KR101281208B1 - 피브로넥틴 ｅｄ-ｂ에 대한 항체 ｌ１９ 및 인터루킨１２의 융합 단백질 - Google Patents

피브로넥틴 ｅｄ-ｂ에 대한 항체 ｌ１９ 및 인터루킨１２의 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

치료 또는 진단 작용제 또는 약물을 신체 내의 세포 또는 조직, 예를 들어 신생물성 성장 또는 혈관신생 영역에 표적화시키기 위한 접합체. 생체내 진단 또는 치료법, 예를 들어 종양 성장 또는 전이의 억제, 혈관신생의 억제 및/또는 암 치료를 위한 접합체의 용도. 접합체는 올리고머성 단백질, 예를 들어 이종이량체성 단백질로서의 치료 또는 진단 작용제를 포함하고, 단백질의 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛은 특이적 결합원, 예를 들어 scFv와 같은 항체 단편에 각각 접합된다. 올리고머의 서브유닛들은 융합 단백질로서 특이적 결합원에 접합될 수 있다. 접합체는 IL-12를 신생물성 성장 및 혈관신생과 관련된 세포외 매트릭스 성분에 표적화시키기 위해 각각의 서브유닛이 scFv L19 또는 TN11에 융합된, 2개의 서브유닛이 있는 IL-12 이종이량체를 포함할 수 있다.
약물 표적화, 종양, 혈관신생, 접합체, IL12, scFv(L19), scFv(L19)-p35/p40-scFv(L19) 이종이량체

Description

피브로넥틴 ＥＤ-Ｂ에 대한 항체 Ｌ１９ 및 인터루킨 １２의 융합 단백질 {FUSION PROTEIN OF ANTIBODY L19 AGAINST FIBRONECTIN ED-B AND INTERLEUKIN 12}
본 발명은 표적-특이적 결합원에의 접합에 의해 약물을 원하는 생체내 부위에 표적화시키는 것에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암 및 기타 종양, 류마티스 관절염, 당뇨 망막병증, 노화-관련 황반 변성 및 혈관종의 치료를 포함하는, 병리학적 혈관신생의 억제와 같은 치료 용도를 위한 IL12와 항체 분자 간의 접합체에 관한 것이다.
이종이량체성 사이토카인 인터류킨-12 (IL12)는 강력한 항-종양 및 항-전이 활성이 있는, 선천적 및 세포성 면역의 주요 매개물이다 [4-6]. 이는 현재 (2005년 봄) 제II상 임상 시험에서 암 및 감염성 질환의 치료에 대해 테스트되고 있다. IL12는 주로 T 및 NK 세포 상에 작용하여, 이들의 활성 및 인터페론-γ (IFN-γ)의 분비를 자극한다 [7]. 그러나, 다수의 다른 사이토카인과 같이, 재조합 인간 IL12의 투여는, 1 ㎍/㎏/일만큼 낮은 용량에서도, 고도의 독성과 관련되어 [8, 9], 항암 약물로서 이를 개발하는 것을 방해한다.
종양 환경에 대한 IL12의 표적화 전달을 사용하여 사이토카인의 치료 지수를 증가시킬 수 있다.
Lexigen의 과학자들은 사이토카인을 특이적으로 표적화시키기 위하여 IL2 및 IL12와 같은 사이토카인을 면역글로불린에 융합시키는 것을 기술하였다 [17, 49-51]. 그러나, 본 발명자들은 이같은 접근법에 한계가 있다고 믿는다. 본 발명자들은 IgG-사이토카인 융합물이 실제로는 다기능성 단백질이고, 따라서 항원 결합 및 사이토카인 활성에 더하여, 이러한 IgG-기재 융합 단백질이 보체를 활성화시킬 수 있고 Fc 수용체와 상호작용할 수 있다는 것을 인지하였다. 본 발명자들의 의견으로는, 사이토카인이 Fc 수용체를 보유하는 세포 (예컨대 대식세포, 호중구 및 천연-킬러 세포)에 근접하게 되어 종양 표적화를 저지하고 비-특이적 세포 활성화를 야기할 수 있기 때문에, 이는 IgG-사이토카인 융합물의 원치 않는 성질이다. 본 발명자들은 전장 면역글로불린 대신 Fc가 없는 항체 분자, 예컨대 단일 사슬 Fv 항체 단편 (scFv)을 사용하는 것이 더욱 바람직한 것으로 생각하였다.
본 발명자들은 마우스 사이토카인 IL12의 서브유닛 p40 및 p35을 순차적으로 코딩하는 단일 사슬 폴리펩티드 ("scIL12")를 인간 단일 사슬 Fv 항체 단편 L19 ("scFv(L19)")와 융합시키는 것에 의해 IL12의 치료적 잠재력이 상당히 증가될 수 있다는 것을 설치류 암 모델에서 이전에 증명하였다. scFv(L19)는 암 환자에서 종양을 선택적으로 표적화할 수 있는 것으로 나타났다 [16]. L19는 혈관신생의 최고의 공지된 마커들 중 하나인 피브로넥틴 이소형(isoform) B-FN의 ED-B 도메인에 특이적으로 결합한다 [14, 25]. ED-B는 B-FN 이소형에서 발견되는 아미노산 91개의 엑스트라(extra) 도메인이고, 마우스, 래트, 토끼, 개 및 인간에서 동일하다. B-FN은 침습성 종양 및 혈관신생이 진행되는 기타 조직 내의 신생혈관 구조물, 예컨대 증식 단계의 자궁내막 및 병리학적 상태의 일부 안구 구조물 주변에 축적되지 만, 정상적인 성인 조직에서는 검출가능하지 않다 [1-3].
융합 단백질 scIL12-scFv(L19)는 마우스에서 관련이 없는 특이성의 scFv에 융합된 scIL12보다, 그리고 재조합 마우스 IL12보다 훨씬 더 우수한 치료 지수를 나타냈다. 이러한 실험은 IL12의 치료적 잠재력을 개선시키기 위한 수단으로서의 항체-기재 사이토카인 융합 단백질의 잠재력을 명백하게 나타냈다 [15]. 이러한 결과의 치료적 잠재력은 상당하다.
L19를 사용하는 것과 같이, IL12를 종양 혈관의 수준에 표적화시키는 것은 다수의 이유로 치료적으로 유익하다. 첫번째로, 정맥내 투여된 치료제가 종양 세포보다 종양 신생혈관계에 더 접근하기 쉽고, 이는 고형 종양의 간질성 고혈압과 관련된 문제점들을 피하는 것을 돕는다 [10]. 두번째로, 혈관신생 (기존의 혈관으로부터의 새로운 모세혈관의 성장)은 대다수의 침습성 고형 종양의 특징적인 양상이다 [11]. IL12를 신생혈관계에 표적화시키는 것은 다양한 여러 종양 유형의 면역요법을 허용할 것이다. 세번째로, IL12는 이의 하류 매개물 IP-10에 의해 부여된 항-혈관신생 활성을 나타낸다 [12, 13].
본 발명자들은 scIL12-scFv(L19)의 종양 표적화 성능, 및 또한 또다른 항-종양 사이토카인인 IL2에 융합된 scFv(L19) ("scFv(L19)-IL2")의 종양 표적화 성능을 이미 광범위하게 연구하였다 [18]. ScFv(L19)-IL2는 종양이 있는 마우스에서 정맥내 주사 24시간 후 30:1로 높은 종양:혈액 및 종양:기관 비율로 우수한 종양-표적화 성능을 나타낸다. 반면에, 동일한 동물 모델에서의 scIL12-scFv(L19)의 종양-표적화 능력은 24시간에 일반적으로 10:1보다 불량한 종양:혈액 및 종양:기관 비율 및 불량한 종양:간 및 종양:비장 비율로 더욱 온건하다 [15]. 그럼에도 불구하고 이러한 표적화 결과는 암탉 계란 라이소자임에 특이적이지만 마우스에서의 항원-특이적 인식이 결여된 융합 단백질 scIL12-scFv(HyHEL10)과 비교하여 우수하였다.
scFv(L19)가 인간 IgE의 CH4 도메인을 통해 이량체화되어 "소형 면역 단백질" 또는 SIP로 또한 명명된 미니-항체 구조가 구축될 때 scFv(L19)의 종양 표적화 성질이 개선되는 것으로 나타났다. SIP(L19)의 종양 표적화 성질은 기존에 기술되었다 [21].
