BRPI0911722B1 - Conjugado de peptídeo-polímero - Google Patents

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Abstract

CONJUGADO DE PEPTÍDEO-POLÍMERO. A presente invenção relaciona-se a um conjugado de um segmento polimérico e um segmento interferon-(beta), um segmento eritropoietina ou um segmento hormônio de crescimento.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA A PARÁGRAFO DE PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO
O presente pedido de patente reivindica o benefício sobre o Pedido Provisório de Patente Americana No. 61/085.072 depositado em 31 de julho de 2008, o conteúdo do qual ê aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
O avanço em tecnologias de biologia celular e de 10 proteína recombinante tem levado ao desenvolvimento de terapias proteicas.
Até o momento, grandes obstáculos ainda existem. A maioria das proteínas é suscetível à degradação proteolítica e por isso têm um tempo de circulação curto. Outras 15 desvantagens incluem baixa solubilidade em água e indução de anticorpos neutralizantes.
A ligação de um polímero, por _ exemplo, poliêtilênbglicoí (PEG) , a uma proteína impede o acesso de enzimas proteolíticas a cadeia principal da proteína, 20 resultando em estabilidade proteica aumentada. Além disso, também pode melhorar a solubilidade em água e minimizar a imunogenicidade. Há uma necessidade de métodos eficazes de ligação de polímeros a proteínas.
DESCRIÇÃO RESUMIDA
Um aspecto da presente invenção relaciona-se a conjugados polímero-polipeptídeo de fórmula I:
Figure img0001
em que cada um de Ri, R2, R3 > R4 ® > independentemente, é H, alquila CÍ-ÍO, alquenila C2.10, alquinila C2-i0, arila, heterarila, cicloalquila C3.8, ou heterocicloalquila C3_8; cada um de A3 e A2, independentemente, é um segmento de polímero (por exemplo um segmento óxido de polialquileno) cada um de Gx, G2 e G3, independentemente, é uma ligação ou um grupo funcional de ligação; P é um segmento interferon-β (INF-β), um segmento eritropoietina (EPO) , ou um segmento de hormônio de crescimento (GH) ; m é 0 ou um número inteiro de 1 a 10; e n é um número inteiro de 1 a 10. Nestes conjugados, o N-terminal de segmento INF-β, do segmento EPO ou do segmento GH é ligado a G3 . Em relação à fórmula acima, os conjugados polímero- polipeptídeo têm uma ou mais das seguintes características:
Al e A2 são segmentos óxido de polialquileno contendo um peso molecular de 2 a 100 kD (preferencialmente 10 a 30 kD, por .exemplo, 20 kD); cada G1 e G2 é
Figure img0002
(no qual o átomo de O é ligado a A3 ou A2, e o átomo de N é ligado a um átomo de carbono como mostrado na 20 fórmula I; cada G3 e G2 é uréia, sulfonamida ou amida (no qual o átomo de N é ligado a um átomo de carbono como mostrado na fórmula I) ; m é 4; n é 2; e cada Rlz R2, R3, R4 e Rs é H. Em alguns destes conjugados, P é rINF-β Ser17 ou um segmento INF-β modificado contendo 1 a 4 resíduos de 25 aminoácido adicionais no N-terminal de INF-β, Outro aspecto da presente invenção relaciona-se a conjugados polímero-polipeptídeo de fórmula II:
A-Gi-L-Gs-P, fórmula II em que A é um segmento polimérico (por exemplo, um segmento óxido de polialquileno) ; cada Gx e G2, independentemente, é uma ligação ou um grupo funcional de ligação; L é alquenileno C2-io ou alquinileno C2-io; e P é um segmento INF-β, um segmento EPO ou um segmento GH. Nestes conjugados, o N-terminal do segmento INF-β, do segmento EPO ou do segmento GH é ligado a G2.
Em relação à fórmula II, os conjugados polímero- polipeptídeo têm uma ou mais das seguintes características: Ai e A2 são segmentos óxido de polialquileno contendo um peso molecular de 2 a 100 kD (preferencialmente 10 a 30 kD, por exemplo, 20 kD) , cada G3 e G2 é uma ligação, C6 é alquenileno, e cada Ri, R2, R3, R4 e R5 é H.
Outro aspecto da presente invenção relaciona-se a conjugados polímero-polipeptídeo de fórmula III:
Figure img0003
em-que cada Ri, * R2, R3; e R4,~ índepêndentéméhtê, é H, alquila Ci.lo, alquenila C2_10, alquinila C2-10, arila, heteroarila, cicloalquila C3.8 ou heterocicloalquila C3_8; n é um número inteiro de 2 a 10; A é um segmento polimérico; G é um grupo funcional de ligação; e P é um segmento peptídico, o átomo de nitrogênio do N-terminal do segmento peptídico sendo ligada ao átomo de carbono no segmento
Figure img0004
mostrado na fórmula acima.
Em relação à fórmula II, os conjugados polímero- polipeptídeo têm uma ou mais das seguintes características: n é 1; A são segmentos óxido de polialquileno contendo um peso molecular de 10 a 40 kD ou 20 a 30 kD; G é
Figure img0005
em que o átomo de O é ligado a A, e o átomo de N é ligado a um átomo de carbono; e P é um segmento INF, um segmento EPO, um segmento GH.
O termo "alquila Ci-i0" empregado neste pedido refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente linear ou ramificado contendo 1 a 10 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila incluem metila, etila, n-propila, isopropila, terc-butila e n-pentila. Similarmente, o termo "alquenila C2- io" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente linear ou ramificado contendo 2 a 10 átomos de carbono e uma ou mais ligações duplas . _ O termo= "alquinila . C2-io" — refere-.se a. um radical hidrocarboneto monovalente linear ou ramificado contendo 2 a 10 átomos de carbono e uma ou mais ligações triplas.0_ termo- "alquenileno C2-io— refere-se -a um -radicai hidrocarboneto linear ou ramificado bivalente contendo 2 a 10 átomos de carbono e uma ou mais ligações duplas. O termo "alquinileno C2-io" refere-se a um radical hidrocarboneto linear ou ramificado bivalente contendo 2 a 10 átomos de carbono e uma ou mais ligações triplas.
O termo "arila" empregado neste pedido refere-se a um sistema anelar de hidrocarboneto (monocíclico ou bicíclico) contendo pelo menos um anel aromático. Exemplos de segmentos arila incluem, mas não são limitadas a, fenila, naftila e pirenila.
O termo "heteroarila" empregado neste pedido refere-se a um sistema de anel de hidrocarboneto (monocíclico ou bicíclico) contendo pelo menos um anel aromático que contém pelo menos um heteroátomo, tal como O, N ou S como parte do sistema anelar e a restante sendo carbono. Exemplos de segmentos heteroarila incluem, mas não são limitados a, furila, pirrolila, tienila, oxazolila, imidazolila, tiazolila, piridinila, pirimidinila, quinazolinila e indolila.
