場合（西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）の場合な ど）、配達するべきタンパク質上で活性アルデヒドが形成され、それがキャリヤ ー上のアミノ基と反応することができる。活性アルデヒド基を抗体分子上に存在 する炭水化物基から形成することもできる。その後これらの基を配達するタンパ ク質上のアミノ基と反応させ、安定した複合体を形成することができる。別の場 合、過ヨウ素酸塩酸化抗体を配達するタンパク質のヒドラジド誘導体と反応させ ることができ、これも安定した複合体を与える。

切断可能リンカ−は、脳に堆積させるべき神経薬の結合に、あるいは切断不可能 なリンカ−が神経薬の活性を変化させる場合に用いることができる。切断可能な リンカ−の例には、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる、 １９８９年２月６日出願の同時係属出願番号０７／３０８．９６０に記載の、酸 に不安定なリンカ−が含まれる。

酸に不安定なリンカ−にはシス−アコニット酸、シス−カルボン酸アルカジエン （ｃｉｓ−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｌｋａｄｉｅｎｅ）、シス−カルボン酸ア ルカトリエン、及びポリ−マレイン酸無水物が含まれる。他の切断可能なリンカ −は、第１アルコール基に結合することができるリンカ−である。切断可能な結 合を介して結合することができる神経薬の例にはＡＺＴ、ｄｄ　Ｌ　ｄｄＣ，ア ドリアマイシン、アンフォテリシンＢ１ピリメタミン、パルプロエート、メトト レキセート、シクロホスファミド、カーポプラチン及びスーパーオキシドジスム ターゼが含まれる。一般にタンパク質の抗体への結合に用いられる切断不可能な リンカ−は、他の神経薬の抗体への結合にも用いることができる。

抗体−神経薬複合体は経口的に、皮下又は他の注射により、静脈内に、筋肉内に 、非経口的に、経皮的に、経鼻的に、又は直腸内に投与することができる。複合 体を投与する形態（例えばカプセル、錠剤、溶液、乳液）は少なくともその一部 がそれを投与する経路に依存する。

抗体−神経薬複合体の治療的有効量とは、特定の神経障害に伴う症状を有意に軽 減又は除去するために必要な量である。治療的有効量は各場合に基づいて決定さ れ、少な（ともその一部が患者の大きさ、処置するべき症状の重度、求める結果 、特定の抗体などの考慮に基づく。かくして治療的有効量は、そのような因子を 用い、日常的実験のみを用いて当該技術分野における熟練者が決定することがで きる。

上記の説明はリガンド結合部位を含むトランスフェリンレセプターの細胞外ドメ インと相互作用し、おそらく血液脳関門を横切って薬物を配達するためのビヒク ルとして働くことができるタンパク質である抗体に焦点を当てている。抗−トラ ンスフェリンレセプター抗体の他に、これにはレセプターに結合するリガンドで あるトランスフェリン、及びレセプター−結合活性を保持しているトランスフェ リン誘導体が含まれる。

実際にトランスフェリンレセプターに結合するいずれのリガンドもおそらく用い ることができる。

トランスフェリンレセプターと反応性のキメラ抗体の製造法は以下の通りに行う ことができる：問題の抗体を生産する少数の細胞から精製したｍＲＮＡからｃＤ ＮＡを合成する。ＰＣＲ反応を行い、抗体重鎮及び軽鎖可変領域を得、それをそ の後クローニングして配列決定する。これらの領域の末端を修飾して発現カセッ トと適合性とするための第２ＰＣＲ反応の後、それらをヒト定常領域、免疫グロ ブリンプロモーター及びエンハンサ−ならびに選択マーカーを含む新しい発現ベ クター中にクローニングする。これらのベクターにおいてネズミ重鎮プロモータ ーは、ブライミングされ、伸長されたリーダー配列を機能性プロモーター中に直 接クローニングできるような制限部位を備えていた。制限部位は、可変領域の３ ′末端を定常領域中に直接クローニングするためでもあった。

重鎮ベクターにおいて新しい制限部位がヒト７１重鎖遺伝子のＣＨＩドメイン中 に工作された。その後ＶＨをこの部位で連結し、完全重鎮タンパク質を与えるこ とができる。ＶＬの場合、クローニングされたＶＬがカッパをスプライシングし て完全に軽鎖タンパク質を製造できるようにスプライシング部位のちょうど３° に制限部位が工作された。その後最終的構築物を、Ｓ　Ｐ　２１０又はＰ３．Ｘ ６３．Ａｇ８６５３などの非生産的ハイブリドーマ細胞系中にトランスフェクシ ョンし、上澄み液を抗体生産に関して調べる。

トランスフェリンレセプターと反応性のキメラ抗体の製造のためのさらに別の方 法及び材料、例えば発現カセットは、本出願と同日に出願された特許出願：代理 人事件整理番号Ｎｏ、３８９９６にある。この同時出願の記載事項は引用するこ とにより本明細書の内容となる。

以下の実施例により本発明を例示する。

両文献の記載事項が引用することにより本明細書の内容となるＴｒ。

ｗｂｒｉｄｇｅ　（１９８４年２月２８日発行の米国特許第４．　４３４゜１５ ６号及びＮａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、２９４．Ｉ）ｐ、１７１−１７３（１９８１） ）により記載のヒトトランスフェリンレセプターを認識する２つのネズミモノク ローナル抗体、Ｂ３／２５及びＴ５８／３０を、ヒト脳毛細血管内皮細胞へのそ の結合能力に関して調べた。Ｂ３／２５及びＴ５８／３０抗体を生産するハイブ リドーマ細胞系をＲｏｃｋｖｉｌ　１　ｅ、　Ｍａ　ｒｙ　ｌ　ａｎｄのＡｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）か ら入手し、２．０ｍＭのグルタミン、１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，２ ）　、１００μＭの非必須アミノ酸及び１０％の熱不活化ウシ胎児血清を補足し たＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ミリグラム量のＩｇＧ抗体を生産するためにハ イブリドーマ培養を２２５ｃｍ”のＴ−フラスコで規模拡大した。ハイブリドー マ上澄み液を真空透析を用いて５０倍に濃縮し、ＢｉｏＲａｄ　ＭＡＰＳ緩衝系 を用いてプロティン−Ａセファロースカラムに適用した。

精製抗体をカラムから溶離し、０，１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８゜０）に対 して透析し、濃縮し、アリコートとして一２０°Ｃで保存した。

ヒト脳内皮細胞の初代培養を平底９６−ウェルプレート中で密集後５日まで増殖 させた。その後細胞を３．０％の緩衝ホルマリンを用いて固定し、プレートをＤ ｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝食塩水（Ｄ　Ｐ　Ｂ　Ｓ）中の１．０％のウシ血 清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を用いて遮蔽した。培養上澄み液又は精製タンパク 質の形態のＢ３／２５あるいはＴ５８／３０抗体のアリコート（１００μｌ）を その後ウェルに加えた（抗体濃度は１−５０μｇ／ｍｌの範囲であった）。固定 細胞に特異的に結合した抗体を、ビオチン−標識ポリクローナルヒツジ−抗−マ ウスＩｇＧ抗血清、及びその後ビオチニル化ホースラディツシュパーオキシダー ゼ（ＨＲＰ）／アビジン混合物を用いて（アビジンビオチン複合体法）（Ａｖｉ ｄｉｎ　Ｂｉｏｔｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ法）検出した。陽性のウェルをＴｉｔｅ ｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓ ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダーを用いて決定した 。結果は、両抗体がヒト脳毛細血管内皮細胞に結合し、Ｔ５８／３０抗体がより 高いレベルの結合を示すことを示した。

又これらの同一の抗体につき、新しく凍結しく固定せずに）、クリオスラット上 で薄片を作り（薄片の厚さは５−５−２０ａ、ガラススライド上に置き、アセト ン中で固定したヒト脳組織の薄片を用いてヒト脳毛細血管への結合に関して調べ た。その後これらの薄片は使用まで一２０℃で保存した。

ヒト脳薄片を含むスライドを使用前に室温にした。その後薄片をＤＰＢＳ中で再 水和し、０．３％のＨ２０□を含むメタノール中でインキュベートして内在性パ ーオキシダーゼ活性を遮蔽した。薄片を０．　２％の無脂肪乾燥乳及び０．　２ ％のメチルマンノピラノンドを含む溶液中で１５分間遮蔽した。上記の通りに精 製したＢ　３／２５及びＴ５８／３０を５−５０ｍｇ／ｍｌの濃度で薄片に適用 し、室温で１−２時間インキュベートシた。組織に特異的に結合した抗体を、Ｅ ＬＩＳＡアッセイに関して上記で記載したアビジン−ビオチン複合体（Ａ　Ｂ　 Ｃ）法を用いて検出した。ヒト脳薄片中の毛細血管の染色はＢ３／２５及びＴ５ ８／３０抗体の両方の場合に観察された。Ｔ５８／３０抗体は脳皮質の白色の物 質（ｗｈｉｔｅ　ｍａｔｔｅｒ）への結合もいくらか示した。

実施例２−ラットトランスフェリンレセプターへのネズミモノクローナル抗体０ Ｘ−２６の試験管内結合 ラットトランスフェリンレセプターを認識する０Ｘ−２６ネズミ抗体は、生体内 で編毛細血管内皮細胞に結合することが示された（Ｊ　ｅ　ｆ　ｆｒｉｅｓ　ｅ ｔ　ａｌ、、上記で引用）、０Ｘ−２６ネズミ抗体を生産する不ズミハイブリド ーマ系を得、ハイブリドーマ細胞系を２．０ｍＭのグルタミン及び１０％の熱不 活化ラン胎児血清を補足したＲＰＭＩＩ６４０培地中で増殖させた。○Ｘ−２６ 抗体を実施例１で記載したアフィニティークロマトグラフィー法を用いて精製し た。

実施例１で抗−ヒトドランスフェリンレセプター抗体に関して記載されている通 りに精製抗体を試験管内で調べ、それが新しい凍結されたアセトン−固定ラット 脳薄片と結合するが否かを決定した。結果は。Ｘ−２６抗−トランスフェリンレ セプター抗体が試験管内でラット脳薄片の毛細血管に結合することを示した。

