DE68929551T2 - Menschliche DNase - Google Patents

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    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Description

  • DNase ist eine Phosphodiesterease, die zur Hydrolyse von Polydesoxyribonukleinsäure fähig ist. Sie bewirkt einen extensiven und nicht-spezifischen Abbau von DNA und unterscheidet sich in dieser Hinsicht von den relativ limitierten und sequenzspezifischen Restriktions-Endonukleasen. Die vorliegende Erfindung betrifft hauptsächlich DNase I und II. DNase I weist ein pH-Optimum in der Nähe des Neutralpunkts auf, ein absolutes Erfordernis für zweiwertige Kationen, und liefert bei der Hydrolyse von DNA 5'-Phosphat-Nukleotide. DNase II weist ein saures pH-Optimum auf, kann durch zweiwertige Kationen aktiviert werden und produziert bei der Hydrolyse von DNA 3'-Phosphat-Nukleotide. Es sind auch mehrere molekulare Formen von DNase I und II bekannt.
  • DNase aus verschiedenen Spezies wurde in variierendem Ausmaß gereinigt. Rinder-DNase A, B, C und D wurde bereits 1973 gereinigt und vollständig sequenziert (Liao et al., J. Biol. Chem. 248, 1489 [1973]; Salnikow et al., J. Biol. Chem. 248, 1499 [1973]; Lao et al., J. Biol. Chem. 249, 2354 [1973]). Schweine- und Schafs-DNase wurden gereinigt und vollständig sequenziert (Paudel et al., J. Biol. Chem. 261, 16006 [1986] und Paudel et al., J. Biol. Chem. 261, 16012 [1986]). Es wurde berichtet, daß menschliche Harn-DNase zu einem elektrophoretisch homogenen Zustand gereinigt wurde und die N-terminale Aminosäure Leucin ist; es wurde über keine andere Sequenz berichtet (Ito et al., J. Biochem. 95, 1399 [1984]; siehe auch Funakoshi et al., J. Biochem. 82, 1771 [1977]; Murai et al., Biochim. et Biophys. Acta 517, 186 [1978] und Wroblewski et al., P.S.E.B.M. 74, 443 [1950]).
  • Obwohl diese vollständige Sequenz-Information für eine Säugetier-DNase zum ersten Mal 1973 zur Verfügung stand, wurde erst kürzlich ein Bericht über einen Versuch veröffentlicht, diese Klasse von Enzymen zu klonen und exprimieren. Shields et al. beschreiben die Expressionsklonierung eines Teils des Gens für Rinder-DNase I und die Expression eines Fusionsprodukts, das biologisch und immunologisch aktiv war, in E. coli (Biochem. Soc. Trans. 16, 195 [1988]). Das DNase-Produkt von Shields et al. war jedoch für Wirtszellen toxisch und konnte nur durch Verwendung eines induzierbaren Promotors erhalten werden. Außerdem stieß man bei Versuchen auf große Schwierigkeiten, Plasmid-DNA aus beiden Klonen zu isolieren, ein Hinder nis, das auf die konstitutiven Expressionswerte von DNase aus den Klonen zurückzuführen ist, sodaß diese Autoren nicht in der Lage waren, die Sequenz der für DNase kodierenden Nukleinsäure zu bestimmen. Gemäß Shields et al. war die Unfähigkeit, das Plasmid zu gewinnen, die Folge konstitutiver Expression von DNase, selbst wenn der Promotor bei niedriger Temperatur unterdrückt wurde. Dies würde ein großes Hindernis schaffen, da Shields et al. nur den Klon durch Expressionsklonieren identifiziert hatten, was notwendigerweiser erfordert, daß die DNase unter die Kontrolle irgendeines Promotors gestellt wird.
  • Es gibt zahlreiche Verwendungszwecke für DNase, u.a. für therapeutische Zwecke. Ihr wichtigster therapeutischer Verwendungszweck ist die Verringerung der Viskosität von Pulmonarsekretionen bei Krankheiten wie Lungenentzündung, wodurch die Befreiung der Atemwege unterstützt wird. Die Verstopfung von Atemwegen durch Sekretionen kann zu Atembeschwerden und in manchen Fällen zu Atemversagen und Tod führen. Rinder-Pankreas-DNase wurde unter dem Markennamen Dornavac (Merck) vertrieben, dieses Produkt wurde jedoch vom Markt zurückgezogen. Berichte weisen darauf hin, daß dieses Produkt eine gewisse klinische Wirksamkeit hatte. Obwohl einige Kliniker keine signifikanten Nebenwirkungen beobachteten (Lieberman, JAMA 205, 312 [1968]), stellten andere jedoch schwerwiegende Komplikationen, wie z.B. Lungenreizung und Anaphylaxe, fest (Raskin, Am. Rev. Resp. Dis. 98, 697 [1968]). Solche Komplikationen können auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß die zuvor vermarkteten Produkte mit Proteasen kontaminiert und beim Menschen immunogen waren. Obwohl das klinische Problem von dickem Lungenschleim oft chronisch und wiederkehrend ist, wurde eine Langzeittherapie mit Rinderpankreas-DNase nicht empfohlen. Diese Probleme könnten durch Bereitstellen von DNase menschlichen Ursprungs und deren Herstellung in großen Mengen in nichtpankreatischen exokrinen Zellen zur Erleichterung der Reinigung, frei von kontaminierenden Proteasen, gelöst werden.
  • Demgemäß ist es ein Ziel dieser Erfindung, Nukleinsäure bereitzustellen, die für menschliche DNase kodiert.
  • Die vorliegende Anmeldung ermöglicht die Herstellung von DNase mit Aminosäuresequenz- oder Glykosylierungs-Varianten, die sonst in der Natur nicht vorkommen, sowie anderer Derivate von DNase mit verbesserten Eigenschaften, einschließlich erhöhter spezifischer Aktivität.
  • Die Ziele dieser Erfindung wurden durch ein Verfahren erreicht, welches das Bereitstellen von für menschliche DNase kodierender Nukleinsäure; das Transformieren einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure; das Kultivieren der Wirtszelle, damit sich DNase in der Kultur akkumulieren kann; und das Gewinnen der DNase aus der Kultur umfaßt. Überraschenderweise wurde ein für menschliche DNase kodierender Klon voller Länge identifiziert und gewonnen, und außerdem wird diese DNA ohne weiteres von rekombinanten Wirtszellen exprimiert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist die Säugetier-DNase reife menschliche DNase voller Länge mit der Aminosäuresequenz von nativer menschlicher DNase, natürlich vorkommenden Allelen davon oder vorbestimmten Aminosäuresequenz- oder Glykosylierungs-Varianten davon. Die Nukleinsäure, die für die DNase kodiert, kodiert vorzugsweise für ein Präprotein, das verarbeitet und von Wirtszellen, insbesondere Säugetier-zellen, sekretiert wird.
  • 1 zeigt die Aminosäure- und DNA-Sequenz menschlicher DNase. Die native Signal-sequenz ist unterstrichen, die potentiellen Initiationscodons sind eingekreist, und die reife Sequenz ist mit eckigen Klammern versehen.
  • 2 zeigt einen Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz für reife menschliche (hDNase) und Rinder- (bDNase) DNase. Sternchen zeigen exakte Homologie an, Punkte konservative Substitutionen.
  • 3 zeigt die Konstruktion der Expressionsvektoren pRK.DNase.3 und pSVe.DNase.
  • 4 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pSVI.DNase, der die Spleißeinheit des pRK5-Vektors ohne jegliche Modifikationen enthält.
  • 5 zeigt die Konstruktion der Expressionsvektoren pSVI2-DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase und pSVI6b.DNase, welche die Modifikationen in der Spleißeinheit und umgebenden DNA enthalten.
  • 6 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz von pSVI.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, der jedoch nicht enthalten ist.
  • 7 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz von pSVI2.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, der jedoch nicht enthalten ist.
  • 8 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz von pSVI3.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, der jedoch nicht enthalten ist.
  • 9 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz von pSVI5.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, der jedoch nicht enthalten ist.
  • 10 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz von pSVI6B.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, der jedoch nicht enthalten ist.
  • 11 zeigt eine schematische Darstellung der Nukleotidsequenzen der Spleißeinheiten, die an der Erzeugung der Vektoren dieses Beispiels beteiligt sind, d.h. SVI, SVI2, SVI3, SVI5 und SVI6B. Die Kästen stellen Änderungen gegenüber der SVI-Sequenz dar, die doppelte Unterstreichung ist ein ungewolltes ATG-Codon, die Unterstreichung zeigt ungewollte Spleißstellen und hinzugefügte oder veränderte Verzweigungspunkt-(BPS-)Bereiche, die Sequenz-Unterbrechungen stellen Deletionen der Nukleotide für SVI3-SVI5 dar, die "..."-Kennzeichnung gibt nicht dargestellte Sequenzen an, und die Dreiecke zeigen die 5'- bzw. 3'-Spaltstelle innerhalb des Spleißdonors bzw. Spleißakzeptors der Spleißeinheit an.
  • Menschliche DNase ist als Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 1 zusammen mit Aminosäuresequenz-Varianten davon, welche die qualitative enzymatische Aktivität von DNase beibehalten, definiert. Vorzugsweise sind die Varianten beim Menschen nicht immunogen. Varianten können größere enzymatische Aktivität, erhöhte Hemmungsresistenz (insbesondere gegenüber Actin) und verbesserte Löslichkeit besitzen, oder sie können von Wirtszellen in größeren Mengen exprimiert werden.
  • Aminosäuresequenz-Varianten von DNase fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten. Diese Varianten werden üblicherweise durch stellenspezifische Mutagenese von Nukleotiden in der für die DNase kodierenden DNA, wobei durch diese DNA-Kodierung die Variante erhalten wird, und durch anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur gewonnen. DNase-Fragmentvarianten mit bis zu etwa 100-150 Resten können jedoch günstigerweise durch in vitro-Synthese hergestellt werden.
  • Die Aminosäuresequenz-Varianten menschlicher DNase sind vorbestimmt oder natürlich vorkommende Allele. Beispielsweise existiert Rinderpankreas-DNase natürlich in 4 molekularen Varianten, welche die gleiche enzymatische Aktivität besitzen, sich jedoch hinsichtlich des Glykosylierungsmusters oder der Substitution auf der Ebene der Amino-sauren unterscheiden. Außerdem existiert menschliche DNase natürlich mit einem Arginin- oder einem Glutaminrest bei Aminosäure 222. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das natürlich vorkommende Analog. Speziell ausgenommen aus dem Bereich der hierin beschriebenen menschlichen DNase sind die Sequenzen von natürlich vorkommender Rinder-, Schweine- oder Schafs-DNase.
  • Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt ist, muß die Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, wird Sättigungsmutagenese am Ziel-codon oder -bereich eingeführt, und die DNase-Varianten werden dann auf die optimale Kombination gewünschter Aktivität gescreent.
  • Aminosäuresubstitutionen werden typischerweise für einzelne Reste eingeführt; Insertionen besitzen üblicherweise die Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten; und Deletionen reichen von etwa 1 bis 30 Resten. Deletionen oder Insertionen erfolgen vorzugsweise in benachbarten Paaren, d.h. eine Deletion von 2 Resten oder Insertion von 2 Resten. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder jede Kornbination davon können kombiniert werden, um zu einem Endkonstrukt zu gelangen. Natürlich dürfen die Mutationen, die in der für die DNase-Variante kodierenden DNA erfolgen, die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens setzen und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten ( EP-A-75.444 ).
  • Substitutionsvarianten sind jene, bei denen zumindest ein Rest in der Sequenz aus 1 entfernt und ein anderer Rest an seine Stelle gesetzt wurde. Solche Substitutionen erfolgen im allgemeinen in Einklang mit nachstehender Tabelle I, wenn es gewünscht wird, die Eigenschaften von DNase einer Feinmodulation zu unterziehen. TABELLE I
    Ursprünglicher Rest Beispiele für Substitutionen
    Ala ser
    Arg lys
    Asn gln; his
    Asp glu
    Cys ser
    Gin asn
    Glu asp
    Gly pro
    His asn; gln
    Ile leu; val
    Leu ile; val
    Lys arg; gln; glu
    Met leu; ile
    Phe met; leu; tyr
    Ser thr
    Thr ser
    Trp tyr
    Tyr trp; phe
    Val ile; leu
  • Substantielle Veränderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden hervorgerufen, indem Substitutionen gewählt werden, die weniger konservativ als jene aus Tabelle 1 sind, d.h. indem Reste ausgewählt werden, die sich in ihrer Wirkung hinsichtlich der Beibehaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Bereich der Substitution, z.B. Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette deutlicher unter-scheiden. Die Substitutionen, von denen man erwartet, daß sie im allgemeinen die stärksten Änderungen der DNase-Eigenschaften herbeiführen, sind jene, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert wird; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z.B.
