MXPA06005732A - Eritropoyetina glucopegilada. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona conjugados entre eritropoyetina y porciones PEG. Los conjugados se enlacen por medio de un grupo de enlace de glucosilo intacto interpuesto entre y covalentemente enlazado al peptido y el grupo de modificacion. Los conjugados se forman a partir de peptidos glucosilados por la accion de una glucosiltransferasa. La glucosiltransferasa enlace una porcion de azucar modificada en un residuo de glucosilo en el peptido. Tambien se proporcionan metodos para preparar los conjugados, metodos para tratar varias condiciones de enfermedad con los conjugados, y formulaciones farmaceuticas que incluyen los conjugados.

Description

ERITROPOYETINA GLUCOPEGILADA Campo de la Invención La eritropoyetina (EPO) es una citocina producida por el higado y riñon que actúa en las células madre hematopoyéticas para estimular la producción de células de glóbulos rojos. La proteina se presenta en dos formas: una es un péptido de 165 aminoácidos, y la otra es una péptido de 166 aminoácidos. El péptido de 166 aminoácidos tiene la misma secuencia como el péptido de 165 aminoácidos excepto que el péptido de 166 aminoácidos tiene una arginina adicional en la posición más de C-terminal. El péptido de 165 aminoácidos maduro es una glucoproteina de 34kD que comprende tres sitios de N-glucosilación (Asn-24, Asn-38, y Asn-83) , y 1 sitio de 0-glucosilación (Ser-126) , y algunas variantes son "hiperglucosiladas" que comprenden sitios de glucosilación enlazados a N.

Antecedentes de la Invención La síntesis de eritropoyetina se induce por condiciones que crean efectivamente hipoxia de tejido, tal como reducción de la tensión arterial de 02 o incremento de la afinidad de oxigeno de la sangre. Bajo condiciones usuales de homeostasis, el hematocrito y la concentración de hemoglobina en la sangre se mantienen constantes con la' eritropoyesis Ref.: 172898 contrabalanceando la destrucción permanente de células de glóbulos rojos añejadas por macrófagos en la médula ósea, bazo e hígado. Cuantitativamente, alrededor de 1% de la masa de células rojas, que es de alrededor de 2-3 x 1011 de células de glóbulos rojos, se renuevan cada dia. Sin embargo, en situaciones que generan efectivamente hipoxia de tejido, tal pérdida sanguínea o ubicación a altitudes superiores, la inducción de EPO puede estimular la eritropoyesis 10 veces o más sobres los niveles normales. Debido a que la EPO estimula la producción de células de glóbulos rojos, esta es una terapia efectiva para muchas enfermedades y condiciones asociadas con hematocrito reductors . Los ensayos iniciales de terapia de reemplazo con EPO' humana recombinante para restaurar el hematocrito en pacientes con insuficiencia renal en etapa terminal se reportaron primera hace 20 años (ver por ejemplo, Winearls, C. G.; et al. (1986) Lancet, 2, 1175-1178, y Eschbach, J. . ; et al. (1987) N. Engl. J. Med., 316, 73-78). Este trabajo proporciona un impulso para estudios adicionales en la patofisiologia y farmacología de la EPO (ver por ejemplo, Jelkmann, W. and Gross, A. (1989) Erythropoietin; Springer, Berlin Heidelberg New York) . Desde aquellos estudios previos, la EPO recombinante humana se ha usado exitosamente para tratar numerosas condiciones patológicas. Por ejemplo, la aplicación farmacológica de EPO humana recombinante a pacientes en cirugía puede reducir la severidad y duración de anemia posterior a la operación. La administración de EPO humana recombinante también se ha comprobado que es una terapia efectiva para pacientes que padecen de varias enfermedades no renales, tales como inflamación crónica, malignidad y SIDA, en donde un carencia relativa de EPO endógena contribuye al desarrollo de anemia (ver por ejemplo, Means, R. T. and Krantz, S. B. (1992) Blood, 80, 1639-1647, y Jelkmann, W. (1998) J. Interf. Cytokine Res., 18, 555-559).

Adicionalmente, se ha reportado que la EPO protege al tejido en lesiones isquémicas, traumáticas, tóxicas e inflamatorias (ver por ejemplo, Brines M. , et al. (2004) PNAS USA: 101:14907-14912 y Brines, M. L., et al. (2000). Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 10526-10531). La utilidad y efectividad de la EPO para el tratamiento de anemias y otras condiciones que surgen de tal amplia variedad de causas, hace a la EPO humana recombinante quizá el mejor fármaco vendido en el mundo. Verdaderamente, la cantidad de ventas estimadas es más de 5 mil millones de dólares americanos por año. Sólo una EPO humana recombinante, producida en linea celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) , se usa extensivamente como un terapéutico. Ya que los mamíferos todos producen glicanos de estructura similar, el Ovario de Hámster Chino (CHO) , Riñon de Hámster Bebe (BHK) , y Riñon Embriónico Humano-293 (HEK-293) son las células hospedadoras preferidas para la producción de terapéuticos de glucoproteina. Como se conoce en la técnica, la glucosilación apropiada es un factor clínicamente importante que tiene influencia in vivo en la vida media e inmungenicidad de péptidos terapéuticos. Verdaderamente, las proteínas pobremente glucosiladas se conocen por el higado como que son "viejas" y de esta manera, son eliminadas más rápidamente del cuerpo que las proteínas glucosiladas apropiadamente. Desafortunadamente, un aspecto frustrante, y bien conocido, de la glucosilación de proteina es el fenómeno de microheterogenicidad. De esta manera, las células hospedadoras preferidas para la producción de glucoproteinas terapéuticas humanas tales como EPO, típicamente produce péptidos que comprenden un rango de variaciones en la estructura precisa del glicano. La extensión de esta heterogenicidad puede variar considerablemente de sitio de glucosilación a sitio de glucosilación, de proteina a proteina, y de tipo de célula a tipo de célula. Por lo tanto, numerosas glucoformas, cada una de las cuales es efectivamente una especie molecular distinta, típicamente existe en cualquier preparación de glucoproteina dada. El problema de microheterogenicidad posee asi numerosos problemas para la producción industrial a gran escala de glucoproteinas terapéuticas. En particular, ya que cada glucoforma puede representar una especie molecular distinta, preparaciones de glucoproteinas terapéuticas deberán fraccionarse para purificarse la glucoforma sencilla deseada. Las complicaciones adicionales que surgen del hecho de que los lotes de producción diferentes pueden variar con respecto al porcentaje de la glucoforma deseada que comprende el lote de glucoproteina terapéutica. De esta manera, no siempre las porciones predecibles, grandes, de cada preparación pueden descartarse, de manera que al último el rendimiento final de la glucoforma deseada puede ser bajo. En general, el problema de microheterogenicidad significa que los glucopéptidos terapéuticos producidos por cultivo de células de mamífero requieren costos de producción mayores, lo que al final se traduce en costos de cuidado de salud más altos que puede ser necesariamente si un método más eficiente para hacer más duradera, terapéuticos de glucoproteina más efectivos disponibles . Una solución al problema de proporcionar terapéuticos de glucopéptido de costo efectivo es proporcionar péptidos con vidas medias in vivo más largas. Por ejemplo, los terapéuticos de glucopéptido con propiedades farmacocinéticas mejoradas se han producido al enlazar polímeros sintéticos a la estructura de péptido. Un polímero ejemplar que se ha conjugado a los péptidos es poli (etilen glucol) ("PEG"). El uso de PEG para derivar terapéuticos de péptido se ha demostrado que reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la Patente E.U.A. No. 4,179,337 (Davis et al.) describe polipéptidos no in unogénicos tales como enzimas y hormonas de péptido acopladas al polietilen glucol (PEG) o polipropilen glucol. Además de reducir la inmunogenicidad, el tiempo de liberación en circulación se prolonga debido al tamaño incrementado del conjugado PEG de los polipéptidos en cuestión. El principal modo de enlace del PEG, y sus derivados, para péptidos es un enlace no especifico a través del residuo de aminoácido péptido (ver por ejemplo, Patente E.U.A. No. 4,088,538, Patente E.U.A. No. 4,496,689, Patente E.U.A. No. 4,414,147, Patente E.U.A. No. 4,055,635, y PCT WO 87/00056). Otro modo de enlazar PEG a péptidos es a través de la oxidación no especifica de residuos de glucosilo en un glucopéptido (ver por ejemplo, WO 94/05332). En estos métodos no específicos, el poli (etilenglucol) se agrega en una manera no especifica, aleatoria a los residuos reactivo en la estructura de péptido. Por supuesto, la adición aleatoria de moléculas PEG tiene sus desventajas, incluyendo la carencia de homogenicidad del producto final, y la posibilidad de reducción en la actividad biológica o enzimática del péptido. Por lo tanto, para la producción de péptidos terapéuticos, una estrategia de derivación que resulte en la formación de un producto esencialmente homogéneo, rápidamente caracterizable, específicamente etiquetado, es superior. Tales métodos se han • desarrollado . Los terapéuticos de péptido homogéneos, específicamente etiquetados, pueden producirse in vitro a través de la acción de las enzimas. Al contrario de los métodos no específicos típicos para enlazar un polímero sintético u otra etiqueta al péptido, las sintasas basadas en enzima tienen las ventajas de regioselectividad y estereoselectividad. Dos clases principales de enzimas para usarse en la síntesis de péptidos etiquetados son glucosiltransferasas (por ejemplo, sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas) , y glucosidasa. Estas enzimas pueden usarse para el enlace especifico de azúcares que pueden posteriormente modificarse para comprender una porción terapéutica. Alternativamente, las glucosiltransferasas y glucosidasas modificadas pueden usarse para transferir directamente azúcares modificados a una estructura de péptido (ver por ejemplo, Patente E.U.A. No. 6,399,336, y Publicaciones de Solicitud de Patente E.U.A. 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838, y 20040142856, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia) . Los métodos que combinan elementos tanto químicos como enzimáticos sintéticos también se conocen (ver por ejemplo, Yamamoto et al. Carbohydr Res. 305: 415-422 (1998) y Publicación de Solicitud de Patente E.U.A. 20040137557 que se incorpora en la presente para referencia) . La eritropoyetina (EPO) es un péptido terapéutico extremadamente valioso. No obstante que las formas comercialmente disponibles de EPO están en uso actualmente, estos péptidos son menos que máximamente efectivos debido a los factores que incluyen microheterogenicidad del producto de glucoproteína que incrementa los costos de producción, farmacocinéticos pobres del producto de glucoproteina aislado resultantes, o una combinación de los dos. De esta manera, queda una necesidad en la técnica para péptidos EPO de larga duración con efectividad mejorada y mejores farmacocinéticos. Adicionalmente, ser efectivos más el números más grande de individuos, ser posible de producir, en una escala industrial, un péptido EPO con farmacocinéticos terapéuticos mejorados que tengan una estructura predecible, esencialmente homogénea, que pueden reproducirse rápidamente una, y otra vez . Afortunadamente, ahora se han descubierto péptidos EPO que mejoran la efectividad terapéutica y métodos para hacerlos. Efectivamente, la invención proporciona péptidos EPO con farmacocinéticos mejorados. La invención también proporciona métodos efectivos en costo e industrialmente practicables para la producción de péptidos EPO modificados. Los péptidos EPO de la invención comprenden grupos modificados tales como porciones PEG, porciones terapéuticas, biomoléculas y los similares. La presente invención por lo tanto cubre la necesidad para péptidos EPO con la efectividad terapéutica y farmacocinéticos mejorados para el tratamiento de condiciones y enfermedades en donde la EPO proporciona una terapia efectiva.

Breve Descripción de la Invención Se describirá ahora que la modificación de eritropoyetina (EPO) con una o más porciones poli (etilen glucol) proporciona derivados de EPO novedosos con propiedades farmacocinéticas mejoradas. Adicionalmente, los métodos efectivos costosos para la producción confiable de los péptidos EPO modificados de la invención sean descubierto y desarrollado. En un aspecto, la presente invención proporciona un péptido de etitropoyetina que comprende la porción: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R1-L- HN-; G es un miembro seleccionado de R1-L- y -C (O) alquilo (C].-C6) ; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado, una porción que comprende un residuo de poli (etilen glucol) de cadena recta o ramificada; y L es un enlacendo el cual es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo substituido o no substituido y heteroalquilo substituido o no substituido, tal que cuando D es OH, G es R1-L- y cuando G es -C (0) alquilo (Ci-C6) , D es RX-L-NH- . En una modalidad, un R1-L tiene la fórmula : en donde a es un entero desde 0 hasta 20. En otra modalidad, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500; y q es un entero desde 1 hasta 20. En otras modalidades R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500; y q y q' son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 20. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un péptido en donde R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500; y q, q' y q" son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 20. En otras modalidades, R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: |—C(0)CH2CH2(OCH2CH2}fOCH3 *, y ~C{ OCH2CH2{ CH2CH2)fOCH3 en donde e y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500. En otro aspecto, la invención proporciona un péptido que comprende una porción que tiene la fórmula: En otras modalidades, la porción tiene la fórmula: En otra modalidad ejemplar el péptido que comprende una porción de conformidad a la fórmula en donde AA es un residuo de aminoácido del péptido. En algunas modalidades el residuo de aminoácido es un miembro seleccionado de serina, treonina y tirosina. En una modalidad preferida el residuo de aminoácido es una serina en la posición 126 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona un péptido de eritropoyetina en donde el péptido comprende al menos una porción que tiene la fórmula: en donde t es un entero desde igual a 0 ó 1. Asi, en esta modalidad, la porción de ácido siálico modificado puede presentarse en cualquier ramificación de la estructura biantenaria. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona un péptido de eritropoyetina en donde el péptido comprende al menos una porción que tiene la fórmula: En otra modalidad, la invención proporciona un péptido de eritropoyetina en donde el péptido comprende al menos una porción que tiene una fórmula de conformidad a: En esta modalidad, la porción de ácido siálico modificado puede presentarse en cualquiera de una o más de las ramificaciones de la forma de la estructura triantenaria. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un péptido de eritropoyetina en donde el péptido comprende al menos una porción que tiene la fórmula: En esta modalidad, la porción de ácido siálico modificado puede presentarse en cualquiera de una o más de las ramificaciones de la estructura tetra antenaria. En otro aspecto la invención proporciona un péptido de eritropoyetina que es un péptido de eritropoyetina bioactivo. En una modalidad, el péptido de eritropoyetina es eritropoyéticamente activo. En otra modalidad, el péptido de eritropoyetina no es esencialmente eritropoyéticamente activo. En otra modalidad, el péptido de eritropoyetina es protector del tejido. En otro aspecto, la invención proporciona un método para hacer una eritropoyetina PEG-ilada que comprende la porción: en donde R1 es una porción que comprende un residuo de poli (etilen glucol) de cadena recta o ramificada; y L es un enlazador el cual es un miembro seleccionado de alquilo substituido o no substituido y heteroalquilo substituido o no substituido. El método comprende poner en contacto un péptido de eritropoyetina de substrato que comprende la porción glucosilada: Gal ? con una porción donadora de ácido PEG-siálico que tiene la fórmula: y una enzima que transfiere el ácido PEG-siálico en el Gal de la porción de glucosilo, bajo condiciones apropiadas para la transferencia. En una modalidad, el péptido de eritropoyetina se expresa en un hospedador adecuado. En una modalidad el hospedador es una célula de mamífero, y en otra modalidad la células hospedadora es una célula de insecto. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición en un sujeto que necesita del mismo, en donde la condición se caracteriza por comprometer la producción de células de glóbulos rojos en el sujeto. El método comprende la etapa de administrar a el sujeto una cantidad del péptido de eritropoyetina de la invención efectiva o para aliviar la condición en el sujeto. En otro aspecto, la invención proporciona un método para elevar la producción de células de glóbulos rojos en un mamífero. El método comprende administrar a el mamífero una cantidad del péptido de eritropoyetina de la invención efectiva para elevar la producción de células de glóbulos rojos en el mamífero. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una lesión de tejido en un sujeto que necesite del mismo, la lesión se caracteriza por el daño resultante a partir de la isquemia, trauma, inflamación o contacto con substancias tóxicas, el método comprende la etapa de administrar a el sujeto una cantidad de un péptido de eritropoyetina de la invención efectivo para aliviar la lesión de tejido en el sujeto. En otro aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el péptido de eritropoyetina de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En los conjugados de eritropoyetina enlazados a O de la invención, esencialmente cada uno de los residuos de aminoácido a los cuales se enlaza tienen la misma estructura. Por ejemplo, si uno de los péptidos incluye un residuo de glucosilo enlazado a Ser, al menos alrededor de 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, o más preferiblemente 99.8% de los péptidos en la población que tienen el mismo residuo de glucosilo convalentemente enlazado al mismo residuo Ser. Otros objetivos y ventajas de la invención serán aparentes por aquellos de habilidad en el arte para la descripción detallada que sigue.

Breve Descripción de las Figuras FIG. 1. La figura 1 ilustra algunos ejemplos de nucleótidos de azúcar modificados útiles en la práctica de la invención. FIG. 2. La figura 2 ilustra además nucleótidos de azúcar modificados ejemplares útiles en la práctica de la invención. FIG. 3A-3B. La figura 3A-3B ilustran nucleótidos de ácido siálico modificados ejemplares útiles en la práctica de la invención. FIG. 3A: Estructura de 40 ilodaltones CMP-Ácido siálico-PEG. FIG. 3B: Estructura de 30 kilodaltones CMP-Ácido siálico-PEG. FIG. 4A-4B. , Las figuras 4A-4B presentan una representación esquemática de isoformas EPO glucopegiladas ejemplares aisladas de células ovario de hámster chino.

Figura 4A. Una glucoforma pegilada enlazada a O de 40 ejemplar. Figura 4B: Una de diversas glucoformas pegiladas enlazadas a N de 30 kilodatones. La porción de ácido siálico modificado que comprende la molécula PEG, puede presentarse en cualquiera de una o más de cualesquiera de las ramificaciones del residuo glucosilado enlazado a N. Además la ilustración es ejemplar en que cualquiera de las moléculas EPO glucosiladas pueden comprender cualquier mezcla de residuos de glucosilo enlazados a N mono, bi, tri o tetra- antenarios y cualesquiera de una o más de las ramificaciones pueden además comprender una porción de ácido siálico modificado de la invención. FIG. 5. La figura 5 ilustra un péptido EPO derivado de CHO ejemplar en su forma no glucopegilada. Como se discute en las Figuras 4A-4B (arriba) la ilustración es ejemplar en que cualquier molécula EPO glucosilada comprende cualesquiera mezcla de residuos de glucosilo enlazados a N mono, bi, tri o tetra antenarios. FIG. 6. La figura 6 muestra los resultados de los experimentos comparando los farmacocinéticos de dos formas EPO no glucopegiladas derivadas de CHO, y dos formas EPO glucopegiladas derivadas de CHO. FIG. 7. La figure 7 ilustra un péptido EPO glucopegilado derivado de insecto de conformidad con la invención. FIG. 8. La figura 8 muestra los resultados de los experimentos comparando los farmacocinéticos de una forma EPO no glucopegilada derivada de CHO, una forma EPO no glucopegilada derivada de insecto con sus formas glucopegiladas correspondientes. FIG. 9. La figura 9 muestra las actividades relativas de dos formas de EPO no glucopegiladas (A y B) contra dos variantes glucoPEGiladas (las variantes de 30 kilodaltones y 40 kilodaltones de las figuras 4 A y 4 B) y una variante EPO hiperglucosiladad en proliferación estimulante de células TF11 que portan el receptor EPO en cultivo. FIG. 10. La figura 10 muestra la inhibición del enlace de EPO etiquetados de isótopo a un receptor EPO quimérico recombinante por diversas concentraciones de dos variantes EPO no pegiladas (A y B) y dos variantes glucoPEGiladas (las variantes de 30 kilodaltones y 40 kilodaltones de las figuras 4 A y 4 B) .

Descripción Detallada de la Invención y las Modalidades Preferidas Abreviaturas PEG, poli (etilenglucol) ; PPG, poli (propilenglucol) ; Ara, arabinosilo; Fru, fructosilo; Fue, fucosilo; Gal, galactosilo; N-acetilgalactosaminilo; Glc, glucosilo; GlcNAc, N-acetilglucosaminilo; Man, manosilo; ManAc, acetato de manosaminilo; Xil, xilosilo; y NeuAc, sialil (N-acetilneuraminilo) ; M6P, manosa-6-fosfato .

Definiciones A menos de que se indique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente generalmente tienen el mismo significado como comúnmente se entiende por alguien de habilidad ordinaria en el arte al cual esta invención pertenece. Generalmente, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio en cultivo de célula, genética molecular, química orgánica y química de ácido nucleico e hibridización son aquellos conocidos y comúnmente empleados en el arte. Las técnicas estándar son usadas por ácidos nucleico y síntesis de péptido. Las técnicas y procedimientos generalmente se llevan a cabo de conformidad a métodos convencionales en el arte y diversas referencias generales (ver generalmente, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., los cuales se incorporan en la presente como referencia), los cuales se proporcionan a través de este documento. La nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio en química analítica y síntesis orgánica son aquellos bien conocidos y comúnmente empleados en el arte. Las técnicas estándar o modificaciones de los mismos, son usadas por síntesis química y análisis químico. Todos los oligosacáridos descritos en la presente se describen con el nombre o abreviatura por el sacárido no reductor (esto es, Gal) , seguido por la configuración del enlace glucosidico (a o ß) , el enlace de anillo (1 ó 2) , la posición .en el anillo del sacárido reductor involucrado en el enlace (2, 3, 4, 6 ó 8), y luego el nombre o abreviatura del sacárido reductor (esto es, GlcNAc) . Cada sacárido es preferiblemente una piranosa. Para una revisión de nomenclatura glucobiológica estándar ver, Essentials of Glycobiology Varki et eds. CSHL Press (1999). Los oligosacáridos se consideran que tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, si o no el sacárido al extremo reductor es en efecto un azúcar reductor. De conformidad con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se detallan en la presente con el extremo no reductor en el lado izquierdo y el extremo reductor en el lado derecho. El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia de ácido siálico es ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3, 5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-onico (frecuentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc, o NANA) . Un segundo miembro de la familia es ácido N-glucolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc se hidroxila. Un tercer miembro de la familia de ácido siálico es ácido • 2-ceto-3-deoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori 265: 21811-21819 (1990) ) . También se incluyen ácido 9 substituido siálico tales como 9-0-C?-C6 acil-Neu5Ac tipo 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-deoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-deoxi-Neu5Ac. Para revisión de la familia de ácido siálico, ver por ejemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992) ; Acids Sialic: Chemistry, Metabolism and Function, R.

Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992) ) . La síntesis y uso de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se discute en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de Octubre de 1992. El "péptido" se refiere a un polímero en el cual los monómeros son aminoácidos y se unen juntos a través de enlaces amida, alternativamente se refieren como un polipéptido. Adicionalmente, los aminoácidos no naturales, por ejemplo, ß-alanina, fenilglicina y homoarginina también se incluyen. Los aminoácidos que no son codificados por el gen también pueden usarse en la presente invención. Además, los aminoácidos que se modifican para incluir los grupos reactivos, sitios de glucosilación, polímeros, porciones terapéuticas, biomoléculas y similares pueden también usarse en la invención. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser ya sea el isómero D o L. El isómero L es generalmente preferido. Además, otros peptidomiméticos son también útiles en la presente invención. Como se usa en la presente "péptido" se refiere a péptidos tanto glucosilados como no glucosilados. También se incluyen péptidos que se glucosilan incompletamente por un sistema que expresa el péptido. Para una revisión general, ver Spatola, A. F. , in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983) .

