KR20060120141A - 글리코페질화 에리트로포이에틴 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴(erythropoietin)과 PEG성분 사이에 콘주게이트(conjugates)를 제공한다.

그 콘주게이트는 그 펩티드와 수식기(modifying group) 사이에 설정되고 공유 결합된 무손상 글리코실 결합기(intact glycosyl linking group)에 의해 결합되어 있다.

그 콘주게이트는 글리코실 전이효소의 작용에 의한 글리코실화 펩티드에서 형성된다.

그 글리코실 전이효소는 수식당 성분을 그 펩티드상에서 글리코실기에 결합한다.

또, 본 발명은 콘주게이트의 제조방법, 여러 가지의 질병상태를 그 콘주게이트로 치료하는 방법 및 그 콘주게이트를 함유하는 의약 조성물을 제공한다.

에리트로포이에틴(erythropoietin), PEG 성분, 콘주게이트, 펩티드, 수식기, 글로코실 전이효소

Description

글리코페질화 에리트로포이에틴{GLYCOPEGYLATED ERYTHROPOIETIN}

(관련특허출원의 참조)

본 특허출원은 미국가특허출원 60/555,504(2004. 03. 22출원), 미국가특허출원 60/590,573(2004. 03. 22출원), 미국가특허출원 60/614,518(2004. 09. 29출원), 미국가특허출원 60/623,387(2004. 10. 29출원)의 우선권을 주장한 출원으로, 여기서 이들 출원의 전체를 목적에 따라 각각 편집하여 기재한 것이다.

본 발명은 에리트로포이에틴과 PEG성분 사이에 콘주게이트를 제공하며, 그 콘주게이트는 펩티드와 수식기 사이에 설정되고 공유결합된 무손상 글리코실 결합기에 의해 결합되어 왔다. 그 콘주게이트는 글리코실 전이효소의 작용에 의한 글리코실화 펩티드에서 형성된다.

본 발명은 콘주게이트의 제조방법과 그 콘주게이트함유 의약조성물에 관한 것이다.

에리트로포이에틴(ERYTHROPOIETIN)(EPO)은 적혈구의 생성을 촉진하는 조혈간세포에 작용하는 간과 신장에 의해 생성된 사이토카인(cytokine)이다. 그 단백질은 2가지 형태로 존재한다: 하나는 165 아미노산 펩티드이고, 다른 하나는 166 아미노산 펩티드이다. 상기 166 아미노산 펩티드는 대부분 C-말단위치에서 추가 아르기닌 을 갖는 것을 제외하고는 165 아미노산 펩티드와 동일한 서열을 가진다. 상기 성숙한 165 아미노산 펩티드는 3개의 N-클리코실화사이트(site)(Asn-24, Asn-38, Asn-83)와 1개의 O-글리코실화사이트(ser-126)로 이루어진 34KD 글리코프로테인(glycoprotein)이며, 5개의 N-결합 글리코실화사이트로 이루어진 일부 변형은 "하이퍼글리코실화"(hyperglycosylated)된 것이다.

에리트로포이에틴 합성은 동맥 O₂ 긴장성(tension)의 저하 또는 혈액의 산소친화성의 증가 등 조직 저산소증(tissue hypoxia)을 효과적으로 생성하는 조건에 의해 유도된다. 통상의 동적평형(homeostasis)조건 하에서, 혈액 중 헤모글로빈의 적혈구 용적비(hematocrit)와 농도는 골수, 비장(spleen) 및 간에서의 대식구(macrophages)에 의해 노화된 적혈구의 영구파괴의 균형을 맞추는 적혈구 형성(erythropoiesis)에 의해 일정하게 유지된다. 양적으로 볼 때, 약 2~3×10¹¹개의 적혈구를 가진 적혈구 집단의 약 1%가 매일 재생된다. 그러나, 혈액손실 또는 높은 고도의 위치 등 조직 저산소증을 효과적으로 발생하는 상태에서 EPO의 유도는 통상 레벨에 비하여 10배 이상으로 적혈구 형성을 촉진할 수 있다.

EPO가 적혈구 생성을 촉진하기 때문에 이것은 적혈구 용적비의 감소에 관련된 여러 가지의 질병과 상태에 대한 치료에 효과적이다. 말기신부전증을 가진 환자의 적혈구 용적비(hematocrit)를 회복하기 위하여 재조합 인간 EPO로 대체 치료하는 초기 실험은 약 20년전에 1차적으로 보고되었다(Winearls, C.G.; 등(1986) Lancet, 2, 1175-1178, 및 Eschbach, J.W.; 등(1987)N. Engl. J. Med., 316, 73-78 참조). 이 연구는 EPO의 병리생리학 및 약리학 분야에서의 추가 연구에 대한 촉진제 역할을 제공하였다(Jelkmann, W. and Gross, A.(1989) Erythropoietin; Springer, Berlin Heidelberg New York 참조).

이들의 초기연구 이후, 재결합 인간 EPO는 연속적으로 사용하여 여러가지의 병리상태를 치료하였다. 예로서, 외과환자의 재결합인간 EPO에 대한 약리적인 적용으로 수술 후 빈혈의 중증도(severity)와 지속기간을 감소할 수 있었다.

또, 재결합 인간 EPO의 투여는 만성염증, 악성종양 및 에이즈(AIDS)등 비신장(non-real)중증질환환자에 대한 치료가 효과적이라는 것이 입증되었으며, 여기서 특히 내인선 EPO의 상대적인 결핍으로 빈혈발생에 도움을 준다는 것을 알 수 있었다(Means, R. T. and Krantz, S.B.(1992)Blood, 80, 1639-1647, and Jelkman, W.(1998) J. interf. Cytokine Res., 18, 555-559 참조). 더 나아가서, EPO가 빈혈성(ischemic), 외상(traumatic), 독성 및 염증 손상에서 조직보호특성이 있다는 연구보고가 있었다(Brines M., et al.(2004)PNAS USA 101:14907-14912 및 Brines, M.L. 등(2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10526-10531 참조).

빈형증과 여러 가지의 원인으로 발생하는 다른 상태에 대한 치료에 있어서 EPO의 유용성과 효과에 의해, 재결합 인간EPO는 전세계에서 가장 좋은 매약(selling drug)으로 될 것이다. 이것은 판매량이 연간 50억불(US$)이상으로 추정된다.

CHO(Chinese Hamster Ovary) 셀라인(cell line)에서 생성된 1종의 재결합 인간EPO만이 치료제로서 광범위하게 사용되었다. 포유동물은 모두 구조가 유사한 글 리칸(glycans)을 생성하기 때문에, CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney) 및 HEK-293(Human Embryonic Kidney-293)은 당단백질(glycoprotein)치료제의 생산에 바람직한 숙주세포(host cells)이다. 이 기술분야에서 공지된 바와 같이, 적합한 글리코실화(glycosylation)는 치료펩티드의 반감기와 면역원성이 생체내에서 영향을 주는 하나의 가장 중요한 요인(factor)이 된다. 실제로, 빈약한 글리코실화 단백질은 간(liver)에 의해 "오래된 것"(old)으로 인식되어, 적합하게 글리코실화한 단백질에서보다 더 신속하게 체내에서 제거되었다.

공교롭게도, 단백질 글리코실화의 공지된 하나의 만족스럽지 못한 국면(aspect)은 마이크로이질성(또 불균질성)현상에 있다. 이와 같이, EPO등 인체치료용 당단백질(glycoproteins)의 생성에 쓰이는 바람직한 숙주세포라도, 글리칸(glycan)의 정밀한 구조에서 여러 가지의 변형으로 이루어진 펩티드(peptides)를 주로 생성한다. 이와 같은 이질성(불균질성)의 범위는 글리코실화 위치에서 글리코실화 위치로, 단백질에서 단백질로, 세포타입에서 세포타입으로 크게 변동시킬 수 있다. 따라서, 여러 가지의 글리코형태(glycoforms)는 각각 하나의 독특한 분자종으로 유효하게 존재하여, 주어진 당 단백질 제조에서 주로 존재한다.

이와 같이, 마이크로 이질성(불균질성)에 대한 문제는 치료용 당 단백질에 대한 대규모의 공업적 제조에서 여러 가지의 문제가 제기되었다. 특히, 각각의 글리코 형태가 하나의 독특한 분자종(distinct molecular species)을 나타낼 수 있기 때문에, 치료용 당 단백질의 제조에서는 소정의 단일 글리코 형태를 정제하기 위하여 부분 분리(fractionation)할 필요가 있다.

치료용 당단백질의 배치(batch)에서 이루어진 소정의 글리코 형태의 백분율(%)에 따라 다른 제조배치가 변동될 수 있다는 사실에서 볼 때 또다른 복잡한 문제가 발생한다.

이와 같이, 각각의 제조에서 예측가능한 부분은 주로 제거할 필요가 있다. 따라서, 소정의 글리코 형태의 최종 수율은 낮아진다.

전체적으로 보아, 마이크로 이질성(불균질성)의 문제점은 포유동물세포 배양에 의해 생성된 치료용 글리코 펩티드가 높은 생산비를 필요로 한다는 점에 있으며, 이와 같은 생산비는 더 오래 지속되고, 더 효과적인 치료용 당 단백질의 더 효과적인 방법이 이용될 경우 필요로 하는 건강관리 비용(health care costs)이더 높게 된다.

효과적인 글리코펩티드 체료제의 코스트 상의 문제점을 해결하는 하나의 해결방법은 생체 내에서 반감기가 더 긴 펩티드를 제공하는 데 있다. 예로서, 약물동태특성(pharmacokinetic properties)을 개선한 글리코펩티드 치료제를 그 펩티드 골격에 합성 폴리머를 결합시켜 생산하였다. 펩티드에 콘주게이팅(conjugating)시킨 하나의 예시적인 폴리머에는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")이 있다. 펩티드 치료제를 유도체화한 PEG의 사용에서는 그 펩티드의 면역원성의 감소를 나타내었다. 예로서 특허문헌(USP 4,179,337)(Davis 등)에서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜에 결합(coupling)된 펩티드 호르몬 및 효소 등 비면역원 폴리펩티드에 대하여 개시되어있다. 면역원성의 감소 이외에, 순환시의 클리어런스 시간(clearance time)은 상기 폴리펩티드의 PEG-콘주게이트의 크기 증가에 의해 연장 되었다.

펩티드에 PEG 및 그 유도체의 결합에 대한 주모드(mode)는 펩티드 아미노산 잔기를 통한 비특이성 결합이다(USP 4,088,538; USP 4,496,689; USP 4,414,147; USP 4,055,635 및 PCT WO87/00056 참조). 펩티드에 PEG를 결합하는 또다른 모드는 글리코펩티드 상에서 글리코실 잔기의 비 특이성 산화에 의한 것이다(WO94/05332 참조).

이들의 비 특이성 방법에서는 폴리(에틸렌글리콜)을 임의로 비특이성있게 펩티드 골격상의 반응성잔기에 첨가한다. 물론, PEG 분자의 랜덤첨가(random addition)에는 최종생성물의 균질성 결여와 그 펩티드의 생물학적 또는 효소활성에서 감소 가능성을 포함하여 결점이 있다. 따라서, 치료용 펩티드의 생산을 위해서는 특이성있게 라벨링(labelling)하며, 용이하게 특성화할 수 있으며, 주로 균질성이 있는 생성물의 형성이 얻어지는 유도체화 설계전략이 더 우수한 것이다. 이와 같은 방법이 개발되고 있다.

특이성 있게 라벨링되고, 균질성 있는 펩티드 치료화합물은 효소의 작용을 통하여 생체외(in vitro)에서 생성할 수 있다. 펩티드에 합성 폴리머 또는 다른 라벨을 결합하는 대표적인 비특이성 방법과 달리, 효소를 기재로한 합성은 부위선택성(regioselectivity)과 입체선택성(stero selectivity)의 이점을 가진다. 라벨 펩티드(labeled peptides)의 합성에서 사용하는 효소의 주요한 2종 등급(classes)에는 글리코실 전이효소(glycosyltransferases)(즉, 시알릴전이효소, 올리고삭카릴전이효소, N-아세틸글루코사미닐전이효소)와 글리코시다아제(glycosidases)가 있다. 이들의 효소는 후수식하여 치료성분으로 이루어질 수 있는 당(sugars)의 특이성 결합에 사용할 수 있다. 또, 글리코실전이효소와 수식 글리코시다아제를 사용하여 수식당을 펩티드 골격에 직접 전이할 수 있다(즉, USP6,399,336 및 미국특원공개 20030040037; 20040132640; 20040137557; 20040126838 및 20040142856; 이들의 특허문헌 각각을 여기서 참고로 편집한다.). 화학적 합성구성요소 및 효소에 의한 합성구성요소를 조합하는 방법도 공지되었다(Yamamoto 등, Carbohydr . Res. 305: 415-422(1998) 및 US 특허출원공개 20040137557 참조).

에리트로포이에틴(erythropoietin)(EPO)은 가장 유효한 치료용 펩티드이다. EPO의 상용형태가 현재 사용중에 있으나, 이들의 펩티드는 생산 코스트를 증가시키는 당단백질 생성물의 마이크로 이질성(균질성)(microheterogenity), 그 결과 얻어진 분리 당단백질 생성물의 빈약한 약물동태(poor pharmacokineties) 또는 상기 양자의 조합을 포함하여, 최대의 효과적인 적합한 팩터(factor)이하로 되었다. 이와 같이, 효과가 개선되고 약물동태가 더 향상되며 장시간 지속되는 EPO 펩티드가 이 기술분야에서 필요로 하였다. 더 나아가서, 최대수의 개별적인 EPO 펩티드에 대하여 효과적으로 하기 위해서는 용이하게 재차 재생성할 수 있는 예측가능하고 주로 균질성 있는 구조를 가지며 약물동태학적으로 치료가 개선된 EPO 펩티드를 공업적 규모로 생산하는 것이 가능하도록 할 필요가 있다.

다행히, 치료효과가 개선된 EPO 펩티드와 그 제조방법이 현재 발견되었다. 실제로, 본 발명은 약물동태가 향상된 EPO 펩티드를 제공한다. 또, 본 발명은 수식 EPO 펩티드를 생성하는 방법으로 공업적으로 실시할 수 있고 코스트면에서 효과적 인 생성방법을 제공한다. 본 발명의 EPO 펩티드는 PEG 성분, 치료성분, 생체분자 등 수식기(modifying groups) 로 이루어진 것이다. 따라서, 본 발명은 EPO가 효과적인 치료를 제공하는 것을 특징하는 여러 가지의 질병과 질병상태의 치료에 있어서 치료효과를 개선하고 약물동태를 향상시키는 EPO 펩티드에 대한 욕구(need)를 충족한다.

1개 이상의 폴리(에틸렌글리콜)성분을 가진 에리트로포이에틴(EPO)의 제어수식이 약물동태특성을 향상시킨 EPO 유도체를 얻는다는 것을 발견하였다. 또, 본 발명의 수식 EPO 펩티드의 신뢰성있고 코스트 면에서 효과적인 생성방법을 발견하여 개발하였다.

하나의 국면에서, 본 발명은 아래에서 나타낸 성분으로 이루어진 에리트로포이에틴펩티드(erythropoietin peptide)를 제공한다.

위 구조에서, D는 -OH와 R¹-L-HN-에서 선택한 하나의 멤버(member)이고; G는 R¹-L-및-C(O)(C₁-C₆)알킬에서 선택한 하나의 멤버이며; R¹은 직쇄(straight-chain) 또는 분기폴리(에틸렌글리콜)잔기로 이루어진 하나의 성분을 선택한 하나의 멤버로 이루어진 성분이며; L은 D가 OH일때 G가 R¹-L-이며, G가 -C(O)(C₁-C₆)알킬일때 D가R¹-L-NH-로 되도록, 하나의 결합(a bond), 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤트로알킬에서 선택한 멤버인 하나의 링커(linker)이다.

하나의 예에서, R¹-L은 다음에 나타낸 식을 가진다.:

위 식에서, a는 0~20의 정수이다.

또 다른 예에서, R¹은 다음식에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가진다:

위 식에서, e와 f는 1~2500에서 독립적으로 선택한 정수이고, q는 1~20의 정수이다.

다른 예에서, R¹은 다음에 나타낸 식에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가진다.:

위 식에서, e, f및 f'는 1~2500에서 독립적으로 선택한 정수이고, q및 q'는 1~20에서 독립적으로 선택한 정수이다.

또 다른 예에서, 본 발명은 R¹이 아래에 나타낸 식에서 선택한 멤버인 구조를 가진 것을 특징으로 하는 펩티드를 제공한다.

위 식에서, e, f및 f″는 1~2500에서 독립적으로 선택한 정수이고, q, q'및 g″는 1~20에서 독립적으로 선택한 정수이다.

다른 예에서, R¹은 아래에 나타낸 식에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가진다.

위 식에서, e와 f는 1~2500에서 독립적으로 선택한 정수이다.

다른 국면(aspect)에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 하나의 성분으로 이루어진 펩티드를 제공한다.

다른 예에서, 상기 성분은 아래에 나타낸 식을 가진다.

또 다른 대표적이 예에서, 상기 펩티드는 아래에 나타낸 식에 의한 성분으로 이루어진다.

위 식에서, AA는 상기 펩티드의 아미노산 잔기이다. 일부 예에서, 그 아미노산 잔기는 세린, 트레오닌 및 티로신에서 선택한 하나의 멤버이다. 하나의 바람직한 예에서, 그 아미노산 잔기는 SEQ.ID.NO:1의 위치 126에서 하나의 세린(serine)이다.

또 다른 대표적 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 최소 하나의 성분으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포에이틴 펩티드를 제공한다.

위 식에서, t는 0 또는 1의 정수이다. 이와 같이, 이 예에서 수식 시알산성분은 2개의 촉각 구조(biantennary structure)의 두개 분기(branch) 상에서 발생한다.

또 다른 관련 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 최소 하나의 성분으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포에이틴 펩티드를 제공한다.

또 다른 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식에 의한 하나의 식을 가진 최소 하나의 성분으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드를 제공한다.

이 예에서, 수식시알산 성분은 3개의 촉각 구조의 어느 형상의 분기 중 어느 하나 이상에서 발생할 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 최소 하나의 성분으로 이루어진 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드를 제공한다.

이 예에서, 수식시알산성분은 4개의 촉각 구조 중 어느 하나 이상의 분기상에서 발생할 수 있다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 생체활성에리트로포이에틴 펩티드인 하나의 에리트로포이에틴 펩티드를 제공한다. 하나의 예에서, 그 에리트로포이에틴 펩티드는 에리트로포이에틴에 의해 활성이다. 다른 예에서, 그 에리트로포이에틴 펩티드는 주로 비에리트로포이에틴에 의해 활성이다. 또 다른 예에서, 그 에리트로포이에틴 펩티드는 조직보호성이 있다.

또 다른 국면(aspect)에서, 본 발명은 아래에 나타낸 성분으로 이루어진 PEG화 에리트로포이에틴(PEG-ylated erythropoietin)의 제조방법을 제공한다.

위 식에서, R¹은 직쇄 또는 분기폴리(에틸렌글리콜)잔기로 이루어진 성분이며, L은 치환 또는 비치환 알킬과 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버(member)인 링커(linker)이다. 상기 제조방법은 아래에 나타낸 글리코실 성분

으로 이루어진 기재 에리트로포이에틴 펩티드를 아래에 나타낸 식을 가진

PEG-시알산 도너(donor)성분

과 상기 글리코실 성분의 Gal 상에 상기 PEG-시알산을 전이하는 효소로 그 전이에 적합한 상태 하에서 접촉하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

하나의 예에서, 그 에리트로포이에틴 펩티드는 적합한 숙주에서 발현된다. 하나의 예에서, 그 숙주는 포유동물세포이며, 또 다른 예에서 그 숙주세포는 곤충세포이다.

다른 국면에서, 본 발명은 피검자의 욕구가 있을 때 피검자의 상태를 치료하는 방법에 있어서 그 상태가 피검자에서 이감염성 적혈구의 생성에 그 특징이 있는 치료방법을 제공한다. 그 방법은 상기 피검자의 상태를 회복하는데 효과적인 본 발명의 에리트로포이에틴 펩티드의 유효량을 상기 피검자에 투여하는 스텝으로 이루어진다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 포유동물에서 적혈구 생성을 증강하는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유동물에서 적혈구 생성을 증강하는데 효과적인 본 발명의 에리트로포이에틴 펩티드의 유효량을 포유동물에 투여하는 스텝으로 이루어진다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 피검자의 욕구가 있을 때 피검자의 조직손상(injury)을 치료하는 방법에 있어서, 그 손상이 허혈(ischemia), 외상(trauma), 염증 또는 독성물질과의 접촉에서 얻어진 상해(damage)에 그 특징이 있으며, 그 방법은 피검자의 상기 조직손상을 회복하는데 효과적인, 본 발명의 에리트로포이에틴 펩티드의 유효량을 그 피검자에 투여하는 스텝으로 이루어진다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 에리트로포이에틴 펩티드와 의약상 허용할 수 있는 캐리어(carier)로 이루어진 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 O-결합 에리트로포이에틴 콘주게이트(conjugates)에서, 주로 폴리머가 결합된 아미노산 잔기의 각각은 동일한 구조를 가진다. 예로서, 하나의 펩티드가 하나의 Ser 결합 글리코실 잔기를 포함할 경우, 그 집단에서 그 펩티드의 최소 약 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6% 또는 더 바람직하게는 99.8%가 동일한 Ser잔기에 공유결합한 동일한 글리코실 잔기를 가진다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 다음의 구체적인 설명에서 당업자에 의해 이해할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시에서 유용한 일부 대표적인 수식당 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 실시에서 유용한 또다른 대표적인 수식당 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 실시에서 유용한 대표적인 수식당 뉴클레오티드를 나타낸 것으로, 도 3A는 40킬로달톤(K)CMP-시알산-PEG의 구조를 나타내며, 도 3B는 30킬로달톤(K)CMP-시알산-PEG의 구조를 나타낸다.

도 4는 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포에서 분리된 대표적인 글리코PEG화(glycopegylated)EPO 이소형(informs)을 개략적으로 나타낸 것으로, 도 4A는 하나의 대표적인 40킬로달톤O-결합PEG화 글리코형(glycoform)을 나타내며, 도 4B는 수개의 30킬로달톤 N-결합 PEG화 글리코형 중 하나를 나타낸다. 상기 PEG 분자로 이루어진 수식 시알산 성분은 N-결합글리코실 잔기의 분기 중 어느 하나 이상의 분기상에서 발생한다. 더 나아가서, 어느 글리코실화 EPO분자라도 모노, 비, 트리 또는 테트라-촉각 형상N-결합 글리코실 잔기의 어느 혼합물로 이루어지며, 이들 분기 중 어느 하나 이상이 본 발명의 수식 시알산 성분을 추가로 이루어지는 것을 대표적으로 나타낸다.

도 5는 하나의 대표적인 비 글리코PEG화형(non-glycopegylated form)의 CHO-유도EPO 펩티드를 나타낸다. 도 4에서 설명한 바와 같이, 어느 글리코실화 EPO분자라도 모노, 비, 트리, 또는 테트라 촉각 형상N-결합 글리코실 잔기의 혼합물로 이루어짐을 대표적으로 나타낸다.

도 6은 2종의 CHO-유도 비글리코PEG화 EPO형과 2종의 다른 CHO-유도 글리코PEG화 EPO형에 대한 약물동태(pharma cokinetics)를 비교한 실험 결과를 그래프로 나타낸다.

도 7은 본 발명에 의한 곤충 -유도글리코PEG화 EPO펩티드를 나타낸다.

도 8은 CHO-유도 비글리코PEG화 EPO형과 곤충-유도 비글리코PEG화 EPO형의 약물동태를 이들의 상응하는 글리코PEG화 EPO형의 약물동태를 비교한 실험결과를 그래프로 나타낸다.

도 9는 2종형(two forms)의 비글리코PEG화 EPO(A 및 B) 대(versus) 2종의 글리코PEG화 변이체(도 4A 및 도 4B에서 30킬로달톤과 40킬로달톤 변이체)와 배양할 때 EPO리셉터(receptor)를 가진 TFI세포의 증식촉진에서 하이퍼글리코실화 EPO변이체에 대한 비교활성을 그래프로 나타낸다.

도 10은 2종의 비PEG화 EPO변이체(A 및 B)와 2종의 글리코PEG화 변이체(도 4A 및도 4B의 30킬로달톤과 40킬로달톤 변이체)의 여러 가지 농도에 의해 재결합 키메라 EPO 리셉터(chimeric EPO receptor)에 동위원소 표지 EPO의 결합을 억제하는 것을 그래프로 나타낸다.

아래에서 본 발명에 사용되는 약어와 정의를 구체적으로 설명한다.

약어

PEG는 폴리(에틸렌글리콜)를 나타내며, PPG는 폴리(프로필렌글리콜)을 나타내고, Ara는 아라비노실을 나타내며, Fru는 프룩토실을 나타내고, Fuc는 푸코실을 나타낸다. Gal은 갈락토실을 나타내고, GalNAc는 N-아세틸갈락토사미닐을 나타내며, Glc는 글루코실을 나타내고, GlcNAc는 N-아세틸글루코사미닐을 나타내며, Man은 만노실을 나타내고, ManAc는 만노사미닐아세테이트를 나타내며, Xyl은 키실로실(xylosyl)을 나타낸다. NeuAc는 시알릴(N-아세틸뉴라미닐)을 나타내며, M6P는 만 노스-6-포스페이트를 나타낸다.

정의

특별한 정의가 없을 경우, 여기서 사용되는 모든 기술용어는 본 발명에 속하는 이 분야의 기술자에 의해 공통적으로 이해하는 동일한 의미를 일반적으로 가진다. 여기서 사용된 명칭과, 세포배양, 분자유전자, 유기화학 및 핵산화학과 혼성화에서의 실험실 처리공정은 이 분야에서 통상적으로 사용되고, 널리 공지된 것이다. 핵산과 펩티드 합성에서는 표준기술을 사용한다. 그 기술과 처리공정은 이 기술분야와 여러 가지의 일반적인 참고문헌에서 제공되는 통상의 방법에 의해 일반적으로 실시한다(Sanbrook 등., Molecular Cloning; A laboratory Manual, 2d ed.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 표준기술 또는 그 변형은 화학적 합성 및 화학적 분석에 사용된다.

여기서 설명한 모든 올리고삭카리드(올리고당류)는 비환원당의 명칭 또는 약어로 기재하고, 그 다음 글리코시드 결합의 구성(α또는β), 당결합(1 또는 2), 그결합 2,3,4,5,6 또는 8)에 포함된 환원당의 링위치를 기재하며, 그 다음 그 환원당의 명칭 또는 약어(GlcNAc)를 기재한다. 각각의 당(saccharide)은 피라노오스가 바람직하다. 표준당생물학(glycobiology)명칭의 재평가(review)문헌으로, 다음 문헌을 참조할 수 있다(Essentials of glycobiology; Vaki등., eds. CSHL press(1999)).

환원말단(reducing end)에서의 당류가 실제로 환원당인지의 여부에 대하여 올리고당류는 환원말단과 비환원말단을 가진 것을 고려할 수 있다. 올리고당류는 허용명칭에 따라, 좌측상에 비탄원 말단으로, 우측상에 환원말단으로 여기서 나타낸다.

용어 "시알산"을 9-탄소카르복시화당류 계통군의 어느 멤버를 말한다. 그 시알산 계통군의 가장 일반적인 멤버로는 N-아세틸-뉴라민산(2-캐토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노누로피라노스-1-온산(종종 약어로는 Neus5Ac, NeuAc, 또는 NANA로 기재함)이 있다. 상기 계통군(family)의 제 2멤버로는 N-글리코릴-뉴라민산(Neu5Ge 또는 NeuGe)이 있으며, 여기서는 NeuAc의 N-아세틸기가 히드록실화 되었다. 제 3의 시알산 계통군 멤버에는 2-케토-3-데옥시-노눌로손산(KDN)이 있다(Nadano 등(1986), J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori 등, J. Biol.Chem.265: 21811-21819(1990)참조). 또, 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-Neu5Ac와 같은 P-O-C₁-C₆ 아실-Neu5Ac 등 9-치환시알산이 포함된다. 상기 시알산계통군(family)의 논평(review)에 대해서는 다음 문헌을 들 수 있다: Varki, Glycobiology 2: 25-40(1992); SialicAcids: chemistry, Metabolism and Function, R.Schauer, Ed.(Springer-Verlag, New York(1992). 시알릴화처리공정에서 시알산화합물의 합성 및 사용은 특허문헌 WO92/16640(1992. 10. 01 공개)의 명세서에서 기재되어 있다.

"펩티드"(peptide)는 그 모노머가 아미노산으로 아미드 결합에 의해 함께 결합한 폴리머를 말하며, 또 폴리펩티드를 말한다. 그밖에 비천연 아미노산, 예로서 β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌이 또 포함한다. 유전자가 코팅되지 않은 아미노산도 본 발명에서 사용된다. 또, 본 발명에서는 수식(modifying)하여 반응성기, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료용 성분, 생체분자 등을 포함한 아미노산을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용된 모든 아미노산에는 D 또는 L-아이소모(isomer)(이성체)가 있다. 상기 L-이성체가 일반적으로 바람직하다. 또, 본 발명에서는 다른 펩티드유사물(peptidomimetics)도 유용하다. 여기서 사용되는 바와 같이, "펩티드"는 글리코실화 펩티드와 비글리코실화 펩티드를 말한다. 또, 펩티드를 발현하는 시스템에 의해 불충분하게 글리코실화한 펩티드도 포함한다. 일반적인 참고문헌의 논평으로, 다음 문헌을 참조할 수 있다: Spatola, A.F., in Chemistry and Biochemisty of Amino acids, peptides and proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, P.267(1983).

용어 "펩티드콘주게이트"(peptide conjugate)는 펩티드가 여기서 설명한 수식당과 콘주게이팅(conjugating)을 한 본 발명의 종(species)을 말한다.

용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 합성 아미노산과 아미노산 동족체 및 천연 아미노산과 동일하게 작용하는 아미노산 유사물을 말한다. 천연 아미노산에는 유전코드에 의해 코딩한 아미노산과, 후수식한 아미노산, 즉 히드록시프롤린, τ-카르복시 글루타메이트 및 O-포스포세린이 있다. 아미노산 동족체는 천연 아미노산과 같이 동일한 염기성 화학구조, 즉 수소에 결합하는 α탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R기를 가진 화합물, 즉 호모세린, 노르류신, 메티오닌술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 말한다. 이와 같은 동족체는 수식 R기(즉, 노르류신) 또는 수식 펩티드 골격을 가지나, 천연 아미노산과 같이 동일한 염기성 화학구조를 가진다. 아미 노산 유사물(mimetics)은 아미노산의 일반 화학구조와 다르나, 천연 아미노산과 동일하게 기능적 작용을 하는 구조를 가진 화학적 화합물을 말한다.

여기서 사용되는 용어 "수식당"은 본 발명의 프로세스에서 아미노산 또는 펩티드의 글리코실 잔기에 효소에 의해 첨가시킨 천연 또는 비천연 카르보히드레이트를 말한다. 그 수식당은 당 뉴클레오티드(모노, 디 및 트리포스페이트), 활성화당(즉, 글리코실 할라이드, 글리코실 메실레이트)및 활성화 하지 않으며, 뉴클레오티드가 아닌 당류를 포함하나, 한정하지 않은 다수의 효소기질에서 선택한다. 그 "수식당"은 "수식기(modifying group)"와 공유결합을 하는 기능적 작용을 한다. 유용한 수식기에는 PEG성분, 치료용 성분, 진단용 성분, 생체분자 등을 포함하며, 한정되어 있는 것은 아니다. 그 수식기는 비천연 카르보히드레이트 또는 비수식카르보히드레이트가 바람직하다. 그 수식기와 기능적 작용을 하는 부위(locus)는 "수식당"이 펩티드에 효소에 의해 부가되는 것을 방해하지 않도록 선택한다.

