JP2002529516A - ＣＤ６６ａを用いて新脈管形成に影響を及ぼす方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新脈管形成に影響を及ぼすための医薬組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、新脈管形成に影響を及ぼす（Ｂｅｅｉｎｆｌｕｓｓｕｎｇ）医薬組
成物に関する。ある場合には、新脈管形成は、ＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａの形
成を阻害する物質の投与により改善され得、一方、他の場合には、新脈管形成は
、ＣＤ６６ａとＣＤ６６ａリガンドとの間の相互作用を妨げる物質を用いること
により阻害され得る。

【０００２】 血管の形成（新脈管形成）は、多くの疾患において治癒に貢献し得る重要な工
程であり、一方、他の症例においては望ましくは阻止される。新脈管形成を改善
することは、例えば、心血管疾患について、例えば、狭心症または心発作または
脳梗塞を治療するのに非常に望ましい。他方で、ヒトおよび動物における悪性固
体腫瘍の脈管供給の阻害は、腫瘍治療における有望なアプローチである。新脈管
形成インヒビター、例えば、エンドスタチンは、腫瘍に供給する血管の正常な、
従って遺伝学的に安定した内皮細胞を直接的に攻撃し、それらを死滅させ、従っ
て栄養含有血管での腫瘍細胞の供給を停止する（Ｋｅｒｂｅｌ，Ｒ．、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３９０、ｐ．３３５ 以下参照、１９９７）。これは、血管および腫瘍質
量の退行を導く。腫瘍細胞とは対照的に、内皮細胞は遺伝学的に安定であるので
、腫瘍細胞に直接的に標的付ける細胞分裂停止治療におけるように耐性が形成さ
れることはない。新脈管形成を阻害することにより、ヒト腫瘍の増殖は、実験モ
デルでブロックされうる。数種の新脈管形成インヒビターは、幾分かは臨床的に
試験されている［Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ ８６、３５３−３６４、（１９
９６）］。

【０００３】 新血管での組織の供給は、多数の生体分子が関与する複雑なプロセスである。
腫瘍は、例えば、新血管の形成を開始する可溶性媒介物を産生する。新脈管形成
が進行する場合、接着分子は、中心的役割を演ずる。それらは、血管細胞の互い
の連絡および周囲の連結する組織との連絡を制御する。最後に、種々のプロテイ
ナーゼもまた、新生血管形成に関与する。

【０００４】 本発明の目的は、所望される新脈管形成の改善または阻害の可能性を提供する
。新脈管形成が阻害される場合、耐性の発生を伴わないガン治療の一形態が提供
され、すなわち、詳細には、腫瘍に付随する新脈管形成が、阻害の減少の意味内
で影響をうける。

【０００５】 本発明によれば、これは、特許請求の範囲に規定される主題により達成される
。

【０００６】 本出願の主題は、詳細には、新脈管形成を調節するのに適した医薬組成物であ
る。かかる組成物は： （ａ）正の調節のために、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ａフラグメントまたはＣＤ６６
ａに由来する糖構造、またはＣＤ６６ａリガンド、リガンドフラグメントあるい
はそれらに由来する構造の１またはそれ以上の成分、ならびにＣＤ６６ａまたは
ＣＤ６６ａリガンドの発現を誘導する物質、または （ｂ）負の調節のために、１またはそれ以上の成分のＣＤ６６ａとＣＤ６６ａリ
ガンドとの相互作用を阻害する物質またはＣＤ６６ａもしくはＣＤ６６ａリガン
ドの発現を阻害する物質、 を含有する。

【０００７】 タンパク質ＣＤ６６ａは、胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）、膜貫通炭素胚性抗原
またはヒトＣ−ＣＡＭとも呼ばれる、特殊な接着分子である。用語ＣＤ６６ａは
以下で使用される。ＣＤ６６ａをコードする遺伝子は、既にクローン化されてい
る（Ｈｉｎｏｄａら、ＰＮＡＳ ８５、６９５９−６９６３、１９８８）。本出
願の出願人は、一つのＣＤ６６ａ−特異的モノクローナル抗体を１９９１年に既
に世界規模で記載していた［Ｄｒｚｅｎｉｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ５６、１７３−１７９ （１９９１）；Ｓｔｏｆｆｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５０、４９７８−４９８４（１９９３）］。この抗体は、４Ｄ１／Ｃ２
と呼ばれ、ＤＳＭＺ［ドイチェサムラングフォンミクロオルガニズメンウントツ
ェルクルツレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）］、マシェローデル
ウェブ、ブラウンシュハイク（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ，Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ）に、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３７１の下で１９９８
年１０月２２日に寄託された。