본 발명은 본 발명자들이 각각 상이한 포맷의 사이토카인 및/또는 항체를 갖는 IL12 및 scFv(L19)의 3가지 접합체의 종양-표적화 능력을 비교하여, scIL12-scFv(L19)의 종양-표적화 능력이 접합체의 포맷을 특정 방식으로 변화시킴으로써 개선될 수 있다는 것을 발견한 연구를 기초로 한다.
본 발명자들이 테스트한 한 포맷은 도 1A에 도해된 scIL12-scFv(L19)였다. 이러한 접합체는 종래 기술의 발견과 일치하는 온건한 종양-표적화 능력을 나타냈다.
또다른 포맷에서는 상기 언급된 이량체성 SIP(L19) 구축물을 사용하여, 도 1B에 도해된 scIL12-SIP(L19)의 동종이량체가 생성되었다. 그러나, SIP 포맷을 사용하여 L19의 종양-표적화 성질이 개선될 수 있다는 종래 기술의 지시에도 불구하고, 이러한 접합체의 증가된 종양 섭취가 관찰되지 않았다.
또다른 포맷은 각각의 서브유닛이 scFv(L19)에 융합되어 도 1C에 도해된 scFv(L19)-p35/p40-scFv(L19) 이종이량체가 형성된, IL12 p40 및 p35 서브유닛의 이종이량체였다. 이러한 이종이량체성 포맷을 사용하여, 본 발명자들은 접합체의 종양 섭취에서 두드러진 개선을 달성하였다.
따라서, 본 발명자들은 IL12의 p40 및 p35 서브유닛을 통해 이종이량체화된 2개의 scFv 단편으로 구성된 신규 항체-IL12 융합 단백질 포맷이 전체 IL12 활성을 유지하고 우수한 종양-표적화 능력을 나타낸다는 것을 발견하였다.
이러한 결과는 종양 및 기타 병리학적 혈관신생 부위에 대한 IL12의 개선된 표적화를 위해, 예를 들어 류마티스 관절염, 당뇨 망막병증, 노화-관련 황반 변성 및 혈관종을 치료하는데 현저한 치료적 의미를 갖는다. 본 발명의 유용성은 IL12를 scFv(L19)에 융합시키는 것뿐만 아니라, 또다른 특이적 결합원과 또다른 약물 및 물질 간의 접합체로 또한 확장된다. 예를 들어, IL12 서브유닛에 접합된 scFv(L19) 이외의 특이적 결합원, 예컨대 종양-관련 항원, 예를 들어, 테나신-C의 이소형에 특이적인 기타 항체 단편으로 접합체가 구축될 수 있고, 종양 표적화 및 암 요법에 사용될 수 있다. 더욱 광범위한 의미에는 질환 및 기타 병리학적 상태의 진단 방법뿐만 아니라 예방 및 치료가 포함되는, 생체내 물질 표적화가 수반되는 다양한 기타 용도가 또한 포함된다.
다양한 양상에서의 본 발명은 신규 접합체, 이의 제조 방법, 접합체 또는 이의 성분을 코딩하는 핵산, 접합체를 함유하는 제약 조성물, 및 치료 방법에서의 접합체의 용도에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 갖는 단백질을 포함하고, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛이 각각 특이적 결합원에 접합된 접합체이 다.
단백질은 통상적으로 이량체성이고, 바람직하게는 이종이량체성이며, 전형적으로 생물학적으로 활성인 작용제 또는 약물, 일반적으로 치료 또는 진단 작용제를 포함한다.
따라서, 접합체는 일반적으로 하기의 포맷을 갖는다:
[특이적 결합원] - [제1 서브유닛] - [제2 서브유닛] - [특이적 결합원]
특이적 결합원은 일반적으로 항체 분자, 바람직하게는 단일 사슬 Fv (scFv)이다. 단일 사슬 Fv (scFv) 항체 분자는 접합체의 생체내 사용에 생리학적 및 치료적 장점을 제공하는 이의 작은 크기로 인해 본 발명에서 특히 바람직하다. 또한, scFv에는 Fc 영역이 결여되어, 잠재적으로 항-이디오타입 반응을 감소시키고, 또한 종양 표적화를 저지할 수 있고 비-특이적 세포 활성화를 야기할 수 있는 Fc 수용체와의 상호작용 및 보체의 활성화와 관련된 원치 않는 성질을 최소화시킨다.
따라서, 접합체의 바람직한 포맷은 하기와 같다:
[ScFv] - [제1 서브유닛] - [제2 서브유닛] -[ScFv]
별법으로, 특이적 결합원은 단일 도메인 항체, 및/또는 항체 단편일 수 있다. 특이적 결합원 및 항체 분자는 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
접합체는 융합 단백질, 즉 2개 이상의 유전자 또는 핵산 코딩 서열의 1개의 오픈 리딩 프레임 (ORF: open reading frame)으로의 융합으로부터 초래된 번역 산물인 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 이러한 융합 단백질을 포함할 수 있다. 2개의 유전자 또는 ORF의 융합된 발현 산물이 펩티드 링커 (잔기 20개, 바람직하게는 2- 15개의 아미노산의 짧은 신장물)에 의해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 펩티드 링커는 잔기 6개의 서열 GSADGG (서열 15)이다. 융합 단백질은 특이적 결합원 및 서브유닛의 상류 (5')에 일반적으로 위치한 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 접합체에서, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛은 통상적으로 연결되고, 예를 들어, 이들은, 예를 들어 1개 이상의 디술피드 결합을 통해, 공유결합으로 연결될 수 있다. 단백질은 올리고머성 (예를 들어 이량체성, 바람직하게는 이종이량체성)일 수 있고, 천연적으로 올리고머성 형태로 발생할 수 있으며, 따라서 접합체 내의 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛은 이들의 천연 방식으로 서로 회합될 수 있다. 따라서 본 발명은 접합체 내에서의 단백질의 천연 포맷의 사용 및 유지를 허용한다. 이는 약물의 단일-사슬 변이체를 구축하거나 사용할 필요가 없게 하고, 약물이 접합체 내에서 이의 완전한 활성을 유지할 잠재력을 최대화시킨다. 또한, 서브유닛들 간의 접합은 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛이 올리고머 내에서 회합 (예를 들어 이량체화)하도록 함으로써 접합체가 간편하게 구축 및 조립되도록 한다. 따라서, 전형적으로 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛이 각각 특이적 결합원에 접합되어, 서브유닛을 통해 회합하는 한쌍의 특이적 결합원-서브유닛 구축물 (예를 들어 이종이량체)이 형성된다. 바람직한 실시양태에서, 제1 서브유닛은 제1 융합 단백질로서 특이적 결합원에 접합되고, 제2 서브유닛은 제2 융합 단백질로서 특이적 결합원에 접합된다.
바람직하게는, 접합체의 분자량은 250 kDa 이하, 더욱 바람직하게는 200 kDa, 150 kDa, 125 kDa, 120 kDa 또는 115 kDa 이하이다 (즉, 250 000, 200 000, 150 000, 125 000, 120 000 또는 115 000 이하의 Mr). 이는 실측 분자량 (글리코실화 포함 또는 불포함)일 수 있거나, 또는 접합체의 예상 분자량을 예를 들어 기초로 하는 추정치 (글리코실화 포함, 또는 일반적으로 불포함)일 수 있다. 접합 체의 비교적 작은 크기는 조직을 투과하거나 표적 부위 (예를 들어 혈관신생, 종양 또는 질환 부위)에 접근하는 이의 능력을 증가시키고, 따라서 표적에 대한 접합체의 다가 (일반적으로 2가) 결합을 여전히 달성하면서 이의 치료 효능을 증가시키고 필요한 투여량을 감소시킨다.
일반적으로, 단백질 및 특이적 결합원은 접합체의 계획된 용도에 따라 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 단백질은 IL12이다. 상기 논의된 바와 같이, IL12는 암의 치료, 종양 성장 및 전이의 억제, 및 병리학적 혈관신생과 관련된 기타 상태의 치료에 적절하다. 접합체 내의 특이적 결합원 중 하나 또는 양쪽 모두가 신생물성 (특히 종양) 성장 및/또는 혈관신생과 관련된 마커, 예를 들어 신생물성 성장 및/또는 혈관신생 부위에 위치한 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 세포외 매트릭스 성분이 신생물성 성장 및/또는 혈관신생의 마커일 수 있는데, 세포외 매트릭스가 이러한 프로세스 동안 개조되기 때문이다.