용어 "수용성"은 수중에서 검출할 수 있는 용해도를 가진 성분을 말한다. 물의 용해도를 검출 및/또는 정량하는 방법은 이 분야에서 공지되어있다. 대표적인 수용성 폴리머에는 펩티드, 당류, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산)등을 포함한다. 펩티드는 단일 아미노산, 즉 폴리(라이신)으로 이루어진 혼합서열(mixed sequence)을 가진다. 하나의 대표적인 폴리삭카리드에는 폴리(시알산)이 있다. 하나의 대표적인 폴리(에테르)에는 폴리(에틸렌글리콜)이 있다. 폴리(에틸렌이민)에는 하나의 대표적인 폴리아민이 있고, 폴리(아크릴)산에는 하나의 대표적인 폴리(카르복실산)이 있다.

수용성 폴리머의 폴리머 골격에는 폴리(에틸렌글리콜)(즉, PEG)이 있다. 그러나, 다른 관련된 폴리머는 또 본 발명의 실시에 적합하며, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌글리콜)의 사용은 이 발명의 국면에서 포함되며, 한정된 것이 아님을 알 수 있다. 용어 PEG에는 알콕시PEG, 2작용성 PEG, 멀티암형(multiarmed)PEG, 포크형(forked)PEG, 분기형 PEG, 현수PEG(즉, 그 폴리머 골격에 현수된 1개 이상의 관능기를 가진 PEG또는 관련 폴리머)또는 분해 가능한 결합을 가진 PEG를 포함하여 그 PEG의 형 중 어느 하나에서 폴리(에틸렌글리콜)을 포함한다.

폴리머 골격은 선상 또는 분기상으로 할 수 있다. 분기 폴리머 골격은 일반적으로 이 기술에서 공지되었다. 주로, 분기상 폴리머는 중심분기코어성분과 그 중심 분기코어에 결합된 다수의 선상 폴리머 사슬을 가진다. PEG는 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨 등 여러 가지의 폴리올에틸렌옥사이드를 첨가시켜 제조할 수 있는 분기형상에서 일반적으로 사용된다. 또, 중심 분기 성분은 라이신 등 수종의 아미노산에서 유도할 수 있다. 그 분기 폴리(에틸렌글리콜)은 R(-PEG-OH)_m와 같이 일반식으로 나타낼 수 있다. 상기 일반식에서 R은 글리콜 또는 펜타에리트리톨 등 상기 코어성분을 나타내며, m은 암(arms)의 수를 나타낸다. 여기서 참고로 기재한 특허문헌 USP5,932,462 명세서에서 멀티암(multi-armed)PEG 분자는 또 폴리머 골격으로 사용할 수도 있다.

또, 다수의 다른 폴리머는 본 발명에 적합하다. 비펩티드이고 수용성이며 2~약 300개의 말단을 가진 폴리머 골격은 특히 본 발명에서 유용하다. 적합한 폴리머 의 예에는 폴리(프로필렌글리콜)("PEG"), 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 코폴리머 등의 다른 폴리(알킬렌글리콜), 폴리(옥시에틸화폴리올), 폴리(올레핀알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시프로필메타아크릴아미드), 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 여기서 참고로 기재된 USP 5,629,384 명세서에서 설명한 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 그 코폴리머, 그 테르폴리머 및 그 혼합물이 포함되나 한정된 것은 아니다. 그 폴리머 골격의 각각의 사슬의 분자량이 변화할 수 있어도, 이것은 주로 약 100Da~약 100,000Da의 범위이며, 빈번하게는 약 6,000Da~약 80,000Da이다.

펩티드 약제를 환자에 투여할 때 여기서 사용되는 "곡선하부의 영역"(area under the curve) 또는 "AUC"는 환자의 전신 순환에서 약제의 농도를 기재한 곡선하부의 전영역을 시간의 함수로서 0~무한대로 정의한다.

펩티드 약제를 환자에 투여할 때 여기서 사용되는 용어 "반감기" 또는 " t^1/2" 은 환자에서 약제의 플라스마 농도가 반(1/2)으로 감소하는데 필요로 하는 시간으로 정의한다. 그 펩티드 약제와 관련된 1종 이상의 반감기는 다중 클리어런스 메카니즘, 재분산 및 이 분야에서 공지된 다른 메카니즘에 따라 좌우된다.

통상적으로, 알파 및 베타 반감기는 알파상이 재분산과 관련되도록 규정하며, 베타상이 클리어런스와 관련되도록 규정한다. 그러나, 대부분 단백질 약제가 혈액의 흐름에 한정되어있어, 최소 2종의 클리어런스 반감기로 할 수 있다.

글리코실화 펩티드에서, 신속한 베타상 클리어런스는 마크로파지에서의 리셉 터 또는 말단 갈락토오스, N-아세틸 갈락토사민; N-아세틸글루코사민, 만노오스 또는 푸코오스를 인식하는 내피세포(endothelical cells)에 의해 중개된다(mediated).

더 느린 베타상 클리어런스는 유효반경 <2nm(약 68KD)을 가진 분자의 신장 사구체 여과(renal glomerular filtration)및/또는 조직 내에서 특이성 또는 비특이성 흡수 및 대사작용에 의해 발생한다.

글리코PEG화 말단당(즉, 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민)을 캐핑(capping)함으로써 이들의 당을 인식하는 리셉터에 의해 신속한 알파상클리어런스를 차단할 수 있다. 이것은 또 유효반경이 더 큼으로써 분산량 및 조직흡수를 감소시켜 느린 베타상을 지연시킨다.

이와 같이, 알파상 및 베타상 반감기에 대한 글리코PEG화의 정밀한 충격은 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 글리코실화의 크기, 상태 및 다른 파라미터에 따라 변동된다. 또다른 "반감기"에 대한 설명은 참고문헌에서 발견된다(Pharmaceutical Biotechnology;1997, DFA Crommelin and RD Sindelar , eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp101-120 참조).

여기서 사용되는 용어 "글리코콘주게이션"(glycoconjugation)은 폴리펩티드의 글리코실 잔기 또는 아미노산에 수식당종의 효소에 의한 중개된 콘주게이션, 즉 본 발명의 에리트로포이에틴 펩티드를 말한다. "글리코콘주게이션"의 아속(subgenus)은 "글리코-PEG화"이며, 여기서 수식당의 수식기에는 폴리(에틸렌글리콜)과, 그 알킬유도체(즉, m-PEG) 또는 반응성 유도체(즉, H2N-PEG, HOOC-PEG)가 있다.

용어 "대규모"(large-scale)와 "공업적 규모"는 서로 바꿔 사용할 수 있으며, 단일 반응주기를 완료할 대 글리코 콘주게이트를 최소 약 250mg, 바람직하게는 최소 약 500mg, 가장 바람직하게는 최소 약 1g을 생성하는 반응주기(reaction cycle)를 말한다.

여기서 사용되는 용어 "글리코실 결합기"(glycosyl linking group)는 수식기(즉, PEG성분, 치료용 성분, 생체분자)가 공유결합을 하는 글리코실 잔기를 말한다. 그 글리코실 결합기는 그 콘주게이트의 잔부에 그 수식기를 결합한다.

본 발명의 방법에서, 그 "글리코실 결합기"는 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 공유결합을 함으로써, 그 펩티드 상에서 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 그 결합제를 결합한다.

"글리코실결합기"는 일반적으로, 그 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 "수식당"의 효소결합에 의해 "수식당"으로 유도된다.

그 글리코실 결합기는 삭카리드유도구조로서, 그 구조는 수식기-수식당 카세트(cassette)(즉, 산화→시프염기생성→환원)를 형성할 때 분해되며, 또 그 글리코실 결합기는 손상이 없다.

"무손상 글리코실결합기"는 삭카리드 모노머가 수식기를 결합하는 글리코실 성분에서 유도되는 결합기를 말하며, 그 콘주게이트의 잔부가 소듐메타퍼아이오데이트에 의해 분해, 즉 산화되지 않는 것을 말한다.

본 발명의 "무손상 글리코실 결합기"는 천연올리고삭카리드에서 하나의 모(parent)삭카리드 구조로부터 1개 이상의 글리코실 단위의 제거 또는 글리코실 단위의 부가에 의해, 유도할 수 있다.

여기서 사용되는 용어 "표적성분"(targeting moiety)은 신체의 특수조직 또는 부위에 선택적으로 국소화 하는 종(species)을 말한다. 그 국소화는 그 표적제 또는 콘주게이트의 분자 결성인자, 분자크기 이온상호작용, 소수성 상호작용 등 소정의 인식에 의해 중개(mediation)된다. 특수 조직 또는 부위에 처리제를 표적으로 하는 다른 메카니즘은 통상의 기술자에 의해 공지되었다. 대표적인 표적성분에는 항체, 항체 프라그멘트, 트랜스페린(transferrin), HS-글리코프로테인, 응결팩터, 혈청단백질, β-글리코프로테인, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등을 포함한다.

여기서 사용되는 "치료용 성분"은 유용한 치료제를 말하며, 항생물질, 항염증제, 항종양약제, 사이토 톡신 및 방사성제를 포함한다. "치료용 성분"에는 생체활성제의 프로드러그(prodrugs)와, 일종 이상의 치료용 성분이 캐리어, 즉 다가처리제(multivalent agents)에 결합하는 구성물(constructs)를 포함한다. 또, 치료용 성분에는 단백질과 단백질을 포함하는 구성물이 있다. 대표적인 단백질에는 GCSF(Granulocyte Colony Stimulating Factor), GMCSF(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), 인터페론(즉, 인터페론-α,-β,-r), 인터류킨(interleukin)(즉, 인터류킨Ⅱ), 혈청단백질(즉, FactorsⅦ, Ⅶa,Ⅷ, Ⅸ 및 Ⅹ), HCG(Human Chorionic Gonado tropin), FSH(Follicle Stimulating Hormome) 및LH(Lutenizing Hormone)와 항체 융합 단백질(즉, TNFR(Tumon Necrosis Factor)/Fc 도메인 융합 단백질)을 포함하며, 한정된 것은 아니다.

여기서 사용되는 용어 " 의약상 허용할 수 있는 캐리어"에는 상기 콘주게이트와 결합할 때 콘주게이트의 활성을 가지며 피검자의 면역 시스템과 무반응성인 어느 캐리어재라도 포함한다. 예로는 포스페이트 버퍼식영용액, 물, 에멀젼(2일/물 에멀전등) 및 여러 가지타입의 습윤제가 포함되나 한정된 것은 아니다. 또, 다른 캐리어에는 멸균액, 코팅정제를 포함하는 정제 및 캡슐을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 캐리어에는 전분, 밀크, 당, 클레이(clay), 젤라틴, 스테아린 산 또는 그 염, 마그네슘 또는 칼슘스테아레이트, 활석, 식물성 유지, 검, 글리콜 등 부형제 또는 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이와 같은 캐리어에는 또 플라보(flavor)와 칼라첨가제 또는 다른 성분도 포함한다. 이와 같은 캐리어로 이루어진 조성물은 공지의 통상의 방법에 의해 조제한다.

여기서 사용되는 "투여"(administering)는 경구투여; 좌약, 국소접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 병소내, 비강내 또는 피하투여 등 투여 또는 서방 디바이스(slow-release device), 즉 소형 침투펌프의 피검자 이식을 말한다. 투여는 비경구와 경점막(즉, 구강, 비강, 질내, 장내 또는 경피)를 포함하는 어느 루트에 의해 실시한다. 비경구투여에는 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 피내 투여, 피하투여, 복강내 투여, 심실내 투여 및 두개내 투여가 있다. 더욱이, 종양을 치료하기 위하여 주사할 때, 즉 고사(세포소멸)(apoptosis)를 유도할 때 그 종양 및/또는 종양을 포위하는 조직에 직접 투여할 수 있다. 다른 투여방식에는 리포솜 조제물, 정맥내 주입, 경피 패치등이 포함되나 한정된 것은 아니다.

사용 용어 "회복"(ameliorating) 또는 "회복하다"라는 것은 환자의 육체적 또는 정신적 웰빙(well being)에 있어서의 개선 또는 증상의 경감, 경쾌 또는 소멸 등 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하여 환자의 병리 또는 상태의 치료에서 성취(success)지수를 말한다. 증상의 회복은 객관적 또는 주관적 파라미터를 기준으로 할 수 있으며; 신체검사 및/또는 정신 의약적 평가의 결과를 포함한다.

용어 "치료"(therapy)는 질병에 걸리기가 쉬우나 질병의 증상을 아직도 나타내지 않는 동물에서 질병 또는 질병상태의 발생을 방지하며(예방치료), 질병을 억제하고(질병의 발생을 지연 또는 정지), 질병의 증상 또는 부작용을 경감하며(고식적 치료포함), 질병을 경감(질병의 회귀(퇴행)발생)하는 것을 포함하는 질병 또는 질병상태의 치료를 말한다.

용어 "유효량" 또는 "~에 효과적인 양" 또는 "치료 유효량" 또는 그 상응하는 용어는 질병을 치료하는 동물에 투여할 때 그 질병을 치료하는데 충분한 양을 말한다.

용어 "조직 보호성"(tissue protective)은 허혈(ischemia)/저산소증(hypoxia), 외상(trauma), 독성 및/또는 염증의 조직 또는 기관에 일반적으로 관련된 세포손상 결과에 대한 조직의 방어(defense)를 말한다.

세포손상은 세포사멸 및/또는 괴사(necrosis)(즉, 독성세포 사멸)로 된다.

이와 같이, "조직보호성"으로 소정의 외상, 염증, 독성 또는 허혈상태와 관련하여 정상적으로 조직의 세포소멸 및/또는 독성세포소멸이 되는 것을 방어한다.

예로서, EPO는 잠식성 모델(rodentmodel)의 중간대뇌동맥폐색 다음에 경색(infarct)영역을 감소한다(Siren, A.L 등(2001), Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98, 4044-4049 참조).

따라서, 이와 같은 상태 하에서 EPO는 허혈손상(즉, 허혈성 뇌졸증:ischemic strike)과 관련하여 괴사 및/또는 세포사멸을 효과적으로 감소함으로써 "조직 보호성"을 제공한다. "조직 보호성"은 또 망막병증(retinopathy) 또는 신경변성질병(neurodegenerative disease)등 변성질병과 관련된 계속되는 세포소멸과 세포손상의 결과에 대한 조직의 방어를 말한다.

용어 "분리"(isolated)이라는 것은 성분(components)에서 실질상 주로 유리되는 유리재(material)를 말하며, 그 성분을 사용하여 그 유리재를 생성한다. 본 발명의 펩티드 콘주게이트에 있어서, 그 용어"분리"는 상기 펩티드 콘주게이트를 제조하는데 사용된 혼합물 중에서 그 유리재를 정상적으로 수반하는 성분으로부터 실질상 유리되는 유리재를 말한다.

"분리"(isolated) 및 "순수"라는 용어는 서로 혼용한다. 일반적으로, 본 발명의 분리 펩티드 콘주게이트는 범위로서 바람직하며 나타낸 순도의 레벨을 가진다. 상기 펩티드 콘주게이트의 순도범위의 하한(lower end)은 약 60%, 약 70%, 또는 약 80%이며, 그 순도범위의 상한(upper end)은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.

그 펩티드 콘주게이트가 순도 약 90%이상일 때, 또 이들의 순도는 범위로서 바람직하게 나타낸 것이다. 그 순도범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 그 순도범위의 상한은 순도 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다.

그 펩티드 콘주게이트가 순도 약 90%이상일 때, 또 이들의 순도는 범위로서 바람직하게 나타낸 것이다. 그 순도범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 그 순도범위의 상한은 순도 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다.

순도는 종래에 알려진 분석방법(즉, 은염색겔, 폴리아크릴아미드겔 전기영동, HPLC, 또는 유사수단에 의한 밴드강도)에 의해 측정한다.

여기서 사용되는 "집단군의 각각의 멤버"는 본 발명의 펩티드 콘주게이트의 집단군의 특징을 설명한 것으로, 펩티드에 부가한 선택%의 수식당을 그 펩티드 상에서 다중의 동일 악셉터 부위에 부가한다. "집단군의 각각의 멤버"는 수식당에 콘주게이팅된 펩티드 상에서 그 부위의 균질성(homogeneity)을 말하며, 본 발명의 콘주게이트를 말한다. 여기서, 그 균질성은 최소 약 80%이고, 바람직하게는 최소 약 90%이며, 더 바람직하게는 최소 약 95%이다.

"균질성"(homogeneity)은 그 수식당이 콘주게이팅된 악셉터 성분의 집단군에 대한 구조 컨시스텐시(structural consistency)를 말한다. 이와 같이, 모든 다른 수식당이 콘주게이팅된 악셉터 부위로서 동일한 구조를 가진 악셉터 부위에 각각의 수식당 성분이 콘주게이팅된 본 발명의 펩티드 콘주게이트에서, 그 펩티드 콘주게이트는 약 100%의 균질성이 있는 것으로 한다. 균질성은 일반적으로 하나의 범위로 나타낸다. 그 펩티드 콘주게이트의 균질성 범위에서 하한은 약 50%, 약 70%, 약 80%이며, 그 순도범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90%이상이다.

그 펩티드 콘주게이트의 균질성이 약 90% 또는 그 이상일 때, 이들의 균질성 은 범위로서 바람직한 것으로 나타낸다. 균질성 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98%이다. 그 순도범위의 상한은 균질성 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다. 그 펩티드 콘주게이트의 순도는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 하나 이상의 방법, 즉 액상 크로마토그래피-질량 스펙트로메트의(LC-MS), 플라이트 스펙트로메트리의 매트릭스 조력형 레이저 탈착매스타임(matrix assisted laser desorption mass time)(MALDITOF), 모세관 전기영동 등에 의해 일반적으로 측정한다.

글리코펩티드종을 참조할 때, "실질상 균일한 글리코형"(glycoform) 또는 "실질상 균일한 글리코실화 패턴"은 관련된 글리코실 전이효소(즉, 푸코실 전이효소)에 의해 글리코실화한 악셉터 성분의 백분율(%)을 말한다. 예로서, α1,2푸코실 전이효소의 경우, 실질상 균일한 푸코실화 패턴은 실질상 모든(아래에서 정의함) Gal β1, 4-GlcNAc-R과 그 시알릴화 동족체가 본 발명의 펩티드 콘주게이트에서 푸코실화할 때 존재한다. 출발재가 글리코실화 악셉터 성분(즉, 푸코실화 Gal β1, 4-GlcNAc-R 성분)을 함유할 수 있다는 것은 이 분야의 기술에 의해 할 수 있다. 이와 같이, 산출%의 글리코실화에서는 본 발명의 방법에 의해 글리코실화한 악셉터 성분과, 그 출발재에서 이미 글리코실화한 이들의 악셉터 성분을 포함한다.

"실질상 균일한"(substantially uniform)의 상기 정의에서 용어 "실질상"은 소정의 글리코실 전이효소에 대한 악셉터 성분의 최소 약 40%, 최소 약 70%, 최소 약 80%, 또는 바람직하게는 최소 약 90%, 더 바람직하게는 최소 약 95%가 글리코실화 되었다는 것을 의미한다.

치환기를 종래의 화학식에 의해 특정하여, 좌측에서 우측으로 기재할 때, 이들의 기는 화학적으로 동일한 치환체를 동일하게 포함하며, 그 치환체는 우측에서 좌측으로 그 구조를 기재하며, 그 치환체는 우측에서 좌측으로 구조를 기재하여 얻어진다. 즉, -CH₂O-는 또 -OCH₂-를 설명한 것으로 한다.

용어 "알킬"은 그 자체 또는 또다른 치환체의 부분으로써, 특별한 설명이 없을 경우, 직쇄 또는 분기사슬, 또는 환상의 탄화수소래디컬 또는 그 결합을 의미하며, 완전 포화하거나, 모노 또는 폴리불포화시킬수 있고, 2가래디컬 또는 다가래디컬을 포함할 수 있으며, 지정한 탄소원자수(즉, C₁-C₁₀은 탄소원자 1~10개를 의미한다)를 가진다. 포화탄화수소래디컬의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 예로서 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성체 등의 기(group)를 포함하나, 한정된 것은 아니다. 불포화 알킬기는 1개 이상의 2중 결합 또는 3중 결합을 가진 것이다. 불포화 알킬기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 그 고급 동족체 및 이성체를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다. 그 용어 "알킬"은 또, 특별한 설명이 없을 경우, "헤테로알킬"등 아래에서 더 구체적으로 정의한 알킬의 유도체를 포함한 것을 의미한다. 탄화수소기로 한정시킨 알킬기를 "호모알킬"로 한다.

용어 "알킬렌"은 그 자체 또는 또다른 치환체의 일부로서 한정되어 있는 것 은 아니나, -CH₂ CH₂ CH₂ CH₂-에 의해 예시된 바와 같이 알칸에서 유도된 2가래디컬을 의미하며, 더 나아가서 "헤테로알킬렌"과 같이 아래에서 설명한 기(groups)를 포함한다. 일반적으로, 알킬(또는 알킬렌)기는 1~24개의 탄소원자를 가지며, 이들의 기에는 본 발명에서 바람직한 10개 또는 수개의 탄소원소를 가진다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 사슬이 더 짧은 알킬 또는 알킬렌기이며, 일반적으로 8개 또는 수개의 탄소원자를 가진다.

용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 이들의 통상의 의미로 사용되며, 그 분자의 잔부에 각각 산소원자, 아미노기 또는 황원자에 의해 결합된 이들의 알킬기를 말한다.

용어 "헤테로알킬"은 그 자체에 의해 또는 다른 용어와 결합하여 있는 헤테로알킬로서, 특별한 설명이 없는 경우 안정성 있는 직쇄 또는 분기사슬, 또는 환식 탄화수소래디컬, 또는 그 결합을 의미하며, 위에서 설명한 탄소원자수와, O,N,Si 및 S로 이루어진 그룹에서 선택한 최소 하나의 헤테로원자로 이루어지고; 질소와 황원자는 선택적으로 산화시킬 수 있으며, 그 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차원 구조화할 수 있는 특징이 있다. 그 헤테로원자 O,N 및 S와 Si는 헤테로알킬기의 내부위치에서 또는 알킬기가 그 분자의 잔부에 결합된 위치에서 위치시킬 수 있다. 예로는 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃를 포함하나, 한정되어있는 것은 아니다. 2개 까지의 헤테로원자 는 예로서 -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃-CH₃ 등 연속적으로 형성할 수 있다. 동일하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체 또는 다른 치환체의 일부로서 한정된 것은 아니나 예로서 -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂와 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-로 나타낸 헤테로알킬에서 유도된 2가래디컬을 의미한다. 헤테로알킬렌기에 있어서, 헤테로원자는 사슬 말단의 어느 한쪽 또는 양쪽을 또 점유하여 위치할 수 있다(즉, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또 더나아가서, 알킬렌과 헤테로 알킬렌 결합기에 있어서 그 결합기의 배향은 그 결합기의 식을 기재한 방향에 따르는 기술적인 의미가 없다. 예로서, 그 식 -C(O)₂R′- 는 -C(O)₂R'와 -R′C(O)₂- 모두를 나타낸다.

용어 "시클로알킬"과 "헤테르시클로알킬"은 이들 자체에 의해 또는 다른 용어와의 결합에서, 특별한 설명이 없는 경우 "알킬"과 "헤테로알킬"이 환상(cyclic)인 것을 각각 나타낸다.

또, 헤테로시클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 그 분자의 잔부에 헤테로 사이클(hetero cycle)이 결합 되어있는 위치를 점유할 수 있다.

시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로섹세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나 한정된 것은 아니다.

헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6,-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1- 피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 한정된 것은 아니다.

용어 "할로" 또는 "할로겐"은 이들 자체에 의해 또는 또다른 치환체의 일부로서 특별한 설명이 없을 경우, 플루오린, 클로린, 브로민 또는 요오드 원자를 의미한다. 또, "할로알킬" 등의 용어는 모노할로알킬과 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예로서, 용어 "할로(C₁-C₄)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등이 포함되나 한정된 것은 아니다.

용어 "아릴"은 특별한 설명이 없을 경우, 동시에 축합 또는 공유결합하는 단일링 또는 다중링 (바람직하게는 1~3개의 링)의 폴리불포화 방향족 치환기를 의미한다.

용어 "헤테로아릴"은 N,O 및 S에서 선택한 1~4개의 헤테로원자를 포함한 아릴기(또는 링)을 의미하며, 그 황원자는 선택적으로 산화하며, 그 질소원자는 선택적으로 4분화하는 특징이 있다.

헤테로아릴기는 헤테로원자에 의해 그 분자의 잔부에 결합할 수 있다.

아릴 및 헤테로 아릴기의 비한정 예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인도릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀸옥살리닐, 5-퀸옥살리닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에닐, 2,3-디히드로벤조[1,4]디옥신-6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴이 포함되어있다.

상기 아릴 및 헤테로아릴링 시스템 각각의 치환기는 아래에서 설명한 허용할 수 있는 치환기의 그룹에서 선택한다.

다른 용어(즉, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)와 결합하여 사용할 경우, 용어 "아릴"은 요약하여 위에서 정의한 아릴과 헤테로아릴링 모두를 포함한다.

이와 같이, 용어 "아릴알킬"은 하나의 탄소원자(즉, 메틸렌기)가 예로서 산소원자에 의해 치환된 이들의 알킬기(즉, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)를 포함하여 하나의 알킬기(즉, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)에 하나의 아릴기가 결합되어있는 이들의 래디컬을 포함하는 것을 의미한다.

각각의 상기 용어(즉, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")는 상기 래디컬의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함한 것을 의미한다. 각 타입의 래디컬에 대한 바람직한 치환기는 아래에서 설명한다.

알킬 및 헤테로알킬 래디컬(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로아케닐 및 헤테로시클로알케닐 등 자주 관련된 이들의 기를 포함)에 대한 치환기는 일반적으로 "알킬기의 치환기"를 말한다.

이들의 치환기는 탄소원자의 수가 0~(2m′+1)인 아래에 예시한 기에서 선택한 1종 이상의 다수의 기이며, 한정된 것은 아니다:

-OR',=O,=NR',=N-OR',-NR'R'',-SR',-할로겐,-SiR'R''R''',-OC(O)R',-C(O)R',-CO₂R',-CONR'R'',-OC(O)NR'R'',-NR''C(O)R',-NR'-C(O)NR''R''',-NR''C(O)₂R',-NR-C(NR'R''R''')=NR'''',-NR-C(NR'R'')=NR''',-S(O)R',-S(O)₂R',-S(O)₂NR'R'',-NRSO₂R,-CN 및 -NO₂.

여기서,m'는 상기 래디컬에서 탄원자의 총수이며, R,R'',R''' 및 R''''은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 즉 1~3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴알킬기이다.

본 발명의 화합물이 1종 이상의 R기를 포함할 경우, 예로서 각각의 상기 R기는 1종 이상의 R',R'',R''',R''''의 기가 존재할 때 각각의 R',R'',R'''및 R''''에서와 같이 독립적으로 선택한다.

R'와 R''가 동일한 질소원자에 결합될 때, 이들은 질소원자와 결합하여 하나의 5-,6-, 또는 7-멤버링을 형성할 수 있다. 예로서, -NR'R''은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 한정된 것이 아님을 의미한다.

상기 치환기의 설명에서, 용어 "알킬"은 할로알킬(즉, -CF₃ 및 -CH₂CF₃)과 아실(즉, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃,-C(O)CH₂OCH₃ 등)등, 수소기 이외의 기에 결합된 탄소원자 함유기를 포함하는 것을 의미한다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

알킬래디컬에 대하여 설명한 치환기와 동일하게 아릴 및 헤테로알릴기에 대 한 치환기는 일반적으로 "아릴기의 치환기"를 말한다. 예로서, 이들의 치환기는 방향족링시스템 상에서 개방원자가의 수가 0~총합수의 범위에 있는 수를 가진 아래의 기에서 선택한다:

할로겐,OR',=O,=NR',=N-OR',-NR'R'',-SR',-할로겐,-SiR'R''R''',-OC(O)R',-C(O)R',-CO₂R',-CONR'R'',-OC(O)ONR'R'',-NR''C(O)R',-NR'-C(O)NR''R''',-NR''C(O)₂R',-NR-C(NR'R''R'')=NR'''',-NR-C(NR'R'')=NR''',-S(O)R',-S(O)₂R',-S(O)₂NR'R'',-NRSO₂R',-CN 및 -NO₂,-R',-N₃,-CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시, 및 플루오로(C₁-C₄)알킬.

여기서, R',R'',R''' 및 R''''는 수소, 치환 또는 비치환알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환아릴 및 치환 또는 비치환헤테로아릴에서 독립적으로 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 하나의 화합물이 1종 이상의 R기를 포함할 경우, 예로서 각각의 상기 R기는 1종 이상의 R',R'',R''' 및 R''''기 존재할 때 각각의 R',R'',R''' 및 R''''에서와 같이 독립적으로 선택한다.

다음의 스킴(schemes)에서, 부호X는 위에서 설명한 바와 같이 "R"을 나타낸다.

상기 아릴 또는 헤테로아릴링의 인접 원자상에 있는 2개의 치환기는 식-T-C(O)-(CRR')_q-U-(여기서, T와 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR' 또는 단일 결합이 며, q는 0~3의 정수임)의 치환기에 의해 선택적으로 치환할 수 있다.

또, 상기 아릴 또는 헤테로아릴링의 인접원자 상에서 2개의 치환기는 식-A-(CH₂)_r-B-의 치환기에 의해 선택적으로 치환할 수 있다(이 식에서, A와 B는 독립적으로 -CRR'-,-O-,-NR-,-S-,-S(O)-,-S(O)₂-,-S(O)₂NR'-또는 단일 결합이고, r은 1~4의 정수이다.).

이와 같이 하여 형성된 새로운 링의 단일결합 중 하나는 2중결합에 의해 선택적으로 치환시킬 수 있다. 또, 상기 아릴 또는 페테로아릴링의 인접원자 상에서 2개의 치환기는 식-(CRR')_s-X-(CR''R''')_d-의 치환기에 의해 선택적으로 치환시킬 수 있다(여기서, s와 d는 독립적으로 0~3의 정수이고, X는 -O-,-NR'-,-S-,-S(O)-,-S(O)₂-또는 -S(O)₂N'-이다. 치환체 R,R',R'' 및 R'''는 수소 또는 치환 또는 비치환(C₁-C₆)알킬에서 독립적으로 선택하는 것이 바람직하다.

여기서 사용되는 용어 "헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 실리콘(Si)을 포함하는 것을 의미한다.

에리트로포이에틴(erythropoietin)(EPO)은 당단백질(glyco protein)로, 이것은 적혈구 합성의 주요한 조절기(regulator)로 사용한다.

에리트로포이에틴은 신장에서 생성되며 전구세포를 성숙한 적혈구로 분할 및 분화하도록 골수내 전구세포를 자극에 의해 작용한다.

EPO는 165 또는 166 아미노산 당단백질로 존재한다. 그 166아미노산 변이체 는 그 당단백질의 C 말단단부에 있는 추가 아르기닌잔기의 존재에 의해 상기 165 아미노산 변이체와 현저하게 다르게 구별된다.

재결합 EPO는 만성 신부전과 관련되 빈혈(anemias)을 포함하는 여러 가지 형태의 빈혈, 지도비딘(Zido Vidine)치료 HIV감염환자와 암환자의 화학요법치료에서 효과적인 치료체로써 때때로 이용할 수 있었다.

그 당단백질은 정맥내(IV)또는 피하(SC)주사로서 피경구투여한다.

치료목적으로 사용된 재결합 에리트로포이에틴의 효과를 향상시키기 위하여, 본 발명은 글리코실화와 비글리코실화 에리트로포이에틴 펩티드의 콘주게이트를 제공한다.

그 콘주게이트는 치료용 성분, 진단용 성분, 표적성분 등 여러 가지종(species)과의 추가 콘주게이션(conjugation)에 의해 추가로 수식할 수 있다.

본 발명의 콘주게이트는 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 수식당의 효소결합에 의해 형성된다. 글리코실화 부위는 그 펩티드에 수식기를 콘주게이팅 하는 좌위(locus)를 제공한다. 즉 글리코콘주게이션(glycoconjugation)에 의해 제공한다.