  • Glutamyl oder Asparagyl, substituiert wird; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne Seitenkette, z.B. Glycin, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert wird.
  • Beispiele für Aminosäuresequenz-Varianten menschlicher DNase werden in nachstehender Tabelle beschrieben. Der Rest nach der Restzahl zeigt die Ersetzung oder insertierte Aminosäuren an. TABELLE 2
    Substitutionen
    H134K, N, R oder Q FGW, L, I, M oder V
    A135S IBF, L, V, M oder W
    L133V, I oder A R41K oder H
    P132A S43T, C oder Y
    N18K, H, R oder Q K77R oder H
    S17T R79K oder H
    T20S oder Y N110D, S, T, R, Y oder Q
    N106K, H, R oder Q G167P
    G105P oder A F169L, V, I oder M
    D107E oder T A171G, V oder M
    R140A S250T, Y oder M
    R121K oder H Y253T, S oder M
    T108S oder Y R73N
    P103S, T oder Y R73C + D139C
    C101S, T, Y oder M K260R oder S
    C104S, T, Y oder M L259V, I oder M
    Deletionen Insertionen
    Δ34H-Δ39E K260RA-COOH
    Δ159G-161E V131A P132
    Δ204A-208H P132A L133
    Δ121R-127E
    Δ188T-191T
    Δ204A-208H
    Δ223G-231L
    Δ260K
  • Im allgemeinen wird Sequenzvariation an den Resten 6-10, 41-43, 77-79, 110-112, 167-171, 250-253, 73, 93, 157, 149, 185, 187, 198, 17-20, 105-108 und 131-139 eingeführt. Vorzugsweise stellen die Varianten konservative Substitutionen dar. Man beachte, daß einige Varianten verringerte oder fehlende hydrolytische Aktivität aufweisen können. Diese Varianten sind trotzdem nützliche Standards für Immunassays auf DNase, sofern sie zumindest ein Immunepitop nativer menschlicher DNase beibehalten.
  • Glykosylierungsvarianten sind im Umfang menschlicher DNase enthalten. Eingeschlossen sind unglykosylierte Aminosäuresequenz-Varianten, unglykosylierte DNase mit der nativen, unmodifizierten Aminosäuresequenz von DNase und Glykosylierungsvarianten. Beispielsweise dient die Substitutions- oder Deletionsmutagenese dazu, die N-gebundenen Glykosylierungsstellen menschlicher DNase an den Resten 18 bzw. 106 zu eliminieren, z.B. wird der Asparaginrest deletiert oder durch einen anderen basischen Rest, wie z.B. Lysin oder Histidin, ersetzt. Alternativ dazu werden flankierende Reste, welche die Glykosylierungsstelle bilden, substituiert oder deletiert, obwohl die Asparagin-Reste unverändert bleiben, um Glykosylierung durch Eliminieren der Glykosylierungs-Erkennungsstelle zu verhindern. Unglykosylierte DNase, welche die Aminosäure-sequenz nativer menschlicher DNase besitzt, wird in rekombinanter prokaryotischer Zellkultur produziert, da Prokaryoten keine Glykosylierung in Polypeptide einführen können. Darüber hinaus können Glykosylierungsvarianten durch Hinzufügen potentieller N-gebundener Glykosylierungsstellen mittels Insertieren (entweder durch Amino-säure-Substitution oder -Deletion) von Konsenssequenzen für N-gebundene Glykosylierung erzeugt werden: Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr. Glykosylierungsvarianten können sowohl durch Eliminieren der N-gebundenen Glykosylierungsstellen an den Resten 18 und 106 als auch durch Hinzufügen neuer erzeugt werden.
  • Glykosylierungsvarianten, d.h. Glykosylierung, die sich von jener menschlicher Pankreas- oder Harn-DNase unterscheidet, werden durch Auswahl geeigneter Wirtszellen oder durch in vitro-Verfahren produziert. Hefe beispielsweise ruft eine Glykosylierung hervor, die sich deutlich von jener der Säugetiersysteme unterscheidet. In ähnlicher Weise werden Säugetierzellen einer anderen Spezies (z.B. Hamster, Mäuse, Insekten, Schweine, Rinder oder Schafe) oder einem anderen Gewebe (z.B. Lunge, Leber, Lymphdrüsen, Mesenchym, Epidermis) als Quelle der DNase auf die Fähig keit gescreent, Glykosylierungsvarianten einzuführen, gekennzeichnet beispielsweise durch erhöhte Werte von Mannose oder variierende Verhältnisse von Mannose, Fucose, Sialinsäure oder anderer Zucker, die typischerweise in Säugetier-Glykoproteinen vorliegen. Ferner können Säugetier- oder Hefezellen, die Mutationen betreffend den Glykosylierungs-Phenotyp aufweisen, identifiziert, zur nachfolgenden Mutation ausgewählt oder konstruiert und verwendet werden, um DNase zu produzieren. Die in vitro-Verarbeitung von DNase erfolgt typischerweise durch enzymatische Hydrolyse, z.B. Neuraminidase- oder Endoglykosidase H-Spaltung.
  • Aminosäuresequenz-Insertionsvarianten von DNasen sind jene, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Stelle in der Ziel-DNase eingeführt werden, um die zuvor bestehenden Reste zu verschieben. Am häufigsten sind Insertions-varianten Fusionen heterologer Proteine oder Polypeptide mit dem Aminooder Carboxylterminus von DNase. DNase-Derivate, die bei Menschen immunogen sind, sind nicht bevorzugt, z.B. jene, die durch Fusionieren eines immunogenen Polypeptids mit DNase mittels in vitro-Vernetzung oder durch rekombinante Zellkultur, die mit DNA transformiert ist, welche für immunogene Fusionen kodiert, z.B. lacZ, hergestellt werden. Aus diesem Grund sind die typischen hierin besprochenen Insertionsvarianten die oben beschriebenen Signalsequenzvarianten.
  • Kovalente Modifikationen des DNase-Moleküls sind auch im Schutzbereich der Erfindung enthalten. Solche Modifikationen werden eingeführt, indem gezielte Aminosäure-reste des gewonnenen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren kann, oder indem man sich der Mechanismen posttranslationaler Modifikation bedient, die in aus-gewählten rekombinanten Wirtszellen auftreten. Die resultierenden kovalenten Derivate eignen sich in Programmen zur Identifizierung von Resten, die für biologische Aktivität bedeutsam sind, für Immunassays auf DNase und zur Herstellung von antimenschlichen DNase-Antikörpern zur Immunaffinitätsreinigung rekombinanter DNase. Beispielsweise würde die vollständige Inaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach der Reaktion mit Ninhydrin nahelegen, daß zumindest ein Arginyl- oder Lysylrest für dessen Aktivität von entscheidender Bedeu tung ist, woraufhin die einzelnen Reste, die unter den gewählten Bedingungen modifiziert wurden, durch Isolation eines Peptidfragments identifiziert werden, das den modifizierten Aminosäurerest enthält.
  • Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen) umgesetzt, wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, um Carboxymethyl- oder Carboxamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)proprionsäure, Chloracetolphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
  • Histidylreste werden vorzugsweise durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5 bis 7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidyl-Seitenkette ist. p-Bromphenacylbromid eignet sich ebenfalls; die Reaktion sollte in 0,1 M Natrium-cacodylat bei pH 6,0 erfolgen.
  • Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt die Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagentien zur Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten sind Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxal-phosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und die mit Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Mitteln wie z.B. Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin modifiziert. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, daß die Reaktion aufgrund des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Außerdem können diese Reagentien mit den Gruppen von Lysin sowie der Arginin-ε-Aminogruppe reagieren.
  • Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten an sich wurde ausführlich untersucht, wobei man sich besonders auf die Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan konzentrierte. Am häufigsten werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyroyl-Spezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von 125I oder 131I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Radio-immunassays herzustellen, wobei das Chloramin T-Verfahren das zu diesem Zweck am häufigsten angewandte Verfahren ist.
  • Carboxyl-Seitengruppen (Asparagyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R'), wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-moprholinyl-(4)-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Außerdem werden Asparagyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste übergeführt, was eine Alternative zur Mutation der Nuklein-säure darstellt, damit diese für Asparagin und Glutamin kodiert.
  • Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln eignet sich zur Herstellung intermolekularer Aggregate des Proteins mit immunogenen Polypeptiden sowie zur Vernetzung des Proteins mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Assay oder zur Affinitätsreinigung von Antikörpern. Außerdem liefert eine Untersuchung der Vernetzungen innerhalb der Kette direkte Informationen über die Konformations-struktur. Üblicherweise eingesetzte Vernetzer sind 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, umfassend Disuccinimidylester wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleimide, wie z.B. Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Bildung von Vernetzungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive, wasserunlösliche Matrices, wie z.B. mit Bromcyan aktivierte Kohlenhydrate, und die in Den US-A-3.969.287 ; 3.691.016 ; 4.195.128 ; 4.247.642 ; 4.229.537 und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substanzen zur Proteinimmobilisierung verwendet.
  • Bestimmte posttranslationale Derivatisierungen sind die Folge des Einflusses rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutaminyl- und Asparagyl-Resten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Schutzbereich der Erfindung.
  • Andere posttranslationale Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Hystidin-Seitenketten (T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 77-86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung des C-terminalen Carboxyls.
  • Andere Derivate umfassen das Polypeptid der Erfindung, das kovalent an ein nicht-proteinartiges Polymer gebunden ist. Das nicht-proteinartige Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das ansonsten nicht in der Natur vorkommt. Polymere, die in der Natur vorkommen und nach rekombinanten oder in vitro-Verfahren produziert werden, sind allerdings ebenso nützlich wie Polymere, die aus der Natur isoliert werden. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Schutzbereich der Erfindung, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders geeignet sind Polyalkylenether, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyoxyethylen-ester oder Methoxypolyethylenglykol; Polyoxyalkylene, wie z.B. Polyoxyethylen, Poly-oxypropylen und Blockcopolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronics); Polymethacrylate; Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, umfassend die Saccharidmonomere D-Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Glucuronsäure, Sialinsäure, Di-Glacturonsäure, D-Mannuron-säure (z.B. Polymannuronsäure oder Alginsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure, einschließlich von Homopolysacchariden und Heteropolysacchariden, wie z.B. Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glykogen oder die Polysaccharid-Untereinheit von sauren Mucopolysacchariden, z.B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen, wie z.B. Polysorbit und Polymannit; sowie Heparin oder Heparon. Wenn das Polysaccharid die native Glykosylierung oder die Glykosylierung ist, die mit rekombinanter Expression einhergeht, kann sich die Substitution an einer anderen als einer nativen N- oder O-gebundenen Glykosylierungsstelle befinden, in der eine zusätzliche N- oder O-gebundene Stelle oder ein Substitut davon in das Molekül eingeführt wurde. Es werden Gemische solcher Polymere verwendet, oder das Polymer kann homogen sein. Das Polymer braucht vor der Vernetzung nicht wasserlöslich zu sein, ist es aber vorzugsweise; das Endkonjugat hingegen muß wasserlöslich sein. Außerdem sollte das Polymer in der Konjugatform nicht hochimmunogen sein und sollte auch keine Viskosität aufweisen, die mit intravenöser Infusion oder Injektion unvereinbar ist, wenn es über solche Wege verabreicht werden soll.
  • Vorzugsweise enthält das Polymer eine einzige reaktive Gruppe. Dies unterstützt die Vermeidung der Vernetzung von Proteinmolekülen. Es liegt jedoch im Schutzbereich der Erfindung, Reaktionsbedingungen zu optimieren, um die Vernetzung zu verringern, oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder chromatographische Siebe zu reinigen, um im wesentlichen homogene Derivate zu erhalten.
  • Das Molekulargewicht des Polymers reicht von etwa 100 bis 500.000 und beträgt vorzugsweise etwa 1.000 bis 20.000. Das ausgewählte Molekulargewicht hängt von der Beschaffenheit des Polymers und dem Substitutionsgrad ab. Im allgemeinen gilt: Je stärker die Hydrophilie des Polymers und der Substitutionsgrad, desto niedriger das einsetzbare Molekulargewicht. Das optimale Molekulargewicht wird durch Routineexperimente bestimmt.