한가지 예는 상기 설명된 바와 같이 엑스트라 도메인 ED-B를 함유하는 피브로넥틴의 B-FN 이소형이다. 본 발명의 특이적 결합원은 바람직하게는 피브로넥틴 이소형 B-FN의 ED-B에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합원은 L19의 VH CDR1 (서열 25), VH CDR2 (서열 26) 및/또는 VH CDR3 (서열 27) 서열 및/또는 L19의 VL CDR1 (서열 28), VL CDR2 (서열 29) 및/또는 VL CDR 3 (서열 30) 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합원은 L19의 VH CDR1, VH CDR2 및/또는 VH CDR3을 포함하는 아미노산 서열의 VH 도메인, 및 L19의 VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3을 포함하는 아미노산 서열의 VL 도메인을 갖는 scFv일 수 있다. 특이적 결합원은 서열 22에 기재된 바와 같은 L19 VH 도메인의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％인 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함할 수 있고/있거나 서열 23에 기재된 바와 같은 L19 VL 도메인의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％인 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 특이적 결합원은 L19 VH 도메인 (서열 22) 및 L19 VL 도메인 (서열 23)을 포함하는 scFv(L19)이다. 바람직한 실시양태에서, 특이적 결합원은 서열 5 (도 10)의 아미노산 서열을 갖는 scFv(L19)이다.
또다른 예는 다양한 이소형으로 존재하는 테나신-C (TnC)이다. 신생물성 조직에서, 추가적인 도메인을 함유하는 TnC, 특히 도메인 C를 함유하는 이소형 (cTN-C)이 정상 조직에서보다 더욱 광범위하게 발현된다 [33]. 따라서, 본 발명의 접합체 내의 특이적 결합원은 신생물성 조직과 관련된 테나신-C 이소형, 특히 cTN-C에 특이적으로 결합할 수 있다. 특이적 결합원은 서열 21 (도 11)에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 TN11 scFv일 수 있다 [33].
본 발명의 접합체 내의 특이적 결합원은 별법으로 또다른 종양-관련 항원, 즉, 정상적인 세포 환경 (예컨대 비-종양 세포 상)에서보다 종양 환경 (예컨대 종 양 세포 상)에서 더욱 우세한 항원에 결합할 수 있다.
일반적으로, 접합체 내의 2개의 특이적 결합원은 동일하거나, 또는 적어도 양쪽 모두 동일한 표적, 항원 또는 에피토프에 대해 특이적이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 접합체는 2개의 특이적 결합원, 바람직하게는 scFv(L19)에, 그리고 이들 사이에 접합된 인간 IL12 이종이량체를 포함하고, 이때
이종이량체는 제1 (일반적으로 p40) 서브유닛 및 제2 (일반적으로 p35) 서브유닛을 갖고;
제1 또는 p40 서브유닛이 제1 융합 단백질로서 제1 특이적 결합원에 접합되고;
제2 또는 p35 서브유닛이 제2 융합 단백질로서 제2 특이적 결합원에 접합된다.
상기 언급된 바와 같이, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛은 전형적으로 공유결합으로 연결되고, 예를 들어 디술피드 결합된다.
바람직하게는, 제1 또는 p40 서브유닛은 특이적 결합원에 N-말단 융합되고, 즉, 서브유닛이 융합 단백질 및 이를 코딩하는 핵산에서 특이적 결합원의 상류이다. 이러한 형태에서, 따라서 p40의 N-말단은 유리 (비-융합)될 수 있고, 이는 이의 활성을 최대화시키는 것으로 여겨진다.
바람직하게는, 제2 또는 p35 서브유닛은 특이적 결합원에 C-말단 융합되고, 즉, 서브유닛이 융합 단백질 및 이를 코딩하는 핵산에서 특이적 결합원의 하류이 다. 이는 융합 단백질의 발현을 증강시킬 수 있는데, 특이적 결합원, 특히 상류 N-말단 신호 펩티드가 있는 결합원이 용이하게 발현될 수 있고 따라서 융합 단백질이 효율적으로 발현되도록 하기 때문이다.
바람직하게는, 제1 융합 단백질은 서열 1에 제시된 바와 같은 p40-scFv(L19)의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 제2 융합 단백질은 서열 2에 제시된 바와 같은 scFv(L19)-p35의 아미노산을 갖는다.
본 발명의 접합체는 임의의 이용가능한 방법으로, 예를 들어 재조합 기술을 사용하여, 예를 들어 융합 단백질로서 접합체의 전부 또는 일부를 발현시킴으로써 생산될 수 있다.
예를 들어, 접합체는
제1 서브유닛 및 특이적 결합원을 포함하는 제1 융합 단백질을 발현시키는 단계;
제2 서브유닛 및 특이적 결합원을 포함하는 제2 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및
제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 함께 접합시키는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
일반적으로, 상기 방법은 발현 후 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 발현은 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포, 예를 들어 배양된 진핵생물 세포 예컨대 HEK 또는 CHO 세포, 또는 박테리아 세포 예 컨대 대장균에서 수행된다. 따라서 발현은 이같은 숙주 세포의 배양을 포함한다. 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 동일한 세포 (예를 들어 2개의 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로 공동-형질감염되거나 이들을 함유하는 세포)에서 발현되는 경우, 서브유닛들의 이종이량체화 또는 올리고머화가 세포 내에서 또는 세포로부터 융합 단백질을 정제하는 동안 일어날 수 있다. 또다른 경우에, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질이 별도로 발현된 후 (예를 들어 상이한 세포에서), 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛이 이종이량체화되거나 또다른 방식으로 회합되도록 접촉 (조합)될 수 있다.
서브유닛들을 함께 접합시키는 것은 능동 또는 수동 프로세스일 수 있다. 접합은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛이 함께 접합 (예를 들어 회합 또는 올리고머화/이종이량체화)되는 조건에 노출 또는 적용시키는 것을 포함할 수 있다. 접합은 서브유닛들 간의 디술피드 결합 형성, 또는 또다른 공유 결합의 형성을 포함할 수 있다. 디술피드 결합 형성과 같은 접합은 비-환원 조건 하에 일어날 수 있고, 따라서 접합은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 비-환원 조건에 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 융합 단백질을 발현시키고 접합체를 생산하기 위한 적절한 방법이 하기 실시예에서 상세하게 제공된다.
추가적인 단계로서, 방법은 접합체를 제약 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이는 접합체를 정제하는 단계 및 이를 생리학적으로 허용가능한 담체와 조합하는 단계를 수반한다. 제약 조성물은 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
접합체 및 이의 일부를 코딩 (예를 들어 융합 단백질을 코딩)하는 핵산 분자 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
한 양상에서, 본 발명은
특이적 결합원 및 제1 단백질 서브유닛을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 핵산 분자; 및
특이적 결합원 및 제2 단백질 서브유닛을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 핵산 분자
를 포함하는 조성물이다.
핵산 분자는 융합 단백질에서 특이적 결합원과 서브유닛이 펩티드 링커에 의해 연결되도록 특이적 결합원과 서브유닛 간의 펩티드 링커를 코딩할 수 있다. 코딩될 수 있는 특정 융합 단백질, 서브유닛, 특이적 결합원 및 링커는 본원의 다른 곳에서 더욱 상세하게 기술된다. 바람직한 실시양태에서, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛은 각각 IL12 이종이량체성 서브유닛 (전형적으로 p40 및 p35 서브유닛)이고, 바람직하게는 특이적 결합원은 scFv, 특히 scFv(L19)이다. 한 실시양태에서, 제1 핵산 분자는 서열 1에 기재된 바와 같은 IL12p40-scFv(L19)의 아미노산 서열을 코딩하고/하거나 제2 핵산 분자는 서열 2에 기재된 바와 같은 scFv(L19)-IL12p35의 아미노산 서열을 코딩한다.
핵산 분자는 벡터, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 발현에 적절한 플라스미드일 수 있다. 따라서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 제1 벡터 및 제2 벡터 일 수 있다. 일반적으로, 뉴클레오티드 서열은 전사를 위해 프로모터와 같은 조절 요소에 작동가능하게 연결된다.