하나의 대표적인 수식기에는 폴리(에틸렌글리콜)등 수용성 폴리머, 즉 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)이 있다.

상기 EPO 펩티드의 수식(modification)은 환자의 혈행(circulation)에서 그 재결합 EPO의 안정성과 보존시간을 향상시킬 수 있고, 또 재결합 EPO의 항원성을 감소할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 실질상 균질성 있는 유도체와 패턴을 가진 펩티드와 글리코펩티드를 회합(assemble)하는 것이 가능하다.

본 발명에서 사용된 효소는 일반적으로 소정의 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 결합 또는 그 펩티드의 소정의 글리코실에 대하여 선택성이 있다.

또, 본 발명의 방법은 수식 펩티드와 글리코펩티드의 대규모 생산에도 실용성이 있다.

이와 같이, 본 발명의 방법은 사전에 선택된 균질의 유도체화 패턴을 가진 글리코 펩티드의 대규모 제조의 실용성 있는 기술적 수단을 제공한다.

본 발명은 또 예로서 면역성 또는 망상내피계(reticuloendothelial system)(RES)에 의한 흡수율 감소 또는 클리어런스율(clearance rate)감소에 의해 치료반감기가 증가한 글리코실화 및 비글리코실화 펩티드의 콘주게이트를 제공한다.

더우기, 본 발명의 방법은 펩티드 상에서 항원결정군(antigenic determinants)의 차폐(masking)수단을 제공함으로써, 그 펩티드에 대한 숙주면역성응답을 감소 또는 제거한다.

또, 표적제의 선택적 결합을 사용하여 소정의 표적제에 대하여 특이성이 있는 소정의 조직 또는 세포편 악셉터에 펩티드를 표적으로 정할 수 있다.

콘주게이트( conjugates )

제 1의 국면에서, 본 발명은 EPO 펩티드와 선택된 수식기 사이에 하나의 콘주게이트를 제공한다.

그 펩티드와 수식기 사이의 결합(link)에는 그 펩티드와 그 선택성분 사이에 설정한 글리코실 결합기을 포함한다.

여기서 설명한 바와 같이, 그 선택성분은 주로, 삭카리드 단위에 결합할 수 있는 어느 종(species)이라도 가능하며, 이것은 "수식당"에서 얻어지고, 그 수식당은 적합한 전이효소에 의해 인식되며, 그 전이효소는 그 펩티드 상에 그 수식당을 결합한다.

그 수식당의 그 삭카리드 성분은 그 펩티드와 선택된 성분 사이에 설정될 때 하나의 "글리코실 결합기", 즉 무손상의 글리코실 결합기로 된다. 그 글리코실 결합기는 수식기와 수식 후에, 펩티드의 글리코실 잔기 또는 아미노산 잔기에 수식당을 부가하는 효소의 기질인 모노 또는 올리고삭카리드에서 형성된다.

그 글리코실 결합기는 삭카리드 성분이며, 또 그 삭카리드 성분을 포함할 수 있으며, 그 삭카리드 성분을 그 수식기의 부가된 또는 부가 중에 분해할 수 있게 수식된다.

예로서, 그 글리코실 결합기는 삭카리드기로부터 유도할 수 있으며, 그 삭카리드기는 그 상응하는 알데히드의 무손상 삭카리드의 산화성 분해, 즉 메타퍼아이오데이트의 작용에 의해 생성되며, 그 다음으로 적합한 아민에 의해 시프염기(schiff base)로 전환된 다음, 상응하는 아민으로 환원된다.

본 발명의 콘주게이트는 다음에 나타낸 일반구조에 상응한다:

위 구조에서, 부호 a,b,c,d 및 s는 0(zero)이아닌 양(+)의 정수를 나타내며, t는 0 또는 양(+)의 정수이다. "에이젠트"(agent)는 치료제, 생체활성제, 검출할 수 있는 라벨, 수용성 성분(즉, PEG, m-PEG, PPG, m-PPG)등이다.

그 "에이젠트"(agent)는 펩티드, 즉 효소, 항체, 항원 등으로 할 수 있다.

그 링커(linker)는 범위가 넓은 결합기 중 어느 하나이다. 또, 그 링커는 단일 결합(bond) 또는 "0차 링커"(zero order linker)로 할 수 있다.

대표적인 하나의 예에서, 그 선택된 수식기에는 수용성 폴리머, 즉 m-PEG가 있다. 그 수용성 폴리머는 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드에 공유결합되어 있다. 그 글리코실 결합기는 그 펩티드의 글리코실 잔기 또는 아미노산 잔기에 공유결합되어있다. 본 발명은 또 아미노산 잔기와 글리코실 잔기가 글리코실 결합기로 수식되어있는 콘주게이트를 제공한다.

하나의 대표적인 수용성 폴리머에는 폴리(에틸렌글리콜), 즉 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이 있다.

본 발명에서 사용된 그 폴리(에틸렌글리콜)이 소정의 형태 또는 분자량의 범위에 한정되어있는 것은 아니다.

분기 없는 폴리(에틸렌 글리콜)분자에 있어서, 그 분자량은 500~100,000사이 가 바람직하다. 분자량 2000~60,000의 사용이 바람직하여, 분자량 약 5,000~ 약 30,000이 더 바람직하다.

또 다른 예에서, 그 폴리(에틸렌글리콜)은 1종 이상의 PEG 성분이 결합된 하나의 분기 PEG이다.

분기 PEG의 예는 특허문허 USP 5,932,462;

USP 5,342,940; USP 5,643,575; USP 5,919,455; USP 6,113,906; USP 5,183,660; WO 02/09766과, 참고문헌(Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5; 283-288(1994); Yamasaki 등, Agric. Biol. Chem., 52: 2125~2127, 1998]이 있다.

하나의 바람직한 예에서, 그 분기 PEG 각각의 폴리(에틸렌글리콜)의 분자량은 약 40,000달톤 또는 그 이상이다.

효소에 의해 부가된 글리코실 결합기에 의해 형성된 콘주게이트의 제공 이외에, 본 발명은 치환패턴에서 고도의 균질성이 있는 콘주게이트를 제공한다.

본 발명의 방법을 사용하여, 본 발명의 콘주게이트의 집단에서 수식당 성분 모두를 구조적으로 동일한 아미노산 또는 글리코실 잔기의 다중 복제에 결합된 펩티드 콘주게이트를 형성할 수 있다.

이와 같이, 제 2의 국면에서, 본 발명은 무손상 글리코실 결합기를 통해 그 펩티드에 공유결합된 수용성 폴리머 성분의 집단을 가진 펩티드 콘주게이트를 제공한다.

본 발명의 하나의 바람직한 콘주게이트에서, 그 집단의 각각의 멤버는 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드의 글리코실 잔기에 결합되고, 그 글리코실 결합기가 결합된 그 펩티드의 각 글리코실 잔기는 동일한 구조를 가진다.

글리코실 결합기에 의해 공유 결합된 수용성 폴리머의 집단을 가진 펩티드 콘주게이트를 또 제공한다.

하나의 바람직한 예에서, 수용성 폴리머 성분의 집단의 모든 멤버는 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드의 아미노산 잔기에 결합되며, 글리코실 결합기를 결합시킨 각각의 아미노산 잔기는 동일한 구조를 가진다.

본 발명은 또 무손상 글리코실 결합기에 의해 치료용 성분, 진단용 성분, 표적 성분, 독성성분 등에 그 펩티드가 콘주게이팅된 위에서 설명한 콘주게이트와 동족인 콘주게이트를 제공한다. 상기에 인용한 성분 각각은 작은 분자의 천연 폴리머(즉, 폴리펩티드)또는 합성 폴리머이다.

어느 서열을 가진 어느 에리트로포이에틴 펩티드라도 본 발명의 콘주게이트의 하나의 성분으로 유용하다.

하나의 대표적인 예에서, 그 펩티드는 다음에 나타낸 서열을 가진다:

또 다른 대표적인 예에서 그 펩티드는 아래에 나타낸 서열을 가진다:

위에서 설명한 서열에서는 2개의 디술피드결합으로서 하나는 C7-C161에서 디술피드 결합이 있고, 다른 하나는 C29-C33에서 디술피드 결합(bond)이 있다.

시스테인기는 위 세열에서 굵고 진한 글자로 나타낸다.

두개말단은 유도체화하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 펩티드에는 최소 하나의 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하며, 이것은 PEG 성분을 포함하는 글리코실 잔기와 글리코실화한다.

그 PEG는 무손상 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드와 공유결합을 한다. 그 글리코실결합기는 그 펩티드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 공유결합을 한다.

또, 그 글리코실 결합기는 글리코펩티드의 1개 이상의 글리코실 단위에 결합한다.

또, 본 발명은 아미노산 잔기와 글리코실 잔기에 글리코실 결합기가 결합된 콘주게이트를 제공한다.

그 PEG 성분은 무손상 글리코실 링커에 직접 또는 비글리코실 링커, 즉 치환 또는 비치환 알킬, 치황 또는 비치환헤테로알킬에 의해 결합된다.

하나의 바람직한 예에서, 에리트로포이에틴 펩티드는 아래의 식Ⅰ에서 나타낸 성분으로 이루어진다.

식Ⅰ

식Ⅰ에서, D는 -OH와 R¹-L-HN-에서 선택한 하나의 멤버(member)이고, G는 R¹-L-과 -C(O)(C₁-C₆)알킬에서 선택한 하나의 멤버이며, R¹은 단일사슬 또는 분기폴리(에틸렌 글리콜)기로 이루어진 하나의 성분을 선택한 하나의 멤버로 이루어진 하나의 성분이고, L은 D가 OH이고 G가 R¹-L-일 때와, G가-C(O)(C₁-C₆)알킬일때 D가 R¹-L-NH-로 되도록 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬과 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나이 멤버인 하나의 링커(linker)이다.

조성물

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 수식 삭카리드, 리피드 및 펩티드 등 종(species)사이에 형성된 콘주게이트와 이들 종의 활성화 동족체 및 수식기를 가진 삭카리드를 제공한다.

수식당( modified sugars )

본 발명은 수식당, 수식당 뉴클레오티드와 수식당의 콘주게이트를 제공한다.

본 발명의 수식당화합물에서, 그 당성분은 삭카리드, 데옥시-삭카리드, 아미노-삭카리드 또는 N-아실삭카리드가 바람직하다.

용어 "삭카리드"와 그 동가물, "삭카릴", "당" 및 "글리코실'은 모노머, 디머, 올리고머 및 폴리머를 말한다. 그 당 성분은 또 수식기와 기능적 작용을 한다. 그 수식기는 일반적으로 그 당(sugar)상에서 아민, 술프히드릴 또는 히드록실, 즉 일급 히드록실성분과의 콘주게이션에 의해 그 당성분에 콘주게이팅을 한다.

하나의 대표적인 예에서, 그 수식기는 그 당 상에서의 아민을 통해, 즉 그 수식기의 반응성 유도체와 아민의 반응에 의해 형성된 아미드, 우레탄 또는 우레아를 통해 결합한다.

본 발명의 콘주게이트의 당 코어로서 어느 당이라도 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 형성하는데 유용한 대표적인 당 코어에는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스 및 시알산이 포함되나, 한정되어있는 것은 아니다.

다른 유용한 당에는 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 시알산의 5-아민 동족체 등 아미노당을 포함한다.

그 당 코어는 자연계에서 발견된 구조이며, 또 이것은 수식되어 수식기를 콘주게이팅하는 부위를 제공할 수 있다.

예로서, 하나의 예에서 본 발명은 시알산 유도체를 제공하며, 그 유도체에서는 P-히드록시성분이 아민과 치환된다. 그 아민은 하나의 선택된 수식기의 활성화 등록체를 용이하게 유도체화 한다.

아래에서의 설명에서, 본 발명은 시알산의 선택유도체의 사용에 대하여 설명한다.

이 분야의 기술자는 그 설명의 요점을 명백하게 하기 위하여, 설명한 구조와 조성물이 일반적으로 삭카리드기, 수식 삭카리드기, 활성화 수식 삭카리드기 및 수식 삭카리드기의 콘주게이트의 종에 적용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

하나의 대표적 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 다음 식을 가진 수식당아민을 제공한다.

위 식에서, G는 글리코실 성분이고, L은 결합(bond) 또는 링커이며, R¹은 수식기이다. 대표적인 결합(bonds)에는 글리코실 성분 상에서 반응성기, 즉 NH₂, SH, 또는 OH와 그 수식기 상에서 하나의 기의 보충 반응성(reactivity)사이에 형성된 결합이다.

이와 같이, 대표적인 결합에는 NHR¹, OR¹, SR¹ 등이 있다.

예로서, R¹이 카르복실산성분을 포함할 때 이 성분은 활성화되어 글리코실 잔기 상에서 NH₂ 성분과 결합하여 구조 NHC(O)R¹을 가진 하나의 결합을 얻는다.

대표적인 링커에는 알킬 및 헤테로알킬 성분을 포함한다. 그 링커에는 결합기, 예로서 아닐-기재 결합기, 즉 -C(O)NH-, -OC(O)NH-등을 포함한다.

그 결합기는 본 발명의 종의 성분사이에서, 즉 글리코실성분과 링커(L)사이에서 또는 그 링커와 수식기(R) 사이에서 형성된 결합(bonds)이다.

다른 결합기에는 에테르, 티오에테르 및 아민이 있다.

예로서 하나의 예에서 그 링커는 아미노산 잔기(글리신 잔기 등)이다.

그 글리신의 카르복실산 성분은 글리코실 잔기 상에서 아민과의 반응에 의해 그 상응하는 아미드로 전환시키며, 그 글리신의 아민은 그 수식기의 활성화한 카르복실산 또는 카르보네이트와 반응에 의해 그 상응하는 아미드 또는 우레탄으로 전환시킨다.

또 다른 대표적인 링커는 PEG 성분 또는 아미노산 잔기와 기능적 작용을 하는 PEG성분이다.

그 PEG는 하나의 PEG말단에서 아미노산 잔기에 의해 그 글리코실 잔기에 결합하고, 다른 PEG말단에 의해 R¹에 결합한다.

또, 그 아미노산 잔기는 R¹에 결합하고, 그 아미노산에 결합하지 않은 그 PEG 말단은 글리코실 잔기에 결합한다.

L-R¹의 하나의 대표적인 종은 다음에 나타낸 식을 가진다:

-NH{C(O)(CH₂)_aNH}_s{C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH]_tR¹

위 식에서, 지수 s와 t는 독립적으로 0 또는 1이다. 지수 a, b 및d는 독립적으로 0~20의 정수이며, 지수 c는 1~2500의 정수이다.

다른 동일한 링커는 -NH 성분이 예로서 -S, -O, 및 -CH₂에 의해 치환되는 종을 기재으로 한다.

더 구체적으로, 본 발명은 L-R¹이 다음에 나타낸 식의 화합물을 제공한다:

NHC(O)(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹, NHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹,NHC(O)O(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹, NH(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹, NHC(O)(CH₂)_aNHR¹, NH(CH₂)_aNHR¹ 및 NHR¹

위 식에서, 지수 a, b 및 d는 0~20, 바람직하게는 1~5의 정수에서 독립적으로 선택한다. 지수 c는 1~2500의 정수이다.

하나의 예에서, G는 시알산이며, 본 발명의 선택 화합물은 아래에 나타낸 식을 가진다.

이 분야의 기술자가 알 수 있는 바와 같이, 위에서 대표적인 화합물에서, 시 알산 성분은 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 이들의 N-아세틸유도체 등을 포함하나 한정되지 않은 다른 아미노-삭카리드와 치환할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 당의 일급 히드록실 성분은 상기 수식기와 기능적 작용을 한다. 예로서, 시알산의 9-히드록실은 그 상응하는 아민으로 전환시킬 수 있으며, 기능적 작용을 할 수 있어 본 발명에 의한 화합물을 제공한다.

이 예에 의한 식은 아래에 나타낸 식을 포함한다;

또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 수식당을 제공하며 그 수식당에서는 6-히드록실 위치가 위에서 설명한 카세트 등 링커-수식기 카세트를 가진 상응하는 아민 성분으로 전환된다.

이들의 수식등의 코어로써 사용할 수 있는 대표적인 삭카릴 기에는 Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man 등을 포함한다.

이 예에 의한 대표적인 수식당은 아래에 나타낸 식을 가진다.

위 식에서, R³-R⁵ 및 R⁷은 H, OH, C(O)CH₃, NH 및 NHC(O)CH₃에서 독립적으로 선택한 멤버이고, R⁶은 OR¹, NHR¹ 또는 L-R¹이며, L-R¹은 위에서 설명한 것과 같다.

본 발명의 선택된 콘주게이트는 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스를 기재로 하거나, 또는 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스의 입체화학 특성을 가진 종(species)을 기재로 한다.

이들의 콘주게이트의 일반 식은 아래에 나타낸 식과 같다;

또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 위에서 설명한 화합물을 제공하며, 이들의 화합물은 그 상응하는 뉴클레오티드당으로써 활성화시킨다.

본 발명에서 사용되는 수식형태의 대표적인 당 뉴클레오티드에는 뉴클레오티드 모노, 디 또는 트리포스페이트 또는 그 동족체를 포함한다.

하나의 바람직한 예에서, 그 수식당 뉴클레오티드는 UDP-글리코시드, CMP-글 리코스디 또는 GDP-글리코시드에서 선택한다.

더 바람직하게는, 그 수식당 뉴클레오리드의 당 뉴클레오티드부분을 UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코오스, UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, CMP-시알산 또는 CMP-NeuAc에서 선택한다.

하나의 대표적인 예에서, 그 뉴클레오티드 포스페이트는 C-1에 결합한다.

이와 같이, 글리코실 성분이 시알산인 하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 화합물을 제공한다.

위 식에서, L-R¹은 위에서 설명한 것과 같으며, L¹-R¹은 그 수식기에 결합한 링커를 나타낸다. L과 같이, L¹에 의한 대표적인 링커 종에는 결합, 알킬성분 또는 헤테로 알킬성분이 있다. 이들 예에 의한 대표적인 수식당 뉴클레오티드 화합물은 도 1 및 도 2에서 설명한다.

또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 본 발명의 수식당과 기질, 즉 펩티드, 리피드, 아글리콘 등 사이에, 더 바람직하게는 수식당과 글리코 펩티드 또는 글리코리피드의 글리코실 잔기 사이에 형성된 콘주게이트를 제공한다.

이 예에서, 수식당의 당성분은 그 기질과 수식기 사이에 설정한 글리코실 결 합기이다.

하나의 대표적인 글리코실 결합기는 하나의 무손상 글리코실 결합기이며, 이 결합기에서는 이 결합기를 형성하는 성분 또는 글리코실 성분이 화학적 처리 프로세스(즉, 소듐메타퍼아이오데이트)또는 효소처리 프로세스(즉, 옥시다아제)에 의해 분해되지 않는다.

본 발명의 선택된 콘주게이트에는 아미노-삭카리드의 아민성분, 즉 만노사민, 글루코사민, 갈락토사민, 시알산 등에 결합되는 수식기를 포합한다.

이 모티프(motif)에 의한 대표적인 수식기-무손상 글리코실 결합기 카세트는 아래에 나타낸 식을 가진 구조 등 시알산 구조를 기질로 한다:

위 식에서, R¹,L¹ 및 L²는 위에서 설명한 정의와 같다.

하나의 또 다른 대표적 예에서, 그 콘주게이트는 하나의 기질과 삭카릴성분의 1-위치 사이에서 형성되며, 여기서, 그 수식기는 그 삭카릴 성분의 6-탄소위치에서 링커에 의해 결합된다.

따라서, 이 예에 의해 설명한 콘주게이트는 아래에 나타낸 식을 가진다.

위 식에서, 래디컬은 위에서 설명한 정의와 같다.

이분야의 기술자는 위에서 설명한 수식 삭카릴 성분이 또 2,3,4 또는 5탄소원자에서 기질에 콘주게이팅을 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

이 예에 의해 설명한 화합물에는 아래에 나타낸 식을 가진 화합물을 포함한다:

위 식에서, R기와 지수는 위에서 설명한 정의와 같다.

본 발명은 또 6-탄소위치에서 L-R¹으로 수식한 당 뉴클레오티드를 제공한다.

이 예에 의한 대표적인 종에는 아래에 나타낸 식의 성분을 포함한다:

위 식에서, R기와 L은 위에서 설명한 성분을 나타낸다.

지수 "y"는 0,1 또는 2이다.

본 발명의 또다른 대표적인 튜클레오티드당은 GDP만노오스 외 입체화학적 특성을 가진 종을 기재한다.

이 예에 의한 하나의 대표적인 종은 아래네 나타낸 구조를 가진다:

또 하나의 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 UDP갈락토오스의 입체화학적 특성을 기초로 한 콘주게이트를 제공한다.

이 예에 의한 하나의 대표적인 화합물은 아래에 나타낸 구조를 가진다:

또 다른 대표적 예에서, 뉴클레오티드당은 글루코오스의 입체화학적 특성을 기초로 한 것이다.

이 예에 의한 대표적인 종은 다음에 나타낸 식을 가진다.

수식기, R1은 수용성 폴리머, 수불용성 폴리머, 치료제, 진단제 등을 포함하나 한정하지 않은 다수의 종 중 어느 하나이다.

대표적인 수식기의 특성은 아래에서 구체적으로 설명한다.

수식기

수용성 폴리머

다수의 수용성 폴리머는 이 분야의 기술자에 의해 공지되어 있으며, 본 발명의 실시에 유용하다.

용어 수용성 폴리머에는 삭카리드(즉, 덱스트린, 아밀로오스, 히알로우론산, 폴리(시알산), 헤파란스, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 즉 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 폴리머[즉, 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 즉 폴리(에틸렌 글리콜)]; 펩티드; 단백질 등의 종을 포함한다.

본 발명은 콘주게이트의 잔부가 결합될 수 있는 지점을 포함할 필요가 있는 유일한 제한을 가진 수용성 폴리머로 실시할 수 있다.

폴리머의 활성화 방법은 특허문헌 WO94/17039, USP5,324,844; WO94/18247; WO94/04193; USP5,219,564;USP5,122,614; WO90/13540; USP 5,281,698 및WO93/15189 명세서에서 확인할 수 있으며; 활성화 폴리머와 펩티드 사이의 콘주게이션, 즉 코규레이션 팩터(coagulation factor)Ⅷ에 대해서는 특허문헌

WO94/15625 명세서에, 헤모글로빈에 대해서는 특허문헌 WO94/09027명세서에, 산소보유분자(oxygen carrying molecule)에 대해서는 특허문헌 USP4,412,989명세서에 각가 기재되어 있고; 리보뉴클리아제 및 수퍼옥사이드 디스부타아제에 대해서는 참조문헌(Veroneses 등, App. Biochem. Biotech.11: 141-45(1985))에 기재되어 있다.

바람직한 수용성 폴리머는 그 폴리머의 샘플에서 그 폴리머의 실질상의 비가 분자량과 거의 동일한 폴리머이다. 이와 같은 폴리머는 "호모분산성"(homo disperse)을 가진다.

본 발명을, 폴리(에틸렌 글리콜)콘주게이트를 참조하여 추가 설명한다. PEG의 기능적 작용과 콘주게이션에 대한 수종의 과학잡지와 참고문헌이 이용되고 있다. 예로서, 아래의 문헌을 예시할 수 있다:

Harris, Macronol. Chem. Phys. C25:325-373(1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65(1987); Wong 등, Enzyme Microb. Technol. 14:866-874(1992); elgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System 9:249-304(1992); alipsky, Bioconjugate Chem. 6:150-165(1995); Bhadra 등, Pharmazie, 57:5-29(2002).

반응성 분자를 사용하여 반응성 PEG 분자를 제조하며 콘주게이트를 형성하는 루트는 공지되어있다.

예로서, 특허 문헌USP 5,672,662 명세서에서는 선상 또는 분기상 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸레이티드 폴리올), 폴리(올레핀 알코올) 및 폴리(아크릴로 모르폴린)에서 선택한 폴리머의 활성 에스테르의 수용성 및 불용성 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다.

특허문헌 USP 6,376,604 명세서에서는 유기용매 중에서 그 폴리머의 말단 히드록실과 디(1-벤조트리아조일)카르보네이트를 반응시켜 수용성의 비 펩티드 폴리머의 수용성 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트 에스테르의 제조방업에 대하여 기재되어있다.

상기 활성에스테르를 사용하여 단백질 또는 펩티드 등 생물학적 활성제로 콘 주게이트를 형성하였다.

특허문헌 WO99/45964 명세서에서는 생물학적 활성제와 안정성 결합에 의해 폴리머 골격에 결합된 최소 하나의 말단을 가진 폴리머 골격으로 이루어진 활성화 수용성 폴리머로 이루어진 콘주게이트에 있어서, 최소 하나의 말단은 분기성분에 결합된 근접 반응성기를 가진 분기성분으로 이루어지며, 그 분기 성분에는 그 생물적인 활성제가 최소 하나의 근접 반응성기에 결합되는 것을 특징으로 하는 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다.

다른 분기상 폴리(에틸렌 글리콜)이 특허문헌 WO96/21469 명세서에서 기재되어 있으며, 특허문헌 USP5,932,462명세서에서는 반응성 기능기를 가진 분기상 말단을 포함한 분기 PEG 분자로 형성된 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다. 그 유리 반응성기를 이용하여 단백질 또는 펩티드 등 생물학적 활성제와 반응하여 폴리(에틸렌 글리콜)과 생물학적 활성종 사이에 콘주게이트를 형성하였다.

특허문헌 USP 5,446,090 명세서에서는 각각의 PEG링커 말단에서 펩티드를 가진 콘주게이트의 형성에 있어서 2 기능성 PEG 링커와 그 사용에 대하여 기재되어 있다.

분해할 수 있는 PEG 링커를 포함한 콘주게이트가 특허문헌 WO99/34833과 WO99/14259 및 USP 6,348,558 명세서에서 기재되어 있다. 이와 같은 분해 가능성 있는 결합을 본 발명에서 적용할 수 있다.

여기서 설명한 분기 폴리머의 형성과, 또 다른 종, 즉 당, 당 뉴클레오티드 등에 이들의 분기 폴리머의 콘주게이션에 대하여 본 발명에서는 위에서 설명한 폴 리머 활성화에 대한 종래 공지된 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 대표적인 폴리(에틸렌 글리콜)분자에는 아래에 나타낸 식을 가진 것을 포함하나 한정된 것은 아니다:

위 식에서, R⁸은 H, OH, NH₂, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 헤테로 시클로 알킬, 즉 아세탈, OHC-H₂N-(CH₂)_q-, HS-(CH₂)_q 또는-(CH₂)_qC(Y)Z¹이다.

지수 "e"는 정수 1~2500을 나타낸다.

지수 b,d 및 q는 독립적으로 정수 0~20을 나타낸다.

그 부호 z와 z¹은 독립적으로 OH, NH2, 이탈기, 즉 이미다졸, P-니트로페닐, HOBT, 테트라졸, 할라이드, S-R⁹, 활성화에스테르의 알코올부; -(CH₂)_pC(Y¹)_v, 또는 -(CH₂)_pU(CH₂)_sC(Y¹)_v를 나타낸다.

부호 Y는 H(2),=O, =S, =N-R¹⁰을 나타낸다.

부호 X, Y, Y^{1 ,} A¹ 및 U는 독립적으로 성분 O, S, N-R¹¹을 나타낸다.

부호 V는 OH, NH², 할로겐, SR¹², 활성화 에스테르의 알코올 성분, 활성화 아 미드의 아민성분, 당-뉴클레오티드 및 단백질을 나타낸다.

지수 p, q, s 및 v는 지수 0~20에서 독립적으로 선택한 멤버이다.

부호 R⁹, R¹⁰,R¹¹ 및 R¹²는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환헤테로알킬, 치환 또는 비치환아릴, 치환 또는 비치환 헤테로 시클로 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴을 나타낸다.

다른 대표적인 예에서, 폴리(에틸렌 글리콜)분자는 아래에 나타낸 식에서 선택한다.

본 발명의 콘주게이트를 형성하는데 유용한 폴리(에틸렌 글리콜)은 선상 또는 분기상이다.

본 발명에서 사용에 적합한 분기상 폴리(에틸렌 글리콜)분자에는 아래에 나타낸 식에 의해 기재한 분자를 포함하나 한정된 것은 아니다.

위 식에서, R⁸와 R^8'는 위에서 R⁸에 대하여 정의한 기에서 독립적으로 선택한 멤버이다.

A¹ 및 A²는 위에서 A¹에 대하여 정의한 기에서 독립적으로 선택한 멤버이다.

지수 e, f, o 및 q는 위에서 설명한 것과 같다.

Z와 Y는 위에서 설명한 것과 같다.

X¹과 X^1'은 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O, OC(O)NH에서 독립적으로 선택한 멤버이다.

다른 대표적인 예에서, 분기 PEG는 시스테인, 세린 또는 디-라이신 코어를 기재로 한다. 이와 같이, 다른 대표적인 분기 PEG는 다음 성분을 포함한다.

또 하나의 다른 예에서, 그 분기 PEG성분은 트리-라이신 펩티드를 기재로 한다. 그 트리라이신은 모노, 디, 트리 또는 테트라 PEG화 할 수 있다.

이 예에 의한 대표적인 종은 아래에 나타낸 식을 가진다.

위 식에서, e f 및 f'는 정수 1~2500에서 독립적으로 선택하며, q, q' 및 q''는 정수 1~20에서 독립적으로 선택한다.

본 발명의 대표적인 예에서, 상기 PEG는 m-PEG(5KD, 10KD 또는 20KD)이다.

하나의 대표적인 분기 PEG종은 m-PEG가 20KD m-PEG인 세린 또는 시스테인-(m-PEG)이다.

이 분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명에서 사용하는 분기 폴리머에는 위에서 설명한 폴리머 구조(themes) 상에서의 변형체를 포함한다. 예로서, 위에서 나타낸 디-라이신-PEG 콘주게이트에는 3개의 폴리머 섭유니트(subunits)를포함하며, 3번째의 것은 위 구조에서 수식하지 않은 상태와 같이 나타낸 α-아민에 결합되어 있다.

동일하게, 3 또는 4개의 폴리머 섭유니트로 기능적 작용을 시킨 트리라이신은 본 발명의 범위 내에서 사용한다.

본 발명에 의한 소정의 예에는 아래에 나타낸 종이 포함되며,

또는 이들의 종의 카르보네이트와 활성에스테르는 아래의 것을 포함한다.

여기서 사용한 화합물의 제조에 사용할 수 있는 선상 및 분기상 PEG의 활성화에 적합한 다른 활성기 또는 유리기에는 아래에 나타낸 종을 포함하나, 한정된 것은 아니다.

이들의 종 및 다른 종과 활성화한 PEG 분자와 그 활성화된 PEG의 제조방법은 특허문헌 WO 04-063259 명세서에 기재되어 있다.

상기 분기상 폴리머의 1개 이상의 m-PEG암(arms)이다른 말단, 즉 OH, COOH, NH₂, C₂-C₁₀-알킬 등을 가진 PEG 성분에 의해 치환시킬 수 있다는 것을 이 분야의 기 술자에 의해 이해하고 있으며, 더욱이, 위 구조는 α-탄소원자와 측쇄의 기능기 사이에 알킬링커의 삽입(또는 탄소원자의 이탈)에 의해 용이하게 수식시킨다.

이와 같이, "호모"(homo)유도체 및 고급 호모동족체와 저급 호모동족체는 본 발명에서 사용할 수 있는 분기상 PEG의 코어 범위 내에 있다.

여기서 설명한 분기상 PEG종은 아래에 나타낸 스킴(scheme)에서 설명한 것과 같은 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

위 스킴에서, X^a는 O또는 S이고, r은 1~5의 정수이다.

지수 e와 f는 1~2500의 정수에서 독립하여 선택한다.