El término "péptido conjugado" se refiere a especies de la invención en las cuales un péptido es conjugado con un azúcar modificado como se estable adelante en la presente . El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan naturalmente y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y aminoácidos miméticos que funcionan en una manera similar a los aminoácidos que se presentan naturalmente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados al final, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácidos que se presenta naturalmente, esto es, un carbono a que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tiene grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras de péptido modificadas, pero retiene la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta naturalmente. Los aminoácidos miméticos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura de química general de un aminoácido, pero que funcionan en una manera similar a un aminoácido que se presenta naturalmente. Como se usa en la presente, el término "azúcar modificado", se refiere a un carbohidrato que se presenta naturalmente o no naturalmente que se agrega enzimáticamente en un aminoácido o un residuo de glucosilo de un péptido en un proceso de la invención. El azúcar modificado se selecciona de un número de substratos de enzima incluyendo, pero no limitando a nucleótidos de azúcar (mono, di y trifosfatos) , azúcares activadas (por ejemplo, haluros de glucosilo, mesilatos de glucosilo) y azúcares que ni son activados ni nucleótidos. El "azúcar modificado" es covalentemente funcionalizado con un "grupo de modificación". Los grupos modificados útiles incluyen, pero no se limitan a, porciones PEG, porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, biomoléculas y similares. El grupo de modificación no es preferiblemente un grupo que se presenta naturalmente o un carbohidrato no modificado. La ubicación de la funcionalización con el grupo de modificación seleccionado de tal manera que no previene que el "azúcar modificado" se agregue enzimáticamente al péptido. El término "soluble en agua" se refiere a las porciones que tiene algún grado detectable o solubilidad en el agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad del agua son conocidos en el arte. Los polímeros solubles en agua ejemplares incluyen péptidos, sacáridos, poli (éteres) , poli (aminas) , ácido poli (carboxílicos) y similares. Los péptidos que tiene secuencias mezcladas de compuesto de un aminoácido sencillo, por ejemplo, poli (lisina) . Un polisacarido ejemplar es ácido poli (siálico) . Un poli (éter) ejemplar es poli (etilen glucol) . La poli (etilen amina) es una poliamina ejemplar, y el ácido poli (acrílico) es un ácido poli (carboxilico) representativo. La estructura de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli (etilen glucol) (esto es, PEG). Sin embargo, se debe entender que otros polímeros relacionados son también adecuados para el uso en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (etilen glucol) se pretende que sea incluyente y no exclusivo en este respecto. El término PEG incluye poli (etilen glucol) en cualquier de sus formas, incluyendo PEG alcoxi, PEG difuncional, PEG multiextremidades, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendiente (esto es, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales pendientes a la estructura del polímero), o PEG con enlaceduras degradables en este. La estructura de polímero pueden ser lineal o ramificada. Las estructuras de polímero ramificadas son generalmente conocidas en el arte. Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción de núcleo ramificado central y una pluralidad de cadena de polímero lineales enlacedas al núcleo ramificado central. El PEG se usa comúnmente en sus formas ramificadas que pueden prepararse por la adición de óxido de etileno o diversos polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción ramificada central puede ser derivada de diversos aminoácidos, tales como lisina. El poli (etilen glucol) ramificado puede representarse en forma general como R(-PEG-OH)m en el cual R representa la porción del núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de extremidades. Las moléculas PEG multi-extremidades, tales como aquellas descritos en la patente E.U.A. No. 5,932,462, la cual se incorpora para referencia en la presente en su totalidad, puede también usarse como la estructura de polímero. Muchos otros polímeros son también adecuados para la invención. Las estructuras de polímeros que no son péptidos y solubles en agua, con desde 2 hasta alrededor de 300 términos, son particularmente útiles en la invención. Los ejemplos de polímero adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquilen glucoles) , tales como poli (propilen glucol) ("PPG") , copolímeros de etilen glucol y propilen gluco y similares, poli (poliol oxietilado) , alcohol poli (olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxipropilmetacrilamida) , ácido poli (a-hidroxi) , alcohol poli (vinilo) , polifosfaceno, polioxizolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,629,384, la cual se incorpora para referencia en la presente en su totalidad, y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos. No obstante que el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero puede variar, típicamente está en el rango desde alrededor de 100 Da hasta alrededor de 100,00 Da, frecuentemente desde alrededor de 6,00 Da hasta alrededor de 80,000 Da. El "área bajo la curva" o "AUC" como se usa en la presente en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el área total bajo la curva que describe la concentración del fármaco en circulación sistémica en el paciente como una función de tiempo desde cero hasta infinito. El término "vida media" o "tl/2", como se usa en la presente en el contexto de administrar un, fármaco de péptido a un paciente, se define como el tiempo requerido para la concentración del plasma de un fármaco en un paciente para reducirse a la mitad. Hay más de una vida media asociada con el fármaco de péptido dependiendo en mecanismos de liberación múltiple, redistribución, y otros mecanismos como bien conocidos en el arte. Usualmente, las vidas medias alfa y beta se definen de tal manera que la fase alfa se asocia con la redistribución, y la fase beta se asocia con liberación. Sin embargo, con los fármacos de proteína que son, para la mayor parte, confinados al torrente sanguíneo, puede haber al menos dos vidas medias de liberación. Para algunos péptidos glucosilados, la liberación de fase beta rápida puede ser mediada por receptores en macrofagos, o células endoteliales que reconocen la galactosa terminal, N-acetilgalactosamina, N- acetilglucosamina, mañosa o fucosa. La liberación de fase beta más lenta puede presentarse por medio de filtración glomerular renal para moléculas con un radio efectivo <2 nm (aproximadamente 68 kD) y/o absorción especifica o no especifica y metabolismo en tejidos. La glucoPEGilación puede tapar azúcares terminales (por ejemplo, galactosa o N-acetilgalactosamina) y por ello bloquear la liberación de la fase alfa rápida por medio de receptores que reconocen estas azúcares. Esto puede también conferir radios efectivos más grandes y por ello reducir el volumen de distribución y absorción en tejidos, por ello prolongando la última fase beta. Así, el impacto preciso de glucoPEGilación en las vidas medias de fase alfa y fase beta variará dependiendo del tamaño, estado de glucosilación y otros parámetros, como es bien conocido en el arte. La explicación adicional de "la vida media" se encuentra en Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101- 120). El término "glucoconjugación" como se usa en la presente, se refiere a la conjugación mediada enzimáticamente de una especie de azúcar modificada a un aminoácido o residuo de glucosilo de un polipéptido, por ejemplo, un péptido de eritropoyetina de la presente invención. Un subgénero de "glucoconjugación" es "gluco-PEGilación", en el cual el grupo de modificación del azúcar modificado es poli (etilen glucol), y el derivado de alquilo (por ejemplo, m-PEG) o derivado reactivo (por ejemplo, H2N-PEG, HOOC-PEG) del mismo. Los términos "gran escala" y "escala industrial" se usan intercambiablemente y se refieren a un ciclo de reacción que produce al menos alrededor de 250 mg, preferiblemente al menos alrededor de 500 mg, y más preferiblemente al menos alrededor de 1 gramo de glucoconjugado al completar un ciclo de reacción sencillo. El término, "grupo de enlace de glucosilo", como se usa en la presente se refiere a un residuo glucosilo al cual un grupo de modificación (por ejemplo, porción PEG, porción terapéutica, biomolécula) se enlaza covalentemente; el grupo de enlace de glucosilo une el grupo de modificación al resto del conjugado. En los métodos de la invención, el "grupo de enlace de glucosilo" se vuelve covalentemente enlazado a un péptido glucosilado o no glucosilado, por ello enlacendo el agente a un aminoácido y/o residuo de glucosilo en el péptido. El "grupo de enlace de glucosilo" se deriva generalmente de un "azúcar modificado" por el enlace enzimático del "azúcar modificado" a una aminoácido y/o residuo de glucosilo del péptido. El grupo de enlace de glucosilo puede ser una estructura derivada de sacárido que se degrada durante la formación de cásete de azúcar que modifica el grupo de modificación (por ejemplo, oxidación—»formación de base Schiff—^reducción) , o el grupo de enlace de glucosilo- puede estar intacto. Un "grupo de enlace de glucosilo intacto" se refiere a un grupo enlazado que se deriva de una porción de glucosilo en la cual el monómero de sacárido que enlace el grupo de modificación y al resto del conjugado no se degrada, por ejemplo, oxida, por ejemplo, por metaperyodato de sodio. Los "grupos enlazados a glucosilo intactos" de la invención pueden derivarse de un oligosacárido que se presenta naturalmente por la adición de unidades de glucosilo o la remoción de una o más unidades de glucosilo de una estructura de sacárido precursora. El término "porción de direccionamiento", como se usa en la presente, se refiere a especies que se localizan selectivamente en un tejido o región particular del cuerpo. La localización está mediada por el reconocimiento de determinantes moleculares, tamaño molecular del agente de direccionamiento o conjugado, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas y los similares. Otros mecanismos de direccionamíento de un agente a un tejido o región particular se conocen por aquellos de experiencia en la técnica. Las porciones de direccionamiento ejemplares incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, transíerrina, glucoproteína HS, factores de coagulación, proteínas de suero, ß-glucoproteína, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO y los similares . Como se usa en la presente, "porción terapéutica" significa cualquier agente útil para terapia incluyendo, pero no se limita a, antibióticos, agentes anti-inflamatorios, fármacos anti-tumor, citotoxinas, y agentes radioactivos, "porción terapéutica" incluye profármacos de agentes bioactivos, constructos en los cuales más de una porción terapéutica se enlaza a un portador, por ejemplo, agentes multivalentes . Porción terapéutica también incluye proteínas y constructos que incluyen proteínas. Las proteínas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Factor Estimulante de la Colonia de Granulocitos (GCSF) , Factor Estimulante de la Colonia de Macrófagos de Granulocitos (GMCSF) , Inferieron (por ejemplo, Interferon-a, -ß, -?) , Interleucina (por ejemplo, Interleucina III), proteínas de suero (por ejemplo, Factores VII, Vlla, VIII, IX, y X) , Gonadotropina Coriónica Humana (HCG) , Hormona Estimulante del Folículo (FSH) y Hormona Lutenizante (LH) y proteínas de fusión de anticuerpo (por ejemplo, Receptor del Factor de Necrosis de Tumor ( (TNFR) /proteina de fusión de dominio Fc) ) . Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material, que cuando se combina con el conjugado mantiene la actividad del conjugado y no es reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualesquiera de los portadores farmacéuticos estándar tales como solución salina amortiguada en fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua, y varios tipos de agentes humectantes. Otros portadores también pueden incluir soluciones estériles, tabletas que incluyen tabletas recubiertas y cápsulas. Típicamente, tales portadores contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas vegetales o aceites, gomas, glucoles, u otros excipientes conocidos. Tales portadores también pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales portadores se formulan por métodos convencionales bien conocidos . Como se usa en la presente, "administrar", significa la administración oral, administración como un supositorio, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitonal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutánea, o el implante de un dispositivo de liberación retardada por ejemplo, una bomba mini-osmótica, al sujeto. La administración es por cualquier ruta incluyendo parenteral, y transmucosal (por ejemplo, oral, nasal, vaginal, rectal, o transdermal) . La administración parenteral incluye, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intradermal, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, e intracraneal. Por otro lado, donde la inyección es para tratar un tumor, por ejemplo, apoptosis inducida, la administración puede ser directamente al tumor y/o en los tejidos que rodean al tumor. Otros modos de administración incluyen, pero no se limitan a, el uso de formulaciones liposomales, infusión intravenosa, parches transdermales, etc. El término "aliviar" o "aligerar" se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento de una patología o condición, que incluye cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatir, remisión o disminución de los síntomas o una mejora en el bienestar físico o mental del paciente. Aliviar los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico y/o evaluación psiquiátrica. El término "terapia" se refiere al "tratamiento" o "tratar" de una enfermedad o condición incluye prevenir la enfermedad o condición que se presente en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o exhibe los síntomas de la enfermedad (tratamiento profiláctico) , inhibe la enfermedad (retarda o detiene su desarrollo) , proporciona alivio de los síntomas o efectos colaterales de la enfermedad (incluyendo tratamiento paliativo) , y alivia la enfermedad (causa la regresión de la enfermedad) . El término "cantidad efectiva" o "una cantidad efectiva para" o "una cantidad terapéuticamente efectiva" o cualquier término gramaticalmente equivalente significa la cantidad que, cuando se administra a un animal para tratar la enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento de tal enfermedad. El término "protector de tejido" se refiere a la defensa de un tejido contra los efectos de daño celular que se asocian típicamente con la experiencia por un tejido u órgano de isquemia/hipoxia, trauma, toxicidad y/o inflamación. El daño celular puede llevar a la apoptosis y/o necrosis (esto es, muerte celular tóxica) . De esta manera, un efecto "protector de tejido" efectúa una guardia del tejido de que experimente el grado de apoptosis y/o muerte celular tóxica asociados normalmente con una lesión traumática, inflamatoria, tóxica o isquémica dada. Por ejemplo, la EPO reduce el área de infarto después de una oclusión arterial cerebral media en un modelo de roedor (Siren, A. L. et al. (2001). Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 98, 4044-4049). De esta manera, bajo tales condiciones la EPO proporciona un efecto "protector del tejido" al reducir efectivamente la necrosis y/o apoptosis asociada normalmente con la lesión isquémica (por ejemplo, apoplejía isquémica) . "Protector del tejido" también se refiere a la defensa de un tejido contra los efectos de daño celular y la muerte celular resultante asociada con enfermedades degenerativas tales como retinopatía, o enfermedad neurodegenerativa. El término "aislado" se refiere a un material que está substancialmente o esencialmente libre de componentes, que se usan para producir el material. Para conjugados de péptido de la invención, el término "aislado" se refiere a un material que está substancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan el material en la mezcla usada para preparar el conjugado de péptido. "Aislado" y "puro" se usan intercambiablemente. Típicamente, los conjugados de péptido aislado de la invención tienen un nivel de pureza preferiblemente expresado como un rango. El extremo más bajo del rango de pureza para los conjugados de péptido es de alrededor de 60%, alrededor de 70% o alrededor de 80% y el extremo superior del rango de pureza es de alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90% o más de alrededor de 90%. Cuando los conjugados de péptido son de más de alrededor de 90% puros, sus purezas también se expresan preferiblemente como un rango. El extremo inferior del rango de pureza es de alrededor de 90%, alrededor de 92%, alrededor de 94%, alrededor de 96% o alrededor de 98%. El extremo superior del rango de pureza es de alrededor de 92%, alrededor de 94%, alrededor de 96%, alrededor de 98% o alrededor de 100% de pureza. La pureza se determina por cualquier método reconocido en la técnica de análisis (por ejemplo, intensidad de banda en un gen teñido con plata, electroforesis en gel de poliacrilamida, CLAR, o medios similares) . "Esencialmente cada miembro de la población", como se usa en la presente, describe una característica de la población de conjugados de péptido de la invención en la cual un porcentaje seleccionado de azúcares modificados agregados al péptido se agregan a sitios aceptores idénticos, múltiples en el péptido. "Esencialmente cada miembro de la población" habla de la "homogeneidad" de los sitios en el conjugado péptido a un azúcar modificado y se refiere a los conjugados de la invención, que son al menos alrededor de 80%, preferiblemente al menos alrededor de 90% y más preferiblemente al menos alrededor de 95% homogéneo. "Homogeneidad", se refiere a una consistencia estructural a través de una población de porciones aceptoras a las cuales se conjugan los azúcares modificados. De esta manera, en un conjugado péptido de la invención en el cual cada porción de azúcar modificada se conjuga a un sitio aceptor que tiene la misma estructura como el sitio aceptor al cual cada otro azúcar modificado se conjuga, el conjugado péptido será de alrededor de 100% homogéneo. La homogeneidad se expresa típicamente como un rango. El extremo inferior del rango de homogeneidad para los conjugados de péptido es de alrededor de 60%, alrededor de 70% o alrededor de 80% y el extremo superior del rango de pureza es de alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90% o más de alrededor de 90%. Cuando los conjugados de péptido son más que o igual a alrededor de 90% homogéneos, su homogeneidad preferiblemente también se expresa como un rango. El extremo inferior del rango de homogeneidad es de alrededor de 90%, alrededor de 92%, alrededor de 94%, alrededor de 96% o alrededor de 98%. El extremo superior del rango de pureza es de alrededor de 92%, alrededor de 94%, alrededor de 96%, alrededor de 98% o alrededor de 100% de homogeneidad. La pureza de los conjugados de péptido se determina típicamente por uno o más de los métodos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica, por ejemplo, cromatografía liquida-espectrometría de masa (CL-EM) , espectrometría de matriz asistida por láser de desorción de masa en tiempo de vuelo (MALDITOF) , electroforesis capilar, y los similares. "Glucoforme substancialmente uniforme" o un "patrón de glucosilación substancialmente uniforme", cuando se refiere a una especie de glucopéptido, se refiere al porcentaje de porciones aceptoras que se glucosilan por la glucosiltransferasa de interés (por ejemplo, fucosultransferasa) . Por ejemplo, en el caso de una al,2 fucosiltransferasa, un patrón de fucosilación substancialmente uniforme existe si substancialmente todo (como se define abajo) del Galßl, 4-GlcNAc-R y análogos sialilados del mismo se fucosilan en un conjugado péptido de la invención. Se entenderá por alguien experto en la técnica, que el material de partida puede contener porciones aceptoras glucosiladas (por ejemplo, porciones Galßl, 4-GlcNAc-R fucosiladas) . De esta manera, el porcentaje de glucosilación calculado incluirá porciones aceptoras que se glucosilan por los métodos de la invención, así como aquellas porciones aceptoras ya glucosiladas en el material de partida. El término "substancialmente" en las definiciones anteriores de "substancialmente uniforme" significa generalmente al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, o más preferiblemente al menos alrededor de 90%, y todavía más preferiblemente al menos alrededor de 95% de las porciones aceptoras para una glucosiltransferasa particular se glucosilan. Donde los grupos substituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, estos igualmente abarcan los substituyentes químicamente idénticos, que resultarán de la escritura de la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH20- se pretende para recitar también -OCH2-.

El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro substituyente significa, salvo que se establezca de otra manera, un radical hidrocarburo cíclico, de cadena recta o ramificada, o una combinación del mismo, que puede estar completamente saturado, mono- o poliinsaturado y puede incluir radicales bi- y multivalentes, que tiene el número de átomos de carbono designado (esto es, C?-C10 significa uno hasta diez carbonos). Los ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homologas e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y los similares. Un grupo alquilo no saturado es uno que tiene uno o más enlaces dobles o enlaces triples. Los ejemplos de grupos alquilo no saturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2, 4-pentadienilo, 3- (1, 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo", salvo que se note de otra manera, también es un medio para incluir aquellos derivados de alquilo definidos en más detalle abajo, tales como "heteroalquilo". Grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarburo se llaman "homoalquilo". El término "alquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, pero no se limita, por - CH2CH2CH2CH-, y además incluye aquellos grupos descritos abajo como "heteroalquileno" . Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá desde 1 hasta 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o algunos átomos de carbono siendo preferidos en la presente invención. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, generalmente que tiene ocho o algunos átomos de carbono. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo enlazados al resto de la molécula por medio de un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, salvo que se establezca de otra manera, una cadena recta o ramificada estable, o un radical hidrocarburo cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste del número establecido de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de 0, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente cuaternizarse . Los heteroátomos O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se enlaza al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-0-CH3, - CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2- S(0)-CH3, -CH2-CH2-S (0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, -CH2- CH=N-OCH3, y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si(CH3)3. Similarmente, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no limitado por, -CH2-CH2-S-CH2~CH2 y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2. Para grupos heteroalquileno, los heteroátomos pueden ocupar ya cualquiera o ambas terminales de cadena (por ejemplo alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, y los similares) . Todavía además, para grupos de enlazado alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación del grupo de enlazado se implica por la dirección en la cual la fórmula del grupo de enlazado se escribe. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'_ representan tanto -C(0)2R'~ como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterociclolquilo", por sí mismo o en combinación con otros términos, representa, salvo que se establezca de otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se enlaza al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicioheptilo, y los similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1- (1, 2, 5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y los similares. Los términos "halo" o "halógeno", por sí mismos o como parte de otro substituyente, significan, salvo que se establezca de otra manera, un átomo de flúor, cloro, bromo, o yodo. Adicionalmente, los términos tales como "haloalquilo", son un medio para incluir monohaloalquilo y polihaloalquilo.

Por ejemplo, el término "haloalquilo (C!-C ) " es un medio para incluir, pero no limitar a, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y los similares . El término "arilo" significa, salvo que se establezca de otra manera, un substituyente poliinsaturado, aromático, que puede ser un anillo sencillo o anillos múltiples (preferiblemente desde 1 hasta 3 anillos) , que se fusionan junto o enlacen covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0, y S, en donde - los átomos de nitrógeno y azufre se oxidan opcionalmente, y los átomos de nitrógeno se cuaternizan opcionalmente. Un grupo heteroarilo puede enlazarse al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-ímidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3- tienilo, 2-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, tetrazolilo, benzo [b] furanilo, benzo [b] tienilo, 2, 3-dihidrobenzo [1,4] dioxin-6-ilo, benzo [1, 3] dioxol-5-ilo y 6-quinolilo. Los substituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo notados arriba se seleccionan del grupo de substituyentes aceptables descritos abajo. Para brevedad, el término "arilo" cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo, aríloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos tanto arilo como heteroarilo como se define arriba. De esta manera, el término "arilalquilo" es un medio para incluir aquellos radicales en los cuales un grupo arilo se enlaza a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y los similares) incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) se ha reemplazado por, por ejemplo, un átomo de oxigeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo, y los similares) . Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroarilo", "arilo" y "heteroarilo") son un medio para incluir formas tanto substituidas como no substituidas del radical indicado. Los substituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan abajo. Los substituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos frecuentemente referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) se refieren genéricamente como "substituyentes del grupo alquilo", y estos pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero no limitados a: -OR' , =0, =NR' , =N-OR' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (0) NR"R"' , -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R" ' )=NR"", -NR-C (NR' R") =NR" ' , S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en un número en el rango desde cero hasta (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono en tal radical. R' , R", R"' y R"" cada uno preferiblemente independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, por ejemplo arilo substituido con 1-3 halógenos, alquilo substituido o no substituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada uno de los grupos R' , R", R"' y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R'y R" se enlazan al mimo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6, ó 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" es un medio para incluir, pero no limitar a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. De la discusión anterior de substituyentes, alguien de experiencia en la técnica entenderá que el término "alquilo" es un medio para incluir grupos que incluyen átomos de carbono para grupos diferentes a los grupos hidrógeno, tal como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0) CH2OCH3, y los similares). Similar a los substituyentes descritos para el radical alquilo, los substituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se refieren genéricamente como "substituyentes del grupo arilo". Los substituyentes se seleccionan de, por ejemplo: halógeno, -OR' , =0, =NR' , =NR-0R' , -NR'R", -SR' , - halógeno, -SiR'R"R"', -OC(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", - OC(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (O) NR"R", NR"C(0)2R', -NR- C(NR'R"R"' )=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"' , S(0)R', -S(0)2R', S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxi (C?~C ) , y fluoroalquilo (C?-C ) , en un número en el rango desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R' , R", R"' se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno, alquilo substituido o no substituido, heteroalquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido y heteroarilo substituido o no substituido. Cuando el compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como que son cada uno de los grupos R' , R", R"' y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente. En los esquema de reaccións de reacción que siguen, el símbolo X representa "R" como se describe arriba. Dos de los substituyentes en los átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un substituyente de la fórmula -T-C (O) - (CRR' ) q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace sencillo, y q es un entero desde 0 hasta 3. Alternativamente, dos de los substituyentes en los átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un substituyente de la fórmula -A- (CH2) r-B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2NR'- o un enlace sencillo, y r es un entero desde 1 hasta 4. Uno de los enlaces sencillos del anillo nuevo formado así puede opcionalmente reemplazarse con un enlace doble. Alternativamente, dos de los substituyentes en los átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un substituyente de la fórmula -(CRR')S-X- (CR"R"')d-f donde s y d son independientemente enteros desde 0 hasta 3, y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(0)2NR'-. Los substituyentes R, R' , R" y R"' se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno o alquilo (Cx-Cß) substituido o no substituido. Como se usa en la presente invención, el término "heteroátomo" es un medio para incluir oxigeno (O) , nitrógeno (N) , azufre (S) y silicio (Si) .

Introducción La eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína que sirve como el regulador principal de la síntesis de células de glóbulos rojos. La eritropoyetina se produce en el riñon y actúa al estimular las células precursoras en la médula ósea lo que causa que se dividan y diferencien en células de glóbulos rojos maduras. La EPO puede existir como una glucoproteína ya sea de 165 o 166 aminoácidos. La variante de 166 aminoácidos se distingue de la variante de 165 aminoácidos por la presencia de una residuo de arginina adicional en el extremo de la C-terminal de la proteína. La EPO recombinante está disponible desde hace algún tiempo como un agente terapéutico efectivo en el tratamiento de varias formas de anemia, incluyendo anemias asociadas con insuficiencia renal crónica, pacientes infectados con VIH tratados con zidovidina, y pacientes con cáncer en quimioterapia. La glucoproteina se administra parenteralmente, ya sea como una inyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) . Para mejorar la efectividad de la eritropoyetina recombinante usada para propósitos terapéuticos, la presente invención proporciona conjugados de péptidos de eritropoyetina glucosilados y no glucosilados. Los conjugados pueden modificarse adicionalmente por la conjugación adicional con diversas especies tales como porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, porciones objetivo y los similares. Los conjugados de la invención se forman por el enlace enzimático del azúcar modificado al péptido glucosilado o no glucosilado. Los sitios de glucosilación proporcionan la ubicación para conjugar grupos modificados al péptido, por glucoconjugación. Un grupo de modificación ejemplar es un polímero soluble en agua, tal como poli (etilen glucol), por ejemplo, metoxi-poli (etilen glucol). La modificación de los péptidos EPO puede mejorar la estabilidad y tiempo de retención del EPO recombinante en la circulación del paciente, o reduce la antigenicidad de la EPO recombinante. Los métodos de la invención hacen posible ensamblar péptidos y glucopéptidos que tienen un patrón de derivación substancialmente homogéneo. Las enzimas usadas en la invención son generalmente selectivas para un residuo de aminoácido particular, combinación de residuos de aminoácido, o residuos de glucosilo particulares del péptido. Los métodos también son prácticos para la producción a gran escala de péptido y glucopéptido modificados. De esta manera, los métodos de la invención proporcionan un medio práctico para la preparación a gran escala de glucopéptidos que tienen patrones de derivación uniformes preseleccionados . La presente invención también proporciona conjugados de péptidos glucosilados y no glucosilados con vida media terapéutica incrementada debido a, por ejemplo, velocidad de liberación reducida, o velocidad de absorción reducida por el sistema inmune o reticuloendotelial (RES) . Por otro lado, los métodos de la invención proporcionan un medio para enmascarar las determinantes antigénicas en los péptidos, reduciendo o eliminando así una respuesta inmune hospedadora contra el péptido. El enlace selectivo de los agentes objetivo también puede usarse para direccionar un péptido a un tejido o receptor de superficie celular particular que es específico para el agente objetivo particular.

Los Conjugados En un primer aspecto, la presente invención proporciona u conjugado entre un grupo de modificación seleccionado y un péptido EPO. El enlazado entre el péptido y el grupo de modificación incluye un grupo de enlace de glucosilo interpuesto entre el péptido y la porción seleccionada. Como se discute en la presente, la porción seleccionada es esencialmente cualquier especie que puede enlazarse a una unidad de sacárido, lo que resulta en un "azúcar modificado" que se reconoce por una enzima transferasa apropiada, que adjunta el azúcar modificado en el péptido. El componente de sacárido del azúcar modificado, cuando se interpone entre el péptido y la porción seleccionada, se vuelve un "grupo de enlace de glucosilo", por ejemplo, un "grupo de enlace de glucosilo intacto". El grupo de enlace de glucosilo se forma de cualquier mono- u oligo-sacárido que, después de la modificación con el grupo de modificación, es un substrato para una enzima que agrega el azúcar modificado a un aminoácido o residuo de glucosilo de un péptido. El grupo de enlace de glucosilo puede ser, o puede incluir, una porción de sacárido que se modifica de forma degradable antes o durante la adición del grupo de modificación. Por ejemplo, el grupo de enlace de glucosilo puede derivarse de un residuo de sacárido que se produce por degradación oxidante de un sacárido intacto al correspondiente aldehido, por ejemplo, por medio de la acción de metaperyodato, y posteriormente se convierte a la base Schiff con una amina apropiada, que se reduce entonces a la amina correspondiente. Los conjugados de la invención corresponden típicamente a la estructura general: En la cual los símbolos a, b, c, d y s representan un entero no cero, positivo; y t es ya sea 0 ó un entero positivo. El "agente" es un agente terapéutico, un agente bioactivo, una etiqueta detectable, porción soluble en agua (por ejemplo, PEG, m-PEG, PPG, y m-PPG) o los similares. El "agente" puede ser un péptido, por ejemplo, una enzima, anticuerpo, antígeno, etc. El enlazador puede ser cualesquiera de una amplia configuración de grupos de enlazado, infra. Alternativamente, el enlazador puede ser un enlace sencillo o un "enlazador del orden cero". En una modalidad ejemplar, el grupo de modificación seleccionado es un polímero soluble en agua, pro ejemplo, m- PEG. El polímero soluble en agua se enlaza covalentemente al péptido por medio de un grupo de enlace de glucosilo. El grupo de enlace de glucosilo se enlaza covalentemente a un residuo de aminoácido o un residuo de glucosilo del péptido. La invención también proporciona conjugados en los cuales un residuo de aminoácido y un residuo de glucosilo se modifican con un grupo de enlace de glucosilo. Un polímero soluble en agua ejemplar es poli (etilen glucol), por ejemplo, metoxi-poli (etilen glucol). El poli (etilen glucol) usado en la presente invención no se restringe a ninguna forma particular o rango de peso molecular. Para moléculas de poli (etilen glucol) no ramificadas, el peso molecular está preferiblemente entre 500 y 100,000. Un peso molecular de 2000-60,000 se usa de preferencia y preferiblemente desde alrededor de 5,000 hasta alrededor de 30,000. En otra modalidad, el poli (etilen glucol) es un PEG ramificado que tiene más de una porción PEG enlazada. Los ejemplos de PEG ramificados se describen en la Patente E.U.A. No. 5,932,462; Patente E.U.A. No. 5,342,940; Patente E.Ü.A. No. 5,643,575; Patente E.U.A. No. 5,919,455; Patente E.U.A. No. 6,113,906; Patente E.U.A. No. 5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); y Yamasaki et al., Agrie. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. En una modalidad preferida el peso molecular de cada poli (etilen glucol) del PEG ramificado es igual a o mayor que alrededor de 40,000 daltones. Además de los conjugados proporcionados que se forman por un grupo de enlace de glucosilo agregado enzimáticamente, la presente invención proporciona conjugados que son altamente homogéneos en sus patrones de substitución. Usando los métodos de la invención, es posible formar conjugados de péptidos en los cuales esencialmente todas las porciones de azúcar modificadas a través de la población de conjugados de la invención se enlazan a copias múltiples de un aminoácidos o residuo de glucosilo estructuralmente idéntico. De esta manera, en un segundo aspecto, la invención proporciona un conjugado péptido que tienen una población de porciones de polímero solubles en agua, que se enlazan covalentemente al péptido a través de un grupo de enlace de glucosilo intacto. En un conjugado preferido de la invención, esencialmente cada miembro de la población se enlaza por medio del grupo de enlace de glucosilo a un residuo de glucosilo del péptido, y cada residuo de glucosilo del péptido al cual el grupo de enlace de glucosilo se enlaza tiene la. misma estructura. También se proporciona un conjugado péptido que tiene una población de porciones de polímero solubles en agua enlazados covalentemente a esto a través de un grupo de enlace de glucosilo. En una modalidad preferida, esencialmente cada miembro de la población de porciones de polímero soluble en agua se enlaza a un residuo de aminoácido del péptido por medio de un grupo de enlace de glucosilo, y cada residuo de aminoácido tiene . un grupo de enlace de glucosilo enlazado a esto tiene la misma estructura. La presente invención también proporciona conjugados análogos a aquellos descritos arriba en los cuales el péptido se conjuga a una porción terapéutica, porción de diagnóstico, porción de direccionamiento, porción de toxina o los similares por medio de un grupo de enlace de glucosilo intacto. Cada una de las porciones arriba recitadas puede ser una molécula pequeña, polímero natural (por ejemplo, polipéptido) o polímero sintético. Esencialmente cualquier péptido de eritropoyetina que tiene cualquier secuencia se usa como el componente de los conjugados de la presente invención. En una modalidad ejemplar, el péptido tiene la secuencia: BaN-TAPPR ICDSR V ERYLLEAK EAEfCTTGCA EHC5LNEWIT VPDT VWFY& WKKMEVGQQA VEVWQGIALL SEAVLRGQAL LVHSSQPWEP QLHVDK&VS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PPDAASRAPL RTIT?DTFRK LPRVYSNFLR GKLKLYTGE& CRTGD-COOH (SEQIDNO:I), En otra modalidad ejemplar, el péptido tiene la secuencia: H2N-APPRLICDSR VLERYL EAK E?EWITTGCA EHCSLNE IT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VBVWQGIALL SEAV RGQSL LWSSQPIEP QLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQJKEAIS ?W Sñ&FL RTITñDTFSK LFRVYSNF R GKL LYTGEA CSTGDR-COOH (SEQ IDNO:2).

