KR20110059600A - 펩티드-중합체 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중합체 부분, 인터페론-β 부분, 에리스로포이에틴 부분 또는 성장 호르몬 부분의 접합체에 관한 것이다.

Description

펩티드-중합체 접합체{PEPTIDE-POLYMER CONJUGATES}
관련 출원서의 상호 참조
본 출원서는 2008년 7월 31일자로 출원된 미국 가출원 제 61/085,072 호의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
기술분야
발명은 중합체 부분, 인터페론-β 부분, 에리스로포이에틴 부분 또는 성장 호르몬 부분의 접합체에 관한 것이다.
세포 생물학 및 재조합 단백질 기술분야에서의 발전이 단백질 치료학의 발전을 이끌었다.
하지만 여전히 주요 장애요인이 존재한다. 대부분의 단백질은 단백질 가수분해성 분해에 민감하며, 그 결과 순환 시간이 짧다. 기타 단점으로는 낮은 수용성 및 항체 중화 유도를 들 수 있다.
중합체, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 단백질에 부착되는 경우 단백질 분해성 효소의 단백질 골격에 대한 접근을 방해하게 되며, 따라서 단백질 안정성이 향상된다. 또한, 상기 부착은 수용성을 향상시키고 면역원성을 최소화할 수도 있다. 중합체를 단백질에 부착시키는 효과적인 방법이 요구된다.
본 발명의 일 양태는 화학식 I의 중합체-폴리펩티드 접합체에 관한 것이다:
화학식 I
Figure pct00001
상기 식에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐, C2 -10 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 사이클로알킬 또는 C3 -8 헤테로사이클로알킬이고; A1 및 A2는 각각 독립적으로 중합체 부분(예를 들어, 폴리알킬렌 옥사이드 부분)이고; G1, G2 및 G3은 각각 독립적으로 단일 결합 또는 연결 작용기이고; P는 인터페론-β(INF-β) 부분, 에리스로포이에틴(EPO) 부분 또는 성장호르몬(GH) 부분이고; m은 0이거나 1 내지 10의 정수이고; n은 1 내지 10의 정수이다. 이들 접합체에서 INF-β 부분, EPO 부분 또는 GH 부분의 N-말단은 G3에 결합되어 있다.
상기 화학식을 참조하면, 중합체-폴리펩티드 접합체는 하나 이상의 하기 특징을 갖는다: A1 및 A2는 2 내지 100kD(바람직하게는, 10 내지 30kD, 예를 들어 20kD)의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 산화물 부분이며, G1 및 G2 각각은
Figure pct00002
(여기서, 화학식 I에 도시된 바와 같이 O 원자는 A1 및 A2에 결합되고, N 원자는 탄소 원자에 결합됨)이고; G1 및 G2 각각은 우레아, 설폰아미드 또는 아미드(여기서, 화학식 I에 도시된 바와 같이 N 원자는 탄소 원자에 결함됨)이고; m은 4이고; n은 2이며; R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각은 H이다. 이들 몇몇 접합체에서, P는 INF-β의 N-말단에 1 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기를 함유하는 rINF-βSer17 또는 변형된 INF-β 부분이다.
본 발명의 다른 양태는 화학식 II의 중합체-펩티드 접합체에 관한 것이다:
화학식 II
Figure pct00003
상기 식에서, A는 중합체 부분(예를 들어, 폴리알킬렌 산화물 부분)이고; G1 및 G2는 각각 독립적으로 단일 결합 또는 연결 작용기이고; L은 C2 -10 알케닐렌 또는 C2-10 알키닐렌이며; P는 INF-β 부분, EPO 부분 또는 GH 부분이다. 이들 접합체에서, INF-β 부분, EPO 부분 또는 GH 부분의 N-말단은 G2에 부착되어 있다.
화학식 II를 참고하며, 중합체-펩티드 접합체는 하나 이상의 하기 특징을 갖는다: A1 및 A2는 2 내지 100kD(바람직하게는, 10 내지 30kD, 예를 들어 20kD)의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 산화물 부분이고, G1 및 G2 각각은 단일 결합이고, C6은 알케닐렌이며, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각은 H이다. 본 발명의 다른 양태는 화학식 III의 중합체-펩티드 접합체에 관한 것이다:
화학식 III
Figure pct00004
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐, C2 -10 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 사이클로알킬, 또는 C3 -8 헤테로사이클로알킬이고; n은 2 내지 10의 정수이고; A는 중합체 부분이고; G는 연결 작용기이며; P는 펩티드 부분이며, 이때 펩티드 부분의 N-말단에 있는 질소 원자는 상기 화학식에 도시된
Figure pct00005
부분에서 탄소 원자에 결합되어 있다.
화학식 II를 참고하면, 중합체-펩티드 접합체는 하나 이상의 하기 특징을 갖는다: n은 1이고; A는 10 내지 40kD 또는 20 내지 30kD의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 산화물 부분이고; G는
Figure pct00006
이며, 이때 O 원자는 A에 결합되어 있고, N 원자는 탄소 원자에 결합되어 있으며, P는 INF 부분, EPO 부분 또는 GH 부분이다.
본원에서 사용된 "C1 -10 알킬"이란 용어는 1 내지 10 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 일가 라디칼을 지칭한다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, t-부틸 및 n-펜틸을 들 수 있다. 유사하게는, "C2 -10 알케닐"이란 용어는 2 내지 10 탄소 원자 및 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 일가 라디칼을 지칭한다. "C2 -10 알키닐"이란 용어는 2 내지 10 탄소 원자 및 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 일가 라디칼을 지칭한다. "C2 -10 알케닐렌"이란 용어는 2 내지 10 탄소 원자 및 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 이가 라디칼을 지칭한다. "C2 -10 알키닐렌"이란 용어는 2 내지 10 탄소 원자 및 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 이가 라디칼을 지칭한다.
본원에서 사용된 "아릴"이란 용어는 하나 이상의 원자 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템(일환식 또는 이환식)을 지칭한다. 아릴 부분의 예로는 페닐, 나프틸 및 피렌일을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "헤테로아릴"이란 용어는 고리 시스템의 일부로서 O, N 또는 S와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 함유하며, 나머지가 탄소인 하나 이상의 원자 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템(일환식 또는 이환식)을 지칭한다. 헤테로아릴 부분의 예로는 퓨릴, 피롤일, 티엔일, 옥사졸일, 이미다졸일, 티아졸일, 피리딘일, 피리미딘일, 퀴나졸린일 및 일돌일을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "사이클로알킬"이란 용어는 탄소 고리 원자만을 갖는 부분 또는 완전 포화된 일환식 또는 이환식 고리 시스템을 지칭한다. 이의 예로는 사이클로프로판일, 사이클로펜탄일, 및 사이클로헥실을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "헤테로사이클로알킬"이란 용어는 고리 원자로서 탄소 이외에 하나 이상의 헤테로원자(예를 들어, O, N 또는 S)를 갖는 부분 또는 완전 포화된 일환식 또는 이환식 고리 시스템을 지칭한다. 이의 예로는 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 및 1,4-옥사제판을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 언급된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬은 치환 및 비치환된 부분 둘 모두를 포함한다. 치환기의 예로는 C1-C10 알킬,C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C5-C8 사이클로알케닐, C1-C10 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 아미노, C1-C10 알킬아미노, C1-C20 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, C1-C10 알킬설폰아미드, 아릴설폰아미드, 하이드록시, 할로겐, 티오, C1-C10 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 카르복실 및 카르복실산 에스테르를 들 수 있다.