이와 같이, 이 스킴(sheme)에 의해 천연 아미노산 또는 비천연아미노산은 활성화된 m-PEG 유도체와 접촉한다. 이 경우, 토실레이트(tosylate)는 그 측쇄 헤테로원자 X^a의 알킬화에 의해 1을 형성한다. 그 모노-기능적 작용을 하는 m-PEG 아미노산은 반응성 m-PEG 유도체에 의해 N-아실화 상태로 됨으로써, 분기상 m-PEG 2를 회합(assembling)한다.

이 분야의 기술자가 이해하고 있는 것과 같이, 그 토실레이트 이탈기는 적합 한 이탈기, 즉 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등으로 치환시킬 수 있다.

동일하게, 그 아민의 아실화에 이용되는 그 반응성 카르보네이트는 활성 에스테르, 즉 N-히드록사숙신이미드 등으로 치환시킬 수 있고, 또 그 산은 디시클로헥실카르보디이미드, 카르보닐디이미다졸 등 탈수제를 사용하여 현장에서 활성화 할 수 있다.

하나의 대표적 예에서, 그 수식기(modifying group)는 PEG 성분이나, 어느 수식기, 즉 수용성 폴리머, 수불용성 폴리머, 치료용 성분 등은 적합한 결합에 의해 글리코실 성분에 결합할 수 있다.

그 수식당은 효소 처리수단, 화학적 처리수단 또는 그 조합에 의해 형성됨으로써 수식당을 생성한다.

하나의 대표적 예에서, 그 당(sugars)은 그 수식성분을 결합하도록 하며, 또 그 수식당이 펩티드에 결합할 수 있도록 하는 효소의 기질로서 그 당이 기능적 작용을 하도록 하는 어느 위치에서 활성 아민으로 치환시킨다.

하나의 대표적 예에서, 갈락토사민이 수식당인 경우 m 아민성분은 그 6위치에서 그 탄소원자에 결합한다.

본 발명은 또 그 당성분이 수식된 뉴클레오티드 당을 제공한다.

하나의 대표적인 수식당 뉴클레오티드는 그 당(sugar) 상에서 아민 성분에 의해 수식된 하나의 당기(sugar group)를 가진다.

수식당 뉴클레오티드, 즉 당 뉴클레오티드의 삭카릴-아민 유도체는 또 본 발명의 방법에서 유용하다.

예로서, 삭카릴아민(수식기없음)은 펩티드(또는 다른 종)에 효소에 의한 콘주게이팅을 한 다음에, 그 유리 삭카릴 아민 성분은 소정의 수식기에 콘주게이팅을 한다.

또, 그 수식당 뉴클레오티드는 그 수식당을 즉, 펩티드, 글리코펩티드, 리피드, 아글리콘, 글리코리피드 등의 기질 상에서 삭카릴 악셉터로 전이하는 효소용 기질로서 기능적 작용을 할 수 있다.

그 삭카리드 코어가 갈락토오스 또는 글루코오스인 하나의 예에서, R⁵는 NHC(O)Y이다.

하나의 대표적 예에서, 그 수식당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 성분을 기질로 한다.

N-아세틸갈락토사민에 대하여 아래에서 나타낸 바와 같이 그 6-아미노-당성분은 기준 방법에 의해 용이하게 제조된다.

위에서 나타낸 스킴(scheme)에서, 지수 n은 정수 1~2500, 바람직하게는 10~1500, 더 바람직하게는 10 ~ 12000을 나타낸다.

부호 "A"는 활성기, 즉 할로, 활성화에스테르의 성분(즉, N-히드록시 숙신이미드 에스테르), 카르보네이트의 성분(즉, p-니트로페닐 카르보네이트)등을 나타낸다.

이 분야의 기술자는 다른 PEG-아미드 뉴클레오티드당이 이 방법과 동일한 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다.

다른 대표적 예에서, 그 아미드 성분은 우레탄 또는 우레아 등 하나의 기(group)에 의해 치환된다.

또 다른 예에서, R¹은 하나의 분기 PEG이며, 예로서, 위에서 설명한 종 중 하나이다.

이 예에 의한 화합물에는 다음에 나타낸 식을 포함한다.

위 식에서, X⁴는 하나의 결합 또는 0이다.

더욱이, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 직쇄 또는 분기상인 수용성 폴리머를 수식한 뉴클레오티드당을 제공한다.

예로서, 아래에 나타낸 식을 가진 화합물은 본 발명의 범위 내에 있는 화합물이다.:

위 식에서, X⁴는 0또는 하나의 결합이다.

동일하게, 본 발명은 아래에 나타낸 6-위치에서의 탄소가 수식된 수식당 종의 뉴클레오티드당을 제공한다.

위 식에서, X⁴는 하나의 결합 또는 O이다.

본 발명의 조성물을 포함하는 펩티드와 글리코 펩티드, 리피드 및 글리코리피드의 콘주게이트를 또 제공한다.

예로서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 콘주게이트를 제공한다.

수불용성 폴리머 ( WATER - INSOLUBLE POLYMERS )

또 다른 예에서, 위에서 설명한 수식당과 동족인 수식당에는 수용성 폴리머 보다 오히려 수불용성 폴리머를 포함한다.

본 발명의 콘주게이트에는 1종 이상의 수불용성 폴리머를 포함한다. 본 발명의 이 예를, 치료용 펩티드를 조절할 수 있게 투여하는 매개체(vehicle)로서 콘주게이트의 사용에 의해 설명한다.

폴리머 약제 시스템은 이 분야의 기술에서 공지되었다.

참고 문헌의 예를 아래에 예시한다.

Dunn 등, Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.

이 분야의 기술자는 본 발명의 콘주게이트에 공지의 어느 약제투여 시스템이라도 실질상 적용할 수 있다는 것을 이해할 수 있다.

대표적인 수불용성 폴리머에는 폴리포스파진, 폴리(비닐알코올), 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌글리콜, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐에테르, 폴리비닐에스테르, 폴리비닐할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리코리드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸메티아크릴레이트), 폴리(에틸메타아크릴레이트), 폴리(부틸메타아크릴레이트), 폴리(이소부틸메타아크릴레이트), 폴리(헥실메타아크릴레이트), 폴리(이소데실메타아크릴레이트), 폴리(라우릴메타아크릴레이트), 폴리(페닐메타아크릴레이트), 폴리(라우릴 메타아크릴레이트), 폴리(페닐메타아크릴레이트), 폴리(메틸아크릴레이트), 폴리(이소프로필아크릴레이트), 폴리(이소부틸아크릴레이트), 폴리(옥타세실아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌테레프탈레이토), 폴리(비닐아세테이트), 폴리비닐클로리드, 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리딘, 플루로닉(pluronics) 및 폴리비닐페놀과 그 코폴리머를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

본 발명의 콘주게이트에서 사용할 수 있는 합성에 의해 수식된 천연 폴리머에는 알킬셀룰로오스, 히드록시알킬셀룰로오스, 셀룰로오스에테르, 셀룰로오스에스테르 및 니트로셀룰로오스를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

합성에 의해 수식된 넓은 분류의 천연 폴리머에서 특히 바람직한 멤버에는 메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시부틸 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피온네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 술페이트 소듐염, 아크릴 및 메타아크릴 에스테르의 폴리머 및 알긴산이 포함되나 한정된 것은 아니다.

여기서 설명한 폴리머 및 다른 폴리머는 제조업자 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA), Poly sciences(Warrenton, PA, USA), Aldrich(Milwaukee, WI, USA), Fluka(Ronkonkoma, NY, USA)및 Biopad(Richmond, CA, USA)등에서 제조한 상품 공급원에서 쉽게 얻을 수 있고, 또 기초기술을 사용하여 상기 상품 제조업자에서 얻은 모노머에서 합성할 수 있다.

본 발명의 콘주게이트에서 사용할 수 있는 대표적인 생분해성 폴리머에는 폴리악티드(polyactides), 폴리글리콜리드 및 그 코폴리머, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코(co)-카프로락톤), 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 그 블렌드 및 코폴리머를 포함하나, 한정된 것은 아니다. 특히 사용에는 콜라겐(collagen), 플루로닉 등을 포함하는 조성물 등 겔을 형성하는 조성물이 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 폴리머에는 이들의 구조 중 최소일부 내에 생 흡수성분자(bioresorbable molecule)를 가진 수불용성재를 포함하는 "혼 성"(hybrid)폴리머를 포함한다.

이와 같은 폴리머의 예에는 폴리머 사슬당(per) 하나의 생분해성 영역, 친수성 영역 및 다수의 가교성 작용기를 가진 수불용성코폴리머를 포함하는 예가 있다.

본 발명에서 "수불용성재"에는 물 또는 물함유 환경에서 실질상 불용성인재를 포함한다.

이와 같이, 그 코폴리머의 어느 영역 또는 세그먼트가 친수성이거나 또는 수용성이라도, 그 폴리머 분자는 전체로서 실질상 수중에서 용해하지 않는 것이다.

본 발명에서, 용어 "생흡수성분자"에는 생체에 의한 정상적인 배출루트에 의해 대사작용 또는 파괴작용 및 흡수 및/또는 제거작용을 할 수 있는 영역을 포함한다. 이와 같은 대사물 및 파괴 생성물은 신체에 실질상 비독성인 것이 바람직하다.

그 생흡수성 영역은 전체로서 그 코폴리머 조성물이 수용성으로 되지 않는 한 소수성 또는 친수성으로 할 수 있다. 이와 같이, 그 생흡수성 영역은 그 폴리머가 전체로서 수불용성인 우선특성(preference)을 기초로 하여 선택한다. 따라서, 그 상대특성, 즉 함유한 작용기의 종류와, 생흡수성 영역 및 친수성 영역의 대비특성을 선택하여 유용한 생흡수성 조성물이 수불용성으로 되도록 확실하게 보장 받는다.

대표적인 흡수성 폴리머에는 예로서 합성에 의해 제조한 흡수성 블록 코폴리머인 폴리(α-히드록시-카르복실산)/폴리(옥시알킬렌을 포함한다(Cohn 등, USP4,826,945 참조).

이들의 코폴리머는 가교하지 아니하여 수용성이므로, 그 생체는 그 분해된 블록 코폴리머 조성물을 배출할 수 있다(Younes 등, J.Biomed, Mater, Res. 21:1301~1316(1987); Cohn 등, J.Biomed. Mater. Res. 22:993-1009(1998)참조).

현재 바람직한 생흡수성 폴리머에는 폴리(에스테르), 폴리(히드록실산), 폴리(락톤), 폴리(아키드), 폴리(에스테르 아미드), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카르보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리삭카리드 및 그 혼합물에서 선택한 1종 이상의 성분을 포함한다.

더 바람직하게는, 그 생흡수성 폴리머에는 폴리(히드록시)산 성분을 포함한다. 그 폴리(히드록시)산 중에서 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산과 그 코폴리머 및 혼합물이 바람직하다.

생체 내에서 흡수성이 있는(생체흡수성) 프래그멘트(fragments)의 형성 이외에, 본 발명의 방법에서 사용하는 바람직한 폴리머 코팅은 또 배출 및/또는 대사작용을 할 수 있는 프래그멘트를 형성할 수 있다.

고차 코폴리머(higher order copolymers)를 본 발명에서 사용할 수 있다.

예로서, 특허문헌(Casey 등, USP 4,438,253; 1984.03.20 특허 취득)에서는 폴리(글리콜산)과 히드록실 말단폴리(알킬렌 글리콜)의 에스테르 교환반응(trans esterification)에서 생성된 트리블록 코폴리머에 대하여 기재되어 있다.

이와 같은 조성물은 흡수성 모노필라멘트 봉합사로서의 사용에 대하여 개시되었다. 이와 같은 조성물의 플렉시빌리티(flexibility)는 그 코폴리머 구조내에 테트라-P-톨릴 오르토카르보네이트 등 방향족 오르토 카르보네이트의 결합에 의해 조절한다.

랙트산(lacticacid) 및/또는 글리콜산을 기재로 한 다른 폴리머를 또 이용할 수 있다. 예로서, 특허문헌(Spinu, USP 5,202,413; 1993.04.13 특허취득)에서는 올리고머 디올 또는 디아민기에 락티드 및/또는 글리콜리드의 개환 중합 후에, 디이소시아네이트, 디아실클로리드 또는 디클로로실란 등 2작용성(difunctional) 화합물의 사슬연장에 의해 생성된 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜리드의 배열순서 결정블록(sequentially ordered blocks)을 가진 생분해성 다중블록 코폴리머에 대하여 개시되었다.

본 발명에서 유용한 코팅의 생흡수성 영역은 가수분해 및/또는 효소작용에 의해 분할할 수 있도록 구성할 수 있다.

본 발명에서, "가수분해에 의해 분할수있는" 이라는 용어는 수중에서 또는 물 함유환경에서 상기 코폴리머, 특히 생흡수성 영역의 가수분해에 대한 감수성(susceptibility)를 말한다.

동일하게, 여기서 사용한 "효소작용에 의해 분할할 수 있는" 이라는 용어는 상기 코폴리머, 특히 생흡수성영역의 내인성 또는 외인성 효소에 의한 분할에 대한 감수성을 말한다.

그 친수성 영역이 생체 내에 위치될 경우, 그 친수성 영역은 배출 및/또는 대사작용을 할 수 있는 프래그멘트로 처리할 수 있다. 이와 같이, 그 친수성 영역에는 예로서 폴리에테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리올, 폴리(비닐피롤리딘), 폴리(비닐알코올), 폴리(알킬옥사졸린), 폴리삭카리드, 카르보히드레이트, 펩티드, 단백질 및 그 코폴리머와 혼합물을 포함할 수 있다.

더 나아가서, 그 친수성 영역에는, 예로서, 또 폴리(알킬렌)옥사이드가 있다. 이와 같은 폴리(알킬렌)옥사이드에는 예로서, 폴리(에틸렌)옥사이드, 폴리(프로필렌)옥사이드 및 그 혼합물과 코폴리머를 포함할 수 있다.

히드로겔(hydrogels)인 폴리머는 또 본 발명에서 유용하다. 히드로겔은 비교적 다량의 물을 흡수할 수 있는 폴리머재이다. 히드로겔 형성화합물의 예에는 폴리아크릴산, 소듐카르복시 메틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리딘, 젤라틴, 카라게닌(carrageenan)및 다른 폴리삭카리드, 히드록시 에틸렌 메타아크릴산(HEMA)과 그 유도체 등을 포함하나, 한정된 것은 아니다.

안정성이 있고, 생분해성이 있으며, 생흡수성이 있는 히드로겔을 생성할 수 있다. 더욱이, 히드로겔 조성물은 이들의 특성 중 한가지 이상을 나타내는 서브유니트(subunits)를 포함한다.

가교에 의해 보존상태(integrity)를 조절할 수 있는 생상용성(bio-compatible)히드로겔은 공지되어 있으며, 현재 본 발명의 방법에서 사용에 바람직하다. 예로서, 특허문헌(Hubbell등 USP 5,410,016; 1995.04.25 특허취득 및 USP 5,529,914; 1996. 06.25 특허취득)에서는 2개의 가수분해가 용이한 연장부(extensions)사이에 수용성 중심 블록 세그멘트를 설정한 블록 코폴리머를 가교시키는 수용계를 개시하였다.

이와 같은 코폴리머는 광중합할 수 있는 아크릴레이트 작용성에 의해 추가하여 말단캐핑(end-capping)을 한다. 가교시킬 경우, 이들의 계(systems)는 히드로겔 이 된다.

상기 코폴리머의 수용성 중심 블록에는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 반면에, 그 가수분해할 수 있는 연장부는 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 등 폴리(α-히드록시산)을 포함할 수 있다. 아래의 참고문헌을 예시할 수 있다: Sawhney등, Macromolecules 26:581-587(1993)

다른 바람직한 예에서, 그 겔은 열가역성 겔이다.

플루노닉(pluronics), 콜라겐, 젤라틴, 히알로우론산, 푸론삭카리드, 폴리우레탄 히드로겔, 폴리우레탄-우레아 히드로겔 및 그 조합 등의 성분을 포함하는 열가역성겔이 현재로는 바람직하다.

또 다른 대표적인 예에서, 본 발명의 콘주게이트에는 리포솜의 성분을 포함한다. 리포솜은 예로써 특허문헌(Eppstein 등, USP 4,552,811; 1985.06.11.특허취득)에서 기재되어 있는 바와 같이 이 분야의 기술자에 의해 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 예로서, 리포솜 조성물(조제물)은 후증발시키는 무기용제 중에서 적합한 리피드(스테아로일 포스파디닐 에타놀아민, 스테아로일 포스파리딜 클로린, 아라카도일 포스파티닐 콜린 및 콜레스테롤)를 용해하여, 용기의 표면 상에서 건조리피드의 박막을 분리시켜 조제할 수 있다. 그 다음, 그 활성 화합물 또는 의약상 허용할 수 있는 그 염의 수용액은 그 용기내에 도입한다. 그 다음으로 그 용기를 수동으로 회전시켜 용기의 양쪽 면에서 리피드재를 분리하여 리피드 집합을 분산시킴으로써 리포솜 현탁액을 형성한다.

위에서 설명한 마이크로입자와 그 마이크로입자의 제조방법은 예에 의해 제 공하며, 본 발명에서 사용할 수 있는 마이크로입자의 범위를 한정한 것은 아니다.

다른 방법에 의해 제조된 마이크로입자의 배열은 본 발명에서 유용하다. 직쇄 및 분기상의 수용성 폴리머에 대하여 위에서 설명한 구조 포맷(formats)은 수불용성 폴리머에 대해서도 일반적으로 적용할 수 있다.

이와 같이, 예로서 시스테인, 세린, 디라이신 및 트리라이신 분기 코어는 2종의 수불용성 폴리머 성분에 의해 기능적 작용을 할 수 있다. 이들의 종을 제조하는데 사용된 방법은 일반적으로 수용성 폴리머의 제조에 사용된 방법과 동일하다.

방법( methods )

위에서 설명한 콘주게이트 이외에, 본 발명은 이들의 콘주게이트와 다른 콘주게이트의 제조방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 질병발생위험이 있는 피검자 또는 질병을 가진 피검자에 본 발명의 콘주게이트를 투여함으로써 질병상태를 방지, 치료 또는 회복하는 방법을 제공한다.

이와 같이, 본 발명은 선택성분과 펩티드, 클리코리피드 또는 아글리콘(즉, 세라미드 또는 스핑고신)사이에서 공유결합 콘주게이트(covalent conjugate)를 형성하는 방법을 제공한다.

설명을 명백하게 하기 위하여, 본 발명은 펩티드와 본 발명의 활성화 수식당의 수식 글리코실 성분 사이에 형성된 콘주게이트를 참조로 하여 설명한다.

이 분야의 기술자는 본 발명이 글리코리피드의 콘주게이트를 형성하는 방법과, 본 발명의 활성화 수식당을 가진 아글리콘을 동일하게 포함한다는 것을 알 수 있다.

대표적인 예에서, 그 콘주게이트는 수용성 폴리머, 치료용 성분, 표적 성분 또는 생체분자와 글리코실화 또 비글리코실화 펩티드 사이에서 형성된다.

그 폴리머, 치료용 성분 또는 생체분자는 그 펩티드와 수식기(즉, 수용성 폴리머)사이에 설정되어 공유결합된 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드에 콘주게이팅 된다. 그 방법에는 수식당과 효소, 즉 수식당을 기재(즉, 펩티드, 아글리콘, 글리코리피드)에 콘주게이팅을 하는 글리코실 전이효소를 함유한 혼합물과 펩티드를 접촉하는 것을 포함한다.

이 반응은 수식당과 펩티드(또는 다른 기재)사이에 공유결합을 형성하는데 적합한 조건 하에서 실시한다. 그 수식당의 당성분은 뉴클레오티드당에서 선택하는 것이 바람직하다.

그 악셉터 펩티드는 일반적으로 다시 합성하거나, 또는 원핵세포(즉, 에콜리등 세균세포)또는 포유동물, 효모, 곤충, 진균등의 진핵세포 또는 식물 세포에서 재조합에 의해 발현된다.

그 펩티드는 전장 단백질 또는 프라그멘트이다. 더욱이, 그 펩티드는 야생형 또는 변이 펩티드이다. 하나의 대표적인 예에서 그 펩티드에는 그 펩티드 서열에 하나 이상의 N-또는 O-결합 글리코실화 부위를 부가한 변이를 포함한다.

본 발명의 방법은 또 재결합할 수 있게 생성된 불완전한 글리코실화 펩티드의 수식을 제공한다. 다수의 재결합할 수 있게 생성된 당 단백질은 바람직하지 않은 특성, 즉 면역원성, RES에 의한 인식을 가진 카르보히드레이트기를 노출시켜 불충분하게 글리코실화 한다.

본 발명의 방법에서 수식당을 사용하여 그 펩티드를 동시에 더 글리코실화시켜 수용성 폴리머, 치료제 등으로 유도체화 할 수 있다.

그 수식당의 당 성분은 완전 글리코실화 펩티드의 악셉터 또는 바람직한 특징성을 가진 또 다른 당성분에 적합하게 콘주게이팅되는 잔기(residue)이다.

이 분야의 기술자는 본 발명이 어느 소오스(source)에서 펩티드 또는 글리코펩티드를 실제로 사용하여 실시할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명을 실시할 수 있는 대표적인 펩티드는 특허문헌 WO03/031464명세서와 여기서 설명한 참고문헌에서 기재되어 있다.

본 발명의 방법에 의한 수식 펩티드는 합성펩티드 또는 야생형 펩티드이거나 또는 부위지향 변이유발(site-directed mutagenesis)등 종래에 공지된 방법에 의해 생성된 변이 펩티드(mutated peptides)이다.

펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-결합 또는 O-결합이다. 하나의 대표적인 N-결합은 아스파라긴잔기의 측쇄에 수식당을 결합한 것이다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 카르보히드레이트 성분의 효소결합을 한 인식 서열이다. 이와 같이, 폴리펩티드에서 이들의 트리펩티드 서열의 둘중 하나의 존재는 하나의 위치 글리코실화 부위를 형성한다.

O-결합 글리코실화는 비천연 아미노산, 즉 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시 라이신이 사용될 수도 있으나, 히드록시 아미노산, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌의 히드록시 측쇄에 하나의 당(즉, N-아세틸 갈락토사민, 갈락토오스, 만노 오스, GlcNAc, 글루코오스, 푸코오스 또는 키실로오스)의 결합을 말한다.

더욱이, 펩티드 이외에, 본 발명의 방법은 다른 생물학적 구조물(즉, 글리코실화 부위를 포함하는 글리코리피드, 리피드, 스피고이드, 세라미드, 전세포 등)로 실시할 수 있다.

펩티드 또는 다른 구조물에 글리코실화의 부가는 1개 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 간편하게 얻어진다.

그 펩티드(O-결합글리코실화 부위)의 서열 내에, -OH기, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌기를 제공하는 하나 이상의 종의 결합에 의해 부가할 수도 있다.

그 부가는 변이에 의해 또는 펩티드의 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 그 펩티드 아미노산 서열은 DNA레벨에서 변경에 의해, 특히 소정의 아미노산으로 번역하는 코돈(codons)이 발생되도록 미리 선택된 염기에서 그 펩티드를 코팅하는 DNA를 변이하여 변경하는 것이 바람직하다. 그 DNA변이는 종래기술에서 공지된 방법을 사용하여 실시하는 것이 바람직하다.

하나의 대표적 예에서, 그 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오리드를 셔플링(shuffling)하여 부가된다. 후보 펩티드(candidate peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오리드는 DNA 셔플링 프로토콜(shuffling protocols)로 조절할 수 있다.

DNA 셔플링은 관련 유전자 풀(pool)의 랜덤 프라그멘트화(random fragmentation)다음에 중합효소 사슬반응-유사 프로세스에 의한 프라그멘트의 재집합에 의해 실시하는 반복성 재조합과 변이 프로세스이다.

참고문헌으로 다음 문헌을 예시할 수 있다.

Stemmer, Proc.Natl, Acad, Sci, USA 91:10747-10751(1994); Stemmer, Nature 370: 389-391(1994); USP 5,605,793; 5,837,458; 5,830,721 및 5,811,238.

본 발명을 실시할 수 있는 대표적인 펩티드, 글리코실화 부위를 부가 또는 제거하는 방법과 글리코실 구조 또는 부구조(substructures)의 부가 또는 제거하는 방법은 특허문헌 WO03/031464 및 관련 미국 및 PCT 출원 명세서에 기재되어 있다.

본 발명은 또 1개 이상의 선택된 글리코실 잔기를 펩티드에 부가(또는 제거)하며, 그 다음 그 펩티드의 최소 하나의 선택된 글리코실 잔기에 수식당을 콘주게이팅 하는 수단을 제공한다.

본 발명은 예로서, 펩티드 상에 존재하지 않거나 또는 소정량으로 존재하지 않은 선택된 글리코실 잔기에 그 수식당을 콘주게이팅 하고자 할 때 유용하다.

이와 같이, 수식당을 펩티드에 커플링(coupling)하기 전에, 그 선택된 글리코실 잔기를 효소커플링 또는 화학적 커플링에 의해 그 펩티드에 콘주게이팅한다.

또 다른 예에서, 글리코 펩티드의 글리코실화 패턴은 그 글리코 펩티드에서 카르보 히드레이트기의 제거에 의해 그 수식당의 콘주게이션 전에 변경된다.

예로서 특허문헌 WO 98/31826을 참조할 수 있다.

상기 글리코 펩티드 상에 존재한 카르보히드레이트 성분의 부가 또는 제거는 화학적 처리 또는 효소 작용에 의해 얻어진다.

화학적 탈 글리코실화는 화합물 트리플루오로 메탄 술폰산 또는 등가 화합물에 폴리펩티드 변이체의 접촉에 의해 실시하는 것이 바람직하다.

이 처리 결과, 결합당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)이외 모 든 당의 분할을 얻을 수 있으나, 그 펩티드는 무손상 상태로 존재한다. 화학적 탈 글리코실화는 참고문헌에 기재되어있다(Hakimuddin 등, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52(1987) 및 Edge 등, Anal. Biochem. 118:131(1981)참조).

폴리펩티드 변이체 상에서 카르보히드레이트 성분의 효소에 의한 분할은 다음 참고 문헌(Thotakura 등, Meth. Enzymol. 138:350(1987))에 기재된 바와 같이 여러 가지의 엔도 및 엑소 글리코시다아제의 사용에 의해 얻을 수 있다.

글리코실 성분의 화학적 부가는 종래 기술에서 공지된 방법에 의해 실시한다. 당 성분의 효소작용에 의한 부가는 여기서 설명한 방법을 변형시켜 사용하며, 미변성 글리코실 단위를 본 발명에서 사용된 수식당으로 치환하여 얻는 것이 바람직하다. 당 성분을 부가하는 다른 방법은 특허문헌 USP 5,876,980; 6,030,815; 5,728,554 및 5,922,577 명세서에 개시되어 있다.

선택된 글리코실 잔기의 대표적인 결합지점에는

(a) N-결합 글리코실화의 공통부위와, O-결합 글리코실화의 부위;

(b) 글리코실 전이효소의 악셉터인 말단 글리코실 성분;

(c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티딘;

(d) 유리 카르복실기;

(e) 시스테인의 술프히드릴기등 유리 술프히드릴기;

(f) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 히드록실기 등 유리히드록실기;

(g) 페닐 알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족기 등 방향족기; 또는

(h) 글루타민의 아미드기가 포함되나, 한정된 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는, 대표적인 방법은 특허문헌 WO 87/05330(1987.09.11. 공개)와 참고문헌(Aplin 및 Wriston, CRC Crit REV. BIOCHEM. pp.259-306(1981))에 기재되어 있다.

하나의 예에서, 본 발명은 결합기에 의해 2개 이상의 펩티드를 결합하는 방법을 제공한다. 그 결합기는 유용한 구조로써, 직쇄 구조와 분기구조에서 선택할 수 있다. 펩티드에 결합된 링커의 각 말단에는 수식당(즉, 초기의 무손상 글리코실 결합기)이 포함한다.

본 발명의 대표적인 방법에서, 2개의 펩티드가 폴리머 링커(즉, PEG 링커)를 포함하는 링커성분에 의해 동시에 결합한다. 그 구조는 위 카툰(cartoon)에서 설명한 일반 구조와 일치한다. 여기서 설명한 바와 같이, 본 발명의 구조에는 2개의 무손상 글리코실 결합기(즉, s+t=1)를 포함한다. 2개의 글리코실 잔기를 포함하는 PEG링커의 포커스(focus)는 명백하게 하는데 목적이 있으며, 본 발명의 이 예에서 사용하는 링커암(linker arms)의 동정을 한정하는 것으로 해석할 필요는 없다.

이와 같이, PEG 성분은 제 1 글리코실 단위를 가진 제 1말단과, 제 2글리코실 단위를 가진 제 2 말단에서 기능적 작용을 한다.

상기 제 1 및 제 2 글리코실 단위는 전이효소가 다른 기질이 바람직하며, 상기 제 1 및 제 2펩티드의 직교결합을 하도록 한다.

실제로, (글리코실)¹-PEG-(글리코실)²링커는 제 1펩티드와 제 1 글리코실 단위가 기질인 제 1 전이효소와 접촉함으로써, (펩티드)¹-PEG-(글리코실)²를 형성한 다.

그 다음, 전이효소 및/또는 미반응 펩티드는 그 반응 혼합물에서 선택적으로 제거된다. 상기 제 2펩티드와 제 2글리코실 단위가 기질인 제 2전이효소가 상기 (펩티드)¹-PEG-(글리코실)²콘주게이트가 부가되어,(펩티드)¹-(글리코실)¹-PEG-(글리코실)²-(펩티드)²를 형성한다.

최소 하나의 글리코실 잔기는 직접 또는 간접적으로 O-결합을 한다.

이 분야의 기술자는 위에서 개략적으로 설명한 방법이 예로서 분기 PEG, 덴드리머(dendrimer), 폴리(아미노산), 폴리삭카리드 등의 사용에 의해 2개 이상의 펩티드 사이에서 콘주게이트의 형성에 적용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

수식 당의 제조

일반적으로, 당성분 또는 당성분-링커 카세트 및 PEG 또는 PEG-링커카세트 그룹은 새로운 유기 작용기 또는 미반응종으로 결합 프로세스에 의해 일반적으로 형질 전환되는 반응성기의 사용으로 동시에 결합된다.

그 당 반응성 작용기는 당성분 상의 어느 위치에 위치된다. 본 발명의 실시에서 반응성기와 여러 가지의 분류의 반응은 바이오콘주게이트 화학기술에서 공지된 것이다.

반응성 당 성분에 의해 이용할 수 있는 바람직한 현행 분류의 반응은 비교적 온화한 조건 하에서 처리한 반응이다.

이들의 반응에는 친핵치환(즉, 아민 및 알코올과 아실할라이드의 반응, 활성 에스테르), 친전자치환(즉, 에나민 반응) 및 탄소-탄소와 탄소-헤테로 원자 다중결합의 부가(즉, 미카엘 반응, 디엘스-알데르 부가)를 포함하나, 한정된 것은 아니다. 이들의 반응과 다른 유용한 반응은 예로서 다음의 문헌에서 기재되어있다:

March,Advanced Organic Chemistry,3rd Ed., John Wiley & Sons, New York,1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; Feeney 등, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol.198. American Chemistry Society, Washington, D.C. 1982.