【０００８】 驚くべきことに、ＣＤ６６ａ因子は、腫瘍毛細血管において発現され、一方、
対応する正常な組織の血管は陰性であることが現在見出された。

【０００９】 ヒトライディヒ（Ｌｅｙｄｉｇ）細胞腫瘍において、新生血管形成の個々の段
階が正確に追跡されうる。これに関連して、所定の段階の新生血管形成が、以下
の因子の出現に関連しうることが見出された。 １．内皮細胞の増殖：ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＶＥＧＦレセプター ２．脈管管腔の形成：ＣＤ６６ａ ３．次の分化の工程：エンドスタチン ４．次の分化の工程：アンジオスタチン

【００１０】 ニワトリ胎仔を用いた本発明者らにより行われた最近の実験では、ＣＤ６６ａ
が強力な新脈管形成因子であり、正常組織および腫瘍組織の新生血管形成を改善
することが示されうる。

【００１１】 ＣＤ６６ａが、ＣＤ６６ａに対する抗体によりブロックされ、腫瘍増殖に必要
な毛細血管の形成が阻害されることも示されうる。腫瘍増殖は、もはや起こり得
ない。

【００１２】 ＣＤ６６ａは、規定された分化のウインドウ、すなわち、管腔形成の段階にお
いてヒト腫瘍の新たに形成された血管（毛細血管）において検出されうる。イン
ビトロ分化モデルにおいて、モノクローナルＣＤ６６ａ抗体は、ヒト内皮細胞に
より脈管の形成（管形成）を阻害する。これらの結果は、ＣＤ６６ａが新脈管形
成において必須な役割を演じることを証明している。腫瘍血管におけるＣＤ６６
ａの発現およびモノクローナルＣＤ６６ａ抗体による毛細血管構造形成のインビ
トロ阻害より、腫瘍新脈管形成は、ＣＤ６６ａを機能的にブロックすることによ
り阻害されうるということになる。

【００１３】 トランスフェクトーマ（Ｔｒａｎｓｆｅｋｔｏｍｅｎ）を用いて行った実験は
、ＣＤ６６ａがそれ自身（ホモタイプ結合）およびＣＤ６６ファミリーの他のメ
ンバーに結合することを示している。基底細胞極（Ｚｅｌｌｐｏｌ）に新規に形
成された内皮のＣＤ６６ａの局在化および毛細血管形成の阻害は、ＣＤ６６ａが
細胞外マトリックスの成分と相互作用することを示している。

【００１４】 ＣＤ６６ａの１もしくはそれ以上の機能性ドメインまたはそのリガンドに特異
的に結合する抗体、ペプチド、タンパク質または他の因子は、本発明の１つの局
面により所望されるＣＤ６６ａ阻害に特に適切である。ＣＤ６６ａの接着性の、
機能的に有意なドメインに対するモノクローナル抗体が好ましく使用される。さ
らに、ＣＤ６６ａは、新脈管形成性効果、例えば、ルイスＸおよびシアリル−ル
イスＸ群を有し得る糖構造を有する。上記のモノクローナルＣＤ６６ａ抗体４Ｄ
１／Ｃ２が好適に使用される。これは、ＣＤ６６ａの機能的不活化による腫瘍新
脈管形成の阻害を導く。ＣＤ６６ａは、このことに関連して、ＣＤ６６ａと可能
なリガンドとの間の相互作用を阻害することにより機能的に不活化される。ここ
で、相互作用を媒介する構造がブロックされる。さらに、可溶性リガンドまたは
可溶性リガンドドメインもまた、上記相互作用をブロックするのに使用され得る
。本発明はまた、ＣＤ６６ａフラグメント、およびＣＤ６６ａのエピトープと実
質的に反応する抗体のフラグメントに対応する組換えドメインの使用に関する。
結果として、ＣＤ６６ａから開始するシグナル鎖がブロックされる。使用される
化合物はまた、例えば、不可逆的にレセプターに結合するのに適切であるように
改変され得る。