제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 핵산 분자로 공동-형질감염된 세포 또는 이같은 세포의 딸일 수 있는 숙주 세포 내에 함유될 수 있다. 핵산 분자를 함유하는 세포, 특히 진핵생물 세포 예를 들어 HEK 및 CHO 세포, 또는 박테리아 세포 예를 들어 대장균 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
핵산으로부터의 발현 후, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 융합 단백질들이 서브유닛을 통해 접합되어 본 발명의 접합체가 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체는 접합체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자 (전형적으로 인간 환자)에서의 질환 또는 장애의 치료 방법 (예방 치료를 포함할 수 있음)과 같은 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
접합체를 사용하여 치료가능한 상태로는 암, 기타 종양 및 신생물성 상태가 포함된다. 접합체는 혈관신생을 억제함으로써 류마티스 관절염, 당뇨 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 혈관종 및 종양 (암 포함)을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료는 예방 치료를 포함할 수 있다. 접합체는 진단 방법, 예를 들어, 상기 상태들 중 임의의 것과 관련될 수 있는 혈관 신생의 표적화 및 진단에서 또한 투여될 수 있다. 접합체 내에 함유된 단백질 치료 또는 진단 작용제의 성질, 및 특이적 결합원의 특이성에 따라, 기타 질환 및 상태가 또한 진단 및 치료될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 양상은 본 발명의 접합체를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법, 이같은 접합체를 포함하는 제약 조성물, 및 상태 또는 질환의 치 료를 위한 의약의 제조, 예를 들어 접합체를 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함하는 의약 또는 제약 조성물의 제조 방법에서의 이같은 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명에 따라, 제공되는 조성물은 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는 "치료 유효량"으로 투여될 수 있고, 이는 환자에게 이점을 나타내기에 충분한 것이다. 이같은 이점은 1가지 이상의 증상이 적어도 완화되는 것일 수 있다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 시간-코스는 치료되는 것의 성질 및 중증도에 따라 좌우될 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 투여량 등의 결정은 일반 개원의 및 기타 의학 박사의 책임 내에 속한다. 적합한 항체 용량은 당업계에 주지되어 있다 [26, 27].
항체 항원-결합 도메인을 포함하는 것들이 포함되는 본 발명의 접합체는 치료를 필요로 하는 환자에게 임의의 적절한 경로를 통해, 일반적으로 혈류 내로 및/또는 직접적으로 치료되는 부위, 예를 들어 종양 또는 종양 혈관계 내로 주사에 의해 투여될 수 있다. 정확한 용량 및 이의 투여 빈도는 다수의 인자, 투여 경로, 치료될 영역 (예를 들어 종양)의 크기 및 위치, 항체 (예를 들어 scFv 분자)의 정확한 성질, 및 임의의 검출가능한 표지 또는 접합체 내에 함유된 기타 분자의 성질에 따라 좌우될 것이다.
조성물은 단독으로, 또는 치료되는 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합되어 투여될 수 있다. 다른 치료는 적절한 용량의 통증 해소 약물 예컨대 비-스테로이드성 소염 약물 (예를 들어 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 아편제 예컨대 모르핀, 또는 항구토제의 투여를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른, 그리고 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은, 활성 성분 (접합체)에 더하여, 제약상 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 주지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이같은 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 경구 투여이거나, 또는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의한 것일 수 있는 투여 경로에 좌우될 것이다. 정맥내 주사, 또는 고통 부위에서의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태일 수 있다.
본 발명의 접합체에서, 일반적으로 단백질은 재조합에 의해 생산된 제1 및 제2 폴리펩티드 서브유닛을 포함한다. 서브유닛은 글리코실화될 수 있고, 이같은 글리코실화의 정도 및 성질은 서브유닛이 발현되는 적합한 숙주 세포의 선택에 의해 제어될 수 있다. 단백질은 생물학적으로 활성인 작용제, 즉 작용제가 투여되는 대상 생물의 구조 또는 기능에 영향을 미치는 작용제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 단백질은 진단 또는 치료 작용제를 포함한다. 예를 들어, 단백질은 질환 또는 병리학적 상태의 진단, 예방 또는 치료에 사용되는 물질을 포함할 수 있다. 단백질은 예를 들어 진단을 위한 마커 또는 표지화제를 포함할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 일반적으로 단백질은, 예를 들어 암 및 기타 종양, 류마티스 관절염, 당뇨 망막병증, 노화-관련 황반 변성 및 혈관종의 치료에서, 병리학적 상태, 특히 혈관 신생의 치료 또는 예방을 위한 치료 물질을 포함한다. 이는 예를 들어 독소, 효소 또는 면역 매개물 예컨대 사이토카인을 포함할 수 있다.
단백질은 천연 또는 재조합 인터류킨-12 (IL12)일 수 있다. 본 발명에서 유용한 IL12는 임의의 동물, 예를 들어 인간, 설치류 (예를 들어 래트, 마우스), 말, 소, 돼지, 양 등으로부터 유래될 수 있다. 인간 IL12가 인간에게 투여하기 위한 접합체에서 바람직하다. IL12는 40 kDa (p40) 서브유닛 및 35 kDa (p35) 서브유닛으로 구성되는 이종이량체성 단백질로서 천연적으로 발생된다. 서브유닛의 실제 분자량은, 예를 들어 상이한 종에서 발현될 때, 그리고 단백질이 글리코실화되었는지 여부 및 글리코실화 패턴에 따라, 변할 수 있다. 따라서 용어 "p40" 및 "p35"는 서브유닛의 분자량이 각각 정확히 40 및 35 kDa이라는 것을 가리키지 않는다. 그보다는, 이러한 용어는 IL12의 2개의 이종이량체성 서브유닛을 확인 및 구별하기 위해 사용되고, 이들은 아미노산 서열의 관점에서 더욱 정확하게 정의될 수 있다. 이종이량체성 IL12는 인간 IL12의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛과 각각 상동성이거나 동일한 제1 및 제2 폴리펩티드 서브유닛을 포함한다. 전형적으로, IL12의 제1 서브유닛은 서열 3에 기재된 바와 같은 인간 IL12 서브유닛 p40의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％인 아미노산 서열을 포함한다. 전형적으로, IL12의 제2 서브유닛은 서열 4에 기재된 바와 같은 인간 IL12 서브유닛 p35의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％인 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 접합체 내의 IL12는 IL12의 생물학적 활성, 예를 들어 활 성화된 T 및 NK 세포에 대한 성장 인자로서 작용하고/하거나, NK/림포카인-활성화 킬러 세포의 용균 활성을 증강시키고/시키거나, 휴지기 PMBC에 의한 IFN-γ의 생산을 자극하고/하거나, 혈관신생을 억제하고/하거나 (예를 들어 하류 매개물 IP-10을 통해), 종양 성장 및/또는 전이를 억제하는 능력을 유지한다.
특이적 결합원은 서로에 대한 결합 특이성을 갖는 한쌍의 분자의 구성원이다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 천연적으로 유래되거나, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 한쌍의 분자의 한 구성원은 한쌍의 분자의 다른 구성원에 특이적으로 결합하고 따라서 다른 구성원의 특정한 공간적 및 극성 구성에 대해 상보적인, 표면 상의 영역 또는 공동(cavity)를 갖는다. 따라서, 한쌍의 구성원들은 서로에게 특이적으로 결합하는 성질을 갖는다.
일반적으로 특이적 결합원은 항원-결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 특이적 결합원은 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비-항체 단백질일 수 있다. 항원-결합 부위는 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등과 같은 비-항체 단백질 스캐폴드(scaffold) 상에서의 상보성-결정 영역 (CDR)의 정렬에 의해 [29, 30, 31], 또는 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위해 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 무작위화 또는 돌연변이시킴으로써 제공될 수 있다. 단백질 내의 신규 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드는 상세하게 개관되어 있다 [31]. 1개 이상의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 유형 III 도메인을 포함하는 단백질 (항체 모방체)을 포함하여, 항체 모방체에 대한 단백질 스캐폴드가 개시되었다 [32]. 1개 이상의 CDR, 예를 들어 HCDR 셋트를 그래프트시키기 위한 적절 한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다.
비-항체 단백질 스캐폴드의 장점은 적어도 일부 항체 분자보다 작고/작거나 제작하기 쉬운 스캐폴드 분자 내에 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 특이적 결합원의 작은 크기는 세포에 들어가거나, 조직 내로 깊게 침투하거나 다른 구조 내의 표적에 도달하는 능력, 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에 결합하는 능력과 같은 유용한 생리학적 성질을 부여할 수 있다.
비-항체 단백질 스캐폴드 내의 항원 결합 부위의 사용은 [34]에 개관되어 있다. 안정적인 골격 및 1개 이상의 가변 루프를 갖는 단백질이 전형적이고, 루프(들)의 아미노산 서열이 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이되어 표적 항원에 결합하는 것에 대한 특이성을 갖는 항원-결합 부위가 생성된다. 이같은 단백질에는 황색포도상구균(S. aureus)로부터의 단백질 A, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인) 및 리포칼린의 IgG-결합 도메인이다. 기타 접근법은 합성 "마이크로바디(Microbody)" (Selecore GmbH)을 포함하고, 이는 분자내 디술피드 결합을 갖는 소형 단백질인 시클로티드를 기재로 한다.
