JPH09500381A - トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経作用剤融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、血液脳関門を通過して宿主の脳へ神経作用剤を送達する方法に関する。この方法は、リガンド−神経作用剤融合タンパク質の治療上有効量を宿主に投与することを含む方法であって、該リガンドは脳毛細血管内皮細胞受容体に対し反応性を有するものである。本発明の他の側面は、脳毛細血管内皮細胞受容体に対し反応性を有するリガンドであって神経作用剤と融合タンパク質を形成したものを含有する送達システムを含んでいる。この融合タンパク質も本発明の側面である。

Description

【発明の詳細な説明】トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経作用剤融合タンパク質 背景技術 脳の組織に血液を供給する毛細血管は血液脳関門を構成している［ゴールドス テインら（Goldstein et al.）、Scientific American 255:74-83 (1986)；パー トリッジ（Pardridge，W.M．）、Endocrin．Rev．7:314-330（1986）］。脳毛細 血管を形成している内皮細胞は他の生体組織に存在する内皮細胞と異なっている 。脳毛細血管内皮細胞は、血液から脳への物質の受動移動を妨げる連続的な壁を 形成する強固な細胞間接合によって結合し合っている。これらの細胞は、他の組 織中ではやや非選択的な毛細血管壁通過移動を許容する飲小胞をほとんど持って いないという違いもある。また、無制限の通過を許容する細胞に沿って走行する 連続的なギャップやチャンネルも欠いている。 血液脳関門は脳の環境が常にコントロールされるように機能する。ホルモン、 アミノ酸、およびイオンなど様々な物質の血中値は、食事や運動などの活動によ って引き起こされる小さな変動を示すことが多い［ゴールドステインら（Goldst ein et al.、同上）。脳が血液脳関門によってこれらの血清組成変動から保護さ れないと、神経活動のコントロールが効かなくなる。 血流からの脳の分離は不十分である。栄養素が不足することと脳以外の生体部 分と化学物質を交換する必要があることから、そのような場合には脳は正しく機 能することができなくなる。毛細血管内皮細胞内に特異的輸送系が存在するので 、脳はコントロールされた状態で正常な成長と機能に必要なすべての化合物を受 け取ることができる。多くの場合、これらの輸送系は、それぞれのリガンドと結 合すると細胞に取り込まれる膜関連受容体から成る［パートリッジら（Pardridg e，W.M．、同上）。次いで、受容体−リガンド複合体を含む小胞が内皮細胞の管 腔から離れた表面に移動し、リガンドが遊離される。 血液脳関門は治療剤として有用である可能性のある多くの物質を脳保護の過程 で排除してしまうという問題がある。現在では、十分な脂肪親和性を有する物質 だけが血液脳関門を通過できるとされている［ゴールドステインら（Goldstein et al. ）、上記；パートリッジ（Pardridge，W.M．）、上記］。一部の薬物は変 性させて脂肪親和性を高めることで、血液脳関門通過能力を向上させることがで きるが、変性は各薬物ごとに個別に試験しなければならず、変性が薬物活性を変 化させてしまうこともある。変性は、化合物が脳毛細血管内皮細胞の膜だけでな くすべての細胞膜を通過する能力を高めてしまうという非常に普遍的な作用を示 すこともある。発明の概要 本発明は、血液脳関門を通過して宿主の脳に神経作用剤を 送達する方法に関する。本発明の方法は、リガンドが脳毛細血管内皮細胞受容体 に対して反応性を示すリガンド−神経作用剤融合タンパク質を宿主に投与するこ とを含む。該融合タンパク質のリガンドは、脳毛細血管内皮細胞受容体またはそ の受容体結合性断片に結合しうる無傷のリガンドである。あるいは、このリガン ドは、脳毛細血管内皮細胞受容体に対して反応性を示す抗体またはその免疫反応 性断片であってもよい。融合タンパク質の神経作用剤は、タンパク質、ポリペプ チドまたはペプチドである。融合タンパク質は、脳毛細血管内皮細胞上の受容体 へのリガンド結合が起き、神経作用剤が薬学的に活性な形でかつ治療上有効な量 で血液脳関門を通過して送達される条件下で投与される。 本発明はまた、リガンドが脳毛細血管内皮細胞受容体に対して反応性を示すリ ガンド−神経作用剤融合タンパク質を含む送達システムにも関する。この送達シ ステムは、融合タンパク質がイン・ビボで投与されたときに、神経作用剤を薬学 的に活性な形で血液脳関門を通過して輸送する。本発明はまた、リガンド結合性 と神経作用剤としての性質を併せ持つ融合タンパク質そのものにも関する。 脳毛細血管内皮細胞受容体リガンドおよびそれ自体が脳毛細血管内皮細胞受容 体と反応性を示す抗体またはその免疫反応性断片を含む融合タンパク質も本発明 の対象である。これらの対象においては、切断可能または切断不可能なリンカー によって神経作用剤を融合タンパク質にコンジュゲート化することにより、これ らの剤を血液脳関門を通過して輸送する ことができる。本発明はまた、これらの融合タンパク質を含む送達システムおよ び融合タンパク質−神経作用剤コンジュゲートを治療上有効な量で宿主に投与す ることによって、神経作用剤を薬学的に活性な形で血液脳関門を通過させて送達 する方法にも関する。 現在利用できる神経作用剤脳送達手段は侵襲的であるという限界がある。一方 、本発明の送達システムは非侵襲的であって、脳毛細血管内皮細胞受容体に対し て反応性を示す容易に入手可能なリガンドを神経作用剤の担体として利用するこ とができる。本発明の送達システムは、神経作用剤との融合タンパク質の一部と してリガンドを形成した場合に、神経作用剤が血液脳関門の脳側に到達する前に 遊離されやすくすることなく血液脳関門を通過して神経作用剤を輸送しうるとい う有利性がある。本発明の送達システムは、神経作用剤が切断不能結合によって 融合タンパク質にコンジュゲート化される場合にも同様に有利である。図面の簡単な説明 図１は、ラットにおけるラット・トランスフェリン受容体に対する¹⁴Ｃ標識ネ ズミモノクローナル抗体（ＯＸ−２６）のラット脳内取り込みを表す図であって 、脳当たりおよび血液５５μｌ当たりの放射標識抗体の％注射用量を注射後の時 間に対してプロットしたものである。 図２は、脳実質と脳血管の間の放射標識ＯＸ−２６の分布 における時間依存性の変化を示すヒストグラムである。 図３は、サイノモルグス種サルにおける抗体１２８．１と対照ＩｇＧの生体内 分布を示すヒストグラムである。 図４は、細菌プラスミドｐＡＴ３４４２の制限酵素地図であって、さらにヒト ＩｇＧ３遺伝子領域およびトランスフェリン遺伝子領域をも示す。 図５Ａは、クローンｐＡＴＸのＣＨ１−ヒンジ−トランスフェリン領域の制限 酵素地図である。 図５Ｂは、クローンｐＡＴＸＸのＣＨ１−ヒンジ−トランスフェリン領域の制 限酵素地図である。 図５Ｃは、クローンｐＡＴＸＸＮＧＦのプレープロＮＧＦ−ヒンジ−トランス フェリン領域の制限酵素地図である。 図６は、ＮＧＦ遺伝子を反対方向に含むクローンｐＵＣＮＧＦ１とｐＵＣＮＧ Ｆ２の制限酵素地図である。 図７は、クローンｐＵＣＮＧＦ２とクローンｐＡＴＸＸＮＧＦ由来の断片を用 いるプラスミドｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴの作成を図示する１セットの制限酵 素地図である。 図８は、クローンＣＤ５１ｎｅｇｌの制限酵素地図である。 図９Ａ−９Ｂは、クローンＣＤ５１ｎｅｇｌのＸｈｏＩ部位とＥａｇＩ部位の 間にあるＤＮＡ配列であって、ＣＤ５リーダーおよびＩｇＧ１のエキソン１、２ 、もしくは３をコードする配列は大きな太い文字で示してある（配列番号：８） 。 図１０は、ヒト胎盤トランスフェリン受容体への結合に際し、組換えヒトトラ ンスフェリンまたはＮＨＴ融合タンパク質と放射活性標識トランスフェリンの間 の競合を示すグラフである。 図１１Ａは、ＰＣ１２細胞からの軸索の伸長に対するＮＧＦの誘導効果を示す グラフである。 図１１Ｂは、ＰＣ１２細胞からの軸索の伸長に対するＮＨＴ融合タンパク質の 誘導効果を示すグラフである。 図１２ＡはプラスミドＤ１およびｄ１の制限酵素地図である。 図１２ＢはプラスミドＣ４およびＣ^* の制限酵素地図である。 図１２ＣはプラスミドＣ４−ＮＨＴの制限酵素地図である。 図１２Ｄはプラスミドｇ^* の制限酵素地図である。 図１２ＥはプラスミドＨ４５の制限酵素地図である。 図１２ＦはプラスミドｇＨの制限酵素地図である。発明の詳細な説明 血液脳関門を通過して宿主の脳に神経作用剤を送達する方法は、リガンドが脳 毛細血管内皮細胞上に存在する受容体に対して反応性を示すリガンド−神経作用 剤融合タンパク質を宿主に投与することを含む。この方法は、リガンドが脳毛細 血管内皮細胞上の受容体に結合し、その神経作用剤が薬学的に活性の形でかつ治 療上有効な量で血液脳関門を通過して送達される条件下で実施される。 リガンド結合性と神経作用剤の特性を併せ持ったリガンド−神経作用剤融合タ ンパク質は、遺伝子工学技術を用いて隣接した一つのタンパク質として製造する ことができる。血液脳関門を通過して送達させようとするタンパク質、ポリペプ チド、またはペプチドをコードするＤＮＡに融合させたリガンドをコードするＤ ＮＡを含む遺伝子構築物を作成することができる。リガンドをコードする配列と 神経作用剤をコードする配列を目的の融合タンパク質の正しい発現に適したやり 方で発現ベクターに挿入する。遺伝子融合物は、リガンド部分と神経作用剤部分 の両者を含む隣接タンパク質分子として発現される。たとえば、ＮＧＦ（神経成 長因子）やＣＮＴＦ（繊毛神経栄養因子）などの神経栄養剤をコードする配列を トランスフェリンをコードする配列と融合させて、発現後にトランスフェリン受 容体を介してＢＢＢを通過して輸送されるキメラポリペプチドを作成することが できる。 リガンドと神経作用剤ＤＮＡコード配列の間にリンカーＤＮＡ配列を挿入する 目的で遺伝子工学技術が使用されることが多い。これらのリンカーＤＮＡ配列は 融合タンパク質の一部として発現させることができる。たとえば、ヒンジ領域を 含む抗体の定常領域の特定のセグメントをリガンドと神経作用剤の間に挿入する ことができる。これらの発現挿入断片は、神経作用剤からリガンドを分離する働 きをするので、発現されたリガンドまたは剤を正しく折りたたんで正しい配座に することを促進するかもしれない。挿入断片が宿主と同系の抗体の定常領域に由 来するセグメントである場合、投与時の免疫原性が低いというさらなる有利性も ある。 宿主は神経障害を受けやすい動物（すなわち脳を持った動物）であってもよい 。宿主の具体例としては、ヒト、家畜（たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ）、マ ウス、ラットなどの哺乳類などが挙げられる。 神経作用剤は、神経障害や中枢神経系の生物学的機能に影響を及ぼす状態に対 して治療効果または予防効果を示す剤であってよい。神経障害の具体例としては 、ガン（たとえば脳 腫瘍）、後天性免疫不全症候群（エイズ）、卒中、てんかん、パーキンソン病、 多発性硬化症などの自己免疫疾患、神経変性病、創傷、うつ、アルツハイマー病 、偏頭痛、疼痛、痙攣障害などが挙げられる。本発明に使用することができる神 経作用剤の種類としては、神経障害を治療または予防する目的で使用されるタン パク質やポリペプチドなどが挙げられる。タンパク質の具体例としては、成長因 子（たとえば神経成長因子（ＮＧＦ））、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由 来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニ ューロトロフィン３、４、および５（ＮＴ−３、４、および５）または繊維芽細 胞成長因子（ＦＧＦ）、リンホカインまたはサイトカイン（たとえばインターフ ェロンやインターロイキン（ＩＬ−２））またはそれらの拮抗剤、ＣＤ４および スーパーオキシドジスムターゼ（その可溶性部分を含む）、ドパミンデカルボキ シラーゼ、およびトリコサンチンなどが挙げられる。ポリペプチドの具体例とし ては、ソマトスタチンアナログとエンケファリナーゼ阻害剤などが挙げられる。 融合タンパク質のリガンドは、脳毛細血管内皮細胞上の受容体に特異的に結合 する能力を有するものであればどのようなポリペプチドやタンパク質であっても よい。これらの受容体は通常、脳血管の内部を裏打ちしている場合はこれらの内 皮細胞の内腔表面上に存在する。とくに好ましいリガンドファミリーはトランス フェリンおよびトランスフェリン受容体結合活性を保持するトランスフェリン誘 導体である。 血清トランスフェリンは循環内の鉄と結合してそれを様々な組織へ輸送する分 子量８０，０００ダルトンのモノマー性糖タンパク質である［アイセンら（Aise n et al.）、Ann. Rev. Biochem. 49:357-393（1980）；マックギリブレイら （MacGillivray et al．）、J．Biol．Chem. 258:3543-3553 (1981)］。個々の 細胞による鉄の取り込みは、ジスルフィド結合で結合している２つの同一の９５ ，０００ダルトンのサブユニットから成る統合膜糖タンパク質であるトランスフ ェリン受容体により媒介される。細胞表面にある受容体の数は細胞増殖と相関し ていると思われ、活発に成長している細胞で最大となり、休止中および最終分化 細胞で最少となる。ジェフリースら（Jeffries et al．）［Nature 312, pp.16 7-168（1984 年11月）］はモノクローナル抗体を用いて、脳毛細血管内皮細胞が その表面上に高密度のトランスフェリン受容体を有していることを示した。 血液脳関門を通過して巨大分子を輸送するエンドサイトーシス過程またはトラ ンスサイトーシス過程をも媒介しうる、トランスフェリン受容体以外の他の受容 体に対してもリガンドが反応性を示すリガンドおよび神経作用剤を含む融合タン パク質を作成することもできる。これらの受容体は脳血管を裏打ちしている内皮 細胞の表面にも存在する。 受容体のタイプとしては、インスリン様成長因子１または２（ＩＧＦ１または ２）やインスリン、および受容体結合活性を保持するこれらのリガンドの誘導体 などがある。リガンドにコンジュゲート化させることができる治療剤としては、 神経成長因子、繊毛神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、スーパーオキシドジス ムターゼ、ＣＤ−４、または抗アミロイド抗体など上記したタンパク質が例示さ れる。 受容体という用語は、受容体全体またはそのリガンド結合部分を指すものとす る。とくに受容体のこれらの部分はリガンドの特異的結合が起きるのに十分な領 域を含む。 脳毛細血管内皮細胞受容体と特異的に結合しうるリガンドとしては、これらの 受容体と結合しうる抗体または抗体断片などが挙げられる。これらの抗体または 抗体断片は名目受容体リガンドと同程度の脳毛細血管内皮細胞受容体結合能力を 有する。抗体が受容体に結合すると、抗体およびそれに付着した剤の血液脳関門 通過移送が起きる。剤は、剤が薬学的に活性な形で血液脳関門を通過して輸送さ れうるようなものであれば、抗体と剤を連結するどのような手段によっても付着 させることができる。好ましい態様においては、付着させた物質が神経作用剤で あって、抗体または抗体断片が剤と融合タンパク質を形成する。これらの態様に おいては、抗体は、トランスフェリンまたはトランスフェリンの受容体結合性誘 導体などの名目リガンドに置換している。 別の態様においては、脳毛細血管内皮細胞受容体に対して免疫反応性を示す抗 体または抗体断片と、脳毛細血管内皮細胞上の同タイプまたは異なるタイプの受 容体に対して反応性を示す第２のリガンドとを連結して、融合タンパク質を作成 する。第２のリガンドは第２の抗体であってもよいが、トランスフェリン、ＩＧ Ｆ１、ＩＧＦ２、またはインスリンなど の名目リガンドであることがより好ましい。逆に、融合タンパク質の２つのリガ ンドは２つの名目リガンドであってもよい。これらの融合タンパク質は、リガン ドを１つしか持たない本発明の融合タンパク質と比べて、脳毛細血管内皮細胞受 容体との相互作用を２倍も起こしやすいという有利性がある。これらの融合タン パク質は、遺伝的または化学的コンジュゲート化によって神経作用剤に連結させ 、薬学的に活性な形でこれらの剤を血液脳関門を通過して移送させることができ る。 抗体と第２のリガンドを含む融合タンパク質を使用すると、血液脳関門を通過 して移送させることができる神経作用剤の範囲が大幅に広がる。タンパク質やポ リペプチド以外で融合タンパク質に連結できる物質としては、脳すなわち中枢神 経系（ＣＮＳ）の疾患を治療または予防する目的に使用される抗生物質、アドレ ナリン作働剤、抗痙攣剤、ヌクレオチドアナログ、化学療法剤、抗炎症剤、およ び抗創傷剤などが挙げられる。抗生物質の具体例としては、アンフォテリシンＢ 、硫酸ゲンタマイシン、およびピリメタミンなどが挙げられる。アドレナリン作 働剤（遮断剤を含む）の具体例としては、ドパミンとアテノロールなどが挙げら れる。