En las secuencias establecidas arriba, hay dos enlaces bisulfuro, uno en C7-C161 y el otro en C29-C33. Los residuos de cisteína se muestra en cursivas negritas. Preferiblemente, ninguna terminal se deriva. Los péptidos de la invención incluyen al menos un sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado, que se glucosila con un residuo de glucosilo que incluye una porción PEG. El PEG se enlaza covalentemente al péptido por medio de un grupo de enlace de glucosilo intacto. El grupo de enlace de glucosilo se enlaza covalentemente a ya sea un residuo de aminoácido o un residuo de glucosilo del péptido. Alternativamente, el grupo de enlace de glucosilo se enlaza a una o más unidades de glucosilo de un glucopéptido. La invención también proporciona conjugads en los cuales el grupo de enlace de glucosilo se enlaza a tanto un residuo de aminoácido como un residuo de glucosilo. La porción PEG se enlaza a un enlazador de glucosilo intacto directamente, o por medio de un enlazador no de glucosilo, por ejemplo, alquilo substituido o no substituido, heteroalquilo substituido o no substituido. En una modalidad preferida, el péptido de eritropoyetina comprende la porción mostrada en la Formula I.

Fórmula I En la Fórmula I, D es un miembro seleccionado de -OH y R1-LHN-; G es un miembro seleccionado de R1-L- y -(C(0) (C?~ C6) alquilo; R1 es una porción que comprende un miembros seleccionado de una porción que comprende un residuo de cadena recta o ramificada poli (etilen glucol); y L es un enlazador el cual es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo substituido o no substituido y heteroalquilo substituido o no substituido, tal como cuando D es OH, G es R1 -L-, y G es -C(0) (C?-C6) alquilo, D es R1 -L-NH- .

Las composiciones Como se discute anteriormente, la invención proporciona sacáridos que llevan un grupo de modificación, análogos activados de esta especie y conjugados formados entre especie tal como péptidos y lípidos y un sacárido modificado de la invención.

Azúcares modificadas La presente invención proporciona azúcares modificadas, nucleótidos de azúcares modificadas y conjugados de las azúcares modificadas. En los compuestos de azúcar modificada de la invención, la porción de azúcar es preferiblemente un sacárido, un desoí-sacarido, un amino-sacarido, o un N-acil sacárido. El término "sacárido" y sus equivalentes, "sacarilo" "azúcar" y "glucosilo" se refiere a monómeros, dímeros, oligomeros y polímeros. La porción de azúcar es también funcionalizada con un grupo de modificación. El grupo de modificación se conjuga a la porción de azúcar, típicamente, a través de la conjugación con una amina, sulfhidrilo o hidroxilo, por ejemplo, hidroxilo primario, porción en el azúcar. En una modalidad ejemplar, el grupo de modificación se enlaza a través de una porción de amina en el azúcar, por ejemplo, a través de una amida, un uretano o un urea que se forma a través de la reacción de la amina con un derivado reactivo del grupo de modificación. Cualquier azúcar se puede utilizar como el núcleo de azúcar de los conjugados de la invención. Núcleos de azúcar ejemplares que son útiles en la formación de las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, y ácido siálico. Otros azúcares útiles incluyen azúcares amino tal como glucosamina, galactosamina, manosamina, el análogo 5 amina de ácido siálico y similares. El núcleo de azúcar puede ser una estructura encontrada en natural o se puede modificar para proporcionar un sitio para conjugar el grupo de modificación. Por ejemplo, en una modalidad, la invención proporciona un derivado de ácido siálico en el cual la porción 9 hidroxi se reemplaza con una amina. La amina se deriva fácilmente con un análogo activado de un grupo de modificación seleccionado. En la discusión que sigue la invención se ilustra por referencia al uso de derivados seleccionados de ácido siálico. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que el foco de la discusión es para la claridad de la ilustración y que las estructuras y composiciones establecidas generalmente al gen de grupos sacáridos, grupos sacáridos modificados, grupos sacáridos modificados activados y conjugados de grupos sacáridos modificados. En una modalidad ejemplar, la invención proporciona una amina de azúcar modificada que tiene la fórmula: en la cual G es una porción de glucosilo, L es un enlace o un enlazador y R1 es el grupo de modificación. Enlaces ejemplares son aquellos que se forman entre un grupo reactivo en la porción glucosilo, por ejemplo, NH2, SH, o OH, y un grupo de reactividad complementaria en el grupo de modificación. Así, enlaces ejemplares incluyen, pero no se limitan a NHR1, OR1, SR1 y similares. Por ejemplo, cuando R1 incluye una porción de ácido carboxílico, esta porción se puede activar y acoplar con una porción NH2 en el residuo glucosilo proporcionando un enlace que tiene la estructura NHC(0)Rx. Similarmente, los grupos OH y SH se pueden convertir al éter correspondiente o derivados de tioéter, respectivamente. Enlazadores ejemplares incluyen porciones alquilo y heteroalquilo. Los enlazadores incluyen grupos enlacendos, por ejemplo, grupos enlacendos basados en acilo, por ejemplo, -C(0)NH-, -OC(0)NH-, y similares. Los grupos enlacendos son enlaces formados entre componentes de la especie de la invención, por ejemplo, entre la porción glucosilo y el enlazador (L) , o entre el enlazador y el grupo de modificación ( R1 ) . Otros grupos enlacendos son éteres, tioéteres y aminas. Por ejemplo, en una modalidad, el enlazador es un residuo de aminoácido, tal como un residuo de glicina. La porción de ácido carboxílico de la glicina se convierte a la amida correspondiente por reacción con una amina en el residuo glucosilo, y la amina de la glicina se convierte a la amida correspondiente o uretano por reacción con un ácido carboxílico activado o carbonato del grupo de modificación. Otro enlazador ejemplar es una porción PEG o una porción PEG que se funcionaliza con un residuo de aminoácido. El PEG es para el grupo glucosilo a través del residuo de aminoácido a una terminación PEG y enlazado a R1 a través de otra terminación PEG. Alternativamente, el residuo de aminoácido se enlaza a R1 y la terminación PEG no enlazada al aminoácido es enlazada al grupo glucosilo. Una especie ejemplar para L-R1 tiene la fórmula: -NH{C(0) (CH2)aNH}s{C(0) (CH2) b (OCH2CH2) c0 (CH2) dNH}tR1, en la cual los índices s y t son independientemente 0 ó 1. Los índices a, b y d son independientemente enteros desde 0 hasta 20, y e es un entero desde 1 hasta 2500. Otros enlazadores similares se basan en especie en la cual la porción -NH se reemplaza por, por ejemplo, -S, -O y -CH2. Más particularmente, la invención proporciona compuestos en los cuales L-R1 es: NHC(O) (CH2)aNHC(0) (CH2) b (OCH2CH2) cO (CH2) dNHR1, NHC(O) (CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHRx, NHC (O) O (CH2) b (OCH2CH2) cO (CH2) d HR1, NH(CH2)aNHC(0) (CHs OCHsCHsJcOÍCHzJdNHR1, NHC (O) (CH2)aNHR1, NH (CH2) aNHR1, y NHR1. En esta fórmula, los índices a, b y d se seleccionan independientemente de los enteros desde 0 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 5. El Índice c es un entero desde 1 hasta 2500. En una modalidad ilustrativa, G es ácido siálico y compuestos seleccionados de la invención tienen las fórmulas: como aquellos expertos en la técnica apreciaran, la porción de ácido siálico en los compuestos ejemplares anteriores se pueden reemplazar con cualquier otro a ino-sacarido que incluye, pero no se limita a, glucosamína, galactosamina, manosamina, sus derivados de acetil N, y similares. En otra modalidad ilustrativa, una porción hidroxilo primaria del azúcar es funcionalizada con el grupo de modificación. Por ejemplo, el 9-hidroxilo de ácido siálico se puede convertir a la amina correspondiente y funcionalizar para proporcionar un compuesto de conformidad con la invención. Las fórmulas de conformidad con esta modalidad incluyen: En una modalidad ejemplar adicional, la invención proporciona azúcares modificadas en las cuales la posición 6-hidroxilo se convierte a la porción de amina correspondiente, que porta un cásete de grupo de modificación enlazador tal como aquellos establecidos anteriormente. Grupos sacaridos ejemplares que se pueden usar como el núcleo de estos azúcares modificados incluyen Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fue, Xyl, Man, y similares. Un azúcar modificado representativo de conformidad con esta modalidad tiene la fórmula: en la cual R3-R5 y R7 son miembros independientemente seleccionados de H, OH, C(0)CH3, NH, y NHC(0)CH3. R6 es OR1, NHR1 o L-R1, el cual es como se describe anteriormente. Conjugados seleccionados de la invención se basan en mañosa, galactosa o glucosa, o en especie que tiene la estereoquímica de mañosa, galactosa o glucosa. Las formulas generales de estos conjugados son: En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona compuestos como se establecen anteriormente que son activados como los azúcares de nucleótido correspondiente.

Nucleótidos de azúcar ejemplares que se usan en la presente invención en su forma modificada incluye mono, bi o trifosfatos de nucleótido o análogos del mismo. En una modalidad preferida, el nucleótido de azúcar modificado se selecciona de un UDP-glucosida, CMP-glucosida, o un GDP-glucosida. Aún más preferiblemente, la porción de nucleótido de azúcar del nucleótido de azúcar modificado se selecciona de UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido siálico, o CMP-NeuAc. En una modalidad ejemplar, el fosfato nucleótido se enlaza a C-l. Así, en una modalidad ilustrativa en la cual la porción glucosilo es ácido siálico, la invención proporciona compuestos que tienen las fórmulas: en las cuales L-R1 es como se discutió anteriormente, y L1-R1 representa un enlace enlazado al grupo de modificación . Como con L, especie de enlazador ejemplar de conformidad con L1 incluyen un enlace, porciones alquilo o heteroalquilo. Compuestos de nucleótido de azúcar modificada ejemplares de conformidad con estas modalidades se establecen en la FIG . 1 y FIG . 2 .

En otra modalidad ejemplar, la invención proporciona un conjugado formado entre un azúcar modificada de la invención y un substrato, por ejemplo, un péptido, lipido, aglucona, etc., más particularmente entre un azúcar modificada y un residuo glucosilo de un glucopéptido o un glucolípido. En esta modalidad, la porción de azúcar del azúcar modificada se convierte un grupo enlacendo glucosilo interpuesto entre el substrato y el grupo de modificación. Un grupo enlazador glucosilo ejemplar es un grupo enlazador glucosilo intacto, en el cual la porción glucosilo o porciones formando el grupo enlazador no se degradan por química (por ejemplo, metaperiodato de sodio) o procesos enzimáticos (por ejemplo, oxidasa) . Conjugados seleccionados de la invención incluyen un grupo de modificación que se enlaza a la porción amina de un amino-sacárido, por ejemplo, manosamina, glucosamina, galactosamina, ácido siálico etc. El cásete de grupo enlazador glucosilo intacto del grupo de modificación ejemplar de conformidad con la porción se basa en una estructura de ácido siálico, tal como tiene las fórmulas: En las fórmulas anteriores, R1, L1 y L2 son como se describió anteriormente. l En todavía una modalidad ejemplar adicional, el conjugado se forma entre un substrato y la posición 1 de una porción sacarilo que en la cual el grupo de modificación se enlaza a través de un enlazador en la posición de carbono 6 de la porción sacarilo. Asi, conjugados ilustrativos de conformidad con esta modalidad tienen las fórmulas: en las cuales los radicales son como se discutió anteriormente. Aquellos expertos apreciaran que las porciones sacarilo modificadas establecidas arriba pueden también ser conjugados a un substrato en los 2, 3, 4 o 5 átomos de carbono. Compuestos ilustrativos de conformidad con esta modalidad incluyen compuestos que tienen las fórmulas : en las cuales los grupos R y los índices son como se describió anteriormente. La invención también proporciona nucleótidos de azúcar modificados con L-R1 en la posición de carbono 6. Especie ejemplar de conformidad con esta modalidad incluye: en la cual los grupos R, y L, representan porciones como se discutió anteriormente. El índice "y" es 0, 1 ó 2.