  • Das Polymer wird mittels eines multifunktionellen Vernetzers, der mit dem Polymer und einer oder mehreren Aminosäure- oder Zuckerresten des Proteins reagiert, im allgemeinen kovalent mit dem Polypeptid der Erfindung verbunden. Es liegt jedoch im Schutz-bereich der Erfindung, das Polymer durch Umsetzen eines derivatisierten Polymers mit dem Protein oder umgekehrt direkt zu vernetzen.
  • Die kovalente Vernetzungsstelle auf dem Polypeptid umfaßt die N-terminale Aminogruppe und ε-Aminogruppen auf Lysinresten sowie andere Amino-, Imino-, Carboxyl-, Sulfhydryl-, Hydroxyl- oder andere hydrophile Gruppen. Das Polymer kann ohne Verwendung eines multifunktionellen (üblicherweise bifunktionellen) Vernetzers direkt mit dem Protein verbunden werden. Beispiele für solche Vernetzer sind 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, umfassend Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Meleimide, wie z.B. N-Maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-Azidophenyl)dithio]propioimidat liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Bildung von Vernetzungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive, wasserlösliche Matrices, wie z.B. durch Bromcyan aktivierte Kohlenhydrate, und die in den US-A-3.959.080 ; 3.969.287 ; 3.691.016 ; 4.195.128 ; 4.247.642 ; 4.229.537 ; 4.055.635 und 4.330.440 beschriebenen Systeme für die Vernetzung geeignet modifiziert. Die kovalente Bindung an Aminogruppen erfolgt durch bekannte Chemien auf der Grundlage von Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, reaktive Aldehydgruppen (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid oder PEG-Chlorid plus das Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, aktive Succinimidylester, aktiviertes Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorphenylchlorformiat oder mit p-Nitro-phenylchlorformiat-aktiviertes PEG). Carboxylgruppen werden durch Bindung an PEG-Amin unter Verwendung von Carbodiimid derivatisiert.
  • Polymere werden durch Oxidation unter Verwendung von Chemikalien, z.B. Metaperiodat, oder Enzymen, z.B. Glucose- oder Galactose-Oxidase (beide produzieren das Aidehydderivat des Kohlenhydrats), gefolgt von der Reaktion mit Hydrazid oder amino-derivatisierten Polymeren, an Oligosaccharidgruppen gebunden; dies erfolgt gemäß Heitzmann et al., P.N.A.S. 71, 3537-3541 (1974) oder Bayer et al., Methods in Enzymology 62, 310 (1979), um Oligosaccharide mit Biotin oder Avidin zu markieren. Außerdem eignen sich andere chemische oder enzymatische Verfahren, die bislang zur Verbindung von Oligosacchariden und Polymeren angewendet wurden.
  • Substituierte Oligosaccharide sind besonders vorteilhaft, da es im allgemeinen weniger Substitutionen als Aminosäurestellen zur Derivatisierung gibt, wodurch die Oligosaccharid-Produkte homogener sind. Die Oligosaccharid-Substituenten werden gegebenenfalls durch Enzymspaltung modifiziert, um Zucker zu entfernen, z.B. durch Neuraminidase-Spaltung, bevor die Polymerderivatisierung erfolgt.
  • Das Polymer trägt eine Gruppe, die direkt mit einer Aminosäure-Seitenkette reaktiv ist, oder den N- oder C-Terminus des Polypeptids der Erfindung, oder die mit dem multifunktionellen Vernetzer reaktiv ist. Im allgemeinen sind Polymere, die solche reaktive Gruppen tragen, zur Herstellung immobilisierter Proteine bekannt. Um solche Chemien hier einzusetzen, sollte man ein wasserlösliches Polymer verwenden, das ansonsten in gleicher Form derivatisiert wird wie unlösliche Polymere, die bislang zur Protein-Immobilisierung verwendet wurden. Bromcyan-Aktivierung ist ein besonders geeignetes Verfahren, das beim Vernetzen von Polysacchariden zum Einsatz kommt.
  • "Wasserlöslich" in bezug auf das Polymerkonjugat bedeutet, daß das Konjugat in physiologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Blut, in einer Menge löslich ist, die ausreicht, um eine therapeutisch wirksame Konzentration zu erzielen.
  • "Wasserlöslich" in bezug auf das Ausgangspolymer bedeutet, daß das Polymer oder sein reaktives, zur Konjugation verwendetes Zwischenprodukt ausreichend wasserlöslich ist, um an einer Derivatisierungsreaktion teilzunehmen.
  • Der Grad der Substitution mit Polymer ist abhängig von der Anzahl an reaktiven Stellen auf dem Protein, davon, ob das gesamte oder ein Fragment des Proteins verwendet wird, davon, ob das Protein eine Fusion mit einem heterologen Protein ist, vom Molekulargewicht, von der Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers sowie von den jeweils gewählten Proteinderivatisierungs-Stellen. Im allgemeinen enthält das Konjugat etwa 1 bis 10 Polymermoleküle, während jede heterologe Sequenz mit einer im wesentlichen unbegrenzten Anzahl an Polymermolekülen substituiert sein kann, sofern die gewünschte Aktivität nicht nennenswert beeinträchtigt wird. Der optimale Vernetzungsgrad wird durch eine Versuchsmatrix problemlos bestimmt, in der die Zeit, Temperatur und andere Reaktionsbedingungen variieren, um den Substitutionsgrad zu ändern, woraufhin die Fähigkeit der Konjugate, in der gewünschten Weise zu funktionieren, untersucht wird.
  • Das Polymer, z.B. PEG, wird durch eine Vielzahl an sich bekannter Verfahren zur kovalenten Modifikation von Proteinen mit nicht-proteinartigen Polymeren, wie z.B. PEG, vernetzt. Manche dieser Verfahren sind jedoch für die Zwecke der Erfindung nicht bevorzugt. Cyanurchlorid-Chemie führt zu vielen Nebenreaktionen, u.a. zur Proteinvernetzung. Außerdem kann sie sehr wahrscheinlich zur Inaktivierung von Proteinen führen, die Sulfhydrylgruppen enthalten. Carbonyldiimidazol-Chemie (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131, 25-33 [1983]) erfordert einen hohen pH-Wert (> 8,5), der Proteine inaktivieren kann. Da das "aktivierte PEG"-Zwischenprodukt mit Wasser reagieren kann, ist ein sehr großer Molüberschuß an "aktivierten PEG" gegenüber Protein erforderlich. Die hohe PEG-Konzentration, die für die Carbonyldiimidazol-Chemie erforderlich ist, führte auch zu Problemen mit der Reinigung, da sowohl die Gelfiltrations-Chromatographie als auch Hydrophob-Chromatogaphie beeinträchtigt werden. Außerdem können die hohen Konzentratinen "aktivierter PEG" Protein fällen, ein Problem, das an sich bereits früher beobachtet wurde (Davis, US-A-4.179.337 ). Andererseits ist Aldehyd-Chemie (Royer, US-A-4.002.531 ) wirksamer, da sie nur einen 40-fachen Molüberschuß an PEG und 1- bis 2-ständige Inkubation erfordert. Das von Royer zur Herstellung des PEG-Aldehyds vorgeschlagene Mangandioxid ist jedoch "aufgrund der ausgeprägten Tendenz von PEG, Komplexe mit Oxidationsmitteln auf Metallbasis zu bilden", problematisch (Harris et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 22, 341-352 [1984]). Die Durchführung von Moffatt-Oxidation unter Verwendung von DMSO und Essigsäureanhydrid löst dieses Problem. Ferner muß das von Royer vorgeschlagene Natriumborhydrid bei hohem pH-Wert eingesetzt werden und besitzt eine signifikante Tendenz, Disulfidbindungen zu reduzieren. Im Gegensatz dazu ist Natriumcyanoborhydrid, das bei neutralem pH wirkt und sehr wenig dazu neigt, Disulfidbindungen zu reduzieren, bevorzugt.
  • Die Konjugate der Erfindung werden durch Gelfitration von nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien getrennt. Heterologe Spezies der Konjugate werden in gleicher Weise voneinander gereinigt. Das Polymer kann auch wasserlöslich sein – als hydrophiles Gel oder als Formkörper. Besonders nützlich sind Polymere, die in chirurgischen Röhren, wie z.B. Katheter oder Dränageleitungen, enthalten sind.
  • Für menschliche DNase kodierende DNA wird durch in vitro-Verfahren synthetisiert oder problemlos aus menschlichen Pankreas-cDNA-Sammlungen erhalten. Da 1 die gesamte DNA-Sequenz für menschliche DNase zeigt, braucht lediglich Hybridisierungs-Screening mit markierter DNA, die für menschliche DNase oder Fragmente davon (üblicherweise mehr als etwa 50 bp) kodiert, eingesetzt zu werden, um in den cDNA-Sammlungen Klone zu entdecken, die homologe Sequenzen enthalten, gefolgt von der Analyse der Klone mittels Restriktionsenzym-Analyse und Nukleinsäure-Sequenzierung zur Identifikation von Klonen voller Länge. Wenn keine Klone voller Länge in der Sammlung vorhanden sind, können geeignete Fragmente der verschiedenen Klone gewonnen und an Restriktionsstellen ligiert werden, die den Fragmenten gemein sind, um einen Klon voller Länge zusammenzusetzen. Für DNase kodierende DNA anderer Tierspezies wird erhalten, indem Sammlungen solcher Spezies mit der menschlichen Sequenz sondiert oder die Gene in vitro synthetisiert werden (für Rinder-, Schweine- oder Schafs-DNase).
  • Im Schutzbereich der Erfindung sind auch Nukleinsäuresonden enthalten, die unter sehr rauhen Bedingungen an die cDNA menschlicher DNase oder an das Genom-Gen für menschliche DNase hybridisieren können (einschließlich der Introns und 5'- oder 3'-Flankierbereiche, die sich zu den benachbarten Genen erstrecken, oder etwa 5.000 bp, je nachdem, welcher Wert höher ist). Die Identifikation der Genom-DNA für DNase ist eine unkomplizierte Angelegenheit und umfaßt das Sondieren einer menschlichen Genom-Sammlung mit der cDNA oder deren Fragmenten, die mit einer nachweisbaren Gruppe markiert wurden z.B. Radiophosphor, und Gewinnen eines oder mehrerer Klone, welche die Gene enthalten. Das vollständige Gen wird – falls erforderlich – durch "Walking" zusammengesetzt. Typischerweise kodieren die Sonden nicht für Rinder-, Schafs- oder Schweine-DNase, und sie besitzen eine Länge von etwa 10 bis 100 bp.
  • Im allgemeinen werden Prokaryoten zum Klonieren von DNA-Sequenzen beim Konstruieren von für die Erfindung geeigneten Vektoren verwendet. Beispielsweise eignet sich besonders E. coli K12-Stamm 294 (ATCC-Nr. 31446). Andere in Frage kommende Mikrobenstämme sind E. coli B und E. coli X1776 (ATCC-Nr. 31537). Diese Beispiele sind veranschaulichend und nicht einschränkend. Alternativ dazu eignen sich in vitro-Klonierverfahren, wie z.B. PCR.
  • DNase wird in rekombinanter Zellkultur als N-terminales Methionyl-Analog oder als Fusion mit einem zu menschlicher DNase heterologem Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus der DNase, direkt exprimiert. Beispielsweise wird beim Konstruieren eines prokaryotischen Sekretions-Expressionsvektors das native DNase-Signal zusammen mit Wirten eingesetzt, die das menschliche Signal erkennen. Wenn der Sekretions-Leader vom Wirt "erkannt" wird, kann die Wirtsignal-Peptidase eine Fusion des Leader-Poly-peptids, das an seinem C-Terminus mit der gewünschten reifen DNase fusioniert ist, spalten. Für Wirtsprokaryoten, die das menschliche Signal nicht besitzen, tritt an die Stelle dieses Signals ein prokaryotisches Signal, das z.B. aus der Gruppe bestehend aus alkalischen Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder wärmestabilen Enterotoxin II-Leadern ausgewählt ist. Für die Hefesekretion kann das menschliche DNase-Signal durch die Hefe-Invertase-, α-Faktor- oder saure Phosphatase-Leader ersetzt werden. Bei der Säugetierzellen-Expression ist das Nativsignal ausreichend, owbeohl auch andere Säugetier-Protein-Sekretionssignale ebenso wie virale Sekretions-Leader in Frage kommen, z.B. das Herpes simplex gD-Signal.