化学療法剤の具体例としては、アドリアマイシン、メトトレキセート、シ クロホスファミド、エトポシド、およびカルボプラチンなどが挙げられる。使用 可能な抗痙攣剤の１例としてはバルプロエートが挙げられ、使用可能な抗創傷剤 の１例としてはスーパーオキシドジスムターゼが挙げられる。使用可能なヌクレ オチドアナログとしては、アジドチミジン（以下ＡＺＴと略称する）、ジデオキ シイノシン（ｄｄＩ）、およびジデオキシシトジン（ｄｄＣ）などが挙げられる 。抗炎症剤の具体例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と形質転換成長因子（Ｔ ＧＦβ）などが挙げられる。 神経作用剤は、化学的コンジュゲート化技術を用いて抗体−第２リガンド融合 タンパク質に連結することができる。一般に、この連結はアミンまたはスルフヒ ドリル基を介して行なわれる。神経作用剤がネイティブな形で遊離された方がよ り効果的であるかどうか、また、融合タンパク質に連結された状態で剤の薬学的 活性が維持できるかどうかによって、連結は切断可能な連結であってもよいし、 切断不可能な連結であってもよい。切断可能連結と切断不能連結のどちらを使用 するかの判断は、ネイティブ形と連結形の両者における薬物の活性を測定すれば 、余計な実験を行なわなくても判断することができ、一部の薬物では、ネイティ ブ形と連結形の両者の形の薬物の既知活性に基づいて判断することができる。 タンパク質剤またはペプチド剤を脳に送達する場合、そのタンパク質剤または ペプチド剤の生物活性部分が融合タンパク質への付着による影響を受けないので あれば、遊離タンパク質またはペプチドの放出は必要でない場合がある。その結 果、切断不能リンカーを用いて抗体−タンパク質または抗体−ペプチドのコンジ ュゲートを構築することができる。 これらの態様に使用できる切断不能リンカー系の具体例としては、カルボジイ ミド（ＥＤＣ）系、スルフヒドリル−マ レイミド系、および過ヨウ素酸塩系などが挙げられる。カルボジイミド系におい ては、水溶性カルボジイミドがタンパク質上のカルボン酸基と反応してカルボキ シル基を活性化する。カルボキシル基は第２のタンパク質のアミノ基に結合する 。この反応の結果、２つのタンパク質の間に切断不能アミド結合ができる。 スルフヒドリル−マレイミド系においては、トラウト試薬などの化合物を用い て、スルフヒドリル基を上記タンパク質のうちの１つのもののアミン基に導入す る。もう１つのタンパク質をＮＨＳエステル（ガンマ−マレイミド酪酸ＮＨＳエ ステル（ＧＭＢＳ）など）と反応させて、スルフヒドリル基に対して反応性を示 すマレイミド誘導体を作成する。次いで、これら２つの修飾タンパク質を反応さ せて、切断不能な共有結合を形成させる。 過ヨウ素酸塩カップリングには、融合タンパク質担体または送達させたいタン パク質のいずれかの上にオリゴ糖基が存在している必要がある。これらの基が送 達させたいタンパク質の上にある場合（たとえばセイヨウワサビペルオキシダー ゼ（ＨＲＰ）の場合）、送達させたいタンパク質の上に担体上のアミノ基と反応 しうる活性アルデヒドを形成する。また、抗体分子上に存在する炭水化物基から 活性アルデヒド基を形成することもできる。次いで、これらの基を、送達させた いタンパク質の上のアミノ基と反応させて、安定なコンジュゲートを作成するこ とができる。あるいは、過ヨウ素酸塩で酸化した抗体を送達させたいタンパク質 のヒドラジン誘導体 と反応させて安定なコンジュゲートを得ることもできる。 切断可能リンカーは、脳内に沈着させたい神経作用剤を結合させる目的に、あ るいは切断不能リンカーが神経作用剤の活性を変化させる場合に、これを用いる ことができる。切断可能リンカーの具体例としては、１９８９年２月６日出願の 同時継続特許出願番号第０７／３０８，９６０に記載の酸不安定リンカーなどが 挙げられるが、該出願の内容も引例により本願に含まれるものとする。酸不安定 リンカーとしては、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ ネート（ＳＰＤＰ；Pharmacia 社）などのジスルフィド類、シス−アコニット酸 、シス−カルボキシリックアルカジエン類、シス−カルボキシリックアルカトリ エン類、およびポリ−無水マレイン酸が挙げられる。他の切断可能リンカーとし ては、一級アルコール基に付着する能力を有するリンカーが挙げられる。切断可 能結合を介して結合させることができる神経作用剤の具体例としては、ＡＺＴ、 ｄｄＩ、ｄｄＣ、アドリアマイシン、アンフォテリシンＢ、ピリメタミン、バル プロェート、メトトレキセート、シクロホスファミド、カルボプラチン、および スーパーオキシドジスムターゼなどが挙げられる。タンパク質を抗体に結合させ るのに一般に使用される切断不能リンカーは、他の神経作用剤を抗体に結合させ る目的にも使用することができる。 ＳＰＤＰは、モノクローナル抗体または神経作用剤のいずれかにチオール反応 性基を導入するヘテロ二官能性架橋試薬である。チオール反応性基は遊離のスル フヒドリル基と反応 して、ジスルフィド結合を形成する。 共有結合以外にも、二官能性抗体とで形成される結合、イオン結合、水素結合 、疎水性相互作用などの非共有結合を利用してコンジュゲートを形成させること ができる。コンジュゲートが血液脳関門を通過するのに十分な程度にコンジュゲ ート結合が強固であることが重要な点である。 本発明の範囲内で使用することができる抗体は、脳毛細血管内皮細胞上の受容 体に対して反応性を示す抗体である。抗体という用語は、ポリクローナル抗体と モノクローナル抗体の両者を包含するものとする。抗体としては、トランスフェ リン受容体などの脳毛細血管内皮細胞受容体に対して反応性を示すモノクローナ ル抗体が好ましい。抗体という用語は、トランスフェリン受容体に対して反応性 を示す複数抗体の混合物（たとえばトランスフェリン受容体反応性の異なるタイ プのモノクローナル抗体の混合物）であって、それぞれが神経作用剤または他の リガンドと連結されて融合タンパク質を形成するものも含むものとする。抗体と いう用語はさらに、抗体全体、その生物学的機能を有する断片、および複数の種 由来の部分や二官能性抗体などを含むキメラ抗体をも包含するものとする。使用 可能な生物学的機能を有する抗体断片とは、脳毛細血管内皮細胞受容体への抗体 断片の結合が起きるのに十分な断片をいう。 キメラ抗体は、２つの異なる種（たとえばヒト定常領域およびネズミ可変領域 または結合領域）に由来する部分を含むものであってよい。２つの異なる種に由 来する部分は従来技 術を用いて化学的に結合させることができる。また、遺伝子工学技術を用いて融 合タンパク質として作成することもできる。また、キメラ抗体の軽鎖部分と重鎖 部分の両者のタンパク質をコードするＤＮＡを融合タンパク質としてまとめて発 現させることができる。 そのようなキメラ抗体は、本発明の融合タンパク質の一部として容易に応用す ることができる。可変領域コード配列を含むＤＮＡを神経作用剤コード配列含有 ＤＮＡに融合させた後で融合タンパク質として発現させることができる。同様に 、可変領域コード配列を含むＤＮＡを第２のリガンドのコード配列を含むＤＮＡ に融合させることも、そのような融合タンパク質の発現が所望であれば可能であ る。２つの異なる種に由来する定常領域部分と可変領域部分を含むキメラ抗体は 、定常領域コードＤＮＡの特定部分の後ろに神経作用剤をコードするＤＮＡまた は別のリガンドをコードするＤＮＡを挿入することによって、本発明の融合タン パク質に容易に変換することができる。したがって、続いて発現された融合タン パク質は、１つの種に由来する可変領域と、別の種に由来する定常領域の所望部 分と、第２のリガンドまたは血液脳関門を通過して送達させたい剤を含んでいる 。 少なくともトランスフェリン受容体の一部分に対して反応性を示すモノクロー ナル抗体を得ることができる（たとえば０Ｘ−２６、Ｂ３／２５［オマリーら（ Omary et al.）、Nature 286:888-891 (1980)］、Ｔ５６／１４［ガッターら（ Gatter et al．）、J．Clin．Path. 36:539-545（1983）； ジェフリースら（Jeffries et al．）、Immunology 54:333-341（1985）］、Ｏ ＫＴ−９［スザーランドら（Sutherland et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 78 :4515-4519 (1981) ］、Ｌ５．１［ロベラ（Rovera，C.）、Blood 59:6 71-678（1982）］、５Ｅ−９［ハイネスら（Haynes et al. ）、J．Immunol．12 7: 347-351 (1981)］、ＲＩ７ ２１７［トロウブリッジら（Trowbridge et al． ）、Proc．Natl．Acad．sci．USA 78:3039 (1981)］、およびＴ５８／３０［オ マリーら（Omary et al.）、同上］）。あるいは、体細胞ハイブリダイゼーショ ン技術［コフラーとミルステイン（Kohler and Milstein ）、Nature 256:495- 497 (1975)］やその他の技術を用いて製造することもできる。典型的なハイブリ ダイゼーション手順では、少なくともトランスフェリン受容体の一部分を含む粗 製または精製タンパク質またはペプチドを免疫原として使用することができる。 この免疫原で動物をワクチン処理して、抗トランスフェリン受容体抗体−産生脾 臓細胞を得る。免疫される動物の種は目的のモノクローナル抗体の種類によって 異なる。抗体産生細胞を不死化細胞（たとえば骨髄腫細胞）と融合させて、抗ト ランスフェリン受容体抗体を分泌する能力を有するハイブリドーマを作成する。 未融合のまま残った抗体産生細胞と不死化細胞を除去する。従来技術を用いて抗 トランスフェリン受容体抗体産生ハイブリドーマを選択し、選択した抗トランス フェリン受容体抗体産生ハイブリドーマをクローン化し、培養する。類似の体細 胞ハイブリダイゼーション技術を用いて、他の脳毛細血管内 皮細胞受容体に対して反応性を示すモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー マを作製することができる。 少なくともトランスフェリン受容体または別の脳毛細血管内皮細胞受容体の一 部分を含む粗製または精製タンパク質またはペプチドで動物を免疫することによ ってポリクローナル抗体を作成することができる。動物は、トランスフェリン受 容体に対して反応性を示す抗体が産生される条件下に維持される。目標の抗体価 に到達したら、動物から採血する。ポリクローナル抗体を含む血清（抗血清）を 他の血液成分から分離する。得られたポリクローナル抗体含有血清は、特定タイ プの抗体の画分（たとえばＩｇＧ、ＩｇＭ）へとさらに分けてもよい。 リガンド−神経作用剤融合タンパク質またはコンジュゲートは経口投与しても よいし、皮下注射またはその他の注射方法によって投与してもよいし、静脈内投 与、動脈内投与、筋肉内投与、非経口投与、経皮投与、経鼻投与、または直腸投 与することができる。コンジュゲートが投与される剤型と濃度（たとえばカプセ ル剤、錠剤、液剤、乳剤）は、少なくとも一部は投与経路に依存する。 リガンド−神経作用剤融合タンパク質またはコンジュゲートの治療上有効な量 とは、特定の神経障害に関連する症状を有意に軽減または除去するのに必要な量 をいう。治療上有効な量は個体ごとに決定され、少なくとも一部は個体のサイズ 、治療対象症状の重篤度、目標とする成績、特異的リガンドなどを考慮した上で 決定される。したがって、治療上有効な 量は、普通の熟練者が上記因子を用いて常法により決定することができる。 以下、本発明を実施例により説明する。 実施例１：ヒト脳内皮細胞へのネズミモノクローナル抗体の イン・ビトロ結合 トロウブリッジによって記載された［トロウブリッジ（Trowbridge）、１９８ ４年２月２８日付与の米国特許第４，４３４，１５６号およびNature 294, pp ．171-173（1981）に記載のもの］２種類のネズミモノクローナル抗体Ｂ３／２ ５とＴ５８／３０はヒトトランスフェリン受容体を認識するが、これらにつき、 ヒト脳毛細血管内皮細胞への結合能力を調べた。なお、いずれの文献の内容も引 例により本願に含まれるものとする。Ｂ３／２５抗体とＴ５８／３０抗体を産生 するハイブリドーマ細胞株をメリーランド州Rockville のAmerican Type Cultur e Collection（ＡＴＣＣ）から入手し、２．０ｍＭのグルタミン、１０．０ｍＭ のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１００μＭの非必須アミノ酸、および１０％の熱 不活化ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地で増殖させた。２２５ｃｍ²のＴフラ スコ中でハイブリドーマ培養をスケールアップし、ミリグラム量のＩｇＧ抗体を 製造した。真空透析法によりハイブリドーマ上清を５０倍に濃縮し、BioRad社の ＭＡＰＳ緩衝液系を用いるタンパク質Ａセファロースカラムに通した。精製抗体 をカラムから溶出させ、０．１Ｍのリン酸 ナトリウム（ｐＨ８．０）に対して透析し、濃縮し、一定量を−２０℃で保存し た。 コンフルーエンシー到達後５日目まで平底９６穴プレートでヒト脳内皮細胞の 一次培養物を培養した。次いで、細胞を３．０％緩衝化ホルマリンで固定し、ド ゥルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中でプレートを１．０％のウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。次いで、培養上清または精製タンパク質 のいずれかの形でＢ３／２５またはＴ５８／３０抗体の一定量（１００μｌ）を ウエルに添加した（抗体濃度は１〜５０μｇ／ｍｌの範囲であった）。ビオチン 標識ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清、次いでビオチン化セイヨウワサ ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／アビジン混合物（アビジン・ビオチン複合体法 ）を用いて、固定細胞に特異的に結合した抗体を検出した。陽性ウエルは、Tite rtek社のマルチスキャン酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダ ーを用いて判定した。その結果、どちらの抗体もヒト脳毛細血管内皮細胞に結合 するが、Ｔ５８／３０抗体の方が高い結合レベルを示すことがわかった。 新鮮凍結させ（固定なし）、クリオスタット上で薄切片を作成し（切片厚みは ５〜２０μｍ）、スライドガラスにのせ、アセトン中で固定した（室温で１０分 ）ヒト脳組織切片を用いて、上記と同じ抗体のヒト脳内皮細胞への結合も試験し た。次いで、これらの切片を使用するまで−２０℃で保存した。 ヒト脳切片を封入したスライドガラスは、室温に戻してか ら使用した。次いで、切片をＤＰＢＳ中で再水和させ、０．３％Ｈ₂ Ｏ₂ 含有メ タノール中でインキュベートして、内生ペルオキシダーゼ（peroxidate）活性を ブロックした。切片は、０．２％の無脂肪乾燥ミルクと０．２％のメチルマンノ ピラノシドを含む溶液中で１５分間ブロックした。上記したようにして精製した Ｂ３／２５およびＴ５８／３０抗体を５〜５０μｇ／ｍｌ濃度で切片に添加し、 室温で１〜２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡアッセイについて上記したよ うなアビジン・ビオチン複合体（ＡＢＣ）を用いて、組織に特異的に結合した抗 体を検出した。ヒト脳切片中の毛細血管の染色性をＢ３／２５抗体とＴ５８／３ ０抗体も両者について観察した。Ｔ５８／３０抗体は脳皮質の白色物質に対して 結合を示した。 実施例２：ラットトランスフェリン受容体へのネズミモノクローナル抗体０Ｘ− ２６のイン・ビトロ結合 ラットトランスフェリン受容体を認識する０Ｘ−２６ネズミ抗体は脳毛細血管 内皮細胞に結合することがイン・ビボで示されている［ジェフリースら（Jeffri es et al．、同上）］。０Ｘ−２６ネズミ抗体を産生するネズミハイブリドーマ 株を入手し、このハイブリドーマ細胞株を、２．０ｍＭのグルタミンと１０％の 熱不活化ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。実施例１で 説明したアフィニティークロマトグラフィー法を用いて０Ｘ−２６抗体を精製し た。 精製抗体を、実施例１で抗ヒトトランスフェリン受容体抗体について説明した ようにしてイン・ビトロで試験して、新鮮凍結アセトン固定ラット脳切片中の脳 毛細血管にそれが結合するかどうかを判定した。その結果、０Ｘ−２６抗トラン スフェリン受容体抗体はイン・ビトロでラット脳切片中の毛細血管に結合しない ことが示された。 実施例３：ラットトランスフェリン受容体への０Ｘ−２６ネズミモノクローナル 抗体のイン・ビボ結合用量範囲 精製抗体（実施例１に説明したようにして精製したもの）を雌スプラーグ−ド ーレー系ラット（１００〜１５０ｇｍ）に尾静脈から注射することにより、抗ラ ットトランスフェリン受容体抗体０Ｘ−２６をイン・ビボで試験した。