【００１５】 特に、分子全体としてのＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ａドメインならびにＣＤ６６ａ
の特異的な糖構造が、本発明の一つの局面により所望される新脈管形成改善に適
切である。これらの場合において、可溶性分子形態が、新脈管形成が引き起こさ
れる身体の部位（例えば、心筋）に適用される。ＣＤ６６ａタンパク質またはＣ
Ｄ６６ａタンパク質の一部をコードするＤＮＡが使用され得る。上記ＤＮＡはま
た、遺伝子治療において一般的であるベクター（例えば、アデノウイルス）に組
み込まれ得る。タンパク質の合成はまた、シンプルなプラスミドＤＮＡの投与に
より達成され得る。新脈管形成の正の影響は、ＣＤ６６ａとＣＤ９６ａリガンド
との間の相互作用を改善することによりもたらされる。

【００１６】 新脈管形成を阻害するのに使用しうる上記の抗体を得る方法は、当業者に公知
であり、例えば、ポリクローナル抗体に関しては、適当な動物を免疫して血清を
得るための免疫源としてのＣＤ６６ａまたはその断片の使用を含む。また、当業
者は、モノクローナル抗体の産生方法について精通している。この目的のために
、例えば、抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とからハイブリッド細
胞を産生し、クローン化する。その後、ＣＤ６６ａに特異的な抗体を産生するク
ローンを選別する。次いで、この抗体を標準的な方法に従って産生させる。抗体
を産生する細胞の例は、脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球などである。この
目的のために免疫しうる動物の例は、マウス、ラット、ウマ、ヤギおよびウサギ
である。ミエローマ細胞は、マウス、ラット、ヒトまたは他の給源から得られう
る。細胞融合は、例えば、一般に知られたケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）およびミ
ルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の方法により行いうる。細胞融合により得たハ
イブリドーマを、ＣＤ６６ａを用いて酵素−抗体法に従って、または類似の方法
に従ってスクリーニングする。クローンを、例えば、限界希釈法により得る。得
られたクローンを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移植する。１０〜１４日後に
マウスから腹水を取り出し、モノクローナル抗体を公知の方法（例えば、硫酸ア
ンモニウム分画、ＰＥＧ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグ
ラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー）により精製する。回収した
抗体を直接使用してもよく、その断片を使用してもよい。これに関連して、「断
片」という用語は、完全な抗体と同じエピトープ特異性を有する、抗体のすべて
の部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖまたは単鎖のＦｖ断片）を意味する。

【００１７】 一態様において、前記モノクローナル抗体は、動物（例えば、マウス）由来の
抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはその断片である。ヒト抗体またはヒト化抗
体と類似するキメラ抗体は、新脈管形成の可能性は低下するが、標的に対する親
和性は低下しない。キメラ抗体およびヒト化抗体の産生、またはヒト抗体に類似
する抗体の産生は、詳細に記載された［ノグチ（Ｎｏｇｕｃｈｉ），Ｎｉｐｐｏ
ｎ Ｒｉｎｓｈｏ，１９９７，５５（６） Ｓ．１５４３−１５５６；バン・ホ
ゲザンド（ｖａｎ Ｈｏｇｅｚａｎｄ），Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ
ｅｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９７，２２３， Ｓ．１０５−１０７］。ヒト化
免疫グロブリンは、実質的にヒト免疫グロブリン（受容免疫グロブリンとよぶ）
に由来する可変フレームワーク領域、および実質的に非ヒト免疫グロブリン（例
えば、マウス由来）（供与免疫グロブリンとよぶ）に由来する相補性決定領域を
有する。定常部も、利用可能な場合は、実質的にヒト免疫グロブリンに由来する
。ヒト患者に投与する場合、本発明のヒト化（およびヒト）抗ＣＤ６６ａ抗体は
、マウスまたは他の種に由来する抗体よりも多くの利点を提供する：（ａ）ヒト
免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常部を外来のものと見なさず、
したがって、かかる注入された抗体に対する抗体応答は、完全に外来のマウス抗
体または部分的に外来のキメラ抗体に対する応答よりも小さいはずである；（ｂ
）ヒト化抗体のエフェクター領域はヒト由来であるため、ヒト免疫系の他の部分
と、より良好に相互作用しうる；および（ｃ）注入されたヒト化抗体は、天然に
存在するヒト抗体と実質的に同等の半減期を有し、これは、他の種の抗体と比べ
て、より少なく、より低頻度の用量での投与を可能にする。