"중합체 부분"이란 용어는 선형, 분지형 또는 별모양 중합체로부터 유래된 일가 라디칼을 지칭한다. 중합체 부분의 분자량은 2 내지 100kD일 수 있다. 중합체 부분의 예로는 폴리에틸렌 산화물, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리이소프로필렌 산화물, 폴리부틸렌 산화물, 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 공중합체를 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 덱스트란, 폴리비닐 알코올류, 폴리아실아미드류 또는 탄수화물계 중합체와 같은 기타 중합체는 또한 항원성 및 독성이 없으며 면역 반응 유도하지 않는 한 사용될 수 있다.
"폴리펩티드 부분"이란 용어는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 변형된 폴리펩티드로부터 유래된 일가 라디칼을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 펩티드는 INF-α2b, INF-β, GH, EPO, 및 과립구 집락형성인자(granulocyte-colony stimulating factor)이거나, 항체일 수 있다. 변형된 펩티드는, 예를 들어 INF, 및 INF-α2b의 N-말단에 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드일 수 있다. 이 같이 변형된 INF의 예로는
Figure pct00007
, 및 INF-α2b 부분을 나타내는 IFN가 있으며, 이의 N-말단에 있는 아미노기는 카르보닐기와 결합된다.
"인터페론-β"란 용어는 바이러스성 복제 및 세포성 분화를 억제하고 면역 반응을 조절하는 고로도 유사한 단백질의 부류를 지칭한다. 문헌[Derynck 등, (1980). Nature 285(5766): 542-7; 및 Taniguchi 등, (1980). Gene 10(1): 11-5]을 참고한다. 이는 자연적으로 발생하는 INF-β 및 이들의 작용성 등가물, 예를 들어 야생형 대응물과 80%이상(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일한 폴리펩티드 둘 모두를 포함한다. INF-β의 예로는 아보넥스(Avonex), 베티세론(Betaseron) 및 레비프(Rebif)와 같은 상업적으로 이용 가능한 약제의 활성 성분을 들 수 있다. 예를 들어, 문헌[Etemadifar M. 등, Acta Neurol . Scand ., 2006, 113(5): 283-7]을 참고한다.
전구체 형태 또는 성숙한 형태인 예시적인 인간 INF-β 단백질의 아미노산 서열이 하기에 나열되어 있다:
Figure pct00008
(유전자은행 기탁 번호: M28622를 참조, 1993년 4월 27일자 버전; 이태리체 부분은 신호 펩티드를 지칭함)
Figure pct00009
(유전자은행 기탁 번호: CAA00839 참조, 1993년 12월 3일자 버전)
일 예로서, INF-β는 변이형 rINF-βSer17(천연의 성숙한 INF-β 서열에서 17번째 위치에서 시스테인 대신에 세린이 존재하는 재조합 INF-β)이다. 이러한 변이체의 아미노산은 하기에 나타나 있다.
Figure pct00010
다른 예로서, INF-β는 천연 INF-β의 N-말단에 1 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기가 부착되어 있는 변형된 천연 INF-β이다.
간 또는 신장에 의해 생성되는 EPO는 적혈구 생성(erythropoiesis), 즉 적혈구 세포 생성을 제어하는 당단백질 호르몬이다. 이는 자연적으로 발생하는 EPO 및 이의 작용성 등가물 둘 모두를 포함한다. 미국 특허 제 5,621,080 호 및 미국 특허 출원 공개공보 제 20050176627 호를 참고한다. 인간 EPO(전구체 및 성숙한 형태)의 아미노산 서열은 하기에 도시되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
본 발명의 접합체를 제조하는데 사용되는 EPO 단백질은 전구체 또는 성숙한 형태의 EPO 단백질일 수 있으며, 이들은 적절한 종, 예를 들어 인간, 귀, 돼지 또는 소를 이용하여 제조될 수 있다. 일 예로서, EPO 단백질은 상기에 도시된 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예로서, EPO는 천연 EPO의 N-말단에 1 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기가 부착되어 있는 변형된 천연 EPO이다.
"성장 호르몬"이란 용어는 전구체 또는 성숙한 형태의 자연적으로 발생하는 인간 성장 호르몬 및, 예를 들어 자연적으로 발생하는 인간 성장 호르몬과 80% 이상(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 가지며 이러한 인간 성장 호르몬과 동일한 생리 활성을 나타내는 이의 작용성 변이체를 지칭한다. 일 예로서, 성장 호르몬은 천연 성장 호르몬의 N-말단에 1 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기가 부착되어 있는 변형된 천연 성장 호르몬이다. 자연적으로 발생하는 인간 성장 호르몬(전구체 및 성숙한 형태)의 아미노산 서열은 하기에 도시되어 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
2개의 아미노산 서열의 "동일성(%)"은 칼린(Karlin) 및 알트슐(Altschul)의 알고리즘(문헌[Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-68, 1990] 및 칼린 및 알트슐에 의한 변형 알고리즘(문헌[Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90:5873-77, 1993])을 이용하여 결정된다. 이 같은 알고리즘은 알트슐 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(2.0 버전)(문헌[J. MoI . Biol . 215:403-10, 1990])에 결합되어 있다. BLAST 단백질 조사는 본 발명에서 사용하기 위한 단백질 분자와 상동성을 갖는 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 문자 길이 = 3)을 이용하여 수행될 수 있다. 2개의 사열 사이에 간격이 존재하는 경우, Gapped BLAST를 문헌[Altschul 등, Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402, 1997]에 개시된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개개의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수(default parameter)를 이용할 수 있다.