당핵 또는 수식기에서 현수된 유용한 반응성 작용기에는

(a) N-히드록시숙신이미드에스테르, N-히드록시벤즈트리아졸에스테르, 산할라이드, 아실이미다졸, 티오에스테르, P-니트로페닐에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나 한정되지 않은 카르복실기 및 여러 가지의 그 유도체;

(b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환시킬 수 있는 히드록시기;

(c) 할라이드가 예로서 아민, 카르복실레이트 아니온, 티올아니온, 카르바니온, 또는 알콕시드이온 등 친핵기로 후치환 함으로써, 그 할라이드 원자의 작용기에서 새로운 기의 공유결합을 얻는 할로알킬기;

(d) 예로서 말레이미도기 등 디엘스-알데르반응에 참가할 수 있는 친디엔기;

(e) 예로서, 이민, 히드라존, 세미카르바존 또는 옥심 등 카르보닐 유도체의 형성에 의해, 또는 그리그나아드부가 또는 알킬리튬부가와 같은 메카니즘에 의해 후유도체화가 가능한 알데히드 또는 케톤기;

(f) 예로서 아민과의 후반응하여 술폰아미드를 형성하는 술포닐 할라이드기;

(g) 예로서, 디술피드로 전환시키거나, 또는 아실할라이드와 반응시킬 수 있는 티올기;

(h) 예로서, 아실화,알킬화 또는 산화시킬 수 있는 아민 또는 술프히드릴기;

(i) 예로서, 시클로부가,아실화 미카엘부가 등을 실시할 수 있는 알켄;

(j) 예로서 아민 및 히드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭시드를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

그 반응성 작용기는 반응성 당핵 또는 수식기를 집합하는데 필요한 반응에 참가하지 않도록, 또는 그 반응을 방해하도록 선택할 수 있다.

또, 반응성 작용기는 보호기의 존재에 의해 그 반응에의 참가에서 보호를 받을 수 있다.

이 분야의 기술자는 선택한 반응조건에 의해 방해받지 않도록 소정의 작용기를 보호하는 방법을 이해하고 있다. 유용한 보호기의 예에 대해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Greene 등, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Yew York, 1991.

다음에 이어지는 설명에서, 본 발명의 실시에 유용한 수식당의 다수의 특정 예를 설명한다.

대표적인 예에서, 시알산 유도체는 수식기가 결합된 당핵으로 이용된다. 시알산 유도체에 대한 설명은 그 요지를 명백하게 하기 위한 목적에 있으며, 본 발명 의 범위를 벗어난 것으로 해석할 필요는 없다.

이 분야의 기술자는 하나의 예로서, 시알산을 사용하여 설명한 것과 동일한 동족체로서 활성화하며 유도체화 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

예로서 다수의 방법이 수종의 당 기질인 갈락토오스, 글루코오스, N-아세틸갈락토사민에 이용할 수 있으며, 그 당기질은 공지의 방법에 의해 용이하게 수식된다. 예로서, 그 참고문헌을 아래에 예시한다:

Elhalabi 등, Curr. Med. Chem. 6: 93(1999);

Schafer 등, J. Org. Chem. 65: 24(2000).

하나의 대표적 예에서, 본 발명의 방법에 의해 수식된 펩티드는 형질전환 동물에서 또는 포유동물세포(즉, CHO세포)에서 생성되어 불충분하게 시알화된 N-및/또는 O-결합올리고삭카리드 사슬을 함유하는 글리코펩티드이다.

시알산이 결여되고 말단 갈락토오스기를 함유한 글리코펩티드의 올리고 삭카리드 사슬은 수식시알산과 PEG화, PPG화 또는 수식할 수 있다.

다음에 나타낸 스킴(sheme)1에서, 아미노 글리코시드 1은 보호아미노산(즉, 글리신)유도체의 활성에스테르와 처리하여, 그 당 아민기를 그 상응하는 보호 아미노산아미드 부가물로 전환한다.

그 부가물(adduct)은 알돌라아제로 처리하여 α-히드록시 카르복실레이트 2를 형성한다.

화합물 2는 CMP-SA 합성효소의 작용에 의해 그 상응하는 CMP유도체로 전환되고, 이어서 그 CMP 유도체의 촉매 수소첨가에 의해 화합물 3을 생성한다.

그 글리신 부가물의 생성에 의해 도입된 아민은 화합물 3을 활성화된 PEG 또는 PPG유도체(즉, PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-P-니트로페닐)와 반응시켜 PEG 결합의 부위(locus)로 이용되어, 각각 4 또는 5 등의 종(species)을 생성한다.

다음 표 1에서는 PEG 성분으로 유도체화시킨 당 모노 포스페이트의 대표적인 예를 설명한다. 표 1의 어느 화합물은 스킴 1의 방법에 의해 제조한다. 다른 유도체는 종래의 공지방법에 의해 제조한다. 예로서 아래의 참고문헌을 예시할 수 있다. Keppler 등, Glycobiology 11: 11R(2001); Charter 등, Glycobiology 10: 1049(2000).

다른 아민 반응성 PEG 및PPG 동족체는 상품으로 얻을 수 있고, 또 이들은 이 분야의 기술자에 의해 용이하게 접근할 수 있는 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 실시에 사용할 수 있는 수식당 포스페이트는 다른 위치와 위에서 설명한 위치에서 치환시킬 수 있다. 시알산의 바람직한 치환을 다음에 나타낸 식Ⅱ에서 설명한다.

위 식에서, X는 하나의 결합기로서, -O-, -N(H)-, -S, CH₂- 및 -N(R)₂ (각각의 R은 R¹-R⁵에서 독립적으로 선택한 하나의 멤버임)에서 선택하는 것이 바람직하다. 부호 Y, Z, A 및 B는 각각 X의 동정에 대하여 위에서 설명한 기(group)에서 선택한 하나의 기를 나타낸다. X, Z, A 및 B는 각각 독립적으로 선택한다. 따라서 이들은 같거나 다르다. 부호, R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵는 H, 하나의 PEG 성분, 치료용 성분, 생체분자 또는 다른 성분을 나타낸다. 또, 이들의 성분은 PEG 성분, 치료용 성분, 생체분자 또는 다른 성분에 결합된 하나의 링커를 나타낸다.

여기서 개시된 콘주게이트에 결합되어있는 대표적인 성분에는 PEG유도체(즉, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG카르바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG유도체(즉, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG카르바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료용 성분, 진단용 성분, 만노오스-6-포스페이트, 헤파린, SLx, 만노오스, 만노오스-6-포스페이트, 시알릴 루이스X, FGF, VFGF, 단백질, 콘드로이틴, 케라탄, 데르마탄, 알부민, 인테그린, 촉각 형상 올리고삭카리드, 펩티드 등을 포함하나, 한정된 것은 아니다.

여러 가지의 수식기를 삭카리드 성분에 콘주게이팅하는 방법은 이 분야의 기술자에 의해 용이하게 접근할 수 있는 방법이다. 아래에 참고문헌을 예시한다.

Poly(Ethylene Glycol) Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.Milton Harris,Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly(Ethylene Glycol)Chemical and Biological Appications,J.Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No.680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn 등., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.

링커 그룹( linker groups )(가교 그룹)

본 발명의 방법에서 사용하는 수식당의 제조에는 당 잔기(sugar residue)에 PEG 성분의 결합, 바람직하게는 글리코실 전이효소의 기질인 안정성 있는 부가물의 생성을 포함한다.

이와 같이, 하나의 링커, 즉 PEG 와 당성분을 가교제와 반응시켜 PEG와 그 당을 콘주게이팅하여 형성한 링커의 사용이 바람직하다.

수식기를 카르보히드레이트 성분에 결합하여 사용할 수 있는 대표적인 2작용성 화합물에는 2작용성 폴리(에틸렌글리콜), 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에스테르 등을 포함하나, 한정된 것은 아니다.

카르보 히드레이트를 다른 분자에 결합하는 일반적인 접근방법은 아래의 문헌에서 공지되었다. 그 문헌을 다음에 예시한다.

Lee 등., Biochemistry 28:1856(1989); Bhatia 등, Anal. Biochem. 178: 408(1989); Janda 등, J. Am. Chem. Soc. 112:8886(1990) and Bednarski 등, WO92/18135.

아래에서 이어지는 설명에서, 그 반응성기는 초기의 수식당의 당성분 상에서 온화한 상태로 처리된다.

이 분야의 기술자는 상기 설명이 수식기상에서 반응성기에 관련이 있다는 것을 알 수 있다.

하나의 대표적인 설계전략에는 헤테로 2작용성 가교제 SPDP(n-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)를 사용하여 그 당상에서 보호된 술프히드릴을 결합한 다음, 그 수식기 상에서 또다른 술프히드릴로 디술피드 결합을 형성하는 상기 술프히드릴을 탈보호하는 것을 포함한다.

상기 SPDP가 글리코실 전이효소 기질로서 작용하는 수식당의 작용능(ability)에 유해한 영향을 줄 경우, 2-이미노티오란 또는 N-숙신이미딜S-아세틸티오아세테이트(SATA)등 다른 가교제 배열 구조 중 하나를 사용하여 디술피드 결합을 형성한다.

2-이미노티오란은 1급 아민과 반응하여, 즉시 아민함유분자 상에서 탈 보호된 술피히드릴을 결합한다.

또, SATA는 1급 아민과 반응하나, 히드록실아민을 사용하여 후 탈아세틸화하는 보호 술프히드릴을 결합하여 유리 술프히드릴을 생성한다.

각각의 경우, 그 결합된 술프히드릴은 유리하여 다른 술프히드릴 또는 보호된 술프히드릴과 반응하며, SPDP와 같이 필요로 한 디술피드 결합을 형성한다.

위에서 설명한 설계전략은 대표적인 것으로 본 발명에서 사용하는 링커를 한정한 것이 아니다.

다른 가교제를 이용할 수 있으며, 그 다른 가교제는 펩티드에 수식기를 가교하는 다른 설계전략에서 사용할 수 있다.

예로서, TPCH(S-(2-티오피리딜)-L_시스테인 히드라지드)와 TPMPH(S-(2-티오피리딜)메르캅토-프로피오노 히드라지드)는 온화한 퍼아이오데이트 처리에 의해 사전에 산화시킨 카르보히드레이트 성분과 반응하여, 그 가교제의 히드라지드부와 그 퍼아이오데이트의 발생한 알데히드 사이에 히드라존 결합을 형성한다.

TPCH와 TPMPH는 그 당상에서 술프히드릴기를 보호한 2-피리딜티온을 도입하여, DTT로 탈보호시킨 다음, 성분 사이에 디술피드 결합을 형성하는 등 콘주게이션에 사용할 수 있다.

디술피드 결합이 안정성 있는 수식당의 생성에 부적합한 것으로 확인될 경우, 성분 사이에 더 안정성 있는 결합을 결합하는 다른 가교제를 사용할 수 있다.

헤테로2작용성가교제 GMBS(N-감마-말이미도부티릴옥시)숙신이미드)와 SMCC(숙신이미딜4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산)은 1급 아민과 반응하여, 말레이미드기를 그 성분상에 도입한다.

그 다음으로, 그 말레이미드기는 다른 성분 상에서 술프히드릴과 반응하여, 앞서 설명한 가교제에 의해 도입함으로써, 상기 성분 사이에 안정성 있는 티오에테르 결합을 형성한다.

성분 사이의 입체장해(steric hindrance)가 성분의 활성 또는 글리코실 전이효소기질로서 작용하는 수식당의 작용능을 방해할 경우, 성분 사이에 긴 스페이서암(spacer arms)을 도입하여 전에 설명한 가교제(즉, SPDP)의 일부의 유도체를 포함하는 가교제를 사용할 수 있다.

이와 같이, 유용한 다수의 적합한 가교제의 각각은 그 효과에 따라 선택되 며, 이것은 최적의 펩티드 상에서 콘주게이트와 수식당 생산을 가진다.

여러 가지의 시약을 사용하여 수식당의 성분을 분자간 화학적 가교에 의해 수식한다. 가교시약 및 가교 처리공정의 레뷰(reviews)에 대하여 다음의 참고문헌을 예시할 수 있다:

Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney D.A., In: Enzymes as Drugs.(Hochenberg, and Roberts, eds.)pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91:580-609, 1983; Mattson 등., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183,1993.

바람직한 가교제는 0(zero)길이이며, 호모-2작용성이며ㅡ, 헤테로-2작용성인 여러 가지의 가교 시약에서 유도된다.

0(zero) 길이의 가교제에는 비고유재(extrinsic material)의 도입이 없는 2개의 고유기(intrinsic chemical groups)의 직접 콘주게이션을 포함한다.

디술피드 결합의 형성촉진제는 이 카테고리에 속한다. 또 다른 예에는 카르복실기와 일급 아미노기의 축합을 유도하여 카르보디이미드, 메틸클로로포름메이트, 우드워드(Wood Ward)의 시약 K(2-에틸-5-페닐이소 옥사졸륨-3'-술포네이트) 및 카르보닐디이미다졸 등 아미드 결합을 형성하는 시약이 있다.

이들의 화학적 시약 이외에, 효소 트랜스 글루타미나아제(글루타밀-펩티드τ-글루타밀전이효소; EC 2.3.2.13)는 영길이 가교시약으로 사용할 수 있다.

이 효소는 단백질-결합 글루타미닐기의 카르복사미드기에서 아실 전이반응을 기질로서 통상적으로 일급 아미노기로 촉진시킨다.

바람직한 호모 및 헤테로-2 작용성 시약에는 2개의 동일 또는 2개의 다른 부위를 각가 포함하며, 이들의 부위는 아미노, 술피히드릴, 구아니디노, 인돌 또는 비특이성기에 대하여 반응성이 있다.

i. 가교시약에서 바람직한 특이성 부위

1. 아미노 반응성기

하나의 바람직한 예에서, 가교링커 상에서의 부위는 아미노 반응성기이다. 아미노 반응성기의 비한정 예에는 N-히드록시 숙신이미드(NHS)에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 아실할라이드, 아릴아지드, P-니트로페닐 에스테르, 알데히드 및 술포닐 클로리드를 포함한다.

NHS 에스테르는 수식당 성분의 일급(방향족 포함)아미노기와 반응시키는 것이 바람직하다.

히스티딘의 이미다졸기는 반응용 일급 아민과 경합(competition)한다는 것은 공지되어있으나, 그 반응생성물은 불안정하여 용이하게 가수분해 한다. 그 반응에는 아미드를 형성하는 NHS 에스테르의 산카르복실 상에서 아민의 친핵공격을 포함하게되어, N-히드록시숙신이미드를 방출한다.

이와 같이, 원(original)아미노기의 양(+)전하가 상실된다.

아미도에스테르는 수식당 성분의 아민기와 반응하는 가장 특이성 있는 아실화시약이다. PH 6과 10 사이에서, 이미도에스테르는 1급 아민에만 반응한다.

1급 아민은 이미데이트를 구핵성 공격을 하여 중간체를 생성하며, 그 중간체는 PH가 높을 때 아미딘으로 절단되며 또 PH가 낮을 때 새로운 이미데이트로 절단 된다. 그 새로운 이미데이트는 또다른 1급 아민과 반응하여, 2개의 아미노기를 가교결합하며, 추정되는 단 작용성 이미데이트의 경우, 2 작용성 반응을 한다.

1급 아민과의 주요한 생성물은 아미딘으로, 이 아미딘은 원(original)아민보다 더 강한 염기이다. 따라서, 그 원아미노기의 양전하(+)가 보존된다.

이소시아네이트(및 이소티오시아네이트)는 수식당 성분의 1급 아민과 반응하여 안정성 있는 결합을 형성한다. 술프히드릴, 이미다졸 및 트로실기와 이들의 반응에서는 비교적 불안정성 있는 생성물을 얻는다.

아실아지드는 또 아미노-특이성 시약으로 사용되며, 이 시약에서 친화성 성분의 구핵성 아민은 산성카르복실기를 약알칼리성 상태하에서, 즉 PH 8.5에서 공격한다.

1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 등 아릴할라이드는 수식당 성분의 아미노기와 티로신 페놀기와 반응하는 것이 바람직하나, 또 술프히드릴과 이미다졸기와도 반응한다.

또, 모노 및 디카르복실산의 P-니트로페닐에스테르는 유용한 아미노 반응성기이다. 그 시약 특이성이 대단히 높지 않으나, α- 및 ε-아미노기는 가장 신속하게 반응한다.

글루타르알데히드 등 알데히드는 수식당의 1급아민과 반응한다. 불안정한 시프염기(schiff bases)가 그 알데히드와 아미노기를 반응할 때 형성되어도 글루타르알데히드는 그 수식당을 안정성 있는 가교로 수식할 수 있다.

일반적인 가교조건의 PH 6-8에서, 사이클릭폴리머는 탈수소화하여 α-β불포 화 알데히드폴리머를 형성한다. 그러나, 시프염기는 또 다른 이중결합에 콘주게이팅되었을 때 안정성이 있다.

양 2중결합의 공명 상호작용은 시프결합의 가수분해를 방지한다.

또, 국소(local)농도가 높은 아민은 에틸렌 2중 결합을 공격하여 안정성있는 미카엘 부가 생성물을 형성한다.

방향족 술포닐 클로리드는 수식당 성분의 다수의 부위와 반응하나, 아미노기와의 반응이 가장 중요한 것으로, 반응결과 안정성 있는 술폰아미드 결합을 얻는다.

2. 술프히드릴 -반응성기( Sulfhydryl - Reactive Groups )

또 다른 바람직한 예에서, 이들의 부위는 술프히드릴-반응성기이다. 술프히드릴-반응성기의 유용한 비한정예에는 말레이미드, 알킬할라이드, 피리딜디술피드 및 티오프탈이미드를 포함한다.

말레이미드는 수식당 성분의 술프히드릴기와 반응하여 안정성있는 티오에테르 결합을 형성하는 것이 바람직하다. 또, 이들은 1급 아미노기 및 히스티딘의 이미다졸기와 가장 느린 속도로 반응한다.

그러나 PH 7에서 단순한 티올의 반응속도는 그 상응하는 아민의 반응속도보다 1000배 이상이 되어, PH 7에서의 그 말레이미드기는 술프히드릴-특이성기인 것으로 생각할 수 있다.

알킬 할라이드는 술프히드릴기, 술피드, 이미다졸 및 아미노기와 반응한다. 그러나 PH가 중성에서 약 알칼리일때, 알킬할라이드는 처음에 술프히드릴기와 반응 하여 안정성 있는 티오에테르 결합을 형성한다. PH가 더 높아질 때, 아미노기와의 반응이 바람직하다.

피리딜 디술피드는 디술피드 교환에 의해 유리술프히드릴과 반응하여 혼합 디술피드를 얻는다. 그 결과, 피리딜디술피드는 가장 특이성 있는 술프히드릴-반응성기가 된다.

티오프탈이미드는 유리술프히드릴기와 반응하여 디술피드를 형성한다.

3 . 카르복실 - 반응성잔기 ( Carboxyl - Reactive Residue )

또 다른 예에서, 물과 유기용매 중에서 용해할 수 있는 카르보디이미드는 카르복실-반응성 시약으로 사용된다. 이들의 화합물은 유리카르복실기와 반응하여 슈도우레아(pseudourea)를 형성하며, 그 다음 이용할 수 있는 아민과 결합히여 아미드 결합을 얻어, 카르복실기를 카르보디이미드로 수식하는 방법을 교시(teaching)한다(참고문헌: Yamada 등, Biochemistry 20: 4836-4842, 1981).

ⅱ. 가교시약에서 바람직한 비특이성 부위

부위 특이성이 있는 반응성 성분의 사용이외에, 본 발명은 수식기(modifying group)에 그 당을 결합하는 비특이성이 있는 반응성기의 사용에 대하여 고찰한다.

대표적인 비특이성 가교링커에는 어두운곳(thedark)에서 완전 불활성인 광활성기가 있으며, 그 광활성기는 적당한 에너지의 광자를 흡수할 때 반응성 종으로 전환하다.

하나의 바람직한 예에서, 광활성기는 아지드의 광분해 또는 가열할 때 발생하는 니트렌(nitrenes)의 전구물질에서 선택한다.

전자 결함 니트렌(electron-deficient nitrenes)은 가장 반응성이 있어, N-H, O-H, C-H 및 C=C를 포함하는 여러 가지의 화학적 결합과 반응할 수 있다. 3가지 타입의 아지드(아릴, 알킬 및 아실 유도체)가 사용될 수 있으나, 아릴아지드가 바람직하다.

광분해시에 아릴아지드의 반응성은 C-H 결합에서보다 N-H와 OH결합에서 더 우수하다.

전자 결함 아릴 니트렌은 신속하게 고리팽창되어(ring expand), 데히드로아제핀을 형성하며, 이것은 C-H 삽입생성물의 형성보다, 오히려 친핵성 시약과 반응할려는 경향이 있다.

아릴 아지드의 반응성은 고리(ring)내에서 니트로기 또는 히드록실기 등 전자제거치환기의 존재에 의해 증가시킬 수 있다. 이와 같은 치환기는 아릴아지드의 최대흡수를 비교적 긴 파장으로 촉진한다. 비치환 아릴 아지드는 260-280nm의 최대흡수를 가진다.

그러나, 히드록시 및 니트로 아릴 아지드는 305nm이상 상당한 광을 흡수한다. 따라서, 히드록시 및 니트로 아릴 아지드는 그 친화성 성분에 대하여 비치환 아릴 아지드보다 덜 유해한 광분해 조건을 사용하도록 하기 때문에 가장 바람직하다.

또 다른 바람직한 예에서, 광활성기는 플루오린화 아릴 아지드에서 선택한다.

플루오린화 아릴 아지드의 광분해 생성물은 아릴니트렌이며, 그 아릴니트렌 전부가 C-H 결합삽입을 포함하여 이 기(group)의 특징있는 반응을 효율 높게 실시한다(참고문헌: Keana 등, J. Org. Chem. 55:3640-3647, 1990).

또 다른 예에서, 광활성기는 벤조페논잔기에서 선택한다. 벤조페논 시약은 일반적으로 알릴 아지드 시약보다 가교, 수율을 더 높게 얻을 수 있다.

또 다른 예에서, 광활성기는 광분해시에 전자결합 카르벤을 형성하는 디아조 화합물에서 선택한다.

이들의 카르벤은 C-H 결합으로의 삽입, 2중 결합으로의 부가(방향족계 포함), 수소유인 및 친핵센터로의 배위를 포함하는 여러 가지의 반응을 실시하여 카본이온을 얻는다.

또 하나의 다른 예에서, 광활성기는 디아조피루베이트에서 선택한다. 예로서, P-니트로페닐 디아조피루베이트의 P-니트로페닐 에스테르는 지방족 아민과 반응하여 디아조 피루브산 아미드를 얻으며, 그 디아조피루브산 아미드는 자외선 광분해를 실시하여 알데히드를 형성한다.

그 광분해된 디아조피루베이트-수식친화성 성분은 포름 알데히드 또는 글루타르 알데히드 형성 가교와 같이 반응한다.

ⅲ. 호모 2작용성 시약( Homobifunctional Reagents )

1. 1급 아민과 반응성 있는 호모 2 작용성 가교 링커

아민-반응성 가교링커의 합성, 특성 및 적용은 참고문헌에서 기재되어있다(즉, Pierce Chemical Company, Rockford, Ⅲ; 상기 문헌 참조)

다수의 시약이 상품으로 이용되었다(즉, Pierce Chemical Company, Rockford, Ⅲ; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.,; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

호모 2 작용성 NHS 에스테르의 바람직한 비한정 예에는

디숙신이미드 글루타레이트(DSG), 디숙신이미딜기질(DSS), 비스(술포숙신이미딜)기질(BS), 디숙신이미딜 타르타레이트(DST), 비스-2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸술폰(BSOCOES), 비스-2-(술포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸술폰(술포-BSOCOES), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트)(술포-EGS), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트(DSP) 및디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트(술포-DSP)를 포함한다.

호모 2작용성 이미도에스테르의 바람직한 비한정예에는 디메틸말론이미데이트(DMM), 디메틸숙신이미데이트(DMSC), 디메틸아디프이미데이트(DMA), 디메틸피멜이미데이트(DMD), 디메틸수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-옥시디프로피온이미데이트(DODP), 디메틸-3,3'-(메틸렌디옥시)디프로피온이미데이트(DMDP), 디메틸-3'-(디메틸렌디옥시)디프로피온이미데이트(DDDP), 디메틸-3,3'-(테트라메틸렌디옥시)-디프로피온이미데이트(DTDP)및 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트 (DTBP)를 포함한다.

호모 2 작용성 이소티오시아네이트의 바람직한 비한정 예에는 P-페닐렌디이소티오시아네이트(DITC)와, 4,4'-디이소티오시아노-2.2'-디술폰산스틸벤(DIDS)가 포함한다.

호모 2 작용성 이소시아네이트의 바람직한 비한정 예에는 키실렌-디이소시아 네이트, 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 톨루엔-2-이소시아네이트-4-이소티오시아네이트, 3-케톡시디페닐메탄-4,4'-디이소시아네이트, 2,2'-디카르복시-4,4'-아조페닐디이소시아네이트 및 헥사메틸렌디이소시아네이트를 포함한다.

호모 2 작용성 아릴할라이드의 바람직한 비한정 예에는 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(DFDNB)와, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐-술폰을 포함한다.

호모 2 작용성 지방족 알데히드시약의 바람직한 비한정 예에는 글리옥살, 말론디알데히드 및 글루타르 알데히드를 포함한다.

호모 2 작용성 아실화시약의 바람직한 비한정 예에는 디카르복실산의 니트로페닐 에스테르를 포함한다.

호모 2 작용성 방향족 술포닐클로리드의 바람직한 비한정 예에는 페놀-2,4-디술포닐클로리드 및 α-나프톨-2,4-디술포닐 클로리드를 포함한다.

추가 아미노-반응성 호모 2 작용성시약의 바람직한 비한정 예에는 아민과 반응하여 비스카르바메이트를 얻는 에리트리톨 비스카르보네이트를 포함한다.

2. 유리술프히드릴기와 반응성 있는 호모 2 작용성가교링커

상기 시약의 합성, 특성 및 적용은 아래의 참고문헌에서 기재되어있다(for reviews of crosslinking procedures and reagens, 상기 인용참고문헌 참조).

대부분의 시약은 상품에서 이용할 수 있다(즉, Pierce Chemical Company, Rockford, Ⅲ; Sigma Chemical Company, St.Louis, MO.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

호모 2 작용성 말레이미드의 바람직한 비한정 예에는 비스말레이미도헥 산(BMH), N,N'-(1,3-페닐렌)비스말레이미드, N,N'-(1,2-페닐렌)비스말레이미드, 아조페닐디말레이미드 및 비스(N-말레이미도메틸렌)에테르를 포함한다.

호모 2 작용성 피리닐 디술피드의 바람직한 비한정 예에는 4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도부탄(DPDPB)를 포함한다.

호모 2 작용성 알킬할라이드의 바람직한 비한정 예에는 2,2'-디카르복시-4,4'-디아이오도아세트아미도아조벤젠, α,α'-디아이오도-P-키실렌풀손산, α,α'-디브로모-P-키실렌 술폰산, N,N'-비스(b-브로모에틸)벤질아민, N,N'-디(브로모아세틸)페닐티드라진 및 1,2-디(브로모아세틸)아미노-3-페닐프로판을 포함한다.

3. 호모 2 작용성 광활성화가능 가교링커

상기 시약의 합성, 특성 및 적용은 다음 참고문헌에서 기재되어 있다(for reviewⅳs of crosslinking procedures and reagents, 상기 인용참고문헌 참조).

일부 시약은 상품으로부터 이용할 수 있다(즉, Pierce Chemical Company, RockfoⅣⅳrd, Ⅲ; Sigma Chemical Company, St.Louis, MO,; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR).

호모 2 작용성 광활성화가능 가교링커의 바람직한 비한정 예에는 비스-β-(4-아지도살리실아미도)에틸디술피드(BASED), 디-N-(2-니트로-4-아지도페닐)-시스타민-S,S-디옥시드(DNCO)및 4-4'-디티오비스페닐아지드를 포함한다.

ⅳ. 헤테로 2 작용성 시약

1. 피리딜디술피드 성분을 가진 아미노 반응성 헤테로 2 작용성 시약

상기 시약의 합성, 특성 및 적용은 아래의 참고문헌에서 기재되어 있다(for reviewⅳs of crosslinking procedures and reagents, 상기 인용참고문헌 참조).

다수의 시약은 상품으로부터 이용할 수 있다(즉, Pierce Chemical Company, Rockford, Ⅲ; Sigma Chemical Company, St.Louis, MO,; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR).

피리딜디술피드 성분과 아미노 반응성 NHS 에스테르를 가진 헤테로 2 작용성 시약의 바람직한 비한정 예에는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 6-3-(2-피리딜디티오)프로피온 아미도 헥사노에이트(LC-SPDP), 술포숙신이미딜6-3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도헥사노에이트(술포-LCSPDP), 4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(SMPT)및 술포숙신이미딜 4-(P-말레이미도페닐)부티레이트(술포-SMPB)를 포함한다.

3. 알킬할라이드 성분을 가진 아미노-반응성 헤테로 2 작용성 시약

상기 시약의 합성, 특성 및 적용은 상기 참고문헌에서 기재되어 있다. 알킬 할라이드 성분과 아미노-반응성 NHS 에스테르를 가진 헤테로 2 작용성 시약의 바람직한 비한정 예에는 N-숙신이미딜-(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB); 술포숙신이미딜-(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(술포-SIAB); 숙신이미딜-6-(아이오도아세틸)아미노헥사노에이트(SIAX); 숙신이미딜-6-(6-((아이오도아세틸)-아미노)헥사노일아미노)헥사노에이트(SIAXX); 숙신이미딜-6-(((4-(아이오도아세틸)-아미노)-메틸)-시클로헥산-1-카르보닐)아미노헥사노에이트(SIACX) 및 숙신이미딜-4((아이오도아세틸)-아미노)메틸시클로헥산-1-카르복실레이트(SIAC)를 포함한다.

아미노 반응성 NHS 에스테르와 알킬 디할라이드 성분을 가진 헤테로-2-작용 성 시약의 바람직한 하나의 예에는 N-히드록시숙신이미딜 2,3-디브로모프로피오네이트(SDBP)가 있다.

SDBP는 친화성 성분에 그 아미노기를 콘주게이팅 함으로써 분자간 가교결합을 도입한다. 1급 아민기에 대한 디브로모프로피오닐 성분의 반응성을 반응온도에 의해 조절한다(McKenzie 등, Protein Chen. 7:581-592;(1998)참조).

알킬할라이드 성분과 아미노-반응성 P-니트로페닐 에스테르성분을 가진 헤테로-2 작용성 시약의 바람직한 비한정 예에는 P-니트로페닐 아이오도아세테이트(NPIA)를 포함한다.

다른 가교결합제는 이 분야의 기술자에 의해 공지되어있다. 예로서 다음 특허문헌을 참조할 수 있다(Pomato 등, USP 5,961,106).

소정의 적용에 적합한 가교제의 선택은 이 분야의 기술자의 선택 능력범위 내에 있다.

ⅴ. 분할성링커기( Linker Groups )

또 다른 예에서, 그 링커기는 그 당잔기에서 그 수식기를 이탈하여 분할할 수 있는 하나의 기(group)를 제공한다.

다수의 분할성기(groups)는 종래기술에서 공지되어 있다. 예로서 다음에 인용한 참고문헌을 예시할 수 있다.

Jung 등., Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162(1983); Joshi 등., J. Biol. Chem. 265: 14518-14525(1990); Zarling 등., J. Immunol. 124: 913-920(1980); Bouizar 등., Eur. J. Biochem. 155: 141-147(1986); Park 등., J. Biol. Chem. 261: 205-210(1986); Browning 등., J. Immunol. 143: 1859-1867(1989).

더욱이, 범위가 넓은 분할성 2 작용성(호모 및 헤테로-2 작용성)링커기는 공급업자(pierce 등)로부터 입수한 상품을 이용할 수 있다.

대표적인 분할성 성분은 광, 열 또는 티올, 히드록실아민, 염기, 퍼아이오데이트 등의 시약을 사용하여 분할할 수 있다. 더욱이, 더 바람직한 기는 세포내 이입응답에 따라 생체내에서 분할된다(즉, Cis-아코니틸; Shen 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048(1991)참조).

바람직한 분할성기는 디술피드, 에스테르, 이미드, 카르보네이트, 니트로벤질, 펜아실 및 벤조인기로 이루어진 그룹에서 선택한 하나의 멤버인 분할성 성분으로 이루어진다.

펩티드에 수식당의 콘주게이션

PEG 수식당은 그 콘주게이션을 매개하는 적합한 효소를 사용하여 글리코실화 펩티드 또는 비글리코실화 펩티드에 콘주게이팅을 한다.