Un azúcar de nucleótido ejemplar adicional de la invención, basado en una especie que tiene la estereoquímica de GDP mañosa. Una especie ejemplar de conformidad con esta modalidad tienen la estructura: Todavía en una modalidad ejemplar adicional, la invención proporciona un conjugado basado en la estereoquímica de UDP galactosa. Un compuesto ejemplar de conformidad con esta modalidad tiene la estructura: En otra modalidad ejemplar, el azúcar de nucleótido se basa en la estereoquímica de glucosa. Especie ejemplar de conformidad con la modalidad tienen las fórmulas El grupo de modificación, R1, es cualquiera de un número de especies que incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua, polímeros insolubles en agua, agentes terapéuticos, agentes de diagnostico, y similares. La naturaleza de los grupos modificados ejemplares se discute en mayor detalle en la presente abajo. Grupos de modificación Polímeros solubles en agua Muchos polímeros solubles en agua son conocidos por aquellos expertos en la técnica y son útiles en la práctica de la presente invención. El término polímero soluble en agua abarca especies tales como sacáridos (por ejemplo, dextrano, amilosa, ácido hialourónico, poli (ácido siálico), heparanos, heparinas, etc.); poli (aminoácidos) , por ejemplo, poli (ácido aspártico) y poli (ácido glutámico); ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (por ejemplo, poli (ácido acrílico), poli (éteres) , por ejemplo, poli (etilen glucol); péptidos, proteínas, y similares. La presente invención se puede practicar con cualquier polímero soluble en agua con la única limitación que el polímero deberá incluir un punto en el cual el resto del conjugado se puede enlazar. Los métodos para la activación de polímeros se pueden también encontrar en la EO 94/17039, patente de E.U.A No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, patente de E.U.A No. 5,219,564, patente de E.U.A No. 5,122,614, WO 90/13540, patente de E.U.A No. 5,281,698, y más WO 93/15189, y para la conjugación entre polímeros y péptidos activados, por ejemplo, Factor de Coagulación VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula portadora de oxígeno (patente de E.U.A No. 4,412,989), ribonucleasa y dismutasa de superóxido (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)). Los polímeros solubles en agua preferidos son aquellos en los cuales una proporción substancial de las moléculas de polímero en una muestra del polímero son de aproximadamente el mismo peso molecular; tales polímeros son "homodispersos" . La presente invención se ilustra además por referencia a un conjugado poli (etilen glucol). Están disponibles varias revistas y monografías en la funcionalización y conjugación de PEG. Ver, por ejemplo, Harris, Macronal . Chem. Phys . C25:325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Barda, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002) . Las rutas para preparar moléculas PEG reactiva y formar conjugados usando las moléculas reactivas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, patente de E.U.A No. 5,672,662 describe un soluble en agua y conjugado aislable de un éster activo de un polímero ácido seleccionado de poli (óxidos alquileno) lineal o ramificado, poli (polioles oxietilados) , poli (alcoholes olefínicos) , y poli (acrilomorfolina) . La patente de E.U.A No. 6,376,604 establece un método para preparar un éster 1-benzotriazolilcarbonato soluble en agua de un polímero soluble en agua y no peptídico al reaccionar una terminal de hidroxilo del polímero con di (1-benzotriazolil) carbonato en un solvente orgánico. El éster activo se usa para formar conjugados con un agente biológicamente activo tal como una proteína péptido. La WO 99/45964 describe un conjugado que comprende un agente biológicamente activo y un polímero soluble en agua activado que comprende una estructura de polímero que tiene al menos un término enlazado a la estructura de polímero a través de una enlacedura estable, en donde al menos un término comprende una porción ramificada que tiene grupos reactivos próximos enlazados a la porción ramificada, el la cual el agente biológicamente activo se enlace al menos a un de los grupos reactivos próximos. Otros poli (etilen glucoles) ramificados se describen en WO 96/21469, patente de E.U.A No. 5,932,462 describe un conjugado formado con una molécula PEG ramificada que incluye un término ramificado que incluye grupos funcionales reactivos. Los grupos reactivos libres están disponibles para reaccionar con una especie biológicamente activa, tal como una proteína o péptido, conjugados de formación entre el poli (etilen glucol) y la especie biológicamente activa. La patente de E.U.A No. 5,446,090 describe un enlazador PEG bi-funcional y su uso en conjugados de formación que tienen un péptido en cada una de la terminación enlaceda a PEG. Los conjugados que incluyen enlaceduras PEG degradables se describen en WO 99/34833; y WO 99/14259, así como en la patente de E.U.A No. 6,348,558. Tales enlaceduras degradables se aplican en la presente invención. Los métodos reconocidos en la técnica de activación de polímero establecidos anteriormente se usan en el contexto de la presente invención en la formación de los polímeros ramificados establecidos en la presente y también para la conjugación de estos polímeros ramificados para otra especie, por ejemplo azúcares, nucleótidos de azúcar y similares. Moléculas poli (etilen glucol) ejemplares de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen la fórmula: en la cual R8 es H, OH, NH2, alquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, heteroarilo substituido o no substituido, heterocicloalquilo substituido o no substituido, heteroalquilo substituido o no substituido, por ejemplo acetal, OHC-, H2N-(CH2)q-, HS-(CH2)q, o (CH2) qC (Y) Z1. El índice "e" representa un entero desde 1 hasta 2500. Los índices b, d, y q representan independientemente enteros desde 0 hasta 20. Los símbolos Z y Z1 independientemente representan OH, NH2, por ejemplo, imidazol, p-nitrofenilo, HOBT, tetrazol, haluro, S-R9, la porción alcohol de esteres activados; - (CH2) PC (Y1) V, o - (CH2)pU(CH2)sC/Y1)v. El símbolo Y representa H(2), =0, =S, =N- R10. Los símbolos X, Y, Yl, Al, y U representan independientemente las porciones 0, S, N-R11. El símbolo V representa OH, NH2, halógeno, S-R12, el componente de alcohol de esteres activados, el componente de amina de amidas activadas, nucleótidos de azúcar, y proteínas. Los índices p, q, s y v son miembros seleccionados independientemente de los enteros desde 0 hasta 20. Los símbolos R9, R10, R11 y R12 representan independientemente H, alquilo substituido o no substituido, heteroalquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, heterocicloalquilo substituido o no substituido y heteroarilo substituido o no substituido. En otras modalidades ej emplares, la molécula poli (etilen glucol) se selecciona de los siguiente : Me-(0CH2CH2)e-O. Me-{OCH2CH2)ß~O .Z El poli (etilen glucol) útil en la formación del conjugado de la invención es ya sea lineal o ramificado. Las moléculas poli (etilen glucol) ramificadas adecuadas para el uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos por la siguiente fórmula: en la cual R y R son miembros seleccionados independientemente de los grupos definidos por R8 , arriba . A1 y A2 son miembros seleccionados independientemente 7S de los grupos definidos por A1, arriba. Los índices e, f, o, y q son como se describió anteriormente. Z y Y son como se definió anteriormente. X1 y X1' son miembros seleccionados independientemente de S, SC(0)NH, NHC(0)S, SC(0)0, O, NH, NHC(O), (O)CNH y NHC(0)0, OC(0)NH. En otras modalidades ejemplares, el PEG ramificado se basa sobre un núcleo de cisteina, serina o di-lisina. Así, los PEG ramificados ejemplares incluyen: En todavía otra modalidad, la porción PEG ramificada se basa sobre un péptido tri-lisina. La tri-lisina se puede mono, bi, tri, o tetra-PEG-ilar . La especie ejemplar de conformidad con esta modalidad tiene las fórmulas: en la cual e, f y f son enteros seleccionados 15 independientemente desde 1 hasta 2500; y q, q' y q' ' son enteros seleccionados independientemente desde 1 hasta 20. En modalidades ejemplares de la invención, el PEG es m- PEG (5 kD, 10 kD, o 20 kD) . Una especie PEG ramificada ejemplar es una serina o cisteína- (m-PEG) 2 en la cual el m- 0 PEG es un 20 kD m-PEG. Como se apreciara por aquellos expertos en la técnica, los polímeros ramificados de uso en la invención incluyen variaciones en los temas establecidos anteriormente. Por ejemplo el conjugado bi-lisina-PEG mostrado anteriormente 5 puede incluir tres sub-unidades poliméricas, el tercer enlazado para la a-amina se muestra como no modificado en la estructura anterior. Similarmente, el uso de una tri-lisina funcionalizada con tres o cuatro sub-unidades poliméricas están dentro del alcance de la invención. Modalidades específicas de conformidad con la invención incluyen: y carbonatos y esteres activos de esta especie, tal como: Otros grupos de partida o activantes, apropiados para PEG activantes lineales y ramificados de uso en preparación de los compuestos establecidos en la presente incluyen, pero no se limitan a la especie: moléculas PEG que son activados con estas y otras especies y métodos para hacer los PEG activados establecidos en WO 04/083259. Aquellos expertos en la técnica apreciaran que uno o más de las extremidades m-PEG del polímero ramificado se pueden remplazar por una porción PEG con un término diferente, por ejemplo, OH, COOH, NH2, C2-C?0-alquilo, etc. Por otra parte, las estructuras anteriores son modificadas rápidamente al insertar enlazadores de alquilo (o remover átomos de carbono) entre átomo de carbono a y el grupo funcional de la cadena lateral. Así, derivados "homo" y homólogos superiores, así como homólogos inferiores están dentro del alcance de núcleos de PEG ramificados de uso en la presente invención. Las especies PEG ramificado establecidas en la presente se preparan por métodos tales como se establecen a continuación en el cual Xa es O ó S y r es un entero desde 1 hasta 5. Los índices e y f enteros seleccionados independientemente desde 1 hasta 2500. Así, de conformidad con el método arriba expuesto, un aminoácido natural o no natural se contacta con un derivado de m-PEG activado, en este caso el tosilato, que forma 1 al alquilar el heteroátomo Xa de la cadena lateral. El aminoácido m-PEG mono funcionalizado se somete a condiciones de acilación N con un reactivo de derivado m-PEG, por ello ensamblando el 2 m-PEG ramificado. Como un experto apreciara, el grupo de partida tosilato se puede reemplazar con cualquier grupo de partida adecuado, por ejemplo, halógeno, esilato, triflato, etc. Similarmente, el carbonato reactivo utilizado para acilar la amina se puede reemplazar con un éster activo, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, etc., o el ácido se puede activar in situ usando un agente deshidratante tal como diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol, etc. En una modalidad ejemplar, el grupo de modificación es una porción PEG, sin embargo, cualquier grupo de modificación, por ejemplo, polímero soluble en agua, polímero insoluble en agua, porción terapéutica, etc., se pueden incorporar en una porción glucosilo a través de una enlacedura apropiada. El azúcar modificado se forma por medios enzimáticos, medios químicos o una combinación del mismo, por ello produciendo un azúcar modificado. En una modalidad ejemplar, los azúcares son substituidos con una amina activa en cualquier posición que se permite para el enlace de la porción modificada, aún todavía se permite al azúcar para función como un substrato por una enzima capaz de acoplar el azúcar modificado al péptido. En una modalidad ejemplar, cuando galactosamina es el azúcar modificado, la porción amina se enlaza al átomo de carbono en la posición 6. La presente invención también proporciona azúcares de nucleótido en los cuales la porción de azúcar se modifica. Un nucleótido de azúcar modificado ejemplarmente que porta un grupo de azúcar que se modifica a través de una porción amina en el azúcar. Los nucleótidos de azúcar modificados, por ejemplo, derivados de amina sacaril de un nucleótido de azúcar, son también de uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, una amina sacaril (sin el grupo de modificación) se puede conjugar enzimáticamente a un péptido (u otra especie) y la porción amina sacaril libre posteriormente conjugados a un grupo de modificación deseado. Alternativamente, el nucleótido de azúcar modificado puede funcionar como un substrato por una enzima que transfiere el azúcar modificado a un aceptador sacarilo en un substrato, por ejemplo, un péptido, glucopéptido, lípido, aglucona, glucolípido, etc. En una modalidad en la cual el núcleo sacarido es galactosa o glucosa, R5 es NHC(0)Y. En una modalidad ejemplar, el azúcar modificado se basa sobre una porción 6-amino-N-acetil-glucosil . Como se muestra abajo por N-acetilgaláctosamina, la -porción 6-amino-azúcar se prepara rápidamente por métodos estándar. a. galactos En el esquema de reacción anterior, el índice n representa un entero desde 1 hasta 2500, preferiblemente desde 10 hasta 1500, y más preferiblemente desde 10 hasta 1200. El símbolo "A" representa un grupo activado, por ejemplo, un halo, un componente de un éster activado (por ejemplo, un éster N-hidroxisuccinimida ) , un componente de un carbonato (por ejemplo, carbonato p-nitrofenilo ) y similares. Aquellos de experiencia en la técnica apreciaran que otros azúcares de nucleótido PEG-amida se preparan rápidamente por este y otros métodos análogos. En otras modalidades ejemplares, la porción amida se reemplaza por un grupo tal como un uretano o una urea . En todavía modalidades adicionales, R1 es un PEG ramificado, por ejemplo, una de esas especies establecidas anteriormente. Compuestos ilustrativos de conformidad con esta modalidad incluyen: en el cual X4 es un enlace u O. Por otra parte, como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona azúcares de nucleótido que se modifican con un polímero soluble en agua, el cual es ya sea cadena recta o ramificada. Por ejemplo, los compuestos que tienen la fórmula mostrada abajo están dentro del alcance de la presente invención: i7 en la cual X es O o un enlace. Similarmente, la invención proporciona azúcares de nucleótido de aquellas especies de azúcar modificado en las cuales el carbono en la posición 6 se modifica: en el cual X es un enlace u O. También se proporcionan conjugados de péptidos y glucopéptidos, lípidos y glucolípidos que incluyen las composiciones de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona conjugados que tienen las siguientes fórmulas: Polímeros Insolubles en Agua En otra modalidad, análogos de aquellos discutidos anteriormente, los azúcares modificados incluyen un polímero insoluble en agua, más bien que un polímero soluble en agua. Los conjugados de la invención pueden también incluir uno o más polímeros insolubles en agua. Esta modalidad de la invención se ilustra por el uso del conjugado como un vehículo con el cual se administra un péptido terapéutico en una manera controlada. Los sistemas de administración de fármaco polimérico son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo,, Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Aquellos expertos en la técnica apreciaran que substancialmente cualquier sistema de administración de fármaco conocido se aplica a los conjugados de la presente invención. Polímeros insolubles en agua representativos incluyen, pero no se limitan a, polifosfazinas, poli (alcoholes de vinilo) , poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquilen glucoles, polialquilen óxidos, polialquilen tereftalatos, éteres de polivinilo, esteres de polivinilo, haluros de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliglucoluros, polisiloxanos, poliuretanos, poli (metil metacrilato), poli (etil metacrilato), poli (butil metacrilato), poli (isobutil metacrilato), poli (hexil metacrilato), poli (isodecil metacrilato), poli (lauril metacrilato), poli (fenil metacrilato), poli (metil acrilato), poli (isopropil acrilato), poli (isobutil acrilato), poli (octadecil acrilato) polietileno, polipropileno, poli (etilen glucol), poli (etilen óxido), poli (etilen tereftalato), poli (vinil acetato), cloruro de polivinilo, poliestireno, polivinil pirrolidona, plurónicos y polivinilfenol y copolimeros del mismo. Los polímeros naturales sintéticamente modificados de uso en los conjugados de la invención, incluyen pero no se limitan a, alquil celulosas, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, esteres de celulosa y nitrocelulosas . Los miembros particularmente preferidos de las amplias clases de polímeros naturales sintéticamente modificados incluyen pero no se limitan a, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato del acetato de celulosa, ftalato del acetato de celulosa, carboximetil celulosa, triacetato de celulosa, sal de sodio del sulfato de celulosa, y polímeros de esteres acrílicos y metacrílicos y ácido algínico. Estos y otros polímeros aquí discutidos se pueden obtener fácilmente de fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Co. (St. Louis MO) , Polysciences (Warrenton, PA) , Aldrich (Milwaukee, Wl) , Fluka (Ronkonkoma, NY) , y BioRad (Richmond, CA) , o sintetizada además de monómeros obtenidos de estos proveedores al usar técnicas estándar. Los polímeros biodegradables de uso en los conjugados de la invención incluyen, pero no se limitan a, polilacturos, poliglicólidos y copolímeros de los mismos, poli (etilen tereftalato), ácido poli (butírico) , ácido poli (valérico) , poli (lacturo-cocaprolactona) , poli (lacturo-co-glucoluro) , polianhidridos, poliortoésteres, mezclas y copolimeros de los mismos. De uso particular son las composiciones que forman geles, tales como aquellas que incluyen colágeno, pluronics y los similares. Los polímeros de uso en la invención incluyen polímeros "híbridos" que incluyen materiales insolubles en agua que tienen dentro al menos una porción de su estructura, una molécula bioresorbible . Un ejemplo detal polímero es uno que incluye un copolimero insoluble en agua, el cual tienen una región de bioresorción, una región hidrofílica y una pluralidad de grupos funcionales reticulables por cadena de polímero. Para los propósitos de la presente invención, "materiales insolubles en agua" incluye materiales que son substancialmente insolubles en agua o en ambientes que incluyen agua. Asi, aunque ciertas regiones o segmentos del copolímero pueden ser hidrofílicas o aun solubles en agua, la molécula de polímero como un todo, no se disuleve hasta alguna medida substancial en agua. Para propósitos de la invención, el término "molécula de bioresorción" incluye una región que es capaz de ser metabolizada o rota y resorbida y/o eliminada a través de rutas excretoras normales por el cuerpo. Tales metabolitos o productos de rompimiento preferiblemente son sustancialmente no tóxicos para el cuerpo. La región de bioresorción puede ser ya sea hidrofóbica o hidrofílica, tanto como la composición del copolimero como un todo no esté vuelta a hacer soluble en agua. Así, la región de bioresorción se selecciona con base en la preferencia que le polímero, como un todo, permanece insoluble en agua. En consecuencia, las propiedades relativas, esto es, los tipos de grupos funcionales contenidos, y las proporciones relativas de la región de bioresorción, y la región hidrofílica se seleccionan para asegurar que las composiciones de bioresorción útiles permanecen insolubles en agua. Ejemplarmente los polímeros de resorción incluyen, por ejemplo, copolímeros de bloque de resorción producidos sintéticamente de poli (ácido a-hidroxi-carboxílico) /poli (oxialquileno) , (ver, Cohn y colaboradores, Patente de EUA No. 4,826,945). Estos copolímeros no están enlazados cruzadamente y son solubles en agua de manera que el cuerpo puede excretar las composiciones de copolímero de bloque degradadas. Ver, Younes y colaboradores, J Bio ed. Mater. Res. 21:1301-1316 (1987); y Cohn y colaboradores, J Biomed. Mater. Res. 22:993-1009(1988). Actualmente los polímeros de bioresorción preferidos incluyen uno o más componentes seleccionados de poli (esteres) , poli (hidroxi ácidos), poli (lactosas) , poli (amidas) , poli (éster-amidas) , poli (aminoácidos) , poli (anhídridos)', poli (ortoésteres) , poli (carbonatos) , poli (fosfazinas) , poli (fosfoésteres) , poli (tioésteres) , polisacáridos y mezclas de estos. Todavía más preferiblemente, el polímero de bioresorción incluye un componente de ácido poli (hidroxi) . De los ácidos poli (hidroxi) , ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido policapróico, ácido polibutírico, ácido polivalérico y copolímeros y mezclas de estos se prefieren. Además para formar fragmentos que son absorbidos in vivo- ("bioresorbidos") , recubrimientos poliméricos preferidos para uso en los métodos de la invención también pueden formar un fragmento excretable y/o metabolizable . Los copolímeros de orden mayor también se pueden usar en la presente invención. Por ejemplo, la Patente de EUA No. 4,438,253 de Casey y colaboradores, la cual se emitió en Marzo 20, 1984, describe copolímeros tri-bloque producidos de transesterificación de poli (ácido glicólico) y un poli (glucol de alquileno) terminado en hidroxilo. Tales composiciones se describen para uso como sutures de onofilamento de resorción. La flexibilidad de las composiciones se controla por la incorporación de un ortocarbonato aromático, tal como ortocarbonato de p-tolilo en la estructura del copolímero. Otros polímeros basados en ácidos láctico y/o glicólico también se pueden utilizar. Por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,202,413 de Spinu, la cual fue emitida en Abril 13, 1993, describe copolímeros de bloque múltiple biodegradables que tiene bloques ordenados secuencialmente de poliláctido y/o poliglucolido producidos por polimerización de abertura de anilla de lactido y/o glucolido en cualquiera de un diol oligomérico o un residuo de diamina seguido por extensión de cadena con un compuesto difuncional, tal como un diisocianato, diacilcloruro o diclorosilano. Las regiones de bioresorción de recubrimientos útiles en la presente invención se pueden diseñar para ser desdoblables hidrolítica y/o enzimáticamente. Para propósitos de la presente invención, "desdoblable hidroliticamente" se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región de bioresorción, a hidrólisis en agua o un ambiente que contiene agua. Similarmente, "desdoblable enzimáticamente" como se usa en la presente se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región de bioresorción, para desdoblar por enzimas endógenas o exógenas . Cuando se coloca dentro del cuerpo, la región hidrofílica se puede procesar en fragmentos excretables y/o metabolizables. Así, la región hidrofílica puede incluir, por ejemplo, poliéteres, óxidos de polialquiileno, polioles, poli (vinil pirrolidina) , poli (vinil alcohol), poli (alquil oxazolinas) , polisacáridos, carbohidratos, péptídos, proteínas y copolímeros o mezclas de estos. Además, la región hidrofílica también puede ser, por ejemplo, un óxido de poli (alquileno) . Tales óxidos de poli (alquileno) pueden incluir, por ejemplo, óxido de poli (etileno) , óxido de poli (propileno) y mezclas y copolímeros de estos. Los copolímeros que son componentes de hidrogeles también son útiles en la presente invención. Los hidrogeles son materiales poliméricos que son capaces de absorber relativamente cantidades grandes de agua. Ejemplos de compuestos que forman hidrogel incluyen, pero no están limitados a, ácidos poliacrílicos, carboximetilcelulosa de sodio, alcohol de polivinilo, pirrolidina de polivinilo, gelatina, carragenano, y otros polisacáridos, ácido hidroxietilenmetacrílico (HEMA) , además de derivados de estos, y similares. Los hidrogeles se pueden producir para ser estables, biodegradables y de bioresorción. Más aún, las composiciones de hidrogel pueden incluir subunidades que exhiben una o más de estas propiedades. Las composiciones de hidrogel biocompatibles cuya integridad se puede controlar a través de enlazamiento cruzado son conocidas y actualmente se prefieren para uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,410,016 de Hubbell y colaboradores, la cual fue emitida en Abril 25 de 1995 y la 5,529,914, la cual fue emitida en Junio 25. de 1996, describen sistemas solubles en agua, los cuales son copolimeros de bloque enlazados cruzadamente que tiene segmento de bloque central soluble en agua intercalado entre dos extensiones inestables hidrolíticamente. Tales copolímeros son además protegidas con funcionalidades de acrilato fotopolimerizables . Cuando son enlazados cruzadamente, estos sistemas se vuelven hidrogeles. El bloque central soluble en agua de tales copolímeros pueden incluir poli (glucol de etileno); considerando que, las extensiones lábile hidrolíticamente pueden ser un poli (ácido a-hidroxi) , tal como ácido poliglicólico o ácido poliláctico. Ver, Sawhney y colaboradores, Macromolecules 26:581-587 (1993). En otra modalidad preferida, el gel es un gel termoreversible. Los geles termoreversibles incluyen componente, tales como plurónicos, colágeno, gelatina, ácido hialourónico, polisacáridos, hidrogel de poliuretano, hidrogel de poliuretano-urea y combinaciones de estos son preferidos actualmente. En todavía otra modalidad ejemplar, el conjugado de la invención incluye un componente de un liposoma. Los liposomas pueden ser preparados de acuerdo a métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Eppstein y colaboradores, Patente de EUA No. 4,522,811, la se emitió en Junio 11, 1985. Por ejemplo, las formulaciones de liposoma se pueden preparar por disolución apropiada de lípido o lípidos (tal como etaolamina de fosfatidil estearilo, colina de fosfatidil de estearoilo, colina de fosfatidil de aracadoilo, y colesterol) en un solvente inorgánico que es luego evaporado, dejando a un lado una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Una solución acuosa del compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable se introduce luego dentro del recipiente. El recipiente es agitado a mano para liberar el material de lípido de las paredes del recipiente y para dispersar los agregados de lípido, formando de esa manera la suspensión liposomal. Las micropartículas descritas anteriormente y los métodos de preparación de las microparticulas se ofrecen a manera de ejemplo y no están proyectados para definir el alcance de las micropartículas de uso en la presente invención. Será apreciable para aquellos expertos en la técnica que un arreglo de micropartículass, fabricadas por métodos diferentes, son de uso en la presente invención. Los formatos estructurales discutidos anteriormente en el contexto de los polímeros solubles en agua, tanto para cadena lineal y ramificada generalmente son aplicables con respecto a los polímeros insolubles en agua. Asi, por ejemplo, la cisterna, serina, dilisina, y trilisina que ramifican núcleos pueden ser funcionarizados con dos porciones de polímeros insolubles en agua. Los métodos usados para producir estas especies generalmente son cercanamente análogos a aquellos usados para producir los polímeros solubles en agua. Los Métodos En adición a los conjugados discutidos anteriormente, la presente invención proporciona métodos para preparación de estos y otros conjugados. Más aún, la invención proporciona métodos de prevención, curación o mejoría de un estado de enfermedad por administración de un conjugado de la invención a un sujeto en riesgo de desarrollar la enfermedad o un sujeto que tiene la enfermedad. Asi, la invención proporciona un método de formación de un conjugado covalente entre una porción seleccionada y un péptido, un glucolipido o un aglucone (por ejemplo, ceramida o esfingosina) . Para claridad de ilustración, la invención se ilustra con referencia a un conjugado formado entre un péptido y la porción de glucosilo modificada de un azúcar modificado activado de la invención. Aquellos de experiencia apreciarán que la invención igualmente abarca métodos de formación de conjugados de glucolípidos, y aglucones con un azúcar modificado activado de la invención. En modalidades ejemplares, el conjugado se forma entre un polímero soluble en agua, una porción terapéutica, porción de dirección o una biomolécula, y un péptido glucosilatado o no glucosilatado. El polímero, porción terapéutica o biomolécula se conjuga al péptido vía un grupo de enlazamiento de glucosilo, el cual está interpuesto entre, y enlazado covalentemente a ambos: el péptido y el grupo de modificación (por ejemplo, polímero soluble en agua) . El método incluye el contacto del péptido con una mezcla que contiene un azúcar modificado y una enzima, por ejemplo, una glucosiltransferasa, que conjuga el azúcar modificado al sustrato (por ejemplo, péptido aglucone, glucolipido). La reacción se conduce bajo condiciones apropiadas para formar un enlace covalente entre el azúcar modificado y el péptido (u otro sustrato) . La porción de azúcar del azúcar modificado se selecciona preferentemente de azúcares de nucleótido. El péptido aceptor se sintetiza comúnmente de novo, o se expresa recombinantemente en una célula procariótica (por ejemplo, células bacteriales, tal como E. coli ) o en células eucarióticas tales como una célula de mamífero, levadura, insecto, hongo o planta. El péptido puede ser ya sea una proteína de longitud completa o un fragmento. Más aún, el péptido puede ser un péptido de tipo silvestre o mutado. En una modalidad ejemplar, el péptido incluye una mutación que agrega uno o más sitios de glucosilación enlazados a N- u 0-a la secuencia del péptido.

El método de la invención también proporciona para modificación de péptidos glucosilatados incompletamente que se producen recombinantemente . Muchas glucoproteínas producidas recombinantemente están glucosilatadas incompletamente, exponiendo residuos de carbohidrato que pueden tener propiedades indeseables, por ejemplo, inmunogenicidad, reconocimiento por el RES. El empleo de un azúcar modificada en un método de la invención, el péptido puede ser simultáneamente además glucosilatado y derivatizado con, por ejemplo, un polímero soluble en agua, agente terapéutico, o similares. La porción de azúcar del azúcar modificado puede ser el residuo que puede ser conjugado apropiadamente al aceptor en un péptido glucosilatada completamente, u otra porción de azúcar con propiedades deseables. Aquellos de experiencia apreciarán que la invención puede ser practicada usando sustancialmente cualquier péptido o glucopéptido de cualquier fuente. E emplarmente los péptidos con los cuales la invención puede ser practicada se establecen en WO 03/031464, y las referencias se establecen en ella. Los péptidos modificados por los métodos de la invención pueden ser sintéticos o péptidos de tipo silvestre o pueden ser péptidos mutados, producidos por métodos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida a sitio. La glucosilación' de péptidos comúnmente es cualquiera de enlaceda en N o enlaceda en 0. Una lagdura en N ejemplar es el acoplamiento del azúcar modificado a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para acoplamientos enzimáticos de una porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Glucosilación enlaceda a 0 se refiere al acoplamiento de un azúcar (por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa, mañosa, GlcNAc, glucosa, mucosa, o xilosa) a la cadena lateral de hidroxi de un ácido de hidroxiamino, preferiblemente serina o treonina, aunque también se pueden usar aminoácidos no usuales o no naturales, por ejemplo, 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . Más aún, además de los péptidos, los métodos de la presente invención pueden ser practicados con otras estructuras biológicas (por ejemplo, glucolípidos, lípidos, esfingóides, ceramidas, células completas, y similares, que contienen un sitio de glucosilación) . Además de los sitios de glucosilación a un péptido u otra estructura se logra convenientemente por alteración de la secuencia de aminoácido de manera que este contiene uno o más sitios de glucosilación. La adición también puede ser por la incorporación de una o más especies que presentan un grupo -OH, preferiblemente residuos de serina o treonina, dentro de la secuencia del péptido (para sitios de glucolización enlazados a 0-) . La adición puede ser hecha por mutación o por síntesis química completa del péptido. La secuencia de aminoácido del péptido preferiblemente se altera a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente por mutación de ADN que codifica al péptido en bases preseleccionadas tales que los codones se generan para que traduzcan dentro de los aminoácidos deseados. La o las mutaciones de ADN preferiblemente se hacen usando los métodos conocidos en la técnica. En una modalidad ejemplar, el sitio de glucosilación se agrega por purga de polinucleótidos. Los polinucleótidos que codifican un péptido candidato pueden ser modulados con protocolos de purga de ADN. La purga de ADN es un proceso de recombinación y mutación recursivo, realizado por fragmentación aleatoria de un acumulado de genes relacionados, seguido por reensamble de los fragmentos por un proceso similar a reacción de cadena de polimerasa. Ver, por ejemplo, Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391(1994); y las Patentes de EUA Nos. 5,605,793, 5,837,458, 5, 830, 721 y 5, 811, 238. Péptidos ejemplares con los cuales la presente invención puede ser practicada, métodos de adición o remoción de sitios de glucosilación, y adición o remoción de estructuras de glucosilo o subestructuras se describen en detalle en WO03/031464 y solicitudes de EUA y PCT relacionadas. La presente invención también proporciona medio de adición (o remoción) de uno o más residuos de glucosilo seleccionados a un péptido, después de lo cual un azúcar modificado se conjuga a por lo menos uno de los residuos de glucosilo seleccionado del péptido. La presente modalidad es útil, por ejemplo, cuando se desea conjugar el azúcar modificado a un residuo de glucosilo seleccionado que está ya sea no presente en un péptido o no está presente en una cantidad deseada. Así, antes de acoplar un azúcar modificado a un péptido, el residuo de glucosilo seleccionado se conjuga al péptido mediante acoplamiento enzimático o químico. En otra modalidad, el patrón de glucosilación de un glucopéptido se altera antes de la conjugación del azúcar modificado por la remoción de un residuo de carbohidrato del glucopéptido. Ver, por ejemplo WO 98/311826. La adición o remoción de cualquier porción de carbohidrato presente en el glucopéptido se logra ya sea química o enzimáticamente. La desglucosilación química preferiblemente se consigue por exposición de la variante del polipéptido al compuesto de ácido trifuorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en el desdoblamiento de la mayoría de los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras que deja el péptido intacto. La desglucosilación química se describe por Hakimuddin y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 259:52(1987) y por Edge y colaboradores, Anal. Biochem. 118:131 (1981). El desdoblamiento enzimático de porciones de carbohidrato en variantes de polipéptido se puede lograr por el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura y colaboradores, Meth. Ezymol. 138:350 (1987). La adición química de porciones de glucosilo se lleva a cabo por cualquier método reconocido en la técnica. La adición enzimática de porciones de azúcar se logra preferiblemente usando una modificación de los métodos establecidos en la presente, sustituyendo unidades de glucosilo nativas para los azúcares modificados usados en la invención. Otros métodos de adición de porciones de azúcar se desglosan en las Patentes de EUA Nos .5, 876, 980, 6,030,815, 5,728,554, y 5,922,577. Los puntos de acoplamiento ejemplares para residuo de glucosilo seleccionado incluyen, pero no se limitan a: (a) sitios de consenso para glucosilación enlaceda a N, y sitios para glucosilación enlaceda a 0; (b) porciones de glucosilo terminal que son aceptores para una glucosiltransferasa; (c) arginina, asparagina e histidina; (d) grupos de carboxilo libres; (e) grupos de sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisterna; (f) grupos de hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina; (g) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofano; o (h) el grupo amida de glutamina. Los métodos ejemplares de uso en la presente invención se describen en WO 87/05330 publicados en Sep. 11, 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). En una modalidad, la invención proporciona un método para enlazamiento de dos o más péptidos a través de un grupo de enlace. El grupo de enlace es de cualquier estructura útil y puede ser seleccionado de estructuras de cadena lineal y ramificada. Preferiblemente, cada término del enlazador, el cual se anexa a un péptido, incluye un azúcar modificado (esto es, un grupo de enlace de glucosilo intacto naciente) . En un método ejemplar de la invención, dos péptidos se enlacen juntos vía una porción enlazadora que incluye un polimérico (por ejemplo, enlazador PEG). El constructo conforma a la estructura general establecida en el dibujo anterior. Como se describe en la presente, el constructo de la invención incluye dos grupos de enlace de glucosilo intactos (esto es, s + t = 1) . El foco en un enlazador PEG que incluye dos grupos de glucosilo es para propósitos de claridad y no debe ser interpretado como limitación de la identidad de brazos enlazadores de uso en esta modalidad de la invención.

Así, una porción de PEG es funcionarizada en un primer término con una unidad de glucosilo y en un segundo término con una segunda unidad de glucosilo. La primera y segunda unidades de glucosilo preferiblemente son sustratos para transferasas diferentes, permitiendo acoplamiento ortogonal del primero y segundo péptidos para la primera y segunda unidades de glucosilo, respectivamente. En la práctica, el enlazador (glucosilo) 1-PEG (glucosilo) 2 es contacta con el primer péptido y una primera transferasa para lo cual la primera unidad de glucosilo es un sustrato, formando de es manera (péptido) 1- (glucosilo) 1-PEG- (glucosilo) 2. La transferasa y/o péptido no reaccionado se remueve luego opcionalmente de la mezcla de reacción. El segundo péptido y una segunda transferasa para lo cual la segunda unidad de glucosilo es un sustrato, se agregan al conjugado (péptido) 1- (glucosilo) 1-PEG- (glucosilo) 2, que forma (péptido) 1- (glucosilo) 1-PEG- (glucosilo) 2- (péptido) 2; por lo menos uno de los residuos de glucosilo se enlace a 0 ya sea directa o indirectamente. Aquellos de experiencia en la técnica apreciarán que el método esbozado anteriormente también es aplicable para formar conjugados entre más de dos péptidos, por ejemplo, mediante el uso de un PEG ramificado, dendrímero, poli (aminoácido) , polisacárido o lo similar. Preparación de Azúcares Modificados . En general, la porción de azúcar o cásete enlazador de porción de azúcar y los grupos PEG o de cásete enlazador de PEG están enlazados juntos a través del uso de grupos reactivos, los cuales son transformados comúnmente por el proceso de enlace en un grupo funcional orgánico nuevo o especie no reactiva. El o los grupos funcionales reactivos de azúcar, se localizan en cualquier posición en la porción de azúcar. Los grupos reactivos y clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención generalmente son aquellos que son bien conocidos en la técnica de química bioconjugada. Las clases actualmente favorecidas de reacciones disponibles con porciones de azúcar reactiva son aquellas, que proceden bajo condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero no se limitan a sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, esteres activos) , sustituciones electrofilicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción Michael, adición Diles-Alder) . Estas y otras reacciones útiles se discuten, por ejemplo, en March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New Cork, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academia Press, San Diego, 1996; y Feeney y colaboradores, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. Los grupos funcionales reactivos útiles pendientes de un núcleo de azúcar o grupo de modificación incluye, pero no se limita a: (a) grupos carboxilo y varios derivados de estos que incluyen, pero no se limitan a, esteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de N-hidroxibenztriazol, haluros de ácido, imidazoles de acilo, tioésteres, esteres de p-nitrofenilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y esteres aromáticos; (b) grupos hidroxilo, los cuales se pueden convertir, por ejemplo, a esteres, éteres, aldehidos, etc. (c) grupos haloalquilo, en donde el haluro puede ser reemplazado posteriormente con un grupo nucleofílico tal como, por ejemplo, una amina, un anión de carboxilato, un anión de tiol, carbanión o un ion de alcixido, resultando de esa manera en el acoplamiento covalente de un grupo nuevo al grupo funcional del átomo de halógeno; (d) grupos dienofilo, los cuales son capaces de participar en reacciones de Diles-Alder tales como, por ejemplo, grupos maelimida; (e) grupos aldehido o cetona, tales que la derivatización subsiguiente es posible vía la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas o oximes, o vía tales mecanismos como adición de Grignard o adición de alquilitio; (f) grupos de haluro sulfonilo para reacción subsiguiente con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas; (g) grupos tiol, los cuales pueden ser, por ejemplo, convertidos a disulfuros o reaccionados con haluros de cilo; (h) grupos amina o sulfhidrílo, los cuales pueden ser, por ejemplo, acilatado, alquilatado u oxidizado; (i) alcanos, los cuales se pueden someter, por ejemplo, a cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc; y (j) epóxidos, los cuales pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxilo. Los grupos funcionales reactivos se pueden seleccionar de manera que ellos no participan, o interfieren, en las reacciones necesarias para ensamblar los núcleos de azúcar reactivo o grupo de modificación. Alternativamente, un grupo funcional reactivo puede ser protegido de la participación en la reacción por la presencia de un grupo de protección. Aquellos expertos en la técnica entenderán cómo proteger un grupo funcional particular tal que este no interfiera con un conjunto seleccionado de condiciones de reacción. Para ejemplos de grupos de protección útiles, ver, por ejemplo, Greene y colaboradores, Protective Groups in Organic Síntesis, John Wiley & Sons, New York, 1991. En la discusión que sigue, se establece un número de ejemplos específicos de azúcares modificados que son útiles en la práctica de la presente invención. En las modalidades ejemplares, un derivado de ácido siálico se utiliza como el núcleo de azúcar para lo cual el grupo de modificación se anexa. El enfoque de la discusión en derivados de ácido siálico es para claridad de la ilustración solamente y no debe ser construido para limitar el alcance de la invención. Aquellos de experiencia en la técnica apreciarán que una variedad de otras porciones de azúcar se pueden activar y derivatizar en una manera análoga que se establece usando ácido siálico como un ejemplo. Por ejemplo, numerosos métodos están disponibles para modificar la galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y fucosa por nombrar unos pocos sustratos, los cuales se modifican fácilmente por métodos reconocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Elhalabi y colaboradores, Curr. Med. Chem. 6:93 (1999); y Schafer y colaboradores, J. Org. Chem. 65:24(2000). En una modalidad ejemplar, el péptido que se modifica por un método de la invención es un glucopéptido que se produce en células mamíferas (por ejemplo, células de CHO) o en un animal transgénico y así, contiene cadenas de oligosacárido enlazado O O ó N enlazado, las cuales son sialilatadas incompletamente. Las cadenas desoligosacáridos del glucopéptido que carece de un ácido siálico y que contiene un residuo de galactosa terminal puede ser PEGilatado, PPGilatado o modificado de otra manera con un ácido siálico modificado.

En el esquema de reacción 1, el amino glucosida 1, se trata con el éster activo de un derivado de aminoácido protegido (por ejemplo, glicina) , que convierte el residuo de amina de azúcar en el aducto de amina de aminoácido protegido que corresponde. El aducto se trata con una aldolasa para formar el carboxilato de a- hidroxi 2. El compuesto 2 se convierte al CMP que corresponde derivado por la acción de sintetasa de CMP-SA, seguido por hidrogenación catalítica del derivativo CMP para producir el compuesto 3. La amina introducida vía formación del aducto de glicina se produce como un lugar del cromosoma de acoplamiento de PEG por reacción del compuesto 3 con un derivado de PEG o PPG (por ejemplo, PEG-C(0)NHS, PEG-OC (O) O-p-nitrofenil) , que produce especies tales como la 4 ó 5, respectivamente.