"연결 작용기"란 용어는 일단이 중합체 부분과 연결되어 있고 타단이 펩티드 부분과 연결되어 있는 이가 작용기를 지칭한다. 이의 예로는 -O-, -S-, 카르복실산 에스테르, 카르보닐, 카보네이트, 아미드, 카바메이트, 우레아, 설포닐, 설피닐, 아미노, 이미노, 하이드록시아미노, 포스포네이트, 또는 포스페이트 기를 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
상술한 펩티드-중합체 접합체는 적용 가능한 경우에 유리 형태 또는 염의 형태일 수 있다. 염은, 예를 들어 본 발명의 펩티드-중합체 접합체 상에서 음이온과 양으로 하전된 기(예를 들어, 아미노) 사이의 형성될 수 있다. 적합한 음이온으로는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 황산염, 질산염, 인산염, 구연산염, 메탄설포네이트, 트리플루오로아세테이트 및 아세테이트를 들 수 있다. 마찬가지로, 염은 본 발명의 폴리펩티드-중합체 접합체 상에서 양이온과 음으로 하전된 기(예를 들어, 카르복실레이트) 사이에 형성될 수도 있다. 적합한 양이온으로는 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 테트라메틸암모니아 이온과 같은 암모니아 양이온을 들 수 있다.
게다가, 펩티드-중합체 접합체는 하나 이상의 이중 결합 또는 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 이 같은 접합체는 라세미화합물, 라세미 혼합물, 단일 거울상 이성질체, 개별의 부분입체 이성질체, 부분입체 이성질체성 혼합물, 및 시스-, 트란스-, E- 또는 Z-이중 결합 이성질체 형태로서 나타날 수 있다.
본 발명의 중합체-펩티드 접합체의 예는 하기에 나타나 있다:
Figure pct00016
상기 식에서, mPEG는 20kD의 분자량을 갖는 메톡시-캡 폴리에틸렌 글리콜을 나타내며, rINF-βSer17, EPO 및 GH의 N-말단은 상기 구조에 나타나 있는 바와 같이 가장 우측의 탄소에 부착되어 있다.
특정 단백질은 치료학적 용도를 갖는다. 따라서 펩티드 부분을 함유하고 있는 본 발명의 접합체는 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, INF-β는 HCV 또는 HBV 감염을 치료하기 위한 면역 조절용 약물이다. 예를 들어, 문헌[Journal of Vascular and Interventional Radiology 13 (2002): 191-196]을 참고한다. 따라서 C형 감염 바이러스(HCV)의 감염 또는 B형 감염 바이러스(HBV) 감염을 상술한 INF-β-중합체 접합체로 치료하는 방법은 본 발명의 범주 내에 있다. 다른 예로서, EPO는 골수에서 적혈구 세포의 형성을 촉진하기 위해 신장에서 생성되는 호르몬이다. 이는 만성 신장 질환으로부터 야기되는 빈혈, AIDS의 지도부딘(zidovudine) 치료에 부차적으로 나타나는 빈혈 및 암과 연관된 빈혈을 치료하기 위한 면역 조절용 약물로서 사용되어 왔다. 또한 최근 연구에 따르면, EPO가 신경 형성(neurogenesis)을 증가시키고, 발작 후 회복에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[P. T. Tsai, Journal of Neuroscience, 2006, 26: 1269]을 참고한다. 따라서 본 발명의 다른 양태는 빈혈증을 치료하거나, 상술한 EPO-중합체 접합체에 의한 신경 형성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또한 HCV 감염 또는 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 상술한 INF-β- 중합체 접합체를 포함하는 조성물, 및 빈혈증의 치료 또는 신경 형성의 증가에 사용하기 위한 상술한 EPO-중합체 접합체를 포함하는 조성물도 본 발명의 범주에 포함되며, 또한 HCV 감염, HBV 감염 또는 빈혈증을 치료하거나 신경 형성을 증가시키기 위한 약물 제조용 접합체의 치료학적 용도 및 용도도 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 하기 상세한 설명에 개시되어 있다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명하게 될 것이다.
본 발명의 펩티드 -중합체 접합체는 화학 기술분야에 널리 공지된 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 하나 이상의 활성 작용기를 갖는 링커 분자를 링커 분자 상의 활성 작용기에 반응하는 작용기를 갖는 2개의 중합체 분자와 결합시킬 수 있다. 이어, 작용기를 함유하고 있는 펩티드 분자는 링커 분자의 작용기와 반응하여 본 발명의 펩티드-중합체 접합체를 형성한다. 2개의 예시적인 합성 반응식이 본원에서 제공된다.
하기의 반응식 1에는 화학식 I의 펩티드-중합체 접합체를 제조하기 위한 예가 나타나 있다. 아세탈 기를 함유하고 있는 디아민 화합물(1)은 N-하이드록시숙신이미딜 카보네이트 mPEG(예를 들어, 화합물(2))와 반응하여 디-PEG화된 화합물(3)을 형성하며, 이는 후속적으로 알데히드(4)로 전환된다. 이러한 알데히드 화합물은 환원성 알킬화를 통해 유리 아미노기를 갖는 펩티드(H-P)와 반응하여 본 발명의 펩티드-중합체 접합체를 수득한다.
반응식 1
Figure pct00017
하기의 반응식 2에는 화학식 II의 펩티드-중합체 접합체를 제조하기 위한 예가 나타나 있다. 화학약품(6)은 중합체 부분과 알데히드 작용기를 갖는다. 이는 유리 아미노 작용기를 갖는 펩티드(7)와 반응할 수 있다. 이어, 얻어진 생성물(8)은, 예를 들어 수첨 반응에 의해 또는 NaBH3CN에 의해 환원되어, 펩티드-중합체 접합체(9)를 수득한다.
반응식 2
Figure pct00018
하기 반응식 3은 화학식 III의 펩티드-중합체 접합체의 제조를 위한 일 예이다. β-아미노산으로부터 제조될 수 있는 아세탈 기를 갖는 화합물(10)은 N-하이드록시숙신이미딜 카보네이트 mPEG(2)와 반응하여 PEG화 화합물(11)을 형성하며, 이는 후속적으로 알데히드(12)로 전환된다. 이러한 알데히드 화합물은 환원성 알킬화를 통해 유리 아미노기를 갖는 펩티드(H-P)와 반응하여 목적하는 화합물(13)을 제조한다.
반응식 3
Figure pct00019
상술한 화학 반응은 용매, 시약, 촉매, 보호기 및 탈보호기 시약, 및 특정 반응 조건의 이용을 포함한다. 부가적으로, 이들 화학 반응은 궁극적으로 펩티드-중합체 접합체의 합성을 가능케 하기 위하여 본원에서 구체적으로 개시된 단계 이전 또는 이후에 적합한 보호기를 부가하거나 제거하기 위한 단계를 포함한다. 또한 다양한 합성 단계는 교대로 수행되거나, 목적하는 폴리펩티드-중합체 접합체를 산출하기 위한 순서로 수행될 수 있다. 적용 가능한 펩티드-중합체 접합체를 합성하는데 유용한 합성 화학 변환(synthetic chemistry transformation) 및 보호기 방법론(methodology)(보호 및 탈보호)이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene 및 P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley 및 Sons (1991); L. Fieser 및 M. Fieser, Fieser 및 Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley 및 Sons (1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley 및 Sons (1995) 및 이의 후속 개정판]에 개시된 것을 들 수 있다.