그 수식 도너당, 효소 및 악셉터 펩티드의 농도는 그 악셉터가 소모될 때까지 글리코실화가 진행되도록 선택하는 것이 바람직하다.

아래에 설명하며, 시알릴 전이효소의 구체적 내용에서 설명한 관찰은 일반적으로 다른 글리코실 전이효소반응에 적용할 수 있다.

소정의 올리고 삭카리드 구조를 합성하는 글리코실 전이효소를 사용하는 여러 가지의 방법은 공지되었으며, 일반적으로 본 발명에 적용할 수 있다.

대표적인 방법은 예로서 아래의 참고 문헌에서 기재되어있다. 그 참고문헌을 아래에 예시한다.

WO 96/32491l; Ito등, Pure Appln. Chem. 65: 753(1993); USP 5,352,670; USP 5,374,541; USP 5,545,553; USP 6,399,336 및 USP 6,440,703.

본 발명은 단일 글리코실 전이효소 또는 조합 글리코실 전이효소를 사용하여 실시한다. 예로서, 시알릴 전이효소와 갈락토실 전이효소의 조합을 사용할 수 있다. 1종 이상의 효소를 사용하는 이들의 예에서, 그 효소와 기질은 초기 반응 혼합액에서 조합하는 것이 바람직하며, 또 상기 제 1 효소반응이 일단 완료되거나 거의 완료될 때, 제 2 효소반응을 위한 그 효소와 시약을 반응배지에 첨가한다.

2가지의 효소반응을 차례로 동일 용기 내에서 실시함으로써 중간체종을 분리하는 처리공정에서 전체수율을 향상시킨다. 더욱이, 부생물과 추가용제의 폐기 및 세척 작업이 감축된다.

하나의 바람직한 예에서, 각각의 제 1 및 제 2 효소는 글리코실 전이효소이다. 또다른 바람직한 예에서, 하나의 효소는 엔도 글리코시다아제이다. 바람직한 하나의 추가 예에서, 2종 이상의 효소를 사용하여 본 발명의 수식 당단백질을 집합한다. 이들의 효소를 사용하여 그 펩티드에 수식당의 부가 전후의 어느시점에서 그 펩티드 상에 삭카리드 구조를 변경한다.

또다른 예에서, 그 방법에 의해 1종 이상의 엑소(exo)글리코시다아제 또는 엔도(endo)글리코시다아제를 사용한다. 그 글리코시다아제는 일반적으로 하나의 변이체로서, 그 변이체는 작용하여 글리코실 결합을 파괴하기보다 오히려 그 글리코 실 결합을 형성한다.

그 변이체 글리카나아제(glycanase)는 일반적으로, 활성부위 상의 아미노산 잔기에 대한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.

예로서, 그 엔도글리카나아제가 엔도(endo)-H 일때그 치환된 활상부위 잔기는 일반적으로 위치 130에서 ASP, 위치 132에서 Glu 또는 그 조합으로 된다.

그 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환된다.

그 변이체 효소는 엔도글리카나아제 가수분해단계의 역반응과 동일한 합성단계에 의해 통상적으로 그 반응을 촉진하다.

이들의 예에서, 그 글리코실 도너 분자(즉, 소정의 올리고 또는 모노삭카리드 구조)에는 이탈기를 포함하며, 그 반응은 그 단백질 상에서 GlcNAc잔기에 그 도너분자의 부가와 함께 진행한다.

예로서, 그 이탈기는 플루오리드 등 할로겐이다.

다른 예에서, 그 이탈기는 Asn 또는 Asn-펩티드 성분이다. 또다른 예에서, 그 글리코실 도너 분자 상에서 그 GlcNAc잔기가 수식된다. 예로서 그 GlcNAc잔기는 1,2-옥사졸린성분으로 이루어진다.

하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 콘주게이트를 생성하는데 이용된 효소 각각은 촉매량으로 존재한다.

특정효소의 촉매량은 효소의 기질의 농도와, 온도, 시간 및 PH 값 등 반응조건에 의해 변화된다. 사전에 선택한 기질 농도와 반응조건 하에서 주어진 효소의 총매량을 측정하는 수단은 이 기술 분야의 기술자에 의해 공지되었다.

상기 프로세스를 실시할 수 있는 온도는 동결 바로 위의 온도에서 가장 감수성 있는 효소가 변성하는 온도까지의 범위로 할 수 있다.

바람직한 온도 범위는 약 0℃에서 약 55℃까지 이며, 가장 바람직한 온도는 약 20℃에서 약 30℃이다.

또 다른 대표적인 예에서, 본 발명의 방법의 1종 이상의 성분은 고온성 효소를 사용하여 고온에서 실시한다.

그 반응 혼합액은 그 악셉터가 글리코실화함으로써, 소정의 콘주게이트를 형성하는데 충분한 시간동안 유지한다. 그 콘주게이트의 일부는 수시간 후에 자주 검출할 수 있으며, 회수할 수 있는 양은 통상 24시간 이내에 얻어진다. 이 분야 기술자는 그 반응속도가 여러 가지의 변화할 수 있는 인자(factors)(즉, 효소농도, 도너농도, 악셉터 농도, 온도, 용매용량)에 따라 좌우되며, 이들의 인자가 선택시스템에 대하여 최적화 한다.

본 발명은 또 수식 펩티드에 대한 공업적 규모의 생산을 제공한다. 여기서 사용되는 바와 같이, 공업적 규모에서는 일반적으로 마무리한 정제 콘주게이트를 최소 1g으로 생산한다.

아래에서의 설명에서, 본 발명은 글리코실화 펩티드에 수식 시알산 성분의 콘주게이션에 의해 대표적으로 나타낸 것이다. 대표적인 수식 시알산은 PEG로 라벨링한다.

PEG 수식 시알산과 글리코실화 펩티드의 사용에 대한 다음 설명의 구성 핵심 은 설명을 명백하게 하기 위한 것이며, 이들의 두성분 파트너의 콘주게이트에 본 발명이 한정되어 있다는 것을 의미하는 것은 아니다.

이 분야의 기술자는 이 설명이 시알산 이외 수식 글리코실 성분의 부가에 일반적으로 적용할 수 있다는 것을 이해한다.

더욱이, 이 설명은 다른 PEG 성분, 치료용 성분 및 생체분자를 포함하는 PEG 이외의 처리제 글리코실 단위의 수식에 동일하게 적용할 수 있다.

펩티드 또는 글리코펩티드 상에서 PEG화(PEGylated) 또는 PPG화(PPGylated) 카르보히드레이트의 도입에 대하여 하나의 효소처리 접근 방법을 사용할 수 있다.

그 방법은 PEG, PPG 또는 차폐(masked)반응성 작용기를 함유한 수식당을 이용하며, 적합한 글리코실 전이효소 또는 글리코신타아제(glycosynthase)와 결합시킨다.

바람직한 카르보히드레이트 결합을 하는 글리코실 전이효소를 선택하여 그 수식당을 도너기질(donor substrate)로서 이용함으로써, 그 PEG 또는 PPG 는 그 펩티드 골격, 글리코 펩티드의 기존의 당잔기 또는 펩티드에 부가되었던 당 잔기 상에 직접 도입할 수 있다.

그 시알릴 전이효소의 악셉터(acceptor)는 본 발명의 방법에 의해 수식된 펩티드 상에서 천연산 구조 또는 재결합에 의해, 효소에 의해 또는 화학적 처리에 의해 설정된 구조로서 존재한다.

적합한 악셉터에는 예로서 Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1, 3GalNAc, 락토-N-테트라오스, Galβ1, 3GlcNAc, Galβ1, 3Ara, Gal β1, 6GlcNAc, Galβ1, 4Glc(락토오스)등 갈락토실 악셉터와, 이 분야의 기술자에 의해 공지된 다른 악셉터가 포함한다(참고문헌 : Paulson 등, J. Biol. Chem. 253 : 5617-5624(1978)).

하나의 예에서, 그 시알릴 전이효소의 악셉터는 그 글리코펩티드의 생체 내 합성을 할 때 수식되는 글리코펩티드 상에 존재한다.

이와 같은 글리코 펩티드는 그 글리코 펩티드의 글리코실화 패턴의 종래의 수식에 없는 본 발명의 청구방법을 사용하여 시알릴화 할 수 있다.

또, 본 발명의 방법을 사용하여 적합한 악셉터를 포함하지 않은 펩티드를 시알릴화 할 수 있으며, 이 기술분야의 기술자로부터 공지된 방법에 의해 하나의 악셉터를 포함하는 펩티드를 1차적으로 수식한다.

하나의 대표적인 예에서, GalNAc잔기는 GalNAc 전이효소의 작용에 의해 부가된다.

하나의 대표적 예에서, 그 갈락토실 악셉터는 그 펩티드, 즉 GlcNAc에 결합된 적합한 악셉터에 갈락토오스 잔기를 결합하여 집합시킨다.

이 방법에는 수식되는 펩티드를 적량의 갈락토실 전이효소(즉, Galβ1,3 또는 Galβ1,4)와, 적합한 갈락토실 도너(즉, UDP-갈락토오스)를 함유한 반응 혼합액으로 배양하는 것을 포함한다.

이 반응은 실질상 완료처리를 하도록 하며, 또는 갈락토오스잔기의 사전에 선택한 양이 첨가될 때 이 반응이 완료된다.

선택된 삭카리드 악셉터를 집합하는 다른 방법은 이 분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.

또 다른 예에서, 글리코펩티드 결합 올리고 삭카리드는 일차적으로 전체 또는 부분 "트리밍"(trimming)을 하고, 시알릴 전이효소의 악셉터 또는 1개 이상의 적합한 잔기를 부가할 수 있는 성분을 접촉하여 적합한 악셉터를 얻는다.

글리코실 전이효소 및 엔도글리코시다아제 등 효소(특허문헌 USP 5,716,812 참조)는 결합 및 트리밍 반응에 유용성이 있다.

아래에 이어지는 설명에서는 PEG 성분을 결합한 수식당의 사용에 의해 본 발명의 방법을 예시한 것이다.

그 설명의 구성요지는 설명을 명백하게 하기 위한 것으로, 그 수식당이 치료용 성분, 생체분자 등을 포함하는 이들의 예에 동일하게 관련된다는 것을 이 분야의 기술자는 알고 있다.

그 수식당의 부가전에 카르보히드레이트기를 "트리밍"(trimming)을 하는 본 발명의 하나의 예에서, 제 1세대 2촉각 형상구조(biantennary structure)로 고 만노오스(high mannose)를 "트리밍 백"(trimming back)한다.

PEG 성분을 가진 수식당은 그 트리밍 백에 의해 접촉된 1개 이상의 당잔기에 콘주게이팅을 한다.

하나의 예에서, PEG 성분은 그 PEG성분에 콘주게이팅 된 GlcNAc성분에 의해 부가된다. 그 수식된 GlcNAc는 그 2촉각 형상구조의 말단 만노오스 잔기 중 1개 또는 2개에 결합된다. 또, 비수식 GlcNAc는 분기종(branched species)의 말단 중 한쪽 또는 양쪽에 부가될 수 있다.

또 다른 대표적인 예에서, PEG 성분은 그 말단 만노오스 잔기 상에 부가된 GlcNAc잔기에 콘주게이팅된 하나의 갈락토오스 잔기를 가진 수식당에 의해 2촉각 형상구조(biantennary structure)의 말단 만노오스 잔기의 1개 또는 2개에 부가된다. 또, 비수식 Gal은 1개 또는 2개의 말단 GlcNAc잔기에 부가할 수 있다.

또 하나의 다른 예에서, PEG성분은 수식 시알산을 사용하여 Gal상에 부가된다.

또 다른 대표적인 예에서, 하나의 높은 만노오스 구조는 그 2촉각 형상구조가 분기된 분기 만노오스에서 상기 만노오스까지 "트리밍백"(trimming back)을 한다.

하나의 예에서, PEG성분은 그 폴리머로 수식된 GlcNAc에 의해 부가된다. 또, 비수식 GlcNAc는 그 만노오스에 부가된 다음, 결합PEG성분을 가진 Gal에 의해 부가된다.

또 다른 예에서, 비수식 GlcNAc와 Gal 잔기는 차례로 그 만노오스에 부가된 다음, PEG 성분으로 수식된 시알산 성분에 의해 부가된다.

하나의 또 다른 대표적인 예에서, 높은 만노오스는 제 1만노오스가 결합된 GlcNAc까지 "트리밍 백"된다. 그 GlcNAc는 PEG 성분을 가진 Gal 잔기에 콘주게이팅 된다. 또, 비수식 Gal은 GlcNAc에 부가시킨 다음에, 수용성 당으로 수식된 시알산을 부가한다.

하나의 또 다른 예에서, 그 말단 GlcNAc는 Gal과 콘주게이팅하고, 그 다음 그 GlcNAc는 PEG 성분을 가진 수식 푸코오스로 푸코실화한다.

높은 만노오스(high mannose)는 또 그 펩티드의 Asn에 결합된 제 1 GlcNAc에 트리밍 백을 할 수 있다. 하나의 예에서 GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 가진 GlcNAc와 콘주게이팅을 한다.

또 다른 예에서, GlcNAc-(Fue)_a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 Gal로 수식한다.

또 다른 예에서, 그 GlcNAc는 Gal로 수식한 다음, 이어서 PEG 성분으로 수식된 시알산의 Gal에 콘주게이팅을 한다.

다른 대표적인 예는 아래의 특허문헌 명세서에서 기재되어 있다. 인용 특허문헌을 예시한다.

미국특허공개공보 20040132640 ; 20040063911; 20040137557 과 미국특허출원번호 10/369,979; 10/140,913; 10/360,770; 10/410,945 및 PCT/US02/32263.

위에서 설명한 예는 여기서 설명한 방법의 공정의 구체적 설정을 제공한 것이다. 여기서 기재한 방법을 사용하여, 실질상 바람직한 구조의 카르보히드레이트 잔기를 "트리밍 백" 할 수 있고 구성할 수 있다. 그 수식당은 위에서 설명한 바와 같이 카르보히드레이트 성분의 단부에 부가할 수 있고, 또 그 펩티드 코어와 그 카르보히드레이트의 단부 사이에서 중간체로 할 수 있다.

하나의 대표적인 예에서, 기존의 시알산은 시알리다아제를 사용하여 글리코펩티드에서 제거시킴으로써, 하부에 있는 갈락토실기 모두 또는 대부분을 노출시킨다(unmasking).

또, 펩티드 또는 글리코펩티드는 갈락토오스 잔기 또는 갈락토오스 단위에서 종료하는 올리고 삭카리드 잔기로 라벨링 한다.

갈락토오스 잔기의 노출 또는 부가한 다음에, 적합한 시알릴 전이효소를 사용하여 수식 시알산을 부가한다. 그 접근 방법을 다음 스킴(scheme)2에서 요약한다.

다음 스킴 3에서 요약한 또 다른 접근 방법에서, 차폐 반응 작용성(functionality)은 그 시알산 상에 존재한다.

그 차폐 반응성기는 그 수식 시알산을 에리트로포이에틴(erythropoietin)에 결합하는 사용상태에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.

그 펩티드에 수식 시알산의 공유결합을 한 후에, 그 차폐는 제거되고, 그 펩티드는 PEG등 처리제와 콘주게이팅을 한다.

그 처리제는 수식 당잔기 상에서 노출 반응성기와의 반응에 의해 특정지게 그 펩티드에 콘주게이팅된다.

어느 수식당이라도 글리코 펩티드의 올리고 삭카리드 측쇄의 말단 당에 따라 적합한 글리코실 전이효소로 사용할 수 있다(표 2 참조).

위에서 설명한 바와 같이, 그 PEG화 구조의 도입에 필요로 한 글리코 펩티드의 말단 당은 물론 발현 중에 도입할 수 있으며, 또는 적합한 글리코시다아제, 글리코실전이효소, 또는 글리코시다아제와 글리코실 전이효소의 믹스(mix)을 사용하여 후발현을 생성할 수 있다.

또 다른 대표적인 예에서, UDP-갈락토오스-PEG는 소밀크 β1,4-갈락토실 전이효소와 반응시킴으로써, 그 수식 갈락토오스를 적합한 말단 N-아세틸 글루코사민 구조로 전이된다. 그 글리코 펩티드 상에서의 말단 GlcNAc 잔기는 포유동물, 곤충, 식물(plant) 또는 진균 등 발현 시스템에서 발생하는 것과 같이 발현 중에 생성되나, 또 필요에 따라, 그 글리코 펩티드를 시알리데이트 및/또는 글리코시다아제 및/또는 글리코실 전이효소와 처리하여 생성할 수 있다.

또 다른 대표적인 예에서, GNT1-5등 GlcNAc 전이효소를 이용하여 PEG화 -G1cN을 글리코 펩티드 상에서의 말단 만노오스 잔기에 전이한다.

또 하나의 다른 대표적인 예에서, N-및 또는 O-결합 글리칸 구조는 글리코펩티드에서 효소에 의해 제거시켜 아미노산 또는 말단 글리코실 잔기를 노출시킨 다음, 수식당과 콘주게이팅을 한다.

예로서, 엔도글리카나아제를 사용하여 글리코펩티드의 N-결합구조를 제거시켜 그 글리코펩티드 상에서의 GlcNAc-결합-Asn과 같이 말단 GlcNAc를 노출시킨다.

UDP-Gal-PEG와 적합한 갈락토실전이효소를 사용하여 그 노출된 GlcNAc 상에서 PEG-갈락토오스 작용성을 도입한다.

하나의 다른 예에서, 그 수식당은 펩티드 골격에 당잔기의 전이에 공지된 글리코실 전이효소를 사용하여 그 펩티드 골격에 직접 부가시킨다. 대표적인 이 예를 다음에 나타낸 스킴 4에서 설명한다.

본 발명의 실시에 유용한 대표적인 글리코 전이효소에는 GalNAc 전이효소(GalNAc T1-14), GlcNAc 전이효소, 푸코실전이효소, 글루코실 전이효소, 키실로실 전이효소, 만노실 전이효소 등이 포함되나, 한정된 것은 아니다.

이 접근방법을 사용하여 , 어느 카르보히드레이트라도 결여되어 있는 펩티드 상에서, 또는 기존의 글리코 펩티드 상에서 수식당의 직접 부가를 하도록 한다.

위의 두 경우에서, 수식당의 부가는 글리코실 전이효소의 기질 특이성에 의해 구성된 바와 같이 펩티드 골격상에서의 특정 위치에서 발생하며, 화학적 방법을 사용하여 단백질의 펩티드 골격의 수식 중에 발생하는 것과 같이 랜덤(random)하게 발생하지 않는다.

연속되는 처리제(agents)는 그 폴리펩티드 사슬 내에 적합한 아미노산 서열 을 설계함으로써 글리코실 전이효소기질 펩티드 서열이 결여된 단백질 또는 글리코 펩티드에 도입시킬 수 있다.

위에서 설명한 각각의 대표적인 예에서, 하나 이상의 추가단계(step)로서 화학적 수식단계 또는 효소적 수식 단계는 그 펩티드에 수식당의 콘주게이션을 행한 다음에 이용할 수 있다.

하나의 대표적인 예에서, 효소(즉, 푸코실 전이효소)를 사용하여 글리코실 단위(즉, 푸코오스)를 그 펩티드에 결합된 말단 수식당에 결합한다.

또 다른 예에서, 효소 반응을 이용하여 수식당이 콘주게이팅 되지 않은 부위를 캐핑(capping)한다. 또, 화학적 반응을 이용하여 콘주게이팅된 수식당의 구조를 변경한다. 예로서, 그 콘주게이팅을 한 수식당을, 그 수식당이 결합된 펩티드 성분으로 결합을 안정화하거나 또는 탈안정화하는 처리제와 반응시킨다.

또 다른 예에서, 그 수식당이 성분을 탈보호시킨 다음, 그 펩티드에 콘주게이션을 행한다. 이 분야의 기술자는 그 수식당을 펩티드에 콘주게이팅을 한 후 어느 한 단계(stage)에서 본 발명의 방법에서 유용한 연속되는 효소 및 화학적 처리공정이 있다는 것을 이해한다.

그 수식당-펩티드 콘주게이트의 추가적인 동화작용(elaboration)은 본 발명 의 범위 내에 있는 것이다.

i. 효소

당 전이 ( sugar transfer )

아실 결합 콘주게이트의 형성과 관련하여 위에서 설명한 효소 이외에, 그 콘주게이트와 출발기질(즉, 펩티드, 리피드)의 글리코실화 패턴은 동화작용할 수 있고, 트리밍 백 할 수 있으며, 또는 다른 효소를 이용하는 방법에 의해 수식할 수 있다. 당 도너를 악셉터에 전이하는 효소를 사용하여 펩티드와 리피드를 리모델링(remodeling)하는 방법은 특허문헌(DeFreed, WO03/031464A2; 2003.04.17 공개)에서 구체적으로 기재되어 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 선택효소의 간단한 요지를 아래에서 설명한다.

글리코실 전이효소

글리코실 전이효소는 단백질, 글리코펩티드, 리피드에 또는 성장하는 올리고 삭카리드의 비환원성 단부에 활성화당(도너 NDP-당)의 부가를 단계식으로 촉진한다.

N-결합 글리코 펩티드는 전이효소와 리피드결합 올리고 삭카리드 도너 Dol-PP-NAG₂Glc₃Man₉ 에 의해 일괄전이하여 합성되며, 그 다음 그 코어의 트리밍을 행한다. 이 경우, 그 "코어"(core)삭카리드의 특성은 후결합과 다소 다르다. 다수의 글리코실 전이효소는 이 기술분야에서 공지되어 있다.

본 발명에서 사용되는 글리코실 전이효소는 당 도너로서 수식당을 이용하는 한 어느 것이라도 가능하다. 이와 같은 효소의 예에는, 가락토실 전이효소, N-아세틸 글루코사미닐 전이효소, N-아세틸 갈락토사미닐 전이효소, 푸코실 전이효소, 시알릴 전이효소, 만노실 전이효소, 키실로실 전이효소, 글루쿠로노닐 전이효소 등 르로(Leloir)경로 글리코실 전이효소를 포함한다.

글리코실 전이효소 반응을 포함하는 효소의 삭카리드 합성에 있어서, 글리코실 전이효소는 어느 소오스(source)에서 클로닝(cloning)하거나, 분리할 수 있다.

다수의 클로닝된 글리코실 전이효소는 이들의 폴리뉴클래오티드 설열에서와 같이 공지된 것이다("The WWW Guide to cloned Glycosyltransferases"; http://www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm 참조).

아미노산 서열을 유도할 수 있는 글리코실 전이효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 글리코실 전이효소 아미노산 서열은 GenBank, Swiss-Prot, EMBL 및기타를 포함하여 공개적으로 이용할 수 있는 여러 가지의 데이타 베이스에서도 확인된다.

본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 글리코실 전이효소에는 갈락토실 전이효소, 푸코실 전이효소, 클루코실 전이효소, N-아세틸 갈락토사미닐 전이효소, N-아세틸 글루코사미닐 전이효소, 글루쿠로닐 전이효소, 시알릴 전이효소, 만노실 전이효소, 클루쿠론산 전이효소, 갈락트론산 전이효소 및 올리고 삭카릴 전이효소를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

적합한 글리코실 전이효소에는 진핵생물과 원핵생물에서 얻은 글리코실 전이효소를 포함한다.

글리코실 전이효소를 코딩하는 DNA는 화학적 합성, 적합한 세포 또는 셀라인(cell line)에서 mRNA의 역전사 스크리닝에 의해, 적합한 세포에서 게놈라이브러리의 스크리닝에 의해, 또는 이들 처리방법의 조합에 의해 얻을 수 있다.

mRNA 또는 게놈 DNA의 스크리닝은 글리코실 전이효소유전자 서열에서 생성된 올리고 뉴클레오티드 프로브로 실시할 수 있다.

프로브는 공지의 처리공정에 의해 형광기, 방사성 원자 또는 화학 조광기(chemiluminescent group)등 검출 가능기로 라벨링할 수 있고, 통상의 혼성화 아세이에서 사용할 수 있다.

또 다른 예에서, 글리코실 전이효소 유전자 서열은 중합효소 연쇄반응(PCR)의 사용에 의해 얻을 수 있고, 그 PCR 올리고 뉴클레오티드 프라이머는 글리코실 전이효소유전자 서열에서 생성된다(Mullis 등, USP 4,683,195; Mullis, USP 4,683,202 명세서 참조).

그 글리코실 전이효소는 효소로서 글리코실 전이효소를 코딩하는 DNA를 함유한 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 합성할 수 있다.

벡터를 사용하여 글리코실 전이효소를 코딩하는 DNA를 증폭하거나, 글리코실 전이효소를 코딩하는 DNA를 발현한다.

발현 벡터는 적합한 숙주에서 글리코실 전이효소의 발현을 시킬 수 있는 적합한 제어서열에 조작할 수 있게 글리코실 전이효소를 코딩하는 DNA 서열을 결합시킨 복제가능한 DNA구조(construct)이다.

이와 같은 제어서열의 필요성은 선택숙주와 선택 형질전환방법에 따라 변동 된다. 일반적으로, 제어서열에는 전사 프로모터, 전사를 제어하는 선택 오퍼레이터 서열, 적합한 mRN 리보솜 결합위치를 코딩하는 서열 및 전사 및 변역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다.

증폭벡터는 발현조절도메인을 필요로 하지 않는다. 필요로 하는 모든 것을 숙주 내에서 복제하는 능력에 있으며, 통상적으로 복제기원(Origin)과 형질전환체(transformants)의 인식을 촉진하는 선택 유전자에 의해 제공된다.

하나의 대표적인 예에서, 본 발명은 원핵생물효소를 이용한다.

이와 같은 글리코실 전이효소에는 리포올리고 삭카리드(LOS)의 합성에 포함된 효소를 포함하며, 그 LOS는 다수의 그램음성균에 의해 생성된다(참고문헌: Preston 등, Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180(1996)).

이와 같은 효소에는 에.콜리(E.coli)와 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) 동종의 rfa 오페론의 단백질을 포함하나, 한정된 것은 아니며, 이들의 효소에는 β1,6 갈락토실 전이효소와 β1,3갈락토실 전이효소를 포함한다[EMBL Aceerssion NOS. M80599 및 M86935 (E.coli0); EMBL Accession No. S56361(S. typhimurium)), 글루코실 전이효소(Swiss- Prot Accession No. P25740(E. coli), β1,2-글루코실 전이효소(rfaJ)(Swiss-Prot. Accession No. P27129(E.coli) 및 Swiss-Prot. Accession No.19817(S. thphimurium)), 및 β1,2-N-아세틸 글루코사미닐 전이효소(rfak)(EMBL Accession No. U00039(E. coli)참조].

락토-N-네오테트라오스, D-갈락토실-β-1,4-N-아세틸-D-글루코사미닐-β-1,3-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코오스, 및 pk 혈액형 트리삭카리드 서열, D-갈락토 실-α-1,4-D-칼락토실-β-1,4-D-글루코오스를 포함하는 구조를 생성하는데 포함하는 글리코실 전이효소는 본 발명의 사용에 적합하며, 이들의 전이효소는 점액병원체 네이스세리아 곤노르회애(Neisseria gonnorhoeae)및 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis)의 LOS에서 동정하였다(Scholten 등, J. Med. Microbiol, 41 : 236-243(1994)참조).

이들 구조의 생합성에 포함된 글리코실 전이효소를 코딩하는 엔. 메닝기티디스와 엔. 고노르회애의 유전자는 엔.메닝기티스 면역타입 L3 및 L1(Jennings 등, Mol. Microbiol. 18 : 729~740(1995)참조)와 엔. 고노르 회애 변이체 F62(Gotshlich, J. Exp. Med. 180 : 2181-2190(1994)참조)에서 동정하였다.

엔. 메닝기티디스에서, 3개의 유전자, lgtA, lgtB 및 lgE로 이루어진 부위(locus)는 락토-N-네오테트라오스 사슬에서 당의 최종 3개의 부가에 필요로 하는 글리코실 전이효소를 코딩한다(Wakarchuk 등, J.Biol. Chem. 271: 19166-73(1996)참조.

최근에 lgtB와 lgtA 유전자 생성물의 효소활성이 입증되어, 이들의 제안된 글리코실 전이효소기능의 제1의 직접입증을 제공하였다(Wakarchuk 등, J.Biol. Chem. 271(45): 28271-276(1996)참조).

엔고노르회애에서는 2종의 추가 유전자, 락토-N-네오테트라오스 구조의 말단 갈락토오스의 3 위치에 β-D-GalNAc를 부가한 lgtD와, 절단(truncated)Los의 락토오스 요소에 말단 α-D-Gal을 부가한 lgtC가 존재하여, P^k 혈액형 항원 구조를 생성 한다(Gotshlich(1994))(상기문헌참조)

엔.메닝기티디스에서는 개별 면역타입 L1이 또 P^k 혈액형 항원을 발현하며, lgtC 유전자를 보유하는 것을 나타낸다(Jennings 등,(1995), 상기문헌참조).

네이스세리아 글리코실 전이효소와 관련 유전자는 또 특허문헌 USP 5,515,553(Gotschlich)명세서에 기재되어 있다.

헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에서의 α1,2-푸코실 전이효소와 α1,3-푸코실 전이효소의 유전자는 또 그 특징이 있었다)Martin 등, J. Biol. Chem. 272: 21349-21356(1997)참조).

또 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 글리코실 전이효소가 본 발명에서 유용하다(예로서, http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html)참조).

푸코실 전이효소

몇 가지의 예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 글리코실 전이효소는 이 기술 분야의 기술자에 의해 공지되었다. 대표적인 푸코실 전이효소에는 GDP-푸코오스에서 악셉터당의 히드록시 위치까지 L~푸코오스를 전이하는 효소를 포함한다.

악셉터에 비 뉴클레오티드 당을 전이하는 푸코실 전이효소는 본 발명에서 역시 유용하다.

몇 가지 예에서, 그 악셉터 당은 예로서, 올리고 삭카리드 글리코시드에서 Galβ(1→3,4)GlcNAc-기의 GlcNAc이다.

이 반응의 적합한 푸코실 전이효소에는 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ1-α(1→3,4)푸코실 전이효소(FT Ⅲ E.C. No. 2.4.1.65)(사람 우유에서 오는 1차적인 특징이 있었음)[Palcic등, Carbohydrate Res. 190:1-11(1989); Prieels 등, J.Biol. Chem. 256: 10456-10463(1981);Nunez 등, Can, J. Chem. 59: 2086-2095(1981)]와 Galβ(1→4) GlcNAc β-α푸코실 전이효소(FTIV, FTV. FTVI)(사람의 혈청에서 발견되었음)를 포함한다.

시알릴 α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ 푸코실 전이효소로서 FTⅦ(E.C.No.2. 4.1.65)가 또 그 특징이 있다.

Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-α(1→3,4)푸코실 전이효소의 재조합형태가 또 그 특징이 있다(Dumas 등, Bioorg. Med. Letters 1: 425-428(1991); kukowska-latallo 등, Genes and development 4: 1288-1303(1990)참조).

효소의 푸코실화는 참고문헌(Mollicone 등, Eur J. Biochem. 191 : 169-176(1990) 또는 USP 5,374,655)에서 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다.

푸코실 전이효소의 생성에 사용되는 세포에는 또 GDP-푸코오스를 합성하는 효소시스템을 포함한다.

갈락토실 전이효소

또 다른 예에서, 그 글리코실 전이효소에는 갈락토실 전이효소가 있다.

대표적인 갈락토실 전이효소에는 α(1,3)갈락토실 전이효소를 포함한다.[E.C. NO.2.4.1.151: 참고문헌 Dabkowski 등, Transplant Proc. 25: 2921(1993); Yamamoto 등, Nature 345: 229-223(1990); bovine(GenBank j04989, Joziasse 등., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297(1989); murine(GenBank m26925; larsen 등., Proc. Nat'l. Acad., Sci. USA 86: 8227-8231(1989); Porcine(GenBank L36152; Strahan 등., Immunogenetics 41: 101-105(1995)].

또 다른 적합한 α1,3 갈락토실 전이효소는 혈액형 B항원의 합성에서 포함된 효소이다[EC 2.4.1.37; Yamamoto 등, J. Biol. Chem. 265: 1146-1151(1990)(human)].