Esquema de reacción de reacción 1 CMP-SA-5-NHCOCH2NH— C{0)0-PEG 5 La tabla 1 establece ejemplos representativos de monofosfatos de azúcar que se derivan con una porción de PEG.

Ciertos de los compuestos de la Tabla 1 se preparan por el método del Esquema de reacción de reacción 1. Otros derivados se preparan por métodos reconocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, keppler y colaboradores, Glycobiology 11:11R (2001); y Charter y colaboradores, Glucobiology 10:1049 (2000) . Otros análogos de PEG y PPG reactivos de amina están disponibles comercialmente, o se pueden preparar por métodos fácilmente accesibles para aquellos de experiencia en la técnica. Tabla 1 CMP-SA-5-NH-R CMf~Ne»Ac- >-R C P-?cuAc-8-NH-R CMP-N«wAc-4-NH-R CMP»NeuAc -0-R Los fosfatos de azúcar modificados para uso en la práctica de la presente invención pueden ser sustituidos en otras posiciones además de aquellos establecidos anteriormente. Las sustituciones preferidas actualmente de ácido siálico se establecen en la Fórmula II: Fórmula II En las cuales X es un grupo de enlace, el cual preferiblemente se selecciona de -O-, -N(H)-, -S, CH2-, y -N(R)2, el cual R es un miembro seleccionado independientemente de R1-R5. Los símbolos Y, Z, A y B cada uno representa un grupo que se selecciona del grupo establecido anteriormente para la identidad de X. X, Y, Z, A y B son cada uno seleccionados independientemente y, por lo tanto, pueden ser el mismo o diferente. Los símbolos R1, R2, R3, R4 y R5 representan H, una porción de PEG, porción terapéutica, biomolécula u otra porción. Alternativamente, estos símbolos representan un enlazador que se enlaza a una porción PEG, porción terapéutica, biomolécula u otra porción.

Las porciones ejemplares acopladas a los conjugados disueltos en la presente incluyen, pero no se limitan a derivado de PEG (por ejemplo, PEG de acilo, PEG de alquilo acilo, PEG de acilo alquilo, PEG de carbamoilo, PEG de arilo), derivados de PPG (por ejemplo, PPG de acilo, PPG de alquilo acilo, PPG de acilo alquilo, PPG de carbamoilo, PPG de arilo) , porciones terapéuticas, porciones diagnósticas, manosa-6-fosfato, heparina, heparán, SLex, mañosa, manosa-6-fosfato, Sialilo Lewis X, FGF, VFGF, proteínas, condroitina, keratán, dermatán, albúmina, integrinas, anternaria oligosacáridos, péptidos y los similares. Los métodos de conjugación de los diferentes grupos de modificación para una porción de sacárido son fácilmente accesibles para aquellos de experiencia en la técnica (Poli (Etilene Glucol) Chemistry: biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly (Etilene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed. , ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn y colaboradores, Es. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).

Grupos ?nlazadores (Grupos de Reticulación) La preparación del azúcar modificada para uso en los métodos de la presente invención incluye el acoplamiento de una porción de PEG a un residuo de azúcar y preferiblemente, la formación de un aducto estable, el cual es un sustrato para una glucosiltransferasa. Así, a menudo se prefiere para uso un enlazador, por ejemplo, uno formado por reacción del PEG y porción de azúcar con un agente de reticulación para conjugar el PEG y el azúcar. Ejemplarmente los compuestos bifuncionales que se pueden usar para acoplar grupos de modificación a porciones de carbohidrato incluyen pero no se limitan a, poli (etilenglucoles) bifuncionales, poliamidas, poliéteres, poliésteres y similares. En la literatura se conocen aproximaciones generales para enlacer carbohidratos a otras moléculas. Ver, por ejemplo, Lee y colaboradores, Biochemistry 28; 1856 (1989); Bhatia y colaboradores, Anal. Biochem. 178:408 (1989); Janda y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990) y Bednarski y colaboradores, WO 92/18135. En la discusión que sigue, los grupos reactivos se tratan como benignos en la porción de azúcar del azúcar modificado naciente. El enfoque de la discusión es para claridad de ilustración. Aquellos de experiencia en la técnica apreciarán que la discusión es relevante para grupos reactivos en el grupo de modificación también. Una estrategia ejemplar involucra la incorporación de un sulfhidrilo protegido en el azúcar usando el enlazador cruzado heterobifuncional SPDP (n-succinimidil-3- (2- piridilditio) propionato) y luego desproteger el sulfhidrilo para formación de un enlace de bisulfuro con otro sulfhidrilo en el grupo de modificación. Si el SPDP afecta perjudicialmente la capacidad del azúcar modificado para actuar como un sustrato de glucosiltransferas, uno de un arreglo de otros enlazadores cruzados tales como 2-iminotiiolano o N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) se usa para ' formar un enlace de bisulfuro. El 2-iminotiolano reacciona con aminas primarias, incorporando instantáneamente un sulfhidrilo no protegido dentro de la molécula que contiene amina. SATA también reacciona como aminas primarias, pero incorpora un sulfhidrilo protegido, el cual se desacetilata posteriormente usando hidroxilamina para producir un sulfhidrilo protegido, el cual es desacetilatado posteriormente usando hidroxilamina para producir un sulfhidrilo libre. En cada caso, el sulfhidrilo incorporado es libre de reaccionar con otros sulfhidrilos o sulfhidrilos protegidos, como SPDP, formando el enlace de bisulfuro requerido. La estrategia descrita anteriormente es ejemplar, y no limitante, de enlazadores de uso en la invención. Otros reticuladores están disponibles de manera que se pueden usar en diferentes estrategias para enlacer cruzadamente el grupo de modificación al péptido. Por ejemplo, la hidracida de TPCH(S-(2-tiopiridil)-L-cisteína y TPMPH((S-(2- tiopiridil)mercapto-propionohidrazida) reaccionan con porciones de carbohidratos que han sido oxidadas previamente mediante tratamiento de periodato suave, formando así un enlace de hidrazona entre la porción de hidracida del enlazador de cruce y los aldehidos generados de periodato. El TPCH y TPMPH inducen una 2-piridiltiona protegida de grupo sulfhidrilo dentro del azúcar, el cual puede ser desprotegido con DTT y luego usada subsiguientemente para conjugación, así como para formación de enlaces de bisulfuro entre componentes. Si el enlazamiento de bisulfuro se encuentra inapropiado para la producción de azúcares modificados estables, se pueden usar otros enlazadores cruzados que incorporan más enlaces estables entre componentes. Los enlazadores cruzados heterobifuncionales GMBS (N-gama-malimidobutiriloxi) succinimida) y SMCC (succinimidil 4- (N-maleimido-metil) ciciohexano) reaccionan con aminas primarias, introduciendo así un grupo de maleimida dentro del componente. El grupo de maleimida subsiguientemente puede reaccionar con sulfhidrilos en el otro componente, el cual se puede introducir por enlazadores cruzados mencionados previamente, formando así un enlace de tioéter estable entre los componentes. Si el impedimento esférico entre los componentes interfiere ya sea con la actividad del componente o la capacidad del azúcar modificado para actuar como un sustrato de glucosiltransferasa, los enlazadores cruzados se pueden usar los cuales introducen brazos espaciadores largos entre los componente e incluyen derivados de alguno de los enlazadores cruzados mencionados previamente (esto es, SPDP) . Así, existe una abundancia de enlazadores cruzados apropiados, los cuales son útiles; cada uno de los cuales se selecciona dependiendo de los efectos que este tenga en el conjugado de péptido óptimo y la producción de azúcar modificada . Se usa una variedad de reactivos para modificar los componentes del azúcar modificada con enlazadores cruzados químicos intramoleculares (para reseñas de reactivos de reticulación y procedimientos de reticulación ver; Wold, F. , Meth. Enzymol. 25:623-651, 1972; Weetall, H. H., y Cooney, D. A., In: Enzymes as Drugs. (holcengerg, and Toberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, U. EL, Meth Enzymol. 91:580-609, 1983; Mattson y colaboradores, mol. Biol. Rep. 17:167-183, 1993, todos los cuales están incorporados en la presente por referencia) . Los reactivos de reticulación preferidos se derivan de varios reactivos de reticulación de longitud cero, homo-bifuncional, y hetero-bifuncional . Los reactivos de reticulación de longitud cero incluyen la conjugación directa de dos grupos químicos intrínsecos sin introducción de material extrínseco. Los agentes que catalizan la formación de un enlace de disulfuro pertenecen a esta categoría. Otro ejemplo son reactivos que inducen la condensación de un carboxilo y un grupo amino primario para formar un enlace de amida tal como carbodiimidas, etilcloroformato, reactivo de Woodward K(2-etil-5-fenilisoxazolio-3' -sulfonato) , y carbonildiimidazol. Además a estos reactivos químicos, la transgluta inasa de enzima (glutamil-péptido ?-glutamiltransferasa; EC 2.3.2.13) se puede usar como reactivo de enlacedura de cruce de longitud cero. Esta enzima cataliza las reacciones de transferencia de acilo en grupos de carboxamida de residuos de glutaminilo de enlace de proteína, usualmente con un grupo amino primario como sustrato. Los reactivos homo- y tetero-bifuncionales preferidos contienen dos sitios idénticos o diferentes, respectivamente, los cuales pueden ser reactivos para grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol o no específicos. i . Sitios Específicos Preferidos en Reactivos de Reticulación . 1. Grupos Reactivos de Amino . En una modalidad preferida, los sitios en el enlazador de cruce son grupos reactivos amino. Ejemplos útiles, sin limitación, de grupos reactivos amino incluyen esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) , imidoésteres, isocianatos, acilhaluros, arilazidas, esteres de p-nitrofenilo, aldehidos, y cloruros de sulfonilo.

Los esteres NHS reaccionan preferiblemente con los grupos amino primarios (incluyen aromáticos) de un componente de azúcar modificado. Los grupos de imidazol de histidinas se conocer por competir con aminas primarias para reacción, pero los productos de reacción son inestables e hidrolizados fácilmente. La reacción involucra el ataque nucleofílico de una amina en el ácido carboxilo de un éster NHS para formar una amida, liberando la N-hidroxisuccinimida . Así, la carga positiva del grupo amino original se pierde. Los imidoésteres son los reactivos de acilación más específicos para reacción con los grupos amina de los componentes de azúcar modificados. A un pH entre 7 y 10, los imidoésteres reaccionan solamente con aminas primarias. Las minas primarias atacan imidatos nucleofílicamente para producir un intermediario que frena imidina a pH alto o a un imidato nuevo a pH bajo. El imidato nuevo puede reaccionar con otra amina primaria, enlacendo cruzadamente así dos grupos amino, un caso de imidato monofuncional supuestamente que reacciona bifuncionalmente . El producto principal de reacción con aminas primarias es una midina que es una base más fuerte que la amina original. La carga positiva del grupo amino original, por lo tanto, se retiene. Los isocianatos (e isotiocianatos) reaccionan con las aminas primarias de los componentes de azúcar modificados para formar enlaces estables. Sus reacciones con grupos sulfhidrilo, imidazol, y tirosilo dan productos relativamente inestables . Las acilazidas también se usan como reactivos específicos de amino en los cuales las aminas nucleofílicas del componente de afinidad atacan grupos carboxilo ácidos bajo condiciones ligeramente alcalinas, por ejemplo, pH 8.5.

Los arilhaluros tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno reaccionan preferentemente con los grupos amino y grupos fenólicos de tirosina de componentes de azúcar modificado, pero también con grupos sulfhidrílo e imidazol. Los esteres de n-Nitrofenilo de ácidos mono- y dicarboxílicos también son grupos reactivos de amino útiles. Aunque la especificidad del reactivo no es muy alta, los grupos a- y e-amino aparentan reaccionar más rápidamente. Los aldehidos tales como glutaraldehído reaccionan con aminas primarias de azúcar modificado. Aunque las bases de Schiff inestables se forman en reacción de los grupos amino con los aldehidos de los aldehidos, el glutaraldehído es capaz de modificar el azúcar modificado con enlaceduras cruzadas estables. A pH de 6-8, el pH de condiciones de reticulación común, los polímeros cíclicos se someten a hidratación para formar polímeros de aldehido insaturados a-ß. Sin embargo, las bases de Schiff son estables, cuando se conjugan con otro enlace doble. La interacción resonante de ambos enlaces dobles previene la hidrólisis de la enlacedura de Schiff. Más aún, las aminas a concentraciones locales altas pueden atacar el enlace doble etilénico para formar un producto de adición de Michael estable. Los cloruros de sulfonilo aromáticos reaccionan con una variedad de sitios de los componentes de azúcar modificados, pero la reacción con los grupos amino es la más importante, resultando en una enlacedura de sulfonamida estable. 2. Grupos Reactivos de Sulfhidrilo . En otra modalidad preferida, los sitios son grupos reactivos de sulfhidrilo. Ejemplos sin limitación útiles de grupos reactivos de sulfhidrilo incluyen maleimidas, haluros de alquilo, disulfuros de piridilo, y tioftalimidas . Las maleimidas reaccionan preferentemente con el grupo sulfhidrilo de los componentes de azúcar modificados para formar enlaces de tioéter estables. Ellos también pueden reaccionar a una velocidad mucho más lenta con grupos amino primario y los grupos de imidazol de histidinas. Sin embargo, a pH 7 el grupo maleimida se puede considerar un grupo específico de sulfhidrilo, puesto que a este pH la velocidad de reacción de tioles simples es 1000 veces mayor que aquella de la amina que corresponde. Los haluros de alquilo reaccionan con grupos sulfhidrilo, sulfuros, imidazoles, y grupos amino. A pH neutral a ligeramente alcalino, sin embargo, los haluros de alquilo reaccionan primeramente con grupos sulfhidrilo para formar enlaces de tioéter estables. A pH más alto, la reacción con grupos amino se favorece. Los disulfuros de piridilo reaccionan con sulfhidrilos libres vía intercambio de disulfuro para dar disulfuros mezclados. Como un resultado, los disulfuros de piridilo son los grupos reactivos de sulfhidrilo más específicos. Las tioftalimidas reaccionan con grupos sulfhidrilo libres para formar disulfuros. 3. Residuo Reactivo de Carboxilo . En otra modalidad, las carbodiimidas solubles en tanto en agua como en solvente orgánico, se usan como agentes reactivos de carboxilo. Estos compuestos reaccionan con grupos carboxilo libres formando una pseudourea que luego se puede acoplar a aminas disponibles que producen una enlacedura de amina enseñan cómo modificar un grupo carboxilo con carbodiimida (Yamada y colaboradores, Biochemistry 20: 4836-4842, 1981) . ii . Sitios No Específicos Preferidos en Reactivos de Enlacedura de Cruce. Además para el uso de porciones reactivas específicas de sitio, la presente invención contempla el uso de grupos reactivos no específicos para enlacer el azúcar a grupos modificados . Ejemplarmente las enlaceduras de cruce no específicas incluyen grupos fotoactivables, completamente inertes en la oscuridad, los cuales se convierten a especies reactivas en absorción de un fotón de energía apropiado. En una modalidad preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de precursores de nitrenos generados en calentamiento o fotolisis de azidos. Los nitrenos son extremadamente reactivos y pueden reaccionar con una variedad de enlaces químicos que incluyen N-H, 0-H, C-H, y C=C. Aunque pueden ser empleados tres tipos de azidos (derivados de arilo, alquilo y acilo), los arilazidos son preferidos actualmente. La reactividad de arilazidos en fotolisis es mejor con enlaces N-H y O-H que con C-H. Los arilnitrenos deficientes de electrón expanden el anillo rápidamente para formar deshidroazepinas, las cuales tienden a reaccionar con nucleofilo, mejor que formar productos de inserción de C-H. La reactividad de arilazidos se puede incrementar por la presencia de sustitutos que retiran electrón tales como grupos nitro o hidroxilo en el anillo. Tales sustituyentes empujan la absorción máxima de arilazidos a longitud de onda más larga. Los arilazidos no sustituidos tienen una absorción máxima en el rango de 260-280 nm, mientras que los hidroxi y nitroarilazidos absorben luz significante más allá de 305 nm. Por lo tanto, los hidroxi y nitroarilazidos son más preferibles puesto que permiten emplear condiciones de fotolisis menos dañinas para el componente de afinidad que arilazidas no sustituidos. En otra modalidad preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de arilazidos fluorinatados . Los productos de fotolisis de arilazidos flurinatados son arilnitrenos, todos los cuales se someten a las reacciones características de este grupo, incluyendo inserción de enlace C-H, con alta eficiencia (Keana y colaboradores, J. Org. Chem. 55:3640-3647, 1990) . En otra modalidad, los grupos fotoactivables se seleccionan de residuos de benzofenona. Los reactivos de benzofenona generalmente dan rendimientos de reticulación más grande que los reactivos de arilazido. En otra modalidad, los grupos fotoactivables se seleccionan de compuestos de diazo, los cuales forman un carbeno deficiente de electrón en fotolisis. Estos carbenos sometidos a una variedad de reacciones incluyen la inserción en enlaces C-H, adición a enlaces dobles (que incluyen sistemas aromáticos) , atracción de hidrógeno y coordinación a centros nucleofílicos para dar iones de carbono. En todavía otra modalidad, los grupos fotoactivables se seleccionan de diazopiruvatos . Por ejemplo, el éster de p-nitrofenilo de diazopiruvato de p-nitrofenilo reacciona con aminas alifáticas para dar amidas de ácido diazopirúvico que se someten a fotolisis ultravioleta para formal aldehidos. El componente de afinidad modificada de diazopiruvato fotolizado reaccionará como formaldehído o glutaraldehído formado enlaceduras cruzadas. iii . Reactivos Homobif ncionales . 1. Enlazadores cruzados ho obifuncionales reactivos con aminas primarias . La síntesis, propiedades, y aplicaciones de enlazadores cruzados reactivos de amina se describen comercialmente en la literatura (para reseñas de procedimientos y reactivos de reticulación, ver a continuación) . Muchos reactivos están disponibles (por ejemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, 111.; Sigma Chemical Company, St . Louis, Mo . ; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. ) . Ejemplos sin limitación preferidos de esteres NHS homobifuncionales incluyen glutarato de disuccinimidilo (DSG) , sorbato de disuccinimidilo (DSS) , suberato de bis (sulfosuccinimidilo) (BS) , tartarato de disuccinimidilo (DST) , tartarato de Disulfosuccinimidilo (sulfa-DST) , bis-2- (succinimidooxicarboniloxi) etilsulfona (BSOCOES) , bis-2- (sulfosuccinimidooxicarboniloxi) etilsulfona (sulfa-BSOCOES) , etilen glucolbis (succinimidilsuccinato) (EGS) , etilen glucolbis (sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfa-EGA) , ditiobis (succinimidilpropionato (DSP), y ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato (sulfa-DSP). Ejemplos si limitación preferidos de imidoésteres homobifuncionales incluyen malinimidato de dimetilo (DMM) , succinimidato de dimetilo (DMSC) , adipimidato de deimetilo (DMA) , pimelimidato de dimetilo (DMP) , suberimidato de dimetilo (DMS) , dimetil- 3, 3' -oxidipropionimidato (DODP) , dimetil-3, 3' - (metilenedioxi) dipropionimidato (DMDP) , dimetil-, 3'- (dimetilenedioxi) dipropionimidato (DDDP) , dimetil-3, 3' - (tetrametilenedioxi) -dipropionimidato (DTDP) , y dimetil-3, 3 ' -ditiobispropionimidato (DTBP) . Ejemplos sin limitación preferidos de isotiocianatos homobufuncionales incluye: p-fenilendiisotiocianato (DITC) , y stilbeno de ácido 4, 4' -diisotiociano-2, 2' -disulfónico (DIDS) . Ejemplos sin limitación preferidos de isocianatos homobifuncionales incluyen diisocianato de xileno, 2,4-diisocianato de tolueno, tolueno 2-isocianato-4-isotiocianato, 3-metoxidifenilmetano-4, 4' -diisocianato, 2,2'-dicarboxi-4, 4' -azofenildiisocianato, y hexametilendiisocianato . Ejemplos sin limitación preferidos de arilhaluros homobifuncionales incluyen 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno (DFDNB), y 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenil-sulfona. Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos de aldehido alifáticos homobifuncionales incluyen glioxal, malondialdehído, y glutaraldehído.

Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos de acilación homobifuncionales incluyen esteres de nitrofenilo de ácidos dicarboxílicos . Ejemplos sin limitación preferidos de cloruros de sulfonilo' aromáticos homobifuncionales incluyen cloruro de fenol-2, 4-disulfonilo, y cloruro de a-naftol-2, 4-disulfonilo.

Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos homobifuncionales reactivos de amono adicionales incluyen eritritolbiscarbonato el cual reacciona con aminas para dar biscarbamatos . 2. Enlazadores cruzados Homofuncionales Reactivos con Grupos Sulfhidrilo Libres . Síntesis, propiedades, y aplicaciones de los reactivos se describen en la literatura (para reseñas de procedimientos y reactivos de reticulación, ver lo anterior) . Muchos de los reactivos están disponibles comercialmente (por ejemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, 111.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) .

Ejemplos sin limitación preferidos de maleimidas homobifuncionales incluyen bismaleimidohexano (BMH) , N,N'-1, 3-fenileno) bismaleimida, N, N' - (1, 2-fenileno) bismaleimida, azofenildimaleimida, y bis (N-maleimidometilo) éter . Ejemplos sin limitación preferidos de disulfuros de piridilo homobifuncionales incluyen 1, -di-3' - (2' -piridilditio) propionamidobutano (DPDPB) .

Ejemplos sin limitación preferidos de haluros de alquilo homobifuncionales incluyen 2, 2 ' -dicarboxi-4, 4' - diiodoacetamidoazobenceno, ácido a-a' -diiodo-p-xilensulfónico, ácido a, a' -dibromo-p-xilensulfónico, N,N'-bis (b-bromoetil) benzilamina, N,N'-di (bromoacetil) feniltidrazina, y 1, 2~di (bromoacetil) amino-3-fenilpropano . 3. Reticuladores Fotoactivables Homobifuncionales . Síntesis, propiedades, y aplicaciones de los reactivos se describen en la literatura (para reseñas de procedimientos y reactivos de reticulación, ver lo anterior) . Algunos de los reactivos están disponibles comercialmente (por ejemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, 111.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . Ejemplos sin limitación preferidos de reticuladores fotoactivables homofuncionales incluyen bis-ß-(4-azidosalicilamido) etildisulfuro (BASED), di-N- (2-nitro-4-azidofenilo) -cistamina-S, S-dióxido (DNCO) , y 4,4'-ditiobisfenilazido . iv. Reactivos Heterobif ncionales . 1. Reactivos Heterobifuncionales de Reacción de Amino con una Porción Disulfuro de Piridilo . Síntesis, propiedades, y aplicaciones de los reactivos se describen en la literatura (para reseñas de procedimientos y reactivos de reticulación, ver lo anterior) . Muchos de los reactivos están disponibles comercialmente (por ejemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, 111.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo . ; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos hetero- bifuncionales con una porción de disulfuro de piridilo y un éster NHS reactivo de amino incluyen N-succinimidil-3- (2- piridilditio) propionato (SPDP), Succinimidil 6-3- (2-piridilditio) ropionamidohexanoato (LC-SPDP) , sulfosuccinimidil 6-3(2-piridilditio) ropionamidohexanoato (sulfa-LCSPDP) , 4- succinimidiloxicarbonil-a-metil-cí- (2-piridilditio) tolueno (SMPT) , y sulfosuccinimidil 6-a-metil-a- (2-piridilditio) toluamidohexanoato (sulfa-LC-SMPT) . 2. Reactivos Heterobifuncionales de Reacción de Amino con una Porción de Maleimida. Síntesis, propiedades, y aplicaciones de los reactivos se describen en la literatura. Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos hetero-bifuncionales con una porción de maleimida y un éster NHS reactivo amino incluyen maleimidilacetato de succinimidilo (AMAS) , 3-maleimidilpropionato de succinimidilo (BMPS) , éster de N-?-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS) , éster de N-?-maleimidobutiriloxisulfo succinimica (sulfa-GMBS) , 6-maleimidilhexanoato de succinimidilo (EMCS) , 3-maleimidilbenzoato de succinimidilo (SMB) , éster de m- maleimidobenxoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) , éster de m-maleimidobenxoil-N-hidroxisulfosuccinimica (sulfo MBS), 4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) , 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfa-SMCC) , 4- (p-maleimidofenil) butirato de succinimidilo (SMPB) , y 4- (p-maleimidofenil) butirato de sulfosuccinimidilo (Sulfa-SMPB) . 3. Reactivos Heterobifuncionales de Reacción de Amino con una Porción de Haluro de Alquilo . Síntesis, propiedades, y aplicaciones de los reactivos se describen en la literatura. Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos hetero-bifuncionales con una porción de haluro de alquilo y un éster NHS reactivo de amino incluyen N-succinimidil- (4-iodoacetil) aminobenzoato (SIAB) , sulfosuccinimidil- (4-iodoacetil) aminobenzoato (sulfa SIAB) , succinimidil-6- (iodoacetil) aminohexanoato (SIAX) , succinimidil-6- ( 6- ( (iodoacetil) -amino) hexanoilamino) hexanoato (SIAXX) , succinimidil-6- ( ( (4- (iodoacetil) -amino) -metil) -ciclohexano-1-carbonil) aminohexanoato (SIACX) , y succinimidil-4- ( (iodoacetil) -amino) metilciclohexano-1-carboxilato (SIAC) . Un ejemplo preferido de un reactivo hetero-bifuncional con un éster NHS reactivo de amino y una porción de dialuro de alquilo es 2, 3-dibromopropionato de N-hidroxisuccinimidilo (SDBP) . El SDBS introduce enlaceduras de cruce intramoleculares al componente de afinidad mediante conjugar sus grupos amino. La reactividad de la porción dibromopropionilo hacia grupos amino primario se controla por la temperatura de reacción (McKenzie y colaboradores, Protein Chem. 7:581-592 (1988)). Ejemplos sin limitación preferidos de reactivos hetero-bifuncionales con una porción de haluro de alquilo y una porción de éster de p-nitrofenilo reactivo de amino icluyen iodoacetato de p-nitrofenilo (NPIA) . Otros agente de reticulación se conocen por aquellos de experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Pomato y colaboradores, Patente de EUA No. 5,965,106. Está dentro de las capacidades de uno de experiencia en la técnica seleccionar un agente de enlacedura apropiado para una aplicación particular. v. Grupos de ?nlazador Desdoblable. En todavía una modalidad más, el grupo enlazador se proporciona con un grupo que puede ser desdoblado para liberar al grupo de modificación del residuo de azúcar. Muchos grupos desdoblables se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Jung y colaboradores, Biochem. Biophys. Acta 761:152-162 (1983); Joshi y colaboradores, J. Biol. Chem. 265:14518-14525 (1990); Zarling y colaboradores, J. Immunol . 124:913-920 (1980); Bouizar y colaboradores, Eur. J. Biochem. 155:141-147 (1986); Park y colaboradores, J. Biol. Chem. 261:205-210 (1986); Browing y colaboradores, J. Immunol . 143:1859-1867 (1989). Más aún una amplia variedad de grupos enlazadores bifuncionales (ambos homo- y hetero-bifuncionales) desdoblables están disponibles comercialmente de proveedores tales como Pierce. Porciones desdoblables ejemplares se pueden desdoblar usando luz, calor o reactivos tales como tiol, hidroxilamina, bases, periodato y similares. Más aún, ciertos grupos preferidos se desdoblan in vivo en respuesta a que son endocitizados (por ejemplo, cis-aconitilo; ver, Shen y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Común. 102:1048(1991)). Los grupos desdoblables preferidos comprenden una porción desdoblable la cual es un miembro seleccionado del grupo que consiste de grupos de disulfuro, éster, imida, carbonato, nitrobencilo, fenacilo y benzoin. Conjugación de Azúcares Modificados a Péptidos . Los azúcares modificados PEG se conjugan a un péptido glucosilatado o no glucosilatado usando una enzima apropiada para mediar la conjugación. Preferiblemente, las concentraciones del o los azúcares donadores modificados, enzima o enzimas y péptido o péptidos aceptores se seleccionan de manera que proceda la glucosilación hasta que el aceptor se consume. Las consideraciones discutidas a continuación, mientras que se establecen en el contexto de una sialiltransferasa, generalmente son aplicables a otras reacciones de glucosiltransferasa. Se conocen un sinnúmero de métodos de uso de glucosiltransferasas para sintetizar las estructuras de oligosacáridos deseadas y generalmente son aplicables a la invención actual. Métodos ejemplares se describen, por ejemplo, WO 96/32491, Ito, y colaboradores, Puré Appl. Chem. 65:753 (1993), Patentes de EUA Nos. 5,352,670, 5,374,541, 5,545,553, y comúnmente las propias Patentes de EUA Nos. 6,399,336, y 6,440,703 las cuales están incorporadas en la presente por referencia. La presente invención se practica usando una glucosiltransferasa única o una combinación de glucosiltransferasas. Por ejemplo, uno puede usar una combinación de una sialiltransferasa y una galactosiltransferasa. En aquellas modalidades usando más de una enzima, las enzimas y los sustratos preferiblemente se combinan en una mezcla de reacción inicial, o las enzimas y reactivos para una segunda reacción enzimática se agregan al medio de reacción una vez que la primera reacción enzimática está completa o cercanamente completa. Mediante la conducción de dos reacciones enzimáticas en secuencia en un recipiente único, los rendimientos generales se mejoran sobre procedimientos en los cuales unas especies intermedias se aislan. Más aún, la limpieza y desecho de solventes extras y sub productos se reduce.