  • DNase wird in beliebigen Wirtszellen exprimiert, jedoch vorzugsweise in Säugetierwirten synthetisiert. Wirtszellen von Prokaryoten, Pilzen, Hefe, Pichia, Insekten und dergleichen werden allerdings auch zur Expression herangezogen. Beispiele für Prokaryoten sind die Stämme, die sich zum Klonieren eignen, sowie E. coli W3110 (F-, λ- prototroph, ATCC-Nr. 27325), andere Enterobacteriaceae, wie z.B. Serratia mercescans, Bazillen und verschiedene Pseudomonaden. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren.
  • Expressionswirte werden typischerweise mit DNA transformiert, die für menschliche DNase kodiert und in einen Expressionsvektor ligiert wurde. Solche Vektoren tragen üblicherweise eine Replikationsstelle (obwohl dies nicht notwendig ist, wenn es zu Chromosomen-Integration kommt). Es wird derzeit bevorzugt, einen Expressinsvektor zu verwenden (siehe Beispiel 4 weiter unten), der eine Spleiß-Donor-Intron-Spleiß-Akzeptor-Sequenz oder -Einheit enthält.
  • Expressionsvektoren umfassen auch Markersequenzen, die in transformierten Zellen für Phenotypen-Selektion sorgen können. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid einer E. coli-Spezies (Bolivar et al., Gene 2, 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet somit eine einfache Möglichkeit der Identifikation transformierter Zellen, ob zum Zweck des Klonierens oder Exprimierens. Expressionsvektoren enthalten optimalerweise auch Sequenzen, die sich zur Transkriptions- und Translations-Kontrolle eignen, z.B. Promotoren und Shine-Dalgarno-Sequenzen (für Prokaryoten) oder Promotoren und Enhancer (für Säugetierzellen). Die Promotoren können – müssen aber nicht – induzierbar sein; überraschenderweise stellte sich heraus, daß selbst leistungsstarke konstitutive Promotoren, wie z.B. der CMV-Promotor für Säugetierwirte, DNase ohne Wirtszellen-Toxizität produzieren. Obwohl es denkbar ist, daß Expressionsvektoren keine Expressionskontrolle, replikativen Sequenzen oder Selektionsgene enthalten können, könnte deren Fehlen die Identifikation von DNase-Transformanten und die Erzielung hoher DNase-Expressionswerte beeinträchtigen.
  • Zu Promotoren, die sich zur Verwendung bei prokaryotischen Wirten eignen, zählen z.B. die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 [1978]; und Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]), alkalische Phosphatase, das Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, "Nucleic Acids Res." 8, 4057 [1980] und EP-A-36.776 ) sowie Hybridpromotoren, wie z.B. der tac-Promotor (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 [1983]). Andere funktionelle bakterielle Promotoren kommen jedoch ebenfalls in Frage. Deren Nukleotidsequenzen sind allgemein bekannt, wodurch sie ein Fachmann auf dem Gebiet operabel an für DNase kodierende DNA ligieren kann (Siebenlist et al., Cell 20, 269 [1980]), wobei Linker oder Adaptoren zum Einsatz kommen, um allenfalls erforderliche Restriktionsstellen zur Verfügung zu stellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die mit der für DNase kodierenden DNA operabel verbunden ist.
  • Neben Prokaryoten sind auch eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefe oder Fadenpilze, geeignet. Saccharomcyces cerevisiae ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch einige andere Stämme allgemein zur Verfügung stehen. Saccharomyces cerevisiae-Stämme mit den identifizierenden Charakteristika von Stamm AB107-30(4)-VN#2 (ATCC-Zugriffsnummer 20937), insbesondere der Resistenz gegenüber 4 M Orthovanadat, eignet sich besonders zur DNase-Expression. Mit diesem VN#2-Stamm ist es wünschenswert, die Zellen mit einem Plasmid hoher Kopienanzahl, das aus einem 2μ-Hefeplasmid stammt, dauerhaft zu transformieren (ebenda). Im allgemeinen ist das Plasmid YRp7 ein zufriedenstellender Expressionsvektor in Hefe (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7, 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10, 157 [1980]). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe aufweist, der keine Fähigkeit besitzt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 [1977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Charakteristikum des Hefe-Wirtszellengenoms bietet dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Erkennen von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Expression in Pichia ( US-4.808.537 ) ist auch recht zufriedenstellend.
  • Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefewirten sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 [1980] oder andere glykolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 [1968]; und Holland, Biochemistry 17, 4900 [1978]), z.B, Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der über Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription sind, sind die Promotorbereiche für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für den Maltose- und Galactose-Verbrauch verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden außerdem von R. Hitzeman et al., EP-A-73.657 beschrieben.
  • Expressions-Kontrollsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene besitzen einen AT-reichen Bereich, der sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle befindet, wo die Transkription eingeleitet wird. Eine weitere Sequenz 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsbeginn zahlreicher Gene ist ein CXCAAT-Bereich, worin X ein beliebiges Nukleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodiersequenz sein kann. Alle diese Sequenzen können in Säugetier-Expressionsvektoren insertiert werden.
  • Zweckmäßige Promotoren zur Kontrolle der Transkription von Vektoren in Säugetier-Wirtszellen werden problemlos aus verschiedenen Quellen erhalten, z.B. den Genomen von Viren, wie z.B. dem Polyomavirus, SV40, Adenovirus, MMV (steroidinduzierbar), Retroviren (z.B. LTR von HIV), Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten Cytomegalo-vrus, oder aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. der β-Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren von SV40 werden günstigerweise als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsur sprung enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird günstigerweise als HindIII E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway, P.J. et al., Gene 18, 355-360 (1982).
  • Die Transkription einer für DNase kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind ciswirkende Elemente von DNA mit üblicherweise 10-300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78, 993 [1981]) und 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 [1983]) von der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell 33, 729 [1983]) sowie innerhalb der Kodierse-quenz selbst (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 [1984]) gefunden. Mittlerweile sind viele Enhancer-Sequenzen von Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise verwendet man jedoch einen Enhancer eines eukaryotischen Zellvirus. Beispiele dafür sind der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der frühe Cytomegalovirus-Promotor-Enhancer, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, tierische, menschliche oder Zellkern enhaltende Zellen anderer mehrzelliger Organismen), enthalten auch Sequenzen, die zur Transkriptionstermination erforderlich sind und die mRNA-Expression beeinflussen könnten. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Bereich der für DNase kodierenden mRNA transkribiert. Die untranslatierten 3'-Bereiche enthalten auch Transkriptions-terminations-Stellen.
  • Expressionsvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Thymidin-Kinase (TK) oder Neomycin. Wenn solche selektierbaren Marker erfolgreich in eine Säugetier-Wirtszelle über tragen werden, kann die transformierte Säugetier-Wirtszelle überleben, wenn sie selektivem Druck ausgesetzt wird. Es gibt zwei weitverbreitete unterschiedliche Kategoden selektiver Systeme. Die erste Kategorie basiert auf dem Zellstoffwechsel und der Verwendung einer Mutanten-Zellinie, die keine Fähigkeit besitzt, sich unabhängig von einem ergänzten Medium zu vermehren. Zwei Beispiele dafür sind CHO-DHFR--Zellen und Mäuse-LTK--Zellen. Diese Zellen besitzen nicht die Fähigkeit, sich ohne Zusatz von Nährstoffen, wie z.B. Thymidin oder Hypoxanthin, zu vermehren. Da diesen Zellen bestimmte Gene fehlen, die für einen vollständigen Nukleotidsynthese-Weg erforderlich sind, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zum Ergänzen des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, welche die jeweiligen Gene nicht aufweisen, wodurch ihre Wachstumsbedingungen geändert werden. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, sind zum Überleben in nicht-ergänztem Medium nicht imstande.
  • Die zweite Kategorie ist die dominante Selektion, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das bei jedem Zelltyp Anwendung findet und keinen Einsatz von Mutantenzellinien erfordert. Diese Schemata umfassen typischerweise ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle zu stoppen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, exprimieren ein Protein, das Arzneimittel-Resistenz verleiht, und überleben somit das Selektionsschema. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 [1982[), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 [1980]) oder Hydromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 [1985]). Diese drei Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegen das geeignete Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hydromycin zu verleihen.
  • Geeignete eukaryotische Wirtszellen zum Exprimieren menschlicher DNase sind die Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV-40 (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryonierenlinie (293 oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham, F.L. et al., J. Gen. Virol. 36, 59 [1977]); Baby hamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); chinesische Hamstereierstockzellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 [1980]; Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather J.P. Biol. Reprod. 23, 243-251 [1980]); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); afrikanische Meerkatzen-Nierenzellen (NERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervikalkarzinom-Zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffetratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrusttumor (MMR 060562, ATCC CCL 51); und TRI-Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 [1982]).
  • Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die gewünschten Kodier- und Kontrollsequenzen enthalten, umfaßt die Anwendung herkömmlicher Ligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form erneut ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
  • Zur Analyse bzw. Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische dazu verwendet, E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert, falls erforderlich. Plasmide werden aus den Transformanten präpariert, durch Restriktion analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
  • Wirtszellen werden mit den Expressionsvektoren der Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die in geeigneter Weise modifiziert wurden, um Promotoren zu induzieren, Transformanten zu selektieren oder das DNase-Gen zu verstärken. Die Kulturbedingungen, z.B. Temperatur, pH-Wert und dergleichen, sind die gleichen wie jene, die für die zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden, und für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.
  • "Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch Chro mosomen-Integration. Sofern nicht anders angegeben, ist das hierin angewendete Verfahren zur Transformation der Wirtszellen das Verfahren von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52, 456-457 (1973). Andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen, z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion, kommen jedoch ebenfalls in Frage. Wenn prokaryotische Zellen oder Zellen, die nennenswerte Zellwandkon-struktionen besitzen, verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid (siehe Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 [1972]).
  • "Transfektion" bezieht sich auf das Einsetzen von DNA in eine Wirtszelle, ob nun Kodiersequenzen letztendlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Transfektions-verfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, z.B. CaPO4 und Elektroporation. Die Transformation der Wirtszelle ist das Anzeichen für erfolgreiche Transfektion.
  • DNase wird aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt, die bereits früher bei menschlicher, Rinder-, Schafs- oder Schweine-DNase zum Einsatz kamen, z.B. Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaus-tausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, Hydrophob-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie (z.B. unter Verwendung von DNA oder Nukleotiden auf einem festen Träger), Hydroxyapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie. Außerdem eignen sich RP-HPLC und Chromatographie unter Verwendung von Anti-DNase-Antikörpern zur Reinigung von DNase. Wie bereits festgestellt (Price et al., J. Biol. Chem. 244, 917 [1969]) werden vorzugsweise geringe Konzentrationen (etwa 0,1-5 mM) an Calciumionen während der Reinigung eingesetzt. Andere zweiwertige Kationen, die DNase stabilisieren, werden ebenfalls verwendet. DNase kann in Gegenwart eines Protease-Hemmers, wie z.B. PMSF, gereinigt werden.
  • Menschliche DNase wird zusammen mit erforderlichen Cofaktoren in therapeutischen Formulierungen eingesetzt und gegebenenfalls in gleicher Weise wie tierische DNase, wie z.B. Rinderpankreas-DNase, verabreicht. Die DNase-Formulierung kann flüssig sein und ist vorzugsweise eine isotonische Salzlösung, wie z.B. 150 mM Natriumchlorid, das 1,0 mM Calcium enthält, mit pH 7. Die Konzentration von Natriumchlorid kann von 75-250 mM reichen. Die Calcium-Konzentration kann von 0,01-5 mM reichen, wobei andere zweiwertige Kationen, die DNase stabilisieren, enthalten sein oder an die Stelle von Calcium treten können. Der pH-Wert kann von 5,5-9,0 reichen, und Puffer, die mit dem enthaltenen zweiwertigen Kationen verträglich sind, können auch verwendet werden. Die Formulierung kann lyophilisiertes Pulver sein, das ebenfalls Calcium enthält.
  • Im Handel erhältliche Zerstäuber für flüssige Formulierungen, z.B. Sprühzerstäuber und Ultraschallzerstäuber, eignen sich zur Verabreichung. Flüssige Formulierungen können direkt zerstäubt und lyophilisiertes Pulver nach Rekonstitution zerstäubt werden. Alternativ dazu kann DNase unter Verwendung einer Fluorkohlenwasserstoff-Formulierung und eines Inhalators mit Zudosierung aerosolisiert oder als lyophilisiertes und gemahlenes Pulver inhaliert werden. Außerdem kann die flüssige DNase-Formulierung direkt in in die Nasotracheal- oder Endotrachealschläuche intubierter Patienten eingeträufelt werden.