또 하나의 다른 대표적인 갈락토실 전이효소는 코어 Gal-T1이다.

β(1,4)갈락토실 전이효소는 본 발명의 방법에서 또 적합하며, 그 갈락토실 전이효소에는 예로서 EC 2,4,1,90(LacNAc 합성요소)및 EC 2.4.1.22(락토오스 합성효소)[bovine(D'Agostro 등, Eur J. Biochem.183: 211-217(1989)); human(Masri 등., Biochem. Biophys. Res. Commun.157: 657-663(1988)); Murine(Nakazawa 등., J.Biochem.104: 165-168(1988)], E.C. 2.4.1.38 및 세라미드 갈락토실 전이효소[EC 2.4.1.45; Stahl 등., J. Neurosci. Res.38: 234-242(1994)]를 포함한다.

다른 적합한 갈락토실 전이효소에는 예로서 α1,2갈락토실 전이효소[즉, Schizosaccharomyces pombs; Chapell 등, Mol. Biol. Cell 5: 519-528(1994)]를 포함한다.

시알릴 전이효소

시알릴 전이효소는 본 발명의 재조합 세포와 반응 혼합액에서 유용한 또 다른 타입의 글리코실 전이효소이다.

재조합 시알릴 전이효소를 생성하는 세포는 시알릴 전이효소의 시알산 도너 인 CMP-시알산을 생성한다.

본 발명에서 사용에 적합한 시알릴 전이효소의 예에는

ST3 GalⅡ[(즉, 랫(rat) 또는 인간(human) ST3 GalⅢ), ST3 GalⅣ, ST3 GalⅠ, ST6 GalNAcⅠ, ST3 GalⅤ, ST6 GalⅡ, ST6 GalNAcⅠ, ST6 GalNAcⅡ 및 ST6 GalNAcⅢ[여기서 사용되는 시알릴 전이효소의 명칭은 참고문(Tsuji 등, Glycobiology 6: ⅴ-ⅹⅳ(1996))에서 기재된 것과 같다.]을 포함한다.

α(2,3)시알릴 전이효소(EC 2.4.99.6)인 하나의 대표적인 α(2,3)시알릴 전이효소는 시알산을 Galβ1→3Glc디삭카리드 또는 글리코시드의 비환원 말단 Gal로 전이한다[Van den Eijnden 등, J. Biol. Chem 256: 3159(1981); Weinstein 등, J. Biol. Chem 257: 13845(1982); Wen 등, J. Biol. Chem.267: 21011(1992)참조].

또 다른 대표적인 α2,3-시알릴 전이효소(EC 2.4.99.4)는 시알산을 디삭카리드 또는 글리코시드의 비환원 말단 Gal로 전이한다[Rearick 등, J. Biol. Chem. 254: 4444(1979); Gillespie 등, J. Biol. Chem .267:21004(1992)참조].

대표적인 또 다른 효소에는 Gal-β-1,4-GlcNAcα-2,6시알릴 전이효소를 포함한다(Kurosa등, Eur. J. Biochem. 219: 375-381(1994)참조).

글리코 펩티드의 카르보히드레이트의 글리코실화에 있어서, 그 시알릴 전이효소는 시알산을 서열 Gal β1,4 GlcNAc로 전이하여, 가장 공통적인 말단에서 두번 째 서열이 완전 시알릴화한 카르보히드레이트 구조상에서 말단 시알산 하부에 위치하는 것이 바람직하다(아래의 표2 참조)

표 2 : 악셉터 기질로서 Gal β1,4 GlcNAc서열을 사용한 시알릴 전이효소

시알릴 전이효소	소스( Source )	형성서열	참조
ST6Gal Ⅰ	Mammalian	NeuAc 2,6Galβ1,4GlCNAc-	1
ST3Gal Ⅲ	Mammalian	NeuAc 2,3Galβ1,4GlCNAc- NeuAc 2,3Galβ1,3GlCNAc-	1
ST3Gal Ⅳ	Mammalian	NeuAc 2,3Galβ1,4GlCNAc- NeuAc 2,3Galβ1,3GlCNAc-	1
ST6Gal Ⅱ	Mammalian	NeuAc 2,6Galβ1,4GlCNA
ST6Gal Ⅱ	photobacterium	NeuAc 2,6Galβ1,4GlCNAc-	2
ST3Gal Ⅴ	N. meningitides N. gonorrhoeae	NeuAc 2,3Galβ1,4GlCNAc-	3

1) Goochee 등, Bio/Technology 9: 1347-1355(1991)

2) Yamamoto 등, J. Biochem. 120: 104-110(1996)

3) Gilbert 등, J. Biol. Chem. 271: 28271-28276(1996)

본 발명의 방법에서 유용한 시알릴 전이효소의 하나의 예에는 ST3GalⅢ이 있으며, 이것은 또 α(2,3)시알릴 전이효소(EC 2.4.99.6)이다.

이 효소는 Gal β1,3 GlcNAc 또는 Gal β1,4 GlcNAc 글리코시드의 Gal로 시알산의 전이를 촉진하며, 글리코 펩티드에서 아스파라긴 결합 올리고 삭카리드의 시알릴화의 원인이 된다[ 참고문헌: Wen 등, J. Biol. Chem. 267: 21011(1992); Van den Eijnden 등, J. Biol. Chem. 256:3159(1991)참조].

그 시알산은 2종의 삭카리드 사이에서 α-결합의 형성에 의해 Gal에 결합된다.

그 삭카리드 사이의 결합은 NeuAc의 2-위치와 Gal의 3-위치사이에 있다.

이 특정의 효소는 랫(rat)간에서 분리할 수 있다[Weinstein 등, J. biol. Chem. 257: 13845: 13845(1982); 인간 cDNA(Sasaki 등,(1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson(1994), J. Biol. Chem. 269: 1394-1401: Genomic(Kitagawa 등,(1996); J. Biol. Chem. 271: 931-938, 참조].

DNA서열은 공지되어 있으며, 재조합 발현에 의해 이 효소의 생성을 촉진한다.

하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 시알릴화 방법은 랫(rat)ST3GalⅢ를 사용한다.

본 발명에서 사용하는 다른 대표적인 시알릴 전이효소에는 α(2,3)을 포함하여 캄필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni)에서 분리한 효소를 포함한다(특허문헌 WO99/49051 참조)

표 2에서 열거하는 효소 이외의 시알릴 전이효소는 또 상업적으로 중요한 글리코펩티드의 시알릴화에 애한 경제적이고 효율적인 대규모 처리방법에서도 유용하다.

다른 이들의 효소의 유용성을 확인하는 간단한 테스트로서, 여러 가지 양의 각각의 효소(1-100mU/mg 단백질)와 각각의 효소(1-100mU/mg 단백질)를 아시알로 -α₁AGP(1~20mg/ml)와 반응시켜 소(bovine) ST6Gal Ⅰ, ST3 Gal Ⅱ또는 양자의 시알릴 전이효소에 대한 글리코펩티드를 시알릴화 하는 관련 시알릴 전이효소 능(ability)을 대비한다.

또, 이 평가를 위하여 아시알로-α,AGP 대신 다른 글리코펩티드, 또는 글리코펩티드 또는 펩티드 골격에서 효소에 의해 이탈된 N-결합 올리코 삭카리드를 사용할 수 있다.

글리코펩티드의 N-결합 올리고 삭카리드를 ST6Gal Ⅰ보다 더 효율있게 시알릴화하는 능력(ability)을 가진 시알릴 전이효소는 펩티드 시알릴화의 실제적인 대규모 프로세스에서 유용하다.

GalNAc 전이효소

N- 아세틸 갈락토사미닐 전이효소는 본 발명의 실시에서, 특히 그 펩티드의 O-결합 글리코실화 부위의 아미노산에 GalNAc성분을 결합하는데 유용하다.

적합한 N-아세틸 갈라토사미닐 전이효소에는 α(1,3)N-아세틸 갈락토사미닐 전이효소, β(1,4)N-아세틸갈락토사미닐 전이효소(Nagata 등, J. Biol. Chem. 269:15162(1994) 및 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐 전이효소(Homa 등, J. Biol. Chemj. 268: 12609(1993))를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

유전자 공학에 의해 클로닝된 유전자에서 효소 GalNAcT₁-xx등 단백질의 제조는 공지되어 있다(특허문헌 USP 4,761,371 참조).

하나의 방법에는 충분한 샘플을 수집한 다음, N-말단 서열결정에 의해 그 효소의 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함한다.

그 다음으로, 이와 같은 정보를 사용하여, 곤충셀라인 Sf 9에서 발현할 때 완전활성효소의 합성에서 얻어진 전장(결합막)전이효소를 코딩하는 cDNA클론을 분리한다.

그 다음으로, 그 효소의 악셉터 특이성은 16종의 다른 단백질에서 공지의 글리코실화 부위를 둘러싼 아미노산의 반정량분석을 사용하여 측정한 다음, 합성 펩 티드의 생체의 글리코실화 연구를 실시하였다.

이 연구에서는 어느 아미노산 잔기가 글리코실화된 펩티드 세그멘트에서 과잉으로 나타내었으며 글리코실화된 세린잔기와 트레오닌 잔기를 둘러싼 특정 위치의 잔기가 다른 아미노산 성분에서 보다 악셉터 효율에 대한 영향이 더 현저하였음을 나타내었다.

세포결합 글리코실 전이효소

또 다른 예에서, 본 발명의 방법에서 이용된 효소는 세포결합 글리코실 전이효소이다.

다수의 가용성 글리코실 전이효소가 공지되었으나(예로서 특허문헌 USP 5,032,519 참조), 글리코실 전이효소는 일반적으로 세포와 결합될 때 막결합형태이다. 이와 같이 연구한 대부분의 막결합효소는 내인성 단백질(intrinsic proteins)로 볼 수 있다. 즉, 이들의 단백질은 초음파 처리(sonification)에 의해 막(membranes)으로부터 분리되지 않으며, 가용화용계면활성제를 필요로 한다.

표면 글리코실 전이효소는 척추동물 세포와 무척추동물세포의 표면상에서 동정하였으며, 이들의 표면 전이효소는 생리적 상태하에서 촉매 활성을 유지하는 것으로 인식하였다.

그러나, 세포표면 글리코실 전이효소의 인식기능은 세포간 인식을 위한 것이다(Roth, Molecular Approaches to supracelluar phenomena, 1990 참조).

세포에 의해 발현된 글리코실 전이효소를 변경하는 여러 가지의 방법이 개발되었다.

예로서 참고문헌(Laresen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231(1989)참조)에서는 세포표면 올리고 삭카리드구조와 이들의 동종의 글리코실 전이효소의 발현을 측정하는 클로닝된 cDNA 서열을 분리하는 일반적인 접근 방법이 보고되었다.

UDP-갈락토오스: .β.-D-갈락토실-1,4-N-아세틸-D-글루코사미드α-1,3-갈락토실 전이효소의 발현에 공지된 마우스의 셀라인으로부터 분리된 mRNA에서 생성된 cDNA 라이브러리를 COS-1 세포 내에 이입하였다.

그 다음, 그 이입된 세포는 배양하여 α1-3갈락토실 전이효소 활성에 대하여 효력검정(assay)을 하였다.

참고문헌(Francisco 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2713-2717(1992))에서는 에쉐리키아 콜리의 외측면에 β-락타마아제를 고정하는 방법에 대하여 개시되었다.

ⅰ) 외측막단백질의 신호서열과, ⅱ) 외측막단백질의 막-스판부(membrane-spanning section)와, ⅲ) 완전완숙 β-락타마아제 서열로 이루어진 3분절계 융합(tripartite fusion)이 생성되어, 활성면 결합 β-락타마아제 분자를 얻는다.

그러나, 상기 참고문헌 방법(Francisco)은 원핵세포계로만 한정되어 있으며, 본원 발명자에 의해 인식된 바와 같이 적합한 기능적 작용을 하는 완전한 3분절계 융합을 필요로 한다.

술포전이효소

본 발명은 예로서, 헤파린, 헤파란 술페이트, 카라게넨(carragenen)및 관련 화합물을 포함하여, 술페이트화한 분자를 포함하는 펩티드의 생성방법을 또 제공한다.

적합한 술포 전이효소에는 예로서 큰드로이틴-6-술포전이효소[치킨(chicken)cDNA; 참고문헌(Fukata 등, J. Biol. Chem. 270: 18575-18580(1995); GenBank Accession No. D49915)에 기재되어 있음], 글리코사미노글리칸 N-아세틸 글루코사민 N-데아세틸라아제/ N-술포전이효소 1(Diwon 등, Genomics 26: 239-241(1995); UL18918)및 글리코사미노글리칸[마우스의 cDNA; 참고문헌(Orellana 등, J. Biol. Chem. 269: 2270-2276(1994); Eriksson 등, J. Biol. Chem. 269: 10438-10443(1994))에 기재되어 있음; 인간 cDNA(Genbank Accession No. U2304에 기재되어 있음)]을 포함한다.

글리코시다아제

본 발명은 또 야생형 및 변이체 글리코시다아제의 사용을 포함한다.

변이체 β-갈락토시다아제 효소는 갈락토실 악셉터 분자에 α-글리코실 플루오리드의 결합에 의해, 디삭카리드의 형성을 촉진하는 것을 나타내었다(특허문헌: Withers, USP 6,284,494: 2001. 09. 04 특허취득).

본 발명에서 사용하는 다른 글리코시다아제에는 예로서 β-글루코시다아제, β-갈락토시다아제, β-만노시다아제, β-아세틸글루코사미니다아제, β-N-아세틸갈락토사미니다아제, β-키힐로시다아제, β-푸코시다아제, 셀룰라아제, 키실라나아제, 갈락타나아제, 만나나아제, 헤미셀룰라아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, α-만노시다아제, α-N-아세틸글루코사미 니다아제, α-N-아세틸갈락토오스-아미니다아제, α-키실로시다아제, α-푸코시다아제 및 뉴라미니다아제/시알릴다아제를 포함한다.

고정화(불용화)효소

본 발명은 고상 및/또는 가용성 지지체 상에 고정화(불용화)시킨 효소의 사용을 제공한다.

하나의 대표적인 예에서, 본 발명의 방법에 의해 무손상 글리코실 링커를 통하여 PEG에 콘주게이팅시킨 글리코실 전이효소를 제공한다. 그 PEG-링커-효소 콘주게이트는 고상 지지체에 선택적으로 결합한다.

본 발명의 방법에서 고상지지효소를 사용함으로써 반응 혼합액의 작용을 단순화하여, 반응 생성물의 정제를 간단하게 하며, 또 그 효소의 회수를 용이하게 하도록한다.

본 발명의 방법에서 그 글리코실 전이효소 콘주게이트를 이용한다. 효소와 지지체의 다른 조합은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

융합단백질( Fusion Proteins )

다른 대표적 예에서, 본 발명의 방법은 하나의 바람직한 글리코펩티드 콘주게이트의 합성에 포함된 1종 이상의 효소활성을 가진 융합 단백질을 이용한다.

그 융합 폴리펩티드는 예로서 보조효소의 촉매활성 도메인에 결합된 글리코실 전이효소의 촉매활성 도메인으로 구성할 수 있다.

그 보조효소촉매 도메인(domain)은 예로서 글리코실 전이효소의 도너(donor)인 뉴클레오티드를 형성하는 스텝을 촉진하거나, 또는 글리코실 전이효소 사이클에 포함된 반응을 촉진할 수 있다.

예로서, 글리코실 전이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프레임 내에서(in-frame) 뉴클레오티드 당 합성에 포함된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

그 다음으로 그 결과 얻어진 융합 단백질은 그 뉴클레오티드당의 합성만이 아니라, 그 악셉터 분자에 그 당성분의 전이도 촉진할 수 있다.

그 융합 단백질은 하나의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열에 결합된 2종 이상의 사이클 효소이다.

다른 예에서, 그 융합 단백질에는 2종 이상의 글리코실 전이효소의 촉매활성 도메인을 포함한다(예로서, 특허문헌 USP 5,641,668 참조).

본 발명의 수식 클리코 펩티드는 여러 가지의 적합한 융합 단백질을 이용하여 용이하게 구성할 수 있고, 제조할 수 있다[예로서, 특허문헌 PCT/CA98/00180(1999. 06. 24. 공개된 WO99/31224임)].

에리트로포이에틴 콘주게이트(eythropoietin conjugates)의 정제

위 처리프로세스에 의해 생성된 생성물은 정제없이 사용할 수 있다. 그러나, 통상적으로 그 생성물을 회수하는 것이 바람직하다.

박층 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 막여과 등 글리코실화 삭카리드의 회수에 사용하는 공지의 기준이 되는 기술을 사용할 수 있다.

막여과의 사용이 바람직하며, 더 바람직하게는 역삼투막(reverse osmotic membrane), 또는 아래에서 설명되고 여기서 인용한 참고문헌에서 설명한 바와 같이 회수에 쓰이는 1종 이상의 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용한다.

예로서, 막이 절단(cut off) 분자량 약 3,000~약 10,000을 가진 막여과를 사용하여 글리코실 전이효소 등 단백질을 제거할 수 있다.

그 다음으로, 나노여과 또는 역삼투를 사용하여 염(salts)을 제거하며, 생성물 삭카리드를 정제할 수 있다(즉, WO98/15581 참조).

나노여과막은 사용막에 따라 1가염을 통과하나 다가염과 약 100이상 약 2,000달톤(Daltons)까지의 무부하 용질을 보존하는 한 등급의 역삼투막이다.

이와 같이, 일반적인 적용에서, 본 발명의 방법에 의해 제조한 삭카리드는 그 막에서 보존하며, 오염염은 완전 통과시킨다.

그 수식 당단백질이 제 1 단계에서 그 입상 부스러기(particulate debris)를 생성할 경우, 숙주세포 또는 용균 프래그멘트를 예로서 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하며; 선택적으로, 그 단백질은 상품용 단백질 농축 필터로 농축시킨 다음, 그 폴리펩티드 변이체를 다른 불순물에서 면역 친수성 크로마토그래피, 이온교환 컬럼분별(즉, 디에틸 아미노에틸(DEAE) 또는 카르복시메틸 또는 술포프로필기함유 매트릭스); 블루-세파로스(Blue-Sephrose)상의 크로마토 그래피, CM블루-세파로스, MONO-Q, MONO-S, 렌틸 렉틴(lentil lectin)-세파로스, WGA-세파로스, 콘 에이(Con A), 세파로스, 에테르토요펄(Toyopearl), 부틸토요펄, 페닐토요펄, 또는 단백직 A 세파로스, SDS-PAGE 크로마토그래피, 실리카크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromato focusing), 역상(reverse phase)HPLC(즉, 결합방향족기를 가진 실리카 겔), 세파덱스 분자시브(molecular sieve)사용겔여과 또는 사이즈배제 크로마토그래피, 폴리펩티드 및 에타놀 또는 암모늄술페이트 침전을 선택적으로 결합하는 컬럼 크로마토그래피에서 선택한 1 이상의 스텝(steps)에 의해 분리시킬 수 있다.

배양에서 생성된 수식 글리코펩티드는 통상적으로 세포, 효소 등에서 초기 추출에 의해 분리시킨 다음, 1회 이상의 농축, 염석(salting-out), 수용성 이온교환, 또는 사이즈배제 크로마토그래피 스텝에 의해 처리한다. 또, 그 수식 당단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 최종적으로, HPLC는 최종 정제스텝 용으로 사용할 수 있다.

프로테아제 개시제, 즉 메틸술포닐 플루오리드(PMSF)는 선행 스텝 중 어느 하나의 스텝에 포함시켜, 단백질 분해를 억제하며, 항생물질이 포함되어 있어 외래 오염물질의 성장을 억제시킬 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명의 수식 글리코펩티드를 생성하는 계(systems)에서의 상징액을 1차적으로 상품으로 이용되는 단백질 농축필터, 예로서 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore)펠리콘(pellicon)한외여과 장치를 사용하여 농축한다.

이 농축스텝 다음에, 그 농축액은 적합한 정제 매트릭스에 처리할 수 있다.예로서, 적합한 친화성 매트릭스는 펩티드의 리간드(ligand), 적합한 지지체에 결합된 항체분자 또는 렉틴으로 구성한다.

또, 아니온 교환수지, 예로서 현수(pendent)DEAE기를 가진 기질 또는 매트릭스를 사용할 수 있다. 적합한 매트릭스에는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 타입을 포함한다.

또, 카티온 교환스텝을 사용할 수 있다. 적합한 카티온교환제에는 술포프로필 또는 카르복시메틸기로 이루어진 여러 가지의 불용성 매트릭스를 포함한다. 술포프로필기가 특히 바람직하다.

최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 즉 현수메틸 또는 다른 지방족기를 가진 실리카겔을 사용하는 하나 이상의 RP-HPLC 스텝을 사용하여 폴리펩티드 변이체 조성물을 추가로 정제한다.

일부 또는 전체의 상기 정제스텝은 여러 가지의 조합으로 사용하여 균질의 수식 당단백질을 제공한다.

대규모의 발효처리결과 얻어진 본 발명의 수식 글리코 펩티드는 참고문헌(Urdal 등, J. Chromatog. 296: 171(1984))에 의해 개시된 것과 동일한 방법에 의해 정제할 수 있다.

이 참고문헌에서는 분리용 HPLC 컬럼 상에서 재조합 인간 IL-2를 정제하는 2종의 연속적인 RP-HPLC 스텝에 대하여 기재되어있다. 또, 친화성 크로마토그래피 등의 기술을 이용하여 그 수식 당단백질을 정제할 수 있다.

의약 조성물

본 발명의 또 다른 국면(aspect)에서, 본 발명은 의약 조성물을 제공한다. 그 의약 조성물에는 의약적으로 허용할 수 있는 희석제와, 비자연산의 PEG 성분, 치료용 성분 또는 생체분자와 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드 사이에서의 공유결합 콘주게이트를 포함한다.

그 폴리머, 치료용 성분 또는 생체분자는 그 펩티드와 그 폴리머, 치료용 성분 또는 생체분자 사이에 설정되고 공유결합되는 무손상 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드에 콘주게이팅된다.

본 발명의 의약조성물은 여러 가지의 약제투여시스템에서 사용하는 데 적합하다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 조제는 다음 참고문헌에서 확인되었다(Remington's Pharmaceutical Science, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17thed(1995)).

약제투여 방법의 간단한 레뷰(review)에 대해서는 다음 참고문헌을 참조할 수 있다(Langer, Science 249:1527-1533(1990)).

의약 조성물은 예로서 국소투여, 경구투여, 비강투여, 정맥내투여, 두개내투여, 복강내투여, 파하투여 또는 근육내투여를 포함하여 적합한 투여방식에 따라 조제할 수 있다.

피하 주사 등 비경구투여에 있어서, 그 캐리어는 물, 염류용액, 알코올, 지방, 왁스 또는 버퍼로 이루어지는 것이 바람직하다.

경구 투여에 있어서, 상기 캐리어 중 어느 하나 또는 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐삭카린, 탈컴(talcom), 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스 및 마그네슘 카르보네이드 등의 고상 캐리어를 사용할 수 있다. 생 분해성 중심체(microspheres)(즉, 폴리락테이트, 폴리글리코레이트)를 본 발명의 의약 조성물의 캐리어로서 사용할 수도 있다.

적합한 생분해성 중심체는 예로서 특허문헌(USP 4,897,268 및 5,075,109)에 개시되었다.

일반적으로, 그 의약 조성물은 비경구투여, 즉 정맥내투여한다.

이와 같이 본 발명은 바람직하게는 수용성 캐리어, 즉 물, 버퍼수, 염류용액, PBS 등 허용할 수 있는 캐리어에 용해 또는 현탁시킨 화합물로 이루어진 비경구투여용 조성물을 제공한다.

그 조성물에는 PH조정제 및 버퍼제(buffering agents), 긴장성 조성제, 습윤제, 세정제 등 적합한 생리상태에 필요로 하는 의약상 허용할 수 있는 조제를 포함할 수 있다.

이들의 조성물은 통상의 살균기술에 의해 살균할 수 있고, 또는 살균 여과할 수 있다.

그 결과 얻어진 수용액은 그대로 사용하기 위하여 패킹할 수 있고, 또는 친액성화(lyophilized)할 수 있다. 그 친액성화 조제액은 투여 전에 살균 수용성 캐리어와 배합한다.

일반적으로, 그 조제액의 PH는 PH 3~PH 11이고,더 바람직하게는 PH 5~PH 9이며, 가장 바람직하게는 PH 7~PH 8이다.

몇 가지의 예에서, 본 발명의 글리코펩티드는 기준소포(vesicle)형성 리프드에서 형성된 리포솜에 결합할 수 있다. 여러 가지의 방법이 다음 참고문헌에서 기재된 바와 같이 리포솜의 제조에 이용할 수 있다(Szoka 등, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467(1980); USP 4,235,871 ; 4,501,728 및 4,837,028 참조).

여러 가지의 표적제(본 발명의 시알릴 갈락토시드)를 사용하는 리포솜의 표 적(targeting)하는 방법은 이 기술분야에서 공지되었다(USP 4,957,773 및 4,603,044 참조).

리포솜에 표적제를 결합하는 표준 방법을 사용할 수 있다.

이들의 방법에는 일반적으로 포스파티딜에타놀아민 등 리피드 성분의 리포솜으로의 결합을 포함하며, 이것은 표적제 또는 본 발명의 리피드-유도체화된 글리코 펩티드등 유도체화한 친리포성 성분의 결합에 대하여 활성화할 수 있다.

표적 설정 메카니즘에서는 일반적으로 그 표적 성분이 그 표적, 예로서 세포표면 리셉터와 상호작용을 하도록 리포솜의 표면상에 그 표적제를 위치시키는 것이 필요하다.

본 발명의 카르보 히드레이트는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 방법(즉, 긴사슬 알킬 할라이드 또는 지방산과 카르보히드레이트 상에 존재한 히드록시기의 알킬화 또는 아실화)을 사용하여 그 리포솜이 형성되기 전에 리피드 분자에 결합할 수 있다.

또, 리포솜은 그 막을 형성할 때 그 막에 결합부분(connector portion)이 1차적으로 결합되게 형성할 수 있다. 그 결합 부분은 하나의 친 리포성 부분을 가질 필요가 있으며, 그 친리포성 부분은 그 막에 견고하게 매입되어, 고정된 것이다.

또, 이것은 하나의 반응성 부분을 가져, 그 반응성 부분은 그 리포솜의 수용성 표면 상에서 화학적으로 작용할 수 있도록 한다.

그 반응성 부분은 표적제 또는 후부가(adding later) 되는 카르보히드레이트와 안정성 있는 화학적 결합을 형성하는데 있어서 화학적으로 적합하다.

몇 가지의 경우, 그 결합분자에 표적제를 직접결합시킬 수 있으나, 대부분의 경우 화학적 결합(브리지)으로서 작용하는 제 3의 분자를 사용하는 것이 더 적합하다.

이와 같이하여, 그 막에 존재하는 결합분자를 표적제 또는 카르보히드레이트와 결합한다. 여기서 그 카르보히드레이트는 그 소포표면에서 3차원 형성을 한다.

또, 본 발명의 방법에 의해 제조된 화합물은 진단용 시약으로 사용하는 것을 확인할 수 있다.

예로서, 라벨링을 한 화합물을 사용하여, 염증의심이 있는 환자에서 염증 또는 종양전이부위를 설정할 수 있다. 이 사용에서, 화합물은 ¹²⁵I, ¹⁴C 또는 트리튬으로 라벨링 할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물에 사용되는 활성성분을 글리코PEG화한 에리트로포이에틴과 그 유도체이며, 이들은 골수세포가 망상적혈구와 적혈구의 생성을 증가하도록 하는 생물학적 특성을 가진다.

본 발명의 리포솜 분산액은 비경구조제물로서, 만성 신부전과 관련된 빈혈을 포함하여 여러 가지의 형태의 빈혈 등 저적혈구생성 또는 결손적혈구생성에 그 특징이 있는 혈액병, 지도비딘(Zidovidins)치료 HIV 감염환자와, 암환자를 화학요법으로 치료하는데 유용하다.

또, 이것은 여러 가지의 질병상태, 장해 및 혈액 부정상태[겸상적혈구 질환. 베타-탈라세미아(thalassemia), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 임신(pregnancy) 및 월경장해, 조기 조숙빈혈, 척수손상(spinal cord injury), 우주비행(space flight), 급성 실혈(blood loss), 노화 등]의 치료에 적용할 수 있다.

본 발명의 EPO 조성물은 비경구투여(즉, IV, IM, SC 또는 IP)하는 것이 바람직하다.

유효량은 치료되는 상태와 투여루트에 따라 상당한 변동이 예측되나, 그 활성재의 단위체중(kg)당 약 0.1(~7U)~100(~7,000U)㎍ 의 범위인 것으로 예측된다.

빈혈상태 치료의 바람직한 용량은 1주일에 3회에 걸쳐 약 50~약 300U/kg이다.

본 발명은 생체내 보존시간을 높인 에리트로포이에틴을 제공하기 때문에, 상기 용량은 본 발명의 조성물을 투여할 때 선택적으로 저하시킨다.

다음의 실시예를 들어 본 발명의 콘주게이트 및 방법을 설명하나, 본 발명을 한정한 것은 아니다.

실시예 1

UDP-GalNAc-6'-CHO의 제조

UDP-GalNAc(200㎎, 0.30mmoles)를 1mM CuSO₄용액(20㎖)과 25mM NaH₂PO₄용액(pH 6.0;20㎖)에 용해 하였다.

그 다음 갈락토오스 옥시다아제(240U;240㎕)과 카타라아제(13000U;130㎕)를 하나의 밸룬(balloon)으로 장치한 반응시스템에 첨가하고, 산소로 필링하여 실온에서 7일간 교반하였다.

그 다음 그 반응혼합액을 여과하여(스핀카라지;MWCO 5K), 그 여액(40㎖)을 필요로 할 때까지 4℃에서 저장하였다.

TLC(실리카;EtOH/물(7/2);R_f=0.77; 아니스알데히드 염색(stain)으로 가시화 하였음).

실시예 2

UDP-GalNAc-6'-NH₂의 제조

암모니늄 아세테이트(15mg, 0.194mmoles)와 NaBH₃CN(1M THF용액;0.17㎖, 0,17mmoles)을 위 실시예에서 얻은 UDP-GalNAc-6'-CHO용액(2㎖ 또는 ~20㎎)에 0℃에서 첨가시켜, 하룻밤 실온에서 가온하도록 하였다.

그 반응액을 G-10 컬럼을 통하여 물로 여과시켜, 생성물을 회수하였다.

적합한 프랙션을 동결 건조시키고, 냉동 저장하였다.

TLC(실리카, 에타놀,물(7/2); R_f=0.72; 닌히도린시약으로 가시화 하였음).

실시예 3

UDP-GalNAc-6-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1 KDa)의 제조

갈락토사미닐-1-포스페이트-2-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1KDa)(58㎎, 0.045mmoles)를 DMF(6㎖)와 피리딘(1.2㎖)중에 용해하였다.

그 다음, UMP-모로폴리데이트(60㎎, 0.15mmoles)를 첨가하였다. 얻어진 혼합액을 70℃에서 48시간 동안 교반하였다.

그 용제는 반응혼합액을 통하여 질소를 버블링(bubbling)시켜 제거하고, 그 잔유분은 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다(C-18 실리카, 10%~18% 사이에서 스텝구배, 메타놀/물).

소정의 프랙션을 회수하고, 감압 건조시켜 백색의 고체 50㎎(70%)을 얻었다.

TLC(실리카, 프로파놀/물/NH₄OH(30/20/2), R_f=0.54). MS(MALD):관찰 되었음, 1485, 1529, 1618, 1706.

실시예 4

시스테인-PEG₂의 제조(2)

4.1 화합물 1의 합성

포타슘 히드록사이드(분말로서, 84.2㎎, 1.5mmol)를 아르곤하에 무수 메타놀(20L)중에서 L-시스테인(93.7㎎, 0.75mmol)을 용해한 용액에 첨가하였다.