O termo "cicloalquila" empregado neste pedido refere-se a um sistema anelar monocíclico ou bicíclico parcialmente ou totalmente saturado contendo somente átomos de anel de carbono. Exemplos incluem, mas não são limitados a, ciclopropanila, ciclopentanila e ciclohexanila.
O termo "heterocicloalquila" empregado neste pedido refere-se a um sistema de anel monocíclico ou bicíclico parcialmente ou totalmente saturado contendo, além de carbono, um ou mais heteroátomos (por exemplo, O, N, ou S) , como átomos de anel. Exemplos incluem, mas não são limitados *15* *a,~ piperidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina e 1,4- oxazepano.
Alquila, alquenila, alquinila,_ _ alquenileno, alquinileno, arila, heteroarila, cicloalquila e heterocicloalquila mencionadas neste pedido incluem tanto 20 segmentos substituídos como não substituídos. Exemplos de substituintes incluem alquila Ci-Ci0, alquenila C2-Ci0, alquinila C2-C10/ cicloalquila C3-C8, cicloalquenila C5-C8, alcóxi Ci-Cio, arila, arilóxi, heteroarila, heteroarilóxi, amino, alquilamino C!-C10, dialquilamino Ci-C20, arilamino, 25 diarilamino, hidroxiamino, alcoxiamino, alquilsulfonamida Ci~ Cio, arilsulfonamida, hidróxi, halogênio, tio, alquiltio Cx- Cio, ariltio, ciano, nitro, acila, acilóxi, carboxila e éster carboxílico.
O termo "segmento polimérico" refere-se a um 30 radical monovalente derivado de polímero linear, ramificado ou em formato de estrela. O peso molecular do segmento polimérico pode ser 2 a 100 kD. Exemplos de segmento polimérico incluem, mas não são limitados a, óxido de polietileno, polietilenoglicol, óxido de poli-isopropileno, óxido de polibutenileno, polietilenoglicol e copolimeros dos mesmos. Outros polímeros, tais como dextrana, polivinil álcoois, poliacrilamidas ou polímeros baseados em carboidrato 5 também podem ser empregados contanto não sejam antigênicos, tóxicos ou provoquem resposta imune.
O termo "segmento polipeptídico" refere-se a um radical monovalente derivado de um polipeptídeo de ocorrência natural ou de um polipeptídeo modificado. O peptídeo de 10 ocorrência natural pode ser INF-α2b, INF-β, GH, EPO e fator de estimulação de colônia granulocítica ou anticorpo. O peptídeo modificado pode ser, por exemplo, um peptídeo contendo INF e 1 a 4 resíduos de aminoácido adicionais no N- terminal do INF-a2b. Um exemplo de tal INF modificado é , IFN
Figure img0006
IFN representando um segmento INF-a2b, o grupo amino no N-terminal do qual é ligado ao grupo carbonila.
O termo "interferon-β" refere-se a uma família de proteínas altamente homólogas que inibem replicação virai e proliferação celular e modulam a resposta imune. Ver Derynck 20 et al., (1980), Nature 285 (5766): 542-7; e Taniguchi et al., (1980). Gene 10 (1): 11-5. Inclui tanto INF-βs de ocorrência natural como seus equivalentes funcionais, isto é, um polipeptídeo que é pelo menos 8 0% (por exemplo, 85%, 90%, 95%, ou 99%) idêntico à sua contraparte selvagem. Exemplos de 25 INF-β incluem os ingredientes ativos nos fármacos comercialmente disponíveis, tais como Avonex, Betaseron e Rebif. Ver, por exemplo, Etemadifar M. et al., Acta Neurol. Scand., 2006, 113(5): 283-7.
Listadas abaixo estão sequências de aminoácido de 30 proteínas INF-β humanas exemplares, na forma precursora ou na forma madura: mtnkcllqia lllcfsttal smsynllgf1 qrssnfqcqk llwqlngrle yclkdrmnfd ipeeikqlqq fqkedaalti yemlqnifai frqdssstgw netivenlla nvyhqinhlk tvleekleke dftrgklmss Ihlkryygri Ihylkakeys hcawtivrve ilrnfyfinr Itgylrn (Ver No. de Acesso no GenBank: M28622, versão de 27 de abril de 1993; a porção em itálico refere-se ao peptideo sinal) mnsfstsafg pvafslglll vlpaafpapv ppgedskdva aphrqpltss eridkqiryi Idgisalrke tcnksnmces skealaennl nlpkmaekdg cfqsgfneet clvkiitgll efevyleylq nrfesseeqa ravqmstkvl iqfIqkkakn Idaittpdpt tnaslltklq aqnqwlqdmt thlilrsfke flqsslralr qm (Ver No. de Acesso no GenBank: CAA00839, versão de 3 de dezembro de 1993) _ _
Eπi üm"exemplo, o INF-β é rINF-β Seri7 mutante (INF- β recombinante, no qual serina está no lugar de cisteina na posição 17 na sequência nativa madura de INF-β) _ 0s_ _ ãminoácidos deste mutante são mostrados abaixo: synllgflqr ssnfqsqkll wqlngrleyc Ikdrmnfdip eeikqlqqfq kedaaltiye mlqnifaifr qdssstgwne tivenllanv yhqinhlktv leeklekedf trgklmsslh Ikryygrilh ylkakeyshc awtivrveil rnfyfinrlt gylrn
Em outro exemplo, o INF-β é um INF-β nativo modificado, no qual 1 a 4 resíduos de aminoácido adicionais são ligados ao N-terminal do INF-β nativo. EPO, produzida pelo fígado ou pelo rim, é um hormônio glicoproteico que controla a eritropoiese ou produção de células vermelhas sanguíneas. Inclui tanto EPO de ocorrência natural como seus equivalentes funcionais. Ver Patente Americana 5.621.080 e Publicação de Pedido de Patente Americana 20050176627. As sequências de ãminoácidos da EPO humana (na forma precursora e madura) são mostradas abaixo: mgvhecpawl wlllsllslp Iglpvlgapp rlicdsrvle rylleakeae nittgcaehc slnenitvpd tkvnfyawkr mevgqqavev wqglallsea vlrgqallvn ssqpweplql hvdkavsglr slttllralg aqkeaisppd aasaaplrti tadtfrklfr vysnflrgkl klytgeacrt gdr (precursor) apprlicdsr vlerylleak eaenittgca ehcslnenit vpdtkvnfya wkrmevgqqa vevwqglall seavlrgqal Ivnssqpwep Iqlhvdkavs glrslttllr algaqkeais ppdaasaapl rtitadtfrk Ifrvysnflr gklklytgea crtgdr (forma madura)
Uma proteína EPO empregada para construir o conjugado da presente invenção pode ser uma proteína EPO, na forma precursora ou madura, produzida por uma espécie adequada, por exemplo, humana, murina, suína ou bovina. Em um exemplo, a proteína EPO tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 99%) idêntica a uma das sequências de aminoácidos mostradas acima. Em outro exemplo, a EPO é uma EPO nativa modificada na qual 1 a 4 resíduos de aminoácido_ adicionais são ligados ao N-terminal _ da EPO nativa.
O termo "hormônio de crescimento" refere-se ao hormônio de crescimento humano de ocorrência natural, na forma precursora ou madura, e suas variantes funcionais, isto é, que têm uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95%, ou 99%) idêntica ao hormônio de crescimento humano de ocorrência natural e que possuem a mesma atividade fisiológica daquele hormônio de crescimento- humano. Em um exemplo, o hormônio de crescimento é um hormônio de crescimento nativo modificado no qual 1 a 4 resíduos de aminoácido adicionais são ligados ao N-terminal do hormônio de crescimento nativo. As sequências de aminoácidos do hormônio de crescimento humano de ocorrência natural (na forma precursora ou madura) são mostradas abaixo: matgsrtsll lafgllclpw Iqegsafpti plsrlfdnam Irahrlhqla fdtyqefeea yipkeqkysf Iqnpqtslcf sesiptpsnr eetqqksnle llrisllliq swlepvqflr svfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtl mgrledgspr tgqifkqtys kf dtnshndd' allknyglly cfrkdmdkve tflrivqcrs vegscgf (precursor) Eptiplsrlf dnamlrahrl hqlafdtyqe feeayipkeq kysfIqnpqt slcfsesipt psnreetqqk snlellrisl lliqswlepv qfIrsvfans Ivygasdsnv ydllkdleeg iqtlmgrled gsprtgqifk qtyskfdtns hnddallkny gllycfrkdm dkvetflriv - qcrsvegscg f (forma madura) mfptiplsrl fdnamlrahr Ihqlafdtyq efeeayipke qkysflqnpq tslefsesip tpsnreetqq ksnlellris llliqswlep vqflrsvfan slvygasdsn vydllkdlee giqtlmgrle dgsprtgqif kqtyskfdtn shnddallkn ygllycfrkd mdkvetflri vqcrsvegsc gf (forma modificada)
A "identidade percentual" de duas sequências de 15 aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-68, 1990, modificado como em Karlin e ^Altschul Prpc.^Natl. Acad_. Sei. USA 90:5873-77, 1993. Tal algoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Buscas de proteína em BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, score=50, comprimento de palavra=3 para obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas proteicas para uso na invenção. Onde lacunas existem entre duas sequências, Gapped 25 BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. , Nucleic Acid Res. 25 (17) :3389-3402, 1997, Utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros pré- configurados dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser empregados.
O termo "grupo funcional de ligação" refere-se a um grupo funcional bivalente, uma extremidade sendo ligada ao segmento polimérico e a outra extremidade sendo ligada ao segmento peptídico. Exemplos incluem, mas não são limitados a, grupo -O-, -S-, éster carboxílico, carbonila, carbonato, amida, carbamato, uréia, sulfonila, sulfinila, amino, imino, hidroxiamino, fosfonato ou fosfato.
O conjugado de peptídeo-polímero descrito acima pode estar na forma livre ou na forma de sal, se aplicável. Um sal, por exemplo, pode ser formado entre um ânion e um grupo positivamente carregado (por exemplo, amino) em um conjugado de peptídeo-polímero da presente invenção. Ânions adequados incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, nitrato, 10 fosfato, citrato, metanossulfonato, trifluoroacetato e acetato. Do mesmo modo, um sal também pode ser formado entre um cátion e um grupo negativamente carregado (por exemplo, carboxilato) em um conjugado polipeptideo-polímero da presente invenção. Cátions adequados incluem íon sódio, íon 15 potássio, íon magnésio, íon cálcio e um cátion amónio, tal como íon tetrametilamônio.
Além disso, o conjugado de peptídeo-polímero^ pode ter uma ou mais ligações duplas ou um ou mais centros assimétricos. Tal conjugado pode ocorrer como racematos, 20 misturas racêmicas, enantiômetros únicos, diastereômeros individuais, misturas diastereoméricas e formas isoméricas de ligação dupla cis- ou trans- ou E- ou Z-.
Exemplos de conjugado polímero-peptídeo da presente invenção são mostrados abaixo:
Figure img0007
Figure img0008
em que mPEG representa polietilenoglicol terminado em metóxi contendo um peso molecular de 2 0 kD, e os N- terminais de rINF-β Seri7, EPO e GH são ligados ao carbono mais ã direita mostrado nas estruturas acima.
Determinadas proteínas têm utilidades terapêuticas. Os conjugados da presente invenção, contendo um segmento peptídico, podem, por isso, ser empregados para tratar doenças. Por exemplo, INF-β é um medicamento imunomodulador para tratamento de infecção por HCV ou HBV. Ver, por exemplo, Journal of Vascular and Interventional Radiology 13 (2002) : 191-196. Dessa forma, dentro do escopo da presente invenção - - está um método de tratamento de infecção por vírus de hepatite C (HCV) ou infecção por vírus de hepatite B (HBV) com um conjugado INF-β-polímero descrito »acima. - Gomo- outro - * * * exemplo, EPO é um hormônio produzido pelo rim para promover a formação de células vermelhas sanguíneas na medula óssea. Tem sido empregada como um medicamento imunomodulador para o tratamento de anemia resultante de doença renal crônica, anemia secundária ao tratamento com zidovudina para Aids e anemia associada ao câncer. Estudos recentes também encontraram que EPO aumenta a neurogênese e desempenha um papel crítico na recuperação pós-derrame. Ver, por exemplo, P. T. Tsai, Journal of Neuroscience, 2006, 26: 1269. Dessa forma, outro aspecto da presente invenção relaciona-se a um método de tratamento de anemia ou aumento de neurogênese por um conjugado EPO-polímero descrito acima.
Também dentro do escopo da presente invenção está uma composição contendo o conjugado INF-β-polímero descrito acima para uso no tratamento de infecção por HCV ou infecção por HBV, e uma composição contendo o conjugado EPO-polímero descrito acima para uso no tratamento de anemia ou aumento de neurogênese, bem como o uso terapêutico e o uso do conjugado para a produção de um medicamento para tratamento de infecção por HCV, infecção por HBV ou anemia, ou para aumento de neurogênese.
Os detalhes de uma ou mais realizações da invenção são apresentados na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os conjugados de peptídeo-polímero da presente invenção podem ser preparados por métodos sintéticos bem conhecidos na técnica química. Por exemplo, pode-se combinar ümà molécula ligante contendo um ou mais grupos funcionais ativos com duas moléculas de polímero contendo um grupo funcional reativo àqueles na molécula _ _ ligante... _ . Posteriormente, uma molécula peptídica contendo um grupo funcional é reagida com um grupo funcional da molécula ligante para formar um conjugado de peptídeo-polímero da presente invenção. Dois esquemas sintéticos ilustrativos são fornecidos neste pedido.
O esquema 1 abaixo mostra um exemplo de preparação dos conjugados de peptídeo-polímero de fórmula I. O composto diamina 1, que contém um grupo acetal, é reagido com carbonato N-hidroxisuccinimidil mPEG (isto é, composto 2) para formar o composto di-PEGilado 3, que é posteriormente convertido no aldeído 4. Este composto aldeído é reagido com o peptídeo H-P contendo um grupo amino livre através de alquilação redutiva para produzir um conjugado de peptídeo- polímero da presente invenção.
Figure img0009
O esquema 2 abaixo mostra um exemplo de preparação dos conjugados de peptídeo-polímero de fórmula II. O produto químico 6 têm um segmento polimérico e um grupo funcional aldeído. Pode ser reagido com o peptídeo 7, que tem um grupo 5 funcional amino livre. O produto resultante 8^ é posteriormente reduzido, por exemplo, por hidrogenação ou por NaBH3CN, para produzir o conjugado de peptídeo-polímero 9.
Figure img0010
A é um segmento polimérica Gi é uma ligação ou um grupo funcional de ligação L é alquenileno ou alquinileno H2N-P' é INF-β, EPO ou GH Esquema 2
O esquema 3 abaixo é um exemplo de preparação de um conjugado de peptídeo-polímero de fórmula III. O composto 10 10 contendo um grupo acetal, que pode ser preparado a partir de β-aminoacido, é reagido com carbonato N-hidroxisuccinimidil mPEG 2 para formar o composto PEGilado 11, que é posteriormente convertido em aldeído 12. Este composto aldeído é reagido com peptídeo H-P contendo um grupo amino livre através de alquilação redutiva para produzir o composto 13 desejado.
Figure img0011
As reações, químicas descritas- acima incluem o uso- — — de solventes, reagentes, catalisadores, reagentes de grupo de proteção e de grupo de desproteção, e determinadas condições de reação. Podem incluir adicionalmente etapas, antes ou após as etapas descritas especificamente neste pedido, para adição ou remoção dos grupos de proteção adequados a fim de permitir finalmente a síntese de um conjugado de peptídeo-polímero. Além disso, várias etapas sintéticas podem ser realizadas em uma sequência ou ordem alternativa para fornecer os conjugados polipeptídeo-polímero desejados. Transformações de química sintética e metodologias de grupo de proteção (proteção e desproteção) úteis na síntese de conjugados de peptídeo-polímero aplicáveis são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas descritas em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991) ; L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L>. Paquette, ed. Enciclopédia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) e edições subsequentes dos mesmos.
Um conjugado de peptídeo-polímero dessa forma sintetizado pode ser ainda purificado por um método, tal como cromatografia de troca iônica, cromatografia por filtração em gel, eletroforese, diálise, ultrafiltração ou ultracentrifugação. O conjugado de peptídeo-polímero da invenção pode ser farmaceuticamente ativo na forma conjugada.
Alternativamente, pode liberar um peptídeo farmaceuticamente ativo in vivo (por exemplo, por hidrólise) pela _cliyagem enzimática da ligação entre o segmento peptídico e a segmento polimérico. Exemplos de enzimas envolvidas em ligações de clivagem_ in_ vivo incl_uem_ enzimas oxidativas. (por .exemplo, _ peroxidases, amina oxidases, ou desidrogenases), enzimas redutoras (por exemplo, ceto redutases), e enzimas hidrolíticas (por exemplo, proteases, esterases, sulfatases ou fosfatases).
Dessa forma, um aspecto da presente invenção relaciona-se a um método de administração de uma quantidade eficaz de um ou mais dos conjugados de peptídeo-polímero descritos acima para tratamento de um distúrbio (por exemplo, infecção por HCV ou HBV, ou anemia) . Especificamente, uma doença pode ser tratada pela administração a um indivíduo de um ou mais dos conjugados de peptídeo-polímero em uma quantidade eficaz. Tal indivíduo pode ser identificado por um profissional da área de saúde com base em resultados de qualquer método diagnóstico adequado. Como empregado neste pedido, o termo "tratar" ou é definido como a aplicação ou administração de uma composição incluindo um conjugado de peptídeo-polímero a um indivíduo (humano ou animal) , que tem um distúrbio, um sintoma de distúrbio, uma doença ou distúrbio secundário ao distúrbio, ou predisposição ao distúrbio, com o objetivo de curar, aliviar, atenuar, curar ou melhorar o distúrbio, o sintoma do distúrbio, a doença ou distúrbio secundário ao distúrbio, ou predisposição ao distúrbio. "Uma quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um conjugado de peptídeo-polímero que confere um efeito terapêutico no indivíduo tratado. O efeito terapêutico pode ser objetivo (isto é, mensurável por alguns testes ou marcadores) ou subjetivo (isto ê, um indivíduo fornece um indício ou sente um efeito).
Para praticar o método da presente invenção, umaB _ , . composição contendo um ou mais dos conjugados citados acima pode ser administrada parenteralmente, oralmente, nasalmente, retalmente, topicamente ou bucalmente. O termo "parenteral". _ - ~ como empregado neste pedido refere-se à injeção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, intraperitonial, intratraqueal ou intracraniana, bem como qualquer técnica de infusão adequada.
Uma composição injetável estéril pode ser uma solução ou suspensão em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, tal como uma solução em 1,3- butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão manitol, água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos são convencionalmente empregados como solventes ou meios de suspensão (por exemplo, mono- ou diglicerídeos sintéticos). Ácido graxo, tal como ácido oleico e seus derivados de glicerídeo é útil na preparação de injetáveis, como são óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como óleo de oliva ou óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante alcoólico de cadeia longa, ou carboximetilcelulose ou agentes de dispersão 5 similares. Outros tensoativos comumente empregados, tais como
Tweens ou Spans ou outros agentes emulsificantes similares ou aumentadores de biodisponibilidade que são comumente empregados na produção de sólidos, líquidos ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser 10 empregados para fins de formulação.
Uma composição para administração oral pode ser qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo cápsulas, comprimidos, emulsões e suspensões, dispersões e soluções aquosas. No caso de comprimidos, veículos comumente empregados' incluem amido de milho e lactose. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para administraçãooral em uma_forma _ . „ - - de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões ou emulsões aquosas são administradas oralmente, o ingrediente ativo pode ser suspenso ou dissolvido em uma fase oleosa combinada com agentes emulsificantes ou de suspensão. Se desejado, determinados agentes adoçantes, flavorizantes ou colorantes podem ser adicionados.
Um aerossol nasal ou composição de inalação podem ser preparados de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica da formulação farmacêutica. Por exemplo, tal composição pode ser preparada como uma solução em salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes, 30 promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorcarbonos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes adequados conhecidos na técnica. Uma composição contendo um ou mais dos compostos acima descritos também pode ser administrada na forma de supositórios para administração retal.
Um veículo farmaceuticamente aceitável será rotineiramente empregado com um ou mais conjugados ativos supracitados. O veículo na composição farmacêutica deve ser "aceitável" no sentido de que seja compatível com o ingrediente ativo da composição (e preferencialmente, capaz de estabilizar o ingrediente ativo) e não deletério ao indivíduo a ser tratado. Um ou mais agentes solubilizantes podem ser utilizados como excipientes farmacêuticos para liberação de um composto supracitado. Exemplos de outros veículos incluem óxido de silício coloidal, estearato de magnésio, celulose, lauril sulfato de sódio e D&C Yellow # 1°. _ __ _ _ _
Os exemplos abaixo devem ser interpretados como simplesmente ilustrativos, e não limitativos do restante da revelação. jde qualquer, modo em_absoluto. _Sem _elaboração _ adicional, acredita-se que um técnico no assunto, com base na descrição neste pedido, possa utilizar a presente invenção até sua extensão mais completa. Todas as publicações citadas neste pedido são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade. EXEMPLO 1: Conjugado polimérico IFN-β-di-PEG Preparação de di-PEG aldeído
Figure img0012
PEGO(C=O)OSu de 20 kD foi preparado a partir de mPEGOH de 20 kD adquirido de (SunBio Inc, California, USA) de acordo com o método descrito em Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569.
Uma solução de 6-(1,3-dioxolan-2-il) hexano-1,5- diamina em diclorometano (11,97 g da solução contendo 9,03 mg de diamina, 47,8 μmol) foi adicionada a um frasco contendo PEGO(C=O)OSu de 20 kD (1,72 g, 86,0 μmol). Após PEGO(C=O)OSu ser completamente dissolvido, N,N-di-isopropiletilamina (79 μl>, 478 μmol) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 24 h, e em seguida metil t-butil éter (200 ml) foi adicionado gota a gota com agitação. O precipitado resultante foi coletado e seco sob vácuo para produzir di-PEG acetal (1,69 g, 98%) como um sólido branco. XH RMN (400 MHz, dε-DMSO) δ 7,16 (t, J = 5,2 Hz, 1 H) , 7,06 (d, J = 8,8 Hz, 1 H) , 4,76 (t, J = 4,8 Hz, 1 H) , 4,10-3,95 (m, 4 H) , 1,80-1,65 (m, 1 H) , 1,65-1,50 (m, 1 H) , 1,48-1,10 (m, 6 H).
Figure img0013
Di-PEG acetal (4,0 g, 0,2 mmol) foi suspenso em tampão pH 2,0 (ácido cítrico, 40 ml). A mistura de reação foi agitada a 35 °C por 24 h e em seguida extraída com diclorometano (3 x 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio, concentradas, e em seguida redissolvidas em diclorometano (20 ml). A solução foi adicionada gota a gota a metil terc-butil éter (400 ml) com agitação. O precipitado resultante foi coletado e seco em pressão reduzida para fornecer di-PEG aldeído (3,8 g, 95%) como um sólido branco. XH RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 9,60 (s, 1 H) , 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,16 (t, J = 5,2 Hz, 1 H), 4,10-3,95 (m, 4 H) , 3,95-3,80 (m, 1 H) , 3,00-2,85 (m, 2 H) , 2,58-2,36 (m, 2 H), 1,46-1,15 (m, 6 H).
Alternativamente, di-PEG aldeído foi preparado da seguinte maneira:
Dois grupos amino de homo-lisina disponível comercialmente (Astatech Pharmaceutical Co, Ltd, China) foram protegidos por benziloxicarbonila. A homo-lisina N-protegida foi esterifiçada e reduzida para formar um composto aldeído. O grupo aldeído foi posteriormente protegido com etilenoglicol. O grupo protetor benziloxicarbonila então foi removido por hidrogenação na presença de um catalisador de paládio. O composto N-desprotegido foi reagido com mPEGOH ativado (Sunbio Chemicals Co, Ltd., Coreia do Sul) em uma condição básica branda. O produto resultante foi agitado em tampão ácido cítrico pH 2,0 (Sigma-Aldrich, Alemanha) a 25°C por 72 horas para remoção do grupo de proteção de aldeído. 109 g de polímero di-PEG aldeído foram obtidos (rendimento: 95%). A pureza foi maior que 97,7% (determinada por HPLC) e maior que 95% (determinada por análise de 1H RMN). Preparação de rhIFN-β Ser17 Humano ~Um"fragmento de DNA que codifica INF-β Sern humano foi clonado no vetor de expressão pET24a para produzir um plasmídeo de expressão rhIFN-β Seri7-pET24a. Este plasmídeo, _ _ . . de expressão foi transformado em E. coli e transformantes positivos, isto é, clones carregando o plasmídeo de expressão, foram selecionados, cultivados e as culturas de E. coli resultantes foram armazenadas a -80 °C. μl de uma cultura de E. coli armazenada acima foram inoculados em 200 ml de um meio de semeadura composto de Terrific Broth e glicerol, por aproximadamente 15 horas a 37°C e 200 rpm. 150 ml da cultura de E. coli dessa forma obtidos foram transferidos para 2,5L de meio de cultura contendo glicose (10 g/1), MgSO4 • 7H2O (0,7 g/1) , (NH4)2HPO4 (4 g/1) , KH2PO4 (3 g/1), K2HPO4 (6 g/1), citrato (1,7 g/1), Extrato de Levedura (10 g/1) , canamicina (50 mg/ml) , cloranfenicol (50 mg/ml), um agente antiespumante, e elementos-traço incluindo FeSO4*7H2O (10 mg/1), ZnSO4 ■ 7H2O (2,25 mg/1) CuSO4 • 5H2O (1 mg/1), MnSO4 • H2O (0,5 mg/1), H3BO3 (0,3 mg/1), CaCl2 • 2H2O (2 mg/1), (NH4) 6Mo7024 (0,1 mg/1), EDTA (0,84 mg/1) e Cl (50 mg/1) , e cultivados a 37 °C. Quando a ODsoo da cultura de E. coli alcançou 120 a 140, IPTG (1 M) foi adicionado à cultura para induzir a expressão de rhIFN-β Seri.,. A cultura induzida foi incubada a 37 °C e 300 rpm por 3 horas. Quando necessário, um meio de alimentação contendo glicose 800 g/1 e MgSO4 20 g/1 foi adicionado à cultura de E. coli durante a incubação.