언급된 바와 같이, CDR이 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B와 같은 스캐폴드에 보유될 수 있지만 [29, 30, 31], 바람직하게는 본 발명의 CDR 또는 CDR 셋트를 보유하기 위한 구조는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 천연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 셋트에 상응하는 위치에 CDR 또는 CDR 셋트가 위치하는 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 실질적인 부분의 구조일 것이 다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 [Kabat 등의 문헌 [35]], 및 인터넷 상에서 입수가능한 이의 업데이트 (http://immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진을 사용하여 "Kabat"을 확인)를 참조로 결정할 수 있다.
항체 분자는 천연이거나 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생산된 면역글로불린이다. 이 용어는 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 또한 포함한다.
모노클로날 및 기타 항체를 사용하고 재조합 DNA 기술을 이용하여 원래 항체의 특이성을 유지하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산할 수 있다. 이같은 기술은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 + 프레임워크 영역에 도입하는 것을 수반할 수 있다 [37, 38, 39]. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 기타 세포에 유전자 돌연변이 또는 기타 변화가 적용될 수 있고, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 변경시키지 않을 수 있다.
다수의 방식으로 항체가 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 필요한 특이성의 항체 항원-결합 부위를 갖는 임의의 특이적 결합원 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 용어는, 천연인지 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성인지 여부와 상관 없이, 항체-항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편 및 유도체를 포함한다. 또다른 폴리펩티드에 융합된, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 분자, 또는 등가물이 따라서 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 주지되어 있다 [40, 41].
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가적인 기술이 인간 및 인간화 항체를 단리하는 것을 가능하게 하였다. 예를 들어, 인간 하이브리도마를 기존에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다 [36]. 특이적 결합원의 생성을 위한 또다른 확립된 기술인 파지 디스플레이가 상세하게 기술되어 있다 [36, 42]. 마우스 면역계의 다른 성분들은 손상되지 않게 하면서 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 트랜스제닉(transgenic) 마우스가 인간 항체의 단리에 사용될 수 있다 [43].
적절한 발현 벡터 내에서 합성 및 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 합성 항체 분자가 생성될 수 있다 [44, 45].
전체 항체의 단편이 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 항체 단편은 이의 작은 크기 및 다른 분자 또는 수용체 (예를 들어 Fc 수용체)와의 최소화된 상호작용으로 인해 본 발명의 접합체에서 선호된다. VH 도메인 및 VL 도메인이 두 도메인이 회합되어 항원 결합 부위를 형성하도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일 사슬 Fv 분자 (scFv)가 특히 선호된다 [46, 47]. scFv는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 다리의 혼입에 의해 안정화될 수 있다 [48].
또다른 소형 항원-결합 항체 단편은 dAb (도메인 항체), 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역이다 [28]. VH dAb는 낙타류 (예를 들어 낙타, 라마)에서 천연적으로 발생하고, 낙타류를 표적 항원으로 면역화시키고, 항원-특이적 B 세포를 단리하고, 개별적인 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝함으로써 생산될 수 있다. dAb는 세포 배양으로 또한 생산가능하다. 이들의 작은 크기, 양호한 용해도 및 온 도 안정성은 이들을 특히 생리학적으로 유용하고 선별 및 친화력 성숙에 적절하도록 한다.
단일 도메인 특이적 결합원, 특히 단일 도메인 항체 예컨대 dAb가 본 발명에서 사용될 수 있고, 예를 들어 Domantis, Phylos, Pieris 및 Affibody로부터 시판된다.
항원-결합 부위는 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고 이에 상보적인 분자의 일부이다. 항체 분자에서, 이는 항체 항원-결합 부위로 지칭되고, 표적 항원의 전부 또는 일부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 항체의 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있고, 이러한 부분은 에피토프로 명명된다. 항체 항원-결합 부위는 1개 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항체 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
용어 "특이적"은 특이적 결합쌍의 한 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자에 대해 어떠한 유의한 결합도 나타내지 않는 상황을 지칭하도록 사용될 수 있다. 이러한 용어는 예를 들어 항원-결합 부위가 다수의 항원이 보유하는 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우 또한 적용가능하고, 이러한 경우에 항원-결합 부위를 보유하는 특이적 결합원은 특정 에피토프를 보유하는 다양한 항원에 결합할 수 있다.
L19는 피브로넥틴 이소형 B-FN의 ED-B 도메인에 특이적인 인간 재조합 항체이다. 이러한 항체 및 이의 서열은 기존에 기술되었다 [20]. L19의 단일-사슬 Fv 가 또한 기술되어 있고, 본 발명의 접합체에서 바람직하게 사용된다. ScFv(L19)는 L19 VH 도메인 및 L19 VL 도메인을 포함하는 scFv이고, 이때 VH 및 VL은 펩티드 링커 서열에 의해 단일 폴리펩티드 사슬로 연합된다. 도 10에 제시된 바와 같이, VH 도메인은 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, VL 도메인은 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. L19 CDR 서열은 하기와 같다:
Figure 112007088501823-pct00001
VH 도메인은 서열 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있고, VL 도메인은 서열 23에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다 (도 10). VH 및 VL 도메인은 일반적으로 잔기 12개의 링커인 서열 24와 같은 펩티드 링커에 의해 연결된다 (도 10). 바람직하게는, scFv(L19)는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
도 1에서 (A)는 scIL12-scFv(L19)를 나타내고; (B)는 scIL12-SIP(L19) 동종이량체를 나타내며; (C)는 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 이종이량체를 나타낸다.
도 2에서 (A)는 환원 및 비-환원 조건 하에서의 scIL12-scFv(L19) 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타내고; (B)는 천연 조건 하에서의 scIL12-scFv(L19) 융합 단백질의 젤 여과 프로파일을 나타내고, 이량체를 나타낸다.
도 3은 생체분포 실험으로 평가된 scIL12-scFv(L19)의 생체내 표적화를 나타낸다. 축적은 (A) 4시간 및 (B) 24시간 후 조직 1 g 당 ％ 주사 용량 (％ID/g)으로 표현된다. 제시된 조직은 하기와 같다 (좌측에서 우측으로): 종양, 비장, 간, 폐, 심장, 장, 혈액 및 신장.
도 4에서 (A)는 환원 및 비-환원 조건 하에서의 scIL12-SIP(L19) 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타내고; (B)는 천연 조건 하에서의 scIL12-SIP(L19) 융합 단백질의 젤 여과 프로파일을 나타내고, 단백질이 이량체임을 나타낸다.
도 5는 생체분포 실험으로 평가된 scIL12-SIP(L19)의 생체내 표적화를 나타내고, 축적은 (A) 4시간 및 (B) 24시간 후 조직 1 g 당 ％ 주사 용량 (％ID/g)으로 표현된다. 제시된 조직은 하기와 같다 (좌측에서 우측으로): 종양, 비장, 간, 폐, 심장, 장, 혈액 및 신장.
도 6에서 (A)는 환원 및 비-환원 조건 하에서의 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타내고; (B)는 천연 조건 하에서의 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 융합 단백질의 젤 여과 프로파일을 나타내고, 단백질이 이량체임을 나타낸다.
도 7은 생체분포 실험으로 평가된 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35의 생체내 표적화를 나타내고, 축적은 (A) 4시간 및 (B) 24시간 후 조직 1 g 당 ％ 주사 용량 (％ID/g)으로 표현된다. 제시된 조직은 하기와 같다 (좌측에서 우측으로): 종양, 비장, 간, 폐, 심장, 장, 혈액 및 신장.
도 8은 서열 1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열은 N 말단에서 C 말단으로 하기의 것들을 함유한다:
(i) 신호 펩티드;
(ii) 인간 IL12 p40 서브유닛 (파선 밑줄로 표시됨 - 서열 3);
(iii) 펩티드 링커 (서열 15);
(iv) scFv(L19) (밑줄로 표시됨 - 서열 5); 및
(v) myc;
즉, 신호 펩티드-인간 p40-링커-L19-myc. 본 발명자들이 사용한 코딩 핵산 서열에서, myc 태그(tag)에 3개의 정지 코돈이 이어졌다.
도 9는 서열 2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열은 N 말단에서 C 말단으로 하기의 것들을 함유한다:
(i) 신호 펩티드;
(ii) scFv(L19) (밑줄로 표시됨 - 서열 5);
(iii) 펩티드 링커 (서열 15);
(iv) 인간 IL12 p35 서브유닛 (파선 밑줄로 표시됨 - 서열 4); 및
(v) 6His-tag;
즉, 신호 펩티드-L19-링커-인간 p35-6×His. 본 발명자들이 사용한 코딩 핵산 서열에서, 6개의 히스티딘에 3개의 정지 코돈이 이어졌다.