注射に先 立ち、ラットをハロセンで麻酔した。ラット１頭あたり２．０ｍｇないし０．０ ５ｍｇの範囲の抗体を含む試料を４００μｌ量づつ尾静脈に注射した。すべての 用量は２頭づつの動物で試験した。注射１時間後に動物を屠殺し、ＤＰＢＳを心 臓に潅流させて、器官から血流を除去した。潅流完了後ただちに脳を摘出し、液 体窒素中で急速凍結させた。次いで、凍結脳をクリオスタット上で切片化し（３ ０〜５０μｍ）、切片を顕微鏡スライドガラスにのせた。脳切片を室温で１〜２ 時間空気中で乾燥させた後、アセトン中で固定した（室温で１０分）。この処理 の後、切片を−２０℃で保存することが できた。 実施例１でイン・ビトロ実験について説明したようにして免疫組織化学法を用 いて０Ｘ−２６抗体の脳切片中の存在位置を調べた。一次抗体は脳切片中に存在 しているので、その添加は不要であった。得られた結果から、０Ｘ−２６抗体は ラット脳毛細血管内皮細胞に結合すること、およびわずか５０μｇという用量で も、本明細書で説明する方法を用いれば脳中に抗体を検出することができること がわかった。０．５ｍｇを超える用量は内皮細胞への抗体結合を有意に増加させ ないと思われたので、抗体結合部位が飽和している可能性が示唆される。肝臓、 腎臓、心臓、脾臓、肺では毛細血管内皮細胞への特異的結合は検出されなかった 。 ０Ｘ−２６と同じサブクラス（ＩｇＧ ２ａ）の非特異的抗体についてもイン ・ビボで試験したところ、観察されたラット脳内皮細胞への０Ｘ−２６の結合は ０Ｘ−２６抗体に特異的であることが示された。ラット１頭あたり０．５ｍｇの 対照抗体を上記のようにして注射した。この結果から、０Ｘ−２６抗体で観察さ れた染色パターンは該抗体に特異的であることがわかる。経時変化 ０Ｘ−２６抗体がイン・ビボ投与後にラット脳毛細血管中に検出できることが 確認された後で、この結合が起きた時間経過を調べた。０．５ｍｇの精製０Ｘ− ２６抗体を標準用量とし、注射後５分、１５分、１時間、２時間、４時間、８時 間、および２４時間目に屠殺した動物から採取した脳切片に０Ｘ−２６抗体が存 在しているかどうかを調べた。すべての投与は４００μｌ量で行ない、各時点で ２頭づつの動物を調べた。試料を注射し、ラットを、上記用量範囲の項で説明し たようにして注射後様々な時点でラットを処理した。 その結果から、０Ｘ−２６抗体は注射後５分の早くから２４時間の遅くにわた りラット脳毛細血管内皮細胞の中または上に検出できることが示された。注射後 ４〜８時間目には抗体の染色パターンが非常に斑点状になったので、抗体が内皮 細胞または血管周囲細胞中の小胞部分に蓄積したことが示唆される。 実施例４：血液脳関門を通過してセイヨウワサビペルオキシダーゼを移送する目 的での０Ｘ−２６ネズミモノクローナル抗体のコンジュゲートの使用 数種類の治療剤とサイズが似ていること、および酵素アッセイにより脳内検出 が容易にできることから、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；４０ｋＤ ）を脳送達化合物として選んだ。切断不能過ヨウ素酸塩結合を用いてＨＲＰを０ Ｘ−２６抗体にコンジュゲート化し、その抗体が化合物担体として機能する能力 を調べた。抗体コンジュゲートをイン・ビボで調べ、抗体が脳にＨＲＰを送達し うるかどうかを判定した。 まず、抗体（１０ｍｇ）を０．０１Ｍの重炭酸ナトリウム （ｐＨ９．０）に対して一夜透析した。ＨＲＰ（１０ｍｇ）を２．５ｍｌの脱イ オン水に溶解し、０．１Ｍの過ヨウ素酸塩ナトリウム（１６０μｌ）を加え、混 合物を室温で５分間インキュベートした。ＨＲＰ溶液にエチレングリコール（２ ５０μｌ）を加えた後、さらに５分間インキュベートした。次いで、この溶液を １．０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）に対して一夜透析した。透析 した０Ｘ−２６抗体（２．０ｍｌ）５．０８ｍｇ／ｍｌ）に１．０Ｍの重炭酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌと透析後のＨＲＰ溶液１．２５ｍｌを 加えた。この混合物を暗所で２時間インキュベートした後、１０ｍｇ／ｍｌの水 素化ホウ素ナトリウム１００μｌを加えた。生じた混合物を暗所で４℃でさらに ２時間インキュベートした。等量の飽和硫酸アンモニウムを加えることによって タンパク質を溶液から沈殿させ、最少量の水に再懸濁させた。コンカナバリンＡ −セファロースカラム（ＨＲＰとＨＲＰ−抗体コンジュゲートを結合させ、遊離 抗体を通過させるカラム）上のクロマトグラフィーによって混合物から遊離抗体 を分離した。得られた遊離ＨＲＰは、抗体−ＨＲＰコンジュゲートを保持するタ ンパク質Ａ−セファロースカラム上のクロマトグラフィーで分離した。最終生成 物のＨＲＰ／抗体比率は４対１であった。 抗体−ＨＲＰコンジュゲートを用いて、実施例３で説明したものと同じ経時変 化試験を行なった。抗体−ＨＲＰコンジュゲート（０．５ｍｇ）をラット１頭あ たり４００μｌ量で注射した。注射後様々な時点で動物を屠殺し、実施例３で説 明したようにして脳を処理した。抗体ＨＲＰコンジュゲートは、実施例１で説明 したようにして免疫組織化学的に抗体を染色する方法か、脳切片を直接染色して ＨＲＰを検出する方法のいずれかによって脳中の存在位置を調べた。ＨＲＰを検 出するために、まずスライドガラスを放置して室温に戻してから、３０分間メタ ノール中でインキュベートした。次いで、脳切片をＤＰＢＳ中で洗い、ＨＲＰの 基質である３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させた。その結果か ら、０Ｘ−２６抗体ＨＲＰコンジュゲートは未コンジュゲート化抗体と同じ様式 でラット脳毛細血管内皮細胞に結合することが示された。抗体単独の場合に見ら れた注射後４〜８時間目の斑点状染色パターンは抗体コンジュゲートの場合でも 見られたので、このコンジュゲートも血液脳関門の管腔から離れた側にある血管 周囲細胞中に入り込むことができることが示唆される。これらの結果を総合する と、０Ｘ−２６抗体は少なくとも４０ｋＤのタンパク質分子を脳に送達できるこ とがわかる。 実施例５：ネズミモノクローナル抗体０Ｘ−２６によるアドリアマイシンの脳へ のイン・ビボ送達 実施例４で使用したものと類似の切断不能リンカー系を用いて、化学療法剤ア ドリアマイシンを０Ｘ−２６抗体に結合させた。アドリアマイシンを検出できる 抗体および実施例１ですでに説明した抗体担体検出系が入手できたので、抗体担 体の存在位置とアドリアマイシンの脳への送達をモニターする免疫組織化学法の 利用が可能となった。 アドリアマイシンを抗体にコンジュゲート化するために、０．１Ｍの過ヨウ素 酸ナトリウム２００μｌを加えることによって該薬物（１０ｍｇを０．５ｍｌの ＤＰＢＳに溶かしたもの）を酸化した。この混合物を暗所にて室温で１時間イン キュベートした。エチレングリコール２００μｌを加えて反応を停止させた後、 ５分間インキュベートした。０Ｘ−２６抗体（５．０ｍｇを炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９．５）０．５ｍｌに溶かしたもの）を酸化アドリアマイシンに加え、室温で１ 時間インキュベートした。水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌ濃度のもの １００μｌ）を加え、混合物を室温でさらに２時間インキュベートした。ＰＤ− １０カラム上のクロマトグラフィーによって０Ｘ−２６抗体−アドリアマイシン コンジュゲートから遊離アドリアマイシンを分離した。この特定バッチのコンジ ュゲートのアドリアマイシン／０Ｘ−２６抗体のコンジュゲート内比率は２対１ であった。 抗体−アドリアマイシンコンジュゲート０．５ｍｇをラット１頭あたり４００ μｌの量で尾静脈から注射投与することによって、アドリアマイシンを脳に送達 する担体としての０Ｘ−２６抗体の効率を測定した。注射１時間後にラットを屠 殺し、実施例１で説明したようにして脳を処理した。すべての注射は２連で行な った。対照として４００μｌ量の遊離アドリアマイシン４００μｇもラットに注 射した。免疫組織化学的検査を行なって、ラット脳切片中の担体０Ｘ−２６抗体 とアドリアマイシンの両者を検出した。アドリアマイシンの場合、ポリクローナ ルウサギ抗アドリアマイシン抗血清を切片に加えた後、ビオチン化ヤギ抗ウサギ ＩｇＧ抗血清を加えた。次いで、ビオチン化ＨＲＰ／アビジン混合物を加え、Ｈ ＲＰの酵素検出を行なった。 この結果から、０Ｘ−２６抗体とコンジュゲート化アドリアマイシンはどちら もイン・ビボ投与後にラット脳毛細血管内皮細胞に局在化されることがわかる。 遊離アドリアマイシンが脳毛細血管内皮細胞に結合したり、脳に進入することを 示す証拠はない。 カルボジイミド結合を介して結合されたアドリアマイシン−０Ｘ−２６コンジ ュゲートも合成し（薬物／抗体比率１０／１）、イン・ビボで試験した。この実 験の結果は、過ヨウ素酸塩結合抗体−薬物コンジュゲートで得られたものと本質 的に同じであった。いずれの場合も、抗体担体の染色性は極めて強力であり、脳 の全領域の毛細血管において可視化された。この染色性は毛細血管に沿って均一 に分布していた。アドリアマイシンの染色性は担体の染色性より弱かったが、こ れも脳全体の毛細血管に見られた。血液脳関門の脳側に存在する血管周囲細胞中 の蓄積を示唆する斑点状染色パターンが見られた。 実施例６：ネズミモノクローナル抗体０Ｘ−２６による脳へのメトトレキセート のイン・ビボ送達 切断不能カルボジイミド系を用いてメトトレキセートを０Ｘ−２６ネズミモノ クローナル抗体に結合させた。実施例５ですでに説明したものと類似の系を用い て、メトトレキセートと担体抗体の両者の脳毛細血管内皮細胞への送達をモニタ ーした。 メトトレキセートは、活性エステルを経由してネズミモノクローナル抗体０Ｘ −２６に結合させた。すなわち、メトトレキセート（Aldrich 社）８１ｍｇ（０ ．１７８ｍＭ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌに溶かしたＮ−ヒド ロキシスクシンイミド（Aldrich 社）２１ｍｇ（０．１８２ｍＭ）とともに４℃ で攪拌した。この溶液にエチル−３−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド （１８０ｍｇ、ＥＤＣ；０．５２ｍＭ）を加え、反応混合物を一夜攪拌した。１ ０％メタノールのクロロホルム溶液を溶出液として用いてシリカゲル６０（Merc k 社）上でフラッシュクロマトグラフィーを行ない、反応副生成物から粗製エス テルを精製した。精製した活性エステル画分をプールし、濃縮乾固した。エステ ルをＤＭＦ１ｍｌに溶解し、使用するまで−２０℃で保存した。Ａ₃₇₂ （ε₃₇₂ ＝７２００）で求めた活性エステル回収量は５０ｍｇ（５０％）であった。 ０．１Ｍのリン酸塩（ｐＨ８．０）０．９ｍｌに溶かした抗体２．１ｍｇ（１ ４ナノモル）を含む０Ｘ−２６抗体溶液を４℃まで融解した。この抗体溶液を攪 拌しながら、上記のようにして調製した活性エステル１．４μｌ（１４０ナノモ ル）を加えた。４℃で１６時間放置した後、混合物をリン酸 緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いるセファデックスＰＤ−１０カラム（Pharmacia 社 ）上のクロマトグラフィーに付して、コンジュゲートを遊離薬物と分離した。抗 体−メトトレキセートコンジュゲートを含む画分をプールした。抗体および薬物 濃度は、エンドーらによって記述されたように［エンドーら（Endo et al．）、 Cancer Research 48:3330-3335 (1988) ］分光測定法で測定した。最終的に得 られたコンジュゲートは抗体１分子あたり７分子のメトトレキセートを含んでい た。 ２頭のラットのそれぞれに尾静脈からコンジュゲート０．２ｍｇ（４００μｌ 量として）を注射することによって、０Ｘ−２６モノクローナル抗体がメトトレ キセートをラット脳毛細血管内皮細胞に送達する能力をイン・ビボで測定した。 注射１時間後にラットを屠殺し、免疫組織化学試験のために実施例１で説明した ように脳を処理した。脳中のメトトレキセートを検出するために、メトトレキセ ートに対するウサギ抗血清を一次抗体として用いた。次いで、ビオチン化ヤギ抗 ウサギ抗血清をビオチン化ＨＲＰ／アビジン混合物と組み合わせたものを用いて 、ラット脳中のメトトレキセートを可視化した。担体抗体は、すでに述べたよう にして検出した。 これらの実験の結果から、０Ｘ−２６抗体とのコンジュゲートの形のメトトレ キセートは、脳の毛細血管内皮細胞に沿って、またはそれらの中に確かに蓄積す ることがわかる。メトトレキセートで観察された染色性は担体で見られたものと 強度的に同等である。染色は脳の全域に見られ、毛細血管に 沿って均一に分布する。 実施例７：抗体誘導体 ０Ｘ−２６ネズミモノクローナル抗体のＦｃ部分を除去して、これがラット脳 毛細血管内皮細胞への局在化や取り込みを変化させるかどうかを調べた。ペプシ ン消化により０Ｘ−２６抗体のＦ（ａｂ）₂ 断片を無傷のＩｇＧから作成した。 Pierce Chemical 社から入手可能なキットには、該抗体を切段して断片を得るた めの試薬とプロトコルが含まれている。４００μｌ量のＦ（ａｂ’）₂ 断片（０ ．２ｍｇ用量）をラットの尾静脈に注射した。次いで、無傷の抗体について実施 した（実施例２）のと同じ経時変化試験を行なった。ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）₂ 抗血清、次いでビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗血清を用いて免疫組織化学的 にＦ（ａｂ’）₂ 断片を検出した。ビオチン化ＨＲＰ／アビジン混合物を加え、 ＨＲＰ酵素アッセイを用いて抗体複合体を可視化した。その結果から、０Ｘ−２ ６抗体のＦ（ａｂ）₂ 断片はラットの脳の毛細血管内皮細胞と結合することがわ かる。 実施例８：脳組織中の０Ｘ−２６の測定 脳内に蓄積する０Ｘ−２６抗体の量を定量するために、放射活性標識抗体をラ ットの尾静脈から注射した。抗体は既報［クンメル（Kummer，U.）、Methods in Enzymology 121: 670-678 (1986)；モンデラロとルエッケルト（Mondelaro，R.C.，and Rueckert ，R.R．）、J．of Biological Chemistry 250:1413-1421 (1975)］に記載の方 法と実質的に同じ方法で¹⁴Ｃ−無水酢酸または ³Ｈ−スクシニミジルプロピオネ ートのいずれかで標識したが、これらの文献の内容も引例により本明細書に含ま れるものとする。すべての実験で、放射標識化合物は４００μｌのボーラスとし てハロセン麻酔下の雌スプラーグ・ドーレー系ラット（１００〜１２５グラム） の尾静脈に注射し、注射後適当な時点で致死量の麻酔剤を用いて動物を屠殺した 。 ³Ｈ標識ＩｇＧ２ａ対照抗体を¹⁴Ｃ標識０Ｘ−２６抗体とともに注射して、残 留血液による脳内非特異的放射活性の対照とした。注射後適当な時点で動物を屠 殺し、ただちに脳を摘出し、オムニミキサーを用いて０．５％ドデシル硫酸ナト リウム５ｍｌ中でホモジェナイズした。一定量のホモジェネートをソルエン３５ ０（Soluene 350 ）組織溶解剤２ｍｌとともに一夜インキュベートした後、液体 シンチレーション計数を行なった。すべてのデータは１分あたりの崩壊回数（ｄ ｐｍ）として記録した。血液試料を遠心分離して赤血球（放射標識物質に対して 有意な結合を示さない）をペレット化し、液体シンチレーション計数により一定 量の血清に含まれる放射活性を測定した。 注射後様々な時点で脳関連抗体の量を測定し、脳取り込みの薬物動力学的特徴 を調べた。また、血流からのクリアランス速度を求めることができるように、血 液中の標識抗体の量を測定した。この情報は、残留血液による汚染による脳中の 放射活性量を計算するためにも用いた。この計算値を合計値から差し引いて、脳 に特異的に結合する抗体の量を求めた。 注射用量の約０．９％に対応する脳内¹⁴Ｃ標識０Ｘ−２６抗体のピーク値が、 図１に示した様に注射後１時間目と４時間目の間で見られた（値は平均±平均の 標準誤差（ＳＥＭ）で示し、各時点ごとのラットの数は３頭とした）。脳結合放 射活性の量は注射後４〜４８時間目にかけて次第に低下し、その時点で注射用量 の約０．３％の水準で一定になった。０Ｘ−２６抗体の脳内蓄積量は、非標識モ ノクローナル抗体の添加（０．５または２．０ｍｇをボーラス注射）により有意 に低下した。もう１つの対照である ³Ｈ−ＩｇＧ２ａ対照抗体を¹⁴Ｃ−０Ｘ−２ ６抗体とともに注射した。対照抗体は脳内に蓄積せず、脳の血液汚染の指標とな った。 脳内の値とは対照的に、０Ｘ−２６の血中値は注射直後に急激に低下し、図１ に示した様に注射１時間後までに血液５５μｌ（脳と関連する血液の量）中に見 られる注射用量のパーセント値は約０．１６％になった。この数字は、ラットの 総血液量に対する注射用量の約２０％に相当する。