【００１８】 また、上記の従来の技術は、組換えファージライブラリーを用いて補足し、ま
たは置き換えうる（フェリチ（Ｆｅｌｉｃｉ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅ
ｖ．１， Ｓ．１４９−１８３（１９９５）；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂ
ｏｏｍ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４， Ｓ．１−２０（１９９
８））。組換えファージライブラリーは、ファージが提示した抗体断片の抗原結
合領域においてランダムなペプチド構造を有し得る。この技術の利点は、とりわ
け、クローニングされたファージにおける抗原結合構造のアミノ酸配列に関する
情報が直接利用可能であることである。

【００１９】 そのブロッキンッグによりＣＤ６６ａの機能が不活化されるＣＤ６６ａのドメ
インまたはＣＤ６６ａリガンドは、任意の方法によって組み換えられ得、治療目
的（例えば、より良好な免疫学的適合性を達成するため）に適する分子内に導入
したまま使用されうる。また、反応性ドメインを、分子生物学的標準法に従って
、例えば、細菌を用いることにより、または昆虫細胞にて発現させうる。

【００２０】 ＣＤ６６ａと、考えられうるリガンドとの相互作用は、好ましくは以下のよう
にして阻害（負の調節）しうる。

【００２１】 − ＣＤ６６ａの機能性ドメインに対する抗体および抗体断片による阻害、 − ＣＤ６６ａリガンドの機能性ドメインに対する抗体および抗体断片による阻
害、 − ＣＤ６６ａの機能性ドメインによる阻害、 − ＣＤ６６ａリガンドの機能性ドメインによる阻害、 − アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａリガ
ンドの内因的形成の阻害

【００２２】 ＣＤ６６ａと、考えられうるリガンドとの相互作用は、好ましくは以下のよう
にして向上（正の調節）させうる。

【００２３】 − 生化学的方法により精製された天然分子の適用、 − 組換えＣＤ６６ａ断片の適用、 − ＣＤ６６ａから単離した新脈管形成において活性な糖構造の適用、 − 完全に合成により、または部分的に合成により調製された、ＣＤ６６ａの血
管形成において活性な糖構造に由来する糖構造の適用、 − 完全ＣＤ６６ａタンパク質をコードする、適当なベクターまたはプラスミド
の形態のＤＮＡの適用、 − ＣＤ６６ａのアイソフォームまたは断片をコードする、適当なベクターまた
はプラスミドの形態のＤＮＡの適用

【００２４】 本発明による医薬組成物は、所望の組織に到達するのに適切な任意の方法によ
り投与しうる。投与は、好ましくは非経口で、特に、経口、静脈内または腫瘍内
に行われる。投与の目的のために、対応する一般的な医薬用賦形剤を用い、それ
ぞれの投与の種類に適する配合で使用される。経口的に適用可能な薬剤は２通り
で開発される。一方、リガンドおよびレセプターの相互作用は、例えば、Ｘ線構
造解析またはＮＭＲスペクトルによりモデル化されうる。また、化学物質のコン
ビナトリアル・ライブラリー（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８， Ｓ．７０１−７１７
（１９９７））を使用しうる。ここで、リガンドおよび（ｂｚｗ．）レセプター
の相互作用は、最初に広く無作為に組み合わせた化学物質により調べることがで
きる。結合が検出された場合、結合特性は、類似の化合物を選択することにより
、より詳細に規定することができる。

【００２５】 本発明の化合物の投与の用量および薬量学は、年齢、体重、性別、疾患の重篤
度などの患者の特定のパラメータに基づいて医師が決定する。

【００２６】 投与の種類に応じて、医薬品は、例えば、溶液、懸濁液の形態で、粉末、錠剤
もしくはカプセルまたは一般的なガレーン法により作製された注射用製剤として
、適宜調剤される。