En una modalidad preferida, cada una de las primera y segunda enzima es una glucosiltransferasa. En otra modalidad preferida, una enzima es una endoglucosidasa. En una modalidad preferida adicional, más de dos enzimas se usan para ensamblar la glucoproteína modificada de la invención. Las enzimas se usan para alterar una estructura de sacárido en el péptido en cualquier punto ya sea antes o después de la adición del azúcar modificado al péptido. En otra modalidad, el método hace uso de una o más exo- o endoglucosidasa. La glucosidasa comúnmente es un mutante, el cual se diseña para formar enlaces de glucosilo mejor que la ruptura de ellos. La glicanasa mutante comúnmente incluye una sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido ácido de sitio activo. Por ejemplo, cuando la endoglicanasa es endo-H, los residuos de sitio activo sustituidos comúnmente serán Asp en la posición 130, Glu en posición 132 o una combinación de estos. Los aminoácios generalmente se reemplazan con serina, alanina, asparagina, o glutamina. La enzima mutante cataliza la reacción, usualmente por un paso de síntesis que es análogo a la reacción inversa del paso de hidrólisis de endoglicanasa. En estas modalidades, la molécula donadora de glucosilo (por ejemplo, una estructura de oligo- o mono-sacárido deseada) contiene un grupo que deja y la reacción procede con la adición de la molécula donadora a un residuo GlcNAc en la proteína. Por ejemplo, el grupo que deja puede ser un halógeno, tal como fluoruro. En tras modalidades, el grupo que deja es un Asn, o una porción de péptido Asn. En todavía más modalidades el residuo GlcNAc en la molécula donadora de glucosilo se modifica. Por ejemplo, el residuo GlcNAc puede comprender una porción de 1,2 oxazolina. En una modalidad preferida, cada una de las enzimas utilizadas para producir un conjugado de la invención está presente en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía de acuerdo con la concentración de aquel sustrato de enzima además de las condiciones de reacción tales como temperatura, tiempo y valor de pH. Los medios para determinar la cantidad catalítica para una enzima dada bajo concentraciones de sustrato preseleccionadas y las condiciones de reacción son bien conocidos para aquellos de experiencia en la técnica. La temperatura a la cual un proceso anterior se lleva a cabo está en el rango de justo arriba de congelamiento hasta la temperatura a la cual la enzima más sensitiva se desnaturaliza. Los rangos de temperatura preferidos son alrededor de 0°C hasta alrededor de 55°C, y más preferiblemente alrededor de 20 °C hasta alrededor de 30 °C. En otra modalidad ejemplar, uno o más componentes del presente método se conducen a una temperatura elevada usando una enzima termofílica. La mezcla de reacción se mantiene por un período de tiempo suficiente para el aceptor a ser glucosilatado, formando de esa manera el conjugado deseado. Algunos de los conjugados a menudo pueden ser detectados después de pocas horas, con cantidades recuperables usualmente siendo obtenidos dentro de 24 horas o menos. Aquellos de experiencia en la técnica entienden que la velocidad de reacción es dependiente de un sinnúmero de factores variables, (por ejemplo, concentración de la enzima, concentración de donador, concentración del aceptor, temperatura, volumen del solvente) , los cuales se optimizan para un sistema seleccionado. La presente invención también proporciona para la producción a escala industrial de péptidos modificados. Como se usa aquí, una escala industrial generalmente produce por lo menos un gramo de conjugado terminado purificado. En la discusión que sigue, la invención se ejemplifica por la conjugación de porciones de ácido siálico modificado a un péptido glucosilatado. El ácido siálico modificado ejemplar se etiqueta con PEG. El enfoque de la siguiente discusión en el uso de ácido siálico modificado con PEG y péptidos glucosilatados es para claridad de ilustración y no se proyecta para implicar que la invención se limita a la conjugación de estos dos compañeros. Uno de experiencia entiende que la discusión generalmente es aplicable a las adiciones de porciones de glucosilo modificadas diferentes al ácido siálico. Más aún, la discusión es aplicable igualmente a la modificación de una unidad de glucosilo con otros agentes diferentes a PEG que incluyen PEG y otras porciones de PEG, porciones terapéuticas, y biomoléculas. Una aproximación enzimática se puede usar para la introducción selectiva de carbohidratos PEGilatados o PPGilatados en un péptido o glucopéptido. El método utiliza azúcares modificados que contienen PEG, PPG, o un grupo funcional reactivo oculto, y se combina con la glucosiltransferasa o glucosintasa apropiadas. Por selección la glucosiltransferasa que hará la enlace de carbohidrato deseada y utiliza el azúcar modificado como el sustrato donador, el PEG o PPG se puede introducir directamente en el soporte del péptido, en los residuos de azúcar que se extingue de un glucopéptido o en residuos de azúcar que han sido agregados a un péptido. Un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el péptido para ser modificado por los métodos de la presente invención ya sea como una estructura que ocurre naturalmente o una colocada recombinantemente, enzimáticamente o químicamente. Los aceptores apropiados, incluyen, por ejemplo, aceptores de galactosilo tales como Galßl, 4GlcNAc, Galßl, 4GalNAc, Galßl, 3GaqNAc, lacto-N-Ntetraosa, Galßl, 3GlcNAc, Galßl, 3Ara, Galßl, 6GlcNAc, Galßl, 4Glc (lactosa), y otros aceptores conocidos por aquellos de experiencia en la técnica (ver, por ejemplo, Paulson y colaboradores, J. Biol. Chem. 253:5617-5624 (1978)). En una modalidad, un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el glucopéptido para ser modificado en síntesis in vivo del glucopéptido. Tales glucopéptidos pueden ser sialilatadas usando los métodos reivindicados sin modificación anterior del modelo de glucosilación del glucopéptido. Alternativamente, los métodos de la invención se pueden usar para sialilar un péptido que no incluye un aceptor apropiado; uno primero modifica el péptido para incluir un aceptor por métodos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. En una modalidad ejemplar, un residuo de GalNAc se agrega por la acción de una transferasa GalNAc. En una modalidad ejemplar, el aceptor de galactosilo se ensambla por acoplamiento a un residuo de galactosa a un aceptor apropiado enlazado por el péptido, por ejemplo, un GlcNAc. Los métodos incluyen la incubación del péptido para ser modificado con una mezcla de reacción que contiene una cantidad apropiada de una galactosiltransferasa (por ejemplo, galßl, 3 o glaßl, 4) , y un donador de galactosilo apropiado (por ejemplo, UDP-galactosa) . La reacción se deja para que proceda sustancialmente para completar o, alternativamente, la reacción se termina cuando una cantidad preseleccionada del residuo de galactosa se agrega. Otros métodos de ensamble de un aceptor de sacárido seleccionado serán palpables para aquellos de experiencia en la técnica. En todavía otra modalidad, los oligosacáridos enlazados a glucopéptido son primero "recortados", ya sea en su totalidad o en parte, para exponer cualquiera de un aceptor para la sialiltransferasa o una porción para la cual uno o más residuos apropiados se pueden agregar para obtener un aceptor apropiado. Las enzimas tales como glucosiltrnsferasas y endoglucosidasas (ver, por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,716,812) son útiles para las reacciones de acoplamiento y recorte . En la discusión que sigue, el método de la invención se ejemplifica por el uso de azúcares modificados que tienen una porción de PEG acoplada a estos. El enfoque de la discusión es para claridad de ilustración. Aquellos de experiencia apreciarán que la discusión es igualmente relevante para aquellas modalidades en las cuales el azúcar modificado lleva una porción terapéutica, biomolécula o similar. En una modalidad ejemplar de la invención en la cual un residuo de carbohidrato es "recortado" antes de la adición del azúcar modificado la mañosa alta es recortada a la primera generación de estructura biantenaria. Un azúcar modificado que lleva una porción de PEG se conjuga a uno o más de los residuos de azúcar expuestos por el "recorte". En una modalidad una porción de PEG se agrega vía una porción de GlcNAc conjugada a la porción de PEG. La GlcNAc modificada se agrega a uno o ambos de los residuos de mañosa terminales de la estructura biantenaria. Alternativamente, una GlcNAc no modificada se puede agregar a una o ambas de las terminaciones de la especie ramificada. En otra modalidad ejemplar, una porción de PEG se agrega a uno o ambos de los residuos de mañosa terminal de la estructura biantenaria vía un azúcar modificado que tiene un residuo de galactosa, el cual se conjuga a un residuo de GlcNAc agregado en los residuos de mañosa terminales. Alternativamente, un Gal modificado se puede agregar a uno o ambos residuos GlcNAc terminales. En todavía un ejemplo más, una porción de PEG se agrega en un residuo de Gal usando un ácido siálico modificado. En otra modalidad ejemplar, una estructura de mañosa alta es "recortada" a mañosa de la cual la estructura biantenaria se ramifica. En un ejemplo, una porción de PEG se agrega vía un GlcNAc modificado con el polímero. Alternativamente, un GlcNAc no modificado se agrega a la mañosa, seguida por un Gal con una porción PEG acoplada. En todavía otra modalidad, residuos de GlcNAc y Gal no modificados son agregados secuencialmente a la mañosa, seguidos por una porción de ácido siálico modificado con una porción de PEG . En una modalidad ej emplar más , la mañosa alta es "recortada" a GlcNAc a la cual la primera mañosa se acopla .

El GlcNAc se conj uga con un residuo de Gal que lleva una porción de PEG . Alternativamente, un Gal no modificado se agrega al GlcNAc, seguido por la adición de un ácido siálico modificado con un azúcar soluble en agua . En todavía un ej emplo más , el GlcNAc terminal se conj uga con Gal y el GlcNAc es fucosílatado subsiguientemente con una mucosa modificada que lleva una porción de PEG . La mañosa alta también puede ser recortada al primer GlcNAc del residuo GlcNAc- (Fuc) a se conjuga con un GlcNAc que lleva un polímero soluble en agua. En otro ejemplo, el GlcNAc del residuo GlcNAc- (Fue) a se modifica con Gal, el cual lleva un polímero soluble en agua. En todavía una modalidad más, el GlcNAc se modifica con Gal, seguido por conjugación a Gal de un ácido siálico modificado con una porción de PEG. Otras modalidades ejemplares se establecen comúnmente en Publicaciones de Solicitud de Patente de EUA Nos : 20040132640; 20040063911; 20040137557; Solicitudes de Patente de EUA Nos . : 10/369, 979; 10/410, 913; 10/360, 770; 10/410, 945 y PCT/US02/32263 admitidas cada una de las cuales está incorporada en la presente por referencia . Los ej emplos establecidos anteriormente proporcionan una ilustración de la fuerza de los métodos establecidos en la presente. Usando los métodos descritos en la presente, es posible "recortar" y construir un residuo de carbohidrato de sustancialmente cualquier estructura deseada. El azúcar modificado se puede agregar a la terminación de la porción de carbohidrato como se estableció anteriormente, o esta puede ser intermedia entre el núcleo del péptido y la terminación del carbohidrato. En una modalidad ejemplar, un ácido siálico que existe se remueve de un glucopéptido usando una sialidasa, haciendo visibles de esa manera todos o la mayoría de los residuos de galactosilo esenciales. Alternativamente, un péptido o glucopéptido se etiqueta con residuos de galactosa, o un residuo de oligosacárido que termina en una unidad de galactosa. Siguiendo la exposición o adición de los residuos de galactosa, se usa una sialiltransferasa apropiada para agregar un ácido siálico modificado. La aproximación se resume en el Esquema de reacción de reacción 2. Esquema de reacción de reacción 2 En todavía una aproximación más, resumida en el Esquema de reacción de reacción 3, una funcionalidad de reactivo oculta está presente en el ácido siálico. El grupo reactivo oculto preferiblemente no es afectado por las condiciones usadas para acoplar el ácido siálico modificado a la eritropoyetina. Después del acoplamiento covalente del ácido siálico modificado al péptido, el ocultamiento se remueve y el péptido se conjuga con un agente tal como PEG. El agente se conjuga al péptido de una manera específica por su reacción con el grupo reactivo no oculto en el residuo de azúcar modificado. Esquema de reacción de reacción 3 Cualquier azúcar modificado puede ser usado con su glucosiltransferasa apropiada, dependiendo de los azúcares terminales de las cadenas laterales de oligosacárido del glucopéptido (Tabla 2). Como se discutió anteriormente, el azúcar terminal del glucopéptido requerido para introducción de la estructura PEGilatada se puede introducir naturalmente durante la expresión o esta puede ser producida después de expresión usando la o las glucosidasas, glucosiltransferasas apropiadas o mezclas de la o las glucosidasas y glucosiltransferasas . Tabla 2 Derivados de UDP-galactosa (cuando A =NH, R4 puede ser acetilo) Derivados de UDP-glucosa Derivados de UDP-glucosamina (cuando A =NH, R puede ser acetilo) Derivados de GDP-Mannosa X = O, NH, S, C N-{ ?-5)2. Y = X; Z = X; A = X? B = X. Q = H2> 0, St NH,N-R. R, R.?- = H, Ligador-M, M. =PEG, e.g., p?-PE? En una modalidad ejemplar más, la UDP-galactosa-PEG se hace reaccionar con ßl, 4-galactosiltransferasa de leche de bovino, transfiriendo de esa manera la galactosa modificada a la estructura de N-acetilglucosamina terminal apropiada. Los residuos de GlcNAc terminales en el glucopéptido se pueden producir durante la expresión, como puede ocurrir en los sistemas de expresión como mamíferos, insectos, plantas u hongos, pero también pueden ser producidos por tratamiento del glucopéptido con una sialidasa y/o glucosidasa y/o glucosiltransferasa, como se requiera. En otra modalidad ejemplar, una transferasa GlcNAc, tal como GNT1-5, se utiliza para transferir GlcN PEGilatado a un residuo de mañosa terminal en un glucopéptido. En todavía una modalidad ejemplar más, las estructuras de glican enlazados a N- y/u O- se remueven enzimáticamente de un glucopéptido para exponer un aminoácido o un residuo de glucosilo terminal que se conjuga subsecuentemente con el azúcar modificado. Por ejemplo, una endoglicanasa se usa para remover las estructuras enlacedas a N de un glucopéptido para exponer un GlcNAc C-terminalomo un GlcNAc-enlazado-Asn en el glucopéptido. EL UDP-Gal-PEG y la galactosiltransferasa apropiada se usan para introducir la funcionalidad de galactosa con PEG en el GlcNAc expuesto. En una modalidad alternativa, el azúcar modificado se agrega directamente a la estructura del péptido usando una glucosiltransferasa conocida para transferir residuos de azúcar a la estructura del péptido. Esta modalidad ejemplar se establece en el Esquema de reacción de reacción 4. La glucosiltransferasas ejemplares útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, transferasas GalNAc (GalNAc Tl-14), transferasas GlcNAc, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, xilosiltransferasas, manosiltransferasas y similares. El uso de esta aproximación permite la adición directa de azúcares modificados en péptidos que carecen de cualquier carbohidrato o, alternativamente, en glucopéptidos que existen. En ambos casos, la adición del azúcar modificado ocurre en posiciones específicas en la estructura del péptido como se define por la especificidad del sustrato de la glucosiltransferasa y no en de una manera aleatoria como ocurre durante la modificación de una estructura de péptido de proteína usando métodos químicos. Un arreglo de agentes se puede introducir en proteína o glucopéptidos que carecen de la secuencia del péptido de sustrato de glucosiltransferasa por diseño de la secuencia de aminoácido apropiada en la cadena de polipéptido.

Esquema de reacción de reacción 4 Proteína o Glicoproteína ?_ afNH-€Ü{€H2)4NH-PEO GalNAc Transferasa ? .. ,. , ?~,?t t . „, . nr.« 0aiNAcT3) GalNH-CO(CH2)4NH-PEG En cada una de las modalidades ejemplares antes establecidas, uno o más etapas de modificación química o enzimática adicionales se pueden utilizar siguiendo la conjugación del azúcar modificado al péptido. En una modalidad ejemplar, una enzima (por ejemplo fucoxiltransferasa) se usa para anexar una unidad de glucosilo (por ejemplo fucose) sobre una azúcar modificado en la terminal enlazado al péptido. En otro ejemplo, una reacción enzimática se utiliza para "cerrar" sitios a los cuales el azúcar modificado fallo en modificarse. Alternativamente, se utiliza una reacción química para alterar la estructura del azúcar modificado conjugado. Por ejemplo, el azúcar modificado conjugado reacciona con agentes que estabilizan o desestabilizan su enlacedura con el componente de péptido al cual se enlaza el azúcar modificado. En otro ejemplo, un componente del azúcar modificado se desprotege siguiendo su conjugación al péptido. Alguien de experiencia apreciará que hay una configuración de procedimientos químicos y enzimáticos que son útiles en los métodos de la invención. En una etapa después de que el azúcar modificado se conjuga al- péptido. La elaboración adicional del conjugado modificado péptido y azúcar está dentro del alcance de la invención. i . Enzimas Transferencia de azúcar Además de las enzimas antes discutidas en el contexto de la formación del conjugado enlazado a acilo, el patrón de glucosilación del conjugado y los substratos de partida (por ejemplo péptidos, lípidos) se puede elaborar, cortar o modificar de otra manera por métodos que utilicen otras enzimas. Los métodos de remodelación de péptidos y lípidos usando enzimas que transfieren un donador de azúcar a un aceptor se discuten en mayor detalle en DeFrees, WO 03/031464 A2, publicada el 17 de abril de 2003. Un breve resumen de las enzimas seleccionadas de uso en el método actual se establece a continuación.

Glucosiltransferasas Las glucosiltransferasas catalizan la adición de azúcares activados (azúcares NDP donador) en una forma por etapas, a una proteína, glucopéptido, lípido o glucolípido o a un extremo no reductor de un oligosacárido en crecimiento. Los glucopéptidos enlazados en N se sintetizan por medio de una transferasa y un donador de oligosacárido enlazado a lípidos Dol-PP-NAG2GlC3 an9 en una transferencia de bloques seguida por el corte del núcleo. En este caso, la naturaleza del sacárido de núcleo es de alguna manera diferente de los enlaces subsecuentes. Se conocen en el arte un gran número de glucosiltransferasas . La glucosiltransferasa a usarse en la presente invención, puede ser cualquier con tal de que pueda utilizar el azúcar modificado como un donador de azúcar. Ejemplos de tales enzimas incluyen la glucosiltransferasa de la trayectoria de Leloir, tal como galactosiltransferasa, N-acetilglucosaminiltransferasa, N-acetilgalactosaminiltransferasa, fucosiltransferasa, sialiltransferasa, mannosiltransferasa, xilosiltransferasa, glucorononiltransferasa y las similares. Para la síntesis de sacáridos enzimáticos que involucran reacciones de glucosiltransferasa, se puede clonar la glucosiltransferasa o aisladose de cualquier fuente. Se conocen muchas glucosiltransferasas clonadas como lo son sus secuencias de polinucleótidos. Ver por ejemplo, "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases, " (http : //ww . ei . co . i /TGN/gt guide . htm) . Las secuencias de glucosiltransferassa y las secuencias de nucleótidos que codifican glucosiltransferasas a partir de las cuales se pueden deducir las secuencias de aminoácidos. También se encuentran en diversas bases de datos públicamente disponibles incluyendo GenBank, ?wiss-Prot, EMBI y otras. Las glucosiltransferasas que se pueden emplear en los métodos de la invención incluye, pero no se limita a galactosiltransferasas , fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosiminiltransferasa, glucoroniltransferasas, sialiltransferasas, mannosiltransferasas, transferasas de ácido glucuronico, transferasas de ácido galacturonico y oligosacariltransferasas . Las glucosiltransferasas adecuadas incluyen aquellas obtenidas a partir de eucariotas así como a partir de procariotas. El ADN que codifica las glucosiltransferasas, se puede obtener por síntesis química, por separación por exclusión de transcritos inversos de ARNm a partir de células apropiadas o cultivos de líneas celulares, por separación por exclusión de colecciones genómicas a partir de células apropiadas o por combinaciones de estos procedimientos. La separación por exclusión de ARNm o de un ADN genómico se puede llevar a cabo con sondas de oligonucleótido generadas a partir de una secuencia de genes de glucosiltransferasa. Se puede etiquetar las sondas con un grupo detectable tal como un grupo fluorescente, un átomo radioactivo o un grupo quimioluminiscente de acuerdo con procedimientos conocidos y usados en ensayos convencionales de hibridación. En la alternativa, se pueden obtener secuencias de genes de glucosiltransferasa por el uso de un procedimiento de reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los cebadores de oligonucleótidos PCR que se producen a partir de la secuencia de genes de glucosiltransferasa. Ver Patentes de EUA No. 4,683,195 to Mullís et al. y Patente de EUA No. 4,683,202 to Mullis. La glucosiltransferasa se puede sintetizar en células hospedadoras transformadas con vectores que contienen el ADN que codifica la enzima de glucosiltransferasa. Se usan vectores ya sea para amplificar el ADN que codifica la enzima de glucosiltransferasa y/o para expresar el ADN el cual codifica la enzima de glucosiltransferasa. Un vector de expresión es un constructo replicable de ADN en el cual una secuencia de ADN que codifica la enzima de glucosiltransferasa se enlace operativamente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión de la enzima de glucosiltransferasa en un hospedero adecuado. La necesidad de tales secuencias de control variaría dependiendo del hospedero seleccionado y el método de transformación elegido. Generalmente, las secuencias de control incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, un a secuencia que codifica sitios de enlace ribosomales adecuados de ARNm, y secuencias las cuales controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de amplificación no requieren dominios de control de expresión. Todo eso se necesita en la capacidad para replicar en un hospedero, usualmente otorgada por un origen de replicación y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformante.

En una modalidad ejemplar, la invención utiliza una enzima procariotica. Tales glucosiltransferasas incluyen enzimas involucradas en la síntesis de lipooligosacáridos (LOS) , los cuales se producen por muchas bacterias gram negativas. (Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)). Tales enzimas incluye, pero no se limita a las proteínas de los operones rfa de especies tales como E. coli y Salmonella typhimurium, las cuales incluyen una ßl,6 galactosiltransferasa y una ßl/3 galactosiltransferasa (ver, por ejemplo Nos. de acceso EMBL M80599 y M86935 (E. coli); No. de acceso EMBL S56361 ( S. typhimurium) ) , una glucosiltransferasa (No. de acceso Swiss-Prot P25740 (E. coli), una ßl, 2-glucosiltransferasa (rfaJ) (No. de acceso Swiss-Prot P27129 (E. coli) y No. de acceso Swiss-Prot P19817 { S . typhimurium) ) , y una ßl,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (frac) (No. de acceso EMBL U00039) (E. coli) . Otras glucosiltransferasas para las cuales se conocen las secuencias de aminoácidos, incluyen aquellas que se codifican por operones tales como rfaB los cuales se han caracterizado en organismos tales como Klebsiella pneumoniae, E. coli , Salmonella typhimurium, Salmonella entérica , Yersinia enterocolitica , Mycobacterium leprosum y el operon rhl de Pseudomonas aeruginosa . También adecuadas para su uso en la presente invención son las glucosiltransferasas que se involucran en la producción de estructuras que contiene lacto-N-neotetraosa, D-galactosil-ß-1, 4-N-acetil-D-glucosaminil-ß-l, 3-D-galactosil-ß-1, 4-D-glucosa, y el grupo Pk de sangre en secuencia de trisacáridos, D-galactosil- -1, 4-D-galactosil-ß- 1, 4-D-glucosa, en cual se ha identificado en los LOS de los patógenos mucosales Neisseria gonnorhoeae y N. meningitidis (Scholten et al., J. Med. Microbila. 41:263-243 (1994). Los genes de N. meningitidis y N. gonorrhoeae que codifican las glucosiltransferasas involucradas en la biosíntesis de estas estructuras se han identificado a partir de inmunotipos de N. meningitidis L3 y Ll (Jennings et al., Mol. Microbiol. 18: 729-740 (1995) ) y el mutante F62 de N gonorrhoeae (Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)). En N. meningitidis un lugar que consiste de 3 genes IgtA, IgtB e IgE, codifican las enzimas de glucosiltransferasa requeridas para la adición de al menos 3 de los azúcares en la cadena de lacto-N-neotetraosa (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996) ) . Recientemente, la actividad enzimática del producto de genes IgtB e IgtA se demostró, suministrando la primera evidencia directa de su función propuesta de glucosiltransferasa (Wakarchuk et al. J. Biol. Chem. 271(45) :28271-276 (1996)). En la N gonorrhoeae, existen 3 genes adicionales IgtD que se agregan a ß-D-GalNAC en la posición 3 de la terminal de galactosa de la estructura de lacto-N-neotetraose y IgtC el cual se agrega una terminal de a-D-Gal al elemento de lactosa de una LOS truncada creando así el grupo de sangre P en la estructura de antígenos (Gotshlich (1994), supra). En N. meningitidis, un inmunotipo separado Ll también expresa el antígeno del grupo sanguíneo Pk y se ha demostrado que lleva un gen IgtC (Jennings et al., (1995), supra.). las glucosiltransferasa de Neisseria y los genes asociados también se describen en USPN 5,545,553 (Gotschlich) . Los genes para al, 2-fucosiltransferasa y al,3-fucosiltransferasa a partir de Helicobacter pylori también se han caracterizado (Martin et al., Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)). También de uso en la presente invención son las glucosiltransferasas Campylobacter jej uni {ver, por ejemplo http : //af b. cnrs-mrs . fr/~pedro/CAZY/gtf_42. html) .