A cultura de E. coli obtida como descrita acima foi submetida ã centrifugação para coleta das células de E. coli. As células foram ressuspensas em tampão PBS (Na2HPO4 0,lM, NaCl 0,15M) e rompidas em um Homogenizador APV. A solução homogeneizada dessa forma obtida foi centrifugada a 10.000 rpm, 4 °C por 15 min. O precipitado (incluindo o corpo de inclusão) foi coletado, ressuspenso em PBS e agitado à temperatura ambiente por 2 0 a 3 0 min para formar uma suspensão. NaOH (6 N) foi adicionado à suspensão para ajustar seu pH a 12 para permitir a dissolução de proteínas _incluídas _ no corpo de inclusão. Aproximadamente 2 minutos depois, o valor de pH da suspensão foi ajustado a 7,5 com HC1 6 N. A suspensão então foi submetida à centrifugação e o sobrenadante dessa forma formado foi coletado, sua concentração proteica sendo determinada usando um espectrofotômetro. O sobrenadante foi misturado com um tampão de renaturação (TEA, pH 8,3) e incubado à temperatura ambiente sem ser agitado por 24-48 horas. Então foi concentrado e dialisado, usando o sistema TFF e cassete PLCCC fornecido por Millipore, Inc. A solução resultante foi submetida à ultrafiltração, diálise e fracionamento com uma coluna Sefarose SPFF. As Frações A9 e AIO assim obtidas, contendo a proteína recombinante rhIFN-β Ser17, foram ainda fracionadas com outra coluna Sefarose SPFF para enriquecer a proteína de recombinação (nas Frações A8-A10). Estas frações contendo rhIFN-β Seri? foram ainda purificadas através de filtração etn gel (Superdex 75 HR 10/300) para obtenção da proteína rhIFN-β Serπ (1 mg/ml) contendo uma pureza maior que 90%. A bioatividade da proteína recombinante foi > 2 xlO7 lü/mg de proteína.
Preparação de conjugado polimérico IFN-μ-di-PEG 18,9 mg de rhINF-β Ser17 e 1,51 g diPEG aldeído foram suspensos, em 26 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 5,0) . A esta solução foram adicionados 400 eq. de NaCNBH3 (Acros Organics, Bélgica). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e em seguida submetida à diálise com tris-HCl 25 mM (pH 7,8). O produto bruto foi purificado por uma coluna de troca iônica para produzir 2 mg de polímero IFN-μ-di-PEG.
Preparação de IFN-β humano
Células de E.coli transformadas BLR (DE3)-RIL, carregando a sequência de codificação de IFN-β operacionalmente ligada a_ um promotor _de_ E^ coli, _foram. inoculadas em 250 ml de meio SYN (10 g/1 de "soytone" selecionado, extrato de Levedura 5 g/1 e NaCl 10 g/1) suplementados com canaraicina 50 μl/ml e cloranfenicol 50 μl/ml. As células então foram cultivadas a 37oC em uma incubadora agitadora a 220 rpm por uma noite (isto é, 16 horas). 250 ml da cultura por uma noite mencionada acima foram inoculados em 3,0 L de meio básico (10 g/1 de Glicose, 0,7 g/1 de MgSO4 • 7 H2O, 4 g/1 de (NH4)2HPO4, 3 g/1 de KH2PO4, 6 g/1 de K2HPO4, 2 g/1 de Citrato, lOg/1 de extrato de Levedura e 2 g/1 de Isoleucina) suplementados com glicose básica 10 g/1, 0,7 g/1 de MgSO4 de alimentação, 30 ml de elemento-traço de alimentação (10 g/1 de FeSO4‘7H2O, 2,25 g/1 de ZnSO4-7H2O, 1 g/1 de CuSO4 5H2O, 0,5 g/1 de MnSO4-H2O, 0,3 g/1 de H3BO3, 2 g/1 de CaCl2-2H2O, 0,1 g/1 de (NH4) sMo7024, 0,84 g/1 de EDTA, 50 ml/L de HC1), canamicina 25 μl/ml e cloranfenicol 25 μl/ml e cultivados em fermentador de cinco litros (Bioflo 3000; Brunswick Scientation Co, Edison NJ) . Durante a fermentação, o pH do meio foi controlado em pH 7,1 pela adição automatizada de uma solução de NH4OH 37%. O nível de oxigênio dissolvido (DO) foi mantido em 30%. A solução de alimentação (800 g/1 de glicose, 20 g/1 de MgSO4, canamicina 50 μl/ml e cloranfenicol 50 μl/ml) foi adicionada usando uma bomba controlada por programa, que era alimentada quando o nível de DO excedia 40-60. Quando a densidade celular (ODeoo) na cultura de fermentação alcançou 180 a 200, 4 ml de Isopropil- β-D-1-tiogalactopiranosideo 1 M (IPTG) foram adicionados à cultura de fermentação para induzir a expressão de IFN β, em conjunto com 3 0 ml de elementos traço de alimentação e 25 g de extrato de levedura. Células foram coletadas cinco horas após indução por IPTG por centrifugação.
Os precipitados celulares foram suspensos em tampão PBS (fosfato de sódio 0,lM, cloreto de sódio 0,15M, pH 1, 4) em uma proporção aproximada de 1:3 (peso úmido g/ml), rompidos por um microfluidizador, e em seguida centrifugados a 10.000 rpm por 20 minutos a 4°C. O precipitado contendo corpo de inclusão (IB) foi lavado duas vezes com tampão PBS, centrifugado como descrito acima, e suspenso em 1L de solução de PBS (fosfato de sódio 0,lM, cloreto de sódio 0,15M, pH 7,4, zwittergent 3-14 3%, DTT 5 mM) . Após ser agitada por 30 minutos, a suspensão foi submetida ao ajuste de pH a 12 com NaOH 6,0 M, agitando para solubilizar o precipitado. O pH da suspensão então foi ajustado ao pH 7,5 com HC1 6 N. Na centrifugação a 10.000 rpm por 20 min, o sobrenadante, contendo IFN β solúvel, foi coletado.
O INF-β solúvel então foi submetido ao renaturação como se segue. O sobrenadante acima mencionado foi diluído em 10 litros de um tampão de renaturação recentemente preparado (Tris-HCl 100 mM (pH 7,6), L-arginina 0,5 M, EDTA 2 mM) para formar uma mistura de renaturação. A mistura foi incubada por 48 horas sem agitação. Após incubação, a mistura, contendo IFN-β renaturado recombinante, foi dialisada contra tampão Tris 20 mM (com NaCl 100 mM, zwittergent 3-140,05%, pH 7,0) .