  • Die gereingte DNase wird zur enzymatischen Änderung der Viskoelastizität oder Klebrigkeit von Schleim verwendet. Menschliche DNase eignet sich besonders zur Behandlung von Patienten mit Lungenerkrankungen, die abnormale, viskose oder verdickte purulente Sekretionen bei Zuständen wie akuter oder chronischer Bronchopulmonar-erkrankung (infektiöse Lungenentzündung, Bronchitis oder Tracheobronchitis, Bronchiektase, zystische Fibrose, Asthma, TB oder Pilzinfektionen), Atelektase aufgrund von Tracheal- oder Bronchialimpaktion und Komplikationen in Zusammenhang mit Tracheo-stomie aufweisen. Für solche Therapien wird eine Lösung oder ein feinteiliges Trocken-präparat menschlicher DNase in herkömmlicher Weise in die Bronchien eingeträufelt, z.B. durch Aerosolisierung einer DNase-Lösung. Menschliche DNase eignet sich auch als Begleitmaßnahme zur verbesserten Behandlung von Abszessen oder schweren Infektionen in geschlossenem Raum bei Zuständen wie Empyem, Meningitis, Abszeß, Peritonitis, Sinusitis, Otitis, Periodontitis, Perikarditis, Pankreatitis, Cholelithiase, Endokarditis und septischer Arthritis so wie bei topischen Behandlungen einer Reihe entzündlicher und infizierter Läsionen, wie z.B. infizierter Läsionen der Haut und/oder Schleimhäute, chirurgischer Wunden, ulzerativer Läsionen und Verbrennungen. Menschliche DNase ist geeignet, den Fluß in medizinischen Röhrenleitungen aufrechtzuerhalten, die mit einem Körperhohlraum kommunizieren, z.B. in chirurgischen Dränageröhren, Harn-kathetern, periotonealen Dialyseöffnungen und intratrachealen Sauerstoffkathetern. DNase kann die Wirksamkeit von Antibiotika bei Infektionen steigern (z.B. wird die Gentamicin-Aktivität durch reversible Bindung an intakte DNA deutlich-reduziert). Sie kann sich auch als orale Ergänzung in Fällen von Pankreas-Insuffizienz eignen. DNase baut DNA-Kontaminierungsstoffe in pharmazeutischen Präparaten ab: das Präparat wird mit DNase unter Bedingungen zum Abbau der kontaminierenden DNA zu Oligonukleotiden und zur Entfernung von Oligonukleotiden und DNase aus dem Präparat in Kontakt gebracht. Die Verwendung von auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisierter DNase ist zweckmäßig. Schließlich kann DNase bei der Behandlung nichtinfizierter Zustände zur Anwendung kommen, wo eine Ansammlung von Zellbruchstücken einschließlich von zellulärer DNA festgestellt wurde. Beispielsweise würde sich DNase nach systemischer Verabreichung bei der Behandlung von Pyelonephritis und tubulointerstitialen Nierenerkrankungen (z.B. mit blockierten Kanälchen infolge von Zell-bruchstücken), einschließlich von arzneimittelinduzierter Nephropathie oder akuter Tubulärnekrose, eignen.
  • DNase kann auch zusammen mit anderen pharmakologischen Mitteln verabreicht werden, die zur Behandlung der obigen Zustände dienen, z.B. Antibiotika, Bronchodilatoren, entzündungshemmenden Mitteln und schleimlösenden Mitteln (z.B. n-Acetylcystein). Es kann sich auch als zweckmäßig erweisen, DNase gemeinsam mit anderen therapeutischen menschlichen Proteinen wie z.B. Wachstumshormon, Protease-Hemmern, γ-Interferon, Enkephalinase, Lungentensid und koloniestimulierenden Faktoren zu verabreichen.
  • Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte häufig vorkommende Verfahren und/oder Ausdrücke erklärt.
  • "Plasmide" werden mit einem kleingeschriebenen p gekennzeichnet, vor und/oder nach denen Großbuchstaben oder Zahlen stehen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, uneingeschränkt öffentlich erhältlich oder aus verfügbaren Plasmiden im Einklang mit veröffentlichten Vorgangsweisen konstruierbar. Ferner sind gleichwertige Plasmide auf dem Gebiet bekannt und für Fachleute offenkundig.
  • "Spaltung" von DNA bezieht sich auf das katalytische Spalten der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, wobei ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und dergleichen so gewählt wurden, wie es Fach-leute auf dem Gebiet tun würden. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 μl Pufferlösung eingesetzt. Um DNA-Fragmente zur Plasmidkonstruktion zu isolieren, werden typischer-weise 5-50 μg DNA mit 20-250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C sind üblich, können aber je nach Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach der Spaltung wird das Reaktionsgemisch auf einem Polyacrylamidgel einer direkten Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
  • Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt unter Verwendung von 8% Polyacrylamidgel, wie von Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980), beschrieben.
  • "Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, daß die zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments "ringschließen", d.h. eine geschlossene Schleife bilden, was die Insertion eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle beeinträchtigen würde. Die Vorgangsweisen und Reagentien zur Dephosphorylierung sind herkömmlich. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, S. 133-134 (1982). Reaktionen unter Verwendung von BAP er folgen in 50 mM Tris bei 68°C, um die Aktivität von Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang durch-geführt. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment gelgereinigt.
  • "Oligonukleotide" sind entweder ein einstrangiges Polydesoxynukleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynukleotid-Stränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonukleotide besitzen kein 5'-Phosphat und ligieren sich daher an kein anderes Oligonukleotid, ohne mittels ATP in Gegenwart einer Kinase ein Phosphat hinzuzufügen. Ein synthetisches Oligonukletoid ligiert sich an ein Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde.
  • "Ligation" ist das Verfahren zur Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., ebda., S. 146). Falls nicht anders angegeben, kann die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase) pro 0,5 μg etwa äquimolekularer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
  • "Füllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf Vorgangsweisen, durch die das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer mit Restriktionsenzym gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dies eliminiert den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Instrument zur Umwandlung eines restriktionsgespaltenen Endes, das mit jenen Enden kohäsiv sein kann, die nur durch ein oder einige wenige andere Restriktionsenzyme gebildet werden, in einen Terminus, der mit jeder stumpfspaltenden Restriktions-Endonuklease oder einem anderen gefüllten kohäsiven Terminus verträglich ist. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2-15 μg der Ziel-DNA in 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiotreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) bei etwa 37°C in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 μM jedes der vier Desoxynukleosid-triphosphate. Die Inkubation ist im allgemeinen nach 30-minütiger Phenol- und Chloroformextraktion und Ethanolfällung abgeschlossen.
  • Beispiel 1
  • Klonieren von menschlicher pankreatischer DNase I
  • Herstellung einer cDNA-Sammlung
  • Eine menschliche Pankreas-cDNA-Sammlung wurde in λgt10 unter Verwendung polyadenylierter mRNA konstruiert, die aus frisch erhaltener und in flüssigem N2 eingefrorener menschlicher Pankreas stammte (Lauffer et al., Nature 318, 334 [1985]). Unter Verwendung von Oligo dT-Primern und EcoRI-SalI-XhoI-SstII-Adaptern wurde eine cDNA-Sammlung von 0,9 × 106 unabhängigen Isolaten von mehr als 600 bp erhalten.
  • Oligonukleotidsonden
  • Zwei lange Sonden wurden auf der Grundlange der Aminosäuresequenz von Rinder-DNase I synthetisiert. Zwei Segmente der Aminosäuresequenz mit geringer Redundanz wurden ausgwählt, wofür Säugetiercodon-Einsatztabellen verwendet wurden.
    Sonde 1: 5'GTG-CTG-GAC-ACC-TAC-CAG-TAT-GAT-GAT-GGC-TGT-GAG-TCC-TGT-GGC-AAT-GAC 3'(51-mer entsprechend der Sequenz Val-Leu-Asp-Thr-Tyr-Gln-Tyr-Asp-Asp-Gly-Cys-Glu-Ser-Cys-Gly-Asn-Asp).
    Sonde 2: 5'TAT-GAC-GTC-TAC-CTG-GAC-GTG-CAG-CAG-AAG-TGG-CAT-CTG-AAT-GAT-GTG-ATG-CTG-ATG-GGC-GAC-TTC-AAC-GC 3'(71-mer entsprechend der Aminosäuresequenz Tyr-Asp-Val-Tyr-Leu-Asp-Val-Gln-Gln-Lys-Trp-His-Leu-Asn-Asp-Val-Met-Leu-Met-Gly-Asp-Phe-Asn).
  • Isolierung menschlicher DNase I-cDNA-Klone
  • Die beiden Sonden wurden mit T4-Polynukleotid-Kinase und [32P]-Adenosintriphosphat endmarkiert (Maniatis et al., Molecular Cloning, [Cold Spring Harbor Laborstory, 1982]) und getrennt eingesetzt, um die menschliche Pankreas-cDNA-Sammlung un ter relativ schonenden Hybridisierungsbedingungen zu screenen: 20% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyro-phosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C. Waschungen unter relativ schonenden Bedingungen erfolgten in 1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C. Drei (1, 2 und 6) von 600.000 Klonen hybridisierten mit beiden Sonden und enthielten 1,3 kB Inserts. Diese wurden in M13-Vektoren subkloniert (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 [1981]) und nach dem Kettenterminationsverfahren sequenziert (Sanger et al., J. Mol. Biol. 143, 161 [1980]).
  • Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäureseugnez von Klon 6 mit der Aminosäuresequenz von Rinderpankreas-DNase I zeigte starke Homologie. Es fiel jedoch eine große Deletion und eine große Insertion in der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Klon 6 auf. Außerdem enthielt die Insertion einen Stop an ihrer Termination und besaß aufgrund einer fehlgespleißten Message die Eigenschaften eines beibehaltenen Introns. Die Klone 1 und 2 enthielten auch das mutmaßliche Intron.
  • Zwei zusätzliche exakte Nukleotidsonden wurden aus der Sequenz von Klon 6 synthetisiert, um weitere Klone zu erhalten.
    Sonde 4 (N-terminale Sonde): 5'CTG-AAG-ATC-GCA-GCC-TTC-AAC-ATC-CAG-ACA-TTT-GGG-GAG-ACC (42-mer)
    Sonde 5 (mutmaßliche Intronsonde): 5'TCC-GCA-TGT-CCC-AGG-GCC-ACA-GGC-AGC-GTT-TCC-TGG-TAG-GAC (42-mer)
  • Die Sonden wurden mit 32P markiert und dazu verwendet, 1,3 × 106 Klone der menschlichen Pankreas-cDNA-Bibiothek unter sehr rauhen Bedingungen erneut zu screenen: 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 X Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C. Waschungen erfolgten bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS. Vier Klone hybridisierten mit Sonde 4 (N-terminale sonde) und nicht mit Sonde 5 (vermeintliche Intronsonde). Davon wurde Klon 18-1, der gemäß PAGE ein Insert von etwa 1,1 kB enthielt, in M13 subkloniert und sequenziert. Die vollständige Nukleotidsequenz von Klon 18-1 und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz sind in 1 dargestellt.
  • Klon 18-1 besteht aus 1039 bp und besitzt einen langen offenen Leserahmen ohne das Intron von Klon 6. Wie bereits erwähnt, sind zwei mögliche Initiationscodons (ATG) vorhanden (Positionen 160-162 und 169-171). Beide können genutzt werden. Das frühere ATG mit einem Purin an Position -3 entspricht eher der Kozak-Regel (Kozak, Cell 44, 283 [1986]). Zwischen den mutmaßlichen Initiationscodons und den Nukleotiden, die dem N-terminalen Leucin entsprechen (CTG an den Positionen 226-228) sind Nukleotide, die für eine kurze, relativ hydrophobe Aminosäuresequenz (mit einer Länge von 19-22 Aminosäuren) kodieren; eine wahrscheinliche Sekretions-Signalsequenz.
  • Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz menschlicher DNase I mit Rinder-DNase I zeigt starke Aminosäurehomologie (2). Die menschlichen und Rinder-Proteine weisen eine Länge von 260 Aminosäuren und ein N-terminales Leucin auf. Die wichtigsten Strukturmerkmale des Rinderproteins, umfassend die 4 Cysteine (101, 104, 173 und 209), die zwei potentiellen N-gebundenen Glykosylierungsstellen (18 und 106) und die aktive Stelle Histidin (134), sind konserviert. Insgesamt besteht etwa 77% Aminosäure-Identität.