血清から全ＩｇＧを抽出した 後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）とオートラジオグラフィーを 行なったが、０Ｘ−２６抗体分解は検出できなかった。したがって、抗体は注射 後４８時間という長時間にわたり血液中で無傷のまま存在することがわかる。 実施例９：脳の実質と毛細血管における０Ｘ−２６の分布 抗トランスフェリン受容体抗体が脳実質に蓄積することを証明するために、標 識０Ｘ−２６を注射した動物から採取した脳のホモジェネートからデキストラン 遠心分離により毛細血管を除去して、脳組織上清と毛細血管ペレットを得た。毛 細血管除去実験はトリグエロら（Triguero et al．）、J．of Neurochemistry 54 :1882-1888（1990）の手順に従って行なったが、該文献の内容も引例により本 明細書に含まれるものとする。実施例８の脳取り込み実験については、放射標識 化合物を４００μｌボーラスとしてハロセン麻酔下の雌スプラーグ−ドーレー系 ラット（１００〜１２５グラム）の尾静脈に注射し、注射後適当な時点で致死量 の麻酔剤を用いて動物を屠殺した。 ³Ｈ標識ＩｇＧ ２ａ対照抗体を¹⁴Ｃ標識０ Ｘ−２６とともに注射して、残留血液による脳内非特異的放射活性の対照とした 。屠殺後、脳を摘出し、氷上に静置した。初回細切後、手動で（８〜１０往復） 、氷冷生理緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭの ＣａＣｌ₂ 、１．２ｍＭのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１．２ｍＭのＭｇＳＯ₄ 、１４．５ｍ ＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＤ−グルコース、ｐＨ７．４）３．５ｍｌ中でホモ ジェナイズした。緩衝液に溶かした２６％デキストラン溶液４ｍｌを加え、ホモ ジェネーションを続けた（３往復）。一定量のホモジェネートを分離し、残りを 揺動バケットローター中７２００ｒｐｍで遠心分離した。生じた上清を慎重に毛 細血管ペレットから分離した。毛細血管ペレット全体と一定量のホモジェネート および上清を２ｍｌのソルエン３５０とともに一夜インキュベートした後、液体 シンチレーション計数を行なった。この方法により、脳ホモジェネートから９０ ％以上の血管組織が除去される［トリグエロら（Triguero et al．）、同上］。 異なる脳画分ごとに含まれる放射活性の相対量の経時変化を比較すると、標識 抗体のトランスサイトーシスが起きたかどうかがわかる。注射後早い時点（３０ 分）および遅い時点（２４時間）における全脳ホモジェネート、脳実質画分、お よび脳毛細血管画分中の０Ｘ−２６の量を図２に示した。図２の値は平均±ＳＥ Ｍで示したもので、１時点あたりのラットの頭数は３頭である。３０分の時点で は、脳実質画分に結合するものよりも、毛細血管画分に結合する放射標識抗体の 量が多い（それぞれ注射用量の０．３６％（％ＩＤ）と０．２３％ＩＤ）。注射 後２４時間目までに分布が逆転し、毛細血管画分（０．１２％ＩＤ）と比べて、 ほとんどの放射活性（０．３６％ＩＤ）は実質画分中に存在している。毛細血管 画分から実質画分への放射標識０Ｘ−２６の再分布は、抗トランスフェリン受容 体抗体が血液脳関門を通過する時間依存性の移動と一致する。 実施例１０：Cynomolgous 種サルにおける抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の 生体内分布と脳取り込み ヒトトランスフェリン受容体上の様々なエピトープを認識 する３２種類のネズミモノクローナル抗体の集合につき、ヒト、サル（cynomolg ous ）、ラット、およびウサギの脳試料から作成した切片中の脳毛細血管内皮細 胞に対して反応性を示すかどうかを、実施例１で説明した免疫組織化学的方法に よって調べた。これらの抗体は、ソーク研究所（Salk Institute）、LaJolla，C A ）のイアン・トロウブリッジ（Ian Trowbrldge）博士から入手したものである 。３２種類の抗体はいずれもヒト脳内皮細胞に対して何らかの反応性を示した。 ２つの抗体はウサギ脳毛細血管と非常に弱く反応し、ラットと反応した抗体はな かった。２１種類の抗体がサル脳毛細血管と反応したが、ヒト脳毛細血管に対し て見られた反応性に匹敵するほど強力な反応性を示した抗体は２種類だけであっ た。本明細書では、これら２つの抗体を１２８．１およびＺ３５．２と称する。 これらの抗体を用いて、２頭の雄cynomolgous 種サルにおける¹⁴Ｃ標識抗ヒト トランスフェリン受容体抗体１２８．１およびＺ３５．２の組織分布と血液クリ アランスを調べた。静脈内カテーテル留置サルの１頭に ³Ｈ標識対照ＩｇＧと同 時に１２８．１およびＺ３５．２を投与した。試験実施中、血液試料を採取して 、循環からの抗体クリアランスを求めた。注射後２４時間目に動物を安楽死させ 、一部の器官と代表的な組織を摘出し、燃焼法によりアイソトープ分布とクリア ランスを測定した。また、脳の異なる領域から採取した試料を、毛細血管除去実 験について実施例９で説明したようにして処理し、抗体が血液脳関門を通過した かどうかを判定した 。毛細血管除去実験は皮質、前頭部皮質、小脳、および線条から採取した試料に 対して行なった。すべての試料は脳実質中の１２８．１またはＺ３５．２の値が ９０％を超えていたので、抗体が血液脳関門を通過したことが示唆される。同じ 試料中の対照抗体の値は５〜１０倍低かった。ｄｐｍ／Ｇ組織の平均脳ホモジェ ネート値を用いると、全脳内で検出された１２８．１のパーセントは注射用量の 約０．２〜０．３％となる。この数字は、注射後２４時間目のラットにおける０ Ｘ−２６の値の０．３〜０．５％に匹敵する。様々な器官について、対照抗体に 対する１２８．１の比率を比較したものを図３に示す。Ｚ３５．２についても同 様の結果が得られた。これらの結果から、１２８．１は対照抗体と比べて選択的 に脳に取り込まれることが示唆される。調べた器官と組織のほとんどにおいて、 対照に対する１２８．１の比率は２未満である。 実施例１１：ＮＧＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン融合遺伝子の構築、Ｎ ＧＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン融合遺伝子の融合タンパク質としての 発現、および融合タンパク質構成要素のアッセイ ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域をＮＧＦとトランスフェリンポリペブチドをつなぐリ ンカーとして用いて、ヒトＮＧＦとヒトトランスフェリンから成る融合タンパク 質を構築した。アミノ酸約６０個分の長さと複数のシステイン残基を有するＩｇ Ｇ３ヒンジ領域を、ＮＧＦおよびトランスフェリンポリペプチドをつなぐコネク ターとして選んだ。この免疫グロブリンヒンジ領域内でジスルフィドが形成され る可能性があるので、ＮＧＦポリペプチドをダイマー化してよりネイティブなＮ ＧＦ配置へと変換される可能性が増大するものと考えられた。ＮＧＦ遺伝子挿入用細菌ベクターの作成 細菌プラスミドｐＡＴ３４４２（図４）をＮＧＦ−ヒンジ−トランスフェリン 遺伝子融合物構築の出発プラスミドとして用いた。このプラスミドは、ＩｇＧ３ ＣＨ１（重鎖の定常領域１）をコードするヒトゲノムＤＮＡとヒンジ領域とヒ トトランスフェリンｃＤＮＡを含んでいた。このプラスミドは以下の手順で構築 した。 細菌プラスミドｐＡＴ３４４２をベクターｐＡＴ１５３［Practical Guide to Molecular Cloning，Bernard Perbal，John Wiley Publisher（1984）］から誘 導した。まず、ｐＡＴ１５３をＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼを用い て５’オーバーハング領域を充填し、再連結を行ない、ＥｃｏＲＩ部位を除去す る改変を行なった。この誘導体をｐＡＴ１５３．７と命名した。 ダングル（Dangl，J.L．）（1986 Dissertation,スタンフォード大学、Stando rd，CA）に従い、ファージラムダ・ライブラリーからヒトＩｇＧ３定常領域と関 連イントロンを含むヒンジ領域をコードする配列を含むＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断 片を単離した。ＩｇＧ３遺伝子の３’末端からＰｖｕＩＩ（この領域内で多数回 切断する）切断と再連結により非翻訳領域の大部分を除去した。この断片を、部 位特異的突然変異誘発法によりさらに改変して、ＣＨ２領域の５’末端にＰｖｕ ＩＩ部位を設けた。ＳｍａＩによる切断とＥｃｏＲＩリンカーの導入により、Ｃ Ｈ３領域内のＳｍａＩ部位がＢａｍＨＩ部位の０．６ｋｂ上流のＳｍａＩ部位に 連結され、ＥｃｏＲＩ部位によりそれらの間が分離された。ＰｖｕＩＩ部位とＥ ｃｏＲＩ部位を有するこのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片をＳａｌＩとＢａｍＨＩで 切断したｐＡＴ１５３．７にクローニングして（ＥｃｏＲＩ部位を充填によって 欠失させたｐＡＴ１５３であって、ｐＡＴ３４０４とも呼ぶ）、ｐＡＴ３４０８ を得た。 クローンＴｆ（米国特許番号第５，０２６，６５１）からヒトトランスフェリ ンｃＤＮＡ配列を含む２．４ｋｂのＰｓｔＩ断片を単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ ＩＩ ＫＳ（Stratagene社）のＰｓｔＩ部位にクローニングして、ｐＫＳ ３４３６を得た。常法の部位特異的突然変異誘発法によってトランスフェリンの リーダー配列の３’末端にＰｖｕＩＩ部位を導入して、ｐＫＳ３４３８を作成し た。トランスフェリン遺伝子の３’末端の向こう側にあるＥｃｏＲＩ部位と新規 に導入されたＰｖｕＩＩ部位を用いて、トランスフェリンをコードする配列を含 有する２．４ｋｂ断片と関連ｐｏｌｙＡ部位をｐＡＴ３４０８にクローニングし て、ＩｇＧ３のＣＨ２およびＣＨ３ドメインをトランスフェリンで置換した。こ の操作の結果、アミノ酸配列ａｌａ−ａｌａをコードするヌクレオチド配列が成 熟トランスフェリンコード配列の前に位置するようになる。ＢａｍＨＩ部位に隣 接するＩｇＧ３の３’領域側約６００ｂｐ分はトランスフェリン遺伝子の３’末 端に隣接していた。生じたプラスミドをｐＡＴ３４４２と命名した（図４）。 ＥｃｏＲＶによる消化とＸｂａＩ制限部位含有合成リンカーの連結によって、 プラスミドｐＡＴ３４２２中の３’非翻訳ＩｇＧ３配列の下流にあるユニークＥ ｃｏＲＶ部位をＸｂａＩ部位に変換することで、適当な哺乳類ベクターへの今後 のクローニングを行ないやすくした。新規ＸｂａＩ部位を含むクローンをｐＡＴ Ｘと命名した。ｐＡＴＸのＣＨＩ−ヒンジ−トランスフェリン（ＣＨ１−ヒンジ −Ｔｆ）領域のマップを図５Ａに示す。 次いで、ｐＡＴＸ中のＣＨ１コード配列をＮＧＦ遺伝子で置換した。ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を２段階で用いてｐＡＴＸを改変した。５’ＰＣＲプラ イマーであるＨＴＦ−１（下記のもの）はその５’末端付近にＳａｌＩおよびＸ ｈｏＩクローニング部位を含んでおり、３’末端にはヒンジ領域の第１イントロ ンに相補的な１４個の塩基を含んでいた。 ３’プライマー（ＨＴＦ−２）は、ヒンジ領域の第１イントロンの内部の配列 に相補的であり、５’プライマーの下流約４００ヌクレオチドの位置にあって、 ＢｇｌＩＩクローニング部位を含んでいた。 プラィマーをｐＡＴＸ鋳型ＤＮＡと混合し、ＰＣＲ手順に従い、４００ｂｐの 増幅断片をゲル精製し、ＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化し、あらかじめＳａｌＩに よる完全消化とＢｇｌＩＩによる部分消化をしておいた（このプラスミドの２つ のＢｇｌＩＩ部位の１つにおいて切断するために）ｐＡＴＸにクローニングした 。連結した試料を大腸菌ＤＨ１細胞に形質転換し、ＣＨ１領域の代わりに４００ ｂｐの連結断片を有するクローンを制限消化分析によって同定した。このクロー ンをｐＡＴＸＸと命名した。ｐＡＴＸＸのヒンジ−トランスフェリン領域のマッ プを図５Ｂに示す。ＮＧＦ遺伝子の単離とクローン化 成熟β−ＮＧＦコード配列の約２倍のサイズを有し、タンパク質分泌とタンパ ク質折りたたみのシグナルを含有するＮＧＦ遺伝子のプレ−プロ型を、下記プラ イマーを用いてヒト赤血球ゲノムＤＮＡ（Clontech社（Palo Alto，CA ）から購 入）からＰＣＲ法によって増幅した。 ＰＮＧＦ１とＰＮＧＦ２はプレ−プロＮＧＦ遺伝子のそれぞれ５’末端と３’末 端にある配列と一部相同であったが、これらを処理して、ＮＧＦ遺伝子のいずれ か１端にＸｈｏｌクローニング部位を作成した。５’プライマーはさらにＸｂａ ｌクローニング部位を含んでいた。 ＰＮＧＦ１プライマーとＰＮＧＦ２プライマーを用いて、プレ−プロＮＧＦ遺 伝子を含む約８００ｂｐの断片を増幅した。生じたＤＮＡをＸｈｏｌで消化し、 （約）８００ｂｐの断片をゲル精製し、Ｘｈｏｌ消化ｐＡＴＸＸに連結した。ト ランスフェリン遺伝子と同方向で上流側ＩｇＧ３ヒンジ領域に隣接して挿入され たプレ−プロＮＧＦ遺伝子を有するｐＡＴＸＸＮＧＦと称するクローンが同定さ れた。その結果、ＮＧＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン（ＮＨＴ）遺伝子 融合物ができた。ｐＡＴＸＸＮＧＦのこの領域のマップを図５Ｃに示す。（ｐＡ ＴＸＸＮＧＦのプレ−プロＮＧＦコード領域の３’側のＸｈｏＩ部位はＩｇＧ３ ヒンジ領域の前に位置するｌｅｕ−ｇｌｕをコードする）。 ＮＧＦ−ヒンジ配列とヒンジ−トランスフェリン配列の間 の連結部分の部分ＤＮＡ配列を決定して、プライマーの配列を確認するとともに 、新規形成遺伝子融合物内部の読み取り枠が正しいかどうか確認した。決定され た配列は、ヌクレオチド変化が１カ所見られた。すなわち、ＧからＡに変化した 結果、ＮＧＦのプレ−プロ部分中の８０位アミノ酸がアルギニンからグルタミン に変化した。哺乳類発現ベクターにおけるＮＧＦ−ヒンジ−トランスフェリン遺伝子融合物の 再構築 下記手順を用いて、ＮＧＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン遺伝子融合物 を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡＭＰ（Invitrogen社）に段階的にクロー ニングして、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６５１）にトランスフェク トした。 まず、ＰＣＲ法を用いて、ｐＡＴＸＸＮＧＦから上記遺伝子融合物のプレ−プ ロＮＧＦ部分を増幅した。５’ＰＣＲプライマーＰＮＧＦ１は上記したものであ り、３’ＰＣＲプライマーＰＮＧＦ３は下記のものである。 ＰＮＧＦ１プライマーとＰＮＧＦ３プライマーを用い、プレ−プロＮＧＦ遺伝子 を含む約８００ｂｐの断片をｐＡＴＸＸＮＧＦから増幅した。生じたＤＮＡをＸ ｂａｌで消化し、Ｘ ｂａｌ消化細菌ベクターｐＵＣ１８（Boehringer-Mannheim 社）に連結し、コン ピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ細胞（Invitrogen社）に形質転換した。いずれかの 方向でＮＧＦ遺伝子を含むクローンを制限酵素分析により同定し、ｐＵＣＮＧＦ １（時計回り方向）およびｐＵＣＮＧＦ２（反時計回り方向）と命名した（図６ ）。 次いで、３部分連結により、ｐＣＤＮＡＩ／Ａｍｐ中に完全ＮＨＴ遺伝子融合 物を再作成した。第１の断片はＮＧＦ遺伝子のほとんどの部分を含む約６００ｂ ｐの断片であって、このものを、プレ−プロＮＧＦ遺伝子配列の上流側にあるポ リリンカー内で切断するＢａｍＨＩ、およびＮＧＦ遺伝子の３’末端付近で切断 するＳｃａｌで消化することによってｐＵＣＮＧＦ２から分離した。第２の断片 はｐＡＴＸＸＮＧＦから単離された４．７ｋｂのＳｃａｌからＸｂａｌまでの断 片であり、ＮＧＦ遺伝子の３’末端の残り部分と、ヒンジ領域とトランスフェリ ン遺伝子全体とを含んでいた。第３の断片は、ＢａｍＨＩとＸｂａｌでポリリン カー配列内で消化されゲル精製されたｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐベクターであった。 上記３つの断片を連結し（図７）、大腸菌細胞に形質転換した。３つの断片すべ てを含むプラスミドを同定し、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴと命名した。再度Ｄ ＮＡ配列を決定し、ＮＧＦおよびトランスフェリンをコードする配列を確認した 。決定された配列は、ＮＧＦ中でＴがＣに転移した結果、３５位アミノ酸のバリ ンがアラニンに変化していた。また、他にも既報のトランスフェリンヌクレオチ ド配列とは異なる変 化が３つ見られたが、これらはアミノ酸変化をもたらしてはいなかった。