【００２７】 注入または注射用の溶液は、好ましくは水溶液または懸濁液であり、例えば、
活性物質をそのままで、またはマンニトール、ラクトース、グルコース、アルブ
ミンなどの担体とともに含む凍結乾燥させた調製物から使用前に作製することが
できる。既製の溶液を滅菌し、任意に、例えば保存剤、安定剤、乳化剤、可溶化
剤、バッファーおよび／または浸透圧を調節するための塩などの補助剤と混合す
る。滅菌は、小孔径を有するフィルターを介する滅菌濾過により行い得、そのと
き組成物は、任意に凍結濾過しうる。また、滅菌性の維持を補助するために抗生
物質を添加してもよい。

【００２８】 医薬組成物は、治療有効量の上述の活性物質の１種またはそれ以上を、通常の
補助剤および担体物質とともに含有する。それは、好ましくは、所望の投与に適
し、かつ活性成分と負に相互作用しない、有機または無機の液状の製薬的に適合
可能な担体である。

【００２９】 本発明による医薬調製物は、例えばアンプルなどの単位用量形態として販売さ
れる。

【００３０】 また、本発明は、本発明による化合物が製薬的に適合可能な担体と混合されて
いることを特徴とする、医薬組成物を製造する方法に関する。

【００３１】 「ＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａリガンドの発現を阻害する物質」は、好ましく
は、例えば、ＣＤ６６ａおよび／またはＣＤ６６ａリガンドに対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドを腫瘍細胞に導入する遺伝子治療により投与される。これ
らのオリゴヌクレオチドは、ＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａリガンドの既知の配列
に由来する（ヒノダ（Ｈｉｎｏｄａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ ＵＳＡ ８５， Ｓ．６９５９（１９８８））。また、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、遺伝子のｍＲＮＡ領域に相補的であり、かつそれに結合するＤ
ＮＡの大きさに達する。次いで、ｍＲＮＡの翻訳が抑制された（ｅｎｔｚｏｇｅ
ｎ）二本鎖分子が形成される。遺伝子発現の阻害は、このようにして行うことが
できる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ＣＤ６６ａ ＲＮ
ＡまたはＣＤ６６ａリガンドＲＮＡの領域に相補的な任意のＤＮＡまたはＲＮＡ
分子、特にｍＲＮＡ、最も特別にはその調節エレメントを包含し、これらの領域
への結合により遺伝子発現の阻害をもたらす。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、そのまま利用可能であり得、または、それらが比較的長い場合は、それらを
コードする、「ミニ遺伝子」といわれることもあるベクターまたはベクター構築
物の形態でも利用可能であり得る。このようなベクターは、通常の発現ベクター
であってもよい。それらをコードする配列の発現は、組織特異的プロモーターま
たは腫瘍特異的プロモーターなどの構成プロモーターまたは誘導プロモーターに
より制御されることが好ましいこともある。アンチセンス分子は通常の方法によ
り導入される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのままでも、それらをコ
ードするベクターの形態でも利用可能であり、例えば、トランスフェクション技
術またはリポソームに封入することが好適である。

【００３２】 「ＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａリガンドの発現を誘導する物質」は、例えば、
ＣＤ６６ａもしくは新脈管形成において活性なＣＤ６６ａ断片またはＣＤ６６ａ
リガンドもしくは新脈管形成において活性なリガンド断片をコードするＤＮＡ分
子である。発現は適当な調節配列により制御される。ＤＮＡは、遺伝子治療の分
野の当業者に既知のプロトコルに従って投与する。したがって、例えば、ウイル
ス粒子（例えば、アデノウイルス）へのＤＮＡのパッケージングまたは裸のプラ
スミドＤＮＡの投与が論ぜられる。