  • Die 6 Bereiche mit höchster Aminosäurediversität (Aminosäurereste 27-39, 83-96, 115-126, 156-161, 219-234 und 243-247) enthalten jeweils mehr als 3 Differenzen, und mehr als 54% der Aminosäuren sind variabel. Interessanterweise sind diese Bereiche bei Vergleich der Rindersequenz mit der Schafs- und Schweinesequenz auch variabel. Einige dieser Bereiche sind gemäß der Röntgenstrahlen-Kristallstruktur von Rinder-DNase (Oefner et al., J. Mol. Biol. 192, 605 [1986]) freiliegende Schleifenstrukturen, wodurch sich vorhersagen läßt, daß sie relativ immunogen sind. Es ist somit wahrscheinlich, daß die Aminosäuredifferenzen zwischen den menschlichen und den Rindersequenzen zu immunologischen Reaktionen führen können.
  • Beispiel 2
  • Assay für DNase-Aktivität
  • Neben dem herkömmlichen ELISA (siehe Beispiel 4) und RIA wurden drei Assays entwickelt, um DNase-Aktivität nachzuweisen.
    • 1. Hydrolyse von 32P-markierter DNA. Radiomarkierte 32P-DNA wurde mit einem einstrangigen M13-Templat, einem 17-mer-Sequenzierprimer, 32P-dCTP, nichtradioaktivem dATP, dTTP und GTP, sowie Klenow hergestellt. Kurz gesagt wurden 1,5λ MgCl2 (35 mM), 1,5λ 10 × Restriktionspuffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,6; 35 mM Dithiothreitol; 1 mM EDTA) und 6λ H2O mit 1λ Templat (etwa 1 μg) und 1,5 Palmer (0,5 μM) vermischt und 7 min lang auf 55°C erhitzt. Ein Nukleotid-Gemisch wurde gebildet, indem 40λ 32P-dCTP (sp. Akt. 3.000 Ci/mMol; 400 μCi) plus jeweils 1λ von 2 mM Stammlösungen von radioaktivem dATP, dTTP und dGTP bis zur Trockenheit eingedampft und die Nukleotide in 7λ 1X Restriktionspuffer rekonstituiert wurden. Das Nukleotid-Gemisch und 1λ Klenow wurden dem Templat-Primer-Gemisch zugegeben und das Reaktionsgemisch bei 37°C inkubiert. Nach 15 mm wurden 2λ eines nicht-radioaktiven Desoxynukleotids zugegeben und die Inkubation weitere 15 mm lang fortgesetzt. Radiomarkierte DNA wurde dann mittels Zentrifugation durch Sephadex G-50 von freien Nukleotiden abgetrennt (Maniatis et al. [1982]). DNase-Aktivität wird durch Inkubieren von Proben mit 100.000 cpm 32P-DNA plus 80 μg/ml nicht-radioaktiver Lachssperma-DNA in DNase-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7, 4 mM MgCl2, 4 mM CaCl2) 45 mm lang bei 37°C gemessen. Die Reaktion wird durch Zugabe des halben Volumens an nicht-radioaktiver DNA (2 mg/ml) und des gleichen Volumens an eiskalter 20%-iger Trichloressigsäure abgebrochen. Nach 10 mm bei 4°C wird das Gemisch bei 12.000 g × 10 mm zentrifugiert und eine Aliquote des Überstands gezählt. Das Vorliegen von "säurelöslichen Counts" im Überstand zeigt DNase-Aktivität an. Jeden Tag wird eine Standardkurve erstellt, indem 0,1-200 ng Rinder-DNase I (Sigma D-5025) getestet werden.
    • 2. Agarplatten-DNase-Assay. Smith, Hankock und Rhoden (Applied Microbiology, 18, 991 [1969]) beschrieben ein Testagar, das Methylgrün und DNA enthält, um DNase-Aktivität von Mikroorganismen zu bestimmen. Dieser Assay wurde modifiziert, um einen raschen, halbquantitativen Assay für lösliche DNase-Aktivität zu entwickeln, sodaß Zellüberstände zwecks Überwachung der Expression und Säulenfraktionen zwecks Überwachung der Reinigung gescreent werden können. Um das Agar herzustellen, wird Bactoagar (7,5 g) in 500 ml Puffer (25 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 0,1% Natriumacid) geschmolzen. Lachssperma-DNA (1,0 g) und Methylgrün (17,5 mg) werden zugegeben. Nach ein- bis zweistündigem Rühren bei 55°C und Autoklaven-behandlung wird es auf Platten gegossen und bei 4°C gelagert. DNase-Aktivität wird durch Aufträufeln von 0,5-5λ Aliquoten auf die Platten gemessen, die dann bei Raum-temperatur oder 37°C 4-48 Stunden lang inkubiert werden. Eine Standardkurve wird durch Messen von 0,1-1.000 ng Aliquoten Rinder-DNase I erstellt. DNase wird durch die Größe der klaren Zonen im Agar problemlos gemessen, wobei eine logarithmische Beziehung zwischen DNase-Konzentration und Durchmesser der klaren Zonen besteht. Dieses Assayformat ist auch auf die rasche Identifikation stark exprimierender, DNase produzierender Klone anwendbar, entweder um DNase zu erzeugen oder um Transformanten zu screenen, worin die DNase als selektierbarer Marker oder als Reporter-Gen eingesetzt wird. Neben der Verwendung von Methylgrün und DNA in einem Agarplattenformat werden diese Reagentien auch in einem wäßrigen Format (z.B. 96-Napf-Platten) verwendet, um DNase-Aktivität rasch, sensitiv und spezifisch zu quantifizieren.
    • 3. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Xymographie. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Xymographie erfolgten durch eine Modifikation der Vorgangsweise von Rosenthal und Lacks (Anal. Biochem. 80, 76 [1977]). Kurz gesagt wurde das Puffer-system von Laemmli verwendet, um 12% Polyacrylamidgele herzustellen. Lachssperma-DNA (10 μg/ml) und EDTA (2 mM) wurden sowohl dem Stapel- als auch dem Auflösungsgel vor der Polymerisation zugegeben. Proteine wurden in Pro benpuffer suspendiert und vor Aufbringung auf die Gele 3 min lang auf 100°C erhitzt. Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur bei konstantem Strom. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Wasser gespült und in 250 ml 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 0,02% Azid inkubiert. Nach 1 Stunde wurde frischer Puffer zugegeben und das Gel 12 h lang bei 24°C eingeweicht. Um DNase-Aktivität zu bestimmen, wurde das Gel in frischen Puffer eingebracht, der 2 mM CaCl2 und 1 μg/ml Ethidiumbromid enthielt, und anschließend unter kurzwelligem UV-Licht in Intervallen von 5 min bis zu 24 h unter-sucht. Zum Abbruch der Reaktion wird EDTA zugegeben (Endkonzentration 15 mM) und das Xymogramm fotografiert. Das Gel kann dann durch Coomassieblau proteingefärbt werden.
  • Beispiel 3
  • Expression von menschlicher DNase 1
  • 1. pRK.DNase.7
  • Plasmid pRK.DNase.7 wurde wie folgt aus dem oben beschriebenen Klon 18-1 konstruiert:
    Das Plasmid pRK5 wurde mit EcoRI gespalten, dephosphoryliert und Fragment I, das den Großteil des Plasmids umfaßt, isoliert. pRK5 wird von Suva et al., Science 237, 896 (1987); und EP-A-307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989, beschrieben, wobei das pCIS2.8c28D-Ausgangsplasmid in EP-A-278.776 vom 17. August 1988 beschrieben ist. Der λ-DNase-Klon 18-1 wurde mit EcoRI gespalten und das Insert (Fragment 2) isoliert. Fragment 1 und Fragment 2 wurden ligiert und das Ligationsgemisch in E. coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medium-Platten aufgebracht, und resistente Kolonien wurden selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht.
  • pRK.DNase.7 wurde zur vorübergehenden und dauerhaften Expression in menschliche Embryonieren-293-Zellen transfiziert. Zur vorübergehenden Expression menschlicher DNase I wurden 60 mm Platten konfluenter HEK-293-Zellen (50%) transfiziert (siehe Eaton et al., 1986); dabei kam das Calciumphosphat-Verfahren (Wigler et al., 1979) zur Anwendung. Zur dauerhaften Expression menschlicher DNase I wurden HEK-293-Zellen in ähnlicher Weise gleichzeitig mit pRK.DNase.7 und einem Plasmid transfiziert, das das Neomycinresistenz-Gen pRSV neo exprimiert (Gorman et al., 1985). Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Standardmedium (1:1 F12/DME, ergänzt mit L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10% FBS) mit 0,5 mg/ml G418 (Genticinsulfat; Gibco) zur Selektion dauerhafter Linien übergeführt.
  • Die Analyse von Überständen von 293-Zellen, die entweder vorübergehend oder dauerhaft mit dem DNase-Plasmid transfiziert waren, zeigte 0,2-1,0 μg/ml DNase-Aktivität (gemessen entweder mittels 32P-DNA-Hydrolyseassay oder den Grünagarplatten-DNase-Assay. Die Analyse der transfizierten Zellüberstände mittels SDS-PAGE und Xymographie zeigte eine neue Proteinbande bei etwa 35-37 kD mit DNase-Aktivität. Zusätzliche Untersuchungen zeigten, daß die rekombinante menschliche DNase I, die in 293-Zellen produziert wurde, Calcium für Aktivität benötigte, durch EDTA, Wärme und Actin gehemmt wurde und eine höhere Aktivität für doppelstrangige DNA als für einstrangige DNA aufwies. Die spezifische Aktivität menschlicher, in 293-Zellen exprimierter DNase schien mit jener von Rinder-DNase vergleichbar zu sein.
  • 2. pSVeDNaseDHFR3
  • pSVeDNAseDHFR3, ein Plasmid, das sich zu rekombinanten Synthese menschlicher DNase I in CHO-Zellen eignet, wurde wie folgt konstruiert:
    Ein Zwischenplasmid wurde konstruiert, um einen redundanten Polylinkerbereich zu entfernen. Plasmid pRK.DNase.7 wurde mit EcoRI und SphI gespalten und das größte Fragment, das den 5'-Teil des DNase-Kodierbereichs enthielt, isoliert (Fragment 3). Plasmid pRK-DNase.7 wurde mit SalI gespalten, mit Klenow abgestumpft, mit SphI gespalten und das mittelgroße Fragment, das den 3'-Teil des DNase-Kodierbereichs enthielt, isoliert (Fragment 4). pRK5 wurde mit SmaI und EcoRI gespalten und das Fragment, das den Großteil des Plasmids umfaßte, isoliert (Fragment 5). Die Fragmente 3, 4 und 5 wurden ligiert und das Gemisch in E. coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Das resultierende Plasmid wird als pRKDNaselnt bezeichnet.
  • Plasmic pE342HBV.E400D22 (Crowley et al., Mol. Cell Biol. 3, 44 [1983]) wurde mit EcoRI und PvuI gespalten und das kleinste Fragment, das den frühen SV40-Promotor und einen Teil des β-Lactamase-Gens enthielt, isoliert (Fragment 5). Plasmic pE342HBV.E400D22 wurde auch mit BamHI und PvuI gespalten und das Fragment, das den Groß-teil des Plasmids umfaßte, das den Rest des β-Lactamase-Gens sowie den frühen SV40-Promotor und das DHFR-Gen enthielt, isoliert (Fragment 6. Plasmid pRKDNaselnt wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und das DNase-Kodierfragment isoliert (Fragment 7). Die Fragmente 5, 6 und 7 wurden ligiert und das Gemisch in E. coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments unter-sucht. Das resultierende Plasmid wird als pSVeDNaseDHFR3 bezeichnet.
  • Zur dauerhaften Expression menschlicher DNase I unter Verwendung des obigen Plasmids wurden 60 mm-Platten konfluenter CHO-Zellen (DP-7) nach dem Calciumphosphat-Verfahren transfiziert und anfänglich in selektivem Medium gezüchtet. Es wurden unamplifizierte Zellinien gezüchtet, deren Medium etwa 0,02-0,1 μg/ml DNase-Aktivität enthält (gemessen entweder mittels 32P-DNA-Hydrolyseassay oder den Grünagarplatten-DNase-Assay. Man kann erwarten, daß höhere Expressionswerte (zumindest 5 x) erzielt werden könnten, falls diese Zellen in einem Fermentor zu hohen Dichten gezüchtet werden würden. Einzelne Klone wurden nach ihren je weiligen DNase-Expressions-werten selektiert, um stark sekretierende Zellen zu selektieren, und danach jeder selektierte Klon in Gegenwart steigender MTX-Konzentrationen (12,5-2.000 nM) amplifiziert.