哺乳類細胞中で発現された融合タンパク質におけるＮＧＦとトランスフェリンを 検出するアッセイ 発現プラスミドｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴをＣＯＳ細胞中でトランスフェク トし一時的に発現させた。常法のＥＬＩＳＡ手順により、抗ＮＧＦ抗体、抗トラ ンスフェリン抗体、または精製トランスフェリン受容体を用いて培養上清中の融 合タンパク質を検出した。 すなわち、融合タンパク質のＮＧＦまたはトランスフェリン部分に対して特異 的な捕捉抗体（抗ＮＧＦまたは抗トランスフェリン）で９６穴プレートのウエル 内を被覆した。ウエルを洗い（ＰＢＳ−０．０５％トゥエーン）、１％ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の上清 をウエルに加え（通常は４倍希釈列で添加）、室温で１時間インキュベートした 。 融合タンパク質のその他の部分（抗Ｔｆまたは抗ＮＧＦ）を認識する検出抗体 を選択し、ウエルの融合タンパク質の上面に加えた。ベクタステインＡＢＣキッ ト（Vectastain ABCキット；VectorLabs社）を用いるアビジン−ビオチン反応に よってシグナルを増幅させた後、結合抗体を検出した。既知濃度のＮＧＦまたは トランスフェリンについて作成した標準曲線から外挿することでタンパク質を定 量した。 上記以外のＥＬＩＳＡ手順を用いて融合タンパク質を検出 し定量することもできる。たとえば、捕捉抗体と検出抗体が融合タンパク質の同 一部分を認識してもよい。ＮＨＴ融合タンパク質の発現の最適化 ＮＨＴ融合タンパク質の発現レベルを増大させるために、コザックコンセンサ ス配列［コザック（Kozak ）、Nucl．Acid．Res. 15，8125（1987）］を導入す るＰＣＲ法を用いて、プレ−プロＮＧＦ遺伝子のＡＵＧ開始コドンの直前にある 翻訳開始配列を改変した。 プレ−プロＮＧＦ遺伝子配列に隣接する領域と相補的であるＰＣＲプライマー を２個設計した。５’プライマーｐ４５．１は、Ｓｍａｌ制限部位および哺乳類 細胞における効率的翻訳に重要であることが示されている配列ＣＣＡＣＣすなわ ちコザック配列をプレ−プロＮＧＦ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの直前に含んでい た。 ３’プライマーｐ１６．１は、３’からｐＵＣＮＧＦ１中のＮＧＦコード配列と ＢａｍＨＩ部位の両者までに及ぶ配列に対して相補的であった。 ｐ４５．１プライマーとｐ１６．１プライマーを用いてＰＣＲ法により、ｐ４ ５．１中のコザック翻訳開始コンセンサス配列の後にあるプレ−プロＮＧＦコー ド配列をｐＵＣＮＧＦ１から増幅した。生じたＤＮＡは、哺乳類発現ベクターＣ Ｄ５１ｎｅｇｌにクローニングすることができる。 このクローニングを実施する１つの方法は、まず、後で行なう哺乳類発現ベク ター中へのクローニングと両立し得る制限部位を有するたとえばｐＧＥＭ−２（ Promega 社）などの細菌ベクターにプレ−プロＮＧＦ遺伝子配列を挿入する。増 幅されたプレ−プロＮＧＦ遺伝子をＳｍａＩとＢａＨＩで消化し、ＨｉｎｃＩＩ およびＢａｍＨＩ部位の間にあるｐＧＥＭ−２のポリリンカーに連結することが できるので（ＳｍａＩとＨｉｎｃＩＩは平滑末端断片を生じるので）、ｐＧＥＭ −２／ＫＮＧＦというクローンができる。 次いで、ＮＨＴ融合物を次のように３段階連結により再作成る。ｐＧＥＭ−２ ／ＫＮＧＦクローン由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｃａＩ断片（ＮＧＦコード領域の 大部分を含有）をｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴ由来のＳｃａＩ−ＸｂａＩ断片（ ＮＧＦ遺伝子のＣ末端側大部分と、ＩｇＧ３ヒンジとトランスフェリンコード配 列を含有）およびＨｉｎｄＩＩＩプラスＸｂａＩ消化ｐＧＥＭ−２ベクターと混 合する。生じたベクターは隣接するＸｂａＩ部位の間に完全なＮＨＴ融合物を有 している（リンカーｐ４５．１由来の５’ＸｂａＩ部位）。次いで、このＸｂａ Ｉ断片をＸｂａＩ消化ＣＤ５１ｎｅｇｌにクローニングする。 ＣＤ５１ｎｅｇｌはＣＭＶプロモーター配列とクローン化タンパク質分泌に必 要なＣＤ５リーダー配列と、ＩｇＧ１のヒンジ領域とＦｃ部分をコードする配列 と、ポリアデニル化シグナル配列を含んでいる（図８）。 ＣＤ５１ｎｅｇｌ［マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hosp ital）のブライアン シード（Brian Seed）より恵与されたもの］は、ＳＶ４０ イントロン配列内の５９０ｂｐのＤｒａＩ断片と、ポリオーマ複製起点を含有す るＢａｍＨＩ−ＳｆｉＩ断片と、ＮｈｅＩ部位を除去するために除去されたＭ１ ３ｏｒｉの３’末端にある２０ｂｐのＮｈｅＩ−ＳｓｐＩ断片を欠失させること によって、プラスミドｐＣＤＭ８（Invitrogen社）から誘導することができる。 また、ＣＤ５１ｎｅｇｌは、ｐＣＤＭ８のＸｈｏＩ（ポリリンカー内）およびＥ ａｇＩ（ポリリンカーから約４３ｂｐ離れている）部位の間に挿入されたＩｇＧ １ヒンジ−Ｆｃ領域（Genbank 登録番号Ｊ００２２８）に隣接するＣＤ５リーダ ー配列（Genbank 登録番号Ｘ０４３９１）も含んでいる。ＸｈｏＩおよびＥａｇ Ｉ部位の間のＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＮＡ配列を図９Ａ−９Ｂに示す（配列番号 ：８）。ＣＤ５リーダー配列とＩｇＧ１エキソンもこの図に示す。ＣＤ５１ｎｅ ｇｌへの完全ＮＨＴ融合物の挿入によって生じたクローンをＣＤ５ＫＮＨＴと命 名する。 ベクターＣＤ５ＫＮＨＴをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、融合タンパク質 の発現を上記手順でＥＬＩＳＡによって測定した。トランスフェリン配列とＮＧ Ｆ配列の両者を含む タンパク質が発現され、培養上清中で検出された。ＣＯＳ細胞上清に含まれるＮＧＦ−ヒンジ−トランスフェリン融合タンパク質の 精製 トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の上清に含まれるＮＧＦ−ヒンジ−トランス フェリン融合タンパク質を抗ＮＧＦアフィニティーカラムを用いて精製した。Ｃ Ｄ５ＫＮＨＴでトランスフェクトした細胞の培地を、あらかじめラット抗マウス ＮＧＦモノクローナル抗体［たとえば抗体１Ｇ３；サフロンら（Saffron et al. ）、Brain Res. 492:245-254 (1989)］を結合させておいたセファロースカラム 上に一夜重力負荷した。このカラムはあらかじめＰＢＳで平衡化させておいたも のである。カラムを２ｍｌのＰＢＳで５回洗い、ＮＧＦ含有タンパク質を０．１ Ｍのグリシンと０．１５ＭのＮａＣｌを含む溶液１０ｍｌ（ｐＨ３．０）で溶出 させた。５つの２ｍｌ画分が溶出され、それぞれ１ＭのＮＨ₄ ＨＣＯ₃ ５０μｌ と８μｇ／ｍｌのＦｅＮＨ₄ クエン酸塩を含む試験管に直接注入した。次いで、 各画分のＯＤ₂₈₀ を測定した。 得られたアフィニティー精製画分は還元性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上 の分子量１００ｋＤに位置する主要バンドを含んでいた。このバンドは抗トラン スフェリン抗体と抗ＮＧＦ抗体によって認識された。トランスフェリン受容体結合活性を検出するイン・ビトロ競合測定 ＮＨＴ融合タンパク質の重要な属性の一つはトランスフェリン受容体と結合す る能力を有することである。融合タンパク質がトランスフェリン受容体への結合 に関してネイティブトランスフェリンと競合する能力に基づきＮＨＴ融合タンパ ク質のヒトトランスフェリン受容体との親和性を測定するアッセイを行なった。 テュルケウイッツら（Turkewitz et al.）の手順［J．Biol．Chem. 263:8318 -8325 (1988)］を用いて、新鮮妊娠満期ヒト胎盤からトランスフェリン受容体を 精製した。すなわち、胎盤膜を単離し、−８０℃で保存し、凍結膜を融解させ、 洗剤で抽出した。内生鉄をキレート化させることで、内生トランスフェリンの受 容体親和性を大幅に低下させた。次いで、トランスフェリン受容体をヒトトラン スフェリン−セファロースカラム上で精製した。ゲル分析を行なったところ、生 じた受容体は予想通りの分子量を有していることがわかった。また、ゲルの走査 密度測定で純度は９８％であることがわかった。精製したトランスフェリン受容 体を抗体１２８．１および別の市販の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（Amer sham社ＲＰＮ．５１１）を用いる免疫ブロッティングに付した。 競合アッセイを行なうために、マイクロタイターウエルに０．７μｇ／ｍｌ精 製ヒト胎盤トランスフェリン受容体を１００μｌ／ウエルの割合でコーティング 緩衝液（１０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）に溶かして４℃で一夜コーティ ング処理した。１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ ００μｌ／ウエルの存在下３７℃で１時間インキュベートすることによって、非 特異的結合をブロックした。次いで、ウエルを洗い、４ｎＭの ¹²⁵Ｉ−トランス フェリン（New England Nuclear 社）と様々な濃度の競合物質すなわち精製組換 えヒトトランスフェリンまたはＮＨＴ融合タンパク質から成る混合物１００μｌ を各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ガンマカウン ターを用いてウエルごとに計数した。競合物質濃度に対する残留シグナルの百分 率をプロットし、５０％残留シグナルの点を求めた（図１０）。その結果、ＮＧ Ｆ−ヒンジ−トランスフェリン融合タンパク質はヒトトランスフェリン受容体と 結合するが、ネイティブのヒトトランスフェリンと比べるとこの受容体に対する 親和性は低下していることがわかった。ＮＧＦ活性を検出するイン・ビトロアッセイ ラット褐色細胞腫のクローン株（ＰＣ１２と呼ぶ）は、イン・ビトロでＮＧＦ の存在下に細胞分裂を停止し、軸索様突起を顕著に突き出す。この細胞ベースの 生物アッセイを利用して軸索成長を刺激する能力を測定することで、発現ＮＨＴ 融合タンパク質がＮＧＦ活性を有するかどうかを調べた。 ５％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、および２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲ ＰＭＩ１６４０培地（Bio Whittaker 社）を入れたＴ７５フラスコ内で５％ＣＯ₂ の存在下でＰＣ１２細胞を培養した。９６穴プレートに、０．５μｇ／ｃｍ² のウシコラーゲンＩＶを５０μｌ／ウエルの量で被覆し、一 夜乾燥させ、２０分間紫外線に曝露させてから、使用した。５ｍｌのＰＣ１２細 胞を各フラスコから取り、約５〜１０回２１ｇニードルを通過させて凝集塊を破 壊した。この手順により、細胞の軸索を喪失させた。細胞を約２Ｘ１０⁴ 個／ｍ ｌまで培地で希釈し、５０μｌをコラーゲン被覆プレートの各ウエルに添加し（ １０００細胞／ウエル）、１〜２時間インキュベートして細胞を付着させた。 試験対象試料は使用前にフィルター滅菌した。用量反応曲線を作成するために 、試料の培地で２倍希釈列を作成し、５０μｌの試料をウエルに添加した。上記 と同様にして精製マウスＮＧＦの希釈列を作成し、プレートに添加して、標準曲 線を作成した。ＮＧＦ含有試料に５日間曝露した後、２つまたは３つの代表的な 視野に入る細胞の総数と細胞体の直径の２倍より長い軸索を少なくとも１本以上 突き出している細胞の数を数えることでＮＧＦ活性の有無を判定することによっ て、プレートの点数評価を行なった。その結果を、ＮＧＦ濃度の関数として軸索 突き出し細胞のパーセント比率で示した（図１１）。パネルＡは精製マウスＮＧ Ｆの標準曲線である。パネルＢはＮＨＴ融合タンパク質の活性曲線である。その 結果から、上記融合タンパク質はイン・ビトロでＮＧＦの生物活性を完全に保持 していることがわかった。 実施例１２−他のＮＧＦ−トランスフェリン融合遺伝子の構築 さらに３つのＮＧＦ−トランスフェリン融合物を作製し試 験した： １） プレ−プロＮＧＦ遺伝子とトランスフェリンｃＤＮＡの直接の融合物、２ ） ５つのグリシン残基をコードする配列によって隔てられたプレ−プロＮＧＦ 遺伝子とトランスフェリンｃＤＮＡの融合物（ＮＧＦ−（ｇｌｙ）₅ −トランス フェリン）、そして ３） ｌｅｕ−ｇｌｕをコードする配列によって隔てられ たプレ−プロＮＧＦ遺伝子とトランスフェリンｃＤＮＡの融合物（ＮＧＦ−ｌｅ ｕ−ｇｌｕ−トランスフェリン）。ＮＧＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン を含むベクター，ＣＤ５ＫＮＨＴをこれらの融合物を作製するための遺伝子材料 源として用いた。 ＮＧＦ−トランスフェリンの直接の融合物とＮＧＦ−（ｇｌｙ）₅ −トランス フェリン融合物を作製するため、２段階のＰＣＲ反応をＣＤ５ＫＮＨＴにおいて 行った。ＮＧＦ−ｌｅｕ ｇｌｕ−トランスフェリンについては、興味のある断 片を生成させるために、１段階のＰＣＲ反応で充分であった。これらの遺伝子融 合物のそれぞれを構築する方法は以下に記述する。ＮＧＦ−Ｔｆ直接融合物の構築 次のＰＣＲプライマーが使われた： Ｐ２０２とＰ２０５はＮＧＦ遺伝子の３’側 ２／３部分を増幅するために使 用したプライマーであった。Ｐ２０２はユニークなＳｃａＩ部位までのＮＧＦ遺 伝子５’内の配列に相補的であった。Ｐ２０５はＮＧＦ遺伝子の３’末端２２塩 基とトランスフェリン遺伝子の５’末端２０塩基に相補的であった。 プライマーＰ２０４とＰ２０３はトランスフェリン遺伝子を増幅するために使 用した。Ｐ２０４はトランスフェリン遺伝子の５’末端２３塩基配列とＮＧＦ遺 伝子の３’末端１９塩基に相補的であった。Ｐ２０３は唯一存するＢａｍＨＩ部 位までの３’配列をコードするトランスフェリン内の配列に相補的であった。 ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴ ＤＮＡを２セットのプライマーと別々に混合し た。ＰＣＲの結果として、ＮＧＦをコードする配列とトランスフェリンをコード する配列の間に接合点を生成する重複する突出部を持つ２つの断片が増幅された 。２つの断片はゲルで精製し、それぞれの断片の等モル量を 混合し、プライマーＰ２０２とＰ２０３と共に第２のＰＣＲ増幅を行った。生じ た産物をＳｃａＩとＢａｍＨＩで消化し、ＮＧＦ遺伝子の３’末端とヒンジ領域 とトランスフェリンをコードする配列の５’末端を含むＣＤ５ＫＮＨＴ ＤＮＡ の匹敵するＳｃａＩからＢａｍＨＩまでの断片と置換した。（ＣＤ５ＫＮＨＴの ＢａｍＨＩ消化は、トランスフェリン遺伝子の下流の第２のＢａｍＨＩ部位の存 在のため、部分消化であった。）生じたプラスミド，ＣＤ５ＫＮＴ，はＮＧＦと トランスフェリン遺伝子の直接融合物を含んでいた。ＮＧＦ−（Ｇｌｙ）₅ −トランスフェリン融合物の構築 次のＰＣＲプライマーが使われた：Ｐ２０２（配列番号：９），Ｐ２００，Ｐ ２０１，Ｐ２０３（配列番号：１２） プライマーＰ２００は一部、ＮＧＦ遺伝子の３’末端に相補的であり、５つの グリシン残基をコードする非相補的な領域を含み、続いてトランスフェリンをコ ードする配列の５’末端に相補的な２３塩基を含んでいた。プライマーＰ２０１ は、５つのグリシン残基をコードする非相補的な領域とＮＧ Ｆ遺伝子の３’末端が前にあるトランスフェリンの５’末端に相捕的であった。 ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴ ＤＮＡを２セットのプライマー（Ｐ２０２とＰ ２０１はＮＧＦ遺伝子の３’側２／３を増幅するために使用し、そしてＰ２００ とＰ２０３はトランスフェリン遺伝子の５’末端を増幅するために使用した）と 別々に混合した。重複する突出部を持つ２つの断片が生成した。２つの断片はゲ ルで精製し、それぞれの断片の等モル量を混合し、プライマーＰ２０２とＰ２０ ３と共に第２のＰＣＲ増幅を行った。生じた増幅産物をＳｃａＩとＢａｍＨＩで 消化し、上述のＣＤ５ＫＮＨＴ ＤＮＡの匹敵するＳｃａＩ部位からＢａｍＨＩ 部位までの断片と置換した。生じたプラスミド，ＣＤ５ＫＮＧＴは５つのグリシ ン残基をコードする配列によって隔てられたＮＧＦとトランスフェリンをコード する配列の融合物を含んでいた。ＮＧＦ−ｌｅｕ ｇｌｕ−トランスフェリン融合物の構築 次のプライマーが使われた： Ｐ２０６とＰ２０３（配列番号：１２） プライマーＰ２０６は、ＸｈｏＩ部位（Ｌｅｕ−ＧｌｕをコードするＣＴＣＧ ＡＧ），直後にトランスフェリンの５’末端をコードする配列に相補的な２１塩 基の配列を含んでいた。プライマーＰ２０３はトランスフェリン遺伝子内の３’ 末端からＢａｍＨＩ部位までに相補的である。ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴ Ｄ ＮＡを２つのプライマーと混合し、ＰＣＲ増幅を行った。生じた断片をＸｈｏＩ とＢａｍＨＩで消化し、ＸｈｏＩで完全に、ＢａｍＨＩで部分的に消化したＣＤ ５ＫＮＨＴと連結して、ＩｇＧ３ヒンジ領域を欠失させそしてｌｅｕ−ｇｌｕを コードする配列を包含させた。生成したプラスミド，ＣＤ５ＫＮＸＴは、ｌｅｕ −ｇｌｕをコードする配列によって隔てられたＮＧＦとトランスフェリンをコー ドする配列の融合物を含んでいた。 ＮＧＦ−トランスフェリンの直接の融合物，ＮＧＦ−（Ｇｌｙ）₅ −トランス フェリン融合物とＮＧＦ−ｌｅｕ ｇｌｕ−トランスフェリン融合物をそれぞれ 実施例１１のように、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、一時的に発現させた。 抗ＮＧＦ抗体、抗トランスフェリン抗体又は精製トランスフェリン受容体を用い て発現された融合タンパク質をそれぞれ検出した。このことは、これらの融合タ ンパク質が天然の非融合タンパク質に類似したＮＧＦ結合特性やトランスフェリ ン結合特性を持っていることを証明するものである。 これらの３つの融合タンパク質についても、実施例１１で述べたように、ＮＧ Ｆ活性を検出するＰＣ１２軸索伸長バイオアッセイを行った。３つの融合タンパ ク質はそれぞれ軸索伸長刺激能によって例示されるようにＮＧＦ生物活性を示し た。 実施例１３−ＣＮＴＦ−トランスフェリン融合遺伝子の構築ＣＮＴＦ遺伝子の単離とクローン化 ヒトＣＮＴＦ遺伝子をＰＣＲ技法を使用し、Ｊｕｒｋｅｔ細胞から調製したゲ ノムＤＮＡよりクローニングした。イントロン配列により遮断されないＣＮＴＦ 遺伝子配列を得るために、次の４つのプライマーを使用し、２段階でＰＣＲを行 った。 Ｐ３１．１とＰ４２．１はＣＮＴＦの５’エクソンを増幅させるための５’プ ライマーと３’プライマーであった。Ｐ３１．１は５’エクソンの５’末端に相 補的であり、ＮｄｅＩクローニング部位を含んでいた。Ｐ４２．１は５’エクソ ンの３’末端に相補的な２１塩基と、３’エクソンの５’末端に相補的な１８塩 基を含んでいた。 Ｐ３５．１とＰ４２．２はＣＮＴＦの３’エクソンを増幅 するための５’プライマーと３’プライマーのプライマーであった。Ｐ３５．１ は３’エクソンに相補的であり、５’エクソンの３’末端に相補的な１３塩基を さらに含んでいた。Ｐ４２．２は３’エクソンの３’末端に相補的であり、Ｘｈ ｏＩクローニング部位を含んでいた。 ゲノムＤＮＡを２セットのプライマーと別々に混合した。プライマーＰ３１． １とＰ４２．１で１２０ｂｐの断片を増幅し、プライマーＰ３５．１とＰ４２． ２で４８０ｂｐの断片を増幅した。２つの断片は全部で３１塩基対の重複配列を 持っていた。 第２のＰＣＲ反応で（上述の）プライマーＰ３１．１とＰ４２．２と共に、ゲ ルで精製した１２０ｂｐと４８０ｂｐの断片を鋳型として混合して使用し、６０ ０ｂｐの断片を増幅した。増幅した断片をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ゲルで 精製した。 ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化後ゲルで単離した大腸 菌発現ベクターｐＥＴ１７ｘＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。連結し て得た生成物を大腸菌 ＭＣ１０６１ コンピテント細胞へ形質転換した。ＣＮ ＴＦ遺伝子断片を含むクローンを制限酵素による消化やＤＮＡ配列分析で同定し 、Ｊ６と命名した。ヒトＣＮＴＦをコードする配列の哺乳動物発現ベクターへのクローンニング ヒトＣＮＴＦをコードする配列を実施例１２の哺乳動物発 現ベクターＣＤ５１ｎｅｇｌにクローニングした。下述の方法により、ＣＮＴＦ 遺伝子をＩｇＧ１配列の代わりにＣＤ５リーダー配列に隣接するＣＤ５１ｎｅｇ ｌ発現ベクターにクローニングした。 ＣＤ５１ｎｅｇｌの部位と一致する末端の制限部位を持つＣＮＴＦＤＮＡを調 製するため、５’および３’ＰＣＲプライマーとしてそれぞれＰ３３．１，Ｐ３ ５．２を、鋳型としてクローンＪ６を使用してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を作成 した。Ｐ３３．１はＣＮＴＦ遺伝子の５’末端に相補的でありそしてＮｄｅＩ部 位というよりむしろＢｌｎＩ制限部位を含んでいた。Ｐ３５．２は一部ＣＮＴＦ 遺伝子の３’末端に相補的であり、ＸｈｏＩ部位というよりむしろＥａｇＩ制限 部位を含んでいた。 ＰＣＲに続き、生じた増幅ＤＮＡ断片をＢｌｎＩとＥａｇＩで処理し、ＮｈｅＩ とＥａｇＩで消化したＣＤ５１ｎｅｇｌベクターバックボーンと連結させた（Ｎ ｈｅＩとＢｌｎＩは一致した突出部を生成させ、連結後はどちらの部位も再生さ れない）。連結反応混合物を大腸菌 ＭＣ１０６１コンピテント細胞に形質転換 した。ＣＮＴＦ遺伝子の前にＣＭＶプロ モーターとＣＤ５リーダーを持つクローンが生成し、これを制限消化で同定し、 Ｄ１と命名した。 ＰＣＲの手順から生じた変異を含むプラスミドＤ１にＣＮＴＦ遺伝子が存在す る可能性を最小にするため、それぞれがＣＮＴＦ内を１回切断するＮｈｅＩとＢ ａｍＨＩを使用し、Ｄ１由来のＣＮＴＦをコードする配列の大部分を含み、Ｊ６ 由来のＣＮＴＦのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と等量交換された断片を単離した。 生じたプラスミドをｄ１と命名した（図１２Ａ参照）。ＣＮＴＦ−トランスフェリン遺伝子融合物の構築 ＣＮＴＦ−トランスフェリン融合タンパク質をコードする３つの異なった遺伝 子融合物を構築した。それぞれの場合で、タンパク質は異なった連結配列で接続 された。これらの構築の第１番めに、ＣＮＴＦとトランスフェリンをＩｇＧ３の ヒンジ領域で接続した（ＣＮＴＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン）。第２ の構築では、ＣＮＴＦとトランスフェリン配列を介在リンカーなしに接続した（ ＣＮＴＦ−トランスフェリン）。第３の構築では、ペンタ−グリシンをコードす る配列をＣＮＴＦ遺伝子とトランスフェリン遺伝子の間に挿入した（ＣＮＴＦ− （Ｇｌｙ）₅ −トランスフェリン）。これらの遺伝子融合物のそれぞれの構築方 法は下記に述べる。Ａ．ＣＮＴＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリン ＣＮＴＦ−ＩｇＧ３ヒンジ−トランスフェリンをコードする遺伝子融合物を次 の多段階の手順を使用して、ＣＤ５１ｎｅｇｌ発現ベクターでの発現のために構 築した。第１にトランスフェリン遺伝子を単離し、ＩｇＧ１配列の代わりにＣＤ ５１ｎｅｇｌにクローニングした。これを行うため、トランスフェリン遺伝子を 含む断片を、実施例１１のｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴを鋳型として、オリゴヌ クレオチドＰ３３．２とＰ３６．１ をそれぞれ５’ＰＣＲプライマーおよび３ ’ＰＣＲプライマーとして使用するＰＣＲ法で、作成した。Ｐ３３．２はトラン スフェリン遺伝子の５’末端に相補的で、ＢｌｎＩ部位を含んでいた。Ｐ３６． １は、その遺伝子の３’末端に相補的で、ＥａｇＩ部位を含んでいた。 ＰＣＲに続き、増幅断片をＢｌｎＩとＥａｇＩで消化し、ＮｈｅＩとＥａｇＩ で消化しゲルで精製したＣＤ５１ｎｅｇｌバックボーンにクローニングした。生 じたプラスミドはＩｇＧ１ヒンジ−Ｆｃの代わりに、ＣＤ５リーダーに隣接する 下流に挿入されたトランスフェリン遺伝子を持ち、Ｃ４と命名された。前述のと おりに、ＰＣＲ増幅中に組み込まれたかもしれない誤りの可能性を排除するため に、トランスフェリ ン遺伝子配列の大部分を含んだＣ４のＢａｍＨＩからＡｓｐ７１８までの断片を 出発プラスミドであるｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮＨＴの均等なＢａｍＨＩ−Ａｓｐ ７１８断片と置換した。生じたプラスミドをＣ^* と命名した（図１２Ｂ参照）。 それから、次のようにＩｇＧ３ヒンジ領域の配列をＣ４内のトランスフェリン をコードする配列の上流に挿入した。ＩｇＧ３ヒンジとｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐＮ ＨＴ由来のトランスフェリンをコードする配列（トランスフェリンをコードする 配列のすぐ上流にａｌａ−ａｌａをコードする配列を持つ）の５’部分を含むＸ ｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片を単離し、ＸｈｏＩとＡｓｐ７１８で消化したＣ４バ ックボーンにクローニングし、Ｃ４−ＮＨＴを作成した（図１２Ｃ参照）。 次に、ＣＮＴＦ遺伝子とトランスフェリン遺伝子からなる遺伝子融合物をＣＤ ５１ｎｅｇｌバックボーン中に作製した。まず、クローンｄ１由来の０．７ｋｂ ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＣＤ５リーダーと３’末端を除くＣＮＴＦ遺伝子 の大部分を含む）と、Ｃ４−ＮＨＴ由来の１．８ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥａｇＩ断 片（５’末端を除くトランスフェリンをコードする配列の大部分を含む）をＸｈ ｏＩとＥａｇＩで消化しゲルで精製したＣＤ５１ｎｅｇｌバックボーンと連結し 、ｇ^* を作成した（図１２Ｄ参照）。 それから、ＩｇＧ３ヒンジ領域を含む断片をＣＮＴＦ遺伝子とトランスフェリ ン遺伝子の間に挿入した。これを行うために、ＣＮＴＦ遺伝子の３’末端にＸｈ ｏＩ部位を作製し、ヒンジ領域配列の５’末端にあるＸｈｏＩ部位と一致させた 。（このＸｈｏＩ部位はＩｇＧ３ヒンジ領域の５’側にｌｅｕ−ｇｌｕをコード した）。新しいＣＮＴＦを含む断片を、Ｊ６を鋳型としてプライマーＰ３３．１ （上述）とＰ３６．５（ＸｈｏＩ部位を含む）を使用してＰＣＲ法により作成し た。 このＰＣＲ生成物をＢｌｎＩとＸｈｏＩで消化し、ＳｐｅＩ（ＢｌｎＩと一致） とＸｈｏＩで消化したＣ４−ＮＨＴにクローニングし、Ｈ４５を作成した。Ｈ４ ５はヒンジをコードする配列に結合したＣＮＴＦ遺伝子を含みそしてヒンジコー ド配列は今度はトランスフェリン遺伝子に連結していた。（図１２Ｅ参照）。 最後に、ＣＮＴＦ遺伝子の３’末端とヒンジをコードする配列とトランスフェ リン遺伝子の５’末端を含むＨ４５由来の１．５ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を単離し 、ＢａｍＨＩ消化のｇ^* にクローニングし、プラスミドｇＨを作成した。このプ ラスミドはＣＭＶプロモーターとＣＤ５リーダー配列の下流にあるＣＮＴＦ−ヒ ンジ−トランスフェリン遺伝子融合物を含んでいた。（図１２Ｆ参照）。Ｂ．ＣＮＴＦ−トランスフェリン直接融合物 ＣＮＴＦ−トランスフェリン直接融合物を２段階のＰＣＲ法で作成した。第１ 段階で、ＣＮＴＦをコードする配列をプ ライマーＰ３３．１（配列番号：２０ 上述）とＰ３８．１（下述）を使用し、 鋳型としてＪ６を用いて増幅し、そしてトランスフェリン遺伝子をプライマーＰ ３６．２（下述）とＰ３６．１（配列番号：２３ 上述）と鋳型 ｐｃＤＮＡＩ ／ＡｍｐＮＨＴを使用して増幅した。Ｐ３８．１はトランスフェリン遺伝子の５ ’末端とＣＮＴＦをコードする配列の３’末端に相補的であった。Ｐ３６．２は ＣＮＴＦをコードする配列の３’末端とトランスフェリン遺伝子の５’末端に相 補的であった。 ２つの増幅した断片をゲルで精製し、等モル量を混合し、プライマーＰ３３． １とＰ３６．１を使用して第２のＰＣＲを行った。生成物つまりＣＮＴＦ−トラ ンスフェリン融合遺伝子を含む無傷の断片をＢｌｎＩとＥａｇＩで消化しＮｈｅ ＩとＥａｇＩで消化したＣＤ５１ｎｅｇｌと連結させた。制限分析でクローンを 同定し、Ａ４５と命名した。ＰＣＲで導入される突然変異の可能性を最小にする ため、ＣＮＴＦ遺伝子配列とトランスフェリン遺伝子配列との接合点にわたるＡ ４５由来のＢａｍＨＩ断片をＢａｍＨＩ消化したｇ^* にクロ ーニングした。生成したプラスミドをｇＡと命名した。Ｃ．ＣＮＴＦ−（Ｇｌｙ）₅ −トランスフェリン融合物 ５つのグリシン残基をコードする一連のヌクレオチドによって隔てられたＣＮ ＴＦ−トランスフェリン融合物を２つのプライマー対と鋳型Ｊ６およびｐｃＤＮ ＡＩ／ＡｍｐＮＨＴを使用して同様に構築した。プライマーＰ３３．１（配列番 号：２０）とＰ５３．２（下述）はＣＮＴＦ遺伝子の５’末端と３’末端に相補 的であった。さらに、Ｐ５３．２は５つのグリシンをコードする介在ヌクレオチ ド配列を含んでいた。プライマーＰ５３．１（下述）とＰ３６．１（配列番号： ２３）は、トランスフェリン遺伝子の５’末端と３’末端に相補的であった。Ｐ ５３．１はまた５つのグリシンをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、そ してこの配列はプライマーＰ３３．１とＰ５３．２で作成した断片の３’末端と 重複した。 第１のＰＣＲ反応の後、２つの増幅した断片を精製し、アニールしてプライマ ーＰ３３．１とＰ３６．１を使った第２回めのＰＣＲにかけた。最終生成物をＢ ｌｎＩとＥａｇＩで消化し、ＮｈｅＩとＥａｇＩで消化したＣＤ５１ｎｅｇｌＤ ＮＡに連結させた。クローンを制限分析で同定し、Ｂ４５と命名した。ＢａｍＨ Ｉ断片を再びｇ^* 内のＢａｍＨＩ断片と置換し、生じたプラスミドをｇＢと命名 した。 ヒトトランスフェリン受容体に対するＣＮＴＦ−トランスフェリン融合タンパ ク質の親和性を測定するために、実施例１１で述べたようにトランスフェリン受 容体結合活性を検出する競合測定を行った。これらの測定結果は、ＣＮＴＦ−ト ランスフェリン融合タンパク質がヒトトランスフェリン受容体と十分に結合する ことを明らかにした。 これらの融合タンパク質が、単離した神経細胞の軸索伸長を刺激する能力を測 定することにより、ＣＮＴＦ−トランスフェリン融合物におけるＣＮＴＦ活性を 測定するためにコリンズ (Collins)ら（1989，Brain Res．502：PP．99-108）に よって述べられた細胞に基づくバイオアッセイを使用した。これらのバイオアッ セイの結果は、すべての融合タンパク質がＣＮＴＦ活性を保持していることを明 らかにした。 実施例１４−ＮＧＦ−抗−トランスフェリン受容体抗体融合遺伝子の構築，ＮＧ Ｆ−抗−トランスフェリン受容体抗体融合遺伝子の融合タンパク質としての発現 および融合タンパク質構成成分の測定 ヒトＮＧＦとヒトトランスフェリン受容体を認識するキメラ抗体を含有する融 合タンパク質を構築した。ＮＧＦ配列を２つのアラニン残基から成る短いリンカ ーセグメントを介して抗体分子の重鎖のＮ末端へ連結した。以下に述べるように 、一過性のトランスフェクションによるスクリーニングを容易にするために、抗 体の軽鎖と重鎖とそれらの融合誘導体をコードする別々の発現プラスミドを最初 に構築した。その後、重鎖と軽鎖の配列を単一の発現プラスミドに組み込んだ。抗体軽鎖発現プラスミドの調製 ベクタ− ｐＲＣ／ＣＭＶＬを抗体軽鎖哺乳動物発現プラスミド構築のために 使用した。このベクターはｐＲＣ／ＣＭＶプラスミド（Invitrogen）の誘導体で あり、ＭｌｕＩ−ＨｉｎｄIII消化のｐＲＣ／ＣＭＶプラスミドへｐＥＥ１４（C elltech社）由来のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄIII断片を挿入することにより、サイトメ ガロウイルス（ＣＭＶ）主要即時型（ＭＩＥ）プロモーターのより大型版をもつ よう修飾を受けている。 最初の構築物，ｐＣＭＶκ１２は、ヒトカッパ (kappa)軽鎖定常領域に直接に 融合したネズミ１２８．１抗−ヒトトランスフェリン受容体モノクローナル抗体 （実施例１０参照）の軽鎖可変領域を含んでいた。このプラスミドを構築する１ つの方法は、１２８．１可変領域をコードする配列をもつプラスミドｐＡＧ４６ １１（ＷＯ９３／１０８１９ １９９３年６月１０日発表；ｐＡＧ４６１１に関 する部分はこの中の 参考文献により本明細書中に組み込まれている）由来のＨｉｎｄIII−ＰｐｕＭ Ｉ断片とそれに加えてヒトカッパ定常領域をコードする２つの隣接断片を一緒に ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで切断したｐＲＣ／ＣＭＶＬに連結することである。 ヒトカッパ定常領域をコードする２つの断片はｐＡＧ４６１１由来であるが、 カッパをコードする領域の３’末端のすぐ後にＸｂａＩ部位を含めるために修飾 される。ＸｂａＩ部位の導入は次の方式で行われてもさしつかえない。 ＸｍｎＩ部位のちょうど上流のカッパ配列の５’末端に相補的な１つのプライ マーとカッパ配列の３’末端に相補的でＸｂａＩ制限部位を含む２つめのプライ マーからなるＰＣＲプライマー対をヒトカッパ定常領域の断片を生成させるため に使用した。 ｐＡＧ４６１１鋳型から増幅したＰＣＲ生成断片をＸｍｎＩとＸｂａＩで消化し 、ｐＡＧ４６１１（カッパ定常領域をコードする配列の５’末端を含む）由来の ＰｐｕＭＩ−ＸｍｎＩ断片とｐＡＧ４６１１由来のＨｉｎｄIII−ＰｐｕＭＩ断 片と共にＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで切断したｐＲＣ／ＣＭＶＬに 連結してｐＣＭＶκ１２を作成する。