도 10은 scFv(L19)의 아미노산 서열 (서열 5)을 나타낸다. VH 및 VL 도메인이 따로따로 제시된다 (각각 서열 22 및 서열 23). VH 및 VL 도메인 내의 CDR1, 2 및 3 서열은 밑줄로 표시된다. VH 및 VL 도메인은 잔기 12개의 펩티드 링커 서열 (서열 24)에 의해 분리된다.
도 11은 항-테나신-C scFv TN 11의 아미노산 서열 (서열 21)을 나타낸다.
본 발명의 양상 및 실시양태가 하기의 실험 섹션에서 예시될 것이다.
3가지 상이한 포맷의 IL12-L19 접합체의 생산 및 특성화를 기술하여, 생체내 표적화에 대한 본원에서 청구된 바와 같은 포맷의 현저한 우수성을 설명한다.
도 1의 A, B 및 C 각각에 도해된 바와 같은 3가지 포맷은 scIL12-scFv(L19), scIL12-SIP(L19) 동종이량체 및 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 이종이량체이다.
도 1 A에 묘사된 scIL12-scFv(L19)는 scIL12 및 scFv(L19)의 융합 단백질이다. 이러한 접합체는 분자 당 1개의 scFv 항원-결합 부위로 인해 1가이다.
도 1 B에 묘사된 scIL12-SIP(L19) 동종이량체는 2개의 융합 단백질의 동종이량체이고, 각각의 융합 단백질은 scIL12, scFv(L19) 및 인간 IgE의 CH4 도메인을 각각 함유한다. 접합체는 2개의 CH4 도메인 간의 디술피드 결합을 통해 이량체화되어, 미니-항체 또는 SIP 구조를 형성한다. 이러한 접합체는 분자 당 2개의 scFv(L19) 항원-결합 부위가 존재하기 때문에 2가이다.
도 1 C에 도해된 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 이종이량체는 2개의 상이한 융합 단백질의 이종이량체이다. 제1 융합 단백질은 아미노산 6개의 펩티드 링커 GSADGG (서열 15)를 통해 scFv(L19)의 N 말단에 융합된 인간 IL12 p40 서브유닛을 함유한다. 제2 융합 단백질은 아미노산 6개의 펩티드 링커 GSADGG (서열 15)를 통해 인간 IL12 p35 서브유닛의 N 말단에 융합된 scFv(L19)를 함유한다. 2개의 융합 단백질이 p40 서브유닛과 p35 서브유닛 간의 디술피드 결합을 통해 이종이량체화되어, 이종이량체성 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35가 형성된다. 접합체는 분자 당 2개의 scFv(L19) 항원-결합 부위가 존재하기 때문에 2가이다.
FLAG 태그가 없는 scIL12 -scFv( L19 )
기존 [15]에 기술된 원래의 융합 단백질은 C-말단 FLAG 태그와 함께 클로닝되었기 때문에 ("scIL12-scFv(L19)-FLAG"), 티로신-함유 FLAG 태그가 생체분포 실험에서 인공물에 기여할 수 있다는 가능성을 고려하여야 한다. 단백질의 티로신이 방사성 표지될 때, FLAG 태그의 용매-노출 티로신이 또한 요오드화될 수 있다. FLAG 태그는 추후에 생체 내에서 단백질분해될 수 있다. 이러한 융합 단백질의 종양-표적화 성질을 더욱 잘 연구하기 위해, FLAG 태그가 없는 scIL12-scFv(L19) 융합 단백질을 클로닝하여 발현시켰다.
scIL12 - scFv ( L19 )의 클로닝 및 발현
scIL12-scFv(L19)-FLAG [15]에 대한 유전자를 함유하는 pCH33 벡터를 주형으로 사용하여 scIL12-scFv(L19)에 대한 DNA-단편을 증폭시켰다. p40의 내인성 분비 서열에 어닐링(annealing)되고 엔도뉴클레아제 EcoR1에 대한 제한 부위를 이의 5' 말단에 추가시키는 프라이머 sp40backEco (5' ccg gaattc atg tgt cct cag aag cta acc atc 3') (서열 6), 및 엔도뉴클리아제 Not1에 대한 제한 부위가 이어지는 3개의 정지 코돈을 scIL12-L19 융합 단백질의 3' 말단에 추가시킴으로써, FLAG 태그를 결실시키는 프라이머 L19stopNotfor (5' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tca tca ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3') (서열 7)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 벡터 의 EcoR1 및 Not1 제한 부위를 사용하여, DNA 단편을 포유류 세포 발현 벡터 pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen, Basel, Switzerland) 내로 클로닝시켰다.
HEK 293 세포를 벡터로 형질감염시키고, 안정적인 형질감염체를 G418 (500 ㎍/㎖)의 존재 하에 선별하였다. 인간 피브로넥틴의 재조합 ED-B 도메인을 항원으로 사용하여, G418-저항성 세포의 클론을 ELISA에 의해 융합 단백질의 발현에 대해 스크리닝하였다. 기존 [19, 20]에 기술된 바와 같이 항원 컬럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 융합 단백질을 세포 배양 배지로부터 정제하고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 투석에 의해 탈염시켰다. 융합 단백질을 분취량으로 -20 ℃에서 동결시켰다. scIL12-scFv(L19) 융합 단백질의 크기를 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에서, 그리고 천연 조건 하에 FPLC 젤 여과에 의해 Superdex S-200 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 분석하였다 (도 2). 원래의 단량체성 scIL12-scFv(L19)-FLAG 융합 단백질과 달리, IL12-L19 단백질 분획의 약 1/3이 이량체인 것으로 나타났다.
scIL12 - scFv ( L19 )의 특성화
FLAG 태그가 없는 scIL12-scFv(L19)의 생체내 표적화를 생체분포 실험으로 평가하였다. 따라서, 융합 단백질의 단량체성 분획을 FPLC 젤 여과에 의해 Superdex S-200 컬럼 상에서 정제하였다. 정제 직후 분획을 요오드화시키고, F9 마우스 기형암종 종양이 있는 129SvEv 면역적격 마우스 내에 주사하였다. 주사 4시간 후 및 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 기관들을 칭량하고 방사능을 카운팅하였다. 대표적인 기관 및 종양에서의 축적은 조직 1 g 당 ％ 주사 용량 (％ID/g) 으로 표시되었다 (도 3). 24시간 후, 종양 부위에서의 축적을 관찰할 수 없었다. 따라서, FLAG 태그가 생체분포 결과를 방해하지 않은 것으로 간주하였다.
scIL12 - SIP ( L19 ) 동종이량체
scFv(L19)가 인간 IgE의 CH4 도메인을 통해 이량체화되어 "소형 면역 단백질" 또는 SIP로 또한 명명된 미니-항체 구조가 구축되었을 때 scFv(L19)의 종양 표적화 성질이 개선되는 것으로 나타났다. SIP(L19)의 종양 표적화 성질은 기존에 기술되었다 [21]. 따라서, scIL12-SIP(L19)의 동종이량체를 구축하여, 이러한 포맷이 종양에 대한 IL12의 표적화를 개선시키는지 여부를 테스트하였다.
인간 IgE 면역글로불린의 CH4 도메인을 scIL12-scFv(L19)-FLAG 융합 단백질의 c-말단에 융합시킴으로써 scIL12-SIP(L19) 융합 단백질을 구축하였다 [22].
scIL12 - L19 - SIP 동종이량체의 클로닝 및 발현
1회 라운드의 PCR 및 PCR 단편을 CH4 도메인을 이미 함유하는 벡터에 삽입하는 것에 의해, CH4 도메인을 scIL12-L19 단편의 c-말단에 융합시켰다.
scIL12-scFv(L19) 단편을 scIL12-scFv(L19)-FLAG [15]에 대한 유전자를 함유하는 pCH33 벡터로부터 증폭시켰다. p40 분비 서열의 5' 말단에서 어닐링되고 EcoR1을 HindIII 제한 부위로 변화시키는 프라이머 sp40backHind (5'ccgta aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3') (서열 8), 및 3' 말단에 어닐링되고, FLAG 태그를 결실시키며, BspE1과의 점착성 말단을 제공하는 Age1 제한 부위를 도입시키는 프라이머 L19forAge1Bsp (5' tgt ggg accggt ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3') (서열 9)를 사용하여 제한 부위를 교환시켰다. 일단 결찰되면, Age1/BspE1 제한 부위는 더 이상 BspE1으로 재절단가능하지 않다. scIL12 서열이 BspE1 제한 부위를 함유하기 때문에 이러한 단계가 필요하다. 엔도뉴클레아제 HindIII 및 BspE1을 사용하여, 단편을 CH4 도메인을 이미 함유하는 포유류 세포 pcDNA3.1(+) 발현 벡터에 이의 5' 말단에서의 BspE1 제한 부위를 사용하여 클로닝시켰다 [21].
scIL12-SIP(L19)에 대한 형질감염, 발현 및 정제 절차를 scIL12-scFv(L19) 융합 단백질에 대해 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. IL12-SIP(L19) 융합 단백질의 크기를 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에서, 그리고 천연 조건 하에 FPLC 젤 여과에 의해 Superdex S-200 컬럼 상에서 또한 분석하였다 (도 4).
scIL12 - SIP ( L19 ) 동종이량체의 특성화
scIL12-SIP(L19) 단백질을 제2단계에서 젤 여과 Superdex S-200 컬럼 상에서 정제하고, 수집 직후에 이량체 분획을 방사성요오드화시켰다. 표지된 단백질을 F9 마우스 기형암종 종양이 있는 129SvEv 면역적격 마우스 내에 주사하였다. 주사 4시간 후 및 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 기관들을 칭량하고 방사능을 카운팅하였다. 대표적인 기관 및 종양에서의 축적은 조직 1 g 당 ％ 주사 용량 (％ID/g)으로 표시되었다 (도 5). scIL12-SIP(L19) 단백질이 BIAcore에서 ED-B에 대한 개선된 결합을 나타냈지만, 증가된 종양 섭취는 관찰될 수 없었고, 종양 섭취는 여전히 불량하였다.
p40 - scFv ( L19 )/ scFv ( L19 )- p35 이종이량체
p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 이종이량체는 2개의 서브유닛으로 구성된다. 한 서브유닛은 IL12의 p35 서브유닛의 N-말단 끝부분에서 융합된 scFv(L19) 단편을 함유한다 (scFv(L19)-p35). 제2 서브유닛에서는, IL12의 서브유닛 p40이 scFv(L19)의 N-말단 끝에 융합된다 (p40-scFv(L19)). 그 후, 융합 단백질들이 p40과 p35 간의 디술피드 결합에 의해 이종이량체성 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35를 구축한다.
이러한 이종이량체성 항체-사이토카인 융합 단백질 접합체는 글리코실화되지 않았을 때 크기가 114 kD일 것으로 예상된다. 상이한 글리코실화 상태로 인해, 접합체의 분자량은 상이한 글리코실화 패턴으로 인해 접합체가 발현되는 종에 따라 변할 수 있다. 후번역 글리코실화 없이 DNA 서열의 길이를 기초로, 융합 단백질의 이론적인 크기는 p40-L19에 대해 65 kDa, L19-p35에 대해 49 kDa, 그리고 이종이량체 p40-L19/L19-p35에 대해 114 kDa이었다.
p40 - scFv ( L19 )/ scFv ( L19 )- p35 의 클로닝 및 발현
2개의 서브유닛 p40-scFv(L19) 및 scFv(L19)-p35를 2개의 상이한 벡터 내로 별도로 클로닝하였고, 이때 제1 벡터는 검출을 위한 myc 태그를 함유하고, 제2 벡터는 검출을 위한 his 태그를 함유한다.
scIL12-scFv(L19)-FLAG 단백질 [15]을 코딩하는 유전자를 함유하는 pCH33 벡터 및 SIP(L19) 단편 [21]을 코딩하는 유전자를 함유하는 pLB 벡터를 주형으로 사용하여 PCR 조립에 의해 p40-scFv(L19)-myc 단편을 생산하였다. p40 모이어티(moiety)를 함유하는 제1 단편 A를 pCH33을 주형으로 사용하여 구축하였다. IL12의 p40 서브유닛의 분비 서열에 어닐링되어 이의 5' 말단에 엔도뉴클레아제 HindIII에 대한 제한 부위를 도입하는 제1 프라이머 HindSp40back (5 'ccc aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3') (서열 10) 및 p40의 3' 말단에 어닐링되어, 제2 단편 B에 융합될 링커 (GSADGG)의 일부를 추가하는 제2 프라이머 Sp40HaLifor (5' acc tcc atc agc gct tcc gga tcg gac cct gca gg 3') (서열 11)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. scFv(L19) 모이어티에 기여하는 이러한 단편 B가 scFvL19의 5' 말단에 어닐링되어 링커 (GSADGG) (서열 15)의 일부를 추가하는 제1 프라이머 LinkL19back (5' gga agc gct gat gga ggt gag gtg cag ctg ttg gag tc 3') (서열 12) 및 scFv(L19)의 3' 말단에 어닐링되고 C-말단 myc 태그를 추가하는 제2 프라이머 L19mycstoBamfor (5' att cag atc ctc ttc tga gat gag ttt ttg ttc ttt gat ttc cac ctt ggt ccc ttg 3') (서열 13)와 함께 주형 pLB를 사용하여 2회 라운드의 PCR에서 구축되었다. 이러한 단편은 프라이머 LinkL19back 및 3개의 정지 코돈 및 BamH1에 대한 제한 부위를 단편 B의 5' 말단에 추가하는 제3 프라이머 mycstoBamfor (5' cgc ggatcc cta tca tca att cag atc ctc ttc tga gat gag ttt 3') (서열 14)를 사용하는 두번째 라운드의 PCR에서 종결되었다. 양쪽 단편을 주형으로 사용하여, 프라이머 HindSp40back 및 mycstoBamfor로의 PCR을 수행하여, p40 단편을 가요성 링커 GSADGG에 의해 연결된 항체 단편 scFv(L19)의 N-말단에 융합시킴으로써, 단편 p40-GSADGG-L19-myc가 생산되었다. HindIII 및 BamH1을 제한 부위로 사용하여, 단편을 선별을 위해 히드로마이신 저항성을 제공하는 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1+/Hygro 내로 클로닝시켰다. CHO 세포를 벡터로 형질감염시키고, 안정적인 형질전환체를 히그로마이신 (500㎍/㎖)으로 선별하였다. 양성 클론을 항원으로서의 재조합 ED-B 및 검출용 항-myc 항체를 사용하여 ELISA로 스크리닝하였 다. 단백질을 발현시키고, 기존 [19, 20]에 기술된 바와 같이 항원 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 정제하였고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 투석에 의해 탈염시켰다. 융합 단백질을 분취량으로 -20 ℃에서 동결시켰다. SDS-PAGE 크기 분석은 단백질이 2가지 상이한 글리코실화 패턴의 약 50％의 단량체, 및 약 50％의 동종이량체임을 나타냈다 [23].
scFv(L19)-p35-His 단편을 동일한 플라스미드 pCH33 및 pLB를 주형으로 사용하여 PCR 조립에 의해 또한 생산하였다. scFv(L19) 모이어티에 상응하는 제1 단편 C를 scFvL19의 분비 서열에 어닐링되어 엔도뉴클레아제 EcoR1에 대한 제한 부위를 이의 5' 말단에 도입하는 제1 프라이머 EcoLonSL19back (5' ccg gaattc gct tgt cga cca tgg gct g 3') (서열 16) 및 scFv(L19)의 3' 말단에 도입되어 링커 (GSADGG)의 일부를 도입하는 제2 프라이머 L19HaLifor (5' acc tcc atc agc gct tcc ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3') (서열 17)를 사용하여 주형 pLB로부터 구축하였다. p35 모이어티를 함유하는 제2 단편 D가 성숙형 p35 서브유닛의 5' 말단에 어닐링되어 링커 (GSADGG)의 일부를 이의 5' 말단에 추가시키는 제1 프라이머 HaLip35back (5' gga agc gct gat gga ggt agg gtc att cca gtc tct gga 3') (서열 18) 및 p35 서브유닛의 3' 말단에 어닐링되어 his 태그를 추가시키는 제2 프라이머 p35hisfor (5' gtg atg gtg atg atg atg ggc gga gct cag ata gcc 3') (서열 19)와 함께 주형 pCH33를 사용하여 2회 라운드의 PCR에서 구축되었다. 두번째 라운드의 PCR에서, 프라이머 HaLip35back 및 제3 프라이머 p35hisstoNot1for (5' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tca tca gtg atg gtg atg atg atg ggc 3') (서열 20)를 사용하 여 3개의 정지 코돈 및 Not1에 대한 제한 부위가 단편 D의 3' 말단에 추가되었다. 프라이머 EcoLonSL19back 및 p35hisstoNot1for를 사용하여 PCR 조립에 의해 p35 사이토카인 서브유닛을 scFv(L19) 단편의 c-말단에 융합시켜, L19-GSADGG-p35-his가 생산되었다. 이제 단편을 EcoR1 및 Not1 제한 부위를 사용하여 네오마이신 저항성을 제공하는 pcDNA 3.1 포유류 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. HEK 293 세포를 형질감염시키고, 안정적인 형질감염체를 G418 (500㎍/㎖)로 선별하였다. 항원으로서의 인간 재조합 EDB 및 검출용 항-his 항체를 사용하여, ELISA에 의해 융합 단백질을 발현하는 저항성 클론에 대해 형질감염된 세포를 스크리닝하였다. 융합 단백질을 기존 [19, 20]에 기술된 바와 같이 항원 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 정제하였고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 투석에 의해 탈염시켰다. SDS-PAGE 분석은 발현이 매우 약한 것을 나타냈고, 단백질은 단량체, 이량체 및 더욱 고차인 올리고머로 구성되는 것으로 나타났다.