実施例３−ＯＸ−２６ネズミモノクローナル抗体のラットトランスフェリンレセ プターへの生体内結合 投薬量範囲 精製抗体（実施例１に記載の精製）を雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット （１００−１５０ｇ）中に尾の静脈を介して注入することにより、ラット抗−ト ランスフェリンレセプター抗体０Ｘ−２６を生体内で調べた。注入の前にラット はハロタンを用いて麻酔した。２．０ｍｇ−０，０５ｍｇの抗体／ラットの範囲 の試料を４００μｌのアリコートとして尾の静脈に注入した。すべての投薬量は ２重の動物で調べた。注入後１時間で動物を犠牲にし、心臓を通してＤＰＢＳを 潅流し、臓器から血液を一掃した。潅流が完了した直後に脳を取り出し、液体窒 素中で急凍結した。凍結した脳をその後クリオスグツト上で薄片化しく３０−５ ０μｍ）、薄片をガラスの顕微鏡スライド上に置いた。脳薄片を室温で１−２時 間空気乾燥してからアセトン中で固定した（室温で１重分間）。この処理の後、 薄片を一２０℃で保存することができた。

実施例１の試験管内実験に関して上記で記載した免疫組織化学を用い、脳薄片中 で０Ｘ−２６抗体の局在を決定した。−次抗体は脳薄片中に存在するので添加す る必要はなかった。結果は０Ｘ−２６抗体がラット脳毛細血管内皮細胞に結合し 、５０ａｇという少量の投薬量でも本明細書に記載の方法を用いて検出可能な量 の抗体を脳において与えることを示した。０．５ｍｇ以上の投薬量が内皮細胞へ の有意に高い抗体結合を示すようには思われず、抗体結合のための部位が飽和さ れ得ることを示唆した。肝臓、腎臓、心臓、膵臓又は肺において毛細血管内皮へ の特異的結合は検出されなかった。

○Ｘ−２６と同一のサブクラスの非特異的抗体（ＩｇＧ　２ａ）も生体内で調べ 、観察されたラット脳内皮細胞への０Ｘ−２６の結合が０ｘ−２６抗体に特異的 であることを示した。ラット当たり０．５ｍｇの標準抗体を上記の通りに注入し た。結果は０Ｘ−２６抗体の場合に観察された染色パターンがその抗体に特異的 であることを示している。

時間経過 ０Ｘ−２６抗体が生体内投与の後にラット脳毛細血管で検出可能であることが確 立された後、この結合が起こる時間枠（ｔ　ｉｍｅ　ｆ　ｒａｍｅ）を決定した 。標準投薬量として０．５ｍｇの精製０Ｘ−２６抗体を用い、注入後５分、１５ 分、１時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間で犠牲にした動物から採取し た脳薄片を０Ｘ−２６抗体の存在に関して調べた。すべての投薬量は４００μｍ のアリコートとして投与し、各時点につき２重の動物で調べた。試料を注入し、 投薬量範囲の章で記載した通りに注入機種々の時間でラットを加工した。

結果は０Ｘ−２６抗体がラット脳毛細血管内皮細胞中又は上で注入後５分もの早 期に、及び２４時間もの後期に検出可能であることを示した。

注入後４及び８時間で抗体の染色パターンは顕著に小はんてん状であり、抗体が 内皮細胞又は血管周囲細胞の小胞室（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｃ。

ｍｐａｒ　ｔｍｅｎｔｓ）内に堆積したことを示唆している。

実施例４−血液脳関門を横切る西洋ワサビパーオキシダーゼの転移のための０Ｘ −２６ネズミモノクローナル抗体の複合体の利用西洋ワサビパーオキシダーゼ（ ＨＲＰ；　４０ｋＤ）はいくっがの治療薬と大きさが類似であり、酵素アッセイ を用いて脳で容易に検出できるので、脳に配達する化合物としてそれを選んだ。

ＨＲＰを切断の不可能な過ヨウ素酸塩結合を用いて０Ｘ−２６抗体に複合化し、 抗体が脳への化合物のキャリヤーとして機能する能力を調べた。抗体複合体を生 体内で試験し、抗体がＨＲＰを脳に配達できるか否かを決定した。

最初に抗体（１０ｍｇ）をＯ，ＯＩＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９゜０）に対し て終夜透析した。ＨＲＰ　（１０ｍｇ）を２．５ｍｌの脱イオン水に溶解し、０ ．１Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム（１６０μｌ）を加え、混合物を室温で５分間イ ンキュベートした。エチレンゲルコール（２５０μｍ）をＨＲＰ溶液に加え、そ の後さらに５分間インキュベートした。

その後この溶液を１．０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，４）に対して終 夜透析した。透析したＯＸ−’２６２６抗２．０ｍｌ、５．０８ｍｇ／ｍｌ）に ２００μｌの１．ＯＭ　重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９５及び１．２５ｍ１の 透析ＨＲＰ溶液を加えた。この混合物を暗所で２時間インキュベートし、その後 １００μｍの１０ｍｇ／ｍｌ　ナトリウムボロハイドライドを加えた。得られた 混合物を４℃の暗所でさらに２時間インキュベートした。等体積の飽和硫酸ナト リウムを加えることによりタンパク質を溶液から沈澱させ、最小体積の水に再懸 濁した。

遊離の抗体を、コンカナバリンＡ−セファロースカラム（ＨＲＰ及びＨＲＰ−抗 体複合体を結合し、遊離の抗体を通過させるカラム）上のクロマドグラフィーに より混合物から除去した。遊離のＨＲＰは抗体−ＨＲＰ複合体を保持するプロテ ィンＡ−セファロースカラム上のクロマトグラフィーにより除去した。最終生成 物のＨＲＰ／抗体比は４／１であった。

抗体−ＨＲＰ複合体を用いて実施例３に記載の方法と同様の時間経過実験を行っ た。抗体−ＨＲＰ複合体（０，５ｍｇ）を４００μｌアリコート／ラツトで注入 した。動物を注入後の種々の時間で犠牲にし、上記実施例３で記載の通りに脳を 加工した。実施例１に記載の通り免疫組織化学的に抗体に関して染色することに より、又はＨＲＰの存在に関して脳薄片を直接染色することにより抗体−ＨＲＰ 複合体の脳における局在を決定した。ＨＲＰの検出のために、スライドを最初に 室温としてがらメタノール中で３０分間インキュベートした。その後編薄片をＤ ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＲＰの基質である３、３°　−ジアミノベンジジン（ＤＡ Ｂ）と反応させた。結果は０Ｘ−２６抗体−ＨＲＰ複合体が非複合抗体の場合と 同様の方法でラット脳毛細血管内皮細胞に結合することを示した。抗体のみの場 合に見られた注入後４−８時間の小はんてん状染色は抗体複合体の場合も見られ 、複合体も血液脳関門の腔側の周皮細胞中に入ることができることを示唆してい る。これらの結果を一緒にすると、０Ｘ−２６抗体が少なくとも４０ｋＤのタン パク質分子を脳に配達することとができることを示す。

実施例４で用いたものと類似の切断不可能なリンカ−系を用い、化学療法薬アド リアマイシンを０Ｘ−２６抗体にカップリングさせた。アドリアマイシンを検出 できる抗体、ならびに抗体キャリヤーの検出のための実施例１で以前に記載した 系を入手できるので、抗体キャリヤーの局在化及びアドリアマイシンの脳への配 達の監視のために免疫組織化学的方法を利用することができた。

アドリアマイシンを抗体に複合化させるために、２００μｌの０．１Ｍ　過ヨウ 素酸ナトリウムを加えることにより薬物（０，５ｍｇのＤＰＢＳ中１０ｍｇ）を 酸化した。この混合物を暗所の室温で１時間インキュベートした。２００μｌの エチレングリコールの添加により反応をクエンチし、その後５分間インキュベー トした。０Ｘ−２６抗体（０，５ｍｇの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）中５．０ｍ ｇ）を酸化アドリアマイシンに加え、室温で１時間インキュベートした。ナトリ ウムポロハイドライド（１０ｍｇ／ｍ］を１００μｌ）を加え、混合物を室温で さらに２時間インキュベートした。ＰＤ−１０カラム上のクロマトグラフィーに より遊離のアドリアマイシンを０Ｘ−２６抗体−アドリアマインン複合体から分 離した。この特定の複合体のバッチの場合、複合体中のアドリアマイシン１０Ｘ −２６抗体比は２／１であった。

脳にアドリアマイシンを配達するためのキャリヤーとしての０Ｘ−２６抗体の効 率を、ラット当たり４００μｍのアリコートとして０．５ｍｇの抗体−アドリア マイシン複合体を尾の静脈を介した注入により投与することにより決定した。注 入後１時間でラットを犠牲にし、実施例１に記載の通りに脳を加工した。注入は すべて２重に行った。標準として４００μｇの遊離のアドリアマイシンも４００ μｌのアリコートとしてラットに注入した。ラット脳薄片におけるキャリヤー０ Ｘ−２６抗体及びアドリアマイシンの両方の検出に免疫組織化学を用いた。アド リアマイシンの場合、ポリクローナルウサギ抗−アドリアマイシン抗血清、その 後ビオチニル化ヒツジ抗−ウサギＩｇＧ抗血清を薄片に適用した。その後これに ビオチニル化ＨＲＰ／アビジン混合物を加え、ＨＲＰを酵素的に検出した。

結果は０Ｘ−２６抗体及び複合アドリアマイシンの両方が生体内投与の後にラッ ト脳毛細血管内皮細胞に局在することを示す。遊離のアドリアマイシンが編毛細 血管内皮細胞に結合するか、又は脳に入る証拠はない。

カーボンイミド結合を介してカップリングさせたアドリアマイシン−０Ｘ−２６ 複合体も合成しく薬物／抗体比は１０／１）、生体内で調べた。この実験の結果 は基本的に過ヨウ素酸塩−結合抗体−薬物複合体の場合に得た結果と同一であっ た。両方の場合に抗体キャリヤーに関する染色は非常に強く、脳のすべての領域 の毛細血管で視覚化された。この染色は毛細血管に沿って平均に分布した。アド リアマイシンに関する染色は比較的弱かったが、この場合も脳全体の毛細血管で 見られた。いくらかの小はんてん状染色が観察され、血液脳関門の脳側にある周 皮細胞中の堆積を示唆している。

切断不可能なカーポジイミド結合を用い、メトトレキセートを０Ｘ−２６ネズミ モノクローナル抗体にカップリングさせた。実施例５に記載した系と類似の系を 用い、メトトレキセート及びキャリヤー抗体の両方の編毛細血管内皮細胞への配 達を監視した。

メトトレキセートをその活性エステルを介してネズミモノクローナル抗体０Ｘ− ２６にカップリングさせた。簡単に記載すると、８１ｍｇ（０，１７８ｍＭ）の メトトレキセート（ＡＪｄｒｉｃｈ）を３ｍｇのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）中で２１ｍｇ　（０，１８２ｍＭ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ａｌｄ ｒｏｃｈ）と共に４℃で撹拌した。