【００３３】 本発明によれば、身体のすべての固形腫瘍の成長は、新脈管形成阻害性医薬組
成物により阻害しうる。例は、上皮腫瘍（例えば、鱗状上皮、円柱上皮、腺上皮
、移行上皮）、間葉腫（例えば、線維、筋肉、軟骨および骨組織）、混合腫瘍
（混合上皮、混合間葉、上皮間葉）、造血組織およびリンパ組織の腫瘍（骨髄、
リンパ組織）、漿液性腔の腫瘍（例えば、肺胸膜、心膜、腹膜、滑膜）、神経系
の腫瘍（例えば、神経節細胞、感覚上皮、神経膠（Ｎｅｒｏｇｌｉａ）、髄膜、
交換神経系、末梢神経）、消化管の腫瘍および個々の臓器の腫瘍である。気管支
および肺、胸部、肝臓、胆汁、膵臓、腎臓および尿管、胃、大腸、直腸、前立腺
ならびに子宮の腫瘍の成長は、本発明に好適である。

【００３４】 本発明によれば、新生血管形成は、血管の疾患依存性閉塞により組織への酸素
および栄養分の供給が不十分となる疾患において、新脈管形成促進性医薬組成物
により誘導しうる。心臓疾患または糖尿病患者、ヘビースモーカーもしくは高血
圧を患う患者における四肢への不十分な血液供給が、例としてあげられる。

【００３５】 本発明を以下の実施例によって、より詳細に説明する。

【００３６】実施例１ 腫瘍毛細血管におけるＣＤ６６ａの局在化 モノクローナル抗ＣＤ６６ａ抗体４Ｄ１／Ｃ２を用いて免疫組織化学的に腫瘍
を染色して、光学顕微鏡によって調べた。この目的のために、以前に使用した免
疫組織化学法〔Ｐｒａｌｌら（１９９６）、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ．４４、３５−４１〕に加えて、ニッケルおよびグルコースオキシダー
ゼを用いて増強する方法を使用した。さらにモノクローナル４Ｄ１／Ｃ２抗体を
用いた免疫組織化学的染色に続き、電子顕微鏡解析を行なった（図１を参照のこ
と）。

【００３７】 ヒト精巣腫瘍、脳腫瘍、並びに前立腺癌、膀胱癌および腎臓癌を免疫組織化学
的に検査した。ＣＤ６６ａは、内皮細胞に、および腫瘍毛細血管の基底膜に局在
した。試験した臓器の成熟した非増殖静止血管は陰性であった。腫瘍が機能的な
面、すなわち、腫瘍細胞、腫瘍縁および腫瘍環境に従って異なるゾーンに分かれ
る場合、正の免疫応答が、腫瘍マージン上で新しく形成された腫瘍毛細血管に見
出されうる。これは、新生血管形成〔新生脈管形成（Ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅ
ｓｅ）〕の非常に初期の段階でのＣＤ６６ａの機能を示す。

【００３８】実施例２ 培養した内皮細胞の増殖および走化性に関するＣＤ６６ａの効果 培養した内皮細胞の増殖および走化性に関するＣＤ６６ａの効果を試験するた
めに、ヒト顆粒球の膜画分から糖タンパク質を精製した。確立された方法〔Ｄｒ
ｚｅｎｉｅｋら（１９９１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５６、１７３−
１７９；Ｓｔｏｆｆｅｌら（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０、４９７
８−４９８４〕に従って、膜画分を単離した。非イオン性界面活性剤で膜の糖タ
ンパク質を抽出した後、固定化したモノクローナルＣＤ６６抗体にそれを結合し
て、グリシン−ＨＣｌを用いてｐＨ２．２で溶出した。中和した後、溶出液をＳ
ｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲルクロマトグラフィーによ
ってさらに分離した。ＣＤ６６ａ陽性画分をプールした。１００ｋＤを除外する
フィルターを用いる限外ろ過により、低分子領域の汚染物質を分離した。ウエス
タンブロットと組み合わせて、銀ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上清はＣＤ
６６ａのみを含むことが示された。この画分を、内皮細胞を用いる細胞培養実験
で使用した。

【００３９】 ２種の異なるヒト内皮細胞型、すなわちＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）お
よびＨＤＭＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）を用いて、実験を行なった。

【００４０】 単層培養で、増殖におけるＣＤ６６ａの効果を調べた。規定の数の微小滴定プ
レートに、内皮細胞を播種した。７２時間後、刺激および非刺激培養での内皮細
胞の数を比較した。ＣＤ６６ａは、用量依存様式で両方の細胞株の増殖を刺激す
ることがわかった。