  • 3.pDNA11
  • Ein Plasmid wurde konstruiert, das sich zur rekombinanten Synthese von DNase in E. coli als sekretiertes Protein eignet. Dieses Plasmid wird als pDNA11 bezeichnet und wurde wie folgt konstruiert:
    Plasmid pTF.III ( EP-A-278.776 ) wurde mit NsiI und SalI gespalten und das größte Fragment, das den Großteil des Plasmids umfaßte, isoliert (Fragment 8). Das Plasmid pRKDNase7 wurde mit SalI und BstXI gespalten und das 798 bp-Fragment, das den Großteil des Kodierbereichs umfaßte, isoliert (Fragment 9). Zwei synthetische Oligonukleotide wurden synthetisiert:
    DLink 1: 5'TTG-AAG-ATC-GCA-GCC-TTC-AAC-ATC-CAG-ACA-T (31-mer)
    DLink 3: 5'CTG-GAT-GTT-GAA-GGV-TGC-GAT-CTT-CAA-TGC-A (31-mer).
  • Die Fragmente 8 und 9 und die synthetischen Oligonukleotide Dlink 1 und Dlink 3 wurden ligiert und das Gemisch in E. coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medium-Platten aufgebracht, und resistente Kolonien wurden selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhlten und durch Restriktions-analyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments und die Bewahrung der NsiI- und BstXI-Restriktionsstellen untersucht. Mehrere Plasmide wurden sequenziert, um den Einbau korrekter synthetischer DNA zu bestätigen. 294-Zellen, die mit pDNA11 transformiert worden waren, exprimierten > 500 mg/l zweier neuer Hauptproteine, wie mittels SOS-PAGE festgestellt: eine Hauptbande bei etwa 32 kD und eine Nebenbande bei etwa 30 kD. Die Aminosäuresequenz-Analyse der zwei Banden zeigte N-terminale Sequenzen von Met-Lys-Lys-Asn-Ile-Ala bzw. Leu-Lys-Ile-Ala-Ala-Phe. Somit stellt die Bande mit höherem Molekulargewich unverarbeitete menschliche DNase und die Bande mit niedrigerem Molekulargewicht korrekt verarbeitete native menschliche DNase dar.
  • In E. coli exprimierte menschliche DNase ist aktiv. 294-Zellen, die mit pDNA11 transformiert und auf mit Calcium, Magnesium und wenig Phosphat ergänzten Agarplatten gezüchtet wurden, zeigten Sekretion aktiver DNase, wie anhand der Gegenwart einer klaren Zone zu erkennen, welche die transformierten Zellen, Vergleichszellen jedoch nicht umgibt. Außerdem wurden transformierte, mit SDS und β-Mercaptoethanol solubilisierte Zellen in SDS-PAGE-Gele laufen gelassen und Xymographie durchgeführt. DNase-Aktivität wurde mit der Bande korrekt verarbeiteter menschlicher DNase, nicht jedoch mit unverarbeiteter menschlicher DNase assoziiert.
  • 4. pDNA2
  • Ein Plasmid wurde zur rekombinanten Expression menschlicher DNase I als intrazelluläres Protein in E. coli konstruiert. Das Plasmid trägt den Namen pDNA2 und wurde wie folgt konstruiert:
    Plasmid pHGH207/307 wurde aus pHGH207 ( US-A-4.663.283 ) durch Entfernen der EcoRI-Stelle stromauf vom trp-Promotor (EcoRI-gespalten, abgestumpft und erneut ligiert) hergestellt.
  • Plasmid pHGH207/307 wurde mit XbaI und SalI gespalten und das größte Fragment, das den Hauptteil des Plasmids umfaßte, isoliert (Fragment 10). Plasmid prK.dNase.7 wurde mit SalI und BstXI gespalten und das 798 bp-Fragment, das den Großteil des Kodierbereichs umfaßt, isoliert (Fragment 9). Zwei synthetische Oligonukleotide wurden synthetisiert:
    DLink 4: 5'CTAGAATTATG-TTA-AAA-ATT-GCA-GCA-TTT-AAT-ATT-CAA-ACA-T (42-mer)
    DLink 5: 5'TTG-AAT-ATT-AAA-TGC-TGC-AAT-TTT-TAACATAATT (34-mer)
  • Die Fragmente 9 und 10 und die synthetischen Oligonukleotide DLink 4 und Dlink 5 wurden ligiert und das Gemisch in E. coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medium-Platten aufgebracht, und resistente Kolonien wurden selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktions-analyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments und die Bewahrung der XbaI- und der BstXI-Restriktionsstelle untersucht. Verschiedene Plasmide wurden sequenziert, um den Einbau korrekter synthetischer DNA zu bestätigen.
  • 294-Zellen, die mit pDNA2 transformiert worden waren, exprimierten ein neues Haupt-Protein, wie mittels SDS-PAGE bei etwa 30 kD festgestellt. Die Aminosäuresequenz-Analyse des Proteins zeigte die N-terminale Sequenz Met-Leu-Lys-Ile-Ala-Ala-Phe, die menschlicher Met-DNase entsprach.
  • In E. coli direkt exprimierte menschliche Met-DNase ist auch aktiv. Transformierte, mit SDS und β-Mercaptoethanol solubilisierte Zellen wurden in SDS-PAGE-Gele laufen gelassen und Xymographie durchgeführt. DNase-Aktivität wurde mit der Bande menschlicher Met-DNase assoziiert.
  • Beispiel 4
  • Weitere Analyse der DNase-Expression
  • a. DNase-Expressionsvektoren
  • Die menschliche Pankreas-Desoxyribonuklease (DNase) I-cDNA aus Plasmid pRK. DNase.7 (siehe oben), die das gesamte Insert von DNase-cDNA-Klon 18-1 enthielt, das aus einer menschlichen Pankreas-λgt10-cDNA-Sammlung in Vektor pRK5 isolied wurde, wurde in pRK5 übertragen, um den Zwischen-Expressionsvektor pRK-DNase.3 zu bilden. In diesem Plasmid (pRK.DNase.3) wird DNase-Synthese duch die CMV-Transkriptionsregulator-Elemente gesteuert. Eine weiter unten beschriebene Spleißeinheit befindet sich zwischen den Transkriptions- und Translationsinitiationsstellen. Zur Erzeugung von DNase-Expressionsvektoren wurden die CMV- Transkriptionsregulator-Sequenzen und die Spleißeinheit von pRK.DNase.3 mit den SV40-Transkriptionsregulator-Sequenzen und unterschiedlichen Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheiten (siehe unten) ersetzt. Zu Vergleichszwecken wurde auch ein entsprechender Vektor gebildet, der die Spleißeinheit nicht aufwies (pSve.DNase).
  • 1. pRK.DNase.3
  • Vektor pRK.DNase.3 (3) wurde wie folgt konstruiert: pRK5 wurde mit SmaI und SalI gespalten, die ausschließlich im Polylinkerbereich zwischen der 5'- und 3'-Steuer-sequenz spalteten, und das große Fragment isoliert. Der pRK5-Vektor enthält einen Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Bereich stromauf von einem Kodierbereich und stromab von einem Promotor, wo der Intronbereich aus einem unmittelbar frühen Cytomegalovirus-(CMV-)Spleißdonor und Intronsequenzen, einem Bakteriophagen-SP6-Promotor-Insert und einem variablen Immunglobulin-(Ig-)Schwerkettenbereich-(VH-)Intron und Spleißakzeptor-Sequenzen besteht. Vektor pRK-DNase.7 wurde mit BsmI gespalten, die hervorstehenden 3'-Enden wurden mit T4 DNA-Polymerase verkürzt und das Material mit SalI erneut ligiert, um die gesamte menschliche DNase I-Kodiersequenz als 921-nt-Fragment freizusetzen. Nach Gelisolierung wurde dieses Fragment an das große pRK5-Fragment unter Verwendung herkömmlicher Ligationsverfahren (Maniatis et al., 1982, s.o.) ligiert, um den Vektor pRK-DNase.3 zu bilden.
  • pRK.DNase.3 enthält CMV-Transkriptionsregulator-Elemente und eine Spleißeinheit, die sich zwischen der Transkriptions- und Translationsinitiationsstelle befindet ("Intron" in 3). In diesem Vektor ist die Spleißeinheit des pRK5-Vektors ohne jegliche Modifikationen vorhanden.
  • 2. pSVe.DNase
  • Vektor pSVe.DNase wurde wie folgt konstruiert (3): Die Regulatorsequenzen vor dem DNase-Kodierbereich in Vektor pRK.DNase.3 wurden vom Rest des Vektors durch Spaltung mit SstI und ClaI abgetrennt; DNA, die aus dam+-Bakterien-Wirtszellen stammte, diente dazu, das Spalten der zweiten ClaI-Stelle im Vektor, die sich in Richtung des 3'-Endes des frühen SV40-Polyadenylierungsbereichs befand, zu verhindern. Das größte Fragment, das den 5'-Kontrollbereich nicht aufwies, wurde gelisoliert.
  • DHFR-Expressionsvektor pE348DHFRUC diente als Quelle der SV40-Transkriptions-Regulatorsequenzen. Der Vektor pE348DHFRUC (Vannice und Levinson, J. Virology, 62, 1305-1313, 1988, wo er als pE bezeichnet wird, 1) enthält den SV40-Enhancer und frühen Promotorbereich stromauf von der HindIII-Stelle, einschließlich der frühen SV40-Stellen der Transkriptionsinitiation (Position 5171 im Virus), vor cDNA, die für Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) kodiert, an die sich das 584 bp-Heptatitis B-Virus-(HBV-)PolyA-Signal in Plasmid pML1 von der GamHI- bis zur BGIII-Stelle von HBV anschließt. Dieses Plasmid enthält einen Polylinker unmittelbar stromauf von den SV40-Sequenzen. Die SV40-Transkriptions-Regulatorsequenzen wurden durch Spaltung mit SstI und ClaI freigesetzt und die resultierenden hervorstehenden 5'-Enden unter Verwendung von Klenow-poll in Gegenwart aller vier Desoxyribunukleotide (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, TTP) gefüllt. Nach anschließender Spaltung mit XbaI wurden die SV40-Transkriptions-Regulatorsequenzen (Enhancer und früher Promotor, einschließlich der frühen SV40-Stellen der Transkriptionsinitiation), die auf dem kleineren XbaI-ClaI-Fragment (360 Nukleotid) vorhanden waren, gelisoliert.
  • Das eben beschriebene kleinere Fragment von pE34DHFRUC wurde gelisoliert und an das große pRK.DNase.3-Fragment ligiert, um Vektor pSVe-DNase zu bilden. In diesem Vektor wird DNase-Synthese durch die SV40-Transkriptions-Kontrollsequenzen gesteuert, doch keine Spleißeinheit ist zwischen ihnen und dem DNase-Kodierbereich vorhanden.
  • 3. pSVI.DNase
  • Vektor pSVI-DNase (4) wurde nach der Insertion der DNase-Kodiersequenz in ein Zwischenplasmid, pRK5.SVe, hergestellt. Das Zwischenprodukt entstand durch Ersetzen der pRK5 CMV-Transkriptions-Regulatorelemente, die zwischen SpeI- und SacII-Restriktionsstellen lagen, mit dem kleinen XbaI-HindIII-Fragment aus pE348DHFRUC, das den frühen SV40-Promotor und Enhancer enthielt. Die vorstehenden 3'-Enden, die durch SacII-Spaltung von pRK5 erhalten wurden, wurden mit T4 DNA-Polymerase verkürzt, und die vorstehenden 5'-Enden, die aus HindIII-Spaltung von pE348DHFRUC resultierten, wurden unter Verwendung von T4-Polymerase in Gegenwart aller vier dNTPs gefüllt.
  • Zur Konstruktion von pSVI-DNase wude die DNase-Kodiersequenz vom Vektor pRK.DNase.3 durch Spaltung mit EcoRI und HindIII isoliert und in das große Fragment von pRK5.Sve insertiert, das nach Spaltung mit den gleichen beiden Enzymen isoliert worden war. Vektor pSVI.DNase enthält die SV40-Transkriptions-Regulatorelemente (Enhancer und früher Promotor, einschließlich der fühen SV40-Stellen der Transkriptionsinitiation) und mRNA-Kappstellen, gefolgt von der Spleißdonor-Intron-Spleißakzeptor-Einheit des pRK5-Vektors ohne jegliche Modifikationen, dem frühen SV40-Polyadenylierungs-("PolyA"-)Bereich und den SV40-Replikationsursprungs("ori"-)Bereichen von SV40.