エチル−３−ジメチルアミノプロピル−カーポジイミド（１８０ｍｇ；ＥＤＣ； ０．５２ｍＭ）をこの溶液に加え、反応混合物を終夜撹拌した。

粗エステルを、溶離剤としてクロロホルム中１０％のメタノール溶液を用いたシ リカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）上のフラッシュクロマトグラフィーにより反応副生 成物から精製した。精製された活性エステル画分を集め、濃縮乾固した。エステ ルを１ｍｇのＤＭＦに溶解し、使用するまで一２０℃で保存した。Ａ３７２（ε ３７ｔ＝　７２００）により決定して５０ｍｇ（５０％）の活性エステルが回収 された。

領　９ｍｇのＯ，ＩＭ　リン酸塩（ｐＨ８，０）中に２．　１ｍｇ　（１４ナノ モル）の抗体を含む０Ｘ−２６の溶液を４℃で解凍した。この撹拌抗体溶液に、 上記で製造した１、４μＬ（１４０ナノモル）の活性エステルを加えた。４℃で １６時間後、混合物をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いたセファデックス　 ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のクロマトグラフィーにかけ、複合 体を遊離の薬物から分離した。

抗体−メトトレキセード複合体を含む画分を集めた。抗体及び薬物の濃度をＥｎ ｄｏ　ｅｔ　ａｌ、（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８８）４８　： 　３３３０−３３３５）に記載の通りに分光光度測定により決定した。最終的複 合体は７メトトレキセ一ト／抗体を含んだ。

メトトレキセートをラット脳毛細血管内皮細胞に配達する０Ｘ−２６モノクロー ナル抗体の能力を、Ｑ、２ｍｇの複合体を（４００μｌ中）２匹のラットのそれ ぞれに尾の静脈を介して注入することにより生体内で調べた。注入後１時間で動 物を犠牲にし、免疫組織化学のために実施例１に記載の通りに脳を加工した。脳 におけるメトトレキセートの検出のために、メトトレキセートに対して誘起され たウサギ抗血清を一次抗体として用いた。その後ビオチニル化ＨＲＰ及びアビジ ンの混合物と組み合わせたビオチニル化ヒツジ−抗−ウサギ抗血清を用い、ラッ ト脳におけるメトトレキセートを視覚化した。キャリヤー抗体は前記の通りに検 出した。

これらの実験の結果は、０Ｘ−２６との複合体の形態のメト・１ツキセードが脳 の毛細血管内皮細胞に沿って、又はその中に堆積することを示す。メトトレキセ ートの場合に観察された染色はキャリヤーの場合に観察された染色に匹敵する強 度である。染色は脳のすべての領域であると思われ、毛細血管に沿って平均に分 布している。

実施例７−抗体誘導体 ０ｘ−２６ネズミモノクローナル抗体のＦｃ部分を除去し、そのために抗体のラ ット脳毛細血管内皮細胞への局在化又はそれによる吸収が変わるか否かを決定し た。０Ｘ−２６のＦ　（ａｂ）２時片をペプシンを用いた消化を介して無損傷の ＩｇＧから製造した。Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から入手できる キットは、断片を得るための抗体の切断用の試薬及び案を含む。４００／１１の アリコートとしてのＦ（ａｂ゛）２時片（０，２ｍｇ投薬ｆｉ）を尾の静脈を介 してラットに注入した。

その後無損傷の抗体の場合に行った（実施例２）実験と同一の時間経過実験を行 った。Ｆ　（ａｂ’）２時片は、ヒツジ抗−マウスＦ　（ａｂ’）２抗血清及び その後ビオチニル化つサギ抗−ヒッシＩｇＧ抗血清を用いて免疫組織化学的に検 出した。ビオチニル化ＨＲＰ／アビジン混合物を加え、ＨＲＰ酵素アッセイを用 いて抗体複合体を視覚化した。結果は０Ｘ−２６抗体のＦ（ａｂ）ｇ断片がラッ ト脳の毛細血管内皮細胞に結合することを示す。

実施例８−脳組織中の０Ｘ−２６の測定脳に堆積する０Ｘ−２６の量を定量する ために、放射活性−標識抗体を尾の静脈を介してラットに注入した。抗体はＩ４ ０−酢酸無水物、又は３Ｈ−スクシンイミジルプロピオネートを用い、基本的に 引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＫｕｍｍｅ　ｒ、Ｕ、 、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１＋６７０−３７８（１ ９８６）、Ｍｏｎｄｅｌａｒｏ、Ｒ，Ｃ，、ａｎｄ　Ｒｕｅｃｋｅｒｔ、Ｒ，Ｒ ，Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２５０□１４１３−１４２１　（１９７５）に記載の通りに標識した。すべての 実験の場合、放射性標識化合物を４００μｌのポーラスとして、ハロタン麻酔下 で雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１００−１２５ｇ）の尾の静脈内 に注入し、注入後の適した時点で致死投薬量の麻酔薬を用いて動物を犠牲にした 。残留血液による脳の非特異的放射活性のための標準とするために、３Ｈ−標識 １ｇＣ２ａ標準抗体をＩＣ−標識○Ｘ−２６と共に注入した。注入後の適した時 点で動物を犠牲にし、すぐに脳を取り出し、０ｍｎ１−ミキサーを用いて０．　 ５％のドデシル硫酸ナトリウム中でホモジナイズした。ホモジネートのアリコー トを２ｍｌの５ｏｌｕｅｎｅ　３５０組織組織化剤と共に終夜インキュベートし てから液体シンチレーション計数した。すべてのデータは分当たりの壊変として 集めた（ｄｐｍ）。血液試料を遠心して赤血球をベレット化しく放射性標識材料 の有意な結合を示さない）、血清のアリコートにおける放射活性を液体シンチレ ーション計数を用いて決定した。

脳に伴う抗体の量を注入後の種々の時間で決定し、脳吸収の薬物動態学を調べた 。さらに血流からのクリアランスの速度を決定できるように血液中の標識抗体の 量を測定した。この情報は血液汚染による脳の放射活性の量の算出にも用いられ 、その後それを合計から引き去って特異的に脳に伴う抗体の量を得た。

図１（示しである値は平均プラスマイナス測定の標準偏差（ＳＥＭ）であり、１ 時へ当たりＮ＝３ラットである）に示す通り、注入後１及び５４時間の脳におい て、注入投薬量の約０．　９％に相当する１４Ｃ−標識０ｘ−２６の最大値に達 した。脳に伴う放射活性の量は注入後４−４８時間で一様に減少し、その時点で 注入投薬量の約１３％で一定となる。

脳における０Ｘ−２６の堆積は未標識モノクローナル抗体の添加（ポーラス注入 において０５又は２．０ｍｇ）により有意に減少した。別の標準として３）１− １ｇＧ２ａ標準抗体を１４Ｃ−ＯＸ−２６と共に注入した。標準抗体は脳に堆積 せず、脳の血液汚染を示した。

脳中のｍと対照的に○ｘ−２６の血液量は注入直後に非常に顕著に減少し、注入 後１時間までに５５μｌ　（脳に伴う血液の量）の血液中の注入投薬量に対する パーセントは図１に示す通り約０．１６％となった。

これはラットの全血液量において注入投薬量の約２０％の値に相当する。

血清から全ＩｇＧを抽出し、その後ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ ）及びオートランオグラフィーを行っても、検出可能な量の○Ｘ−２６の分解は 現れず、抗体が注入後４８時間もの長い間、血液中に無損傷で残ることを示した 。

実施例９−脳実質及び毛細血管における０Ｘ−２６の分布抗−トランスフェリン レセプター抗体が脳実質に堆積することを示すために、標識０Ｘ−２６を注入し た動物から採取した脳のホモジネートからデキストランを通した遠心により毛細 血管を枯渇させ、脳組織上澄み液及び毛細血管ペレットを得た。毛細血管枯渇実 験は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＴｒｉｇｕｅｒ ｏ、ｅｔａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５４：１８８２− １８８８　（１９９０）の方法に従った。実施例８の脳吸収実験の場合と同様に 、放射性標識化合物を４００μｍのポーラスとしてハロタン麻酔下の雌のＳｐｒ ａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１００−１２５ｇ）の尾の静脈に注入し、注入 後の適した時点で致死投薬量の麻酔薬を用いて動物を犠牲にした。３Ｈ−標識Ｉ ｇＧ２ａ標準抗体を１４０−標ｍｏｘ−２６と共に注入し、残留血液による脳の 非特異的放射活性のための標準とした。犠牲にした後、脳を取り出し、氷上に保 った。最初に細かく切り刻んだ後、脳を３．５ｍｌの水冷生理緩衝液（１００ｍ ＭのＮａＣ１，４，７ｍＭのＫＣＩ、２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＤ− グルコース、ｐＨ７，４）中で手によりホモジナイズした（８−１０打ち）。

緩衝液中２６％のデキストラン溶液を４ｍｌ加え、ホモジナイズを続けた（３打 ち）。ホモジネートのアリコートを取り出した後、残りを揺りバケツローター（ ｓｗｉｎｇｉｎｇ　ｂｕｃｋｅｔ　ｒｏｔｏｒ）中で７２０Ｏｒｐｍにおいて回 転させた。得られた上澄み液を注意深く毛細血管ペレットから除去した。全毛細 血管ペレット及びホモジネートならびに上澄み液のアリコートを２ｍｌの５ｏｌ ｕｅｎｅ　３５０と共に終夜インキュベートしてから液体／ンチレーンヨン計数 を行った。この方法は脳ホモジネートから血管の９０％以上を除去する（Ｔｒｉ ｇｕｅｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、上記で引用）。

脳の異なる画分における放射活性の相対的量を時間の関数として比較すると、標 識抗体のトランスサイト−シス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が起こったか否か が示される。注入後初期の時点（３０分）及び後期の時点（２４時間）における 全脂ホモジネート、脳実質画分及び編毛細血管画分中の０Ｘ−２６の量を図２に 示す。図２の値は１時点当たりＮ＝３ラットの平均±ＳＥＭとして示しである。

３０分の時点で脳実質画分より多くの放射性標識抗体が毛細血管画分に伴ってい る（それぞれ注入投薬量の（％ＩＤ）０．２３％ＩＤ及び０．３６％ＩＤ）。注 入後２４時間までに分布は逆転し、毛細血管画分（０，１２％ＩＤ）と比較して 放射活性の大半（０，３６％ＩＤ）が実質画分にある。毛細血管画分から実質画 分への放射性標識０Ｘ−２６の再分布は、血液脳関門を横切る抗−トランスフェ リンレセプター抗体の時間依存性移動と一致する。