그후, scFv(L19)-p35 및 p40-scFv(L19)를 코딩하는 2개의 벡터로의 HEK 293 세포의 동시형질감염을 동시에 수행하였다. 양쪽 모두의 융합 단백질을 함유하는 안정적인 형질전환체의 선별을 G418 (500㎍/㎖) 및 히그로마이신 (500㎍/㎖)으로 수행하였다. 항원으로서의 재조합 EDB 및 검출용 항-myc 항체, 뿐만 아니라 검출용 항-his 항체를 사용하여 ELISA로 세포를 양쪽 모두의 단백질의 발현에 대해 스크리닝하였다. 융합 단백질을 기존 [19, 20]에 기술된 바와 같이 ED-B 항원 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 제1 단계로 정제하였고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 투석에 의해 탈염시켰다. 그 후 이러한 제1 분획을 HisTrap HP 1 ㎖ Ni2 + 컬럼 (Amersham Biosciences) 상에서 제2 단계로 정제하여, 이종이량체 (p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35) 내에 결합되지 않은 유리 p40-scFv(L19) 단편을 세정으로 제거하였다. 보관을 위해, 0.1％ Tween 80을 단백질에 첨가한 후, 이를 분취량으로 -80℃에서 동결시켰다. SDS PAGE 분석은 비-환원 조건 하에 단백질이 2가지 글리코실화 상태의 이량체인 것을 나타냈고, 환원 조건 하에 상이한 크기의 2개의 이종 단량체를 나타냈으며, 이때 p40-L19 단량체는 2가지의 상이한 글리코실화 상태로 나타났다. Superdex S-200 컬럼으로 젤 여과를 수행함으로써, 단백질은 천연 조건 하에 순수한 이량체인 것으로 나타났다 (도 6).
p40 - scFv ( L19 )/ scFv ( L19 )- p35 의 특성화
융합 단백질의 정확한 폴딩 및 정확한 디술피드 결합의 구축을 정제된 이종이량체성 단백질의 IL12 활성에 의해 결정하였다.
T 세포 증식 분석을 수행함으로써 IL-12 활성을 결정하였다 [24]. 간략하게, 휴지기의 인간 말초혈 단핵구 (PBMC)를 마이토젠 (피토헤마글루티닌 (PHA) 및 IL-2)와 함께 3일 동안 배양한 후, 융합 단백질 또는 기준물로서의 시판되는 재조합 마우스 IL- 12 (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, United Kingdom)의 일련의 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 증식을 [3H]티미딘 혼입에 의해 측정하였다.
생체분포 실험을 FPLC 젤 여과 Superdex S-200 컬럼 상에서 정제되고 방사성요오드화된 p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 단백질로 수행하였다. 표지된 단백질을 F9 마우스 기형암종 종양이 있는 129SvEv 면역적격 마우스 내에 주사하였다. 주사 4시간 후 및 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 기관들을 칭량하고 방사능을 카운팅하였다. 대표적인 기관 및 종양에서의 축적은 조직 1 g 당 ％ 주사 용량 (％ID/g)으로 표시되었다. 이종이량체성 포맷으로, 24시간에 거의 10 ％의 종양 섭취가 달성되었다 (도 7).
참조문헌
인용된 모든 참조문헌은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
Figure 112007088501823-pct00002
Figure 112007088501823-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Philogen S.p.A Neri, Dario Gafner, Verena Halin, Cornelia <120> Conjugate for Targeting of Drug <130> SMWFP6360341 <140> PCT/EP2006/004114 <141> 2006-05-03 <150> US 60/680,105 <151> 2005-05-11 <160> 30 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence: Fusion protein Signal peptide - human p40 - l inker - L19 - myc <400> 1 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 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<213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer L19HaLifor <400> 17 acctccatca gcgcttcctt tgatttccac cttggtccc 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer HaLip35back <400> 18 ggaagcgctg atggaggtag ggtcattcca gtctctgga 39 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer p35hisfor <400> 19 gtgatggtga tgatgatggg cggagctcag atagcc 36 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer p35hisstoNotIfor <400> 20 ttttcctttt gcggccgcct atcatcagtg atggtgatga tgatgggc 48 <210> 21 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-tenascin-C scFv(TN11) <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Arg Ile Thr Ile Phe Gly Gly Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln 130 135 140 Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys 145 150 155 160 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser 180 185 190 Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly 195 200 205 Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala 210 215 220 Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 <210> 22 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence: Peptide linker <400> 24 Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Phe Ser Met Ser 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr 1 5

Claims (33)

  1. 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 갖는 IL12 이종이량체를 포함하며, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛은 Fc 도메인이 없는 항체 분자에 각각 접합된 것인 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 이종이량체성 단백질의 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛이 디술피드 결합을 통해 공유결합으로 연결된 것인 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 항체 분자가 단일 사슬 Fv (scFv)인 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 항체 분자가 단일 도메인 항체 분자 (dAb)인 접합체.
  5. 제1항에 있어서, 제1 서브유닛이 제1 융합 단백질로서 항체 분자에 접합되고, 제2 서브유닛이 제2 융합 단백질로서 항체 분자에 접합된 것인 접합체.
  6. 제1항에 있어서, 분자량이 250,000 이하인 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 분자량이 150,000 이하인 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 분자량이 120,000 이하인 접합체.
  9. 제1항에 있어서, 2개의 항체 분자가 동일한 접합체.
  10. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 없는 2개의 항체 분자에 이들 사이에서 접합된 인간 IL12 이종이량체를 포함하고,
    IL12 이종이량체가 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 갖고,
    제1 서브유닛이 Fc 도메인이 없는 항체 분자에 제1 융합 단백질로서 접합되고,
    제2 서브유닛이 Fc 도메인이 없는 항체 분자에 제2 융합 단백질로서 접합된 것인 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 제1 융합 단백질이 서열 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인 접합체.
  12. 제10항에 있어서, 제2 융합 단백질이 서열 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인 접합체.
  13. 제1항에 있어서, 항체 분자 중 1개 또는 2개 모두가 신생물성 성장 및/또는 혈관신생과 관련된 세포외 매트릭스 성분에 특이적으로 결합하는 것인 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 성분이 피브로넥틴 ED-B인 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 항체 분자가 서열 25, 서열 26 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 28, 서열 29 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 갖는 scFv(L19)인 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 항체 분자가 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 scFv(L19)인 접합체.
  17. 제13항에 있어서, 성분이 테나신-C 이소형인 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 항체 분자가 서열 21에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 scFv(TN11)인 접합체.
  19. 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    제1 서브유닛 및 제 2 서브유닛을 접합시켜, IL12 이종이량체를 형성시키는 단계
    를 포함하는, 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 이들 융합 단백질 둘 다를 코딩하는 핵산을 함유하는 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 접합체를 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. Fc 도메인이 없는 항체 분자 및 IL12 p40 서브유닛을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
    Fc 도메인이 없는 항체 분자 및 IL12 p35 서브유닛을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 핵산 분자
    를 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 항체 분자가 scFv인 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 항체 분자가 dAb인 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 항체 분자가 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물.
  26. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자가 제1 벡터 및 제2 벡터인 조성물.
  27. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  29. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위한 접합체.
  30. 제29항에 있어서, 환자에서의 혈관신생 및/또는 신생물성 성장 억제에 사용하기 위한 접합체.
  31. 제30항에 있어서, 종양, 류마티스 관절염, 당뇨 망막병증, 노화-관련 황반 변성 또는 혈관종의 치료에 사용하기 위한 접합체.
  32. 삭제
  33. 삭제
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