얻어진 혼합액을 실온에서 30분간 교반시킨 다음, 분자량 20KD의 mPEG-O-토실레이트(Ts; 1.0g, 0.05mmol)를 2시간에 걸쳐 수회 소량으로 나누어 첨가하였다.

그 얻어진 혼합액을 실온에서 5일간 교반하고, 최전식 증발에 의해 농축하였다.

그 잔류분을 물(30㎖)로 희석시킨 다음, 실온에서 2시간 교반하여 과잉의 20KD의 mPEG-O-토실레이트를 파괴하였다.

그 다음 얻어진 용액을 아세트산으로 중성화시켜, 그 pH를 pH 5.0으로 조절하고, 역상 크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼 상에서 로딩(loading)하였다.

그 컬럼은 메타놀/물의 구배로 용출하여(생성물은 약 70% 메타놀에서 용출하였음), 생성물 용출은 증발성 광산란에 의해 모니터링(monitoring) 하였으며, 적합한 프랙션은 회수하여 물(500㎖)로 희석하였다.

이 용액은 크로마토그래피 처리를 하였다(이온 교환, XK 50 Q, BIG 비드, 300㎖, 히드록사이드 형태, 물과 물/아세토산의 구배-0.75N). 그리고 적합한 프랙션의 pH는 아세트산으로 6.0까지 저하시켰다.

그 다음, 이 용액은 역상 컬럼(C-18 실리카)상에서 포집하여 위에서와 같이 메타놀/물의 구배로 용출하였다.

그 생성물 프랙션을 푸울링(pooling)하고, 농축하며, 수중에서 재용해시키고, 동결 건조하여, 백색고체(1) 453㎎(44%)을 얻었다.

상기 화합물의 구조 데이터는 다음과 같다:

¹H-NMR(500MHz;D₂0)δ2.83(t,2H, O-C-CH ₂-S), 3.05(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.18(q, 1H, (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.38(s, 3H, CH ₃O), 3.7(t, OCH ₂CH ₂O), 3.95(q, 1H, CHN).

그 생성물의 순도는 SDS PAGE에 의해 확인되었다.

4.2 화합물 2의 합성(시스테인-PEG)

트리에틸아민(~0.5㎖)을 용액이 염기성으로 될 때까지 무수 CH₂CI₂(30㎖)에 화합물 1(440mg, 22μ㏖)을 용해한 용액에 적가하였다.

20KD mPEG-O-p-니트로페닐 카르보네이트(660mg, 33μmol)와 N-히드록시 숙신이미드(3.6㎎, 30M8μmol)를 CH₂CI₂(20㎖)중에서 용해한 용액을 수회 소량으로 나누어 실온에서 1시간에 걸쳐 첨가하였다.

얻어진 그 반응혼합액을 실온에서 24시간 동안 교반 하였다.

그 다음, 그 용제는 회전식 증발에 의해 제거시키고, 그 잔류분은 수중(100㎖)에 용해하였다.

그 pH는 1.0N NaOH를 사용하여 pH 9.5로 조정하였다.

얻어진 그 염기성 용액을 실온에서 2시간 교반시킨 다음, 아세트산을 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다.

그 다음, 그 용액을 역상 크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼 상에서 로딩하였다.

그 컬럼은 메타놀/물의 구배로 용출하였으며(생성물 약 70% 메타놀에서 용출하였음), 생성물 용출은 증발성 광산란에 의해 모니터링 하였고, 적합한 프랙션은 회수하여 물(500㎖)로 희석하였다.

이 용액을 크로마토그래피 처리하였으며(이온 교환, XK 50 Q, BIG 비드, 300㎖, 히도록사이드 형태; 물과 물/아세트산(0.75N)의 구배), 그 적합한 프랙션의 pH는 아세트산을 사용하여 6.0으로 저하시켰다.

그 다음, 이 용액을 역상 컬럼(C-18 실리카) 상에서 포집하여 위에서 설명한 바와 같이 메타놀/물의 구배로 용출하였다.

그 생성물 프랙션은 풀링(pooleing)하고, 농축하며, 수중에서 재용해하고, 동결 건조하여 백색고체(2) 575㎎(70%)을 얻었다.

그 화합물의 구조데이터는 다음과 같다;

1H-NMR(500MHz;D₂0)δ2.83(t, 2H, O-C-CH ₂-S), 2.95(t, 2H, O-C-CH ₂-S), 3.12(q, 1H, S-C-CHH-CHN), 3.39(s, 3H, CH ₃O), 3.71(t, OCH ₂CH ₂0).

그 생성물의 순도는 SDS PAGE에 의해 확인되었다.

실시예 5

UDP-GaINAc-6-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1 KDa)의 제조

갈락토사미닐-포스페이트-2-NHCO(CH₂)-O-PEG-OMe(1KD)(58mg, 0.045mmoles)를 DMF(6㎖)와 피리딘(1.2㎖)에 용해하였다.

그 다음 UMP-모르폴리데이트(60mg, 0.15mmoles)을 첨가하여, 얻이진 혼합액 을 48시간 동안 70℃에서 교반하였다.

그 용제는 그 반응혼합액을 통하여 질소를 버블링하여 제거시키고, 그 잔유분은 역상 크로마토그래피(C-18 실리카, 10~18% 사이에서 스텝 구배, 메타놀/물)에 의해 정제하였다.

그 소정의 프랙션은 회수하여 감압하여서 건조하여 백색고체 50㎎(70%)를 얻었다.

TLC(실리카, 프로파놀/H₂0/NH₄OH(30/20/2), R_f=0.54), MS(MALDI); 관찰 되었음, 1485, 1529, 1618, 1706.

실시예 6

하나의 폿(Pot)내에서의 GnT1 및 GaIT1 반응

6.1 하나의 폿 내에서의 반응

하나의 폿내 G1cNAc 전이효소-1과 갈락토오스전이효소-1 반응을, 100mM Tris HC1 pH 7.5 또는 MES pH 6.5 함유 150mM NaC1, 5mM UDP-G1cNaC, 5mM UDP-Ga1, 5mM MnCl₂, 0.02% 소듐아지드, 정제 G1cNAc전이효소-1 30mU/mL와 정제 갈락토오스전이효소-1 200mU/㎖ 중에서 EPO(1㎎/㎖)를 32℃에서 16시간 배양시켜 실시하였다.

6.2 Superdex 75 컬럼 상에서 EPO의 정제

수퍼덱스(Superdex)75 컬럼을 유속 5㎖/min에서 100mM MES 버퍼 pH 6.5 함유 150mM NaC1 중에 평형화 하였다.

스텝 6.1(상기)에서의 EPO 생성물을 그 컬럼 상에 로딩(loading)하여 평행화 버퍼로 용출하였다.

그 용출액을 280㎚ 흡수와 전도율에 대하여 모니터링 하였다.

SDS-PAGE를 사용하여 그 EPO를 함유한 그 푸울링된 프크 프랙션을 측정하였으며, 추가 실험에 사용하였다.

6.3 ST3 Gal-Ⅲ반응

그 ST3 Gal Ⅲ반응은 1㎎/㎖의 EPO-Gal(상기 스텝 6.2에서)을 100mM Tris HC1 pH 7.5 또는 MES pH 6.5함유 150mM NaC1, 0.5mM CMP-N-아세틸-뉴라민산-20KD-PEG, 0.02% 소듐아지드 및 정제 ST3 Gal-Ⅲ 200mU/㎖에 배향하여 실시하였다.

실시예 7

하나의 폿에서 GnT1, GaIT1 및 ST3Gal-Ⅲ(CMP-NAN-20K PEG사용)반응

EPO(1㎎/㎖)는 G1cNAc전이효소-1 30mU/mL, 갈락토오스전이효소-1 200mU/㎖와, 당뉴클레오리드 및 CMP-N-아세틸-뉴라민산-20KD PEG를 가진 ST3GalⅢ 500mU/㎖로 100mM MES 버퍼 pH 6.5에서 배양하였으며, SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다.

그 스텝 효소 리모델링 반응에서 얻은 결과와 동일하게 PEG화 EPO의 3개 밴드가 하나의 폿내 3종 효소제조에서 나타내었다.

실시예 8

2 촉각형상 PEG-EPO의 제조

8.1 rEPO에 GlcNAc의 부가

0.1M Tris, 0.15M NaCl, 5mM MnCl₂ 및 0.02% 소듐아지드(pH 7.2)에서 바쿠로 바이러스(baculovirus)(1㎎/㎖)에서의 발현된 재조합 EPO를 32℃에서 24시간 동안 3mM USP-GlcNAc, 50mU/mg GlcNAc 전이효소-1 및 50mu/mg GlcNAc 전이효소-Ⅱ로 배양하였다.

8.2 갈락토오스의 부가

3mM UDP-Gal과 0.2U/㎎ 갈락토오스 전이효소는 위 스텝 8.1의 GlcNAc-라벨링한 펩리드에 첨가하였다. 그 얻어진 혼합액은 32℃에서 36시간 동안 배양하였다. 그 갈락토실화 생성물은 Tris-버퍼 염류용액 중에서 수퍼덱스 75 컬럼 상에서의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

그 정제 생성물은 1㎎/㎖로 될 때까지 농축하였다.

8.3 시알산 또는 시알산 PEG의 부가

0.1M Tris, 0.1M NaCl(pH 7.2) 중에서 위 스텝 8.2에서의 갈락토실화 생성물(1㎎/㎖)을 32℃에서 24시간 동안 200mU/㎎ ST3GalⅢ와 0.5mM CMP-시알산 또는 CMP-시알산-PEG(여기서 PEG는 분자질량 5KD, 10KD 또는 20KD을 가짐)로 배양하였다.

실시예 9

CST-Ⅱ에 의한 N-결합 30K PEG화

CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현된 것과 같이 글리코실화한 EPO(5㎎, 0.166μmol, 5㎖)를 최종 용량 5ml로 될 때까지 농축시켜 tris-버퍼(50mM Tris, 0.15M NaCl, 0.001M CaCl₂+0.005% NaN₃)로 버퍼 교환하였다.

그 다음, CMP-시알산-PEG(30킬로달톤, 25㎎, 0.833㏖; 30K달톤 CMP-시알산-PEG의 구조를 나타낸 도 3B 참조), 0.25㎖ 100mM MnCl₂, 및 캄필로박터제주니(Campylobacter jejuni)에서 유래한 2작용성시알릴전이효소, CST-Ⅱ(1.4U/㎖, 0.5㎖, 0.7U)를 첨가하였다.

그 결과, 얻어진 혼합액을 48시간 동안 온도 32℃에서 로케팅(rocketing)하였다.

그 반응을 종결할 때, 그 혼합액을 1㎖의 용량으로 될 때까지 한외여과에 의해 농축하였다. 그 다음, 20mM NaOAc+0.005% Tween-80(pH 6.0) 2.5ml로 버퍼 교환하였다.

용리액으로서 25mM NaOAc+2m NaCl + 0.005% Tween-80(pH 6.0)를 사용하여 Q-Sepharose EX 크로마토그래피를 실시하였다.

피크(Peak) 2를 회수하여 1.5ml까지 한외여과에 의해 농축한 다음, 용리액으로서 1XPBS(pH 5.5+0.005% Tween80)을 사용하여 Superdex-200 정제(컬럼:Superdex200, 16/60 GL, Amersham)처리를 하였다.

피크 2를 회수하여 1.5ml로 될 때까지 농축하였다.

이와 같이 하여 얻어진 물질을 살균 여과시키고, 10mM NaOAc(0.75% NaCl, pH 5.5)를 사용하여 2.5㎖의 최종 용량으로 조제하였다.

단백질 농축물은 264㎍/㎖이었고, 단백질 660㎍을 얻었다(BCA 측정).

실시예 10

다음 실시예에서는 ST3GalⅢ을 사용하여 O-결합 40킬로달톤 PEG 결합 EPO를 제조하는 방법을 설명한다:

10.1 탈시알릴화(Desialylation)

이 스텝에서는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 성장한 EPO를 탈시알릴화 하였다.

GlcNAc-Gal 결합은 아래의 스텝 10.2에서 수식시알산 PEG의 전이 악셉터로서 작용한다.

상기 CHO 세포에서 발현되는 것과 같이 글리코실화시킨 EPO 용액을 Tris 버퍼(20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02% NaN₃, pH 7.2)로 버퍼 교환시켜 10㎖의 최종 용량을 얻었다.

그 다음, 이 용액에 750mU 2,3,6,8-뉴라미다아제[아르트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter Ureafaciens)에서 유래 함]를 첨가하였다.

그 결과 얻어진 혼합물을 48시간 동안 32℃에서 로케팅(rocketing)하였다.

이 스텝의 생성물을 프로토콜의 다음 스텝에서 직접 사용하였다(아래 내용 참조).

10.2 O-결합 40K PEG화

이 스텝에서는 O-시알릴 전이효소를 사용하여 수식시알산-PEG 성분을 상기 스텝 10.1의 탈시알릴화 EPO로 전이한다.

CMP-시알산-PEG(40킬로달톤, 33mg, 0.825μmol; 40킬로달톤 CMP-SA-PEG의 구 조에 대한 도 3A 참조), O-시알릴 전이효소(1.4U/㎖, 300mU) 및 0.25㎖의 100mM MnCl₂를 상기 혼합액의 2/1량에 첨가하였다.

이와 같이하여 얻어진 혼합액을 한외여과(MWCO 5K)에 의해 2.8㎖가지 농축한 다음, 최종 용량 3㎖로 될 때까지 25mM NaOAc+0.001% Tween-80(pH 6.0)으로 버퍼 교환을 하였다.

그 최종 생성물은 SP(5㎖) 상에서 3회(3회 주입, 각각 1㎖씩) 이온 교환에 의해 정제하였다.

PEG화 EPO(피크2)를 회수하여 한외여과에 의해 최종 용량 2㎖까지 SEC 정제를 위하여 농축하였다.

Superdex 200 상에서의 정제는 다음 소정의 단백질의 분해를 제공하였다: EPG-GlcNAc-Gal-SA-PEG(40K)(반응의 최종 스텝).

10.3 CHO-EPP-GalNAc-Gal-SA-PEG(40K)의 완전말단시알릴화(Complete terminal sialylation)

이 프로세스의 스텝에서, 시알산을 수식시알산잔기를 갖지 않은 글리코실 구조의 말완에 부가하였다.

결합된 PEG화 EPO(상기 스텝 b의 반응에서 약 2㎎)을 한외여과(MWCO 5K)에 의해 농축시킨 다음, tris 버퍼(0.05M Tris, 0.15M NaCl, 0.001M CaCl₂+0.005% NaN₃)로 최종 용량 2㎖까지 버퍼 교환을 하였다.

그 다음, CMP-N-아세틸 뉴라민산(CMP-NANA; 1.5mg, 2.4μmol), ST3Gal Ⅲ(8.9U/㎖, 10㎕, 0.089 U) 및 50㎕의 100mM MnCl₂를 첨가하였다.

그 결과 얻어진 혼합물을 32℃에서 24시간 동안 로케팅한 다음, 1㎖의 최종 용량으로 될 때까지 농축하였다.

이 용액을 용리액으로서 1XPBS(pH 5.5+0.005% Tween80)를 사용하여 직접 Superdex 200으로 정제 처리하였다.

피크(peak) 1을 회수하여 10㎖로 될 때까지 희석하였다.

단백질 농도 52.8㎍/㎖(BCA).

총 528㎍의 단백질을 얻었다.

최종 펩티드 생성물의 개략적 표시를 도 4A에 나타내었다.

실시예 11

이 실시예에서는 정맥내 투여 CHO-유도 EPO(도 5에서 개략적인 표시를 나타내었음)와 CHO-유도 EPO의 글리코PEG화 변이체의 약물동태프로파일을 ELISA 검정(assay)을 사용하여 비교하였다.

랫(rat)에 정맥내 투여량을 1㎏당 30㎍을 단일회에 투여한 후, CHO-유도 에리트로포리에틴의 2종의 비PEG화 배치(batch), 즉

본 발명의 방법에 의해 생성된 30K PEG화 CHO-유도 에리트로포이에틴(도 4B)과, 본 발명의 방법에 의해 생선된 40K PEG화 CHO-유도 에리트로포이에틴(도 4A)의 약물동태프로파일을 ELISA에 의해 비교하였다.

11.1 ELISA 플레이트 준비

인간 EPO에 대한 포집항체(capure antibody)를 웰(well)당 100㎖에서 96-웰 플레이트의 모든 웰에 조제하였다.

그 플레이트는 플레이트 실(seal)테이프로 커버하여 37℃에서 2시간 동안 양하였다.

그 포집항체는 그 플레이트에서 0.2% Tween-20을 함유한 Tris 버퍼 염류용액(TBST)으로 2회 세척하여 제거하였다.

세번 세척 후, 3% 밀크차단용액(milk blocking solution)(TBST+3%밀크)을 그 플레이트에 가하여, 그 플레이트를 플레이트 실테이프로 커버시켜 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

오전에 그 블록킹 용액을 TBST로 3회 세척시켜 제거하였다.

랫(rat) 플라스마 샘플과 기준 단백질을 랫(rat) 플라스마로 적합하게 희석시켜 웰(wells)내에서 100㎕/웰로 조제하였다.

그 플레이트를 플레이트 실테이프로 커버시켜 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

그 다음날 오전에 표준 단백질을 사용하여 약물동태 특성을 테스트하는 EPO 단백질 각각 에 대하여 표준선행회귀(standard linear regression)를 발생하였다.

그 표준 단백질의 역상-HPLC 분석을 완료하였으며, 농도는 검출 단백질에 상응하는 피크 하부영역을 계산하여 측정하였다.

11.2 테스트 샘플의 조제 및 첨가

각각의 테스트 샘플을 희석시켜, 희석 샘픔을 HLISA 플레이트 내에서, 100㎕ /웰로 조제하였다.

그 다음, 그 플레이트를 플레이트 실테이프로 커버시켜 온도 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

11.3 유로퓸 카운트(Europium counts)의 측정

오전중에 그랫혈청 샘플을 제거시키고, 그 플레이트를 3회 TBST로 세척하였다. 유로퓸으로 사전에 라벨링시켜 겔여과 컬럼을 통하여 정제시킨 검출항체, 마우스 항인간 EPO를 그 ELISA 플레이트에 처리하였다.

그 플레이트를 1시간 동안 실온에서 회전속도 100rpm의 교반하에 배양하였다.

그 플레이트를 6회 TBST로 세척시켜 그 검출항체를 제거하였다. 촉진용액을 그 플레이트에 200㎕/웰로 첨가하였으며, 그 플레이트를 실온에서 20분간 배양하였다.

유로퓸 카운팅 프로그램을 사용하여 그 형광을 윌락(Wallac) 플레이트 리터(plate reader)로 판독하였다.

11.4 결과

11.4a 표준선형회귀(Standard Linear Regression)발생

각 플레이트에서의 표준 단백질로부터 그 유로퓸 카운트를 사용하여 표준선현회귀 곡선과 식을 얻었다.

그 식을 사용하여 유로퓸 카운트를 각각의 샘플 웰에 대하여 동가 EPO량으로 변환하였다.

11.4b 약물동태 결과

그 결과를 도 6에 나타내었다.

검출한정치는 비PEG화 EPO에 있어서 약 0.4ng/㎖이었고, 30KD와 40KD PEG화 EPO에 있어서 약 0.8ng/㎖이었다.

30KD PEG화 CHO-유도 EPO 및 40KD PEG화 CHO-유도 EPO는 이들의 비PEG화 대응 EPO와 대비하여 정맥내 클리어런스 파라미터가 상당히 우수함을 명백하게 나타내었다. 도면에서 나타낸 바와 같이, 여러 가지의 EPO 이소형(isoforms)은 40KD PEG화 CHO-유도 EPO ~ 30KD PEG화 CHO-유도 EPO >>> 비PEG화 대응 EPO의 순서로 되었다.

실시예 12

이 실시예에서는 ELISA 검정(assay)을 사용하여 피하투여 CHO-유도 에리트로포이에틴(EPO), 하이퍼 글리코실화 비글리코PEG화 EPO, 곤충 세포 성장 글리코PEG화 EPO 및 CHO세포 유도 글리코PEG화 EPO의 약물동태프로파일을 측정하였다.

랫(rats)에 피하 용량으로 1회에 10㎍/㎏을 투여한 후 ELISA에 의해 비 글리코실화 CHO-유도 EPO, 비-PEG화 하이퍼 글리코실화 CHO 유도 EPO, 글리코PEG화 곤충 세포 유도 EPO, 10K N-결합 PEG화 곤충 세포 유도 에리트로포이에틴(개략적 표시는 도 7에서 나타내었음), 40KD O-결합 PEG화 CHO-결합 에리트로포이에틴(도 4A 참조)의 약물동태프로파일을 비교하였다.

상기 ELISA 플레이트를 준비하여 실시예 10에서와 같이하여 블록킹 하였다. 또, 표준 단백질을 제조하여 유로퓸 카운트를 또 위에서와 같이하여 측정하였다.

12.1 랫 샘플(rat samples)의 준비 및 첨가

피하(S.C.) 주사 후에, 순환중의 EPO의 양은 그 등가 1.V. 주사에서 나타낸 것과 비교하여 감소하였다.

S.C. 주사 EPO 단백질의 플라즈마 농도는 일반적으로 주사 후 30분 내지 48시간 사이에서 검출되었다.

12.2 약물 동태 결과

이들의 실험결과는 도 8에서 나타낸다.

도 8에는 EPO의 평균량(ng/㎖)을 나타내며, 서로 다른 시간에 랫 혈청 샘플에서의 표준 편차는 각 EPO 변이체군에 대한 주사시간=0시간 후에 나타낸다. 검출한정치는 비-PEG화 EPO와 PEG화 EPO에 대하여 약 0.3ng/㎖이다.

곤충 세포에서 성장한 10K PEG화 EPO아 40킬로달톤 PEG화 CHO-EPO의 경우, 그 흡수는 좀진적(gradual)인 것으로 나타내며, 이들 EPO 변이체의 상당량의 그 피크 혈청 레벨(Cmax)이상으로 잘 흡수되어 있는 상태를 발생한다.

곤충 세포에서 성장한 10K PEG화 EPO 변이체는 주사 후 24-36시간 범위에서 Cmax에 도달한다.

이에 대하여, 40킬로달톤 PEG화 CHO-EPO 변이체는 주사 40-60시간 후에 Cmax에 도달한다.

또, 그 PEG화 변이체의 감지할 수 있는 레벨은 현행 주사용량으로 주사한 후 96시간에서 존재하였다.

그 혈청순위 순서 t_{1 /2}는 다음과 같다;

40킬로달톤 PEG화 CHO-EPO > 곤충 세포에서 성장한 10K PEG화 변이체 > 하이퍼 글리코실화 CHO-EPO >> 비 PEG화 CHO-EPO.

실시예 13

배양시 EPO 리셉터를 가진 TEI 세포의 증식 촉진에 있어서, 2종의 비 PEG화 EPO 변이체(A 및 B)의 상대 활성을 2종의 글리코PEG화 변이체(30킬로달톤 및 40킬로달톤 PEG) 및 하이퍼 글리코실화 PEG와 비교하였다.

이 검정에서 글리코PEG화 EPO 펩티드의 활성은 그 하이퍼 글리코실화 EPO 변이체와 유사하였다.

실시예 14

재조합 키메라(chimeric) EPO 리셉터에 동위원소 라벨링을 한 EPO의 결합 억제를 비 PEG화 EPO(A 및 B) 및 글리코PEG화 30킬로달톤 및 40킬로달톤 PEG 변이체의 여러 가지의 농도에 의해 실시하였다.

리셉터 친화성(Ki)은 비 PEG화 EPO와 글리코PEG화 변이체에 있어서 유사하였다.

여기서 설명한 실시예와 예는 본 발명의 목적만을 위하여 설명한 것이며, 본 발명의 목적을 달성하기 위한 여러 가지의 변경 및 변형은 이 분야의 기술자에 의해 가능하다는 것을 암시하며, 첨부 청구범위내와 이 특허출원의 범위내에서 포함한다는 것을 알 수 있다.

여기서 인용한 모든 참고 간행물, 특허 및 특허출원은 본 발명의 목적을 위해 참고로 편집하여 기재한 것이다.

Claims (34)

1. 다음 구조의 성분으로 이루어진 에리트로포이에틴 펩티드(erythropoietin peptide).

   

   위 구조에서,

   D는 -OH와 R¹-L-HN-에서 선택한 하나의 멤버이고;

   G는 R¹-L- 와 -C(O)(C₁-C₆)알킬에서 선택한 하나의 멤버이며,

   R¹은 직쇄 또는 분기 폴리(에틸렌 글리콜)잔기로 이루어진 하나의 성분을 선택한 하나의 멤버로 이루어진 하나의 성분이고,

   L은 D가 OH일 때 G가 R¹-L- 이고, G가 -C(0)(C₁-C₆)알킬일 때 D가 R¹-L-NH- 가 되도록, 하나의 결합(bond), 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버인 링커(linker)이다.
2. 제 1항에 있어서,

   L-R¹은 다음 식을 가짐을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   

   위 식에서,

   a는 0 ~ 20의 정수이다.
3. 제 1항에 있어서,

   R¹은 아래에 나타낸 구조에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가짐을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   

   위 구조에서,

   e와 f는 1 ~ 2500에서 독립적으로 선택한 정수이며, q는 0 ~ 20의 정수이다.
4. 제 1항에 있어서,

   R¹은 아래에 나타낸 구조에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가짐을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   

   위 구조에서,

   e,f 및 f'는 1 ~ 2500에서 독립적으로 선택한 정수이고,

   q 및 q'는 1 ~ 20에서 독립적으로 선택한 정수이다.
5. 제 1항에 있어서,

   R¹은 아래에 나타낸 구조에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가짐을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   

   위 구조에서,

   e, f 및 f'는 1 ~ 2500에서 독립적으로 선택한 정수이고,

   q, q' 및 q''는 1 ~ 20에서 독립적으로 선택한 정수이다.
6. 제 1항에 있어서,

   R¹은 아래에 나타낸 구조에서 선택한 하나의 멤버(member)인 구조를 가진 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   

   위 구조에서,

   e 및 f는 1 ~ 2500에서 독립적으로 선택한 정수이다.
7. 제 1항에 있어서,

   상기 성분(moiety)은 아래에 나타낸 식을 가진 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   
8. 제 1항에 있어서,

   상기 성분(moiety)은 아래에 나타낸 식을 가진 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   
9. 제 1항에 있어서,

   상기 성분(moiety)은 아래에 나타낸 식을 가진 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

   

   위 식에서,

   AA는 상기 펩티드의 아미노산잔기(amino acid residue)이다.
10. 제 9항에 있어서,

    상기 아미노산잔기는 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine)에서 선택한 멤버(member)인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
11. 제 10항에 있어서,

    상기 펩티드는 아미노산 서열 SEQ. ID. NO:1을 가진 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
12. 제 11항에 있어서,

    상기 아미노산잔기는 SEQ. ID. NO:1의 위치 126에 있는 세린인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
13. 제 1항에 있어서,

    상기 펩티드는 아래에 나타낸 식에서 선택한 하나의 식에 의한 상기 성분 중 최소 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

    

    위 식에서,

    AA는 상기 펩티드의 아미노산잔기이고,

    t는 0 또는 1의 정수이다.
14. 제 13항에 있어서,

    상기 아미노산잔기는 아스파라긴잔기(asparagine residue)인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
15. 제 14항에 있어서,

    상기 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가지며,

    상기 아미노산잔기는 N24, N38, N83 및 그 결합에서 선택한 하나의 멤버(member)인 아스파라긴잔기(asparagine residue)인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
16. 제 1항에 있어서,

    상기 펩티드는 아래에 나타낸 식에 의한 상기 성분 중 최소 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포리에틴 펩티드.

    

    위 식에서,

    AA는 상기 펩티드의 아미노산잔기이고, t는 0 또는 1의 정수이다.
17. 제 16항에 있어서,

    상기 아미노산잔기는 아르기닌잔기(arginine residue)인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
18. 제 17항에 있어서,

    상기 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가지며, 상기 아미노산잔기는 N24, N38, N83 및 그 결합에서 선택한 하나의 멤버(member)인 아스파라긴잔기인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
19. 제 1항에 있어서,

    상기 펩티드는 아래에 나타낸 식에서 선택한 하나의 식에 의한 상기 성분 중 최소 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

    

    

    

    위 식에서,

    AA는 상기 펩티드의 아미노산잔기이고,

    t는 0 또는 1의 정수이다.
20. 제 1항에 있어서,

    상기 펩티드는 아래에 나타낸 식에서 선택한 하나의 식에 의한 상기 성분 중 최소 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.

    

    

    

    위 식에서,

    AA는 상기 펩티드의 아미노산잔기이고,

    t는 0 또는 1의 정수이다.
21. 제 20항에 있어서,

    상기 아미노산잔기는 아스파라긴잔기인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
22. 제 21항에 있어서,

    상기 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가지며,

    상기 아미노산잔기는 N24, N38, N83 및 그 결합에서 선택한 하나의 멤버(member)인 아스파라긴잔기임을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
23. 제 1항에 있어서,

    상기 펩티드는 생체활성 에리트로포이에틴 펩티드(bioactive erythropoietin peptide)인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
24. 제 23항에 있어서,

    상기 펩티드는 에리트로포이에틴(erythropoietin)에 의한 활성인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
25. 제 24항에 있어서,

    상기 펩티드는 주로 비에리트로포이에틴(non-erythropoietin)에 의한 활성인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
26. 제 25항에 있어서,

    상기 펩티드는 조직 보호성(tissue protective)인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 펩티드.
27. 아래에 나타낸 성분(moiety)으로 이루어진 PEG화 에리트로포이에틴(PEG-ylated erythopoietin)의 제조방법에 있어서,

    아래에 나타낸 글리코실 성분으로 이루어진 기질 에리트로포이에틴 펩티드(substituted erythopoietin peptide)를 아래에 나타낸 식을 가진 PEG-시알산도 너 성분(PEG-sialic acid donor moiety) 및 상기 글리코실 성분의 Gal 상에 상기 PEG-시알산을 전이하는 효소와 함께 그 전이에 적합한 조건하에서 접촉하는 단계(step)(a)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.

    

    (PEG화 에리트로포이에틴 성분)

    위 성분에서,

    R¹은 직쇄 또는 분기 폴리(에틸렌 글리콜)잔기로 이루어진 하나의 성분이며,

    L은 치환 또는 비치환 알킬과 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버(member)인 링커(linker)이다.

    

    (글리코실 성분)

    

    (PEG-시알산 도너 성분)
28. 제 27항에 있어서,

    상기 단계(a)를 밟기 전에, 상기 기질 에리트로포이에틴 펩티드를 적합한 숙주(host)에서 발현하는 단계(b)를 추가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
29. 제 28항에 있어서,

    상기 숙주는 곤충 세포와 포유동물 세포에서 선택하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
30. 제 29항에 있어서,

    상기 곤충세포는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 셀라인(cell line)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
31. 필요할 때 피검자의 이감염성 적혈구 생성(compromised red blood cell production)에 특징이 있는 상태를 치료하는 방법에 있어서,

    상기 피검자의 상태를 회복하는데 유효한 제 1항의 펩티드의 량을 피검자에 투여하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 포유동물에서 적혈구 생성을 증강하는 방법에 있어서,

    상기 포유동물에 제 1항에 의한 펩티드를 투여하는 스텝으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 허혈(ischemia), 외상(trauma), 염증(inflammation) 또는 독성물질과의 접촉에서 얻어지는 손상에 특징이 있는 피검자의 조직손상을 치료하는 방법에 있어서,

    상기 피검자의 조직손상과 관련된 상해(damage)를 회복하는데 유효한 제 1항에 의한 에티프로포이에틴 펩티드(erythropoietin peptide)의 양을 상기 피검자에 투여하는 스텝으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 1항에 의한 에리트로포이에틴 펩티드(erythropoietin peptide)와 의약상 허용할 수 있는 캐리어(carrier)로 이루어지는 의약 조성물.

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