Fucosil ransferasas En algunas modalidades, una glucosiltransferasa usada en el método de la invención es una fucosiltransferasa. Las fucosiltransferasas se conocen por aquellos expertos en la técnica. Fucosiltransferasas ejemplares incluyen enzimas las cuales transfieren L-fucosa de GDP-fucosa a una posición hidroxi de un azúcar aceptor. Las fucosiltransferasas que transfieren azúcares no nucleótidos a una aceptor también son de uso en la presente invención. En algunas modalidades, el azúcar aceptor es por ejemplo GlcNAc en un grupo Galß ( 1—3, 4 ) GlcNAcß en un glucósido de oligosacáridos. Las fucosiltransferasas adecuadas para esta reacción incluyen Galß (1?3, 4) GlcNAcßl-a ( l-3 , 4) focosiltransferasas (FTIII E. C. No. 2.4.1.65), la cual se caracterizó primero a partir de la leche humana (ver, Palcic, et al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels, et al., J. Biol.. Chem. 256: 10456-10463 (1981); y Nunez, et al., Can. J. Chem. 59:2086-20595 (1981)) y Galß ( 1?4 ) GlcNAcß-afucosiltransferasas (FTIV, FTV, FTVI) las cuales se encuentran en el suero humano. FTVII (E. C. No. 2.4.1.65), un sialil a (2?3 ) Galß ( ( 1?3 ) GlcNAcß fucosiltransferasa, también se ha caracterizado. Una forma recombinante del Galß (1?3 , 4 ) GlcNAcß-a ( 1?3, 4) fucosiltransferasa se ha caracterizado también (ver, Dumas, et al., Bioorg. Med. Letters 1:425-428 (1991) y Kukowska-Latalo, et al., Genes and Development 4:1288-1303 (1990)). Otros fucosiltransferasas ejemplares incluyen por ejemplo, al, 2fucosiltransferasas (E. C. No. 2.4.1.69). la fucosilación enzimática se puede llevar a cabo por los métodos descritos en Mollicone, et al., Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990) o la Patente de EUA No. 5,374,655. Las células que se usan para producir una fucosiltransferasa también incluirán un sistema enzimático para sintetizar GDP-fucosa. Galactosil ransferasas En otro grupo de modalidades, la glucosiltransferasa es una galactosiltransferasa. Las galactosiltransferasas ejemplares incluyen a (1, 3) galactosiltransferasas (E. C. No. 2.4.1.151, ver, por ejemplo, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) e Yamamoto et al. Nature 345:229-233 (1990), bovino (GenBank J04989, Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), murino (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)), porcino (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41:101-105 (1995)). Otra al,3 galactosiltransferasa adecuada es aquella que está involucrada en la síntesis del antígeno B del grupo sanguíneo (EC 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265:1146-1151 (1990) (human)). Todavía una galactosiltransferasa ejemplar adicional es la Gal-Tl del núcleo. También adecuados para su uso en los métodos de la invención son las ß (1, 4) galactosiltransferasas, las cuales incluyen por ejemplo, EC 2.4.1.90 (sintetasa LacNAc) y EC 2.4.1.22 (sintetasa lactosa) (bovino (D'Agostaro et al., Eur.

J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), humano (Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)), murino (Nakazawa et al., J. Biochem. 104: 165-168 (1988)), así como E. C. 2.4.1.38 y la galactosiltransferasa de ceramida (EC 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)). Otras galactosiltransferasas ejemplares, incluyen por ejemplo, al,2 galactosiltransferasas (a partir de por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol.

Biol.. Cell 5:519-528 (1994)).

Sialiltransferasas Las sialiltransferasas son otro tipo de glucosiltransferasa que es útil en las células recombinants y mezclas de reacción de la invención. Las células que producen sialiltransferasas recombinants también producirán un CMP ácido siálico, es un donador del ácido siálico para la sialiltransferasa. Ejemplos de las sialiltrasferasas son adecuadas para su uso en la presente invención incluyen ST3Gal III (por ejemplo, un ST3Gal III de rata o de humano), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, STdGalNAc I, ST6GalNAc II, y ST6GalNAc III (la nomenglatura de la sialiltransferasa usada en la presente es como se describe en Tsuji et al., Glycobiology 6: v-xiv (1996)). Un a (2, 3) sialiltransferasa ejemplar referida como a(2, 3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere el ácido siálico a la terminal no reductora Gal de un disacárido Galßl—»3Glc o glucosid. Ver, Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982) y Wen et al., J. Biol. Chem. 267:21011 (1992). Otra a2, 3-sialiltransferasa ejemplar transfiere ácido siálico a la terminal no reductora Gal del disacárido o glucósido. Ver, Rearick et al., J. Biol. Chem. 254:4444 (1979) y Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267:21004 (1992). Enzimas ejemplares adicionales incluyen Gal-ß-1, 4-GlcNAc a-2,6 sialiltransferasa (ver, Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375-381(1994) ) . Preferiblemente, para la glucosilación de carbohidratos de glucopéptidos la sialiltransferasa podrá transferir ácido siálico a la secuencia de Galßl, GlcNAc, la secuencia penúltima más común que subyace en el ácido siálico terminal en estructuras de carbohidratos completamente sialiladas (ver Tabla 2) .

Tabla 2: Sialiltransferasas que utilizan la secuencia Galßl, 4GlcNAc como un substrato aceptor 1) Goochee et al., Bio/Technology 9:1347-1355 (1991) 2) Yamamoto et al., J. Biochem.- 120: 104-110 (1996) 3) Gilbert et al., Biol. Chem. 271: 28271-28276 (1996) Un ejemplo de una sialiltransferasa que es útil en los métodos reivindicados ST3Gal III, la cual se refiere también como a (2, 3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Esta enzima cataliza la transferencia del ácido siálico al Gal de un Galßl, 3GlcNAc O Galßl, 4GlcNAc glucósido (ver, por ejemplo, Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256:3159 (1991)) y es responsible de la sialilación de oligosacáridos enlazados a asparagina en gllicopéptidos . El ácido siálico se enlace a Gal con la formación de una enlacedura a entre los 2 sacáridos. El enlace (enlacedura) entre los sacáridos está entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal. Esta enzima en particular se puede asilar del hígado de la rata (Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845(1982)); el ADNc humano (Sasaki et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401) y secuencias de AND genómico (Kitagawa et al. (1996) J. Biol.

Chem. 271: 931-938) se conocen, que facilitan la producción de esta enzima por expresión recombinante. En una modalidad preferida, los métodos reivindicados de sialilación utilizan un ST3Gal III. Otras sialiltransferasas ejemplares de uso en la presente invención incluyen aquellas aisladas de Campylobacter jejuni, incluyendo la a(2,3). Ver por ejemplo, WO99/49051. Sialiltransferasas diferentes a aquellas listadas en la tabla 2, también son útiles en un proceso a gran escala económico y eficiente para la sialilación de glucopéptidos comercialmente importantes. Coomo una prueba sencilla para descubrir la utilidad de estas otras enzimas, se hacen reaccionar diversas cantidades de cada enzima (1-100 mU/mg proteína) con asialo-a,? AGP (a 1-10 mg/ml) para comparar la capacidad de la sialiltransferasa de interés para sialilar glucopéptidos con relación al ST6Gal bovino, ST3G1 III o ambas sialiltransferasas . Alternativamente, otros glucopéptidos o glucopéptidos, u oligosacáridos enlazados en N liberados enzimaticamente de la estructura del péptido se pueden usar en lugar de asialo-otí AGP para esta evaluación. La sialiltransferasa con la capacidad de sialilar los oligosacáridos enlazados en N de los glucopéptidos más eficientemente que ST6Gal I son útiles en un proceso de escala mayor practico para la sialilación de péptidos.

Transferasas de GalNAc Las transferasas de N-acetilgalactosaminiltransferasas son de usos en la práctica de la presente invención particularmente para enlazar a una porción de GalNAc a un aminoácido del sitio de glucosilación O enlazada del péptido.

Las N-acetilgalactosaminiltransferasas adecuadas incluye, pero no se limita a a (1, 3) N-acetilgalactosaminiltransferasa, ß (1, 4) N-acetilgalactosaminiltransferasas (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) and Smith et al., J. Biol Chem. 269:15162 (1994)) y polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa (Homa et al., J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993) ) . La producción de proteínas tales como la enzima GalNAc T?-?? a partir de genes clonados por ingeniería genética es bien conocida. Ver, por ejemplo la Patente de EUA No. 4,761,371. Un método involucra la recolección de muestras suficientes luego se determina la secuencia de aminoácidos de la enzima por formación de secuencias en la terminal N. Esta información luego se usa para aislado un clon de ADNc que codifique una transferasa de longitud completa (enlace a la membrana) la cual con la expresión en la línea celular de insectos Sf9 resulta en la síntesis de una enzima completamente activa. La especificidad del aceptor de la enzima luego se determina usando un análisis semicuantitativo de los aminoácidos que rodean los sitios de glucosilación conocidos en 16 proteínas diferentes, seguidos por estudios de glucosilación in vitro de los péptidos sintéticos. Este trabajo ha demostrado que ciertos residuos de aminoácidos están sobre representados en los segmentos de péptidos glucosilados y que los residuos en las posiciones especificas que rodean los residuos glucosilados de serina y treonina pueden tener una influencia más marcada en la eficiencia del aceptor que en otras porciones de aminoácidos.

Glucosiltransferasas enlazadas a células En otra modalidad, las enzimas utilizadas en el método de la invención son glucosiltransferasas enlazadas a células. Aunque se conocen muchas glucosiltransferasas solubles (ver por ejemplo Patente de EUA No. 5,032,519) las glucosiltransferasas están generalmente en una forma enlazada a la membrana cuando se asocian con la célula. Muchas de las enzimas enlazadas a la membrana estudiadas hasta ahora se consideran que son de propiedades intrínsecas esto es, no se liberan de las membranas por sonicación y requieren de detergentes para solubilización. Las glucosiltransferasas de superficie se han identificado en la superficie de células de vertebrados e invertebrados, y también se ha reconocido que estas transferasas de superficie mantienen actividad catalítica bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la función más reconocida de las glucosiltransferasas de superficie celular es para el reconocimiento intercelular (Roth, MOLECULAR APPROACHES to SUPRACELLULAR PHENOMENA, 1990) . Se han desarrollado métodos para alterar las glucosiltransferasas expresadas por células. Por ejemplo, Larsen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989) , reportan un método genético para aislado secuencias clonadas de ADNc que determinan la expresión de las estructuras de oligosacáridos de la superficie celular y sus glucosiltransferasas similares. Una colección de ADNc generada a partir del ARNm aislada de una línea celular murina conocida por expresar la UDP-galactosa: . ß. D-galactosil-1, 4-N-acetil-D-glucosaminida a-1, 3-galactosiltransferasa se transfectan en las células COS-1. Las células transfectadas luego se cultivan y ensayan para una actividad de a l-3galactosiltransferasa. Francisco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 2713-2717 (1992) , describe un método de anclaje ß-lactamasa a la superficie externa de Escherichia coli. Una fusión tripartite que consiste de (i) una secuencia de señal de una proteína de membrana exterior, (ii) una sección de cobertura de membrana de una proteína de membrana exterior y (iii) una secuencia de ß-lactamasa madura completa se produce lo que resulta en una molécula de ß-lactamasa enlazada a una superficie activa. Sin embargo, el método de Francisco se limita solamente a los sistemas de células procarióticas y como se reconoce por los autores, requiere de la fusión tripartita completa para un funcionamiento adecuado.

Sulfotransferasas La invención también proporciona métodos para la producción de péptidos que incluyen moléculas sulfatadas incluyendo por ejemplo, polisacáridos sulfatados tales como heparina, sulfato de heparano, carragenina, y compuestos relacionados. Las sulfotransferasas adecuadas incluyen por ejemplo condroitin-6-sulfotransferasa (ADNc de pollo descrito por Fukuta et al., J. Biol. Chem. 270: 18575-18580 (1995); GenBank Accession No. D49915), glucosaminoglican N-acetilglucosamina N-deacetil/N-sulfotransferasa 1 (Dixon et al., Genomics 26:239-241 (1995); UL18918) y glucosaminoglican N-acetilglucosamina N-deacetilasa/N-sulfotransferasa 2 (ADNc de murino descrito en Orellana et al., J. Biol. Chem. 269: 2270-2276 (1994) and Eriksson et al., J. Biol. Chem. 269: 10438-10443 (1994); ADNc humano descrito en GenBank Accession No. U2304).

Glucosidasas Esta invención también abarca el uso de glucosidasas mutantes y de tipo silvestre. Las enzimas mutantes de ß-galactosidasa se ha demostrado que catalizan la formación de disacáridos a través del acoplamiento de un fluoruro de a-glucosilo a una molécula aceptora de galactosilo (Withers, U.S. Pat. No. 6,284,494; concebida el 4 de septiembre de 2001) . Otras glucosidasas de uso en esta invención incluyen por ejemplo ß-glucosidasas, ß-galactosidasas, ß-mannosidasas, ß-acetil glucosaminidasas, ß-N-acetil galactosaminidasas, ß-xilosidasas, ß-fucosidasas, celulasas, xilanasas, galactanasas, mannanasas, hemicelulasas, amilasas, glucoamilasas, a-glucosidasas, a-galactosidasas, a-mannosidasas, a-N-acetil glucosaminidasas, a-N-acetil galactosa-aminidasas, a-xilosidasas, a-fucosidasas, y neuraminidasas/sialidasas .

Enzimas inmovilizadas La presente invención también proporciona el uso de enzimas que se inmovilizan en un soporte sólido y/o soluble. En una modalidad ejemplar, se proporciona una glucosiltransferasa que se conjuga a un PEG por medio de una enlacedura intacta de glucosilo de acuerdo con los métodos de la invención, el conjugado de enzima y enlacedura de PEG se enlaza opcionalmente a un soporte sólido. El uso de enzimas sólidas soportadas en los métodos de la invención simplifica la preparación de la mezcla de reacción y la purificación del producto de reacción y también permite la recuperación sencilla de la enzima. El conjugado de glucosiltransferasa se utiliza en los métodos de la invención. Otras combinaciones de enzimas y soportes serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.

Proteínas de Fusión En otras modalidades ejemplares, los métodos de la invención utilizan proteínas de fusión que tienen más de una actividad enzimática que esta involucrada en la síntesis de un conjugado deseado de clicopéptidos . Los polipéptidos de fusión se pueden componer de por ejemplo un dominio catalíticamente activo de glucosiltransferasa que se une a un dominio catalíticamente activo de encima accesoria. El dominio catalítico de la encima accesoria puede por ejemplo catalizar una etapa en la formación de un azúcar de nucleótido que es un donador para la glucosiltransferasa, o catalizar una reacción involucrada en un ciclo glucosiltransferasa. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una glucosultransferasa se puede unir en la estructura a un polinucleótido que codifica una encima involucrada en la síntesis de azúcares nucleótidos la proteína de fusión resultante luego puede catalizar no solamente la síntesis del azúcar nucleótido sino también la transferencia de la porción de azúcar a la molécula aceptora. La proteína de fusión pueden ser dos o más encimas de ciclo enlacedas en una secuencia de nucleótido que se expresa. En otras modalidades, la proteína de fusión incluye los dominios catalíticamente activos de dos o más glucosiltransferasa. Ver por ejemplo 5,641,668. Los glucopéptidos modificados de presente invención se pueden diseñar fácilmente y fabricar utilizando diversas proteínas de fusión adecuadas (ver por ejemplo, solicitud de patente de PCT/CA98/01180, la cual se publico como WO 99/31224 en Junio 25, 1999) .

Purificación de Conjugado de Eritropoyetina. Los productos producidos por los procesos anteriores se pueden usar sin purificación. Sin embargo, se prefiere usualmente recuperar el producto. Las técnicas estándar y bien conocidas para la recuperación de sacáridos glucosilados tales como cromatografía de capa gruesa o delgada, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio de iones o filtración de membranas se pueden usar. Se prefiere usar filtración de membranas mas preferiblemente utilizando una membrana . osmótica inversa, o una o más técnicas cromatográficas en columna para la recuperación como se discute de aquí en adelante y en la literatura aquí citada. Por ejemplo, la filtración de membrana en donde las membranas tienen un corte de peso molecular de alrededor de 3000 alrededor de 10,000 se pueden usar para retirar proteínas tales como glucosiltransferasa. La nanofiltración u osmosis inversa luego se puede usar para retirar sales y/o purificar los sacáridos del producto (ver por ejemplo WO 98/15581).. Las membranas de nanofilatración son una clase de membranas de osmosis inversa que pasan las sales monovalentes pero retienen las sales polivalentes y los solutos sin carga mayores de alrededor de_ 100 hasta alrededor de 2,000 Daltones dependiendo de la membrana usada. Así en una aplicación típica, los sacáridos preparados por los métodos de la presente invención se retendrán se en la membrana y pasaran las sales contaminantes. Si se produce intracelularmente las glucoproteína modificada como una primera etapa, los desechos de partículas ya sean células hospederas o fragmentos lisados se retiran por ejemplo por centrifugación o ultra filtración, opcionalmente, la proteína se puede concentrar con un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible seguido por la separación de la variante de polipéptido a partir de otras impurezas por una o más etapas seleccionadas de cromatografía de inmunoafinidad, reaccionamiento en columnas de intercambio de iones (por ejemplo, sobre dietilaminoetilo (DEAE) o matrices que contienen grupos carboximetilo o sulfopropilo) , cromatografía sobre Blue-Spharose, CM Blue-Spharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectina-Sefarosa, WGA-Shepharose, Con A-Sepharose, perlas toyo de éter, perlas toyo de butilo, fenilo perlas toyo de fenilo, o proteína A Sefarosa, cromatografía SDS-PAGE, cromatografía de sílice, cromatofocalización, CLAR de clase inversa (por ejemplo, gel de sílice con grupos alifáticos anexos), filtración en gel usando gromatografia por exclusión de tamaño o malla molecular Sephadex, cromatografía en columnas que se enlazan selectivamente al polipéptido y precipitación con sulfato de amonio o etanol. Los glucopéptidos modificados producidos en cultivo se aislan usualmente por la extracción inicial de células, encimas etc., seguida por uno o más etapas de cromatografía de exclusión de tamaño, concentración, desalado, intercambio de iones acuoso. Adicionalmente, la glucoproteína modificada se puede purificar por cromatografía de afinidad. Finalmente, la CLAR se puede emplear para etapas de purificación finales.

Un inhibidor de proteasa por ejemplo, metilsulfonilfluoruro (PMSF) se puede incluir en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y antibióticos se pueden incluir para evitar el crecimiento de contaminantes ajenos. Dentro de otra modalidad, los sobrenadantes de sistemas los cuales producen el glucopéptido modificado de la invención, se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponibles por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon or Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender un enlacendo para el péptido, una molécula de lectina o de anticuerpo enlazada a un soporte adecuado. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio de aniones por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos colgantes DEAE . Las matrices adecuadas incluyen archilamida azarosa, dextrano celulosa, u otros tipos comúnmente empleados en al purificación de proteínas. Alternativamente, la etapa de intercambio de cationes se puede emplear. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son particularmente preferidos . Finalmente, una o más etapas de RP-HPLC que emplean medios hidrofóbitos RP-HPLC por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos colgantes metilo u otros grupos alifáticos, se pueden emplear para purificar además una composición de variantes de polipéptido. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores en diversas combinaciones, se pueden emplear para proporcionar una clicoproteína modificada homogénea. El glucopéptido modificado de la invención que resulta de una fementación a gran escala se puede purificar por métodos análogos a aquellos descritos por Urdal et al., J. Chromatog. 296:171 (1984). Esta referencia describe dos etapas secuenciales desde RP-HPLC para la purificación de IL-2 humano recombinante en una columna CLAR preparativa.

Alternativamente, las técnicas tales como cromatografía de afinidad se pueden utilizar para purificar las gliproteínas modificada.

Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica. La composición farmacéutica incluye un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre una porción PEG que no se presenta naturalmente, porción terapéutica o biomolécula y un péptido glucosilado o no glucosilado. El polímero, porción terapéutica o biomoléculas se conjuga a un péptido por medio de un grupo de enlacedura, glucosilo intacto interpuesto entre y enlazado covalentemente tanto al péptido como al polímero, porción terapéutica o biomolécula. Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para su uso en una diversidad de sistemas de suministro de fármacos. Las formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención se encuentran en Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (19985) . Para una breve revisión de los métodos de suministro de fármacos ver Langer, Science 249:1527-1533(1990) . Las composiciones farmacéuticas se pueden formular por cualquier forma adecuada de administración incluyendo por ejemplo, administración, tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral tal como una inyección subcutánea, el portador comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera, o una solución amortiguadora. Para administración oral, cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio se pueden emplear. También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactat, piliglucolato) como portadores para las compasiones farmacéuticas de esta invención. Se describen microesferas biodegradables adecuadas por ejemplo en las patentes de EUA a 4,897,268 y 5,075,109. Comúnmente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente por ejemplo, por vía intravenosa. Así, la invención proporciona composiciones para administración parenteral las cuales comprenden el compuesto disuelto o suspendido en un portador aceptable preferiblemente un portador acuoso por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina, PBS y los similares. Las composiciones se pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH ya agentes amortiguadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes, y los similares . Estas compasiones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales o se pueden filtrar estériles. La solución acuosa resultante se puede empacar para su uso como están o liofilizarse, la preparación liofilizada se combina con un portador acuosos estéril previo a la administración. El pH de las preparaciones se estar típicamente entre 3 y 11 más preferiblemente desde 5 a 9 y más preferiblemente desde 7 y 8. En algunas modalidades los glucopéptidos de la invención se pueden incorporar en liposomas formados a partir de lívidos que forman vesículas estándar. Están disponibles una diversidad de métodos para la preparación de lipososmas como se describen en por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (11980), U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728 y 4,837,028. el direccionamiento de liposomas usando una diversidad de agentes de direccionamiento (por ejemplo, la sialil galactosidas de la invención) es bien conocida en el arte (ver por ejemplo, patentes de EUA Nos. 4,957,773 y 4,603,044). ón) es bien conocida en el arte (ver por ejemplo, patentes de EUA Nos. 4,957,773 y 4,603,044). Los métodos estándar para acoplamiento de agentes de direccionamiento a liposomas pueden usar. Estos métodos involucran generalmente la incorporación en liposoma de componentes de lipido tales como fosfatidiletanolamina, la cual se puede activar por enlace a los agentes de direccionamiento o compuestos lipofilicos derivados tales como lipopéptidos derivados de lípidos de la invención.. Los mecanismos de direccionamiento requieren generalmente que los agentes de direccionamiento se posicionan en la superficie de liposoma en una forma tal que las porciones objetivo estén disponible para interacción con el objetivo como por ejemplo, un receptor de superficie celular. Los carbohidratos de la invención se pueden unir a una molécula de lípidos antes de que se forme el liposoma usando métodos conocidos por aquellos expertos en técnica (por ejemplo, alquilación o acilación de un grupo hidroxilo presente del carbohidratos con un halogenuro de alquilo de cadena larga o con un ácido graso respectivamente) . Alternativamente, la liposomas se puede diseñar en una forma tal que se incorpore primero una porción del conector en la membrana al momento de formar la membrana. La porción del conector debe tener una porción lipofilica la cual se aloja fermente de ancla en la membrana. También debe tener una porción reactiva la cual este químicamente disponible en la superficie acuosa de liposoma. La porción reactiva se selecciona de manera tal que será químicamente adecuada para formar un enlace químico con el agente de direccionamiento o carbohidrato, que se agrega después. El algunos casos, es posible enlazar el agente objetivo a la molécula conectora directamente, pero en la mayoría de los casos es más adecuado usar una tercera molécula para actuar como un puente clínico, enlacendo así a la molécula conectora la cual esta en la membrana con el agente objetivo o carbohidrato el cual se extiende tridimencionalmente fuera de la superficie de la vesícula. Los compuestos preparados por los métodos de la invención también pueden encontrar uso como reactivos de diagnostico. Por ejemplo, se pueden usar compuestos etiquetados para localizar áreas de inflamación o metástasis de tumor en un paciente que se sospeche que tiene inflamación. Para este uso, los compuestos se pueden etiquetar con 125I, 14C, o tritio. El ingrediente activo usado en las composiciones farmacéuticas de la presente invención es una eritropoyetina glipegilada y sus derivados que tienen las propiedades biológicas de provocar que las células de medula ósea incrementen la producción de reticulocitos y células de glóbulos rojos. La dispersión liposomal de la presente invención es útil como una formulación parenteral en el tratamiento de trastornos sanguíneos caracterizados por unaproducción baja o defectuosa de células de glóbulos rojos tales como diversas formas de anemia incluyendo anémicas asociadas con insuficiencia renal crónica, pacientes infectados con VIH tratados con zidovidina y pacientes con cáncer en quimioterapia. También puede tener aplicaciones en el tratamiento de una diversidad de estados de enfermedad, trastornos y estados de irregularidad hematológica tales como enfermedades células rojas de tamaño anormal, beta-thalassemia, fibrosis quística, trastornos del embarazo y menstruales, anemia temprana de la pre-madures, lesión de la espina dorsal, vuelo espacial, perdida de sangre aguda, envejecimiento y similares. Preferiblemente, la composición EPO de la presente invención se administra parenteralmente, (por ejemplo, IV, IM, SC o IP) . Las dosificaciones efectivas se espera que varíen considerablemente dependiendo de la condición a tratarse y la vía de administración pero se espera que estén en el intervalo de alrededor de 0.1 (~7U) a 100(~7000U) µg/kg de peso corporal del material activo. Preferiblemente, las dosis para el tratamiento de condiciones anémicas son de alrededor de 50 alrededor de 300 Unidades/kg tres veces a la semana. Debido a que la presente invención proporciona una eritropoyetina con un tiempo de residencia intensificado in vivo, las dosificaciones establecidas se disminuyen opcionalmente cuando se administra una composición de la invención. Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar los conjugados y los métodos de la presente invención pero no para limitar la invención reivindicada.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de UDP-GalNAc-6' -CHO UDP-GalNAc (200 mg, 0.30 mmoles) se disolvió en una solución 1 mM de CuS04 (20 mL) y una solución 25 mM de NaH2P0 (pH 6.0; 20 mL) . Galactosa oxidasa (240 U; 240 µl) y catalasa (13000 U; 130µl) luego se agregaron, el sistema de reacción se equipó con un globo lleno con oxígeno y agitado a temperatura ambiente por siete días. La mezcla de reacción luego se filtró (cartucho de giro; MWCO 5K) y el filtrado (-40 mL) se almacenó a 4°C hast que se requirió. CCD (sílice; EtOH/agua (7/2); Rf=0.77; visualizada con tinción de anisaldehído) .

Ejemplo 2 Preparación de UDP-GalNAc-6' -NH2 Acetato de amonio (15 mg, 0.194 mmoles) y NaBH3CN (solución 1M de THF; 0.17 mL, 0.17 mmoles) se agregaron a la solución de UDP-GalNAc-6' -CHO anterior (2 mL o -20 mg) a 0°C y se dejaron entibiar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se filtró a través de una columna G-10 con agua y el producto se recolectó. Las fracciones adecuadas fueron secadas por congelación y se almacenaron congeladas. CCD (sílice; etanol/agua (7/2); Rf= 0.72; visualizado con el reactivo de ninhidrina) .