引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＫｒａｌ。

介して結合し、ＭＴＸ部分が３Ｈて標識されている０Ｘ−２６−メドトレキセー １−　（ＭＴＸ）複合体を用い、実施例９に記載の方法に従って毛細血管枯渇研 究を行った。非複合抗体の場合と同様に、注入後３０分における毛細血管画分中 の標識の量は実質画分より大である（図３に示す通り約２倍、データは１時点当 たりＮ＝３ラットの平均±ＳＥＭとして表す）。この分布は時間を経て変化し、 注入後２４時間までに毛細血管より約４．５倍多量の標識ＭＴＸが脳実質に存在 する。これらの結果は非複合抗体の場合に得た結果と一致し、この場合もこれら の化合物が血液脳関門を横切ることを示唆している。

これらの結果が汚染量の遊離の３Ｈ−ＭＴＸ又は注入後に複合体から切断された ３Ｈ−ＭＴＸによるものではないことを確認するために、標識薬物及び抗体の混 合物をラットに注入し、毛細血管枯渇実験を行った。

脳の異なる画分における３Ｈ−ＭＴＸの量は、複合体（図３に示す通り、注入後 ３０分において毛細血管画分の場合４７倍）と比較して混合物の場合に有意に低 い。３Ｈ−ＭＴＸ及び混合物は、抗体−ＭＴＸ複合体又は抗体のみの場合に観察 されたような時間を経た脳の異なる画分の間の標識の分布の変化も示さない。こ れらの結果は血液脳関門を横切る脳実質への３Ｈ−ＭＴＸの配達が、薬物の抗− トランスフェリンレセプター抗体０Ｘ−２６への複合化により非常に強化される ことを示す。

実施例１１−脳実質及び毛細血管における０Ｘ−２６−ＡＺＴの分布ｐＨ−感受 性スクシネートリンカ−を用いた０Ｘ−２６−ＡＺＴ複合体を用いて実施例９の 方法に従う毛細血管枯渇研究を行った。これらの研究ではＡＺＴが＋４−Ｃ標識 であり、抗体キャリヤーが３Ｈ−標識である二重−標識複合体を用いた。そのよ うな複合体の使用により抗体及びＡＺＴの両方の脳における堆積を独立して監視 することができる。

リンカ−は以下の通りに合成した。新しく蒸留したピリジン中のジメチルアミノ ピリジン及び重炭酸ナトリウムの存在下及びアルゴン下の室温で等モル量のコハ ク酸無水物とＡＺＴを３時間反応させることによりコハク酸無水物でＡＺＴをア シル化した。生成物を、トリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液を用いたＤＥＡ Ｅセフアゾ、ソクスＡ５０カラム上のクロマトグラフィーにより単離した。ＡＺ Ｔのスクシネート誘導体を、新しく蒸留したＴＨＦ中の４°Ｃで等モル量のＮ− ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロへキシルカーポジイミドと２時間反応さ せることにより、カルボキシル基においてＮＨＳエステルとして活性化した。生 成物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。得られた ＡＺＴ−スクシネートのＮＨＳエステルを用いて０Ｘ−２６のアミン基をアシル 化し、ＡＺＴ−ＯＸ−２６複合体を得た。１５倍のモル過？Ｉ量のＡＺＴ−ＮＨ ＳエステルをＨＥＰＥＳ緩衝液中の４°Ｃで０Ｘ−２６と終夜反応させた。抗体 −薬物複合体をＰＤ−１０カラム上で遊離の薬物から単離した。抗体に対する薬 物のモル比は７：１であった。これらの研究にはＡＺＴが１４ｃ−標識てあり、 抗体キャリヤーが３Ｈ−標識である二重−標識複合体を用いた。

脳の毛細血管画分には類似の量の０Ｘ−２６及びＡＺＴが観察され、この量は図 ４０に示す通り時間と共に減少し、物質が毛細血管内皮細胞により保持されない ことを示唆している。図４ｂに示す通り毛細血管画分中の○Ｘ−２６の量が減少 すると共に実質画分中の量が増加し、時間依存的に抗体が毛細血管から実質に移 動することを示している。対照的に脳実質中のＡＺＴの量は有意に上昇せず、薬 物の大半が内皮細胞で放出され、血液脳関門を横切って輸送されないことを示唆 している。図４ａに示す通り、非分別ホモジネートにおける０Ｘ−２６及びＡＺ Ｔの量は時間を経ても同程度のままである。図４のデータは時点当たりＮ＝３ラ ットの平均±ＳＥＭとして表しである。これらの結果はリンカ−が内実細胞内て 切断され、化合物をこれらの細胞に配達する方法を与えることを示す。

実施例４に記載の切断不可能な過ヨウ素酸塩結合を用いて製造した３Ｈ−１［０ Ｘ−２６−ＨＲＰ複合体を用い、実施例９で０Ｘ−２６＋：関して記載した方法 に従って毛細血管枯渇研究を行った。トリチウム標識は複合体の抗体及びＨＲＰ 部分の間で分配された。図５に示す通り注入後１時間で脳に伴う放射活性の大半 が毛細血管画分にある。図５のデータは１時点当たりＮ＝３ラットの平均±ＳＥ Ｍとして表しである。注入後４時間までに脳に伴う放射活性の分布は変化し、大 半が脳実質を示す画分にある。注入後２４時間で、基本的にすべての３Ｈ−標識 ０Ｘ−２６−ＨＲＰ複合体が脳の実質画分にあり、物質が血液脳関門を横切った ことを示す。複合体のＨＲＰ部分のみを放射性標識した実験でも同様の結果が得 られた。

脳に達した０Ｘ−２６−ＨＲＰ複合体の注入投薬量中のパーセントは、抗体のみ 、又は○Ｘ−２６−ＨＲＰ複合体の場合よりいくらか低い。これは各キャリヤー に結合した２−３個の４０ｋＤ　ＨＲＰ分子の存在に最も起因し、これらの“パ センジャ−（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ）”分子がキャリヤーに無作為に結合するため と思われる。このために、多くのＨＲＰパセンジャーは抗原認識と抵触するよう な方法で抗体に結合し得る。

この問題はパセンジャーの結合を、限界機能性ドメイン（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆ ｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ）から隔たったキャリヤーの領域に方向づ けることにより軽減することができる。

アミノ酸］、　−３６８を含む可溶性の形態のＣＤ４を、抗体のＦｃ部分に位置 する炭水化物基にＣＤ４の結合を方向づける結合を用いてｏＸ−２６に複合化し た。この方法で結合の部位を方向づけることにより、パセンジャー分子が抗体− 抗原認識と抵触する機会を少なくする。タンパク質問の結合は７、商業的に入手 できる化合物である５ＡＴＡ　（Ｎ・−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセ テート）を用いて最初にスルフヒドリル基をＣＤ４上に導入することにより行っ た。別の商業的架橋剤である５ＤＰＤのヒドリシト誘導体を抗体上の炭水化物基 を介して０Ｘ−２６に結合した。２つの修飾タンパク質の反応は、ジスルフィド −結合複合体を与える。

さらに特定するとタンパク質問の結合は、最初に商業的に入手可能な化合物であ るＮ−スクシンイミシルＳ−アセチルチオアセテート（ｓＡＴＡ）を用いてＣＤ ｄ上にスルフヒドリル基を導入することにより行った。４倍モル過剰量の５ＡＴ Ａを３ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５） 中の５ｍｇのＣＤ４に加えた。この混合物を室温の暗所で３０分間反応させた。

未反応の出発材料をＰＤ−１０カラム上を通過させることにより除去した。別の 商業的に入手可能な架橋剤である５ＰＤＰのヒドリノド誘導体を抗体上の炭水化 物基を介して○Ｘ−２６に結合した。２．０ｍｌの０．１Ｍ　酢酸ナトリウム及 Ｕ０．１５Ｍ　ｔＨＬ−ｊ−ト’）つＬ　（ｐＨ５，０）中の１０ｍｇの□Ｘ− ２６を１０００倍のモル過剰量の過ヨウ素酸ナトリウムと暗所の４℃で１時間反 応させた。未反応の出発材料をＰＤ−１０カラム上を通過させることにより除去 した。酸化抗体を３０倍のモル過剰量のヒトランド−３ＰＤＰと４°Ｃで撹拌し ながら終夜反応させた。２つの修飾タンパク質の反応はジスルフィド−結合複合 体を与える。１０分の１の体積の０゜５Ｍ　ヒドロキシルアミンをチオアセチル 化ＣＤ４　（ＣＤ４−ＤＡＴＡ）に加え、その後誘導抗体を、抗体に対するＣＤ ４の比率が７．５：１となるように加えた。この混合物を暗所の室温で２時間反 応させた。プロティンＡカラム及びその後ＣＤ４アフイニテイーカラム上に反応 混合物を通すことにより複合体を精製した。

ＣＤ４部分のみが３Ｈ−標識された０Ｘ−２６−ＣＤ４複合体を用い、実施例９ で０Ｘ−２６を用いて記載した方法に従い、毛細血管枯渇実験を行った。図６に 示す通り、血液脳関門を横切るトランスサイト−シスと一貫する、毛細血管及び 脳の実質画分の間の標識複合体の分布における時間依存性変化が観察された。図 ６のデータは１時点当たりＮ＝３ラットの平均±ＳＥＭとして表しである。

実施例１４−ジノモルガスモンキーにおける抗−ヒトドランスフェリンレセプタ ー抗体の生体内分布及び脳吸収ヒトトランスフェリンレセプター上の種々のエピ トープを認識する３２のネズミモノクローナル抗体の集合（ｃｏｌ　Ｉｅｃｔ　 １ｏｎ）を、ヒト、モンキー（ジノモルガス）、ラット及びウサギ脳試料からの 薄片の編毛細血管内皮細胞との反応性に関し、実施例１に記載の免疫組織化学的 方法により調べた。これらの抗体は５ａｃｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、のＤｒ、Ｉａｎ　Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅから得た。３２ の抗体はすべてヒト脳内皮細胞とい（らかの反応性を示した。

２つの抗体はウサギ脳毛細血管と非常に弱く反応し、ラットと反応するものはな かった。抗体の２１はモンキー脳毛細血管と反応したが、２つのみがヒト脳毛細 血管の場合に観察された反応性に匹敵する強い反応性を示した。これらの２つの 抗体を本明細書で１２８．１及び２３５．　２と呼ぶ。

これらの抗体を用い、２匹の雌のジノモルガスモンキーにおける１４ｃ−標識抗 −ヒトトランスフェリンレセプター抗体１２８．１及び２３５゜２の組織分布及 び血液クリアランスを決定した。１２８．１及びＺ３５２は３Ｈ−標識標準１ｇ Ｇと同時にモンキーの１匹に静脈内カテーテルを用いて投与した。研究の経過の 間に、血液試料を集めて循環系からの抗体のクリアランスを決定した。注入後２ ４時間で動物を安楽死させ、同位体分布及び燃焼によるクリアランスの決定のた めに選択された臓器及び代表的組織を集めた。さらに、抗体が血液脳関門を横切 ったか否かの決定のために、実施例９で毛細血管枯渇実験に関して記載した通り に脳の異なる領域からの試料を加工した。毛細血管枯渇実験の結果は皮質、前頭 皮質（ｆｒｏｎｔａｌ　ｃｏｒｔｅｘ）、小脳、及び線条体からの試料について 行った。すべての試料は１２８．１及び２３５．２の９０％以上を脳実質中に有 し、抗体が血液脳関門を横切ったことを示した。

同試料中の標準抗体の量は５−１０ｍ低かった。ｄｐｍ／Ｇ組織に関する平均脳 ホモジネート値を用いると、全脳中の１２８１のパーセント注入投薬量は約０． 　２−０．　３％である。これは注入後２４時間におけるラットの場合の０Ｘ− ２６に関する０、３−０．　５％の値に匹敵する。

標準抗体に対する１２８１の比率の種々の臓器に関する比較を図７に示す。同様 の結果が２３５２の場合に得られた。これらの結果は１２８１が標準抗体と比較 して選択的に脳によって吸収されることを示唆している。調べた臓器及び組織の 大半の場合に標準に対する１２８．１の比率は２より小である。

実施例１５−ＡＬＫ　１２８．１のクローニング及び発現：抗−ヒトドランスフ ェリンレセプターキメラ抗体ＲＮＡ抽出： １段階グアニジニウム／フェノール法（Ｐ、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉａｎｄ　Ｓ 、５ａｃｃｈｉ、１９８７．Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、１６２・１５６−２５９） に従ってＤＮＡを抽出した。用いた器具及び容器はすべてＲＮＡアーゼによる分 解を避けるために前もってオートクレーブにかけ、ジエチルピロカーボネート（ ｄｅｐｅ）処理水で濯いだ。そわぞれネズミ抗−ヒトドランスフェリンレセプタ ーモノクローナル抗体を分泌する１２８．１ハイブリドーマからの５Ｘ１０５の 細胞を含むいくつかの試料をＰＢＳで２回洗浄した。ペレットを液体窒素中で急 速凍結し、後の使用のために一７０°Ｃで保存するか、又はすぐに抽出した。

抽出のためにＲＮアーゼを含まない微量遠心管において、１／２ｍｌの溶１ｆｆ ｌＤ（溶液Ｄ：５ｍｌのＩＸ　ＧＩＴＣ当たり３６μｌの２−メルカプトエタノ ール［ＩＸ　ＧＩＴＣ：２５０ｇのグアニジニウムチオシアナート、］、７７． ６ｍの０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム　ｐＨ７，２６，４ｍｌの１０％　サルコ シル、２９．３ｍｌ　ｄＨ２０］　）、５０μｍの２Ｍ　酢酸Ｎａ　ｐＨ４，１ ５ｍｌのフェノール（ｄＨ２０平衡化）、及び１００μｍのクロロホルム：イソ アミルアルコール（４９１）を、各添加後に反転させることにより混合しながら 細胞ペレットに加えた。抽出液を水上に１５分間放置し、４°Ｃで２０分間、１ ３０００ｇにおいて遠心した。

ＲＮＡを含む上部水相を新しい管に取り出し、２体積の無水冷エタノールを用い て一７０°Ｃで２時間沈澱させた。７０％のｄｅｐｃ−エタノールで２回洗浄し た後、ＲＮＡベレットを短時間乾燥し、ｄＨ２００゜５％　ＳＤＳ中に再懸濁し た。

第１鎖ｃＤＮＡ合成 ５ｘｌＯ’細胞からの全ＲＮＡを１８μｌの０．５％　ＳＤＳ中に再懸濁した。

９μｍのＲＮＡを、２ｕｌの３゛ブライ７−　（１ｍｇ／ｍｌ）を用い、６０℃ で１０分間アニールした。軽鎖■領域の増幅の場合はオリゴｄＴプライマーを用 いたが、重鎖Ｖ領域の増幅の場合は、ＸｂａＩ部位（表１における下線）を含み 、γ３以外のネズミ重鎮のイソタイプをすべてブライミングするように縮重を導 入したγ　ＣＨＩアンチセンスプライマーを用いた（表１）。

アニーリングの後、試料を水上で冷却し、４μ】の第１鎮ｃＤＮＡ緩衝液（５０ ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８，３，５ＱｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭのＭｇＣ１，，１ｍ ＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのスペルミジン）、ｌμｌのＲＮＡ アーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）　、２ｔｔ１の１０ｍＭ　ｄＮＴＰ及び２μｌ の予備希釈１：１０　ＰｒｏｍｅｇａＡＭＶ逆転写酵素を加え、反応混合物を４ ２℃で１時間インキュベートした。ｃＤＮＡをＰＣＲに使用するまで一２０°Ｃ で保存した。

表１・ｃＤＮＡ合成のためのプライマー軽鎖■領域ｃＤＮＡの合成のためのプラ イマーオリゴｄＴ、Ｒ１，ＸＢＡ、Ｈ３ ５’　Ｇ　ＣＣＧ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ（Ｔ　 ）　＋　？重鎖■領域ｃＤＮＡの合成のためのプライマーＭ７Ｃ，ＣＨＩ　ＡＳ 　（１位置における縮重を括弧内に示す）５°ＡＧＧ　ＴＣＴＡＧＡ　Ａ（ＣＴ ）ＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＡＣＡＧＧ　（ＡＧ）　（ＡＧ）ＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＡＴ Ａ　ＧＡＣプライマー及びＰＣＲ反応： 可変領域を増幅し、その配列を決定するために第１ＰＣＲ反応を行った。これを 行うためにＰＣＲプライマーを、リーダー配列（５″プライマー）及びＶ−Ｊ領 域の直下流の定常領域（３゛　プライマー）にハイブリッド形成するように設計 した。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３９１　ＤＮＡ合成機でオリゴヌクレオ チドを合成し、精製せずに溶離し、２０μＭに希釈し、４℃で保存した。

すべてのプライマーは、部位を保護し酵素消化を容易にするために上流に３つの 追加の塩基を有する制限部位を用いて設計した。部位は、ＰＣＲ生成物をサブク ローニングベクター及び最終的発現カセットベクター中にクローニングできるよ うに選んだ。

リーダー領域として、プライマーは出発コドンの５゛　にリポソーム認識部位（ Ｋｏｚａｋの配列ＣΔＣＣ；Ｋｏｚａｋ　Ｍ、１９８１．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、、９：２０．５２３３−５２５２）及び３つの５°　Ｇにより保護され たＥｃｏＲ１部位（表２及び３における下線）を含む。軽鎖可変領域増幅におい て、４つの普遍的５゛センスプライマーの１組を同時に用い、重鎮可変領域の場 合は３つの普遍的５′センスプライマーの１組を用いた（Ｃｏｌｏｍａ　ｅｔ　 ａｌ、１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１１，２，１５２−１５６）ｏ 等モル量の各プライマーをＰＣＲ反応で用いた。これらのプライマーは、Ｋａｂ ａｔのデータベースに報告されているすべての属のネズミリーダー配列とハイブ リッド形成するような縮重を含む。（Ｋａｂａｔ　Ｅ、１９８７゜５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ）。３°プライマーはＶ−Ｊ領域の２０ 塩基下流の定常領域に設計され、サブクローニングの目的のためにＸｂａＩ部位 （表２及び３における下線）を含む（表２及び３）。

表２＝ネズミ重鎮可変領域増幅のためのプライマー（１位置における縮重を括弧 内に示す）リーダー領域プライマー（５°センス）ＭＨＡＬＴｌ、ＲＶ　＃０８ ５ リーダーネズミ重鎖ＩｇＶ ５’　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　Ｇ（ＡＧ）Ａ　ＴＧ（ＣＧ）　Ａ ＧＣＴＧ（ＴＧ）　ＧＴ（ＣＡ）　ＡＴ（ＣＧ）　ＣＴＣＴＴ ＭＨＡＬＴ２．ＲＶ　＃０８６ リーダーネズミ重鎖１ｇＶ ５’　ＧＧＧ　ＧＡＴ、ＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　（ＡＧ）ＡＣＴＴＣＧＧＧ　（ ＴＣ）ＴＧ　ＡＧＣＴ（ＴＧ）Ｇ　ＧＴＴ　ＴＴＮｉＨＡＬＴ３．ＲＶ　＃０８ ７ リーダーネズミ重鎖１ｇＶ ５’　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＴＴＧ　ＧＧＧ　 ＣＴＧ　ＣＴＣＴＴＣＴ 定常領域プライマー（３′　アンチセンス）１ｇγのＣＨＩのアミノ酸１３０− １２０で７１イブ１ノ・ノド形成するように設計されたプライマー。このプライ マー１ま重鎖第１鎖ｃＤＮＡ合成で用いられたプライマーと同一である。

ＭＣ７ＣＨＩＡＳ、ＸＢＡ　＃０９７ １ｇγ３以外のネズミＩｇγのためのＣＨＩアンチセンスプライマー５°　ＡＧ Ｇ　ＴＣＴＡＧＡ　Ａ（ＣＴ）ＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＡＣＡＧＧ　（ＡＣ）（ＡＧ ）ＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＧＡＣ表３：ネズミ軽鎖可変領域増幅のためのプ ライマー（１位置における縮重を括弧内に示す）リーダー領域プライマー（５′ 　センス）ＭＬＡＬＴｌ、ＲＶ　＃０８８ リーダーネズミ軽鎖ＩｇＶ ５’　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＡＣＡＣＡ　 ＣＴＣＣＴＧ　ＣＴＡ　Ｔ ＭＬＡＬＴ２．ＲＶ　＃０８９ リーダーネズミ軽鎖ＩｇＶ ５’　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＣＡＡ　ＧＴＧ 　ＣＡＧ　ＡＴＴ　ＴＣＣＡＧＭＬＡＬＴ３．ＲＶ　＃０９０ リーダーネズミ軽鎖１ｇＶ ５’　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＧ　（ＴＡ）ＣＡＣＡ（ＧＴ ）（ＴＡ）ＣＴ　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＴＴ　（ＧＡ）ＴＡＭＬＡＬＴ４．ＲＶ　＃ ０９１ リーダーネズミ軽鎖ＩｇＶ ５°　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ　（ＧＴ）ＣＣ’ＣＣ（ＡＴ）　（ ＧＡ）ＣＴ　ＣＡＧ　（ＣＴ）Ｔ（ＣＴ）　ＣＴ（ＴＧ）Ｔ 定常領域プライマー（３°アンチセンス）カッパ定常領域のアミノ酸１２２−１ １６にハイブリッド形成するように設計されたプライマー ＭＣに　ＡＳ、ＸＢＡ　＃９６ 定常ネズミ軽鎖 ５’　ＧＣＧ　ＴＣＴＡＧＡ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＧＡＡＧＡＴ 　ＧＧＡ 第２ＰＣＲ反応のためのプライマー（表４）は、サブクローニングされた産物の 配列決定により（図９）実際にＶ−Ｊ領域の配列を有する。

これらのプライマーはＶＨプライマーの場合にＮｈｅ１部位、及びＶＬプライマ ーの場合に５μｌ１部位を有し、それが発現ベクターへのクローニングを可能に する（表４において制限酵素部位に下線を引く）。ＶＨの場合の３゛プライマー のＮｈｅ１部位はＶＨ−Ｊ領域をγ１定常領域のＣＨＩの最初の２つのアミノ酸 に直接連結させる。ＶＬ３’　プライマーは発現ベクターにおいてＶＬをＣにに スプライスするのに必要なドナースプライス配列を５ａＩＩ部位の前に有する。

表４　発現ベクター中にクローニングする前の第２ＰＣＲによる１２８、ＩＶ− Ｊ領域修飾のためのプライマー重鎮プライマー（３′　アンチセンス）。

１２８１重鎖Ｖ領域のＪ４領域におけるアミノ酸１１１−１１３にハイプリント 形成するように設計されたプライマー。これは発現ベクター中へのクローニング のためのＮｈｅ１部位（Ｊ４をＣＨＩに結合する）、及びサブクローニングのた めの５ａｌＩ（Ｎｈｅｌの上流）を有する。

ＡＬＫＪ４　ＡＳ、ＮＨＥ、５ＡＬＩ　＃０９８ＶＨＪ４＋γＩ　ＣＨＩのアン チセンス５°　ＴＧＧ　ＧＴＣＧＡＣＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＧ　ＴＧＴ　ＴＧＴ ＧＣＴＡＧＣＴＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣ 軽鎖プライマー（３°アンチセンス） １２８．１軽鎖Ｖ領域のＪ４領域におけるアミノ酸１０１−１０７にハイブリッ ド形成するように設計されたプライマー。これはドナースプライス配列を含み、 それを強調しである。

ＡＬＫに−Ｊ４ＡＳ、５ＡＬＩ　＃１０１ＶＬ　Ｊ４＋スプライシングドナーの アンチセンス５’　ＡＣＧ　ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧ　ＴＣＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣ ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＴ ＰＣＲ反応は１００μｍの体積で以下の最終的条件を用いて行った；２μｌのｃ ＤＮＡ、０．５μｌのＴａｇポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ　１ ｏｎ）　、ＩＸ　緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８，１，５ｍＭのＭｇＣｌ ２．５０ｍＭのＫＣＩ、１００μｇのＢＳＡ）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ 、それぞれ１μＭのプライマー及び５０μｍの鉱油。ＰＣＲはＰＴＣ１００Ｔｈ ｅｒｍａｌ　Ｃｏｎｔｒ。

１１ｅｒ　（Ｍ、Ｊ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）において１分間の変性（９ ４℃）、１分間のアニーリング（５５°ＣＬ１．５分間の伸長　・（７２°Ｃ） 及び１０分間の最終的伸長を用い、３０サイクルで行った。

ＰＣＲ産物のサイズをエチジウムプロミドで染色した２％ＴＡＥゲル中のアガロ ースゲル電気泳動により確認した。正しい産物は軽鎖の場合約３８０塩基対であ り、重鎮可変領域の場合４２０塩基対であった。

サブクローニング及び配列決定・ ＰＣＲ反応の後、クロロホルム抽出により油を除去し、試料を４℃に保った。サ ブクローニングのために、産物をＨｏ１ｔｏｎ　（Ｔ、Ａ、Ｈｏ１ｔｏｎ　ａｎ ｄ　Ｍ、Ｗ、Ｇｒａｈａｍ、１９９０　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、１９： ５．１１５６）による方法に従って調製したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　Ｔ− Ａ（ＥｃｏＲＶ部位における消化により平滑末端化し、末端トランスフェラーゼ を用いてジデオキシチミジントリホスフェートで尾部処理（ｔａｉｌｅｄ））中 に直接クローニングするか、あるいはゲル単離し、適した制限酵素（Ｅ　ｃ　ｏ 　ＲＶ及び５ａＩＩ）で切断し、前もってで同酵素で切断したＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔＫＳ中にクローニングした。

ＴＡクローニングの場合、３μｌのＰＣＲ産物を５０ｎｇのＴ−Ａベクターと、 １５μｍの反応中の１６°Ｃで４−１２時間直接連結した。付着末端連結の場合 、２ＱＱｎｇの切断Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔを２０μｍの連結反応において２００ −４００１ｇの切断産物と連結した。塩化カルシウム処理により調製したＥ　コ リ（Ｅ、ｃｏ　］　ｉ）　ＸＬＩ−ｂ　Ｉ　ｕｅ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）感 応細胞の形質転換の場合、５μｍの連結を用いた。挿入片を含む白色コロニーを 青色コロニーバックグラウンド上で選択した。ミニブレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ） 　ＤＮＡを制限消化し、分析し、正しいと思われるクローンを配列決定した。

ノデオキシヌクレオチド連鎖停止配列決定を、Ｔ７　ＤＮＡポリメラ−セ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ又は５ｅｑｕｅｎａｓｅ、ＵＳ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ）を用 い、製造者の案に従って行った。異なるＰＣＲ反応からの４つの独立したクロー ンを両方向において配列決定し、共通配列を得た。

得られた配列をＧ　ｅ　ｎ　ｂ　ａ　ｎ、　ｋの他のネズミ配列に対して比較し 、その属と保存アミノ酸の同定のためにＫａｂａｔのデータベースにおいて報告 されているＶ領域と整列させた（表５及び６を参照）。

表５：キメラ１２８．１（抗−ヒトドランスフェリンレセプター）軽鎖可変領域 の完全配列、マウスカッパサブグループＶｌＡ− 保存アミノ酸は大文字の太字である。

＊記：この属に関してＫａｂａｔのデータベースに報告されている配列の９８％ においてアミノ酸＃３０は保存Ｖａｌであり、アミノ酸＃１０３及び＃１０７は 保存Ｌｙｓである。

表６：キメラ１２８．１（抗−ヒトドランスフェリンレセプター）ｊムー 保存アミノ酸は大文字の太字である。

＊記：この属に関してＫａｂａｔのデータベースに報告されている配列の９８％ においてアミノ酸＃１８は保存Ｖａｌであり、アミノ酸＃６８は保存Ｔｈｒであ る。

最終的クローンはＶＨ領領域関してｐＢＫｓ４６００、及びＶＬ領領域関してｐ ＢＫｓ４６０１と名付けた。

発現ベクター中へのクローニング プラスミドｐＡＨ４２７４は、リーダー／Ｊ領域ブライミングを用いたＰＣＲに よって得た重鎮可変領域の発現のためのベクターである。このカセット中へのＶ 領域クローニングは、ベクター及び産物をＥｃｏＲＶ及びＮｈｅＩで完全消化す ることにより行った。このベクターはヒトγ１定常領域を有し、そのＣＨＩはＮ ｈｅ１部位によりＶＨ−Ｊ領域の３°末端と直接結合している。この１ｌｋｂの ベクターは原核選択（ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）のための アンピシリン耐性遺伝子、重鎮免疫グロブリンエンハンサ−及びトランスフェク ション産物の選択のためのヒスチジン（ヒスチジノール）選択マーカー（Ｈａｒ ｔｍａｎ、Ｓ、、Ｒ，Ｍｕｌ　ｌ　ｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ 、Ｓｃ　ｉ、８５．８０４７−８０５１）を含み、転写はネズミ２７゜４４遺伝 子のＶＨプロモーターからである。

ｐＢＫｓ４６００からの４００ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＮｈｅＩ断片（１２８，１の ＶＨ）を用い、プラスミドｐＡＨ４２７４中のＥｃｏＲＶ−ＮｈｅＩ断片を置換 した。ＨＢＩＯＩ感応細胞を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む ＬＢプレート上で平板培養した。３２ｐ末端櫟識リーダー領域オリゴヌクレオチ ドを用いたコロニーハイブリッド形成によりコロニーをスクリーニングした。陽 性のクローンを制限マツピングし、ＱＩＡＧＥＮ　ｖキシ　ブレツ　キット（Ｑ ＩＡＧＥＮ　Ｉｎｃ、、５ｔｕｄｉｏ　Ｃ１ｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用 いてマキシ　プラスミド　プレグ（ｍａｘｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｒｅｐｓ）を 調製した。１２８．１のＶＨをヒトγ１定常領域と結合させて含む最終的発現ベ クターをｐＡＨ４６０２と名付けた（図１０）。この発現ベクターに関するコー ド配列を図１１に示す。

プラスミドｐＡＧ４２７０はリーダー／Ｊ領域ブライミングを用いたＰＣＲによ って得た軽鎖可変領域のための発現ベクターである。１４ｋｂのベクターはアン ピシリン耐性遺伝子、ｇｐｔ（ミコフェノール酸耐性）選択マーカー、免疫グロ ブリンＨエンハンサ−及び■一定常領域スブラインシンのためのイントロール（ ｉｎｔｒｏｌ）を有し、転写は２７４４遺伝子からのネズミＶＨプロモーターか らである。

ベクターの呈且工遺伝子内にＥｃｏＲＶが存在するために、抗−トランスフェリ ンレセプターＶＬのクローニングを２段階で行って無効な部分的消化を避けた。

ｐＢＫｓ４６０１からの３８０ｂｐのＥｃｏＲＶ−３ａｌＩ断片（ＶＬ）を、あ らかじめ同酵素で切断したＶＨプロモーターを有するサブクローニングベクター であるｐＢＲ４６０Ｘ　（６，９ｋｂ）中にクローニングした。得られた構築物 （ｐＢＲ４６０８）をその後ＰｖｕＩ−３ａｌｌで切断し、プロモーター、■領 域及びアンビンリン耐性遺伝子の一部を含む４ｋｂの断片を、プロモーターのな い中間ベクターであるｐＳＶ４２７１の９．７ｋｂのＰｖｕＩ−９ａｉｌ断片に 連結した。ＨＢＩＯＩ感応細胞を形質転換し、陽性の細胞をコロニー／”ｔイブ リッド形成及び制限消化によりスクリーニングした。上記の通りにマキシブレブ を調製した。最終的発現ベクターをｐＡＧ４６１１と名付けた（図１２）。この 発現ベクターのコード配列を図１３に示す。

トランスフェクション及び選択： 各最終的発現ベクターからの１０μｇのマキシプレブＤＮＡをＢＳＰＣｌ　（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅＳＰｖｕｌ　イソチゾ？−（ｉｓｏｃｈｉｚｏｍｅｒ））消 化により直鎖状とし、１ｘ１０７のＳ　Ｐ　２１０細胞をエレクトロポレーショ ンによりトランスフェクトした。トランスフェクションの前に細胞を冷ＰＢＳで 洗浄し、その後Ｑ、９ｍｌの間冷緩衝液中に再腎濁し、０．４ｃｍの電極間隙の エレクトロポレーションキュベツト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中にＤ　Ｎ　、Ａと共に 入れた。電気パルスのためにＢｉｏ−ＲａｄからのＧｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を９６０μＦ及び ２００■のキャパシタンスに設定した。パルスの後、細胞を氷上で１０分間イン キユベートシ、その後１０％のウシ血清を含むＩＭＤＭで１回洗浄し、１０％の ウシ血清を含むＩＭＤＭ中に１０５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。

トランスフェクトされた細胞を５つの９６ウエルプレートにおいて１０４細胞／ ウエルの濃度で平板培養した。選択は４８時間後に開始した。

２つのプレートを５ｍＭのヒスチジノールで選択しく重鎮選択）、２つのプレー トを１μｌ／ｍｌのミコフェノール酸で選択しく軽鎖選択）、１つのプレートを ヒスチジノール及びミコフェノール酸で選択した（重鎮及び軽鎖選択）。

選択後１２日で上澄み液を、両鏡の分泌に関して調べるＥＬＩＳＡによりスクリ ーニングした。Ｉｍｍｕｌｏｎ　ＩＩ　９６ウエルプレートにｐＨ９，６の炭酸 塩緩衝液中の５μｇ／ｍｌのヒツジ抗ヒトγ１を塗布し、３％のＢＳＡで遮蔽し た。トランスフェクション産物がらの上澄み液を加え、プレートを４℃で終夜イ ンキュベートした。洗浄の後、プレートをアルカリ性ホスファターゼと複合化し たヒツジ抗−ヒトにを用いて発色させ、Ｈ及びＬ鎖を分泌するウェルを同定した （表７）。

表７：トランスフエクシヨンの結果 ５Ｐ２１０細胞におけるベクターｐＡＨ４６ｏ２及びｐＡＧ４６１１を用いたト ランスフェクションの結果。２つのプレートを５ｍＭのヒスチジノールで選択し くＨｌｓ）、２つのプレートを１μｍ／ｍｌのミコフェノール酸で選択しくＨＸ Ｍ）　、１つのプレートを両者で選択した（ＨＩＳ十ＨＸＭ）。クローンを含む ウェルをＥＬＩＳＡにより分析し、分泌された抗体を含むウェルを決定した（＃ 陽性ウェル）。

選択 ＨＩＳ　ＨＸＭ　ＨＩＳ＋ＨＸＭ ＃クローンを含む　７８／９６　７６／９６　１．３／９６ウエル　８３／９６ 　６４／９６ ＃陽性ウエル　２０／７８　２８／７６　１０／１３高生産クローンをさらに分 析するために拡大した。

選択されたトランスフェクション産物をサブクローニングした。

抗体分析４ 生産されるタンパク質の性質を決定するために、トランスフェクション産物を３ ５８メチオニンで生合成により標識し、細胞質の抗体及び分泌抗体をウサギ抗− ヒトＩｇ及びプロティンＡを用いて免疫沈降させ、免疫沈降物をＳＤＳポリアク リルアミドゲル上で分別した。

ＥＬＩＳＡにより最高生産と同定されたクローンを５ｍｌのペトリ皿に拡大し、 選択から除去した。１ｘｌＱ’の細胞を２２０Ｘｇにおいて、４℃で５分間ペレ ット化し、標識培地（メチオニンを含まない高グルコースＤＭＥ：ＧＩＢＣ○） で２回洗浄した。最後に細胞を２５μＣｉの３ｆｉ３−メチオニンを含む１ｍｌ の標識培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、　）中に再懸濁し、組織培養雰囲気 条件下の３７℃で３時間標識を挿入させた。

分泌ＩｇＧの免疫沈降のために細胞をベレット化し、上澄み液を吸引した。細胞 ベレットをＮＤＥＴ　（１％のＮＰ−４０，０，４％のデオキシコレート、６６ ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓＳｐＨ７，４）中で細胞溶解し、遠心し、 上澄み液を除去し、ウサギ抗−ヒトＩｇＧＦｃポリクローナル抗血清（５μ］／ ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートした。標識上澄み液に１００μｍ／ｍ ｌのプロティンＡ　（ＮＤＥＴ中で１０％、ＩｇＧ　５ｏｒｂ）を加え、４℃で １５分間回転させることにより混合した。プロティンＡ結合１ｇＧを、１００μ ｍ１７１ＮＤＥＴ＋Ｑ、３％のＳＤＳ中で１ｍｌの３０％スクロースを通して遠 心することにより洗浄した。その後プロティンＡベレットを１００μｌのＮＤＥ Ｔ／３％のＳＤＳ中に再懸濁し、１００μｌの同緩衝液と共に１．５ｍｌのポリ プロピレン管に移し、以前の管を１００μｌで濯いだ。３゜０Ｉｉｌの懸濁液を 遠心し、脱イオン水で洗浄した。最後にプロティンＡベレットを５０μｍの負荷 緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ　ｐＨ６，７，０，２％（７）ＳＤＳ、１０％のグ ’Ｊセロ−／ｌ／、８％μｇ／ｌｏｏｍ１のブロモフェノールブルー）に再懸濁 し、２分間煮沸してからゲル負荷した。

抗体を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（５％のアクリルアミドゲル、０．１％のリン酸ナト リウム緩衝）により分析し、Ｈ及びＬ鎖の正しい組み立てを確認した。さらに標 識試料の一部を、０１５Ｍの２−メルカプトエタノールを用いて３７°Ｃで１時 間処理することにより還元し、１２％のアクリルアミドゲル上で分析し、組み立 てられていないＨ及びＬ鎖のサイズを確認した。ゲルを染色し、乾燥し、オート ラジオグラムのために露光した。

得られたオートラジオグラムは、完全に機能性の抗体に関して予想されたパター ンを現した。細胞上澄み液中に存在した分泌抗体は、完全に発現され、組み立て られた機能性抗体の場合に予想された遊離の軽鎖、軽鎖２量体、及び２つの軽鎖 と２つの重鎮から形成された４量体の分子量パターンを示した。細胞質中の抗体 部分の場合のパターンも完全に発現された抗体構築物に関する予想通りであった 。

実施例１５に記載の通り、ヒトトランスフェリンレセプターと結合するネズミモ ノクローナル抗体１２８１の重鎮をコードする遺伝子の最初のクローニングは、 重鎮の可変領域をコードする配列をヒトγ１定常領域フレームワークを含む発現 ベクター中に入れることを含む。これにより、抗体の重鎮（〜７Ｈ）の可変領域 をコードする配列がネズミ源から誘導され、ＣＨ，、ＣＨ２及びＣＨ３をコード する配列がヒト源から誘導されたマウス／ヒトキメラが創造される。異なるヒト カンマイソタイプ（γ−１、−２、−３及び−４）は異なる生物学的性質を有す るので、これらの各イソタイプのためのマウス／ヒトキメラを得るために各イソ タイプからの定常領域配列を有するキメラ抗体を創造することが必要である。こ れらのキメラの製造は、抗体１２８．１のＶＨ領領域γ−１定常領域を含む発現 ベクター中へのクローニングに関して実施例１５で以前に記載した方法と同様の 方法でプラスミドｐＢｓＫ４６００がらの抗体１２８．１のＶＨ領領域含む４０ ０ｂｌ）のＥ　ｃ　ｏＲＶ−Ｎｈ　ｅ　Ｉ断片をγ−２、γ−３及びγ−４定常 領域を含む発現ベクター中にクローニングすることにより行った。γ−２、γ− ３及びγ−４定常領域を用いたこれらのクローニングはそれぞれプラスミドｐＡ Ｈ４６２５、ｐＡＨ４８０７及びｐＡＨ４８０８を与え、このプラスミド地図を それぞれ図１４、図１５及び図１６に示す。重鎮発現ベクターｐＡＨ４６２５、 ｐＡＨ４８０７及びｐＡＩ−１４８０８の抗体：＋−Ｆ配列をそれぞれ図１７、 図１８及び図１９に示す。

これらのベクターをキメラ軽鎖ベクターｐＡＧ４６１１と組み合わせてＳ　Ｐ　 ２１０細胞中にトランスフェクトし、クローンを実施例１５に記載の通りに選択 した。前記の生合成的標識タンパク質、免疫沈降及びＳＤ　Ｓ　−Ｐ　ＡＧ　Ｅ を用いた最初の抗体分析は、γ−３及びγ−４キメラの場合に重鎮及び軽鎖、な らびに組み立てられた抗体に関する適したバンドを与えた。γ−２トランスフェ クション産物は検出可能なタンパク質を作らなかった。

実施例１７−トランスフェクション産物による抗体生産選択されたトランスフェ クション産物による抗体生産をＥＬＩＳＡにより評価した。細胞を新しい培地中 で１０’細胞／ｍｌの密度に希釈し、１ｍｌを２４−ウェル培養プレート上の３ ウエルのそれぞれに分配した。

その後プレートを５％のＣＯ２を用いて３７°Ｃで２４時間インキュベートした 。その後培地をウェルがら集め、細胞及び細胞破片を回転により沈澱させて透明 な上澄み液を得た。ＥＬＩ　ＳＡのために９６−ウェルのミクロタイター皿にヒ トＩｇＧに対するヒツジ抗血清を塗布した。３％のＢＳＡで遮蔽した後、プレー トを洗浄し、細胞上澄み液及び既知の濃度のヒト１ピＧ標準の両方の１系列の希 釈液をプレートに適用し、室温で１時間インキュベートした。その後プレートを 洗浄し、ヒトＩｇＧに対するビオチニル化ヒツジ抗血清、その後アビジンとビオ チニル化ホースラディツシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）の混合物を加えた。そ の後試料中に存在する抗体の量を、ＨＲＰにより変換された基質の量に基づいて 決定した。

γ−１キメラトランスフェクションから生じた３つのクローンを抗体生産に関し て調べた。３回の実験からの平均値は、異なるクローンに関してそれぞれ３９． ２１及び２４μｇ／ｍｌ　ＩｇＧ／１０’細胞／２４時間であった。１つのγ− ３クローンを調べ、約１μｇ／ｍｌ　ＩｇＧ／１０’細胞／２４時間を生産する ことが見いだされた。γ−４キメラの２つの異なるクローンを調べ、それぞれ２ ．８及び０．２ｎｇ／ｍ１　１ｇＧ／１０’細胞／２４時間を生産することが見 いだされた。

同等事項 当該技術分野における熟練者は日常的実験のみを用い、本明細書に特に記載の特 定の実施態様に対する多くの同等事項を既知であるが、又は確かめることができ るであろう。これらは本明細書の請求の範囲により記載の本発明の範囲内に含ま れるものとする。

時間（時） 時間 乙ホモジネート・複合体 ３０分　２４時間 時間 囮ホモンネーｔ・：０Ｘ−２６ ０脳実質　０Ｘ−２６ ０脳実質　△Ｚ１ 時　間　（時） １時間　４時間　２４時間 時間 Ｊう５ １時間　７１時間　２４時間 時間 ＩｇＧ２ａ標準に対する１２８．２ＭΔｂの比率ＦＩＧ、　８ リーダー　可変　定常 ＦＱＩ　ＣＤＩ’ｌｌ　ＦＰ２　ＣＤＩ：１２　Ｆｆ１３　ＣＤＰ３ＦＲ４１」 Ｂ）第２ＰＣＲ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ 八ＴＧ　ＧＭ　ＴＧＧ ＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　Ｇ ＡＡ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧ ＣＴＡＣＴＡＴ　ＴＡＣＴＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＣＴＡＣＴＧＧ　ＧＧＴ 　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＡＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ　ＧＣＴ　 ＡＧＣＡＣＣＭＧ　ＧＧＣＣＣＡ　ＴＣＧ　ＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧ　 ＧＴＣＡＡＧ　ＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＭ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＡＣＧ　ＧＴ Ｇ　ＴＣＧ　ＴＧＧ　ＡＡＣＦＩＧ、ＩＩＨ ＴＣＣＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧ　ＧＴＧ 　ＡＣＣＧＴＧ　ＣＣＣＴＣＣＡＧＣＦＩＧ、　ＩＩＩ ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＧＡ　ＧＭ　ＣＣ八へＡＧ　ＧＴＧ　ＴＡＣＡＣＣＣ ＴＧ　ＣＣＣＣＣＡ　ＴＣＣＣＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＡＡＧ　 ＡＡＣＣＡＧＧＴＣ八ＧＣＣＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＣＴＧ　ＧＴＣＡＡＡ　ＧＧＣ ＴＴＣＴＡＴ　ＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡ Ｇ　ＡＧＣＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＭＣＭＣＴＡＣＭＧ　Ａ ＣＣＡＣＧＣＣＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴ ＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＭＧ　ＣＴＣＡＣＣＧＴＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＧ ＣＡＧＧ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡ　ＴＧ ＣＴＣＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　ＧＧＴ　ＡＡＡＦＩＧ、ＩＩＬ ＦＩＧ、ＩＩＭ 八ＴＧ Ｍｅｔ ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＣＴｈｒ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａ１ＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧ　ＣＣＡ　Ｔ ＣＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　Ｇ ＣＣＴＣＴＧＧＡ　ＧＡＧ　ＴＧＴ ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　１５ ＦＩＧ、　１７Ｊ Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ工ｌａ　ＧｌｕＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａ ｌ　ｋｒｑ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａ ｌ　Ａｌａ　Ｓｓｒ　Ｖａｌ　ＧｌｙＬｅｕ　Ｔｙｒ　工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｕｙ 　Ｇｕｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ｌｅｕ　ＭｅｔＶａｌ工１ｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔ ｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＬａｕＦＩ Ｇ、１７に Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＲｉＦ＋Ｌｅｕ工ｌｅ工］ 、ｅ　Ｇ］、ｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＡｒｇＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖ ａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｉ］、ｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａ］、ａ　ＧＩＹ　Ｓｅｒ 　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａ唐■ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　’ｒｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ 　Ｃｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌ■ Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＰｈｅＦＩＧ、１７Ｌ ＧＴＧ　ＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＣＴＡ　ＣＡＧ　ＴＣＣＴ ＣＡ　ＧＧＡ　ＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣ ＧＴＧ　ＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧ　ＧＧＣＡＣＣＣＡＧ　ＡＣＣＴＡＣ Ｔｒ ａｌ ＧＡＧ　ＣＴＣＡＡＡ　ＡＣＣ Ｇ八Ｇ　へＣＣＣＡＭ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＧＡＣＡＣＡ　ＣＣＴ　ＣＣＣＣＣＧ 　ＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡ ＦＩＧ、　１８Ｊ ＧＡＧ　ＣＣＣＡＡＡ　ＴＣＴ ＴＧＴ　ＧＡＣＡＣＡ　ＣＣＴ　ＣＣＣＣＣＧ　ＴＧＣＣＣＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣ ＣＣＡＦＩＧ、１８に ＧＡＧ　ＣＣＣＡＡＡ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＧＡＣＡＣＡ　ＣＣＴ　ＣＣＣＣＣＧ 　ＴＧＣＣＣＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣＣＣＡＦＩＧ、１８Ｌ ＦＩＧ、１８八１ ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＧＡ　ＧＭ　ＣＣＡＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧ 　ＡＧＣＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＭＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡ ＣＣＡＣＧＣＣＴ　ＣＣＣＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴ ＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＯＡＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＧＴＧ　ＧＡＣＡＡＧ　Ａ ＧＣＡＧＧ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡ　Ｔ ＧＣＴＣＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　ＧＧＴ　ＭＡＦＩＧ、１８Ｎ Ｍｅｔ　ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　Ｉｌｅ　ＡＳｐ　Ｔｒｐ　 ＡＳｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎＦＩＧ、１８０ ＦＩＧ、１８Ｐ 八ＴＧ　ＧＭ　ＴＧＧ ＦＩＧ、１９Ｇ ＧＡＧ　ＴＣＣＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＣＣＡ　ＴＧＣＣＣＡ　ＴＣＡ 　ＴＧＣＣＣＡＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＧ Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ ＦＩＧ、　１９Ｊ Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ｋｒｑ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａ ｌ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｍａｌ　’ｒｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ工１ａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＣｙｓＬ＠ｕ　Ａｌａ　Ｐｈ ｅＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ＡＳＰ 　ＬＹｓ工ｌｅ　Ｐｈｅ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇ ｉｎ　ＡｒｇＯｒＴ／ＩＩ（Ｑ）／１ｎり０６ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ、ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、 ＳＥ、　ＵＳ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．抗体が脳毛細血管内皮細胞上に存在するトランスフェリンレセプターに結合 し、神経薬又は診断薬が製薬学的活性形態で血液脳関門を横切って転移され、抗 体が該トランスフェリンレセプターと反応性のキメラ抗体であることを特徴とす る、神経薬又は診断薬を血液脳関門を横切って宿主の脳に配達するための薬剤の 製造のための、抗体一神経薬又は診断薬複合体。
2. ２．キメラ抗体がネズミ抗体の可変領域及び別の抗体の定常領域の間のキメラで あることを特徴とする、請求の範囲１に記載の抗体一神経薬又は診断薬複合体。
3. ３．定常領域がねずみ以外の動物源のものであることを特徴とする、請求の範囲 ２に記載の抗体一神経薬又は診断薬複合体。
4. ４．動物源がヒトであることを特徴とする、請求の範囲３に記載の抗体一神経薬 又は診断薬複合体。
5. ５．可変領域が１２８、１ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体 からのものであることを特徴とする、請求の範囲２に記載の抗体一神経薬又は診 断薬複合体。
6. ６．可変領域が１２８．１ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体 からのものであることを特徴とする、請求の範囲４に記載の抗体一神経薬又は診 断薬複合体。
7. ７．定常領域がプラスミドｐＡＨ４２７４及びｐＡＧ４２７０からのものである ことを特徴とする請求の範囲６に記載の抗体一神経薬又は診断薬複合体。
8. ８．定常領域がプラスミドｐＡＨ４６２５及びｐＡＧ４２７０からのものである ことを特徴とする請求の範囲６に記載の抗体一神経薬又は診断薬複合体。
9. ９．定常領域がプラスミドｐＡＨ４８０７及びｐＡＧ４２７０からのものである ことを特徴とする請求の範囲６に記載の抗体一神経薬又は診断薬複合体。
10. １０．定常領域がプラスミドｐＡＨ４８０８及びｐＡＧ４２７０からのものであ ることを特徴とする請求の範囲６に記載の抗体一神経薬又は診断薬複合体。
11. １１．脳毛細血管内皮細胞上に存在するトランスフェリンレセプターと反応性の キメラ抗体を神経薬又は診断薬と結合させて含み、それにより配達系が生体内に 投与された時に血液脳関門を横切って神経薬又は診断薬を輸送する、神経薬又は 診断薬を血液脳関門を横切って配達するための配達系。
12. １２．キメラ抗体がネズミ抗体の可変領域及び別の抗体の定常領域の間のキメラ であることを特徴とする、請求の範囲１１に記載の配達系。
13. １３．定常領域がねずみ以外の動物源のものであることを特徴とする、請求の範 囲１２に記載の配達系。
14. １４．動物源がヒトであることを特徴とする、請求の範囲１３に記載の配達系。
15. １５．可変領域が１２８．１ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗 体からのものであることを特徴とする、請求の範囲１２に記載の配達系。
16. １６．可変領域が１２８．１ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗 体からのものであることを特徴とする、請求の範囲１４に記載の配達系。
17. １７．定常領域がプラスミドｐＡＨ４２７４及びｐＡＧ４２７０からのものであ ることを特徴とする請求の範囲１６に記載の配達系。
18. １８．定常領域がプラスミドｐＡＨ４６２５及びｐＡＧ４２７０からのものであ ることを特徴とする請求の範囲１６に記載の配達系。
19. １９．定常領域がプラスミドｐＡＨ４８０７及びｐＡＧ４２７０からのものであ ることを特徴とする請求の範囲１６に記載の配達系。
20. ２０．定常領域がプラスミドｐＡＨ４８０８及びｐＡＧ４２７０からのものであ ることを特徴とする請求の範囲１６に記載の配達系。
21. ２１．脳毛細血管内皮細胞上に存在するトランスフェリンレセプターと反応性の 可変領域、及び別の抗体の定常領域を含むキメラ抗体。
22. ２２．可変領域がネズミ起源のものであることを特徴とする請求の範囲２１に記 載のキメラ抗体。
23. ２３．定常領域がネズミ以外の動物源からのものであることを特徴とする請求の 範囲２２に記載のキメラ抗体。
24. ２４．動物源がヒトであることを特徴とする請求の範囲２３に記載のキメラ抗体 。