【００４１】 走化性におけるＣＤ６６ａの効果を２チャンバー培養系（ボイデンチャンバー
と呼ばれる）で調べた。細胞を上のチャンバーで培養した。底のチャンバーは走
化性物質を含む。両方のチャンバーを、細胞の通過が可能なポリカーボネートフ
ィルターにより分離する。底のチャンバーにＣＤ６６ａを添加後、両方の内皮細
胞株で、用量依存性走化性効果を示した。ＣＤ６６ａの効果を、ＶＥＧＦの効果
と比較し得た。図２から明らかなように、ＣＤ６６ａ（＝ＢＧＰ）は、１００ｎ
ｇ／ｍｌの濃度から走化性効果を有する。１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、走化性効
果はＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）のものよりほんのわずか少ないだけである。

【００４２】 ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）と組み合わせて、ＣＤ
６６ａの走化性効果をまた解析した。ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦの走化性の効果は
、ＣＤ６６ａによりそれぞれ約３０％増加した。

【００４３】 ５０、１００、２００、４００および６００ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＤ６６ａ
（＝ＢＧＰ）と共に、培養したヒト微小脈管皮膚線維芽細胞をインキュベートし
た。２００ｎｇ／ｍｌの濃度から、ＣＤ６６ａの増殖増加効果を検出できた。こ
れを図３に示す。

【００４４】 増殖および走化性における陽性効果のために、ＣＤ６６ａは新脈管形成因子の
主な判定基準を満たす。

【００４５】実施例３ 細胞培養における毛細血管様脈管の形成におけるＣＤ６６ａの効果 実施例２で記載された試験結果は、ＣＤ６６ａが原因となって新しい血管の形
成（新生脈管形成）に関与することを示唆する。この仮説を調べるためには、動
物実験が最も適切であろう。しかしながら、ＣＤ６６ａはヒト糖タンパク質であ
るので、種における相違のために、実験動物における効果は発現がないかまたは
わずかな発現を示すのみであることが予期しなければならない。モノクローナル
抗ＣＤ６６ａ ４Ｄ１／Ｃ２抗体がヒト組織で良好な反応を示すという知見は、
この仮説を支持する。ラットおよびマウスの対応する組織で反応は弱く、非特異
的バックグラウンド反応からわずかな困難を伴って識別できる。４Ｄ１／Ｃ２抗
体は、この形態で齧歯類では生じない抗原構造に明らかに結合する。

【００４６】 種に関する相違によって生じる問題を回避するために、ある条件下で内皮細胞
が、新しく形成された毛細血管（管形成）に対応する脈管に成長する細胞培養モ
デルを使用する。この目的のために、結合組織マトリックスで、ＶＥＧＦ（血管
内皮成長因子）またはＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子）等の特定の増殖因子の
存在下に細胞を培養する。この培養型はインビボ条件に対する良好なアプローチ
を表わす。

【００４７】 毛細血管の形成に対するＣＤ６６ａの重要性を調べるために、３次元コラーゲ
ンＩゲルでＨＵＶＥＣおよびＨＤＭＥＣ細胞を培養した。ＶＥＧＦおよびＦＧＦ
−２等の増殖因子の存在下で、内皮細胞は新しく形成された毛細血管に対応する
管状構造を形成する。モノクローナルＣＤ６６ａ抗体４Ｄ１／Ｃ２の存在下で、
脈管の形成は阻害された。ＣＤ６６ａの別のエピトープに対する第２のモノクロ
ーナル抗体は、管の形成に影響しなかった。これらの実験は、ＣＤ６６ａの発現
と毛細血管様脈管の新形成との間の機能的な相関を証明する。ＣＤ６６ａの機能
的なドメインはまた、抗体によって規定される。

【００４８】 上記実験結果を、図４に示す。

【００４９】 新脈管形成因子ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、毛細血管様構造が発
達する（図４ａ参照）。毛細血管様構造は、縦の内皮細胞が平行に配列する管を
経由して現れる。これらの管をフィッシュ スクール（Ｆｉｓｃｈｚｕｅｇｅｎ
）と比較できる。図４ａの中央に、内皮細胞が丸くなる領域がある。それらは、
管ではない。

【００５０】 図４ｂは、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＣＤ６６ａ（１５０ｎｇ／ｍｌ
）の存在下で毛細血管形成を調べた実験の結果を示す。図４ａと比較すると、ほ
とんど全ての内皮細胞は管の形成に関与している。さらに、新脈管形成過程のさ
らなる分化を支持する分岐パターンが見られ得る。したがって、ＣＤ６６ａは、
ＶＥＧＦの新脈管形成効果を強める。

【００５１】 図４ｃでは、ＣＤ６６ａ（３００ｎｇ／ｍｌ）の存在下およびＶＥＧＦの非存
在下で、内皮細胞を培養した。毛細血管様構造が現れる。

【００５２】 図４ｄは、モノクローナル４Ｄ１／Ｃ２抗体の存在下で内皮細胞を培養した実
験の結果を示す。毛細血管の形成は十分阻害される。この実験から、毛細血管形
成に必須であるＣＤ６６ａのドメインに、４Ｄ１／Ｃ２抗体が結合することがわ
かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトライディヒ細胞腫瘍の血管でのＣＤ６６ａの局在化。４Ｄ１
／Ｃ２抗体を用いて免疫組織化学的染色を行なった。 図１ａ：染色した腫瘍毛細血管の１つに矢印をつける（×３５０）。 図１ｂ：図１ａの領域の拡大。矢印は、内皮細胞の染色を示す（×９５０）。

【図２】 ＨＤＭＥＣにおけるＣＤ６６ａ（＝ＢＧＰ）の走化性効果。

【図３】 ＣＤ６６ａ（＝ＢＧＰ）を用いた刺激後のＨＤＭＥＣの増殖。

【図４】 細胞培養での毛細血管様脈管の形成におけるＣＤ６６ａの効果。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 エアギュン，ジュレイマン ドイツ連邦共和国 ハンブルク デー− 20251 マルティーニシュトラーセ 52， ウニヴェルジテーツ−クランケンハウス エッペンドルフ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA13 AA17 BA44 MA01 NA14 ZB262 ZC412 4C085 AA14 CC32 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC41

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）正の調節のために、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ａフラグメ
   ントまたはＣＤ６６ａに由来する糖構造、またはＣＤ６６ａリガンド、リガンド
   フラグメントあるいはそれらに由来する構造、ならびにＣＤ６６ａまたはＣＤ６
   ６ａリガンドの発現を誘導する物質の１またはそれ以上の成分、または （ｂ）負の調節のために、ＣＤ６６ａとＣＤ６６ａリガンドとの相互作用を阻害
   する物質またはＣＤ６６ａもしくはＣＤ６６ａリガンドの発現を阻害する物質の
   １またはそれ以上の成分、 を含有する新脈管形成に影響を及ぼす医薬組成物。
2. 【請求項２】 ＣＤ６６ａとＣＤ６６ａリガンドとの相互作用を阻害する物
   質が、ＣＤ６６ａまたはそのリガンドの１またはそれ以上の機能的ドメインに特
   異的に結合する抗体、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする、請求
   項１（ｂ）記載の組成物。
3. 【請求項３】 抗体が抗ＣＤ６６ａ抗体であることを特徴とする、請求項２
   記載の組成物。
4. 【請求項４】 抗体が、１９９８年１０月２２日にＤＳＭ ＡＣＣ２３７１
   の下でＤＳＭＺブラウンシュワイクに寄託されたモノクローナル抗ＣＤ６６ａ
   抗体４Ｄ１／Ｃ２であることを特徴とする、請求項３記載の組成物。
5. 【請求項５】 ＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａリガンドの発現を阻害する物質
   が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡであることを特
   徴とする、請求項１（ｂ）記載の組成物。
6. 【請求項６】 肺ガン、乳ガンおよび大腸ガンの腫瘍新脈管形成を停止しう
   ることを特徴とする、請求項１（ｂ）〜５いずれかに記載の組成物。
7. 【請求項７】 ＣＤ６６ａまたはＣＤ６６ａリガンドの発現を誘導する物質
   が、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ａアイソフォームまたはＣＤ６６ａフラグメントをコ
   ードするＤＮＡであることを特徴とする、請求項１（ａ）記載の組成物。