A mistura dialisada foi carregada sobre uma coluna SP-Sefarose (GE Amersham Pharmacia), que foi pré-equilibrada e lavada com um tampão Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM (pH 7,0) . IFN β foi eluído com uma solução contendo tampão Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) e NaCl 200 mM. Frações contendo IFN β foram coletadas com base em sua absorbância em 280 nm. O IFN β contido nesta foi ainda purificado por uma coluna de interação hidrofóbica (GE Healthcare, Butyl Sefarose Fast Flow), que foi pré-equilibrada e lavada com solução contendo sulfato de amónio 1,0 M, acetato de sódio 20 mM e zwittergent 0,05% (pH 4,5). O IFN β foi eluído usando uma solução contendo sulfato de amónio 0,5 M e acetato de sódio 20 mM. Frações contendo a proteína foram coletadas com base em sua absorbância em 280 nm. Estas frações foram agrupadas e a concentração de IFN β foi determinada pelo ensaio proteico BCA (BCATM Protein assay, Pierce).
Preparação de conjugado PEG-IFN-β
A uma solução de di-PEG aldeído (296 mg, 7,4 μmol) em água (1,46 ml) foi adicionado tampão fosfato de sódio 2 M (pH 4,0, 0,37 ml), zwittgen 3-14 (1,48 ml, 10% em água) e INF-β (14,8 mg em 3,7 ml de tampão pH 4,5 contendo acetato de sódio 20 mM, sulfato de amónio 0,7% e detergente 0,05%) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 minutos, seguida pela adição de solução aquosa de cianoborohidreto (400 mM, 92,5 μL, 37 μmol) . A mistura de reação foi agitada no escuro por 40 horas e purificada por cromatografia em SP HP Sefarose. Frações contendo o conjugado PEG-IFNβ desejado foram coletadas com base em seu tempo de retenção e absorbância em 280 nm. A concentração do conjugado foi determinada pelo ensaio proteico BCA (BCATM Protein assay, Pierce).
Estudo farmacocinêtico em ratos
Um estudo farmacocinêtico foi realizado em um modelo de rato para comparar a meia-vida sérica de IFN-β e PEG-IFN-β. Ratos machos (250~350 g) foram administrados intravenosamente com uma dose de 600 μg/kg de IFN β (n=3) e PEG-IFN β (n=3). O sangue (250 μL) de cada rato foi coletado antes da administração e em 0,1, 1, 2, 4, 6, 10, 24, 48, 72 e 96 horas após administração. Amostras séricas foram preparadas a partir do sangue e as quantidades de IFN-β contidas nas amostras foram analisadas por um imunoensaio ligado à Enzima (ELISA). A meia-vida sérica de IFN-β e PEG- IFN-β foi 2 horas e 20 horas respectivamente, calculada a - partir "dá concentração de soro dos três últimos pontos de tempo.
EXEMPLO 2: Conjugado polimérico EPO-PEG Preparação de PEG-EPO
A uma solução de di-PEG aldeído (267 mg, 6,1 μmol) em água (2,67 ml) foi adicionado tampão fosfato de sódio 2 M (pH 4,0, 1 ml) e EPO (10 mg em 3,03 ml de tampão pH 7,3 contendo fosfato de sódio 20 mM e NaCl 150 mM) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 minutos, seguida pela adição de solução aquosa de Cianoborohidreto de sódio (400 mM, 100 μl, 40 μmol) . A mistura de reação foi agitada no escuro por 17 horas e purificada por uma coluna Toyopearl SP (Tosoh). A coluna foi equilibrada com tampão acetato de sódio 20 mM, pH 4,5. A mistura de reação foi diluída a uma concentração de 0,3 a 0,4 mg/ml e carregada sobre a coluna Toyopearl SP. Frações contendo o conjugado PEG-EPO desejado foram coletadas com base em seu tempo de retenção e absorbância em 280 nm. A concentração do conjugado foi determinada por absorbância de UV em 280 nm.
Estudo farmacocinético em ratos Um estudo farmacocinético foi realizado em um modelo de rato para comparar a meia-vida sérica de EPO e PEG- EPO. Ratos machos (250~350 g) foram administrados 5 intravenosamente com EPO (n=5) e PEG-EPO (n=5) em uma dose de 25 μg/kg. Sangue (250 μL) foi retirado de cada rato antes da administração e 0,088, 0,75, 1,5, 3, 6, 10, 24 e 48 horas pós-administração. Para ratos tratados com PEG-EPO, amostras de sangue foram ainda coletadas em 72 e 96 horas após a 10 administração. Amostras séricas foram preparadas a partir do sangue e analisadas com um imunoensaio ligado à Enzima (ELISA) para determinar as quantidades de EPO contidas nelas. Os resultados mostram que a meia-vida sérica de EPO foi 9 horas enquanto aquela de PEG-EPO foi significativamente 15 aumentada, isto é, 38 horas.
Preparação de conjugado polimérico EPO-PEG 0,2 mg de EPO (Cashmere Scientific Company, e 4 mg de di-PEG aldeído (20 equal.) foram suspensos em tampão fosfato 0,1 M (pH 5,0) . A esta solução foi adicionado 20 400 eq. de NaCNBH3. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. HPLC confirmou a formação do polímero EPO-di-PEG.
EXEMPLO 3: Conjugado polimérico GH-PEG Preparação de Met-hGH
Células de E.coli transformadas BLR (DE3)-RIL, capazes de expressar Met-hGH, foram cultivadas após o procedimento de fermentação descrito acima para expressão de Met-hGH. • Células foram coletadas através de centrifugação e o precipitado celular foi suspenso em tampão TE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) em uma proporção aproximada de 1:3 (peso úmido g/ml). As células então foram rompidas por um microfluidizador e em seguida centrifugadas a 10.000 rpm por minutos. O precipitado contendo corpo de inclusão (IB) foi lavado duas vezes com tampão TED (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, Deoxicolato 2%, pH 8,0), centrifugado como descrito acima, e suspenso em água MilliQ e centrifugado a 20.000 rpm por 15 min. Os IBs foram suspensos em 4 00 ml de solução TUD 50 mM (Tris-HC150 mM, Ureia 4 M, DTT 2,5 mM, pH 10,0) e a suspensão foi centrifugada a 2 0.000 rpm por 2 0 minutos; o sobrenadante foi coletado.
O sobrenadante foi diluído em 2,0 litros de um tampão de renaturação recentemente preparado (Tris-HCl 50 mM, EDTA 0,5 mM, glicerol 5% GSH 10 mM/GSSG 1 mM, pH 8,0). A mistura assim formada foi incubada por 36 horas sem agitação e em seguida dialisada contra tampão Tris 20 mM (pH 7,0).
A mistura dialisada, contendo Met-hGH, foi carregada sobre uma coluna Q-Sefarose (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA) , que foi pré-equilibrada e lavada com um tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,_0. Met-hGH foi eluído com uma solução contendo tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 e NaCl 100 mM. Frações contendo Met-hGH, determinadas pela sua absorbância em 280 nm, foram coletadas, agrupadas e carregadas sobre uma coluna de interação hidrofóbica (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA) , pré-equilibradas e lavadas com um tampão acetato de sódio 20 mM (pH 7,0) , a uma vazão de 5 ml/min. Met-hGH foi eluído com uma solução contendo tampão acetato de sódio 20 mM e sulfato de amónio 15 0 mM. Uma fração contendo Met-hGH foi coletada e submetida ao ensaio proteico BCA (BCATM Protein assay, Pierce) para determinar a concentração de Met-hGH.
Preparação de conjugado PEG-Met-hGH
A uma solução de di-PEG aldeído (74 mg, 1,7 μmol) em água (387 μl) foram adicionados tampão fosfato de sódio 2 M (pH 4,0, 3 74 μl) e GH humano (22,4 mg em 6,5 ml de tampão pH 4,5 contendo acetato de sódio 20 mM e NaCl 150 mM) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 minutos, seguida pela adição de solução aquosa de cianoborohidreto de sódio (400 mM, 140 μl, 56 μmol) . A mistura de reação foi agitada no escuro por 17 horas e 5 purificada por cromatografia em SP XL Sefarose. Frações * contendo o conjugado polímero-proteína desejado foram coletadas com base em seu tempo de retenção e absorbância em 280 nm. A concentração do conjugado foi determinada por um conjunto de ensaio proteico usando o método de Bradford 10 (Pierce, Rockford, IL).
Estudo farmacocinêtico em ratos
Um estudo farmacocinêtico foi realizado em um modelo de rato para comparar a meia-vida sérica de Met-hGH e PEG-Met-hGH. Ratos machos (250~350_ g) foram administrados 15 intravenosamente com Met-hGH (n=5) ou PEG-Met-hGH (n=5) em uma dose de 100 μg/kg. Amostras de sangue foram coletadas de ratos-tratados com Met-hGH antes da_administração=e. 0,083, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas após administração; e foram coletadas de ratos tratados com PEG-Met-hGH antes da administração e 20 0,33, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, e 96 horas após administração.
Amostras séricas foram preparadas a partir do sangue e analisadas com um imunoensaio ligado à Enzima (ELISA) para determinar as concentrações de hGH. A meia-vida sérica de Met-hGH e PEG-Met-hGH foi 3 horas e 35 horas respectivamente.
OUTRAS REALIZAÇÕES
Todas as características apresentadas neste . relatório descritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica revelada neste relatório • descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa servindo ao mesmo objetivo, equivalente ou similar. Dessa forma, a menos que expressamente afirmado de outra maneira, cada característica revelada é somente um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou similares.
A partir da descrição acima, um técnico no assunto pode apurar facilmente as características essenciais da presente invenção, e sem se afastar do espírito e escopo desta, pode fazer várias modificações e alterações na invenção para adaptar a mesma a vários usos e condições. Dessa forma, outras realizações estão também dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (7)

1. CONJUGADO DE PEPTÍDEO-POLÍMERO, caracterizado por possuir a seguinte fórmula:
Figure img0014
em que cada um de R1, R2, R3, R4 e R5, independentemente, é H, C1-10 alquil, C2-10 alquenil, C2-10 alquinil, aril, C3-8 cicloalquil ou C3-8 heterocicloalquil; cada um de A1 e A2, independentemente, é um segmento de polímero; cada um de G1, G2 é
Figure img0015
em que o O está ligado a A1 ou A2, e o átomo N está ligado a um átomo de carbono; P é rINF-β Ser17 ou um segmento de interferon-β modificado que contém de um a quatro resíduos de aminoácidos adicionais no N-terminal, o átomo de nitrogênio do N-terminal de P sendo ligado a G3; m é 0 ou um número inteiro de 1 a 10; e n é um número inteiro de 1 a 10.
2. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por cada um de A1 e A2 ser um segmento de polietilenoglicol que tem um peso molecular de 2 a 100 kD.
3. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por cada um de A1 e A2 ser um segmento de polietilenoglicol que tem um peso molecular de 10 a 30 kD.
4. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por m ser 4, n ser 2, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 ser H.
5. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo conjugado ser
Figure img0016
em que mPEG é um segmento de metoxi (polietileno glicol) que tem um peso molecular de 20 kD.
6. CONJUGADO DE PEPTÍDEO-POLÍMERO, caracterizado pelo conjugado ser
Figure img0017
em que mPEG é um segmento de metoxi (polietileno glicol) que tem um peso molecular de 20 kD.
7. CONJUGADO DE PEPTÍDEO-POLÍMERO, caracterizado pelo conjugado ser
Figure img0018
em que mPEG é um segmento de metoxi (polietileno glicol) que tem um peso molecular de 20 kD.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4282485A3 (en) * 2014-11-06 2024-01-17 PharmaEssentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3643575A (en) * 1967-10-31 1972-02-22 Nippon Kogaku Kk Exposure-measuring device in a single-lens reflex camera
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
EP1191189A1 (de) * 2000-09-26 2002-03-27 Siemens Aktiengesellschaft Gasturbinenschaufel
US7257546B2 (en) * 2001-09-04 2007-08-14 Yahoo! Inc. System and method for correlating user data from a content provider and user data from an advertising provider that is stored on autonomous systems
CN1608079A (zh) * 2001-11-20 2005-04-20 法玛西雅公司 化学修饰的人生长激素缀合物
KR100964411B1 (ko) * 2002-01-18 2010-06-15 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 생물학적 활성 화합물과 컨쥬게이팅되는 잔기를 갖는 폴리알킬렌 글리콜
US7157546B2 (en) 2002-09-09 2007-01-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Water-soluble polymer alkanals
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
GEP20084487B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof
DK2644206T3 (da) * 2003-05-23 2019-06-11 Nektar Therapeutics PEG-derivater indeholdende to PEG-kæder
US7405198B2 (en) * 2003-11-24 2008-07-29 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060024953A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Papa Rao Satyavolu S Dual damascene diffusion barrier/liner process with selective via-to-trench-bottom recess
AP2007003919A0 (en) 2004-08-31 2007-02-28 Pharmacia & Upjohn Co Llc Glycerol branched polyethylene glycol human growthhormone conjugates, process for their prepation a nd methods of use thereof
US7524318B2 (en) * 2004-10-28 2009-04-28 Boston Scientific Scimed, Inc. Ablation probe with flared electrodes
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
EP1869079A2 (en) * 2005-03-11 2007-12-26 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
EP1834963A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-19 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.

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