  • Die vollständige Nukleotidsequenz von pSVI.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, den sie nicht einschließt, ist in 6 dargestellt.
  • 4. pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase und pSVI6B.DNase
  • Die Vektoren pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase und pSVI6B.DNase wurden konstruiert (5), indem jeweils zwei Fragmente rekombiniert wurden. Das erste war das große pRK.DNase.3-Fragment, das aus der Spaltung mit EcoRI, Behandlung mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von dNTPs und anschließende Spaltung mit SstI erhalten wurde; das zweite war in jedem Fall das kleine Fragment, das die SV40-5'-Regulatorsequenzen und eine modifizierte Spleißeinheit enthielt.
  • Modifikationen an Spleißeinheiten zur Steigerung rekombinanter Expression in Säuge-tierzellen sind auf dem Gebiet bekannt. 11 zeigt eine schematische Darstellung der Nukleotidsequenzen der Spleißeinheit, die an der Herstellung der Vektoren dieses Beispiels beteiligt sind, d.h. SVI, SVI2, SVI3, SVI5 und SVI6B. Die Kästchen stellen Änderungen gegenüber der SVI-Sequenz dar, die doppelte Unterstreichung ist ein ungewolltes ATG-Codon, die Unsterstreichung zeigt ungewollte Spleißstellen und Bereiche mit hinzugefügter oder geänderter Verzweigungspunkt-Sequenz (BPS), die Sequenz-Unter-brechungen stellen Deletionen der Nukleotide für SVI3-SVI5 dar, die "..."-Kennzeichnung gibt eine nicht dargestellte Sequenz an, und die Dreiecke zeigen die 5'- und 3'-Spaltstellen innerhalb des Spleißdonors bzw. Spielßakzeptors der Spleißeinheit. Diese Sequenzen können nach bekannten Verfahren der Proteinsynthese oder durch herkömmliche Modifikationen der pSVI-Sequenz hergestellt werden.
  • Die 7-10 zeigen die vollständigen Nukleotidsequenzen von PSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase und pSVI6B.DNase bis zum Kodierbereich von DNase, den sie aber nicht einschließen. Die Spleißeinheitsequenzen aus 11 sind in den 7-10 enthalten.
  • b. Vorübergehende DNase-Expression
  • Vorübergehende Expression, die durch die unterschiedlichen DNase-Vektoren gesteuert wurde, wurde nach Transfektion in CHO-dhfr--Zellen analysiert. Zellen wurden durch eine Modifikation des DEAE-Dextran-Verfahrens und Mengen von DNase, die im Zell-medium 36 bis 48 Stunden nach der Transfektion akkumulierten, transfiziert. Etwa 4 × 105 Zellen wurden pro Napf in 6-Napf-35 mm-Kulturschalen eingebracht. Am folgenden Tag wurde das Volumen von 2 μg DNase-Expressionsvektor durch Zugabe von TBS (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM Na2PO4, 24,7 mM TrisHCl, 1,35 mM CaCl2, 1,05 mM MgCl2, pH 7,5) auf 15 μl eingestellt. 30 μl DEAE- Dextran (10/mg/ml) und 2 ml serumfreies Kulturmedium mit 100 μM Chlorochin wurden dann zugegeben. Das Zellmedium wurde entfernt, die Zellen wurden einmal mit PBS (phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,5) gespült, und das DNA-Gemisch wurde zugegeben. Danach erfolgte 2-3 Stunden später ein Glycerinschock, und die Zellen wurden mit 2 ml herkömmlichem Wachs-tumsmedium bedeckt, bis der Assay erfolgte. Die DNase-Vektoren wurden mit 2 μg eines Vergleichsplasmids, pRSV.hGH, cotransfiziert, das die Expression des menschlichen Wachstumshormon-(hGH-)Gens steuert, das durch die Transkriptions-Regulator-sequenzen in der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous-Sarcomavirus gesteuert wird. Dieses Plasmid kann dann gebildet werden, indem der ras-Promotor von rasP.hGH (beschrieben von Cohen und Levinson, Nature 334, 119-124 [1988]) durch den RSV-Promotor ersetzt wird. Die Menge an in jedem Fall synthetisiertem hGH diente als Standard, um einen präziseren Vergleich der DNase-Mengen zu ermöglichen, die in den unterschiedlichen Transfektionen erhalten wurden. Nachstehend sind die Werte von DNase und hGH angeführt, die in einem typischen Versuch mit Doppelbestimmung erzielt wurden.
    (korrigiert)
    Vektor ng/ml DNase ng/ml hGH ng/ml DNase
    Versuch 1 Versuch 2 Versuch 1 Versuch 2 Versuch 1 Versuch 2
    pSVe.DNase 19,7 17,4 50,1 42,0 8,6 9,2
    pSVI.DNase 17,9 13,8 29,7 20,4 12,8 14,7
    pSVI2.DNase 34,2 30,5 41,9 40,3 18,0 17,0
    pSVI3.DNase 37,8 28,7 45,2 40,5 18,0 15,1
    pSVI5.DNase 28,4 22,1 37,2 28,7 16,7 17,0
    pSVI6B.DNase 28,5 31,0 61,3 67,5 10, 12,2
  • DNase-Werte im Medium wurden durch einen herkömmlichen ELISA unter Verwendung von Serum aus Hasen gemessen, die entweder mit menschlicher DNase oder Rinder-DNase und Adjuvans injiziert wurden (Practice and Theory of Enzyme Immuno-assays, P. Tijssen, Kapitel 5, "Production of Antibodies", S. 43-78 (Elsevier, Amsterdam 1985)). hGH-Werte wurden mittels eines im Handel erhältlichen Assay sets (IRMA, immunradiometrischer Assay) von Hybritech, Inc., La Jolla, CA, bestimmt.
  • Die Daten in der letzten Spalte legen nahe, daß die durch die Vektoren pSVI2.DNase, pSVI3.DNase und pSVI5.DNase gesteuerte DNase-Expression etwas stärker ist als jene, die mit dem Stammvektor pSVI.DNase erzielt wird. Die Zahlen in der ersten Spalte zeigen signifikantere Unterschiede, die nun auch für pSVI6B.DNase gelten. Obwohl man meinen könnte, daß die dritte Spalte die zuverlässigeren Daten enthält, ist es nicht sicher, ob eine effiziente hGH-Synthese keinen negativen Einfluß auf das Ausmaß der DNase-Synthese ausübt. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, kann man feststellen, daß die Expression bei diesem Wert wahrscheinlich zu Kompetition um Komponenten im Sekretions-Weg und folglich zu reduzierten DNase-Mengen führt, wenn die hGH-Expression stark ist. Andere kompetitive Effekte können die Ergebnisse ebenfalls in eine Richtung lenken, sodaß die erste Spalte mit Daten durchaus die tatsächlichen Unterschiede in der Expressionsfähigkeit unter den verschiedenen DNase-Vektoren darstellen könnte. In beiden Fällen ist klar, daß zumindest einige der Vektoren, die eine modifizierte Spleißeinheit enthalten, höhere Mengen an DNase in einem vorübergehenden Assay exprimieren als der entsprechende Vektor, der die ursprüngliche Spleißeinheit besitzt.
  • c. Dauerhafte DNase-Expression
  • 2 μg von Plasmid pSVe.DNase, pSVI.DNase, pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase oder pSVI6B.DNase wurden in CHO-dhfr--Zellen in einer 60-mm-Schale mit 0,1 μg pFD11 transfiziert. Nach 2 Tagen wurden die Zellen zu 90% und 10% in 10-cm-Schalen aufgeteilt. Wenn Kolonien auftraten, wurden sie gezählt und als Mischkolonien untersucht. Pro Zelle wurden Assays in Doppelbestimmung durchgeführt (in nachstehender Tabelle als A oder B bezeichnet), außer bei pSVI2.DNase, das einmal gemessen wurde. In diesem Assay wurde die Zellinie auf 2 × 105 Zellen/Napf in einer 6-Napf-Schale in 3 ml eingestellt. 3 Tage später wurden die Zellen gezählt und das Medium unter Anwendung des oben beschriebenen DNa se-ELISA in einem Bereich von 0,2 bis 25 ng/ml untersucht. Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Vektor pg/Zelle/Tag DNase
    A B
    pSVe.DNase 0,057 0,040
    pSVI.DNase 0,079 0,016
    pSVI2.DNase 0,067
    pSVI3.DNase 0,048 0,043
    pSVI5.DNase 0,014 0,005
    pSVI6B.DNase 0,039 0,062
  • Beispiel 5
  • Senkung der Viskosität in eitrigem Sputum durch rekombinante menschliche DNase
  • Der Einfluß rekombinanter menschlicher DNase I und reiner Rinder-DNase I (Worthington) auf eitriges Sputum eines Patienten mit zystischer Fibrose wurde unter Verwendung eines einfachen Fließfähigkeitsassays untersucht. Zusammenfassend gesagt wurden Proben mit etwa 100 μl Sputum in Eppendorf-Reagenzgläsern inkubiert. Nach verschieden langen Zeiträumen bei 37°C wurden die Gläser umgedreht und die Fähigkeit des Sputums, an der Seite des Reagenzglases herunterzufließen, auf einer Skala auf 0 (keine Bewegung) bis 5+ (ungehindertes Herunterfließen entlang des Reagenzglases) bewertet. Während 293-Überstände aus mit menschlicher DNase I transfizierten Zellen nach 30-minütiger Inkubation eine Änderung von 4-5+ herbeiführten, hatten untransfizierte Zellüberstände keine Auswirkungen. Die Spezifität wurde bestätigt, indem gezeigt wurde, daß EDTA (hemmt Rinder- und menschliche DNase) die 293-Überstände aus mit menschlicher DNase I transfizierten Zellen vollkommen daran hinderte, Sputum eines Patienten mit zystischer Fibrose zu verflüssigen. Außerdem wurden die Wirkungen von Sputum auf Rinder-DNase, die rein und frei von Proteasen war, erstmals unteruscht. Bereits veröffentlichte Berichte verwendeten alle Rinder-DNase, die den Berichten zufolge mit signifikanten Mengen an Chymotrypsin und Trypsin kontaminiert war, mit Proteinen also, die selbst auf Sputum einwirken. Reine Rinder-DNase I, frei von Proteasen, verflüssigte eitriges Sputum rasch. Somit ist reine DNase alleine wirkungsvoll, die Viskosität von Sputum zu senken.

Claims (11)

  1. Isolierte DNA, die für ein Polypeptid kodiert, welches die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz reifer menschlicher DNase umfasst.
  2. Isolierte DNA, die für ein Polypeptid kodiert, welches eine Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvariante der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz reifer menschlicher DNase umfasst, wobei die Variante DNase-Aktivität aufweist und bei Menschen nicht immunogen ist.
  3. Isolierte DNA, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz reifer menschlicher DNase ist, mit Ausnahme einer einzigen Aminosäuresubstitution an einem Rest der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz reifer menschlicher DNase.
  4. DNA nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welche die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, die für die Aminosäuresequenz reifer menschlicher DNase kodiert.
  5. Rekombinanter Expressionsvektor, welcher DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
  6. Verwendung eines von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodierten Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduktion der Viskoelastizität einer Akkumulation von purulentem Material bei einem Patienten.
  7. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodierten Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von zystischer Fibrose.
  8. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodierten Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Steigerung der Aktivität von Antibiotika.
  9. Verwendung eines von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodierten Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Aufrechterhaltung des Flusses eines Fluids in einer mit einer Körperhöhle eines Patienten kommunizierenden Röhre durch Kontakt mit dem Inneren der Röhre.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, worin das Polypeptid mit DNase-Aktivität kovalent an die Röhre gebunden ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, worin das Arzneimittel eine Lösung des Polypeptids mit DNase-Aktivität zum Leiten durch die Röhre in die Körperhöhle ist.
DE68929551T 1988-12-23 1989-12-20 Menschliche DNase Expired - Lifetime DE68929551T2 (de)

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US28995888A 1988-12-23 1988-12-23
US44803889A 1989-12-08 1989-12-08
US448038 1989-12-08
US289958 1994-08-12

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