このプラスミドは可変と定常ドメインをコ ードする両エクソンの間に存在するイントロンを復元したｐＣＭＶκＩＶＳ２１ を作成するために使用された。このプラスミドをｐＣＭＶκ１２由来の０．４ｋ ｂのＰｐｕＭＩ−ＸｍｎＩ断片とｐＡＧ４６１１由来のイントロンを含む３．０ ｋｂのＰｐｕＭＩ−ＸｍｎＩ断片の交換により構築した。抗体重鎖とＮＧＦ−重鎖融合物発現プラスミドの調製 重鎖発現プラスミドの構築に使用されたキメラ抗体配列はブラスミドｐＡＨ４ ６０２（ＷＯ９３／１０８１９ １９９３年６月１０日発表；ｐＡＨ４６０２に 関する部分はこの明細書中に参考文献により組み込まれている。）から誘導され 、ＩｇＧ１定常領域をコードするヒトゲノムＤＮＡに融合したネズミ１２８．１ 抗−ヒトトランスフェリン受容体モノクローナル抗体の重鎖可変領域から成って いた。完全なキメラ重鎖遺伝子をもつｐＡＨ４６０２の３．０ｋｂのＥｃｏＲＶ −ＢａｍＨＩ断片を哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１３(Celltech 社) のＳｍａＩ とＢｃｌＩ部位の間にクローニングして、ｐＥＥγ１を作成した。それから、こ のプラスミドを重鎖をコードする領域の下流にある削除することによりプロモー ターの直後にユニークなＨｉｎｄIII部位を含むように修飾した。ＤＮＡポリメ ラーゼを使用してＨｉｎｄIII部分消化プラスミドを埋めた後、再連結により第 ２のＨｉｎｄIII部位を削除した。このｐＥＥγ１誘導体をｐＥＥ７ＨＩＩＩｂ と命名 した。 抗体重鎖のアミノ末端に連結したヒトＮＧＦを発現するプラスミドを次の多段 階手順を使用して構築した。５’の翻訳されない領域とキメラ１２８．１重鎖の シグナル配列をコードするセグメントとをｐＥＥγ１ＨＩＩＩｂプラスミドから 削除し、ＮｏｔＩ部位を含むリンカーセグメントと置換した。このリンカーセグ メントは重鎖可変領域の成熟アミノ末端にフレームを合わせて１対のアラニン残 基をコードする。この置換をＰＣＲを介した突然変異誘発を使用して行い、修飾 されたＤＮＡ断片を作成し、それからその断片をｐＥＥγ１ＨＩＩＩｂプラスミ ドのＨｉｎｄIIIとＮｈｅＩ部位の間と交換した。鋳型としてｐＡＨ４６０２を 用い，５’と３’ＰＣＲプライマーとしてそれぞれオリゴヌクレオチド＃３７５ と＃３７６を使用して突然変異誘発を実行した。プライマー＃３７５はＨｉｎｄ III部位とその後にＮｏｔＩ（Ａｌａ−Ａｌａ）リンカーを上流に付加した１２ ８．１重鎖遺伝子の５’末端に相補的であった。プライマー＃３７６は抗体遺伝 子のＣＨ１をコードする部分に見られたセグメントに相補的であった。 増幅したＰＣＲ断片をＨｉｎｄIIIとＮｈｅＩで消化し、それからｐＥＥＥγ１ ＨＩＩＩｂから単離したＨｉｎｄIII−ＮｈｅＩベクター断片と連結した。大腸 菌 ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ株への形質転換後、修飾された１２８．１重鎖遺伝子を 含むクローンを制限消化で同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。このプラス ミド，ｐＥＥγ１ＨＩＩＩｂ／ＮｏｔＩは最終のＮＧＦ−抗体融合プラスミドの 構築において、中間体として役立った。 第２の中間構築物，ｐＲＣ／ＣＭＶＬ−ＮＧＦ１２０は、ＮｏｔＩ部位を導入 するため３’末端をコードする配列の改変されたヒト プレプロＮＧＦを含み、 次の方法で作成した。プラスミド ｐＲＣ／ＣＭＶＬ−ＮＧＦ１２０において、 プレプロＮＧＦは前にコザック配列（実施例１１に記述）を置き、ＣＭＶ ＭＩ Ｅプロモーター（上述）の長い配列の支配下にある。ｐＲＣ／ＣＭＶＬ−ＮＧＦ １２０を構築する１つの方法は、最初にｐＧＥＭ２／ＫＮＧＦ（実施例１１から ）ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩ挿入部を除き、それをＨｉｎｄIIIとＳｍａＩで消化し たｐＥＥ１４（Celltech社）へ挿入し、ｐＥＥＮＧＦ７を作成する方法である。 コザック配列−プレプロＮＧＦ遺伝子とＳＶ４０ ポリＡ部位（ｐＥＥ１４ベク ターに存在する）を含む約１０００塩基対の断片をＨｉｎｄIII完全消化とＢａ ｍＨＩ部分消化によりｐＥＥＮＧＦ７から除く。それから、この断片をＨｉｎｄ IIIとＢａｍＨＩで消化したｐＲＣ／ＣＭＶＬへ挿入して、ｐＲＣ／ＣＭＶＬ− ＮＧＦ１２０を作成する。 それから、抗体重鎖への融合を容易にするためにｐＲＣ／ＣＭＶＬ−ＮＧＦ１ ２０を次の方法で修飾し、そのコードする配列の３’末端にＮｏｔＩ部位を導入 した。これらの修飾をとり込んだ改変ＤＮＡを作成するため、ＰＣＲプライマー の対＃２１９／＃３８２を使用した。正方向（５’）プライマー＃２１９はヒト ＮＧＦプレプロをコードする配列内のセグメントと同一であり、一方逆方向（３ ’）プライマー＃３８２はＮＧＦをコードする配列の３’末端に相補的であり、 さらにＮＧＦのＣ末端にフレームを合わせてＡｌａ−Ａｌａジペプチドをコード するＮｏｔＩ制限部位をもっている。 ｐＲＣ／ＣＭＶＬ−ＮＧＦ１２０鋳型から増幅したＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩとＸ ｂａＩで切断し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断プラスミドに戻し連結した。大腸菌 ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ株への形質転換の後に、修飾したＮＧＦプラスミドを含む クローンを制限消化で同定し、ＤＮＡ配列決定にり確認した。ｐＲＣ／ＣＭＶＬ −ＮＧＦＮｏｔＩと命名したこのプラスミドから修飾したプレプロＮＧＦ遺伝子 全体を持つＨｉｎｄIII−ＮｏｔＩ断片を得て、ＨｉｎｄIIIとＮｏｔＩで消化し たｐＥＥγ１ＨＩＩＩｂ／ＮｏｔＩ重鎖プラスミドへ連結した 。この連結反応から誘導された生成物であるプラスミドｐＲＣ／ＣＭＶＬγ１Ｎ ＧＦ−４は完全なプレプロ（propro）ＮＧＦ−（Ａｌａ）₂ −１２８．１重鎖融 合タンパク質をコードしていた。結合１２８．１軽鎖／ＮＧＦ−１２８．１重鎖発現プラスミドの構築 ＣＯＳ７細胞を使った一過性のトランスフェクション法における機能的な評 価の後、全体の軽鎖転写単位をｐＲＣ／ＣＭＶＬベクターのバックボーンから切 り取り、ＮＧＦ−重鎖発現プラスミド内へ移した。これを行うために軽鎖発現プ ラスミドｐＣＭＶκＩＶＳ２１をＢａｍＨＩで切断しＢｇｌIIで部分消化して、 ＣＭＶプロモーターと軽鎖遺伝子とポリアデニル化／終止シグナルを含む６．４ ｋｂ断片を単離した。このＤＮＡセグメントをＢａｍＨＩで切断しアルカリフォ スファターゼで処理したｐＲＣ／ＣＭＶＬγ１ＮＧＦ−４に連結した。大腸菌へ の形質転換そしてＰＣＲと制限消化によるスクリーニングの後に、ＢａｍＨＩ部 位へ２つの可能な向きのどちらかに挿入された軽鎖単位を含むプラスミドを同定 した。これらの２つのプラスミド構築物を、同じ向きで重鎖と軽鎖の両遺伝子転 写単位をもつものをｐＥＥＡＫ−３０κ／γ１ＮＧＦ５−４と呼び、重鎖と軽鎖 遺伝子が反対向きに転写されるものをｐＥＥＡＫ−３０γ１ＮＧＦ／κ５−１２ と呼んだ。哺乳動物細胞で発現したＮＧＦ−抗体融合タンパク質におけ るＮＧＦの測定 発現プラスミドｐＥＥＡＫ−３０γ１ＮＧＦ／κ５−１２をＣＯＳ細胞にトラ ンスフェクトし一過性に発現させた。培養上清中のＮＧＦ−抗−トランスフェリ ン受容体抗体融合タンパク質（ＮＡＫと命名）を標準的なＥＬＩＳＡ法で検出し た。 簡単に言うと、ヒトＩｇＧ１に特異的な捕捉抗体（抗−ヒトＩｇＧ，Ｖｅｃｔ ｏｒＬａｂｓ）を９６穴プレートのウェル内に被覆した。ウェルを洗い（ＰＢＳ −０．０５％トゥイーン）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、 そしてトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の上清をウェルに加え（典型的に４倍希 釈列で）、ついで室温で１時間インキュベートした。 ＮＡＫ融合タンパク質のＮＧＦ部分を認識するであろう抗−ＮＧＦ検出抗体（ ラットモノクローナル抗体１Ｇ３）を選択し、ウェルの融合タンパク質の上面に 加えた。ビオチン化した抗ラット抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）とベクタステイ ン ＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を使用するアビジン−ビオチン反応 によってシグナルを増幅させた後ペルオキシダーゼ反応で結合抗体を検出した。 既知濃度のＮＧＦについて作成した標準曲線から外挿することでタンパク質を定 量した。 上記以外のＥＬＩＳＡ手順を用いて融合タンパク質を検出し定量することもで きる。たとえば、捕捉抗体と検出抗体が融合タンパク質の同一部分を認識しても よい。 ＮＡＫを発現する安定な細胞株を樹立するため、開環したベクターｐＥＥＡＫ −３０γ１ＮＧＦ／κ５−１２をＣＨＯ細胞内に電気穿孔法で導入し、細胞を２ ５ｍＭのメチオニン スルフォキシミン（methionine sulfoximine）(MSX) 中で 薬剤選択を行った。ＮＡＫ融合タンパク質の発現を上述のＥＬＩＳＡで測定した 。ＮＧＦと抗トランスフェリン受容体抗体の両方の配列を含むタンパク質が発現 し培養上清中に検出された。ＣＯＳ細胞上清中からＮＧＦ−抗−トランスフェリン受容体抗体融合タンパク質 の精製 トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の上清に存在するＮＧＦ−抗−トランスフェ リン受容体抗体融合タンパク質を、製造業者の指示書にしたがってプロティンＡ アフィニティカラム（Perseptive Biosystems， ケンブリッジ，MA）、次にＰｏ ｒｏｓ ＨＳ／５０陽イオン交換カラム（Perseptive Biosystems）を用いて精 製した。 アフィニティ精製した画分は、還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで、分子 量６３ｋＤと２４ｋＤに２つの主要なバンドを含んでいた。両バンドを抗ヒトＩ ｇＧ１抗体で認識した。６３ｋＤバンドはまた抗ＮＧＦ抗体でも認識した。トランスフェリン受容体結合活性のためのイン・ビトロ競合測定 ＮＡＫ融合タンパク質の重要な属性はトランスフェリン受容体への結合能であ る。トランスフェリン受容体に対する結 合において融合タンパク質が天然の抗トランスフェリン受容体抗体（１２８．１ ）と競合する能力により、ヒトトランスフェリン受容体へのＮＡＫ融合タンパク 質の親和性の測定評価を行った。 実施例１１のように競合測定を行った，ただし可溶ヒトトランスフェリン受容 体を使用し、５ｍＭセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗トランスフェリン受 容体抗体と種々の濃度のＮＡＫ融合タンパク質の混合物をそれぞれのウェルに加 えた。これらの競合測定の結果は、抗トランスフェリン受容体抗体と比べてＮＡ Ｋ融合タンパク質はわずかに低い親和性でヒトトランスフェリン受容体と結合す ることを明らかにした。ＮＧＦ活性のイン・ビトロ測定 細胞株６−２４〔フレデリックがん研究所，フレデリック，ＭＤのデビッド カプラン（Ｄａｖｉｄ Ｋａｐｌａｎ）より入手〕を使用した細胞に基づくバイ オアッセイを行い、これらの細胞からの軸索突起伸長刺激能を測定することによ り発現ＮＡＫ融合タンパク質がＮＧＦ活性を持つかどうか評価した。６−２４細 胞株はＰＣ１２細胞由来のものであり、ＰＣ１２細胞をｔｒｋＡ発現ベクターで トランスフェクトすることによりｔｒｋＡ高親和性ＮＧＦ受容体を過剰発現する ように設計されている。 ６−２４細胞株を５％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、２ｍＭＬ−グルタミン を含むＤＭＥＭ培地 (Bio Whittaker)でＴ７５フラスコ中５％ＣＯ₂ の下で培養 した。９６穴プレー トを、ウェル当たり５０μｌの１．０μｇ／ｃｍ² ウシコラーゲンIVを含む０． ０５ＮのＨＣｌを用いて室温で１時間被覆し、ＰＢＳで３回洗浄した。それぞれ のフラスコから６−２４細胞を５ｍｌ取り、２１ｇニードルを２〜５回通過させ てクランプを破壊した。この手順により細胞の軸索を喪失させた。細胞を約２× １０⁴ 個／ｍｌまで培地で希釈し、コラーゲン被覆プレートのそれぞれのウェル に５０μｌ加え（１０００個／ウェル），そして一晩３７℃でインキュベートし 、細胞を付着させた。 試験対象試料は使用前にフィルター滅菌した。用量反応曲線を作成するために 、試料を増殖培地で２倍増加の段階希釈し、５０μｌの試料をウェルに添加した 。同じように精製マウスＮＧＦを段階希釈し、プレートに添加して標準曲線を作 成した。ＮＧＦ含有試料に１日間曝露した後、２つまたは３つの代表的な視野に 入る細胞の総数と細胞体の直径の２倍より長い軸索を少なくとも１本以上突き出 している細胞の数を数えることでＮＧＦ活性の有無を判定することによって、プ レートの点数評価を行った。その結果を、ＮＧＦ濃度の関数として軸索突き出し 細胞のパーセント比率で示した。この測定結果から融合タンパク質はイン・ビト ロでＮＧＦ生物活性を十分に保持していることがわかった。均等物 当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の 具体的態様による多くの均等物を認識し 、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は下記クレームに 記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年６月２６日 【補正内容】 ２９．該切断不可能なリンクが、アミド結合、スルフヒドリル基とマレイミド 誘導体との間の結合、チオールとアミノ基の間の結合、またはアルデヒドとアミ ノ基の間の結合である、請求項２８記載の方法。 ３０．血液脳関門を通過して神経作用剤を送達する送達システムであって、脳 毛細血管内皮細胞受容体リガンドと該神経作用剤を含む融合タンパク質を含有し 、これによってイン・ビボで血液脳関門を通過して該神経作用剤を移送する送達 システム。 ３１．該神経作用剤が、成長因子、リンホカイン、リンホカイン拮抗物質、サ イトカイン、サイトカイン拮抗物質、ドパミンデカルボキシラーゼおよびトリコ サンチンからなる群より選択されるものである、請求項３０記載の送達システム 。 ３２．該神経作用剤が、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴ Ｆ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤ ＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４ ）、ニューロトロフィン５（ＮＴ−５）および繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）か ら成る群より選択される成長因子である 、請求項３１記載の送達システム。 ３３．神経作用剤がＮＧＦである請求項３２記載の送達システム。 ３４．神経作用剤がＣＮＴＦである請求項３２記載の送達システム。 ５０．該抗体またはその断片がネズミ抗体の可変領域とヒト起原の定常領域と のキメラである、請求項４９の送達システム。 ５１．該可変領域が１２８．１ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体 由来でありそして該定常領域がＩｇＧ₃ ヒンジ領域である、請求項５０記載の送 達システム。 ５２．該神経作用剤が切断可能なリンクを介して融合タンパク質にコンジュゲ ートされているものである、請求項４８記載の送達システム。 ５３．該神経作用剤が切断不可能なリンクを介して融合タンパク質にコンジュ ゲートされているものである、請求項４８記載の送達システム。 ５４．脳毛細血管内皮細胞受容体リガンドおよび神経作用剤を含有する融合タ ンパク質。 ５５．該神経作用剤が、成長因子、リンホカイン、リンホカイン拮抗物質、サ イトカイン、サイトカイン拮抗物質、ドパミンデカルボキシラーゼおよびトリコ サンチンからなる群より選択されるものである、請求項５４記載の融合タンパク 質。 ５６．該神経作用剤が、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴ Ｆ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤ ＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４ ）、ニューロトロフィン５（ＮＴ−５）および繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）か ら成る群より選択される成長因子である、請求項５５記載の融合タンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/44 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 39/395 9455−4Ｃ 37/14 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フライデン，フィリップ エム. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01730 ベッドフォード，ワシントン ス トリート 32 (72)発明者 スターズィック，ルース エム. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01701 フラミンガム，ウィローブルック ドライブ 12 (72)発明者 モリソン，シェリー エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア 90049 ロサンジェルス，デンスロー アベニュ ー 258 (72)発明者 パーク，アン−チャング アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139 ケンブリッジ，ナンバー．５，リ ー ストリート 27 (72)発明者 マグラス，ジョン ピー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139 ケンブリッジ，フォート ワシン トン プレイス 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液脳関門を通過して神経作用剤を宿主の脳に送達する方法であって、脳 毛細血管内皮細胞受容体リガンドおよび該神経作用剤を含む融合タンパク質を宿 主に投与することを含み、該投与が該リガンドのその相補的脳内皮細胞受容体へ の結合が生じ、そして神経作用剤が薬理学的に活性な形でかつ治療上有効量で血 液脳関門を通過して移送される条件下で行われる方法。 ２．該神経作用剤が、成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、ＣＤ４、リ ンホカイン、リンホカイン拮抗剤、サイトカイン、サイトカイン拮抗剤、ドパミ ンデカルボキシラーゼおよびトリコサンチンから成る群より選択されるものであ る、請求項１記載の方法。 ３．該神経作用剤が、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮ Ｆ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４） 、ニューロトロフィン５（ＮＴ−５）および繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）から 成る群より選択される成長因子である、請求項２記載の方法。 ４．該神経作用剤がＮＧＦである請求項３記載の方法。 ５．該神経作用剤がＣＮＴＦである請求項３記載の方法。 ６．該リガンドがトランスフェリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、 インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン、トランスフェリン受容体に 対する抗体、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体に対する抗体、インス リン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体に対する抗体およびインスリン受容体に対 する抗体から成る群より選択されるものである請求項１記載の方法。 ７．リガンドと神経作用剤が中間にあるペプチドまたはポリペプチドを介して 連結されているものである、請求項１記載の方法。 ８．中間のポリペプチドが抗体鎖由来のアミノ酸配列である、請求項７記載の 方法。 ９．中間のポリペプチドがＩｇＧ₃ ヒンジ領域である請求項８記載の方法。 １０．リガンドがトランスフェリンでありそして神経作用剤が神経成長因子（ ＮＧＦ）である、請求項９記載の方法。 １１．リガンドがトランスフェリンでありそして神経作用 剤が繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項９記載の方法。 １２．中間のペプチドが５個のグリシン（ｇｌｙ）₅ である請求項７記載の方 法。 １３．リガンドがトランスフェリンでありそして神経作用剤が神経成長因子（ ＮＧＦ）である、請求項１２記載の方法。 １４．リガンドが抗トランスフェリン受容体抗体でありそして神経作用剤が神 経成長因子（ＮＧＦ）である、請求項７記載の方法。 １５．抗トランスフェリン受容体抗体がキメラ抗体である、請求項１４記載の 方法。 １６．リガンドがトランスフェリンでありそして神経作用剤が繊毛神経栄養因 子（ＣＮＴＦ）である、請求項１２記載の方法。 １７．中間のペプチドがロイシン−グルタミン酸（ｌｅｕ−ｇｌｕ）である、 請求項７記載の方法。 １８．リガンドがトランスフェリンでありそして神経作用 剤が神経成長因子（ＮＧＦ）である、請求項１７記載の方法。 １９．血液脳関門を通過して神経作用剤を宿主の脳に送達する方法であって、 宿主に融合タンパク質−神経作用剤コンジュゲートを、該融合タンパク質と脳毛 細血管内皮細胞受容体との結合が生じそして該神経作用剤が薬学的に活性な形で かつ治療上有効な量で血液脳関門を通過して移送される条件下で投与するもので あり、該融合タンパク質が脳毛細血管内皮細胞受容体リガンドおよび脳毛細血管 内皮細胞受容体に対して反応性を有する抗体またはその断片を含むものである方 法。 ２０．リガンドおよび抗体またはその断片が同一タイプの脳毛細血管内皮細胞 受容体に対して反応性を有するものである、請求項１９記載の方法。 ２１．脳毛細血管内皮細胞受容体のタイプがトランスフェリン受容体でありそ して該リガンドがトランスフェリンである、請求項２０記載の方法。 ２２．該抗体またはその断片がキメラである、請求項２１記載の方法。 ２３．該キメラがネズミ抗体の可変領域およびヒト起原の定常領域である請求 項２２記載の方法。 ２４．該可変領域が１２８．１ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体 由来のものである、請求項２３記載の方法。 ２５．該キメラが、該モノクローナル抗体可変領域とＩｇＧ₃ ヒンジ領域であ る、請求項２４記載の方法。 ２６．該神経作用剤が切断可能なリンク（ｌｉｎｋ）を介して融合タンパク質 にコンジュゲートされているものである、請求項２１記載の方法。 ２７．該切断可能なリンクが、ジスルフィド、シス−アコニット酸、シス−カ ルボキシリックアルカジエン、シス−カルボキシリックアルカトリエンまたはポ リ無水マレイン酸を用いて形成されるものである、請求項２６記載の方法。 ２８．該神経作用剤が切断不可能なリンクを介して融合タンパク質にコンジュ ゲートされているものである、請求項１９記載の方法。 ２９．該切断不可能なリンクが、アミド結合、スルフヒドリル基とマレイミド 誘導体との間の結合、チオールとアミノ基の間の結合、またはアルデヒドとアミ ノ基の間の結合である、請求項２８記載の方法。 ３０．血液脳関門を通過して神経作用剤を送達する送達システムであって、脳 毛細血管内皮細胞受容体リガンドと該神経作用剤を含む融合タンパク質を含有し 、これによってイン・ビボで血液脳関門を通過して該神経作用剤を移送する送達 システム。 ３１．該神経作用剤が、成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、ＣＤ４、 リンホカイン、リンホカイン拮抗物質、サイトカイン、サイトカイン拮抗物質、 ドパミンデカルボキシラーゼおよびトリコサンチンからなる群より選択されるも のである、請求項３０記載の送達システム。 ３２．該神経作用剤が、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴ Ｆ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤ ＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４ ）、ニューロトロフィン５（ＮＴ−５）および繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）か ら成る群より選択される成長因子である、請求項３１記載の送達システム。 ３３．神経作用剤がＮＧＦである請求項３２記載の送達システム。 ３４．神経作用剤がＣＮＴＦである請求項３２記載の送達 システム。 ３５．該リガンドが、トランスフェリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１ ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン、トランスフェリン受容 体に対する抗体、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体に対する抗体、イ ンスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体に対する抗体およびインスリン受容体 に対する抗体から成る群より選択されるものである請求項３０記載の送達システ ム。 ３６．該リガンドと該神経作用剤が中間にあるペプチドまたはポリペプチドを 介して連結されているものである請求項３０記載の送達システム。 ３７．該中間のポリペプチドが抗体鎖由来のアミノ酸配列である、請求項３６ 記載の送達システム。 ３８．該中間のポリペプチドがＩｇＧ₃ ヒンジ領域である、請求項３７記載の 送達システム。 ３９．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が神経成長因 子（ＮＧＦ）である、請求項３８記載の送達システム。 ４０．該リガンドが抗トランスフェリン受容体抗体であり そして該神経作用剤が神経成長因子（ＮＧＦ）である、請求項３６記載の送達シ ステム。 ４１．該抗トランスフェリン受容体抗体がキメラ抗体である、請求項４０記載 の送達システム。 ４２．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が繊毛神経栄 養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項３８記載の送達システム。 ４３．該中間ペプチドが５個のグリシン（ｇｌｙ）₅ である、請求項３６記載 の送達システム。 ４４．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が神経成長因 子（ＮＧＦ）である、請求項４３記載の送達システム。 ４５．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が繊毛神経栄 養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項４３記載の送達システム。 ４６．中間ペプチドがロイシン−グルタミン酸（ｌｅｕ−ｇｌｕ）である、請 求項３６記載の送達システム。 ４７．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経 作用剤が神経成長因子（ＮＧＦ）である、請求項４６記載の送達システム。 ４８．血液脳関門を通過して神経作用剤を送達するための送達システムであっ て、神経作用剤に連結した融合タンパク質を含有し、この融合タンパク質は脳毛 細血管内皮細胞受容体リガンドおよび脳毛細血管内皮細胞受容体に対して反応性 を有する抗体またはその断片を含み、これによってこの送達システムがイン・ビ ボで投与されたとき血液脳関門を通過して神経作用剤を移送するものである送達 システム。 ４９．該リガンドおよび抗体またはその断片がトランスフェリン受容体に対し て反応性を有するものでありかつ該リガンドがトランスフェリンである、請求項 ４８記載の送達システム。 ５０．該抗体またはその断片がネズミ抗体の可変領域とヒト起原の定常領域と のキメラである、請求項４９の送達システム。 ５１．該可変領域が１２８．１ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体 由来でありそして該定常領域がＩｇＧ₃ ヒンジ領域である、請求項５０記載の送 達システム。 ５２．該神経作用剤が切断可能なリンクを介して融合タン パク質にコンジュゲートされているものである、請求項４８記載の送達システム 。 ５３．該神経作用剤が切断不可能なリンクを介して融合タンパク質にコンジュ ゲートされているものである、請求項４８記載の送達システム。 ５４．脳毛細血管内皮細胞受容体リガンドおよび神経作用剤を含有する融合タ ンパク質。 ５５．該神経作用剤が、成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、ＣＤ４、 リンホカイン、リンホカイン拮抗物質、サイトカイン、サイトカイン拮抗物質、 ドパミンデカルボキシラーゼおよびトリコサンチンからなる群より選択されるも のである、請求項５４記載の融合タンパク質。 ５６．該神経作用剤が、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴ Ｆ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤ ＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４ ）、ニューロトロフィン５（ＮＴ−５）および繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）か ら成る群より選択される成長因子である、請求項５５記載の融合タンパク質。 ５７．該神経作用剤がＮＧＦである、請求項５６記載の融 合タンパク質。 ５８．該神経作用剤がＣＮＴＦである、請求項５６記載の融合タンパク質。 ５９．該リガンドが、トランスフェリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１ ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、インスリン、トランスフェリン受容 体に対する抗体、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体に対する抗体、イ ンスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体に対する抗体およびインスリン受容体 に対する抗体から成る群より選択されるものである、請求項５４記載の融合タン パク質。 ６０．該リガンドと該神経作用剤が中間にあるペプチドまたはポリペプチドを 介して連結されているものである、請求項５４記載の融合タンパク質。 ６１．該中間ポリペプチドが抗体鎖由来のアミノ酸配列である、請求項６０記 載の融合タンパク質。 ６２．該中間ポリペプチドがＩｇＧ₃ ヒンジ領域である、請求項６１記載の融 合タンパク質。 ６３．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が神経成長因 子（ＮＧＦ）である、請求項６２記載の 融合タンパク質。 ６４．該リガンドが抗トランスフェリン受容体抗体でありそして該神経作用剤 が神経成長因子（ＮＧＦ）である、請求項６０記載の融合タンパク質。 ６５．該抗トランスフェリン受容体抗体がキメラ抗体である、請求項６４記載 の融合タンパク質。 ６６．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が繊毛神経栄 養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項６２記載の融合タンパク質。 ６７．該中間ペプチドが５個のグリシン（ｇｌｙ）₅ である、請求項６０記載 の融合タンパク質。 ６８．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が神経成長因 子（ＮＧＦ）である、請求項６７記載の融合タンパク質。 ６９．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が繊毛神経栄 養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項６７記載の融合タンパク質。 ７０．中間のペプチドがロイシン−グルタミン酸（ｌｅｕ −ｇｌｕ）である、請求項６０記載の融合タンパク質。 ７１．該リガンドがトランスフェリンでありそして該神経作用剤が神経成長因 子（ＮＧＦ）である、請求項７０記載の融合タンパク質。 ７２．血液脳関門を通過して宿主の脳へ神経作用剤を送達するための医薬品の 製造における融合タンパク質の使用であって、該融合タンパク質が脳毛細血管内 皮細胞受容体リガンドおよび該神経作用剤を含むものであり、これにより該リガ ンドとその相補的な脳内皮細胞受容体との結合が生じそして該神経作用剤が薬学 的に活性な形でかつ治療上有効な量で血液脳関門を通過して移送される条件下で 送達が起こるものである融合タンパク質の使用。