이렇게 합성된 펩티드-중합체 접합체는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 한외여과 또는 초원심분리 등과 같은 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명의 펩티드-중합체 접합체는 접합체 형태에서 약학적으로 활성일 수 있다. 대안적으로, 이는 펩티드 부분과 중합체 부분 사이의 연결을 효소학적으로 개열함으로써 생체 내에 (예를 들어, 가수분해를 통해) 약학적으로 활성인 펩티드를 방출할 수 있다. 생체 내에서 연결을 개열하는 것과 관련된 효소의 예로는 산화성 효소(예를 들어, 퍼옥시다제, 아민 산화제 또는 탈수소효소), 환원성 효소(예를 들어, 케토 환원효소), 및 가수분해 효소(예를 들어, 프로테아제, 에스테르 가수분해 효소, 설파타제(sulfatase) 또는 포스파타제(phosphatase))를 들 수 있다.
따라서 본 발명의 일 양태는 질환(예를 들어, HCV 또는 HBV 감염 또는 빈혈증)을 치료하기 위해 하나 이상의 상술한 펩티드-중합체 접합체의 유효량을 투여하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 질병은 하나 이상의 펩티드-중합체 접합체를 유효량으로 개체에 투여함으로써 치료될 수 있다. 이 같은 개체는 임의의 적합한 진단 방법으로 얻어진 결과에 기초하여 건강 전문가에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하기" 또는 "치료"란 용어는, 질환, 질환의 증상, 상기 질환에 의한 부차적인 질병 또는 질환, 또는 상기 질환에 걸리기 쉬운 소인을 치료하거나, 완화시키거나, 해소하거나, 치유하거나, 또는 개선할 목적으로 질환, 질환의 증상, 상기 질환에 의한 부차적인 질병 또는 질환, 또는 상기 질환에 걸리기 쉬운 소인을 갖고 있는 개체(인간 또는 동물)에 펩티드-중합체 접합체를 포함하는 조성물을 적용 또는 투여하는 것으로 정의된다. "유효량"은 치료받은 개체에 치료 효과를 부여하는 펩티드-중합체 접합체의 양을 지칭한다. 치료 효과는 객관적(예를 들어, 몇몇 시험에 의해 또는 표지(marker)를 이용하여 측정됨)이거나 주관적(예를 들어, 개체가 효능의 징후를 나타내거나 효능이 있는 것으로 느낌)일 수 있다.
본 발명의 방법을 실행하기 위해, 상술한 하나 이상의 접합체를 갖는 조성물은 비경구, 경구, 비강, 직장, 국부 또는 구강 경로로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "비경구 투여"란 용어는 임의의 적합한 주입 기술뿐만 아니라 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 관부내, 병변내, 복막내, 기관내 또는 두개내 주사를 지칭한다.
멸균 주사용 조성물은 비독성이며 비경구용으로 허용 가능한 희석제 또는 용매 중의 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 만니톨, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한 고정유(fixed oil)가 용매 또는 현탁용 매질(예를 들어, 합성 모노- 또는 디-글리세리드류)로서 통상적으로 이용된다. 올레산 및 이의 글리세리드 유도체와 같은 지방산은, 올리브유 또는 캐스터 오일과 같은 천연의 약학적으로 허요 가능한 오일, 특히 이들의 폴리옥시에틸화 유도체에서와 같이 주사제의 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 오일 현탁액은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 또는 카르복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 포함할 수도 있다. 트윈 또는 스판(Span)과 같이 일반적으로 사용되는 기타 계면활성제, 또는 약학적으로 허용 가능한 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 기타 유사한 유화제 또는 생체 이용성 증강제가 제형화를 목적으로 사용될 수도 있다.
경구 투여용 조성물은 캡슐, 정제, 유제 및 수용성 현탁액, 분산액 및 용액을 비롯한 임의의 경구용으로 허용 가능한 투여 형태일 수 있다. 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체로는 락토스 및 옥수수 전분을 들 수 있다. 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제도 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태로서 경구 투여용으로 유용한 희석제로는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 들 수 있다. 수용성 현탁액 또는 유제가 경구 투여되는 경우, 활성 성분은 유화제 또는 현탁제와 결합된 오일상(oily phase)에서 현탁되거나 용해될 수 있다. 필요한 경우, 특정 감미제, 향미제, 또는 착색제가 첨가될 수 있다.
비강용 에어로졸 또는 흡입 조성물은 약학 제형화 분야에서 널리 공지된 기법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 이 같은 조성물은, 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생체 이용성을 향상시키기 위한 흡착 증진제, 플루오르화 탄소, 및/또는 당업계에 공지된 기타 안정화제 또는 분산제를 이용하여 염수 중의 용액으로서 제조될 수 있다. 상술한 화합물을 하나 이상 갖는 조성물은 직장 투여용인 좌약의 형태로 투여될 수도 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 상술한 바와 같은 하나 이상의 활성 접합체와 함께 통상적으로 사용된다. 약학 조성물 중의 담체는 상기 조성물의 활성 성분과 상용성이고(바람직하게는 활성 성분을 안정화시킬 수 있고) 치료될 개체에 대해 유해하지 않다는 측면에서 허용 가능해야 한다. 하나 이상의 가용화제가 상술한 화합물의 전달을 위해 약학적 부형제로서 이용될 수 있다. 기타 담체의 예로는 콜로이드성 실리콘 산화물, 스테아르산 마그네슘, 셀룰로스, 소듐 라우릴 설페이트 및 D&C Yellow # 10을 들 수 있다.
하기 실시예는 임의의 방식으로 본 발명의 개시 내용의 나머지 부분을 제한하기 위함이 아니라 단지 예시적인 것으로 이해되어야 한다. 추가적인 기교없이 당해 기술분야의 숙련자는 본원의 상세한 설명을 기초로 하여 본 발명의 최대로 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 본원에서 인용된 모든 공개물은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
실시예 1: IFN -β-디- PEG 중합체 접합체
디- PEG 알데히드의 제조
Figure pct00020
20kD의 PEGO(C=O)OSu를 문헌[Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569]에 개시된 방법에 따라 선바이오사(미국 캘리포니아 소재의 SunBio Inc.)로부터 구매한 20kD의 mPEGOH로부터 제조하였다.
디클로로메탄 중의 6-(1,3-디옥솔란-2-일)헥산-1,5-디아민의 용액(9.03㎎의 디아민을 함유하는 11.97g의 용액: 47.8μmol)을 20kD의 PEGO(C=O)OSu(1.72g, 86.0μmol)을 함유하고 있는 플라스크에 첨가하였다. PEGO(C=O)OSu가 완전히 용해된 이후에 N,N-디이소프로필에틸아민(79㎕, 478μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 이어 메틸 t-부틸에테르(200㎖)를 교반하면서 적가하였다. 얻어진 침전물을 수집하고, 진공하에서 건조하여 백색 고체로서 디-PEG 아세탈(1.69g, 98%)을 수득하였다.
Figure pct00021
Figure pct00022
디-PEG 아세탈(4.0g, 0.2mmol)을 pH 2.0의 완충액(시트르산, 40㎖)에 현탁하였다. 반응 혼합물을 35℃에서 24시간 동안 교반하고, 이어 디클로로메탄(3 x 50㎖)으로 추출하였다. 수집된 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축한 후, 디클로로메탄(20㎖)에 다시 현탁하였다. 용액을 메틸 t-부틸 에테르(400㎖)에 교반하면서 적가하였다. 얻어진 침전물을 수집하고, 감압 하에서 건조하여 백색 고체로서 디-PEG 알데히드(3.8g, 95%)를 수득하였다.
Figure pct00023
대안적으로는, 디-PEG 알데히드를 하기 방식으로 제조하였다: 상업적으로 이용 가능한 호모 리신(중국 소재의 Astatech Pharmaceutical Co., Ltd)의 2개의 아미노기를 벤질옥시카르보닐로 보호하였다. N-보호된 호모 리신을 에스테르화하고, 환원하여 알데히드 화합물을 형성하였다. 이어, 알데히드 기는 에틸렌 글리콜로 보호되었다. 이어, 벤질옥시카르보닐 보호기는 팔라듐 촉매의 존재하에 수첨 반응에 의해 제거되었다. N-탈보호된 화합물을 온화한 염기성 조건에서 활성화된 mPEGOH(대한민국 소재의 Sunbio Chemicals Co., Ltd.)와 반응시켰다. 얻어진 생성물을 pH 2.0의 시트르산 완충액(독일 소재의 Sigma-Aldrich)에서 25℃에서 72시간 동안 교반하여 알데히드 보호기를 제거하였다. 109g의 디-PEG 중합체 알데히드를 수득하였다(수율: 95%). 순도는 97.7%이상(HPLC로 결정됨), 및 95% 이상(1NMR 분석에 의해 결정됨)이었다.
인간 rhIFN -β Ser 17 의 제조
인간 rhIFN-βSer17을 암호화하는 DNA 단편을 발현 벡터 pET24a에 클로닝(cloning)하여 발현 플라스미드인 rhIFN-βSer17-pET24a를 제조하였다. 이러한 발현 플라스미드를 대장균(E. coli)에 형질전환시키고, 양성 형질전환체, 예를 들어 발현 플라스미드를 함유하고 있는 클론을 선별하고, 배양하였으며, 얻어진 대장균 배양액을 -80℃에서 저장하였다.
10㎕의 상기 저장된 대장균 배양액을 37℃에서 약 15시간 동안 200rpm으로 Terrific Broth 및 글리세롤로 이루어진 200㎖의 시드 배지(seeding medium)에 접종하였다. 이렇게 수득된 150㎖의 대장균 배양액을 2.5ℓ의 배양 배지에 옮겼으며, 이때 배양 배지는 글루코스(10g/ℓ), MgSO4ㆍ7H2O(0.7g/ℓ), (NH4)2HPO4(4g/ℓ), KH2PO4(3g/ℓ), K2HPO4(6g/ℓ), 구연산염(1.7g/ℓ), 효무 추출물(10g/ℓ), 카나마아신(50㎎/㎖), 클로람페니콜(50㎎/㎖), 발포방지제, 및 미량 원자(FeSO4ㆍ7H2O(10㎎/ℓ), ZnSO4ㆍ7H2O(2.25㎎/ℓ) CuSO4ㆍ5H2O(1㎎/ℓ), MnSO4ㆍH2O(0.5㎎/ℓ), H3BO3(0.3㎎/ℓ), CaCl2ㆍ2H2O(2㎎/ℓ), (NH4)6Mo7O24(0.1㎎/ℓ), EDTA(0.84㎎/ℓ), 및 Cl(50㎎/ℓ)를 포함함)를 포함한다. 이어, 대장균 배양액을 37℃에서 배양하였다. 대장균 배양액의 OD600이 120 내지 140에 도달하면, IPTG(1M)을 배양액에 첨가하여 rhIFN-βSer17의 발현을 유도하였다. 유도된 배양액을 37℃에서 300rpm으로 3시간 동안 배양하였다. 필요한 경우에 800g/ℓ의 글루코스 및 20g/ℓ의 MgSO4를 함유하는 공급 배지를 배양 도중에 대장균 배양액에 첨가하였다.
이렇게 수득된 대장균 배양액을 원심분리하여 대장균 세포를 수확하였다. 세포를 PBS 완충액(0.1M의 Na2HPO4, 0.15M의 NaCl)에서 다시 현탁하고, APV 균질화 기기(APV Homogenizer)로 분쇄하였다. 이렇게 수득된 균질화 용액을 4℃에서 10,000rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 침전물(봉입체를 포함함)을 수집하고, PBS에서 다시 현탁한 후, 20 내지 30분 동안 실온에서 교반하여 현탁액을 제조하였다. NaOH(6N)을 현탁액에 첨가하여 봉입체에 포함된 단백질이 용해되도록 pH를 12로 조정하였다. 약 2분 후, 현탁액의 pH 값을 6N HCl을 이용하여 7.5로 조절하였다. 이어, 현탁액을 원심분리하고, 이렇게 형성된 상층액을 수집하였으며, 이의 단백질 농도는 분광 광도계를 이용하여 결정하였다. 상층액을 리폴딩 완충액(refolding buffer: TEA, pH 8.3)과 혼합하여, 실온에서 24시간 내지 48시간 동안 교반없이 배양하였다. 이어, 밀리포어사(Millipore, Inc.)에서 제공되는 TFF 시스템 및 PLCCC 카세트(cassette)를 이용하여 이를 농축하고, 투석하였다. 얻어진 용액은 SPFF 세파로스 칼럼을 이용하여 한외여과, 투석 및 분획화하였다. 이렇게 수득된 분획(A9 및 A10)은 재조합 단백질 rhIFN-βSer17을 포함하는데, 이를 다른 SPFF 세파로스 칼럼으로 추가로 분획화하여 재조합 단백질(분획 A8 내지 A10)을 농축하였다. 이들 rhIFN-βSer17-함유 분획을 겔 여과(Superdex 75HR 10/300)에 의해 추가로 정제하여 90% 초과의 순도를 갖는 rhIFN-βSer17 단백질(1㎎/㎖)을 수득하였다. 재조합 단백질의 생물 활성은 2 x 107IU/㎎ 이상의 단백질이었다.
IFN -β-디- PEG 중합체 접합체의 제조
18.9㎎의 rhINF-βSer17 및 1.51g의 디-PEG 알데히드를 26㎖의 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 5.0)에 현탁하였다. 이러한 용액에 400 등가량의 NaCNBH3(벨기에 소재의 Acros Organics)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 25mM 트리스-HCl(pH 7.8)로 투석하였다. 조질 생성물을 이온 교환 칼럼으로 정제하여 2㎎의 IFN-β-디-PEG 중합체를 수득하였다.
인간 IFN -β의 제조
대장균 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IFN-β의 암호화 서열을 갖는 형질전환된 대장균 BLR(DE3)-RIL 세포를 50㎕/㎖의 카나마이신 및 50㎕/㎖의 클로람페니콜이 보충된 250㎖의 SYN 배지(10g/ℓ의 선별 소이톤(select soytone), 5g/ℓ의 효모 추출액 및 10g/ℓ의 NaCl)에 접종하였다. 이어, 세포를 37℃의 교반 배양기에서 220rpm으로 하룻밤(예를 들어, 16시간) 동안 배양하였다.
상기와 같이 하룻밤 동안 배양된 250㎖의 배양액을 10g/ℓ의 염기성 글루코스, 0.7g/ℓ의 공급용 MgSO4, 30㎖의 공급용 미량 원소(10g/ℓ의 FeSO4ㆍ7H2O, 2.25g/ℓ의 ZnSO4ㆍ7H2O, 1g/ℓ의 CuSO4ㆍ5H2O, 0.5g/ℓ의 MnSO4ㆍH2O, 0.3g/ℓ의 H3BO3, 2g/ℓ의 CaCl2ㆍ2H2O, 0.1g/ℓ의 (NH4)6Mo7O24, 0.84g/ℓ의 EDTA, 50㎖/ℓ의 HCl), 25㎕/㎖의 카나마이신 및 25㎕/㎖의 클로람페니콜이 보충된 3.0ℓ의 염기성 배지(10g/ℓ의 글루코스, 0.7g/ℓ의 MgSO4ㆍ7H2O, 4g/ℓ의 (NH4)2HPO4, 3g/ℓ의 KH2PO4, 6g/ℓ의 K2HPO4, 2g/ℓ의 구연산염, 10g/ℓ의 효모 추출액 및 2g/ℓ의 이소류신)에 접종하고, 5ℓ 발효기(Bioflo 3000; 뉴저지주 에디슨 소재의 Brunswick Scientation Co.)에서 배양하였다. 발효 도중에 배지의 pH는 37% NH4OH의 자동 첨가를 통해 pH 7.1로 제어되었다. 용존 산소(DO)량을 30%로 유지하였다. 공급용 용액(800g/ℓ의 글루코스, 20g/ℓ의MgSO4, 50㎕/㎖의 카나마이신 및 50㎕/㎖의 클로람페니콜)을 프로그램 제어 펌프를 이용하여 첨가하였으며, 이는 DO량이 40 내지 60을 초과하는 경우에 공급하도록 설정되었다. 발효 배양액 중의 세포 밀도(OD600)가 180 내지 200에 도달한 경우, 30㎖의 공급용 미량 원소 및 25g의 효모 추출액과 함께 4㎖의 1M 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 발효 배양액에 첨가하여 IFN-β 발현을 유도하였다. IPTG 유도 5시간 이후에 원심분리를 이용하여 세포를 수확하였다.
세포 펠릿을 PBS 완충액(0.1M 인산나트륨, 0.15M 염화나트륨, pH 7.4)에서 1:3의 적정 비율(습윤 중량 단위: g/㎖)로 현탁하고, 마이크로플루이다이저(microfluidizer)로 분쇄한 후, 4℃에서 10,000rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 봉입체(IB)를 포함하는 펠릿을 PBS 완충액으로 2회 세척하고, 상술한 바와 같이 원심분리하였으며, 1ℓ의 PBS 용액(0.1M 인산나트륨, 0.15M 염화나트륨, pH 7.4, 3% zwittergent 3-14, 5 mM DTT)에 현탁하였다. 30분 동안 교반한 이후에 펠릿을 가용화하기 위해 교반하면서 6.0M NaOH를 이용하여 현탁액의 pH를 12로 조절하였다. 이어, 6N HCl을 이용하여 현탁액의 pH를 pH 7.5로 조절하였다. 10,000rpm으로 20분 동안 원심분리시, 가용성 IFN-β를 함유하는 상층액을 수집하였다.
이어, 가용성 INF-β를 하기와 같이 리폴딩하였다. 상술한 상층액을 새로 제조된 10ℓ의 리폴딩 완충액(100mM 트리스-HCl (pH 7.6), 0.5M L-아르기닌, 2mM EDTA)에서 희석하여 리폴딩 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 교반없이 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 리폴딩된 재조합 IFN-β를 함유하는 혼합물을 20mM 트리스(100mM NaCl, 0.05% zwittergent 3-14 함유, pH 7.0) 완충액으로 투석하였다.
20mM 트리스-HCl 및 10OmM NaCl의 완충액(pH 7.0)으로 예비 평형화되고 세척된 SP-세파로스 칼럼(GE Amersham Pharmacia)에 투석 혼합물을 적재하였다. IFN-β를 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.0) 및 200mM NaCl를 포함하는 용액으로 용출하였다. IFN-β를 함유하고 있는 분획은 280㎚에서 이들의 흡광도에 기초하여 수집되었다. 여기에 포함된 IFN-β를 1.0M 황산암모니아, 20mM 아세트산나트륨 및 0.05% zwittergent(pH 4.5)를 포함하는 용액으로 평형화되고 세척된 소수성 상호작용 칼럼(GE healthcare, Butyl Sepharose Fast Flow)을 이용하여 추가로 정제하였다. 0.5M 황산암모니아 및 20mM 아세트산나트륨을 함유하는 용액을 이용하여 IFN-β를 용출하였다. 단백질을 함유하고 있는 분획을 280㎚에서 이들의 흡광도에 기초하여 수집하였다. 이들 분획을 모은 후, IFN-β의 농도를 BCA 단백질 분석법(BCA(TM) Protein assay, Pierce)으로 결정하였다.
PEG - IFN -β 접합체의 제조
수(1.46㎖)중 디-PEG 알데히드(296㎎, 7.4μmol)의 용액에 2M 인산나트륨 완충액(pH 4.0, 0.37㎖), zwittgen 3-14(1.48㎖, 수중 10%) 및 INF-β(20mM 아세트산나트륨, 0.7% 황산암모니아 및 0.05% 세정제를 함유하는 3.7㎖의 pH 4.5 완충액 중 14.8㎎)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, 시아노보로하이드라이드 수용액(400mM, 92.5㎕, 37μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 암 상태에서 40시간 동안 교반하고, SP HP 세파로스 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 PEG-IFN-β 접합체를 함유하고 있는 분획을 280㎚에서 이들의 보유 시간 및 흡광도에 기초하여 수집하였다. 접합체의 농도를 BCA 단백질 분석법(BCA(TM) Protein assay, Pierce)으로 결정하였다.
래트에서의 약물 동력학 연구
래트 모델에서 약물 동력학 연구를 수행하여 IFN-β와 PEG-IFN-β의 혈청 반감기를 비교하였다. 수컷 래트(250 내지 350gm)에 IFN-β(n=3) 및 PEG-IFN-β(n=3)를 600㎍/㎏의 양으로 정맥내 투여하였다. 투여 전 및 투여 0.1, 1, 2, 4, 6, 10, 24, 48, 72 및 96시간 후에 각각의 래트로부터 혈액(250㎕)을 수집하였다. 혈액으로부터 혈청 시료를 준비하고, 시료에 포함된 IFN-β의 양을 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunoassay, ELISA)으로 분석하였다. IFN-β 및 PEG-IFN-β의 혈청 반감기는 각각 2시간과 20시간이었으며, 이는 마지막 3번의 시점에서의 혈청 농도로부터 계산되었다.
실시예 2: EPO - PEG 중합체 접합체
PEG - EPO 의 제조
수(2.67㎖)중 디-PEG 알데히드(267㎎, 6.1μmol)의 용액에 2M 인산나트륨 완충액(pH 4.0, 1㎖) 및 EPO(20mM 인산나트륨 및 150mM NaCl을 함유하는 3.03㎖의 pH 7.3 완충액 중의 10㎎)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, 소듐 시아노보로하이드라이드 수용액(400mM, 100㎕, 40μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 암 상태에서 17시간 동안 교반하고, SP Toyopearl 칼럼(Tosoh)으로 정제하였다. 칼럼은 20mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)으로 평형화되었다. 반응 혼합물을 0.3 내지 0.4㎎/㎖의 농도가 될 때까지 희석하여, SP Toyopearl 칼럼 상에 적재하였다. 목적하는 PEG-EPO 접합체를 함유하고 있는 분획을 280㎚에서 이들의 보유 시간 및 흡광도에 기초하여 수집하였다. 접합체의 농도를 280㎚ UV 흡광법으로 결정하였다.
래트에서의 약물 동력학 연구
래트 모델에서 약물 동력학 연구를 수행하여 EPO와 PEG-EPO의 혈청 반감기를 비교하였다. 수컷 래트(250 내지 350gm)에 EPO(n=5) 및 PEG-EPO(n=5)를 25㎍/㎏의 양으로 정맥내 투여하였다. 투여 전 및 투여 0.088, 0.75, 1.5, 3, 6, 10, 24 및 48시간 후에 각각의 래트로부터 혈액(250㎕)을 수집하였다. PEG-EPO 처리 래트에 대해서는 및 투여 72 및 96시간 후에 혈액 시료를 추가로 수집하였다. 혈액으로부터 혈청 시료를 준비하고, 효소 면역 분석법(ELISA)으로 분석하여 시료에 포함된 EPO 양을 결정하였다. 결과에 따르면, EPO의 혈청 반감기는 9시간이지만, PEG-EPO의 혈청 반감기는 상당히 증가하여, 38시간이었다.
EPO - PEG 중합체 접합체의 제조
0.2㎎의 EPO(대만 소재의 Cashmere Scientific Company) 및 4㎎의 디-PEG 알데히드(20 등가량)를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 5.0)에 현탁하였다. 이 용액에 400 등가량의 NaCNBH3을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. HPLC를 통해 EPO-디-PEG 중합체의 형성을 확인하였다.
실시예 3: GH - PEG 중합체 접합체
Met - hGH 의 제조
Met-hGH의 발현을 위해 Met-hGH를 발현할 수 있는 형질전환된 대장균 BLR (DE3)-RIL 세포를 상술한 발효 과정에 따라 배양하였다.
원심분리를 통해 세포를 수확하고, 세포 펠릿을 TE 완충액(50mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에서 1:3의 적정 비율(습윤 중량 단위: g/㎖)로 현탁하였다. 이어, 세포를 마이크로플루이다이저로 분쇄한 후, 10,000rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 봉입체(IB)를 포함하는 펠릿을 TED 완충액(50mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 2% 데옥시콜레이트(deoxycholate), pH 8.0)으로 2회 세척하고, 상술한 바와 같이 원심분리하였으며, MiIIiQ 물에서 현탁하고, 20,000rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. IB를 400㎖의 50mM TUD 용액(50mM 트리스-HCl, 4M 우레아, 2.5mM DTT, pH 10.0)에 현탁하고, 현탁액을 20,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 수집하였다.
상층액을 새로 제조된 2.0ℓ의 리폴딩 완충액(50mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, 5% 글리세롤, 10mM GSH/1mM GSSG, pH 8.0)에서 희석하였다. 이렇게 형성된 혼합물을 교반없이 36시간 동안 배양한 후, 20mM 트리스 완충액(pH 7.0)에 대해 투석하였다.
20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.0)으로 예비 평형화되고 세척된 Q-세파로스 칼럼(펜실바니아주 피츠버그 소재의 GE Amersham Pharmacia)에 Met-hGH를 함유하는 투석 혼합물을 적재하였다. 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 용액을 이용하여 Met-hGH를 용출하였다. 280㎚에서 흡광도에 의해 결정된 Met-hGH 함유 분획을 수집하고, 모은 후, 20mM 아세트산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 예비 평형화되고 세척된 소수성 상호작용 칼럼(펜실바니아주 피츠버그 소재의 GE Amersham Pharmacia)에 분당 5㎖의 유속으로 적재하였다. 20mM 아세트산나트륨 완충액 및 150mM 황산암모니아를 함유하는 용액을 이용하여 Met-hGH를 용출하였다. Met-hGH를 함유하고 있는 분획을 수집하고, BCA 단백질 분석법(BCA(TM) Protein assay, Pierce)에 적용하여 Met-hGH 농도를 결정하였다.
PEG - Met - hGH 접합체의 제조
수(387㎕)중 디-PEG 알데히드(74㎎, 1.7μmol)의 용액에 2M 인산나트륨 완충액(pH 4.0, 374㎕) 및 인간 GH(20mM 아세트산나트륨 및 150mM NaCl을 함유하는 6.5㎖의 pH 4.5 완충액 중의 22.4㎎)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, 소듐 시아노보로하이드라이드 수용액(400mM, 140㎕, 56μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 암 상태에서 17시간 동안 교반하고, SP XL 세파로스 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 중합체-단백질 접합체를 함유하고 있는 분획을 280㎚에서 이들의 보유 시간 및 흡광도에 기초하여 수집하였다. 접합체의 농도를 브래드포드법(일리노이주 록퍼드 소재의 Pierce)으로 결정하였다.
래트에서의 약물 동력학 연구
래트 모델에서 약물 동력학 연구를 수행하여 Met-hGH와 PEG-Met-hGH의 혈청 반감기를 비교하였다. 수컷 래트(250 내지 350gm)에 Met-hGH(n=5) 또는 PEG-Met-hGH(n=5)를 100㎍/㎏의 양으로 정맥내 투여하였다. 투여 전 및 투여 0.083, 1, 2, 4, 8, 12 및 24시간 후에 Met-hGH-처리 래트로부터 혈액 시료를 수집하였으며, 투여 전 및 투여 0.33, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 및 96시간 후에 PEG-Met-hGH-처리 래트로부터 혈액 시료를 수집하였다. 혈액으로부터 혈청 시료를 준비하고, 효소 면역 분석법(ELISA)으로 분석하여 hGH의 농도를 결정하였다. Met-hGH 및 PEG-Met-hGH의 혈청 반감기는 각각 3시간과 35시간이었다.
기타 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일한 목적, 등가의 목적 또는 유사한 목적을 충족시키기는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서 달리 언급하지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 단지 일련의 통상적인 등가 및 유사 특징의 예이다.
상술한 설명을 통해 당해 기술분야의 숙련자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 이의 진의 및 범주에서 벗어나지 않는 한, 다양한 용도 및 조건에 부합하도록 본 발명을 다양하게 변경 및 변형할 수 있다. 따라서 기타 실시형태도 또한 하기 특허청구범위의 범주에 포함된다.

Claims (26)

  1. 하기 화학식 I의 펩티드-중합체 접합체:
    화학식 I
    Figure pct00024

    상기 식에서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐, C2 -10 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 사이클로알킬 또는 C3 -8 헤테로사이클로알킬이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 중합체 부분이고;
    G1, G2 및 G3은 각각 독립적으로 단일 결합 또는 연결 작용기이고;
    P는 인터페론-β 부분, 에리스로포이에틴 부분 및 성장호르몬 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이때 P의 N-말단은 G3에 결합되고;
    m은 0이거나 1 내지 10의 정수이고;
    n은 1 내지 10의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, P는 인터페론-β 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  3. 제 2 항에 있어서, P는 rINF-βSer17인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  4. 제 2 항에 있어서, P는 N-말단에 1 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기를 포함하는 변형된 인터페론-β 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  5. 제 1 항에 있어서, P는 에리스로포이에틴 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  6. 제 1 항에 있어서, A1 및 A2 각각은 2 내지 100kD의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  7. 제 6 항에 있어서, A1 및 A2 각각은 10 내지 30kD의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  8. 제 7 항에 있어서, G1 및 G2 각각은
    Figure pct00025
    이며,
    여기서 O는 A1 또는 A2에 결합되고, N 원자는 탄소 원자에 결합되고; 및 G3은 단일 결합인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  9. 제 8 항에 있어서, m은 4이고, n은 2이고, R1, R2, R3, R4 및 R5 각각은 H인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  10. 제 9 항에 있어서, P는 인터페론-β 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  11. 제 10 항에 있어서, P는 rINF-βSer17인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  12. 제 10 항에 있어서, P는 N-말단에 1 내지 4개의 부가적인 아미노산 잔기를 갖는 변형된 인터페론-β 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  13. 제 9 항에 있어서, P는 에리스로포이에틴 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  14. 제 9 항에 있어서, P는 성장 호르몬 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  15. 제 1 항에 있어서, P는 성장 호르몬 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 접합체는,
    Figure pct00026
    이며,
    상기 식에서, mPEG는 2OkD의 분자량을 갖는 메톡시-캡 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 접합체는,
    Figure pct00027
    이며,
    상기 식에서, mPEG는 2OkD의 분자량을 갖는 메톡시-캡 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 접합체는,
    Figure pct00028
    이며,
    상기 식에서, mPEG는 2OkD의 분자량을 갖는 메톡시-캡 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  19. 하기 화학식 III의 펩티드-중합체 접합체:
    화학식 III
    Figure pct00029

    상기 식에서,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐, C2 -10 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 사이클로알킬, 또는 C3 -8 헤테로사이클로알킬이고;
    n은 2 내지 10의 정수이고;
    A는 중합체 부분이고;
    G는 연결 작용기이며;
    P는 펩티드 부분이며, 이때 펩티드 부분의 N-말단에 있는 질소 원자는 상기 화학식에 도시된
    Figure pct00030
    부분에서 탄소 원자에 결합되어 있다.
  20. 제 19 항에 있어서, G는
    Figure pct00031
    이며,
    여기서 O 원자는 A에 결합되고, N 원자는 탄소 원자에 결합되는 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  21. 제 20 항에 있어서, A는 10 내지 40kD의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  22. 제 21 항에 있어서, A는 20 내지 30kD의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  23. 제 22 항에 있어서, P는 인터페론 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  24. 제 22 항에 있어서, P는 에리스로포이에틴 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  25. 제 22 항에 있어서, P는 성장 호르몬 부분인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
  26. 제 19 항에 있어서, n은 1인 것을 특징으로 하는 펩티드-중합체 접합체.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11559567B2 (en) * 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3643575A (en) * 1967-10-31 1972-02-22 Nippon Kogaku Kk Exposure-measuring device in a single-lens reflex camera
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
EP1191189A1 (de) * 2000-09-26 2002-03-27 Siemens Aktiengesellschaft Gasturbinenschaufel
US7257546B2 (en) * 2001-09-04 2007-08-14 Yahoo! Inc. System and method for correlating user data from a content provider and user data from an advertising provider that is stored on autonomous systems
BR0214451A (pt) * 2001-11-20 2006-05-30 Pharmacia Corp conjugados do hormÈnio do crescimento humano quimicamente modificado
AU2003210564B2 (en) * 2002-01-18 2008-10-23 Biogen Ma Inc. Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
MXPA05002620A (es) 2002-09-09 2005-05-05 Nektar Therapeutics Al Corp Alcanales polimericos solubles en agua.
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
MXPA05006945A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor.
NZ541374A (en) * 2003-05-23 2008-09-26 Nektar Therapeutics Al Corp PEG derivatives having an amidocarbonate linkage
MXPA06005732A (es) * 2003-11-24 2006-08-17 Neose Technologies Inc Eritropoyetina glucopegilada.
US20060024953A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Papa Rao Satyavolu S Dual damascene diffusion barrier/liner process with selective via-to-trench-bottom recess
JP2008511610A (ja) 2004-08-31 2008-04-17 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー グリセロール分岐のポリエチレングリコール−ヒト成長ホルモン結合体、それらの製造方法及び使用方法
US7524318B2 (en) * 2004-10-28 2009-04-28 Boston Scientific Scimed, Inc. Ablation probe with flared electrodes
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
EP1869079A2 (en) * 2005-03-11 2007-12-26 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
EP1834963A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-19 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.

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