Ejemplo 3 Preparación de UDP-GalNAc-6' -NHCO (CH2) 2-0-PEG-OMe (1 KDa). El galactosaminil-l-fosfato-2-NHCO(CH2)2-0-PEG-OMe (1 KDa) (58 mg, 0.045 mmoles) se disolvió en DMF (6 mL) y piridina (1.2 mL) . UMP-morfolidato (60 mg, 0.15 mmoles) luego se agregó y la mezcla resultante se agitó a 70°C por 48 h. El solvente se removió al burbujear nitrógeno a través de la mezcla de reacción y el residuo se purificó por cromatografía de fase inversa (C-18 sílice, gradiente por etapas entre 10 a 80%, metanol/agua) . Las fracciones deseadas se colectaron y secaron a presión reducida para producir 50 mg (70%) de un sólido blanco. CCD (sílice, propanol/H20/NH4OH, (30/20/2), Rf=0.54). EM (MALDI) : Observado, 1485,1529, 1618,1706. Ejemplo 4 Preparación de Cisteína-PEG2 (2) 4. 1 Síntesis del compuesto 1 Hidróxido de potasio (84.2 mg, 1.5 mmol, como un polvo) se agregó a una solución de L-cisteína (93.7mg, 0.75 mmol) en metanol anhidro (20L) bajo argón. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 30 min, y luego mPEG-O-tosilato de masa molecular de 20 kilodaltones (Ts; 1.0 g, 0.05 mmol) se agregó en diversas porciones durante 2 horas. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 5 días, y concentró por evaporación rotatoria. El residuo se diluyó con agua (30 L) , y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas para destruir cualquier exceso del mPEG-O-tosilato de 20 kilodaltones. La solución luego se neutralizó con ácido acético, el pH se ajustó a un pH 5.0 y se cargó sobre una columna de cromatografía de fase inversa (C-18 sílice) . La columna se eluyó con un gradiente de metanol/agua (el producto eluye a alrededor de 70% de metanol) , la elusión del producto se monitoreó por dispersión de luz evaporativa, y las fracciones apropiadas se recolectaron y diluyeron con agua (500 mL) . Esta solución se procesó por cromatografía (intercambio de iones, XK 50 Q, BIG Beads, 300 ml, forma de hidróxido; gradiente de agua a agua/ácido acético-0.75N) y el pH de las fracciones apropiadas se disminuyó hasta 6.0 con ácido acético. Esta solución luego se capturó en una columna de fase inversa (C-18 sílice) y eluyó con un gradiente de metanol/agua como se describió anteriormente. Las fracciones del producto se acumularon, concentraron y redisolvieron en agua y secadas por congelación para resultar 453 mg (44%) de un sólido blanco (1) . Datos estructurales para el compuesto fueron como siguen ^?-RMN (500 MHz; D20 d 2.83 (t, 2H, O-C-CH2-S), 3.05 (q, 1H, S-CHH-CHN) , 3.18 (q, 1H, (q, S-CHH-CHN) , 3.38 (s, 3H, CH30) , 3.7 (t, OCH2CH20) , 3.95 (q, 1H, CHN) . La pureza del producto se confirmó por .SDS PAGE. 4.2 Síntesis del Compuesto 2 (Cisteina-PEG ) Trietilamina (-0.5 mL) se agregó gota a gota a una solución del compuesto 1 (440 mg, 22µmol) disuelto en CH2C12 anhidro (30 mL) hasta que se hizo básica la solución. Una solución de mPEG-O-p-nitrofenil carbonato de 20 kilodalton (660 mg, 33 µmol) y N-hidroxisuccinimida (3.6 mg, 30.8 µmol) en (20 mL) se agregó en varias porciones durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 24 horas. El solvente luego se removió por evaporación rotatoria, el residuo se disolvió en agua (100 mL) , y el pH se ajustó a 9.5 con NaOH 1.0N. La solución básica se agitó a temperatura ambiente por 2 horas y luego se neutralizó con ácido acético hasta un pH 7.0. La solución luego se cargó sobre una columna de cromatografía de fase inversa (C-18 sílice) . La columna se eluyó con un gradiente de metanol/agua (el producto se eluye a alrededor de 70% metanol) , la elusión del producto se monitoreó por dispersión de luz evaporativa, y las fracciones apropiadas se recolectaron y diluyeron con agua (500 mL) . Esta solución se procesó por cromatografía (intercambio de iones, XK50Q, BIG Beads, 300mL, forma de hidróxido; gradiente de agua a agua/ácido acético-0.75N) y el pH de las fracciones apropiadas se disminuyó a 6.0 con ácido acético. Esta solución luego se capturó sobre una columna de fase inversa (C-18 sílice) y eluyó con un gradiente de metanol/agua como se describió anteriormente. Las fracciones del producto se acumularon, concentraron y redisolvieron en agua y secadas por congelación para resultar 575 mg (70%) de un sólido blanco (2) . Datos estructurales para el compuesto fueron como siguen ^-RMN (500 MHz; D20) d 2.83 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 2.95 (t, 2H, 0-C-CH2-S), 3.12 (q, 1H, S-CHH-CHN) , 3.39 (s, 3H CH30) , 3.71 (t, OCH2CH20) . La pureza del producto se confirmó por SDS PAGE.

Ejemplo 5 Preparación de UDP-GalNAc-6' -NHCO (CH2) 2-0-PEG-OMe (1 KDa). Galactosaminil-1-fosfato-2-NHCO (CH2) 2-0-PEG-OMe (1 kilodalton) (58 mg, 0.045 mmoles) se disolvió en DMF (6 mL) y piridina (1.2 mL) . UMP-morfolidato (60 mg, 0.15 mmoles) luego se agregó y la mezcla resultante se agitó a 70°C por 48 h. El solvente se removió al burbujear nitrógeno a través de la mezcla de reacción y el residuo se purificó por cromatografía de fase inversa (C-18 sílice, gradiente por etapas entre 10 a 80%, metanol/agua) . Las fracciones deseadas se recolectaron y secaron a presión reducida para producir 50 mg (70%) de un sólido blanco. CCD (sílice, propanol/H20/NH4OH, (30/20/2), Rf= 0. 54). EM (MALDI) : Observado, 1485, 1529, 1618, 1706.

Ejemplo 6 Reacción de GnTl y GalTl en un recipiente 6. 1 Reacción en Un Recipiente La reacción en un recipiente de GlcNac transferasa-1 y galactosa transferasa-1 se llevó a cabo al incubar EPO (1 mg/ml) en 100 mM Tris HCl, pH 7.5 o MES pH 6.5 que contiene 150 mM NaCl, 5 mM UDP-GlcNAc, 5 mM de UDP-Gal, 5 mM MnCl2, 0.02% de azida de sodio, 30 mU/mL de GlcNAc transferasa-1 purificada y 200 mU/mL de galactosa transferasa-1 purificada a 32°C por 16 h. 6.2 Purificación de EPO en Superdex75 Una columna Superdex 75 se equilibró en solución amortiguadora 100 mM de MES, pH 6.5 que contiene 150 mM de NaCl a una relación de flujo de 5 mL/min. La EPO, producto de la etapa 6.1 (anterior) se cargó sobre la columna y se eluyó con la solución amortiguadora de equilibrio. El producto de elusión se monitoreó por absorbancia a 280 nm y conductividad. SDS-PAGE se usó para determinar cuales fracciones pico acumuladas contienen la EPO y usarse en experimentos adicionales. 6. 3 Reacción ST3Gal-III La reacción se llevó a cabo al incubar 1 mg/mL de EPO- Gal (de la etapa 6.2, anterior) en 100 mM de Tris HCl pH 7.5 o MES pH 6.5 que cotiene 150 mM de NaCl, 0.5 mM de ácido CMP- N-acetil-neuramínico-20kilodalton-PEG, 0.02% azida de sodio, y 200 mU/mL de ST3Gal-III purificado a 32 °C por 16 horas.

Ejemplo 7 Reacción de GnTl, GalTl y ST3Gal-III (usando CMP-NAN-20KPEG) en un recipiente EPO (1 mg/mL) se incubó con 30 mU/mL de GlcNAc transferasa 1, 200 mU/mL de Galactosa transferasa-1 y 500 mU/mL de ST3GalIII con nucleótidos de azúcar y ácido CMP-N-acetil-neuramínico-20Kd PEG en 100 mM de solución amortiguadora MES, pH 6.5 y analizado usando SDS-PAGE. Similar a los resultados obtenidos en las reacciones de remodelado de enzimas de dos etapas, tres bandas de EPO PEGilada se observan en un recipiente, tres preparaciones de enzimas .

Ejemplo 8 Producción de PEG-EPO Biantenario 8. 1 Adición de GlcNaC a rEPO EPO recombinante, expresada en baculovirus (1 mg/mL) en 0.1 M Tris, 0.15 M NaCl, 5 mM MnCl2 y 0.02% azida de sodio a pH 7.2 se incubó con 3 mM USP-GlcNAc, 50 mU/mg GlcNAc transferasa-1 y 50 mU/mg GlcNAc transferasa-II a 32 °C por 24 horas. 8.2 Adición de Galactosa Al péptido etiquetado con GlcNAc de la etapa 8.1 (anterior) se agregó UDP_Gal mM y 0.2 U/mg de Galactosa transferasa-1. La mezcla se incubó por 36 horas a 32°C. El producto galactosilado se aisló por cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex 75 en solución salina amortiguada con Tris. El producto purificado se concentró a 1 mg/mL. 8. 3 Adición de Acido Siálico o PEG Acido Siálico El producto galactosilado de la etapa 8.2 (anterior) (1 mg/mL) en 0.1 M Tris, 0. 1M NaCl a pH 7.2 se incubó a 32 °C por 24 horas con 200 mU/mg ST3GalIII y 0.5 M CMP-ácido siálico o CMP-ácido siálico-PEG (donde el PEG tiene una masa molecular de 5 kilodaltones, 10 kilodaltones o 20 kilodaltones) .

Ejemplo 9 PEGilación enlaceda a 30K por CST-II EPO glucosilado como se expresa en células CHO (ovario de hámster chino) (5 mg, 0.166 µmol, 5 ml) se concentró y se intercambió la solución amortiguadora con solución amortiguadora Tris (50 mM Tris, 0.15M NaCl, 0.001 M CaC12+ 0.005% NaN3) hasta un volumen final de 5 ml. Luego el CMP-ácido siálico-PEG (30 kilodaltones, 25 mg, 0.833 µmol; ver Figura 3B para la estructura de CMP-ácido siálico-PEG de 30 kilodaltones), 0.25ml de 100 mM MnCl2 0.25 ml y se agregó una sialiltransferasa bifuncional de Campylobacter jejuni, CST-II (1.4 U/mL, 0.5 ml, 0.7 U) , . La mezcla resultante se enfrió con hielo por 48 horas. Al término de la reacción, la mezcla se concentró por ultrafiltración hasta 1 mL de volumen final, y luego se intercambió la solución amortiguadora con 25 mM NaOAc+0.005% Tween-80 (pH 6.0) a 2.5 ml. Cromatografía de Q-Sepharose IEX se efectuó al usar 25 mM NaOAct 2M NaCl 005% Tween-80 (pH 6.0) como eluyente. El pico 2 se recolectó y concentró a 1.5 ml por ultrafiltración, luego se sometió a una purificación superdex- 200 (columna: Superdex 200, 16/60 GL, Amersham) al usar 1XPBS (pH 5.5+0.005% TweendO) como eluyente. El pico 2 se colectó y concentró a 1.5 ml. Este material resultante se filtró y formuló de forma estéril hasta un volumen final de 2.5 mL usando 10 mM NaOAc (0.75% NaCl, pH 5.5). Concentración de proteínas 264 µg/ml; 660 µg de proteína se obtuvieron (determinación BCA) .

Ejemplo 10 El siguiente ejemplo ilustra un método para la preparación de una EPO enlaceda a "O" de 40 kilodaltones de PEG usando ST3GalIII: 10. Desialilación En esta etapa la EPO crecida en células de ovario de hámster chino (células CHO) , se desialiló. La enlacedura sirve como un aceptor para la transferencia del ácido siálico PEG modificado en la etapa 10.2, a continuación. La solución de EPO 10 ml (10 mg, 0.33 µmol) glucosilada como se expresa en células CHO (de ovario de "hámster chino) , se intercambió la solución amortiguadora con solución amortiguadora Tris (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02% NaN3, pH 7.2) para dar un volumen final de 10 ml. Luego 750 mU de 2, 3, 6, 8-neuramidasa, de Arthrobacter Ureafaciens, se agregó a la solución. La mezcla resultante se puso con hielos por 48 horas. El producto de esta etapa se usó directamente en la siguiente etapa del protocolo (ver a continuación) . 10. 2 PEGilación de 40K enlaceda en "O" En esta etapa se usa la O-sialiltransferasa para transferir una porción modificada de ácido siálico-PEG a la EPO desialilada de la etapa 10.1, anterior. CMP-ácido siálico-PEG (40 kilodaltones, 33 mg, 0.825 µmol; ver Figura 3A para la estructura de 40 kilodaltones de CMP-SA-PEG) , O-sialiltransferasa (1.4U/ml, 300 mU) , y 0.25 mL de 100 mM MnCl2 se agregaron a la mitad de la mezcla anterior. Esta mezcla se enfrió con hielos a 32 °C por 48 horas. Después del periodo de 48 horas, la mezcla de reacción se concentró por ultrafiltración (MWCO 5K) hasta 2.8 ml, luego se intercambió la solución amortiguadora con 25 mM NaOAc+0.001% Tween-80, pH 6.0) hasta un volumen final de 3 ml. El producto final se purificó por intercambio de iones en SP (5 mL) tres veces (tres inyecciones de 1 ml cada una) . La EPO PEGilada (Pico 2) se recolectó y concentró por ultrafiltración hasta un volumen final de 2 ml para purificación SEC. La purificación en superdex 200 proporcionó la resolución de la proteína deseada: EPO-GlcNAc-Gal-SA-PEG (40K) para la etapa final de la reacción. 10. 3 Sialilación C-terminalompleta de CHO-EPO-GalNAc-Gal-SA~PEG (40K) En esta etapa del proceso, se agregó ácido siálico a las terminaciones de las estructuras de glucosilo que no soportan un residuo modificado de ácido siálico. La EPO PEGilada combinada (aproximadamente 2 mg de la reacción en la etapa, b anterior) se concentró por ultrafiltración (MWCO 5K) y luego se intercambió la solución amortiguadora con solución amortiguadora Tris (0.05M Tris, 0.15 M NaCl, 0.001 M CaCl2+ 0.005% NaN3) hasta un volumen final de 2 mL. Luego se agregaron el ácido CMP-N-acetil neuramínico (CMP-NANA; 1.5 mg, 2.4 µmol), ST3GalIII (8.9U/mL, 10 µl, 0.089 U) y 50 µl de 100 mM MnCl2. La mezcla resultante se enfrió con hielos a 32°C por 24 h, luego se concentró hasta 1 ml de volumen final. Esta solución se sometió directamente a una purificación por Superdex 200 usando 1XPBS (pH 5.5 + 0.005% Tween 80) como eluyente. El pico 1 se colectó y diluyó a 10 ml . Concentración de proteínas 52.8 ug/ml (BCA) . Se obtuvieron un total de 528 µg de proteínas. Una representación esquemática del producto de péptido final se muestra en la Figura 4A.

Ejemplo 11 En este ejemplo los perfiles farmacocinéticos administrados intravenosamente EPO derivados de CHO (un representación esquemática se muestra en la figura 5) y variantes glucopegiladas de EPO derivadas de CHO se compararon usando un ensayo ELISA. Las farmacocinéticas de dos lotes no-PEGiladas de eritropoyetina derivadas de CHO, una eritropoyetina derivada de CHO PEGilada 30K (Figura 4B) producida por métodos de la invención, y eritropoyetina derivada de CHO PEGilada 40K (figura 4A) producida por métodos de la invención, se comparan por ELISA después de una dosis de intravenosa 30 µg/kg sencilla en ratas. 11 . 1 Preparar la placa de ELISA Un anticuerpo de captura contra la EPO humana se dosificó en todos los pozos de una placa de 96 pozos a 100 µl por pozo. La placa se cubrió con cinta para sello de placas y 5 se incubó por dos horas a 37 °C. El anticuerpo de captura se removió de la placa al lavar 2 veces con solución salina amortiguada Tris que contiene 0.2% de Tween-20 (TBST) . Después de un tercer lavado, una solución de bloqueo en leche al 3% (TBST más leche al 3%) se agregó a la placa, se cubrió 10 la placa con cinta para sello de placas y se incubó durante la noche a 4°C. En la mañana la solución de bloqueo se removió por lavado 3 veces con TBST. Las muestras de plasma en rata y las proteínas estándar se diluyeron adecuadamente con plasma de 15 rata y se dosificaron en pozos a 100 µl/pozo. La placa se cubrió con una cinta para sello de placas y se incubó durante la noche a 4°C. A la mañana siguiente las proteínas estándar se usaron para generar una regresión estándar lineal para cada una de 20. las proteínas EPO cuyas propiedades farmacocinéticas se probaron. Un análisis CLAR de fase inversa de las proteínas estándar se completó y las concentraciones se determinaron al calcular el área bajo los picos que corresponden a la pro.teína detectada. 25 11 . 2 Preparación y adición de las muestras de pruebas. Cada muestra de prueba se diluyó y las muestras diluidas se dosificaron en una placa ELISA a 100 µl . La placa luego se cubrió con cinta para sello de placas y se incubó durante la noche a 4°C 11 . 3 Medición de las cuentas de Europio En la mañana, las muestras de suero de rata se removieron y las placas se lavaron 3 veces con TBST. El anticuerpo de detección, EPO * anti-humano de ratón el cual se etiquetó previamente con europio y se purificó a través de una columna de filtración con gel, se aplicó a las placas ELISA. Las placas se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora bajo agitación a 100 rpm. Se removió el anticuerpo de detección por el lavado de las placas 6 veces con TBST. Se agregó la solución de mejora a las placas a 200 µl/pozo y se incubaron las placas a temperatura ambiente por 20 minutos. Se leyó la fluorescencia en un lector de placas Wallac usando un programa de conteo con europio. 11 . 4 Resultados 11. 4a Generación de la Regresión Lineal estándar Se usaron las cuentas de europio de las proteínas estándar de cada placa, para generar una curva y ecuación de regresión lineal estándar. La ecuación se usó para convertir las cuentas de europio en la cantidad equivalente de EPO para cada pozo de prueba. 11 . 4b Resultados farmacocinéticos Los resultados se muestran en la figura 6. El límite de detección es de aproximadamente 0.4ng/mL para EPO no PEGilada y de aproximadamente 0.8ng/mL para EPO pegilada tanto de 30 kilodaltones como de 40 kilodaltones. La EPO derivada de CHO Pegilada de 30 kilodaltones y la EPO derivada de CHO Pegilada de 40 kilodaltones, despliegan claramente parámetros de depuración intravenosa bastante superiores con sus contrapartes no PEGiladas . Como se puede observar de la Figura, las diversas EPO se clasificaron en EPO derivada de CHO Pegilada de 40 kilodaltones ~ EPO derivada de CHO Pegilada de 30 kilodaltones, contrapartes no PEGiladas.

Ejemplo 12 En este ejemplo, los perfiles farmacocinéticos de eritropoyetina (EPO) derivada de CHO administrada subcutáneamente, una EPO hiperglucosilada no glucopegilada, una EPO glucopegilada crecida en células de insectos, y una EPO glucopegilada derivada de células CHO se determinaron al usar un ensayo ELISA.

La farmacocinética de una EPO derivada de CHO no glucopegilada, una EPO hiperglucosilada derivada de células CHO no-PEGilada, una EPO derivada de células de insectos glucoPEGilada; una eritropoyetina derivada de células de insectos PEGilada enlaceda en N de 10K (una representación esquemática se muestra en la Figura 7), y una eritropoyetina derivada de CHO PEGilada enlaceda en 0 de 40 kilodaltones (ver Figura 4A) , se compararon por ELISA después de que se les dieron a las ratas una dosis sencilla subcutánea de 10 µg/kg Las placas ELISA se prepararon y bloquearon como se describen en Ejemplo 10. Las proteínas estándar también se prepararon y se determinaron también las cuentas de europio como se describió anteriormente. 12. 1 Preparación y adición de muestras de rata . Después de las inyecciones subcutáneas (S.C.) se redujo la cantidad de la EPO en circulación en comparación con lo que se observa en inyecciones equivalentes I.V.. Las concentraciones en plasma de las proteínas EPO inyectadas de forma subcutánea se detectaron típicamente entre 30 minutos a 48 horas después de la inyección. 12.2 Resultados Farmacocinéticos. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 8. Figura 8 muestra la cantidad promedio de EPO en ng/mL y las desviaciones estándar en muestras de suero de rata en puntos de tiempo diferentes después de la inyección de cada grupo variante de EPO . El límite de detección es de aproximadamente 0. 3 ng/mL para la EPO PEGilada y EPO no PEGilada . En el caso de la EPO PEGilada que crece en células de insectos , y la EPO PEGilada con CHO de 40 kilodaltones, la absorción parece ser gradual , creando una situación en donde muchas de estas variantes de EPO permanecen por absorberse más allá de los niveles de suero pico (Cmax) . La variante de EPO PEGilada de 10K que crece en células de insecto , alcanza una Cmax en un rango de tiempo de 24-36 horas después de la inyección. Mientras que la variante de EPO PEGilada con CHO de 40 kilodaltones, alcanza una Cmax a las 40-60 horas posteriores a la inyección. Además, estuvieron presentes niveles apreci bles de variantes pegiladas a las 96 horas después de la inyección con la dosis actual inyectada. El orden de clasificación de suero es como sigue : EPO PEGilada con CHO de 40 kilodaltones>10K, variante de EPO PEGilada crecida en células de insectos>CHO-EPO hiperglucosiladas»CHO-EPO no pegilada . Ejemplo 13 Las actividades relativas de las dos variantes no pegiladas de EPO (A y B) se compararon con las dos variantes glucoPEGiladas ( 30 kilodalton y 40 kilodalton PEG) y a una PEG hiperglixosilada en estimular la proliferación de células que transportan el receptor de EPO en cultivo. Las actividades de los péptidos glucopegilados de EPO en este ensayo, son similares a la variante de EPO hiperglucosilada. Ejemplo 14 Inhibición de enlace de EPO etiquetada con isótopo a un receptor EPO quimérico recombinante por diversas concentraciones de EPO no pegilado (A y B) y variantes de PEG glucoPEGiladas de 30 kilodaltones y 40 kilodaltones. Las afinidades del receptor (Ki) son similares para variantes de EPO no pegiladas y glucoPEGiladas. Se entiende que los ejemplos y las modalidades aquí descritas son solamente para propósitos ilustrativos, y que se sugerirán diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos, para las personas expertas en la técnica, y se incluirán dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí citadas se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para todos los' propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invasión, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES : Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un péptido de eritopoyetina caracterizado porque comprende la porción de: en donde D es un miembro seleccionado de -OH y R^L-HN-; G es un miembro seleccionado de Ra-L- y -C(0) alquilo (Ci-Cg) ; R1 es una porción que comprende un miembro seleccionado de una porción que comprende un residuo de poli (etilen glucol) de cadena recta o ramificada; y L es un enlazador el cual es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo substituido o no substituido y heteroalquilo substituido o no substituido, de tal manera que cuando D es OH, G es R1-L~ y cuando G es -C(0) alquilo (C?-C6) , D es R1-L-NH.
2. 2. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L-R1 tiene la fórmula: en donde a es un entero desde 0 hasta 20
3. 3. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un número seleccionado de: en donde e y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500; y q es un entero desde 0 hasta 20.
4. 4. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500; y q y q' son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 20.
5. 5. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en donde e, f y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500; y QA <-[' y y ' son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 20.
6. 6. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: |— C(G)CH2CH2{aCH2CH2)eGCH3 ; y |— C(050CH CH2{OCH2GH2jfOCH3 en donde e y f son enteros independientemente seleccionados de 1 hasta 2500.
7. 7. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula:
8. 8. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula:
9. 9. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción tiene la fórmula: en donde AA es un residuo de aminoácidos del péptido.
10. 10. El péptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el residuo de aminoácidos es un miembro seleccionado de la serina o treonina.
11. 11. El péptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1.
12. 12. El péptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el residuo de aminoácidos es una serina en la posición 126 de SEQ. ID. NO: 1.
13. 13. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende de al menos una porción de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácidos del péptido y t es un entero igual a 0 ó 1.
14. 14. El péptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el residuo de aminoácidos es un residuo de asparagina.
15. 15. El péptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde el residuo de aminoácidos es un residuo de asparagina la cual es un miembro seleccionado de N24, N38, N83, y combinaciones del mismo.
16. 16. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende de al menos una porción de acuerdo a la fórmula: en donde AA es un residuo de aminoácidos del péptido, y t es un entero igual a 0 ó 1.
17. 17. El péptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el reisudo de aminoácidos es un residuo de arginina.
18. 18. El péptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde el residuo de aminoácidos es un residuo de asparagina el cual es un miembro seleccionado de N24, N38, N83 y combinaciones del mismo.
19. 19. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende de al menos una porción de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde A es un residuo de aminoácidos del péptido, y t es un entero igual a 0 ó 1.
20. 20. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una porción de acuerdo a una fórmula seleccionada de: en donde AA es un residuo de aminoácidos del péptido, y un entero igual a 0 ó 1.
21. 21. El péptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el residuo de aminoácidos es un residuo de asparagina.
22. 22. El péptido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde el residuo de aminoácido es un residuo de asparagina el cual es un miembro seleccionado de N24, N38, N83 y combinaciones de los mismos.
23. 23. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un péptido de eritropoyetina bioactivo.
24. 24. El péptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es eritropoyéticamente activo.
25. 25. El péptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque es esencialmente no eritropoyéticamente activo.
26. 26. El péptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque protector de tejido.
27. 27. Un método para hacer una eritropoyetina PEG-ilado caracterizado porque comprende la porción de: en donde : R1 es una porción que comprende un residuo de poli (etilen glucol) de cadena recta o ramificada; y L es un enlazador el cual es un miembro seleccionado de alquilo substituido o no substituido o heteroalquilo substituido o no substituido, el método que comprende: (a) poner en contacto un substrato de péptido de eritropoyetina que comprende la porción de glucosilo: Gal¬ eón una porción del donador de ácido PEG-siálico que tiene la fórmula: y una enzima que transfiere el ácido PEG-siálico en el Gal de la porción de glucosilo, bajo condiciones apropiadas para la transferencia.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende además, previo a la etapa (a) : (b) expresar el substrato de péptido eritropoyetina en un hospedador adecuado.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el hospedador se selecciona de una célula de insecto y una célula de mamífero.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la célula de insecto es una línea de células de Spodoptera frugiperda .
31. 31. Un método para tratar una condición en un sujeto que necesite del mismo, en el que se compromete la producción de células de glóbulos rojos, el método está caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad de un péptido de conformidad con la reivindicación 1, efectivo para aliviar la condición en el sujeto.
32. 32. Un método para aumentar la producción de células de glóbulos rojos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero un péptido de conformidad con la reivindicación 1.
33. 33. Un método para tratar una lesión del tejido en un sujeto que necesite del mismo, en donde la lesión es un daño resultante de la isquemia, trauma, inflamación o contacto con substancias tóxicas, el método caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad de un péptido de eritropoyetina de conformidad con la reivindicación 1, efectivo para aliviar el daño asociado con la lesión de tejido en el sujeto.
34. 34. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende el péptido de eritropoyetina de conformidad con la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable.