JP2001157580A - 組換えヒトｄｎアーゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えヒトＤＮアーゼの提供。
【解決手段】 ヒトＤＮアーゼをコードしている核酸に
よって宿主細胞を形質転換し、得られた宿主細胞を培養
してＤＮアーゼを培養物中に蓄積させ、その培養物から
組換えヒトＤＮアーゼを回収する。
よって宿主細胞を形質転換し、得られた宿主細胞を培養
してＤＮアーゼを培養物中に蓄積させ、その培養物から
組換えヒトＤＮアーゼを回収する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換えヒトＤＮア
ーゼに関する。
ーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮアーゼ(ＤＮase)は、ポリデオキシ
リボ核酸を加水分解することのできるホスホジエステラ
ーゼである。これはＤＮＡを膨大にかつ非特異的に分解
するので、この意味から比較的限定された配列特異的な
制限エンドヌクレアーゼとは区別されている。本発明は
主としてＤＮアーゼＩおよびIIに関する。ＤＮアーゼＩ
は中性付近に至適pＨを有し、二価カチオンが必須であ
り、ＤＮＡの加水分解に際しては５'-リン酸ヌクレオチ
ドを生じさせる。ＤＮアーゼIIの至適pＨは酸性であ
り、二価カチオンにより活性化され得、ＤＮＡの加水分
解に際して３'-リン酸ヌクレオチドを生じさせる。ＤＮ
アーゼＩおよびIIの多重分子型も知られている。
リボ核酸を加水分解することのできるホスホジエステラ
ーゼである。これはＤＮＡを膨大にかつ非特異的に分解
するので、この意味から比較的限定された配列特異的な
制限エンドヌクレアーゼとは区別されている。本発明は
主としてＤＮアーゼＩおよびIIに関する。ＤＮアーゼＩ
は中性付近に至適pＨを有し、二価カチオンが必須であ
り、ＤＮＡの加水分解に際しては５'-リン酸ヌクレオチ
ドを生じさせる。ＤＮアーゼIIの至適pＨは酸性であ
り、二価カチオンにより活性化され得、ＤＮＡの加水分
解に際して３'-リン酸ヌクレオチドを生じさせる。ＤＮ
アーゼＩおよびIIの多重分子型も知られている。
【０００３】様々な種から得られたＤＮアーゼが種々の
程度にまで精製されている。ウシＤＮアーゼＡ、Ｂ、Ｃ
およびＤが精製され、１９７３年には早くも完全に配列
決定された[ＬiaoらのJ.Biol.Chem.248:1489(1973)、Ｓ
alnikowらのJ.Biol.Chem.248:1499(1973)、ＬiaoらのJ.
Biol.Chem.249:2354(1973)]。ブタおよびヒツジＤＮア
ーゼも精製され、完全に配列決定されている[Ｐaudelら
のJ.Biol.Chem.261:16006(1986)、およびＰaudelらのJ.
Biol.Chem.261:16012(1986)]。ヒト尿ＤＮアーゼが電気
泳動的に均一な状態にまで精製され、その観察されるＮ
-末端アミノ酸はロイシンであることが報告されたが、
他の配列については報告されていない[ＩtoらのJ.Bioch
em.95:1399(1984)、さらにＦunakoshiらのJ.Biochem.8
2:1771(1977)、ＭuraiらのBiochim.et Biophys.Acta 51
7:186(1978)およびＷroblewskiらのP.S.E.B.M.74:443(1
950)も参照のこと]。
程度にまで精製されている。ウシＤＮアーゼＡ、Ｂ、Ｃ
およびＤが精製され、１９７３年には早くも完全に配列
決定された[ＬiaoらのJ.Biol.Chem.248:1489(1973)、Ｓ
alnikowらのJ.Biol.Chem.248:1499(1973)、ＬiaoらのJ.
Biol.Chem.249:2354(1973)]。ブタおよびヒツジＤＮア
ーゼも精製され、完全に配列決定されている[Ｐaudelら
のJ.Biol.Chem.261:16006(1986)、およびＰaudelらのJ.
Biol.Chem.261:16012(1986)]。ヒト尿ＤＮアーゼが電気
泳動的に均一な状態にまで精製され、その観察されるＮ
-末端アミノ酸はロイシンであることが報告されたが、
他の配列については報告されていない[ＩtoらのJ.Bioch
em.95:1399(1984)、さらにＦunakoshiらのJ.Biochem.8
2:1771(1977)、ＭuraiらのBiochim.et Biophys.Acta 51
7:186(1978)およびＷroblewskiらのP.S.E.B.M.74:443(1
950)も参照のこと]。
【０００４】哺乳動物ＤＮアーゼの完全な配列情報が初
めて知られたのは１９７３年であったにもかかわらず、
このクラスの酵素をクローンして発現しようという試み
についての報告がなされたのは、最近になってからであ
る。Ｓhieldsらは、ウシＤＮアーゼＩ遺伝子の部分につ
いての発現クローニング、および生物学的かつ免疫学的
に活性である融合産物の大腸菌(Ｅ.coli)における発現
を開示している[Biochem.Soc.Trans.16:195(1988)]。し
かし、ＳhieldsらのＤＮアーゼ産物は宿主細胞にとって
毒性であり、誘導プロモーターを使用することによって
のみ入手できたものである。さらに、いずれかのクロー
ンからプラスミドＤＮＡを単離しようという試みは、ク
ローンからのＤＮアーゼの構成性レベルの発現という障
害のため、非常に困難であり、したがってこの著者らは
ＤＮアーゼをコードしている核酸の配列決定を行うこと
ができなかった。Ｓhieldsらによれば、そのプロモータ
ーが低温で抑制された場合ですら起こるＤＮアーゼの構
成性発現の結果としてプラスミドが回収できなかった。
Ｓhieldsらは、必ずある種のプロモーターの制御下にＤ
Ｎアーゼを配置する必要がある発現クローニングによっ
てしかクローンを同定していなかったので、このことが
相当の障害となったであろう。
めて知られたのは１９７３年であったにもかかわらず、
このクラスの酵素をクローンして発現しようという試み
についての報告がなされたのは、最近になってからであ
る。Ｓhieldsらは、ウシＤＮアーゼＩ遺伝子の部分につ
いての発現クローニング、および生物学的かつ免疫学的
に活性である融合産物の大腸菌(Ｅ.coli)における発現
を開示している[Biochem.Soc.Trans.16:195(1988)]。し
かし、ＳhieldsらのＤＮアーゼ産物は宿主細胞にとって
毒性であり、誘導プロモーターを使用することによって
のみ入手できたものである。さらに、いずれかのクロー
ンからプラスミドＤＮＡを単離しようという試みは、ク
ローンからのＤＮアーゼの構成性レベルの発現という障
害のため、非常に困難であり、したがってこの著者らは
ＤＮアーゼをコードしている核酸の配列決定を行うこと
ができなかった。Ｓhieldsらによれば、そのプロモータ
ーが低温で抑制された場合ですら起こるＤＮアーゼの構
成性発現の結果としてプラスミドが回収できなかった。
Ｓhieldsらは、必ずある種のプロモーターの制御下にＤ
Ｎアーゼを配置する必要がある発現クローニングによっ
てしかクローンを同定していなかったので、このことが
相当の障害となったであろう。
【０００５】ＤＮアーゼは多くの既知の用途を提供する
ものであり、治療用途として使用されてきた。その主要
な治療用途は、肺炎などの疾患における肺分泌物の粘性
を減少させることにより、呼吸気道の清浄化を助けるこ
とであった。分泌物による気道閉塞は呼吸困難症の原因
となり得、呼吸不全および死に至らしめる場合もあり得
る。ウシ膵ＤＮアーゼは商標名ドルナバック(Ｄornava
c)[Ｍerck]として市販されていたが、この製品は販売が
中止された。報告によれば、この製品は臨床的にある程
度有効であったことが示されている。しかし、重大な副
作用を認めていない臨床医もいたが[Ｌieberman,JAMA 2
05:312(1968)]、肺刺激およびアナフィラキシーなどの
重篤な合併症に気付いた臨床医がいた[ＲaskinのAm.Re
v.Resp.Dis.,98:697(1968)]。このような合併症は、従
来市販されていた製品にはプロテアーゼが混入してお
り、ヒトの免疫原性であったことに由来するものであっ
た。実際、濃い肺分泌物の臨床上の問題は慢性かつ再発
性であることが多いが、ウシ膵ＤＮアーゼを用いた長期
療法は推奨されなかった。これらの問題は、ヒト起源の
ＤＮアーゼを提供し、夾雑プロテアーゼを含まないよう
に精製するため、それを非膵臓の外分泌腺細胞において
大量に生産することによって克服できるであろう。
ものであり、治療用途として使用されてきた。その主要
な治療用途は、肺炎などの疾患における肺分泌物の粘性
を減少させることにより、呼吸気道の清浄化を助けるこ
とであった。分泌物による気道閉塞は呼吸困難症の原因
となり得、呼吸不全および死に至らしめる場合もあり得
る。ウシ膵ＤＮアーゼは商標名ドルナバック(Ｄornava
c)[Ｍerck]として市販されていたが、この製品は販売が
中止された。報告によれば、この製品は臨床的にある程
度有効であったことが示されている。しかし、重大な副
作用を認めていない臨床医もいたが[Ｌieberman,JAMA 2
05:312(1968)]、肺刺激およびアナフィラキシーなどの
重篤な合併症に気付いた臨床医がいた[ＲaskinのAm.Re
v.Resp.Dis.,98:697(1968)]。このような合併症は、従
来市販されていた製品にはプロテアーゼが混入してお
り、ヒトの免疫原性であったことに由来するものであっ
た。実際、濃い肺分泌物の臨床上の問題は慢性かつ再発
性であることが多いが、ウシ膵ＤＮアーゼを用いた長期
療法は推奨されなかった。これらの問題は、ヒト起源の
ＤＮアーゼを提供し、夾雑プロテアーゼを含まないよう
に精製するため、それを非膵臓の外分泌腺細胞において
大量に生産することによって克服できるであろう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
えヒトＤＮアーゼを提供することである。
えヒトＤＮアーゼを提供することである。
【０００７】本発明のさらなる目的は、天然では見いだ
されない変異型アミノ酸配列またはグリコシル化を有す
るＤＮアーゼ、および比活性が増大しているなどの改良
された特性を有する他のＤＮアーゼ誘導体を提供するこ
とである。
されない変異型アミノ酸配列またはグリコシル化を有す
るＤＮアーゼ、および比活性が増大しているなどの改良
された特性を有する他のＤＮアーゼ誘導体を提供するこ
とである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、ヒトＤ
Ｎアーゼをコードしている核酸により、その核酸を宿主
細胞に形質転換し、得られた宿主細胞を培養してＤＮア
ーゼを培養物中に蓄積させ、そしてその培養物からＤＮ
アーゼを回収することを特徴とする方法によって達成さ
れる。驚くことに、ヒトＤＮアーゼをコードしている完
全長のクローンが同定、回収され、さらにこのＤＮＡが
組換え宿主細胞によって容易に発現された。
Ｎアーゼをコードしている核酸により、その核酸を宿主
細胞に形質転換し、得られた宿主細胞を培養してＤＮア
ーゼを培養物中に蓄積させ、そしてその培養物からＤＮ
アーゼを回収することを特徴とする方法によって達成さ
れる。驚くことに、ヒトＤＮアーゼをコードしている完
全長のクローンが同定、回収され、さらにこのＤＮＡが
組換え宿主細胞によって容易に発現された。
【０００９】
【発明の実施の形態】好ましい態様では、哺乳動物ＤＮ
アーゼは、天然のヒトＤＮアーゼのアミノ酸配列を有す
る完全長の成熟ヒトＤＮアーゼ、天然に存在するそのア
レル、または前もって決定されたアミノ酸配列もしくは
グリコシル化のそれらの変異体である。ＤＮアーゼをコ
ードしている核酸は、プロセッシングされ、宿主細胞、
特に哺乳動物細胞から分泌されるプレタンパク質をコー
ドしているものが好ましい。
アーゼは、天然のヒトＤＮアーゼのアミノ酸配列を有す
る完全長の成熟ヒトＤＮアーゼ、天然に存在するそのア
レル、または前もって決定されたアミノ酸配列もしくは
グリコシル化のそれらの変異体である。ＤＮアーゼをコ
ードしている核酸は、プロセッシングされ、宿主細胞、
特に哺乳動物細胞から分泌されるプレタンパク質をコー
ドしているものが好ましい。
【００１０】ヒトＤＮアーゼとは、図１のアミノ酸配列
を有するポリペプチド、およびＤＮアーゼの質的な酵素
活性を保持しているそのアミノ酸配列変異体を有するポ
リペプチドと定義される。変異体にはより高い酵素活
性、阻害(具体的にはアクチンによる阻害)に対する増大
した耐性、改良された溶解性を有するものがあり、ある
いは宿主細胞によってより高いレベルで発現されるもの
もある。
を有するポリペプチド、およびＤＮアーゼの質的な酵素
活性を保持しているそのアミノ酸配列変異体を有するポ
リペプチドと定義される。変異体にはより高い酵素活
性、阻害(具体的にはアクチンによる阻害)に対する増大
した耐性、改良された溶解性を有するものがあり、ある
いは宿主細胞によってより高いレベルで発現されるもの
もある。
【００１１】ＤＮアーゼのアミノ酸配列変異体は３つの
クラス、すなわち置換、挿入または欠失変異体のうちの
１つまたはそれ以上のクラスに分類される。これらの変
異体は普通、ＤＮアーゼをコードしているＤＮＡ内にお
けるヌクレオチドを部位特異的突然変異させ、それによ
り変異体をコードしているＤＮＡを得、次いでそのＤＮ
Ａを組換え細胞培養物中で発現させること、によって調
製される。しかし、約１００−１５０までの残基を有す
る変異体ＤＮアーゼのフラグメントは、インビトロ合成
によって常法に従って調製することもできる。
クラス、すなわち置換、挿入または欠失変異体のうちの
１つまたはそれ以上のクラスに分類される。これらの変
異体は普通、ＤＮアーゼをコードしているＤＮＡ内にお
けるヌクレオチドを部位特異的突然変異させ、それによ
り変異体をコードしているＤＮＡを得、次いでそのＤＮ
Ａを組換え細胞培養物中で発現させること、によって調
製される。しかし、約１００−１５０までの残基を有す
る変異体ＤＮアーゼのフラグメントは、インビトロ合成
によって常法に従って調製することもできる。
【００１２】ヒトＤＮアーゼのアミノ酸配列変異体は前
もって配列決定されているか、または天然に存在するア
レルである。例えば、ウシ膵ＤＮアーゼでは、同じ酵素
活性を有しているがグリコシル化のパターンまたはアミ
ノ酸レベルでの置換が相違している４つの分子変異体が
天然に見いだされている。さらに、ヒトＤＮアーゼは天
然では２２２位アミノ酸にアルギニンまたはグルタミン
残基を有していることが見いだされている。これらの変
異体は通常、天然に存在するアナログと質的に同じ生物
活性を示す。本明細書に記載しているヒトＤＮアーゼの
範囲から特に排除されるものは、天然に存在するウシ、
ブタまたはヒツジＤＮアーゼの配列である。
もって配列決定されているか、または天然に存在するア
レルである。例えば、ウシ膵ＤＮアーゼでは、同じ酵素
活性を有しているがグリコシル化のパターンまたはアミ
ノ酸レベルでの置換が相違している４つの分子変異体が
天然に見いだされている。さらに、ヒトＤＮアーゼは天
然では２２２位アミノ酸にアルギニンまたはグルタミン
残基を有していることが見いだされている。これらの変
異体は通常、天然に存在するアナログと質的に同じ生物
活性を示す。本明細書に記載しているヒトＤＮアーゼの
範囲から特に排除されるものは、天然に存在するウシ、
ブタまたはヒツジＤＮアーゼの配列である。
【００１３】アミノ酸配列の変異を導入する部位は前も
って決定しておくが、突然変異それ自体は前もって決定
しておく必要はない。例えば、ある特定の部位で突然変
異の挙動を最適化するため、標的コドンまたは領域に飽
和突然変異(saturation mutagenesis)を導入し、次いで
得られたＤＮアーゼ変異体を所望の活性の最適突然変異
組合わせについてスクリーニングする。
って決定しておくが、突然変異それ自体は前もって決定
しておく必要はない。例えば、ある特定の部位で突然変
異の挙動を最適化するため、標的コドンまたは領域に飽
和突然変異(saturation mutagenesis)を導入し、次いで
得られたＤＮアーゼ変異体を所望の活性の最適突然変異
組合わせについてスクリーニングする。
【００１４】アミノ酸置換は通常、単一の残基について
行い、挿入は約１から１０個のアミノ酸残基のオーダー
で行うのが通常であり、また、欠失は約１から３０残基
の範囲で行う。欠失または挿入は、隣接対、すなわち２
残基の欠失、または２残基の挿入で行うのが好ましい。
置換、欠失、挿入またはその任意の組合わせを共に含有
させて最終構築物を得ることができる。明らかに、変異
ＤＮアーゼをコードしているＤＮＡ内に作成する突然変
異は解読フレームの外側の配列に配置してはならず、二
次mＲＮＡ構造体を産生しかねない相補領域を作成しな
いことが好ましい[EP 75,444A]。
行い、挿入は約１から１０個のアミノ酸残基のオーダー
で行うのが通常であり、また、欠失は約１から３０残基
の範囲で行う。欠失または挿入は、隣接対、すなわち２
残基の欠失、または２残基の挿入で行うのが好ましい。
置換、欠失、挿入またはその任意の組合わせを共に含有
させて最終構築物を得ることができる。明らかに、変異
ＤＮアーゼをコードしているＤＮＡ内に作成する突然変
異は解読フレームの外側の配列に配置してはならず、二
次mＲＮＡ構造体を産生しかねない相補領域を作成しな
いことが好ましい[EP 75,444A]。
【００１５】置換変異体は、図１の配列内の少なくとも
１つの残基が除去され、その位置に別の残基が挿入され
ているものである。このような置換は一般に、ＤＮアー
ゼの特性を微細に調節したい場合には以下の表１に従っ
て調製する。
１つの残基が除去され、その位置に別の残基が挿入され
ているものである。このような置換は一般に、ＤＮアー
ゼの特性を微細に調節したい場合には以下の表１に従っ
て調製する。
【表１】元の残基 例示置換 Ａla Ser Ａrg Lys Ａsn Gln、His Ａsp Glu Ｃys Ser Ｇln Asn Ｇlu Asp Ｇly Pro Ｈis Asn、Gln Ｉle Leu、Val Ｌeu Ile、Val Ｌys Ａrg、Gln、Glu Ｍet Leu、Ile Ｐhe Met、Leu、Tyr Ｓer Thr Ｔhr Ser Ｔrp Tyr Ｔyr Trp、Ｐhe Ｖal Ile、Leu
【００１６】表１の置換よりも保存性の低い置換を選択
することによって、すなわち(a)置換領域内のポリペプ
チド骨格の構造、例えばシートまたはヘリックスコンフ
ォメーションを、(b)標的部位での分子の変化または疎
水性を、または(c)側鎖のバルクを維持させる効果がよ
り有意に異なっている残基を選択することによって、機
能または免疫学的な同一性が実質的に変動される。一般
にＤＮアーゼの性質が最も大きく変動すると期待される
置換は、(a)親水性残基、例えばセリンまたはスレオニ
ン残基を疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、
フェニルアラニン、バリンまたはアラニン残基と置換す
ること、(b)システインまたはプロリンを別の残基と置
換すること、(c)正電荷の側鎖を有する残基、例えばリ
シン、アルギニンまたはヒスチジン残基を、負電荷残
基、例えばグルタミンまたはアスパラギン残基と置換す
ること、または(d)バルキーな(かさ高い)側鎖を有する
残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有さない残
基、例えばグリシンと置換すること、である。
することによって、すなわち(a)置換領域内のポリペプ
チド骨格の構造、例えばシートまたはヘリックスコンフ
ォメーションを、(b)標的部位での分子の変化または疎
水性を、または(c)側鎖のバルクを維持させる効果がよ
り有意に異なっている残基を選択することによって、機
能または免疫学的な同一性が実質的に変動される。一般
にＤＮアーゼの性質が最も大きく変動すると期待される
置換は、(a)親水性残基、例えばセリンまたはスレオニ
ン残基を疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、
フェニルアラニン、バリンまたはアラニン残基と置換す
ること、(b)システインまたはプロリンを別の残基と置
換すること、(c)正電荷の側鎖を有する残基、例えばリ
シン、アルギニンまたはヒスチジン残基を、負電荷残
基、例えばグルタミンまたはアスパラギン残基と置換す
ること、または(d)バルキーな(かさ高い)側鎖を有する
残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有さない残
基、例えばグリシンと置換すること、である。
【００１７】ヒトＤＮアーゼのアミノ酸配列変異体の例
を、以下の表２に示す。残基番号の後ろの残基は、置換
または挿入されるアミノ酸を示している。
を、以下の表２に示す。残基番号の後ろの残基は、置換
または挿入されるアミノ酸を示している。
【表２】 置換 H134K,N,RまたはQ FGW,L,I,MまたはV A135S I8F,L,V,MまたはW L133V,IまたはA R41KまたはH P132A S43T,CまたはY N18K,H,RまたはQ K77RまたはH S17T R79KまたはH T20SまたはY N110D,S,T,R,YまたはQ N106K,H,RまたはQ G167P G105PまたはA F169L,V,IまたはM D107EまたはT A171G,VまたはM R140A S250T,YまたはM R121KまたはH Y253T,SまたはM T108SまたはY R73N P103S,TまたはY R73C+D139C C101S,T,YまたはM K260RまたはS C104S,T,YまたはM L259V,IまたはM 欠失 挿入 △34H-△39E K260RA-COOH △159G-161E V131A P132 △204A-208H P132A L133 △121R-127E △188T-191T △204A-208H △223G-231L △260K
【００１８】一般に、配列変異は残基６-１０、４１-４
３、７７-７９、１１０-１１２、１６７-１７１、２５
０-２５３、７３、９３、１５７、１４９、１８５、１
８７、１９８、１７-２０、１０５-１０８、および１３
１-１３９に導入する。得られた変異体は保存置換性で
あることが好ましい。ある種の変異体は減少した、また
は喪失した加水分解活性を示す場合があることは理解さ
れよう。しかし、これらの変異体は天然ヒトＤＮアーゼ
の少なくとも１つの免疫エピトープを保持している限
り、ＤＮアーゼの免疫検定の標準品として有用である。
３、７７-７９、１１０-１１２、１６７-１７１、２５
０-２５３、７３、９３、１５７、１４９、１８５、１
８７、１９８、１７-２０、１０５-１０８、および１３
１-１３９に導入する。得られた変異体は保存置換性で
あることが好ましい。ある種の変異体は減少した、また
は喪失した加水分解活性を示す場合があることは理解さ
れよう。しかし、これらの変異体は天然ヒトＤＮアーゼ
の少なくとも１つの免疫エピトープを保持している限
り、ＤＮアーゼの免疫検定の標準品として有用である。
【００１９】グリコシル化変異体も本発明のヒトＤＮア
ーゼの範囲内に包含される。非グリコシル化アミノ酸配
列変異体、ＤＮアーゼの天然の非修飾化アミノ酸配列を
有する非グリコシル化ＤＮアーゼ、およびグリコシル化
変異体が包含される。例えば、置換または欠失突然変異
を使用してヒトＤＮアーゼの１８および１０６残基に見
いだされるＮ-連結グリコシル化部位を削除する。例え
ば、アスパラギン残基を削除、またはそれをリシンまた
はヒスチジンなどの他の塩基性残基と置換する。あるい
は、そのアスパラギン残基を未変化のままで残すとして
も、そのグリコシル化認識部位を削除することによって
グリコシル化を防ぐために、グリコシル化部位を形成し
ているフランキング残基を置換または削除する。天然の
ヒトＤＮアーゼのアミノ酸残基を有する非グリコシル化
ＤＮアーゼは、原核生物がポリペプチドにグリコシル化
を導入できないことから、組換え原核細胞培養物で産生
させる。さらに、グリコシル化変異体は、Ｎ-連結グリ
コシル化の共通配列：Ａsn-Ｘ-ＳerまたはＡsn-Ｘ-Ｔhr
を(アミノ酸置換もしくは欠失によって)挿入することに
よりＮ-連結グリコシル化部位を付加して調製すること
ができる。グリコシル化変異体は、１８および１０６残
基のＮ-連結グリコシル化部位を削除し、新しい残基を
付加することにより調製することもできる。
ーゼの範囲内に包含される。非グリコシル化アミノ酸配
列変異体、ＤＮアーゼの天然の非修飾化アミノ酸配列を
有する非グリコシル化ＤＮアーゼ、およびグリコシル化
変異体が包含される。例えば、置換または欠失突然変異
を使用してヒトＤＮアーゼの１８および１０６残基に見
いだされるＮ-連結グリコシル化部位を削除する。例え
ば、アスパラギン残基を削除、またはそれをリシンまた
はヒスチジンなどの他の塩基性残基と置換する。あるい
は、そのアスパラギン残基を未変化のままで残すとして
も、そのグリコシル化認識部位を削除することによって
グリコシル化を防ぐために、グリコシル化部位を形成し
ているフランキング残基を置換または削除する。天然の
ヒトＤＮアーゼのアミノ酸残基を有する非グリコシル化
ＤＮアーゼは、原核生物がポリペプチドにグリコシル化
を導入できないことから、組換え原核細胞培養物で産生
させる。さらに、グリコシル化変異体は、Ｎ-連結グリ
コシル化の共通配列：Ａsn-Ｘ-ＳerまたはＡsn-Ｘ-Ｔhr
を(アミノ酸置換もしくは欠失によって)挿入することに
よりＮ-連結グリコシル化部位を付加して調製すること
ができる。グリコシル化変異体は、１８および１０６残
基のＮ-連結グリコシル化部位を削除し、新しい残基を
付加することにより調製することもできる。
【００２０】変異グリコシル化、すなわちヒト膵または
尿ＤＮアーゼとは異なるグリコシル化は、適当な宿主細
胞を選択すること、またはインビトロ法によって調製す
ることができる。例えば、酵母は、哺乳動物系とは明ら
かに異なったグリコシル化を導入する。同様に、ＤＮア
ーゼの供給源とは異なる種(例えば、ハムスター、ネズ
ミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ)または組織起源(例
えば、肺、肝、リンパ節、間充織、表皮)の哺乳動物細
胞を、変異グリコシル化の導入能、すなわち例えばマン
ノースの上昇レベルまたはマンノース、フコース、シア
ル酸および、哺乳動物の糖タンパク質に通常見いだされ
る他の糖の変異比によって特徴付られる変異グリコシル
化導入能についてスクリーニングする。さらに、グリコ
シル化表現型についての突然変異を有する哺乳動物また
は酵母細胞を同定し、伴う突然変異について選択し、ま
たは構築してＤＮアーゼの生産に利用することができ
る。ＤＮアーゼのインビトロプロセッシングは通常、酵
素加水分解、例えばノイラミニダーゼまたはエンドグリ
コシダーゼＨ消化によって行われる。
尿ＤＮアーゼとは異なるグリコシル化は、適当な宿主細
胞を選択すること、またはインビトロ法によって調製す
ることができる。例えば、酵母は、哺乳動物系とは明ら
かに異なったグリコシル化を導入する。同様に、ＤＮア
ーゼの供給源とは異なる種(例えば、ハムスター、ネズ
ミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ)または組織起源(例
えば、肺、肝、リンパ節、間充織、表皮)の哺乳動物細
胞を、変異グリコシル化の導入能、すなわち例えばマン
ノースの上昇レベルまたはマンノース、フコース、シア
ル酸および、哺乳動物の糖タンパク質に通常見いだされ
る他の糖の変異比によって特徴付られる変異グリコシル
化導入能についてスクリーニングする。さらに、グリコ
シル化表現型についての突然変異を有する哺乳動物また
は酵母細胞を同定し、伴う突然変異について選択し、ま
たは構築してＤＮアーゼの生産に利用することができ
る。ＤＮアーゼのインビトロプロセッシングは通常、酵
素加水分解、例えばノイラミニダーゼまたはエンドグリ
コシダーゼＨ消化によって行われる。
【００２１】ＤＮアーゼの挿入アミノ酸配列変異体は、
標的ＤＮアーゼの前もって決めておいた部位に１つまた
はそれ以上のアミノ酸残基を先に存在している残基と置
き換えて導入したものである。最も普通には、挿入変異
はヘテロローガスなタンパク質またはポリペプチドと、
ＤＮアーゼのアミノまたはカルボキシ末端との融合であ
る。ヒトにおいて免疫原性を有するＤＮアーゼ誘導体、
例えば免疫原性ポリペプチドをインビトロ架橋連結によ
ってＤＮアーゼと融合すること、またはlacＺなどの免
疫原性融合をコードしているＤＮＡで組換え細胞培養物
を形質転換すること、によって調製される誘導体は、好
ましくない。それ故に、本発明に包含しようとする典型
的な挿入変異体は、上記のシグナル配列変異体である。
標的ＤＮアーゼの前もって決めておいた部位に１つまた
はそれ以上のアミノ酸残基を先に存在している残基と置
き換えて導入したものである。最も普通には、挿入変異
はヘテロローガスなタンパク質またはポリペプチドと、
ＤＮアーゼのアミノまたはカルボキシ末端との融合であ
る。ヒトにおいて免疫原性を有するＤＮアーゼ誘導体、
例えば免疫原性ポリペプチドをインビトロ架橋連結によ
ってＤＮアーゼと融合すること、またはlacＺなどの免
疫原性融合をコードしているＤＮＡで組換え細胞培養物
を形質転換すること、によって調製される誘導体は、好
ましくない。それ故に、本発明に包含しようとする典型
的な挿入変異体は、上記のシグナル配列変異体である。
【００２２】ＤＮアーゼ分子の共有結合的修飾も本発明
の範囲内に包含される。このような修飾は、回収したタ
ンパク質の標的にされたアミノ酸残基を、選択した側鎖
または末端残基と反応することのできる有機誘導化剤と
反応させるか、または選択した組換え宿主細胞内で機能
する翻訳後修飾のメカニズムを活用することによって導
入される。得られた共有結合誘導体は、生物活性に重要
な残基を同定することを目的とした研究、例えばＤＮア
ーゼの免疫検定、または組換えＤＮアーゼの免疫アフィ
ニティー精製のための抗-ヒトＤＮアーゼ抗体の調製に
有用である。例えば、このタンパク質がニンヒドリンと
反応した後における生物活性の完全な不活化は、アルギ
ニンまたはリシン残基の少なくとも１つがその活性にと
って重要であることを示唆するものであり、次いでこの
選択した条件下で修飾された個々の残基は、修飾アミノ
酸残基を含有するペプチドフラグメントを単離すること
によって同定される。
の範囲内に包含される。このような修飾は、回収したタ
ンパク質の標的にされたアミノ酸残基を、選択した側鎖
または末端残基と反応することのできる有機誘導化剤と
反応させるか、または選択した組換え宿主細胞内で機能
する翻訳後修飾のメカニズムを活用することによって導
入される。得られた共有結合誘導体は、生物活性に重要
な残基を同定することを目的とした研究、例えばＤＮア
ーゼの免疫検定、または組換えＤＮアーゼの免疫アフィ
ニティー精製のための抗-ヒトＤＮアーゼ抗体の調製に
有用である。例えば、このタンパク質がニンヒドリンと
反応した後における生物活性の完全な不活化は、アルギ
ニンまたはリシン残基の少なくとも１つがその活性にと
って重要であることを示唆するものであり、次いでこの
選択した条件下で修飾された個々の残基は、修飾アミノ
酸残基を含有するペプチドフラグメントを単離すること
によって同定される。
【００２３】システイン残基を最も普通にはクロロ酢酸
またはクロロアセトアミドなどのα-ハロアセテート(お
よび対応するアミン)と反応させ、カルボキシメチルま
たはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン
残基はさらに、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロ
モ-β-(５-アミダゾリル)プロピオン酸、クロロアセト
ール・ホスフェート、Ｎ-アルキルマレイミド、３-ニト
ロ-２-ピリジル・ジスルフィド、メチル・２-ピリジル
ジスルフィド、p-クロロメルクリ安息香酸、２-クロロ
メルクリ-４-ニトロフェノールまたはクロロ-７-ニトロ
ベンゾ-２-オキサ-１，３-ジアゾールと反応させること
によっても誘導化される。
またはクロロアセトアミドなどのα-ハロアセテート(お
よび対応するアミン)と反応させ、カルボキシメチルま
たはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン
残基はさらに、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロ
モ-β-(５-アミダゾリル)プロピオン酸、クロロアセト
ール・ホスフェート、Ｎ-アルキルマレイミド、３-ニト
ロ-２-ピリジル・ジスルフィド、メチル・２-ピリジル
ジスルフィド、p-クロロメルクリ安息香酸、２-クロロ
メルクリ-４-ニトロフェノールまたはクロロ-７-ニトロ
ベンゾ-２-オキサ-１，３-ジアゾールと反応させること
によっても誘導化される。
【００２４】ヒスチジン残基を誘導化するには、pＨ
５．５から７．０において、ジエテルピロカルボネート
と反応させることが、その試薬がヒスチジン側鎖に比較
的特異的であるために好ましい。パラ-ブロモ-フェナシ
ル・ブロミドも有用である。この反応は０．１Ｍ カコ
ジル酸ナトリウム中、pＨ６．０で行うべきである。
５．５から７．０において、ジエテルピロカルボネート
と反応させることが、その試薬がヒスチジン側鎖に比較
的特異的であるために好ましい。パラ-ブロモ-フェナシ
ル・ブロミドも有用である。この反応は０．１Ｍ カコ
ジル酸ナトリウム中、pＨ６．０で行うべきである。
【００２５】リシンおよびアミノ末端残基は、コハク酸
または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試
薬による誘導化は、リシン残基の電荷を反転させる作用
を有している。α-アミノ含有残基を誘導化するのに適
当な他の試薬には、ピコリンイミノ酸メチルなどのイミ
ドエステル類、ピリドキサールリン酸、ピリドキサー
ル、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスル
ホン酸、Ｏ-メチルイソウレア、２，４-ペンタンジオ
ン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ
-触媒反応がある。
または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試
薬による誘導化は、リシン残基の電荷を反転させる作用
を有している。α-アミノ含有残基を誘導化するのに適
当な他の試薬には、ピコリンイミノ酸メチルなどのイミ
ドエステル類、ピリドキサールリン酸、ピリドキサー
ル、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスル
ホン酸、Ｏ-メチルイソウレア、２，４-ペンタンジオ
ン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ
-触媒反応がある。
【００２６】アルギニン残基は、フェニルグリオキサー
ル、２，３-ブタンジオン、１，２-シクロヘキサンジオ
ン、およびニンヒドリンなどの幾つかの従来からの試薬
の１つと反応させることによって誘導化される。アルギ
ニン残基の誘導化では、グアニジン官能基のpＫaが高い
ことから、反応をアルカリ条件下で行う必要がある。さ
らに、これらの試薬はリシンの基およびアルギニンのε
-アミノ基とも反応し得る。
ル、２，３-ブタンジオン、１，２-シクロヘキサンジオ
ン、およびニンヒドリンなどの幾つかの従来からの試薬
の１つと反応させることによって誘導化される。アルギ
ニン残基の誘導化では、グアニジン官能基のpＫaが高い
ことから、反応をアルカリ条件下で行う必要がある。さ
らに、これらの試薬はリシンの基およびアルギニンのε
-アミノ基とも反応し得る。
【００２７】チロシン残基自体の特異的修飾は広範に研
究されており、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテ
トラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチ
ロシン残基に導入することに関心が集まっている。最も
普通には、Ｎ-アセチルイミジゾールおよびテトラニト
ロメタンを使用し、それぞれＯ-アセチルチロシン種お
よび３-ニトロ誘導体を製造する。チロシン残基を125Ｉ
または131Ｉによってヨウ素化し、ラジオイムノアッセ
イにおいて有用である標識化タンパク質を調製する。こ
の目的自体では、クロラミンＴ法が広範に使用される。
究されており、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテ
トラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチ
ロシン残基に導入することに関心が集まっている。最も
普通には、Ｎ-アセチルイミジゾールおよびテトラニト
ロメタンを使用し、それぞれＯ-アセチルチロシン種お
よび３-ニトロ誘導体を製造する。チロシン残基を125Ｉ
または131Ｉによってヨウ素化し、ラジオイムノアッセ
イにおいて有用である標識化タンパク質を調製する。こ
の目的自体では、クロラミンＴ法が広範に使用される。
【００２８】カルボキシ側鎖基(アスパルチルまたはグ
ルタミル残基)を、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリ
ニル-(４)-エチル)カルボジイミドまたは１-エチル-３-
(４-アゾニア-４，４-ジメチルペンチル)-カルボジイミ
ドなどのカルボジイミド類(Ｒ'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ')との
反応によって選択的に修飾する。さらに、アスパルチル
およびグルタミル残基をアンモニウムイオンとの反応に
よってアスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
これは、アスパラギンおよびグルタミンをコードするよ
うに核酸を突然変異させるための代替法である。
ルタミル残基)を、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリ
ニル-(４)-エチル)カルボジイミドまたは１-エチル-３-
(４-アゾニア-４，４-ジメチルペンチル)-カルボジイミ
ドなどのカルボジイミド類(Ｒ'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ')との
反応によって選択的に修飾する。さらに、アスパルチル
およびグルタミル残基をアンモニウムイオンとの反応に
よってアスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
これは、アスパラギンおよびグルタミンをコードするよ
うに核酸を突然変異させるための代替法である。
【００２９】２機能性の試薬を用いて誘導化すること
は、免疫原性ポリペプチドを有するタンパク質の分子内
凝集を作成するため、および抗体のアフィニティー精製
の用途においてそのタンパク質を水-不溶性の支持マト
リックスまたは表面に架橋するために有用である。さら
に、側鎖内架橋の研究により、コンホメーション構造に
関する直接的な情報が得られている。普通使用する架橋
連結剤には、１，１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニ
ルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエ
ステル、３，３’-ジチオビス(スクシンイミジル−プロ
ピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを包含
するホモ２機能性イミドエステル、およびビス-Ｎ-マレ
イミド-１，８-オクタンなどの２機能性マレイミドなど
がある。メチル-３-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピ
オイミデートなどの誘導化剤により、光りの存在下に架
橋連結を形成することができる光り活性中間体が得られ
る。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性
の水不溶性マトリックス、および米国特許第３,９６９,
２８７号、第３,６９１,０１６号、第４,１９５,１２８
号、第４,２４７,６４２号、第４,２２９,５３７号およ
び第４,３３０,４４０号に記載されている反応性物質
が、タンパク質の固定化に使用される。
は、免疫原性ポリペプチドを有するタンパク質の分子内
凝集を作成するため、および抗体のアフィニティー精製
の用途においてそのタンパク質を水-不溶性の支持マト
リックスまたは表面に架橋するために有用である。さら
に、側鎖内架橋の研究により、コンホメーション構造に
関する直接的な情報が得られている。普通使用する架橋
連結剤には、１，１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニ
ルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエ
ステル、３，３’-ジチオビス(スクシンイミジル−プロ
ピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを包含
するホモ２機能性イミドエステル、およびビス-Ｎ-マレ
イミド-１，８-オクタンなどの２機能性マレイミドなど
がある。メチル-３-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピ
オイミデートなどの誘導化剤により、光りの存在下に架
橋連結を形成することができる光り活性中間体が得られ
る。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性
の水不溶性マトリックス、および米国特許第３,９６９,
２８７号、第３,６９１,０１６号、第４,１９５,１２８
号、第４,２４７,６４２号、第４,２２９,５３７号およ
び第４,３３０,４４０号に記載されている反応性物質
が、タンパク質の固定化に使用される。
【００３０】特定の翻訳後誘導化は、発現ポリペプチド
に対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミ
ンおよびアスパラギン残基は翻訳後に脱アミノ化され、
対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になること
が多い。あるいは、これらの残基は緩和な酸性条件下で
脱アミノ化される。これら残基はいずれの形態であって
も本発明の範囲内に包含される。
に対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミ
ンおよびアスパラギン残基は翻訳後に脱アミノ化され、
対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になること
が多い。あるいは、これらの残基は緩和な酸性条件下で
脱アミノ化される。これら残基はいずれの形態であって
も本発明の範囲内に包含される。
【００３１】他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシ
ンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒ
ドロキシ基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒス
チジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[クレイトン(T.E.C
reighton)のProteins:Structure and Molecular Proper
ties,W.H.Freeman & Co.,サンフランシスコ,79-86頁(19
83)]、Ｎ-末端アミノのアセチル化、およびある場合に
おけるＣ-末端カルボキシルのアミド化がある。
ンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒ
ドロキシ基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒス
チジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[クレイトン(T.E.C
reighton)のProteins:Structure and Molecular Proper
ties,W.H.Freeman & Co.,サンフランシスコ,79-86頁(19
83)]、Ｎ-末端アミノのアセチル化、およびある場合に
おけるＣ-末端カルボキシルのアミド化がある。
【００３２】他の誘導体は、非タンパク質のポリマーと
共有結合している本発明ポリペプチドを包含している。
この非タンパク質ポリマーは通常、親水性の合成ポリマ
ー、すなわち天然には見いだされないポリマーである。
しかし、天然に存在し、組換えもしくはインビトロ法に
よって生産されるポリマーは、天然から単離されるポリ
マー同様に有用である。親水性のポリビニルポリマー、
例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリド
ンは本発明の範囲内である。実際上有用なものとしては
以下のものが挙げられる：ポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル
またはメトキシポリエチレングリコールなどのポリアル
キレンエーテル；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロ
ピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピ
レンとのブロックコポリマー[プルロニックス(Pluronic
s)]などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリレー
ト；カルボマー；サッカライドモノマーＤ-マンノー
ス、Ｄ-およびＬ-ガラクトース、フコース、フルクトー
ス、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン
酸、シアル酸、Ｄ-ガラクトロン酸、Ｄ-マンヌロン酸
(例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸)、Ｄ-グ
ルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ-グルコースおよび
ノイラミン酸、およびラクトース、アミロペクチン、デ
ンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸
デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコー
ゲンなどのホモポリサッカライドおよびヘテロポリサッ
カライド、または酸ムコポリサッカライドのポリサッカ
ライドユニット、例えばヒアルロン酸、などの分枝鎖状
または非分枝鎖状のポリサッカライド；ポリソルビトー
ルおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマ
ー；ならびにヘパリンまたはヘパロン。ポリサッカライ
ドが天然のグリコシル化または組換え発現の際の随伴グ
リコシル化を受ける場合には、置換の部位は天然のＮま
たはＯ-連結グリコシル化部位ではなく、付加的なまた
は置換ＮまたはＯ-連結部位が分子内に挿入されている
他の部位に位置させればよい。このようなポリマーの混
合物を使用するか、またはそのポリマーは同種であって
もよい。架橋連結する前のポリマーは水溶性でなくても
よく、むしろそのほうが好ましいが、最終コンジュゲー
ト体は水溶性でなければならない。さらに、ポリマー
は、コンジュゲート形態にあっては高い免疫原性を有す
るべきではなく、また静脈注入またはこのような経路に
よって投与するつもりであるなら注射に適合しない粘性
を有するべきではない。
共有結合している本発明ポリペプチドを包含している。
この非タンパク質ポリマーは通常、親水性の合成ポリマ
ー、すなわち天然には見いだされないポリマーである。
しかし、天然に存在し、組換えもしくはインビトロ法に
よって生産されるポリマーは、天然から単離されるポリ
マー同様に有用である。親水性のポリビニルポリマー、
例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリド
ンは本発明の範囲内である。実際上有用なものとしては
以下のものが挙げられる：ポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル
またはメトキシポリエチレングリコールなどのポリアル
キレンエーテル；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロ
ピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピ
レンとのブロックコポリマー[プルロニックス(Pluronic
s)]などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリレー
ト；カルボマー；サッカライドモノマーＤ-マンノー
ス、Ｄ-およびＬ-ガラクトース、フコース、フルクトー
ス、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン
酸、シアル酸、Ｄ-ガラクトロン酸、Ｄ-マンヌロン酸
(例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸)、Ｄ-グ
ルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ-グルコースおよび
ノイラミン酸、およびラクトース、アミロペクチン、デ
ンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸
デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコー
ゲンなどのホモポリサッカライドおよびヘテロポリサッ
カライド、または酸ムコポリサッカライドのポリサッカ
ライドユニット、例えばヒアルロン酸、などの分枝鎖状
または非分枝鎖状のポリサッカライド；ポリソルビトー
ルおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマ
ー；ならびにヘパリンまたはヘパロン。ポリサッカライ
ドが天然のグリコシル化または組換え発現の際の随伴グ
リコシル化を受ける場合には、置換の部位は天然のＮま
たはＯ-連結グリコシル化部位ではなく、付加的なまた
は置換ＮまたはＯ-連結部位が分子内に挿入されている
他の部位に位置させればよい。このようなポリマーの混
合物を使用するか、またはそのポリマーは同種であって
もよい。架橋連結する前のポリマーは水溶性でなくても
よく、むしろそのほうが好ましいが、最終コンジュゲー
ト体は水溶性でなければならない。さらに、ポリマー
は、コンジュゲート形態にあっては高い免疫原性を有す
るべきではなく、また静脈注入またはこのような経路に
よって投与するつもりであるなら注射に適合しない粘性
を有するべきではない。
【００３３】ポリマーは、反応性である基は１つしか有
していないことが好ましい。これは、タンパク質分子の
架橋連結を防止するのに役立つ。しかし、実質的に均一
な誘導体を回収するためのゲル濾過もしくはクロマトグ
ラフィー性シーブによって反応生成物を精製するため
の、または架橋連結を減少させるための反応条件を最適
化することも本発明の範囲内である。
していないことが好ましい。これは、タンパク質分子の
架橋連結を防止するのに役立つ。しかし、実質的に均一
な誘導体を回収するためのゲル濾過もしくはクロマトグ
ラフィー性シーブによって反応生成物を精製するため
の、または架橋連結を減少させるための反応条件を最適
化することも本発明の範囲内である。
【００３４】ポリマーの分子量は約１００から５００,
０００の範囲であり、好ましくは約１,０００から２０,
０００である。選択する分子量はポリマーの性質および
置換の程度によって変動する。一般には、ポリマーの親
水性が高くなり、置換の程度が高くなる程に、使用する
ことのできる分子量は小さくなる。最適の分子量は通常
の実験法によって決定される。
０００の範囲であり、好ましくは約１,０００から２０,
０００である。選択する分子量はポリマーの性質および
置換の程度によって変動する。一般には、ポリマーの親
水性が高くなり、置換の程度が高くなる程に、使用する
ことのできる分子量は小さくなる。最適の分子量は通常
の実験法によって決定される。
【００３５】ポリマーおよびタンパク質の１つまたはそ
れ以上のアミノ酸または糖残基と反応する多機能性架橋
連結剤によって、ポリマーをポリペプチドと共有結合さ
せるのが一般である。しかし、誘導化ポリマーをタンパ
ク質と反応、またはその反対に反応させることによって
直接ポリマーを架橋させることも本発明の範囲内であ
る。
れ以上のアミノ酸または糖残基と反応する多機能性架橋
連結剤によって、ポリマーをポリペプチドと共有結合さ
せるのが一般である。しかし、誘導化ポリマーをタンパ
ク質と反応、またはその反対に反応させることによって
直接ポリマーを架橋させることも本発明の範囲内であ
る。
【００３６】ポリペプチドの共有結合的架橋部位は、リ
シン残基に見いだされるＮ-末端アミノ基およびεアミ
ノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシ、スル
フヒドリル、ヒドロキシまたは他の親水性の基などであ
る。ポリマーは、多機能性(通常は２機能性)架橋連結剤
を使用せずに直接タンパク質と共有結合させることがで
きる。このような架橋連結剤の例としては、１,１-ビス
(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデ
ヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンアミドエステルがあり、
例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチ
オビス(スクシンイミジル-プロピオネート)などのジス
クシンイミジルエステルを包含するホモ２機能性イミド
エステル、およびビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン
などの２機能性マレイミドが挙げられる。メチル-３-
[(p-アジド-フェニル)ジチオ]プロピオイミデートなど
の誘導化剤によって、光りの存在下に架橋連結を形成す
ることのできる光り活性中間体が得られる。あるいは、
臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水溶性マトリッ
クス、および米国特許第3,959,080号、第3,969,287号、
第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,2
29,537号、第4,055,635号および第4,330,440号に記載さ
れている系が、架橋連結にとっての修飾に適当である。
アミノ基との共有結合は、シアヌール酸クロライド、カ
ルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基に基づく既
知の化学によって行うことができる[ＰＥＧアルコキサ
イド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；
ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧクロラ
イド＋４-ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキサイ
ド、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカル
ボネートＰＥＧ、２,４,５-トリクロロフェニルクロロ
ホルメートまたはp-ニトロフェニルクロロホルメート活
性化ＰＥＧ]。カルボキシル基を、カルボジイミドを使
用するＰＥＧ-アミンのカップリングによって誘導化す
る。
シン残基に見いだされるＮ-末端アミノ基およびεアミ
ノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシ、スル
フヒドリル、ヒドロキシまたは他の親水性の基などであ
る。ポリマーは、多機能性(通常は２機能性)架橋連結剤
を使用せずに直接タンパク質と共有結合させることがで
きる。このような架橋連結剤の例としては、１,１-ビス
(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデ
ヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンアミドエステルがあり、
例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチ
オビス(スクシンイミジル-プロピオネート)などのジス
クシンイミジルエステルを包含するホモ２機能性イミド
エステル、およびビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン
などの２機能性マレイミドが挙げられる。メチル-３-
[(p-アジド-フェニル)ジチオ]プロピオイミデートなど
の誘導化剤によって、光りの存在下に架橋連結を形成す
ることのできる光り活性中間体が得られる。あるいは、
臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水溶性マトリッ
クス、および米国特許第3,959,080号、第3,969,287号、
第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,2
29,537号、第4,055,635号および第4,330,440号に記載さ
れている系が、架橋連結にとっての修飾に適当である。
アミノ基との共有結合は、シアヌール酸クロライド、カ
ルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基に基づく既
知の化学によって行うことができる[ＰＥＧアルコキサ
イド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；
ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧクロラ
イド＋４-ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキサイ
ド、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカル
ボネートＰＥＧ、２,４,５-トリクロロフェニルクロロ
ホルメートまたはp-ニトロフェニルクロロホルメート活
性化ＰＥＧ]。カルボキシル基を、カルボジイミドを使
用するＰＥＧ-アミンのカップリングによって誘導化す
る。
【００３７】ポリマーをオリゴサッカライド基とコンジ
ュゲートするに当たっては、例えばメタ過ヨウ素酸の化
学、または他のグルコースもしくはガラクトースオキシ
ダーゼの酵素を使用して酸化し(いずれによってもその
炭水化物のアルデヒド誘導体が得られる)、次いでハイ
トマン(Heitzmann)らのP.N.A.S.,71:3537-3541(1974)ま
たはベイヤー(Bayer)らのMethods in Ezymology,62:310
(1979)に記載の方法と同じ方法により、オリゴサッカラ
イドをビオチンまたはアビジンで標識するためヒドラジ
ドまたはアミノ-誘導化ポリマーと反応させる。さら
に、オリゴサッカライドおよびポリマーを連結するため
にこれまで使用されている他の化学または酵素学的方法
も適当であり得る。置換されたオリゴサッカライドは、
一般に誘導化のためのアミノ酸部位よりも置換の数が少
なく、またそのオリゴサッカライド生成物がより均質で
あるので、特に有益である。このオリゴサッカライド置
換は、酵素消化、例えばポリマー誘導化の前にノイラミ
ニダーゼ消化によって糖を除去することにより、要すれ
ば修飾することができる。
ュゲートするに当たっては、例えばメタ過ヨウ素酸の化
学、または他のグルコースもしくはガラクトースオキシ
ダーゼの酵素を使用して酸化し(いずれによってもその
炭水化物のアルデヒド誘導体が得られる)、次いでハイ
トマン(Heitzmann)らのP.N.A.S.,71:3537-3541(1974)ま
たはベイヤー(Bayer)らのMethods in Ezymology,62:310
(1979)に記載の方法と同じ方法により、オリゴサッカラ
イドをビオチンまたはアビジンで標識するためヒドラジ
ドまたはアミノ-誘導化ポリマーと反応させる。さら
に、オリゴサッカライドおよびポリマーを連結するため
にこれまで使用されている他の化学または酵素学的方法
も適当であり得る。置換されたオリゴサッカライドは、
一般に誘導化のためのアミノ酸部位よりも置換の数が少
なく、またそのオリゴサッカライド生成物がより均質で
あるので、特に有益である。このオリゴサッカライド置
換は、酵素消化、例えばポリマー誘導化の前にノイラミ
ニダーゼ消化によって糖を除去することにより、要すれ
ば修飾することができる。
【００３８】ポリマーは、そのポリペプチドのアミノ酸
側鎖またはＮ-もしくはＣ-末端と直接反応するか、また
は多機能性架橋連結剤と反応する基を有している。一般
には、このような反応性の基を含有するポリマーは、固
定化タンパク質の調製で知られている。本発明におい
て、このような化学を使用するためには、タンパク質の
固定化にこれまで使用されていた不溶性ポリマーの誘導
化法と同じ方法によって誘導化される水溶性ポリマーを
使用すべきである。臭化シアンの活性化はポリサッカラ
イドを架橋連結するのに使用するための特に有用な操作
法である。
側鎖またはＮ-もしくはＣ-末端と直接反応するか、また
は多機能性架橋連結剤と反応する基を有している。一般
には、このような反応性の基を含有するポリマーは、固
定化タンパク質の調製で知られている。本発明におい
て、このような化学を使用するためには、タンパク質の
固定化にこれまで使用されていた不溶性ポリマーの誘導
化法と同じ方法によって誘導化される水溶性ポリマーを
使用すべきである。臭化シアンの活性化はポリサッカラ
イドを架橋連結するのに使用するための特に有用な操作
法である。
【００３９】ポリマーコンジュゲート体について使用し
ている「水溶性」とは、コンジュゲート体が血液などの
生理学的体液に治療学的に有効な濃度なるに充分な量で
溶解することを意味する。
ている「水溶性」とは、コンジュゲート体が血液などの
生理学的体液に治療学的に有効な濃度なるに充分な量で
溶解することを意味する。
【００４０】出発物質ポリマーについて使用している
「水溶性」とは、コンジュゲート化に使用されるポリマ
ーまたはその反応性中間体が誘導化反応に関与するため
に十分に水溶性であることを意味する。
「水溶性」とは、コンジュゲート化に使用されるポリマ
ーまたはその反応性中間体が誘導化反応に関与するため
に十分に水溶性であることを意味する。
【００４１】ポリマーにおける置換の程度は、タンパク
質の反応部位の数、タンパク質フラグメントのすべてを
使用するか否か、タンパク質がヘテロローガスなタンパ
ク質と融合しているか否か、分子量、親水性、およびポ
リマーの他の特性、ならびに選択する個々のタンパク質
誘導部位によって変動する。一般には、コンジュゲート
体は約１から１０個のポリマー分子を含有しており、同
時に、所望の活性が有意な悪影響を受けない限り、ヘテ
ロローガスな配列が本質的に非制限的な数のポリマー分
子と置換している場合もある。最適な架橋連結の程度
は、時間、温度および他の反応条件を変化させることに
より置換の程度を変動させる実験マトリックスによって
容易に決定される。
質の反応部位の数、タンパク質フラグメントのすべてを
使用するか否か、タンパク質がヘテロローガスなタンパ
ク質と融合しているか否か、分子量、親水性、およびポ
リマーの他の特性、ならびに選択する個々のタンパク質
誘導部位によって変動する。一般には、コンジュゲート
体は約１から１０個のポリマー分子を含有しており、同
時に、所望の活性が有意な悪影響を受けない限り、ヘテ
ロローガスな配列が本質的に非制限的な数のポリマー分
子と置換している場合もある。最適な架橋連結の程度
は、時間、温度および他の反応条件を変化させることに
より置換の程度を変動させる実験マトリックスによって
容易に決定される。
【００４２】タンパク質をＰＥＧなどの非タンパク質性
ポリマーで共有結合的に修飾するためのそれ自体既知の
広範な方法によって、ポリマー、例えばＰＥＧを架橋連
結する。しかし、これらの方法の中には、本発明の目的
に好ましくないものがある。シアヌール酸クロライド化
学によってはタンパク質架橋などの多くの副反応が誘起
される。さらに、スルフヒドリル基を含有するタンパク
質の不活化を招来することも具体的にはあり得る。カル
ボニル・ジイミダゾールの化学[ブーチャンプ(Beaucham
p)らのAnal.Biochem.131:25-33(1983)]は、タンパク質
を不活化することのできる高いpＨ(＞８.５)を必要とす
る。さらに、「活性化ＰＥＧ」中間体は水と反応するこ
とができるので、「活性化ＰＥＧ」がタンパク質よりも
非常に多くのモル過剰量であることを要する。カルボニ
ル・ジイミダゾール化学に必要とされる高濃度のＰＥＧ
ではさらに、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび疎水性
相互作用クロマトグラフィーが反対の作用を引き起こす
ので、精製に伴う問題が起こる。さらに、高濃度の「活
性化ＰＥＧ」はタンパク質を沈殿しかねず、それ自体従
来から指摘されている問題である[デイビス(Davis)の米
国特許第4,179,337号]。対照的に、アルデヒド化学[Roy
erの米国特許第4,002,531号]は、ＰＥＧが４０倍のモル
濃度過剰量であり、１-２時間のインキュベートを要す
るのみであるので、より有効である。しかし、Royerに
よって示唆されているＰＥＧアルデヒドを調製するため
の二酸化マンガンは、"ＰＥＧが金属-基礎酸化剤と錯体
を形成する傾向が明らかであるので"、問題である[ハリ
ス(Harris)らのJ.Polym.Sci.,Polym.Chem.編.22:341-35
2(1984)]。ＤＭＳＯおよび無水酢酸を利用してモファッ
ト(moffatt)酸化を使用すると、この問題は顕著にな
る。さらに、Royerによって示唆されている水素化ホウ
素ナトリウムは高いpＨで使用しなければならず、ジス
ルフィド結合を減少させる顕著な傾向を有する。これと
は対照的に、水素化シアノホウ素ナトリウムは中性pＨ
で有効であり、ジスルフィド結合を還元する傾向が殆ど
無く、好ましい。
ポリマーで共有結合的に修飾するためのそれ自体既知の
広範な方法によって、ポリマー、例えばＰＥＧを架橋連
結する。しかし、これらの方法の中には、本発明の目的
に好ましくないものがある。シアヌール酸クロライド化
学によってはタンパク質架橋などの多くの副反応が誘起
される。さらに、スルフヒドリル基を含有するタンパク
質の不活化を招来することも具体的にはあり得る。カル
ボニル・ジイミダゾールの化学[ブーチャンプ(Beaucham
p)らのAnal.Biochem.131:25-33(1983)]は、タンパク質
を不活化することのできる高いpＨ(＞８.５)を必要とす
る。さらに、「活性化ＰＥＧ」中間体は水と反応するこ
とができるので、「活性化ＰＥＧ」がタンパク質よりも
非常に多くのモル過剰量であることを要する。カルボニ
ル・ジイミダゾール化学に必要とされる高濃度のＰＥＧ
ではさらに、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび疎水性
相互作用クロマトグラフィーが反対の作用を引き起こす
ので、精製に伴う問題が起こる。さらに、高濃度の「活
性化ＰＥＧ」はタンパク質を沈殿しかねず、それ自体従
来から指摘されている問題である[デイビス(Davis)の米
国特許第4,179,337号]。対照的に、アルデヒド化学[Roy
erの米国特許第4,002,531号]は、ＰＥＧが４０倍のモル
濃度過剰量であり、１-２時間のインキュベートを要す
るのみであるので、より有効である。しかし、Royerに
よって示唆されているＰＥＧアルデヒドを調製するため
の二酸化マンガンは、"ＰＥＧが金属-基礎酸化剤と錯体
を形成する傾向が明らかであるので"、問題である[ハリ
ス(Harris)らのJ.Polym.Sci.,Polym.Chem.編.22:341-35
2(1984)]。ＤＭＳＯおよび無水酢酸を利用してモファッ
ト(moffatt)酸化を使用すると、この問題は顕著にな
る。さらに、Royerによって示唆されている水素化ホウ
素ナトリウムは高いpＨで使用しなければならず、ジス
ルフィド結合を減少させる顕著な傾向を有する。これと
は対照的に、水素化シアノホウ素ナトリウムは中性pＨ
で有効であり、ジスルフィド結合を還元する傾向が殆ど
無く、好ましい。
【００４３】本発明のコンジュゲート体はゲル濾過によ
って未反応の出発物質から分離する。ヘテロローガスな
種のコンジュゲート体を同様にして他のものから精製す
る。得られるポリマーも、親水性ゲルまたは成形品と同
様に、水不溶性であり得る。実際上、カテーテルまたは
ドレナージ導管などの外科用のチューブを構成している
ポリマーが有用である。
って未反応の出発物質から分離する。ヘテロローガスな
種のコンジュゲート体を同様にして他のものから精製す
る。得られるポリマーも、親水性ゲルまたは成形品と同
様に、水不溶性であり得る。実際上、カテーテルまたは
ドレナージ導管などの外科用のチューブを構成している
ポリマーが有用である。
【００４４】ヒトＤＮアーゼをコードしているＤＮＡは
インビトロ法によって合成され、またはヒト膵cＤＮＡ
ライブラリーから容易に入手される。ヒトＤＮアーゼの
全ＤＮＡ配列を図１に示すが、これは、ヒトＤＮアーゼ
またはそのフラグメント(通常、約５０bp以上の大きさ
である)をコードしている標識化ＤＮＡを用いて、ホモ
ローガスな配列を含有するcＤＮＡライブラリー中のク
ローンを検出するため、ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングを行うためにのみ必要とされるものであり、次
いで制限酵素分析および核酸配列決定によってクローン
を分析し、完全長のクローンを同定する。完全長のクロ
ーンがこのライブラリーに存在しない場合には、適当な
フラグメントを種々のクローンから回収し、完全長のク
ローンを組み立てるためのフラグメントに共通した制限
部位で連結する。他の動物種由来のＤＮアーゼをコード
しているＤＮＡは、このような種由来のライブラリーを
このヒト配列でプロービングすること、またはインビト
ロで(ウシ、ブタまたはヒツジＤＮアーゼの)遺伝子を合
成すること、によって入手される。
インビトロ法によって合成され、またはヒト膵cＤＮＡ
ライブラリーから容易に入手される。ヒトＤＮアーゼの
全ＤＮＡ配列を図１に示すが、これは、ヒトＤＮアーゼ
またはそのフラグメント(通常、約５０bp以上の大きさ
である)をコードしている標識化ＤＮＡを用いて、ホモ
ローガスな配列を含有するcＤＮＡライブラリー中のク
ローンを検出するため、ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングを行うためにのみ必要とされるものであり、次
いで制限酵素分析および核酸配列決定によってクローン
を分析し、完全長のクローンを同定する。完全長のクロ
ーンがこのライブラリーに存在しない場合には、適当な
フラグメントを種々のクローンから回収し、完全長のク
ローンを組み立てるためのフラグメントに共通した制限
部位で連結する。他の動物種由来のＤＮアーゼをコード
しているＤＮＡは、このような種由来のライブラリーを
このヒト配列でプロービングすること、またはインビト
ロで(ウシ、ブタまたはヒツジＤＮアーゼの)遺伝子を合
成すること、によって入手される。
【００４５】高いストリンジェンシー条件下でヒトＤＮ
アーゼのcＤＮＡと、またはヒトＤＮアーゼのゲノムＤ
ＮＡ(イントロンおよび、隣接遺伝子にまで伸長してい
る５'または３'フランキング領域、すなわち約５０００
bp を包含する。いずれにしてもさらに大きい)とハイブ
リダイズできる核酸プローブは、本発明の範囲内に包含
される。ＤＮアーゼのゲノムＤＮＡの同定法は、ヒトゲ
ノムライブラリーを、検出可能な基、例えば放射性リン
で標識しておいたcＤＮＡまたはそのフラグメントでプ
ロービングし、次いでその遺伝子を含有するクローン
(群)を回収するという簡単なものである。完全な遺伝子
は、要すれば「歩行(ウォーキング)」によって共につな
ぎ合わせる。通常、そのプローブはウシ、ヒツジまたは
ブタＤＮアーゼをコードしておらず、長さは約１０から
１００bp である。
アーゼのcＤＮＡと、またはヒトＤＮアーゼのゲノムＤ
ＮＡ(イントロンおよび、隣接遺伝子にまで伸長してい
る５'または３'フランキング領域、すなわち約５０００
bp を包含する。いずれにしてもさらに大きい)とハイブ
リダイズできる核酸プローブは、本発明の範囲内に包含
される。ＤＮアーゼのゲノムＤＮＡの同定法は、ヒトゲ
ノムライブラリーを、検出可能な基、例えば放射性リン
で標識しておいたcＤＮＡまたはそのフラグメントでプ
ロービングし、次いでその遺伝子を含有するクローン
(群)を回収するという簡単なものである。完全な遺伝子
は、要すれば「歩行(ウォーキング)」によって共につな
ぎ合わせる。通常、そのプローブはウシ、ヒツジまたは
ブタＤＮアーゼをコードしておらず、長さは約１０から
１００bp である。
【００４６】一般に、本発明で有用であるベクターを構
築するには、ＤＮＡ配列をクローニングするために原核
生物を使用する。例えば、Ｅ.coli(大腸菌) Ｋ１２株２
９４(ＡＴＣＣ ３１４４６番)は特に有用である。Ｅ.co
li ＢおよびＥ.coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３１５３７
番)などの他の微生物株も使用することができる。これ
らは単なる例示であって、限定ではない。あるいは、ク
ローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲが適当であ
る。
築するには、ＤＮＡ配列をクローニングするために原核
生物を使用する。例えば、Ｅ.coli(大腸菌) Ｋ１２株２
９４(ＡＴＣＣ ３１４４６番)は特に有用である。Ｅ.co
li ＢおよびＥ.coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３１５３７
番)などの他の微生物株も使用することができる。これ
らは単なる例示であって、限定ではない。あるいは、ク
ローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲが適当であ
る。
【００４７】ＤＮアーゼは、Ｎ-末端メチオニン同族体
として、またはヒトＤＮアーゼとヘテロローガスなポリ
ペプチド、好ましくはシグナル配列またはＤＮアーゼの
Ｎ-末端に特定の開裂部位を有している他のポリペプチ
ドとの融合物として組換え細胞培養物から直接発現され
る。例えば原核生物分泌発現ベクターを構築するには、
ヒトシグナルを認識する宿主と共に天然のＤＮアーゼシ
グナルを使用する。その分泌リーダーは宿主によって
「認識」された場合、リーダーポリペプチドがそのＣ末
端で所望の成熟ＤＮアーゼと融合している融合物は、宿
主のシグナルペプチダーゼによって開裂され得る。ヒト
シグナルをプロセッシングしない原核生物宿主のために
は、そのシグナルを、例えばアルカリホスファターゼ、
ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定なエンテロトキシンI
Iリーダーの中から選択される原核生物シグナルと置換
する。酵母分泌のためには、ヒトＤＮアーゼシグナルを
酵母インベルターゼ、α因子または酸ホスファターゼリ
ーダーと置換すればよい。哺乳動物細胞での発現では天
然のシグナルで十分であるが、他の哺乳動物分泌タンパ
ク質シグナル、例えば単純ヘルペスgＤシグナルなどの
ウイルス性の分泌リーダーが適当である。
として、またはヒトＤＮアーゼとヘテロローガスなポリ
ペプチド、好ましくはシグナル配列またはＤＮアーゼの
Ｎ-末端に特定の開裂部位を有している他のポリペプチ
ドとの融合物として組換え細胞培養物から直接発現され
る。例えば原核生物分泌発現ベクターを構築するには、
ヒトシグナルを認識する宿主と共に天然のＤＮアーゼシ
グナルを使用する。その分泌リーダーは宿主によって
「認識」された場合、リーダーポリペプチドがそのＣ末
端で所望の成熟ＤＮアーゼと融合している融合物は、宿
主のシグナルペプチダーゼによって開裂され得る。ヒト
シグナルをプロセッシングしない原核生物宿主のために
は、そのシグナルを、例えばアルカリホスファターゼ、
ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定なエンテロトキシンI
Iリーダーの中から選択される原核生物シグナルと置換
する。酵母分泌のためには、ヒトＤＮアーゼシグナルを
酵母インベルターゼ、α因子または酸ホスファターゼリ
ーダーと置換すればよい。哺乳動物細胞での発現では天
然のシグナルで十分であるが、他の哺乳動物分泌タンパ
ク質シグナル、例えば単純ヘルペスgＤシグナルなどの
ウイルス性の分泌リーダーが適当である。
【００４８】ＤＮアーゼはあらゆる宿主細胞から発現さ
れるが、好ましくは哺乳動物宿主で合成する。しかし、
原核生物、真菌、酵母、ピチア(pichia)、昆虫など由来
の宿主細胞も発現に使用される。クローニングに適切な
原核細胞を例示すれば、Ｅ.coli Ｗ３１１０(Ｆ-、λ-
原栄養性、ＡＴＣＣ ２７３２５番)、セラチア・マルセ
スセンスなどの他のエンテロバクター属、バシルス属、
および種々のシュードモナス属などがある。好ましく
は、宿主細胞は最小限のタンパク質分解性酵素を分泌す
べきである。
れるが、好ましくは哺乳動物宿主で合成する。しかし、
原核生物、真菌、酵母、ピチア(pichia)、昆虫など由来
の宿主細胞も発現に使用される。クローニングに適切な
原核細胞を例示すれば、Ｅ.coli Ｗ３１１０(Ｆ-、λ-
原栄養性、ＡＴＣＣ ２７３２５番)、セラチア・マルセ
スセンスなどの他のエンテロバクター属、バシルス属、
および種々のシュードモナス属などがある。好ましく
は、宿主細胞は最小限のタンパク質分解性酵素を分泌す
べきである。
【００４９】発現宿主は通常、予め発現ベクターに連結
させたヒトＤＮアーゼをコードするＤＮＡで形質転換す
る。このようなベクターは通常、複製部位(これは染色
体組込みが起こる場合には必須でない)を担っている。
本発明では、以下の実施例４に記載している発現ベクタ
ーであって、スプライス-ドナー-イントロン-スプライ
ス-アクセプター配列またはユニットを含有するものを
利用するのが好ましい。
させたヒトＤＮアーゼをコードするＤＮＡで形質転換す
る。このようなベクターは通常、複製部位(これは染色
体組込みが起こる場合には必須でない)を担っている。
本発明では、以下の実施例４に記載している発現ベクタ
ーであって、スプライス-ドナー-イントロン-スプライ
ス-アクセプター配列またはユニットを含有するものを
利用するのが好ましい。
【００５０】発現ベクターはさらに、形質転換細胞にお
ける表現型の選択を可能とするマーカー配列を含有して
いる。例えば、Ｅ.coli は通常、Ｅ.coli 種から誘導さ
れるプラスミドであるpＢＲ３２２[ボリバー(Bolivar)
らのCell 2:95(1977)]で形質転換する。pＢＲ３２２は
アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含
有しており、従ってクローニングまたは発現の目的に関
係なく、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提
供できるものである。発現ベクターはさらに転写および
翻訳を制御するのに有用である配列、例えばプロモータ
ーおよびシャイン-ダルガーノ配列(原核生物のもの)、
またはプロモーターおよびエンハンサー(哺乳動物のも
の)を含有するのが最適である。プロモーターは誘導性
のものであることができるが、そうである必要はない。
驚くべきことに、哺乳動物宿主のためのＣＭＶプロモー
ターなどの強力な構成プロモーターでさえも、宿主細胞
の毒性もなくＤＮアーゼを産生することが見いだされ
た。発現ベクターは発現コントロール、複製配列または
選択遺伝子を含有する必要はないと考えられるが、それ
らが存在しないことはＤＮアーゼの形質転換体の同定、
および高いレベルのＤＮアーゼ発現の実施の妨げとなる
場合がある。
ける表現型の選択を可能とするマーカー配列を含有して
いる。例えば、Ｅ.coli は通常、Ｅ.coli 種から誘導さ
れるプラスミドであるpＢＲ３２２[ボリバー(Bolivar)
らのCell 2:95(1977)]で形質転換する。pＢＲ３２２は
アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含
有しており、従ってクローニングまたは発現の目的に関
係なく、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提
供できるものである。発現ベクターはさらに転写および
翻訳を制御するのに有用である配列、例えばプロモータ
ーおよびシャイン-ダルガーノ配列(原核生物のもの)、
またはプロモーターおよびエンハンサー(哺乳動物のも
の)を含有するのが最適である。プロモーターは誘導性
のものであることができるが、そうである必要はない。
驚くべきことに、哺乳動物宿主のためのＣＭＶプロモー
ターなどの強力な構成プロモーターでさえも、宿主細胞
の毒性もなくＤＮアーゼを産生することが見いだされ
た。発現ベクターは発現コントロール、複製配列または
選択遺伝子を含有する必要はないと考えられるが、それ
らが存在しないことはＤＮアーゼの形質転換体の同定、
および高いレベルのＤＮアーゼ発現の実施の妨げとなる
場合がある。
【００５１】原核生物宿主と共に使用するのに適してい
るプロモーターを例示すれば、β-ラクタマーゼおよび
ラクトースプロモーター系[チャング(Chang)らのNature
275:615(1978)、およびゴーデル(Goeddel)らのNature
281:544(1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトフ
ァン(trp)プロモーター系[GoeddelのNucleic Acids Re
s.8:4057(1980)およびＥＰＯ出願公開第36,776号]、お
よびtacプロモーターなどのハイブリッド(雑種)プロモ
ーター[H.de BoerらのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.80:2
1-25(1983)]がある。しかし、他の機能的細菌プロモー
ターも適当である。これらのヌクレオチド配列は概して
既知であり、従って当業者ならば、必要な制限部位を供
給するためのリンカーまたはアダプターを使用してそれ
らをＤＮアーゼをコードしているＤＮＡに機能的に連結
することができる[シーベンリスト(Siebenlist)らのCel
l 20:269(1980)]。細菌システムで使用するためのプロ
モーターは、ＤＮアーゼをコードしているＤＮＡと機能
的に連結されたシャイン-ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列も含
有している。
るプロモーターを例示すれば、β-ラクタマーゼおよび
ラクトースプロモーター系[チャング(Chang)らのNature
275:615(1978)、およびゴーデル(Goeddel)らのNature
281:544(1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトフ
ァン(trp)プロモーター系[GoeddelのNucleic Acids Re
s.8:4057(1980)およびＥＰＯ出願公開第36,776号]、お
よびtacプロモーターなどのハイブリッド(雑種)プロモ
ーター[H.de BoerらのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.80:2
1-25(1983)]がある。しかし、他の機能的細菌プロモー
ターも適当である。これらのヌクレオチド配列は概して
既知であり、従って当業者ならば、必要な制限部位を供
給するためのリンカーまたはアダプターを使用してそれ
らをＤＮアーゼをコードしているＤＮＡに機能的に連結
することができる[シーベンリスト(Siebenlist)らのCel
l 20:269(1980)]。細菌システムで使用するためのプロ
モーターは、ＤＮアーゼをコードしているＤＮＡと機能
的に連結されたシャイン-ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列も含
有している。
【００５２】原核細胞に加えて、酵母または糸状菌類な
どの真核性の微生物も好都合である。サッカロマイセス
・セレビシアエは最も普通に使用される真核性の微生物
であるが、他の多くの株も市販品が入手できる。ＡＢ１
０７-３０(４)-ＶＮ＃２(ＡＴＣＣ 受託番号２０９３７
号)株の同定特性、特に４Ｍ オルトバナデートに対する
耐性を有するサッカロマイセス・セレビシアエ株はＤＮ
アーゼの発現にとって特に有用である。このＶＮ＃２株
に関しては、酵母２-ミクロンプラスミドから誘導され
る高いコピー数のプラスミドでその細胞を安定に形質転
換することが望ましい[前掲]。一般に、プラスミドＹＲ
p７は酵母における満足のいく発現ベクターである[Stin
chcombらのNature 282:39(1979)、KingsmanらのGene 7:
141(1979)、TschemperらのGene 10:157(1980)]。このプ
ラスミドは既に、トリプトファン中での増殖能を欠いて
いる酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ ４４０７６号
またはＰＥＰ４-１[ジョーンズ(Jones)のGenetics 85:1
2(1977)]の選択マーカーを提供するtrp１遺伝子を含有
している。酵母宿主細胞のゲノムの特性としてのtrp１
欠失は、トリプトファン不存在下での増殖に基づいて形
質転換を同定するための環境を提供するものである。ピ
チア(pichia)における発現(米国4,808,537)も満足いく
ものである。
どの真核性の微生物も好都合である。サッカロマイセス
・セレビシアエは最も普通に使用される真核性の微生物
であるが、他の多くの株も市販品が入手できる。ＡＢ１
０７-３０(４)-ＶＮ＃２(ＡＴＣＣ 受託番号２０９３７
号)株の同定特性、特に４Ｍ オルトバナデートに対する
耐性を有するサッカロマイセス・セレビシアエ株はＤＮ
アーゼの発現にとって特に有用である。このＶＮ＃２株
に関しては、酵母２-ミクロンプラスミドから誘導され
る高いコピー数のプラスミドでその細胞を安定に形質転
換することが望ましい[前掲]。一般に、プラスミドＹＲ
p７は酵母における満足のいく発現ベクターである[Stin
chcombらのNature 282:39(1979)、KingsmanらのGene 7:
141(1979)、TschemperらのGene 10:157(1980)]。このプ
ラスミドは既に、トリプトファン中での増殖能を欠いて
いる酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ ４４０７６号
またはＰＥＰ４-１[ジョーンズ(Jones)のGenetics 85:1
2(1977)]の選択マーカーを提供するtrp１遺伝子を含有
している。酵母宿主細胞のゲノムの特性としてのtrp１
欠失は、トリプトファン不存在下での増殖に基づいて形
質転換を同定するための環境を提供するものである。ピ
チア(pichia)における発現(米国4,808,537)も満足いく
ものである。
【００５３】酵母宿主と共に使用するのに適切なプロモ
ーター配列は、３-ホスホグリセレートキナーゼ[Hitzem
anらのJ.Biol.Chem.255:2073(1980)]、またはエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラー
ゼ、３-ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ース・イソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解
糖系酵素[HessらのJ.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)およ
びHollandのBiochemistry17:4900(1978)]にかかるプロ
モーターなどである。
ーター配列は、３-ホスホグリセレートキナーゼ[Hitzem
anらのJ.Biol.Chem.255:2073(1980)]、またはエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラー
ゼ、３-ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ース・イソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解
糖系酵素[HessらのJ.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)およ
びHollandのBiochemistry17:4900(1978)]にかかるプロ
モーターなどである。
【００５４】増殖条件下で制御される転写の付加的な利
点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵
素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸
デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトー
ス利用に関与している酵素にかかるプロモーター領域で
ある。酵母発現に使用するのに適したベクターおよびプ
ロモーターはさらに、R.Hitzemanらの欧州特許公開第7
3,657A号に記載されている。
点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵
素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸
デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトー
ス利用に関与している酵素にかかるプロモーター領域で
ある。酵母発現に使用するのに適したベクターおよびプ
ロモーターはさらに、R.Hitzemanらの欧州特許公開第7
3,657A号に記載されている。
【００５５】発現の制御配列は真核生物では既知であ
る。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写が開始す
る部位から約２５−３０塩基対上流にあるＡＴ-豊富な
領域を含有している。多くの遺伝子の転写開始部位から
７０−８０塩基上流に見いだされるもう１つの配列は、
ＣＸＣＡＡＴ領域[ここに、Ｘはいずれのヌクレオチド
でもよい]である。殆どの真核生物遺伝子の３'末端に
は、ポリＡテールをコード化配列の３'末端に付加する
ためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。こ
れら配列のすべては哺乳動物発現ベクターに挿入するこ
とができる。
る。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写が開始す
る部位から約２５−３０塩基対上流にあるＡＴ-豊富な
領域を含有している。多くの遺伝子の転写開始部位から
７０−８０塩基上流に見いだされるもう１つの配列は、
ＣＸＣＡＡＴ領域[ここに、Ｘはいずれのヌクレオチド
でもよい]である。殆どの真核生物遺伝子の３'末端に
は、ポリＡテールをコード化配列の３'末端に付加する
ためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。こ
れら配列のすべては哺乳動物発現ベクターに挿入するこ
とができる。
【００５６】哺乳動物宿主細胞においてベクター由来の
転写を制御するのに適したプロモーターは種々の供給
源、例えばポリオーマウイルス、ＳＶ４０、アデノウイ
ルス、ＭＭＶ(ステロイド誘発性)、レトロウイルス(例
えば、ＨＩＶのＬＴＲ)、Ｂ型肝炎ウイルス、および最
も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲ
ノムから、またはβ-アクチンプロモーターなどのヘテ
ロローガスな哺乳動物プロモーターから容易に入手され
る。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４
０のウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限フラグ
メントとして簡便に入手される[FiersらのNature 273:1
13(1978)]。ヒトサイトメガロウイルスの即時型(immedi
ate early)プロモーターは、ＨindIIIＥ制限フラグメン
トとして簡便に入手される[Greenaway,P.J.らのGene 1
8:355-360(1982)]。
転写を制御するのに適したプロモーターは種々の供給
源、例えばポリオーマウイルス、ＳＶ４０、アデノウイ
ルス、ＭＭＶ(ステロイド誘発性)、レトロウイルス(例
えば、ＨＩＶのＬＴＲ)、Ｂ型肝炎ウイルス、および最
も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲ
ノムから、またはβ-アクチンプロモーターなどのヘテ
ロローガスな哺乳動物プロモーターから容易に入手され
る。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４
０のウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限フラグ
メントとして簡便に入手される[FiersらのNature 273:1
13(1978)]。ヒトサイトメガロウイルスの即時型(immedi
ate early)プロモーターは、ＨindIIIＥ制限フラグメン
トとして簡便に入手される[Greenaway,P.J.らのGene 1
8:355-360(1982)]。
【００５７】高等真核生物によるＤＮアーゼをコードし
ているＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を
挿入することにより増大される。エンハンサーは、プロ
モーターに作用して転写を増大させる、通常は約１０−
３００bp のＤＮＡのシス-作用性エレメントである。エ
ンハンサーはイントロン内部[Banerji,J.L.らのCell33:
729(1983)]、およびコード化配列自身の内部[Osborne,
T.F.らのMol.Cell Bio.4:1293(1984)]における転写ユニ
ットの５'側[Lamins,L.らのPNAS 78:993(1981)]および
３'側[Lusky,M.L.らのMol.Cell Bio.3:1108(1983)]に見
いだされている独立した位置および相対的な方向性を有
している。現在、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスタ
ーゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインス
リン)起源の多くのエンハンサー配列が知られている。
しかし、通常は真核生物細胞ウイルス起源のエンハンサ
ーを使用する。例えば、ＳＶ４０の複製起点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０bp)、サイト
メガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオ
ーマの複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、およびアデノウイルスエンハンサーなどである。
ているＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を
挿入することにより増大される。エンハンサーは、プロ
モーターに作用して転写を増大させる、通常は約１０−
３００bp のＤＮＡのシス-作用性エレメントである。エ
ンハンサーはイントロン内部[Banerji,J.L.らのCell33:
729(1983)]、およびコード化配列自身の内部[Osborne,
T.F.らのMol.Cell Bio.4:1293(1984)]における転写ユニ
ットの５'側[Lamins,L.らのPNAS 78:993(1981)]および
３'側[Lusky,M.L.らのMol.Cell Bio.3:1108(1983)]に見
いだされている独立した位置および相対的な方向性を有
している。現在、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスタ
ーゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインス
リン)起源の多くのエンハンサー配列が知られている。
しかし、通常は真核生物細胞ウイルス起源のエンハンサ
ーを使用する。例えば、ＳＶ４０の複製起点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０bp)、サイト
メガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオ
ーマの複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、およびアデノウイルスエンハンサーなどである。
【００５８】真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植
物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の核細胞)で
使用される発現ベクターはさらに、mＲＮＡの発現に影
響を与え得る転写終止に必須である配列も含有してい
る。これらの領域は、ＤＮアーゼをコードしているmＲ
ＮＡの非翻訳領域部分内のポリアデニル化セグメントと
して転写される。３'非翻訳領域も転写終止部位を含有
している。
物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の核細胞)で
使用される発現ベクターはさらに、mＲＮＡの発現に影
響を与え得る転写終止に必須である配列も含有してい
る。これらの領域は、ＤＮアーゼをコードしているmＲ
ＮＡの非翻訳領域部分内のポリアデニル化セグメントと
して転写される。３'非翻訳領域も転写終止部位を含有
している。
【００５９】発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれ
る選択遺伝子を含有することができる。哺乳動物細胞に
とって適切な選択マーカーには例えば、ジヒドロ葉酸還
元酵素(ＤＨＦＲ)、チミジンキナーゼ(ＴＫ)またはネオ
マイシンがある。このような選択マーカーを哺乳動物細
胞に導入するのに成功した場合、得られた形質転換哺乳
動物宿主細胞は、選択圧の下に置いても生存することが
できる。選択の手段には広範に使用される明確に異なっ
た２つのカテゴリーがある。第１のカテゴリーは細胞の
代謝を基礎とするものであり、捕捉培地とは独立して増
殖できる増殖能を欠いている突然変異セルラインを使用
することによる。２つの例を挙げれば、ＣＨＯ ＤＨＦ
Ｒ-細胞およびマウスＬＴＫ-細胞がある。これらの細胞
はチミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加し
なくても増殖できる増殖能を欠いている。これらの細胞
は完全なヌクレオチド合成経路のために必須な特定の遺
伝子を欠いているので、欠失したヌクレオチドをその捕
捉培地中に提供しないならば生存することができない。
培地を捕捉にするに替わるものは、無傷のＤＨＦＲまた
はＴＫ遺伝子を各それぞれの遺伝子を欠いている細胞に
導入し、それによりそれらの増殖要件を変化させること
である。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されてい
ない個々の細胞は非捕捉培地中では生存することができ
ない。
る選択遺伝子を含有することができる。哺乳動物細胞に
とって適切な選択マーカーには例えば、ジヒドロ葉酸還
元酵素(ＤＨＦＲ)、チミジンキナーゼ(ＴＫ)またはネオ
マイシンがある。このような選択マーカーを哺乳動物細
胞に導入するのに成功した場合、得られた形質転換哺乳
動物宿主細胞は、選択圧の下に置いても生存することが
できる。選択の手段には広範に使用される明確に異なっ
た２つのカテゴリーがある。第１のカテゴリーは細胞の
代謝を基礎とするものであり、捕捉培地とは独立して増
殖できる増殖能を欠いている突然変異セルラインを使用
することによる。２つの例を挙げれば、ＣＨＯ ＤＨＦ
Ｒ-細胞およびマウスＬＴＫ-細胞がある。これらの細胞
はチミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加し
なくても増殖できる増殖能を欠いている。これらの細胞
は完全なヌクレオチド合成経路のために必須な特定の遺
伝子を欠いているので、欠失したヌクレオチドをその捕
捉培地中に提供しないならば生存することができない。
培地を捕捉にするに替わるものは、無傷のＤＨＦＲまた
はＴＫ遺伝子を各それぞれの遺伝子を欠いている細胞に
導入し、それによりそれらの増殖要件を変化させること
である。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されてい
ない個々の細胞は非捕捉培地中では生存することができ
ない。
【００６０】第２のカテゴリーは、あらゆるタイプの細
胞に使用され、突然変異セルラインを必要としない選択
法とみなされる優性選択法である。これらの方法は通
常、宿主細胞の増殖を阻止するための薬物を使用する。
ヘテロロガースな遺伝子で形質転換するのに成功した細
胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現するので、
その選択法でも生存する。このような優性選択法に使用
する薬物には、ネオマイシン[ＳouthernらのJ.Molec.Ap
pl.Genet.1:327(1982)]、ミコフェノール酸[Ｍulligan
らのScience 209:1422(1980)]またはハイグロマイシン
[ＳugdenらのMol.Cell.Biol.5:410-413(1985)]がある。
この３つの例では、真核生物の制御下に細菌遺伝子を使
用し、それぞれ、適当な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイ
シン(ゲネチシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、またはハ
イグロマイシンに対する耐性を導入する。
胞に使用され、突然変異セルラインを必要としない選択
法とみなされる優性選択法である。これらの方法は通
常、宿主細胞の増殖を阻止するための薬物を使用する。
ヘテロロガースな遺伝子で形質転換するのに成功した細
胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現するので、
その選択法でも生存する。このような優性選択法に使用
する薬物には、ネオマイシン[ＳouthernらのJ.Molec.Ap
pl.Genet.1:327(1982)]、ミコフェノール酸[Ｍulligan
らのScience 209:1422(1980)]またはハイグロマイシン
[ＳugdenらのMol.Cell.Biol.5:410-413(1985)]がある。
この３つの例では、真核生物の制御下に細菌遺伝子を使
用し、それぞれ、適当な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイ
シン(ゲネチシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、またはハ
イグロマイシンに対する耐性を導入する。
【００６１】ヒトＤＮアーゼを発現させるのに適当な真
核生物宿主細胞には以下のものがある：ＳＶ４０で形質
転換されたサル腎ＣＶ１ライン[ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１]、ヒト胚腎ライン[２９３細胞または浮
遊培養液中で増殖させるためにサブクローンした２９３
細胞、Graham,F.L.らのJ.Gen Virol.36:59(1977)]、仔
ハムスター腎細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)、チ
ャイニーズハムスター卵巣-細胞-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Url
aub and Chasin,PNAS(USA)77:4216,(1980))、マウスセ
ルトリ細胞[ＴＭ４，Ｍather,J.P.,Biol.Reprod.23:243
-251(1980)]、サル腎細胞[ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７
０]、アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ-１５８７)、ヒト子宮頚癌細胞(ＨＥＬＡ、
ＡＴＣＣＣＣＬ２)、イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ３４)、バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３
Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)、ヒト肺細胞(Ｗ１３
８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)、ヒト肝細胞(Ｈep Ｇ２、Ｈ
Ｂ８０６５)、マウス乳癌(ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ５１)、およびＴＲＩ細胞(Mather,J.P.らのAn
nals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))。
核生物宿主細胞には以下のものがある：ＳＶ４０で形質
転換されたサル腎ＣＶ１ライン[ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１]、ヒト胚腎ライン[２９３細胞または浮
遊培養液中で増殖させるためにサブクローンした２９３
細胞、Graham,F.L.らのJ.Gen Virol.36:59(1977)]、仔
ハムスター腎細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)、チ
ャイニーズハムスター卵巣-細胞-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Url
aub and Chasin,PNAS(USA)77:4216,(1980))、マウスセ
ルトリ細胞[ＴＭ４，Ｍather,J.P.,Biol.Reprod.23:243
-251(1980)]、サル腎細胞[ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７
０]、アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ-１５８７)、ヒト子宮頚癌細胞(ＨＥＬＡ、
ＡＴＣＣＣＣＬ２)、イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ３４)、バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３
Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)、ヒト肺細胞(Ｗ１３
８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)、ヒト肝細胞(Ｈep Ｇ２、Ｈ
Ｂ８０６５)、マウス乳癌(ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ５１)、およびＴＲＩ細胞(Mather,J.P.らのAn
nals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))。
【００６２】所望のコード化および制御配列を含有する
適当なベクターを構築するには、標準的な連結法を利用
する。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを
開裂し、テーリングし、そして必要なプラスミドを形成
するに望ましい形態で連結する。
適当なベクターを構築するには、標準的な連結法を利用
する。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを
開裂し、テーリングし、そして必要なプラスミドを形成
するに望ましい形態で連結する。
【００６３】構築したプラスミドの正確な配列を確認す
る分析を行うには、得られた連結混合物をＥ.coli Ｋ１
２ 株２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)に導入し、アンピシ
リンまたはテトラサイクリン耐性によって適度に、成功
した形質転換体を選択する。形質転換体からプラスミド
を調製し、MessingらのNucleic Acids Res.9:309(1981)
の方法またはMaxamらのMethods in Enzymology 65:499
(1980)の方法による制限および／または配列決定によっ
て分析する。
る分析を行うには、得られた連結混合物をＥ.coli Ｋ１
２ 株２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)に導入し、アンピシ
リンまたはテトラサイクリン耐性によって適度に、成功
した形質転換体を選択する。形質転換体からプラスミド
を調製し、MessingらのNucleic Acids Res.9:309(1981)
の方法またはMaxamらのMethods in Enzymology 65:499
(1980)の方法による制限および／または配列決定によっ
て分析する。
【００６４】本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転
換し、プロモーターを誘導するに適した通常の改変栄養
培地中で培養し、形質転換体を選択しまたはＤＮアーゼ
遺伝子を増幅させる。ここに、温度、pＨなどの培養条
件は、発現のために選択する宿主細胞について従来から
使用されているものであり、当業者には明らかである。
換し、プロモーターを誘導するに適した通常の改変栄養
培地中で培養し、形質転換体を選択しまたはＤＮアーゼ
遺伝子を増幅させる。ここに、温度、pＨなどの培養条
件は、発現のために選択する宿主細胞について従来から
使用されているものであり、当業者には明らかである。
【００６５】「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素
として、または染色体の組込みのいずれかによって複製
できるようにそのＤＮＡを生物に導入すること、を意味
する。特に明記しない限り、宿主細胞の形質転換のため
に本発明で使用している方法は、Graham,F.およびvan d
er Eb,A.のVirology 52:456-457(1973)の方法である。
しかし、ＤＮＡを、核注入またはプロトプラスト融合な
どによって細胞に導入するための他の方法も使用するこ
とができる。原核生物細胞または、全体に細胞壁構築物
を含有している細胞を使用する場合、好ましいトランス
フェクション法は、コーエン(Cohen,F.N.らのProc.Nat
l.Acad.Sci.,U.S.A.,69:2110(1972))に記載されている
ような、塩化カルシウムを使用するカルシウム処置であ
る。
として、または染色体の組込みのいずれかによって複製
できるようにそのＤＮＡを生物に導入すること、を意味
する。特に明記しない限り、宿主細胞の形質転換のため
に本発明で使用している方法は、Graham,F.およびvan d
er Eb,A.のVirology 52:456-457(1973)の方法である。
しかし、ＤＮＡを、核注入またはプロトプラスト融合な
どによって細胞に導入するための他の方法も使用するこ
とができる。原核生物細胞または、全体に細胞壁構築物
を含有している細胞を使用する場合、好ましいトランス
フェクション法は、コーエン(Cohen,F.N.らのProc.Nat
l.Acad.Sci.,U.S.A.,69:2110(1972))に記載されている
ような、塩化カルシウムを使用するカルシウム処置であ
る。
【００６６】「トランスフェクション」とは、コード化
配列が最終的に発現されるか否かに関係無く、宿主細胞
にＤＮＡを導入することを意味する。トランスフェクシ
ョンの多くの方法は当業者に既知であり、例えばＣaＰ
Ｏ４および電気穿孔法などがある。宿主細胞の形質転換
が、トランスフェクションの成功を示す指標である。
配列が最終的に発現されるか否かに関係無く、宿主細胞
にＤＮＡを導入することを意味する。トランスフェクシ
ョンの多くの方法は当業者に既知であり、例えばＣaＰ
Ｏ４および電気穿孔法などがある。宿主細胞の形質転換
が、トランスフェクションの成功を示す指標である。
【００６７】ヒト、ウシ、ヒツジまたはブタＤＮアーゼ
についてこれまで使用されていた方法、例えば硫安また
はエタノール沈殿、酸抽出、陽イオンもしくは陰イオン
交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー(例えば、固相にあるＤＮ
Ａまたはヌクレオチドを使用する)、ヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーなどの方法によって、ＤＮアーゼは組換え細胞培養
物から回収精製される。さらに、ＤＮアーゼの精製に
は、逆相ＨＰＬＣおよび、抗-ＤＮアーゼ抗体を使用す
るクロマトグラフィーも有用である。従来から知られて
いたように(ＰriceらのJ.Biol.Chem.244:917(1969))、
精製時に存在するカルシウムイオンは低濃度(約０.１−
５mＭ)であることが好ましい。ＤＮアーゼを安定化する
他の二価陽イオンも使用される。ＤＮアーゼは、ＰＭＳ
Ｆなどのプロテアーゼインヒビターの存在下に精製する
ことができる。
についてこれまで使用されていた方法、例えば硫安また
はエタノール沈殿、酸抽出、陽イオンもしくは陰イオン
交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー(例えば、固相にあるＤＮ
Ａまたはヌクレオチドを使用する)、ヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーなどの方法によって、ＤＮアーゼは組換え細胞培養
物から回収精製される。さらに、ＤＮアーゼの精製に
は、逆相ＨＰＬＣおよび、抗-ＤＮアーゼ抗体を使用す
るクロマトグラフィーも有用である。従来から知られて
いたように(ＰriceらのJ.Biol.Chem.244:917(1969))、
精製時に存在するカルシウムイオンは低濃度(約０.１−
５mＭ)であることが好ましい。ＤＮアーゼを安定化する
他の二価陽イオンも使用される。ＤＮアーゼは、ＰＭＳ
Ｆなどのプロテアーゼインヒビターの存在下に精製する
ことができる。
【００６８】ヒトＤＮアーゼは、必要な共同因子(コフ
ァクター)と共に治療学的製剤中に加え、要すればウシ
膵ＤＮアーゼなどの動物ＤＮアーゼの場合と同じように
して投与される。ＤＮアーゼの製剤は液体であることが
でき、それはpＨ７で１.０mＭカルシウムを含有する、
１５０mＭ 塩化ナトリウムなどの等張性塩溶液であるこ
とが好ましい。塩化ナトリウムの濃度は７５−２５０m
Ｍ の範囲にすればよい。カルシウムの濃度は０.０１−
５mＭ の範囲にすればよく、ＤＮアーゼを安定化する他
の二価陽イオンも加えることができ、またはカルシウム
の代わりに使用することもできる。pＨは５.５−９.０
の範囲であればよく、加える二価陽イオンと適合する緩
衝液も利用することもできる。製剤は、カルシウムを含
有することもある凍結乾燥粉末であってよい。
ァクター)と共に治療学的製剤中に加え、要すればウシ
膵ＤＮアーゼなどの動物ＤＮアーゼの場合と同じように
して投与される。ＤＮアーゼの製剤は液体であることが
でき、それはpＨ７で１.０mＭカルシウムを含有する、
１５０mＭ 塩化ナトリウムなどの等張性塩溶液であるこ
とが好ましい。塩化ナトリウムの濃度は７５−２５０m
Ｍ の範囲にすればよい。カルシウムの濃度は０.０１−
５mＭ の範囲にすればよく、ＤＮアーゼを安定化する他
の二価陽イオンも加えることができ、またはカルシウム
の代わりに使用することもできる。pＨは５.５−９.０
の範囲であればよく、加える二価陽イオンと適合する緩
衝液も利用することもできる。製剤は、カルシウムを含
有することもある凍結乾燥粉末であってよい。
【００６９】ジェット噴霧器および超音波噴霧器などの
液体製剤のための市販されている噴霧器も投与に有用で
ある。液体製剤は直接噴霧することができ、また再構成
後に噴霧するよう凍結乾燥して粉末にすることもでき
る。あるいは、ＤＮアーゼはフルオロカーボン製剤およ
び用量規定吸入剤を使用してエアロゾル剤にすることが
でき、または凍結乾燥し粉砕した粉末として吸入するこ
ともできる。さらに、ＤＮアーゼの液体製剤は、挿管さ
れた患者に鼻管または気管内に直接滴下することができ
る。
液体製剤のための市販されている噴霧器も投与に有用で
ある。液体製剤は直接噴霧することができ、また再構成
後に噴霧するよう凍結乾燥して粉末にすることもでき
る。あるいは、ＤＮアーゼはフルオロカーボン製剤およ
び用量規定吸入剤を使用してエアロゾル剤にすることが
でき、または凍結乾燥し粉砕した粉末として吸入するこ
ともできる。さらに、ＤＮアーゼの液体製剤は、挿管さ
れた患者に鼻管または気管内に直接滴下することができ
る。
【００７０】粘液の粘-弾性または粘着性を酵素学的に
改変するのに、本発明の精製ＤＮアーゼは使用される。
ヒトＤＮアーゼは、急性もしくは慢性気管支肺疾患(感
染性肺炎、気管支炎または気管気管支炎、気管支拡張
症、嚢胞性線維症、喘息、ＴＢまたは菌類感染)、気管
もしくは気管支の埋状症に由来する肺拡張不全、および
気管切開に伴う合併症の症状を有する異常な、粘着性
の、または濃厚な分泌物を伴う肺疾患の患者を処置する
のに有用である。このような治療では、ヒトＤＮアーゼ
の溶液または細かに分割した乾燥調製物を、例えばＤＮ
アーゼ溶液のエアロゾルなどの気管支へ吸入する常法に
よって滴下する。ヒトＤＮアーゼはさらに、蓄膿、脳膜
炎、膿瘍、腹膜炎、副鼻腔炎、耳炎、歯周炎、心膜炎、
膵炎、胆石症、心内膜炎および敗血性関節炎など症状の
閉塞性または重篤な閉管性の感染症の改善管理のための
補助処置、ならびにヒフおよび／または粘液性膜、外科
的創傷、潰瘍性の損傷および火傷の感染損傷などの種々
の炎症および感染病巣の局所処置にも有用である。ヒト
ＤＮアーゼは、体腔と連結する医療用導管、例えば外科
的ドレナージ管、尿管カテーテル、腹膜透析口および気
管内酸素カテーテルなどの流通を維持するためにも有用
であることが見いだされている。ＤＮアーゼは感染にお
ける抗生物質の効能を高めることができる(例えば、ゲ
ンタマイシン活性は、無傷のＤＮＡとの可逆的な結合に
よって顕著に減少される)。さらに、ＤＮアーゼは膵不
全における経口用補助物質としても有用である。ＤＮア
ーゼは医薬調製物におけるＤＮＡ夾雑物を分解するのに
有用である：夾雑ＤＮＡをオリゴヌクレオチドにまで分
解する条件下でその医薬調製物をＤＮアーゼと接触さ
せ、次いでその調製物からオリゴヌクレオチドとＤＮア
ーゼを除去する。この場合、水-不溶性の支持体に結合
させたＤＮアーゼを使用すると便利である。最後に、Ｄ
Ｎアーゼは、細胞性ＤＮＡなどの細胞残骸の蓄積が存在
している非感染性の症状の処置に有用である。例えば、
ＤＮアーゼは、腎盂腎炎および、薬物誘発性のネフロパ
シーまたは急性細管ネクロシスなどの細管-間質性の腎
疾患(例えば、細胞残骸に続発する閉鎖型細管)の処置に
おいて全身投与した後に有用である。
改変するのに、本発明の精製ＤＮアーゼは使用される。
ヒトＤＮアーゼは、急性もしくは慢性気管支肺疾患(感
染性肺炎、気管支炎または気管気管支炎、気管支拡張
症、嚢胞性線維症、喘息、ＴＢまたは菌類感染)、気管
もしくは気管支の埋状症に由来する肺拡張不全、および
気管切開に伴う合併症の症状を有する異常な、粘着性
の、または濃厚な分泌物を伴う肺疾患の患者を処置する
のに有用である。このような治療では、ヒトＤＮアーゼ
の溶液または細かに分割した乾燥調製物を、例えばＤＮ
アーゼ溶液のエアロゾルなどの気管支へ吸入する常法に
よって滴下する。ヒトＤＮアーゼはさらに、蓄膿、脳膜
炎、膿瘍、腹膜炎、副鼻腔炎、耳炎、歯周炎、心膜炎、
膵炎、胆石症、心内膜炎および敗血性関節炎など症状の
閉塞性または重篤な閉管性の感染症の改善管理のための
補助処置、ならびにヒフおよび／または粘液性膜、外科
的創傷、潰瘍性の損傷および火傷の感染損傷などの種々
の炎症および感染病巣の局所処置にも有用である。ヒト
ＤＮアーゼは、体腔と連結する医療用導管、例えば外科
的ドレナージ管、尿管カテーテル、腹膜透析口および気
管内酸素カテーテルなどの流通を維持するためにも有用
であることが見いだされている。ＤＮアーゼは感染にお
ける抗生物質の効能を高めることができる(例えば、ゲ
ンタマイシン活性は、無傷のＤＮＡとの可逆的な結合に
よって顕著に減少される)。さらに、ＤＮアーゼは膵不
全における経口用補助物質としても有用である。ＤＮア
ーゼは医薬調製物におけるＤＮＡ夾雑物を分解するのに
有用である：夾雑ＤＮＡをオリゴヌクレオチドにまで分
解する条件下でその医薬調製物をＤＮアーゼと接触さ
せ、次いでその調製物からオリゴヌクレオチドとＤＮア
ーゼを除去する。この場合、水-不溶性の支持体に結合
させたＤＮアーゼを使用すると便利である。最後に、Ｄ
Ｎアーゼは、細胞性ＤＮＡなどの細胞残骸の蓄積が存在
している非感染性の症状の処置に有用である。例えば、
ＤＮアーゼは、腎盂腎炎および、薬物誘発性のネフロパ
シーまたは急性細管ネクロシスなどの細管-間質性の腎
疾患(例えば、細胞残骸に続発する閉鎖型細管)の処置に
おいて全身投与した後に有用である。
【００７１】ＤＮアーゼは、上記の疾患を処置するのに
使用される他の薬理学的物質、例えば抗生物質、気管支
拡張剤、抗-炎症剤、および粘液溶解剤(例えばn-アセチ
ル-システイン)と共に投与することもできる。さらに、
成長ホルモン、プロテアーゼインヒビター、γ−インタ
ーフェロン、エンケファリナーゼ、肺表面活性剤および
コロニー刺激因子などの他の治療用ヒトタンパク質と共
にＤＮアーゼを投与するのも有用である。
使用される他の薬理学的物質、例えば抗生物質、気管支
拡張剤、抗-炎症剤、および粘液溶解剤(例えばn-アセチ
ル-システイン)と共に投与することもできる。さらに、
成長ホルモン、プロテアーゼインヒビター、γ−インタ
ーフェロン、エンケファリナーゼ、肺表面活性剤および
コロニー刺激因子などの他の治療用ヒトタンパク質と共
にＤＮアーゼを投与するのも有用である。
【００７２】以下の実施例で頻繁に使用している特定の
方法および／または用語の理解を助けるため、その説明
を以下に行う。
方法および／または用語の理解を助けるため、その説明
を以下に行う。
【００７３】「プラスミド」は、大文字および／または
数字が前後いずにかにある小文字のpによって表す。本
発明における出発プラスミドは、市販されているか、無
制限に公から入手可能であり、または公知文献に基づき
入手可能なプラスミドから構築することができる。さら
に、本明細書に記載のプラスミドと等価のものも当業界
では既知であり、当業者には明らかである。
数字が前後いずにかにある小文字のpによって表す。本
発明における出発プラスミドは、市販されているか、無
制限に公から入手可能であり、または公知文献に基づき
入手可能なプラスミドから構築することができる。さら
に、本明細書に記載のプラスミドと等価のものも当業界
では既知であり、当業者には明らかである。
【００７４】ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの特定の配
列においてのみ作用する制限酵素によってＤＮＡを触媒
的に開裂することを意味する。本発明で使用する種々の
制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補酵素
および他の使用される要件は当業者には既知であろう。
分析のためには、通常、プラスミドまたはＤＮＡフラグ
メント１μｇを、緩衝溶液約２０μｌ中、酵素約２単位
と共に使用する。プラスミドの構築のためにＤＮＡフラ
グメントを単離するためには通常、ＤＮＡ５から５０μ
ｇを、大容量用いて酵素２０から２５０単位で消化す
る。ある種の制限酵素にとって適当な緩衝液および基質
の量は、製造業者で特定されている。インキュベート時
間は通常、３７℃で約１時間であるが、取り扱い説明書
に従って変動させることができる。反応物を消化した
後、直接ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、所望
のフラグメントを単離する。
列においてのみ作用する制限酵素によってＤＮＡを触媒
的に開裂することを意味する。本発明で使用する種々の
制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補酵素
および他の使用される要件は当業者には既知であろう。
分析のためには、通常、プラスミドまたはＤＮＡフラグ
メント１μｇを、緩衝溶液約２０μｌ中、酵素約２単位
と共に使用する。プラスミドの構築のためにＤＮＡフラ
グメントを単離するためには通常、ＤＮＡ５から５０μ
ｇを、大容量用いて酵素２０から２５０単位で消化す
る。ある種の制限酵素にとって適当な緩衝液および基質
の量は、製造業者で特定されている。インキュベート時
間は通常、３７℃で約１時間であるが、取り扱い説明書
に従って変動させることができる。反応物を消化した
後、直接ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、所望
のフラグメントを単離する。
【００７５】得られた開裂フラグメントのサイズ分離
は、８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行う[Goedd
el,D.らのNucleic Acids Res.,8:4057(1980)]。
は、８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行う[Goedd
el,D.らのNucleic Acids Res.,8:4057(1980)]。
【００７６】「脱リン酸化」は、細菌アルカリホスファ
ターゼ(ＢＡＰ)処置による末端５'リン酸の除去を意味
する。この操作により、ＤＮＡフラグメントの２つの制
限開裂末端が「環状化すること」または、制限部位に他
のＤＮＡフラグメントが挿入するのを妨害しかねない閉
鎖系ループの形成が防がれる。脱リン酸化の操作法およ
び試薬は既知である。Maniatis,T.らのMolecular Cloni
ng 133-134(1982)。ＢＡＰを使用する反応は、５０mＭ
トリス中、６８℃で行い、酵素調製物に存在する場合が
あるエンドヌクレアーゼの活性を抑える。反応は１時間
行った。反応後、得られたＤＮＡフラグメントをゲル精
製する。
ターゼ(ＢＡＰ)処置による末端５'リン酸の除去を意味
する。この操作により、ＤＮＡフラグメントの２つの制
限開裂末端が「環状化すること」または、制限部位に他
のＤＮＡフラグメントが挿入するのを妨害しかねない閉
鎖系ループの形成が防がれる。脱リン酸化の操作法およ
び試薬は既知である。Maniatis,T.らのMolecular Cloni
ng 133-134(1982)。ＢＡＰを使用する反応は、５０mＭ
トリス中、６８℃で行い、酵素調製物に存在する場合が
あるエンドヌクレアーゼの活性を抑える。反応は１時間
行った。反応後、得られたＤＮＡフラグメントをゲル精
製する。
【００７７】「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合
成することのできる１本鎖ポリデオキシヌクレオチドま
たは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味す
る。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を
有していないので、キナーゼの存在下、ＡＴＰと共にリ
ン酸を添加しなければ、他のオリゴヌクレオチドとは連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されて
いないフラグメントと連結する。
成することのできる１本鎖ポリデオキシヌクレオチドま
たは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味す
る。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を
有していないので、キナーゼの存在下、ＡＴＰと共にリ
ン酸を添加しなければ、他のオリゴヌクレオチドとは連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されて
いないフラグメントと連結する。
【００７８】「連結」とは、２本鎖核酸フラグメント間
にホスホジエステル結合を形成させる方法を意味する[M
aniatis,T.らの前掲,146頁]。特に明記しない限り、連
結は、連結するＤＮＡフラグメントのおよそ等モル量
０.５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ(リガーゼ)１０単
位を用いる既知の緩衝液および条件を使用して行うこと
ができる。
にホスホジエステル結合を形成させる方法を意味する[M
aniatis,T.らの前掲,146頁]。特に明記しない限り、連
結は、連結するＤＮＡフラグメントのおよそ等モル量
０.５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ(リガーゼ)１０単
位を用いる既知の緩衝液および条件を使用して行うこと
ができる。
【００７９】「充填」または「平滑末端化」とは、制限
酵素で開裂した核酸の粘着末端における１本鎖の末端を
２本鎖に変換させるための操作を意味する。この方法
は、ただ１つのまたは幾つかの他の制限酵素によって作
成された末端のおかげで結合能を有し得る制限的な切断
末端を、平滑切断制限エンドヌクレアーゼと適合する末
端または他の充填された粘着末端に変換するための応用
範囲の広い手段である。通常、平滑末端化は、１０mＭ
ＭgＣl２、１mＭ ジチオトレイトール、５０mＭＮaＣ
l、１０mＭ トリス(pＨ７.５)緩衝液中、約３７℃で、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー酵素８単位および２５
０μＭ の各４つのデオキシヌクレオチド３リン酸の存
在下に、標的ＤＮＡ２−１５μｇをインキュベートする
ことによって行われる。インキュベートは一般に、約３
０分後の、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿によって終了させる。
酵素で開裂した核酸の粘着末端における１本鎖の末端を
２本鎖に変換させるための操作を意味する。この方法
は、ただ１つのまたは幾つかの他の制限酵素によって作
成された末端のおかげで結合能を有し得る制限的な切断
末端を、平滑切断制限エンドヌクレアーゼと適合する末
端または他の充填された粘着末端に変換するための応用
範囲の広い手段である。通常、平滑末端化は、１０mＭ
ＭgＣl２、１mＭ ジチオトレイトール、５０mＭＮaＣ
l、１０mＭ トリス(pＨ７.５)緩衝液中、約３７℃で、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー酵素８単位および２５
０μＭ の各４つのデオキシヌクレオチド３リン酸の存
在下に、標的ＤＮＡ２−１５μｇをインキュベートする
ことによって行われる。インキュベートは一般に、約３
０分後の、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿によって終了させる。
【００８０】
【実施例】実施例１ ヒト膵ＤＮアーゼＩのクローニング cＤＮＡライブラリーの調製 入手したばかりの液体窒素凍結化ヒト膵臓から調製した
ポリアデニル化ＲＮＡを使用し、λgt１０においてヒト
膵cＤＮＡライブラリーを構築した[LaufferらのNature
318:334(1985)]。オリゴdＴプライマーおよびＥcoＲＩ-
ＳalＩ-ＸhoＩ-ＳstIIアダプターを使用し、６００bp
よりも大きな０.９×１０6個の独立した単離体のcＤＮ
Ａライブラリーを得た。
ポリアデニル化ＲＮＡを使用し、λgt１０においてヒト
膵cＤＮＡライブラリーを構築した[LaufferらのNature
318:334(1985)]。オリゴdＴプライマーおよびＥcoＲＩ-
ＳalＩ-ＸhoＩ-ＳstIIアダプターを使用し、６００bp
よりも大きな０.９×１０6個の独立した単離体のcＤＮ
Ａライブラリーを得た。
【００８１】オリゴヌクレオチドプローブ ２つの長いプローブをウシＤＮアーゼＩのアミノ酸配列
に基づいて合成した。縮重度(リダンダンシー,redundan
cy)の低い２つのアミノ酸配列セグメントを選択し、哺
乳動物のコドンユーセイジ表を使用した。
に基づいて合成した。縮重度(リダンダンシー,redundan
cy)の低い２つのアミノ酸配列セグメントを選択し、哺
乳動物のコドンユーセイジ表を使用した。
【００８２】プローブ１：５’GTG-CTG-GAC-ACC-TAC-CA
G-TAT-GAT-GAT-GGC-TGT-GAG-TCC-TGT-GGC-AAT-GAC３’ (Ｖal-Ｌeu-Ａsp-Ｔhr-Ｔyr-Ｇln-Ｔyr-Ａsp-Ａsp-Ｇly
-Ｃys-Ｇlu-Ｓer-Ｃys-Ｇly-Ａsn-Ａspのアミノ酸配列
に対応する５１merである)
G-TAT-GAT-GAT-GGC-TGT-GAG-TCC-TGT-GGC-AAT-GAC３’ (Ｖal-Ｌeu-Ａsp-Ｔhr-Ｔyr-Ｇln-Ｔyr-Ａsp-Ａsp-Ｇly
-Ｃys-Ｇlu-Ｓer-Ｃys-Ｇly-Ａsn-Ａspのアミノ酸配列
に対応する５１merである)
【００８３】プローブ２：５’TAT-GAC-GTC-TAC-CTG-GA
C-GTG-CAG-CAG-AAG-TGG-CAT-CTG-AAT-GAT-GTG-ATG-CTG-
ATG-GGC-GAC-TTC-AAC-GC３’ (Ｔyr-Ａsp-Ｖal-Ｔyr-Ｌeu-Ａsp-Ｖal-Ｇln-Ｇln-Ｌys
-Ｔrp-Ｈis-Ｌeu-Ａsn-Ａsp-Ｖal-Ｍet-Ｌeu-Ｍet-Ｇly
-Ａsp-Ｐhe-Ａsnのアミノ酸配列に対応する７１merであ
る)
C-GTG-CAG-CAG-AAG-TGG-CAT-CTG-AAT-GAT-GTG-ATG-CTG-
ATG-GGC-GAC-TTC-AAC-GC３’ (Ｔyr-Ａsp-Ｖal-Ｔyr-Ｌeu-Ａsp-Ｖal-Ｇln-Ｇln-Ｌys
-Ｔrp-Ｈis-Ｌeu-Ａsn-Ａsp-Ｖal-Ｍet-Ｌeu-Ｍet-Ｇly
-Ａsp-Ｐhe-Ａsnのアミノ酸配列に対応する７１merであ
る)
【００８４】ヒトＤＮアーゼＩcＤＮＡクローンの単離 上記２つのプローブをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼお
よび[32Ｐ]アデノシン３リン酸によって末端標識し[Man
iatisらのMolecular Cloning,Cold Spring Harbar Labo
ratory,1982]、それを別々に使用して低いストリンジェ
ンシーのハイブリダイゼーション条件下、ヒト膵cＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした[２０％ホルムア
ミド、５×ＳＳＣ(０.７５Ｍ ＮaＣl、０.０７５Ｍ ク
エン酸ナトリウム)、５０mＭ リン酸ナトリウム(pＨ６.
８)、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶
液、音波処理済みサケ精液ＤＮＡ(５０μｇ/ml)、０.１
％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸、４２℃]。
１×ＳＤＳおよび０.１％ＳＤＳ(４２℃)で、低いスト
リンジェンシー洗浄を行った。６００,０００個の３つ
のクローン(１、２および６)が上記の両プローブとハイ
ブリダイズし、それらは１.３kb 挿入体を含有してい
た。これらをＭ１３ベクター[MessingらのNucleicAcids
Res.9:309(1981)]にサブクローンし、鎖-終止法(chain
-termination method)によって配列決定した[Sangerら
のJ.Mol.Biol.143:161(1980)]。
よび[32Ｐ]アデノシン３リン酸によって末端標識し[Man
iatisらのMolecular Cloning,Cold Spring Harbar Labo
ratory,1982]、それを別々に使用して低いストリンジェ
ンシーのハイブリダイゼーション条件下、ヒト膵cＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした[２０％ホルムア
ミド、５×ＳＳＣ(０.７５Ｍ ＮaＣl、０.０７５Ｍ ク
エン酸ナトリウム)、５０mＭ リン酸ナトリウム(pＨ６.
８)、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶
液、音波処理済みサケ精液ＤＮＡ(５０μｇ/ml)、０.１
％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸、４２℃]。
１×ＳＤＳおよび０.１％ＳＤＳ(４２℃)で、低いスト
リンジェンシー洗浄を行った。６００,０００個の３つ
のクローン(１、２および６)が上記の両プローブとハイ
ブリダイズし、それらは１.３kb 挿入体を含有してい
た。これらをＭ１３ベクター[MessingらのNucleicAcids
Res.9:309(1981)]にサブクローンし、鎖-終止法(chain
-termination method)によって配列決定した[Sangerら
のJ.Mol.Biol.143:161(1980)]。
【００８５】クローン６の推定アミノ酸配列をウシ膵Ｄ
ＮアーゼＩのアミノ酸配列と比較したところ、広範なホ
モロジー(相同性)を見いだした。しかし、クローン６の
推定アミノ酸配列内には、大きな欠失と大きな挿入が明
らかに認められた。さらに、その挿入体はその末端に終
止を含有しており、誤って配置されたメッセイジにより
保持されたイントロンの特性を有していた。クローン１
および２も推定イントロンを含有していた。
ＮアーゼＩのアミノ酸配列と比較したところ、広範なホ
モロジー(相同性)を見いだした。しかし、クローン６の
推定アミノ酸配列内には、大きな欠失と大きな挿入が明
らかに認められた。さらに、その挿入体はその末端に終
止を含有しており、誤って配置されたメッセイジにより
保持されたイントロンの特性を有していた。クローン１
および２も推定イントロンを含有していた。
【００８６】さらにクローンを入手するために、クロー
ン６から正確なヌクレオチドプローブをさらに２つ合成
した。 プローブ４(Ｎ-末端プローブ)：５'CTG-AAG-ATC-GCA-GC
C-TTC-AAC-ATC-CAG-ACA-TTT-GGG-GAG-ACC(４２mer) プローブ５(推定イントロンプローブ)：５'TCC-GCA-TGT
-CCC-AGG-GCC-ACA-GGC-AGC-GTT-TCC-TGG-TAG-GAC(４２m
er) これらのプローブを32Ｐで標識し、それを使用してヒト
膵cＤＮＡライブラリー由来の１.３×１０6個のクロー
ンを、高いストリンジェンシーで再度スクリーニングし
た[５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０.７５Ｍ ＮaＣ
l、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム)、５０mＭ リン酸
ナトリウム(pＨ６.８)、０.１％ピロリン酸ナトリウ
ム、５×デンハート溶液、音波処理済みサケ精液ＤＮＡ
(５０μｇ/ml)、０.１％ＳＤＳ、および１０％デキスト
ラン硫酸、４２℃]。０.２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤ
Ｓ中、４２℃で洗浄を行った。４つのクローンがプロー
ブ４(Ｎ-末端プローブ)とハイブリダイズしたが、プロ
ーブ５(推定イントロンプローブ)とはハイブリダイズし
なかった。これらのうち、ＰＡＧＥに基づいて約１.１k
bの挿入体を含有しているクローン１８-１をＭ１３にサ
ブクローンし、配列決定した。クローン１８-１の完全
ヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を図１に
示す。
ン６から正確なヌクレオチドプローブをさらに２つ合成
した。 プローブ４(Ｎ-末端プローブ)：５'CTG-AAG-ATC-GCA-GC
C-TTC-AAC-ATC-CAG-ACA-TTT-GGG-GAG-ACC(４２mer) プローブ５(推定イントロンプローブ)：５'TCC-GCA-TGT
-CCC-AGG-GCC-ACA-GGC-AGC-GTT-TCC-TGG-TAG-GAC(４２m
er) これらのプローブを32Ｐで標識し、それを使用してヒト
膵cＤＮＡライブラリー由来の１.３×１０6個のクロー
ンを、高いストリンジェンシーで再度スクリーニングし
た[５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０.７５Ｍ ＮaＣ
l、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム)、５０mＭ リン酸
ナトリウム(pＨ６.８)、０.１％ピロリン酸ナトリウ
ム、５×デンハート溶液、音波処理済みサケ精液ＤＮＡ
(５０μｇ/ml)、０.１％ＳＤＳ、および１０％デキスト
ラン硫酸、４２℃]。０.２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤ
Ｓ中、４２℃で洗浄を行った。４つのクローンがプロー
ブ４(Ｎ-末端プローブ)とハイブリダイズしたが、プロ
ーブ５(推定イントロンプローブ)とはハイブリダイズし
なかった。これらのうち、ＰＡＧＥに基づいて約１.１k
bの挿入体を含有しているクローン１８-１をＭ１３にサ
ブクローンし、配列決定した。クローン１８-１の完全
ヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を図１に
示す。
【００８７】クローン１８-１は１０３９bp から構成さ
れ、クローン６に見いだされるイントロンを含有するこ
とのない長いオープン解読フレームを有している。気付
かれようが、あり得る開始コドン(ＡＴＧ)は２つ存在し
ている(１６０-１６２位および１６９-１７１位)。いず
れも使用可能である。−３位にプリンを有する前者のＡ
ＴＧは、より正確にコザック則[Kozak,Cell 44:283(198
6)]に従う。推定開始コドンとＮ-末端ロイシンに相当す
るヌクレオチド(２２６−２２８位のＣＴＧ)との間は、
分泌シグナル配列であり得る短い比較的疎水性のアミノ
酸配列(１９−２２の長さのアミノ酸)をコードしている
ヌクレオチドである。
れ、クローン６に見いだされるイントロンを含有するこ
とのない長いオープン解読フレームを有している。気付
かれようが、あり得る開始コドン(ＡＴＧ)は２つ存在し
ている(１６０-１６２位および１６９-１７１位)。いず
れも使用可能である。−３位にプリンを有する前者のＡ
ＴＧは、より正確にコザック則[Kozak,Cell 44:283(198
6)]に従う。推定開始コドンとＮ-末端ロイシンに相当す
るヌクレオチド(２２６−２２８位のＣＴＧ)との間は、
分泌シグナル配列であり得る短い比較的疎水性のアミノ
酸配列(１９−２２の長さのアミノ酸)をコードしている
ヌクレオチドである。
【００８８】ヒトＤＮアーゼＩの推定アミノ酸配列をウ
シＤＮアーゼＩと比較することにより、膨大なアミノ酸
相同性が明らかとなった(図２)。ヒトおよびウシタンパ
ク質は２６０aaの長さであり、Ｎ-末端ロイシンを有し
ている。ウシタンパク質の主要な構造的特徴、例えば４
つのシステイン(１０１、１０４、１７３および２０
９)、２つのＮ-連結グリコシル化部位(１８および１０
６)および活性部位のヒスチジン(１３４)は保存されて
いる。全体的に約７７％のアミノ酸が同一である。
シＤＮアーゼＩと比較することにより、膨大なアミノ酸
相同性が明らかとなった(図２)。ヒトおよびウシタンパ
ク質は２６０aaの長さであり、Ｎ-末端ロイシンを有し
ている。ウシタンパク質の主要な構造的特徴、例えば４
つのシステイン(１０１、１０４、１７３および２０
９)、２つのＮ-連結グリコシル化部位(１８および１０
６)および活性部位のヒスチジン(１３４)は保存されて
いる。全体的に約７７％のアミノ酸が同一である。
【００８９】最も大きなアミノ酸変動の６つの領域(ア
ミノ酸残基２７−３９、８３−９６、１１５−１２６、
１５６−１６１、２１９−２３４および２３４−２４
７)それぞれは、３つ以上の相違を含有しており、５４
％以上の意味が変動している。興味深いことに、これら
の配列は、ウシ配列をヒツジおよびブタのものと比較し
た場合にも変動している。これらの領域は、ウシＤＮア
ーゼのＸ線結晶構造によれば暴露されたループ構造のも
のがあり[OefnerらのJ.Mol.Biol.192:605(1986)]、従っ
て比較的免疫原性であると予想できよう。このように、
ヒトおよびウシの配列間のアミノ酸の相違は免疫反応を
導きかねないと思われる。
ミノ酸残基２７−３９、８３−９６、１１５−１２６、
１５６−１６１、２１９−２３４および２３４−２４
７)それぞれは、３つ以上の相違を含有しており、５４
％以上の意味が変動している。興味深いことに、これら
の配列は、ウシ配列をヒツジおよびブタのものと比較し
た場合にも変動している。これらの領域は、ウシＤＮア
ーゼのＸ線結晶構造によれば暴露されたループ構造のも
のがあり[OefnerらのJ.Mol.Biol.192:605(1986)]、従っ
て比較的免疫原性であると予想できよう。このように、
ヒトおよびウシの配列間のアミノ酸の相違は免疫反応を
導きかねないと思われる。
【００９０】実施例２ ＤＮアーゼ活性の検定 標準的なＥＬＩＳＡ(実施例４参照)およびＲＩＡに加
え、ＤＮアーゼ活性を検出するための３つの検定法が開
発されている。１．32 Ｐ-標識化ＤＮＡの加水分解 Ｍ１３ の１本鎖鋳型、１７merの配列決定プライマー、
32Ｐ-dＣＴＰ、非-放射活性dＡＴＰ、dＴＴＰおよびdＧ
ＴＰ、およびクレノーを使用し、放射線標識化32Ｐ-Ｄ
ＮＡを調製した。簡単に説明すれば、１.５λＭgＣl２
(３５mＭ)、１.５λ １０×制限緩衝液(７０mＭ トリス
-ＨＣl、pＨ７.６、３５mＭ ジチオトレイトール、１m
Ｍ ＥＤＴＡ)、および６λ水を、１λ鋳型(約１μｇ)お
よび１.５λＰalmer(０.５μＭ)と混合し、５５℃に７
分間加熱した。４０λ32Ｐ-dＣＴＰ(比活性３０００Ｃi
／mmol；４００μＣi)および非放射活性dＡＴＰ、dＴＴ
ＰおよびdＧＴＰの２mＭ ストックの各１λを乾固さ
せ、次いで７λ１×制限緩衝液中で、ヌクレオチドを再
構成することにより、ヌクレオチドミックスを調製し
た。このヌクレオチドミックスおよび１λクレノーを鋳
型-プライマー混合物に加え、得られた反応物を３７℃
でインキュベートした。１５分後、２λの非-放射活性
デオキシヌクレオチドを加え、さらに１５分間インキュ
ベートを続けた。次いで、セファデックスＧ-５０の遠
心により、放射標識化ＤＮＡを遊離のヌクレオチドから
分離した[Ｍaniatisら,1982]。
え、ＤＮアーゼ活性を検出するための３つの検定法が開
発されている。１．32 Ｐ-標識化ＤＮＡの加水分解 Ｍ１３ の１本鎖鋳型、１７merの配列決定プライマー、
32Ｐ-dＣＴＰ、非-放射活性dＡＴＰ、dＴＴＰおよびdＧ
ＴＰ、およびクレノーを使用し、放射線標識化32Ｐ-Ｄ
ＮＡを調製した。簡単に説明すれば、１.５λＭgＣl２
(３５mＭ)、１.５λ １０×制限緩衝液(７０mＭ トリス
-ＨＣl、pＨ７.６、３５mＭ ジチオトレイトール、１m
Ｍ ＥＤＴＡ)、および６λ水を、１λ鋳型(約１μｇ)お
よび１.５λＰalmer(０.５μＭ)と混合し、５５℃に７
分間加熱した。４０λ32Ｐ-dＣＴＰ(比活性３０００Ｃi
／mmol；４００μＣi)および非放射活性dＡＴＰ、dＴＴ
ＰおよびdＧＴＰの２mＭ ストックの各１λを乾固さ
せ、次いで７λ１×制限緩衝液中で、ヌクレオチドを再
構成することにより、ヌクレオチドミックスを調製し
た。このヌクレオチドミックスおよび１λクレノーを鋳
型-プライマー混合物に加え、得られた反応物を３７℃
でインキュベートした。１５分後、２λの非-放射活性
デオキシヌクレオチドを加え、さらに１５分間インキュ
ベートを続けた。次いで、セファデックスＧ-５０の遠
心により、放射標識化ＤＮＡを遊離のヌクレオチドから
分離した[Ｍaniatisら,1982]。
【００９１】試料を１００,０００cpmの32Ｐ-ＤＮＡお
よび、ＤＮアーゼ緩衝液(１０mＭ トリス-ＨＣｌpＨ
７、４mＭ ＭgＣl２、４mＭ ＣaＣl２)中、８０μｇ/m
ｌ非-放射活性サケ精液ＤＮＡと共に３７℃で４５分
間、インキュベートすることにより、ＤＮアーゼ活性を
測定する。１.５容量の非-放射活性ＤＮＡ(２mｇ/ml)お
よび１容量の氷冷２０％トリクロロ酢酸を添加して反応
を終止させる。４℃１０分間経過後、混合物を１２,０
００Ｇ×１０分で遠心し、上清をカウントする。上清中
の酸-溶解性のカウントの存在は、ＤＮアーゼ活性を反
映するものである。ウシＤＮアーゼＩ(シグマＤ-５０２
５)０.１−２００nｇを試験することにより、毎日、標
準曲線を作成する。
よび、ＤＮアーゼ緩衝液(１０mＭ トリス-ＨＣｌpＨ
７、４mＭ ＭgＣl２、４mＭ ＣaＣl２)中、８０μｇ/m
ｌ非-放射活性サケ精液ＤＮＡと共に３７℃で４５分
間、インキュベートすることにより、ＤＮアーゼ活性を
測定する。１.５容量の非-放射活性ＤＮＡ(２mｇ/ml)お
よび１容量の氷冷２０％トリクロロ酢酸を添加して反応
を終止させる。４℃１０分間経過後、混合物を１２,０
００Ｇ×１０分で遠心し、上清をカウントする。上清中
の酸-溶解性のカウントの存在は、ＤＮアーゼ活性を反
映するものである。ウシＤＮアーゼＩ(シグマＤ-５０２
５)０.１−２００nｇを試験することにより、毎日、標
準曲線を作成する。
【００９２】２．寒天プレートＤＮアーゼ検定 スミス(Smith)、ハンコック(Hankock)およびローデン(R
hoden)[Applied Microbiology,18:991(1969)]には、微
生物のＤＮアーゼ活性を測定するための、メチルグリー
ンおよびＤＮＡを含有する試験寒天が記載されている。
この検定は、細胞上清をスクリーニングして発現をモニ
ターし、カラム分画をスクリーニングして精製度をモニ
ターするための可溶性ＤＮアーゼ活性の迅速半-定量検
定を開発するために改変されたものである。この寒天を
調製するには、バクト寒天(７.５ｇ)を緩衝液(２５mＭ
トリスpＨ７.５、５mＭ ＭgＣl２、５mＭ ＣaＣl２、
０.１％アジ化ナトリウム)５００mｌ中で溶融する。サ
ケ精液ＤＮＡ(１.０ｇ)およびメチルグリーン(１７．５
mｇ)を加える。５５℃で１−２時間撹拌し、オートクレ
ーブ処理した後、プレートを入れ、４℃で保存する。そ
のプレートに０.５−５λ試料をスポットし、それを室
温または３７℃で４−４８時間インキュベートすること
により、ＤＮアーゼ活性を測定する。ウシＤＮアーゼＩ
０．１−１０００nｇを標本として、標準曲線を作成す
る。寒天上の明瞭なゾーンの大きさによってＤＮアーゼ
は容易に測定され、そこにはＤＮアーゼ濃度と明瞭なゾ
ーンの直径との間に対数関数的な相関関係が存在する。
この検定法は、ＤＮアーゼを選択マーカーまたはレポー
ター遺伝子として使用する形質転換体のスクリーニン
グ、またはＤＮアーゼの産生のいずれかを目的とし、発
現ＤＮアーゼを高度に産生するクローンを迅速に同定す
る場合にも適用することができる。
hoden)[Applied Microbiology,18:991(1969)]には、微
生物のＤＮアーゼ活性を測定するための、メチルグリー
ンおよびＤＮＡを含有する試験寒天が記載されている。
この検定は、細胞上清をスクリーニングして発現をモニ
ターし、カラム分画をスクリーニングして精製度をモニ
ターするための可溶性ＤＮアーゼ活性の迅速半-定量検
定を開発するために改変されたものである。この寒天を
調製するには、バクト寒天(７.５ｇ)を緩衝液(２５mＭ
トリスpＨ７.５、５mＭ ＭgＣl２、５mＭ ＣaＣl２、
０.１％アジ化ナトリウム)５００mｌ中で溶融する。サ
ケ精液ＤＮＡ(１.０ｇ)およびメチルグリーン(１７．５
mｇ)を加える。５５℃で１−２時間撹拌し、オートクレ
ーブ処理した後、プレートを入れ、４℃で保存する。そ
のプレートに０.５−５λ試料をスポットし、それを室
温または３７℃で４−４８時間インキュベートすること
により、ＤＮアーゼ活性を測定する。ウシＤＮアーゼＩ
０．１−１０００nｇを標本として、標準曲線を作成す
る。寒天上の明瞭なゾーンの大きさによってＤＮアーゼ
は容易に測定され、そこにはＤＮアーゼ濃度と明瞭なゾ
ーンの直径との間に対数関数的な相関関係が存在する。
この検定法は、ＤＮアーゼを選択マーカーまたはレポー
ター遺伝子として使用する形質転換体のスクリーニン
グ、またはＤＮアーゼの産生のいずれかを目的とし、発
現ＤＮアーゼを高度に産生するクローンを迅速に同定す
る場合にも適用することができる。
【００９３】ＤＮアーゼ活性を迅速に、かつ選択的に、
かつ特異的に定量するには、メチルグリーンおよびＤＮ
Ａを寒天プレート法に使用するに加え、これらの試薬を
水性状態(例えば、９６-ウエル平板)で使用する。
かつ特異的に定量するには、メチルグリーンおよびＤＮ
Ａを寒天プレート法に使用するに加え、これらの試薬を
水性状態(例えば、９６-ウエル平板)で使用する。
【００９４】３．ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびキモグラフィー(xymography) RosenthalおよびLacks[Anal.Biochem.80:76(1977)]の操
作の変法によって、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動およびキモグラフィーを行った。簡単に説明すれ
ば、Ｌaemmliの緩衝系を使用し、１２％ポリアクリルア
ミドゲルを調製した。ポリマー化の前に、サケ精液ＤＮ
Ａ(１０μｇ/ml)およびＥＤＴＡ(２mＭ)を、積み重ねゲ
ルおよび溶解ゲルの両者に添加した。適用の前に、タン
パク質を試料緩衝液中に懸濁し、１００℃で３分間加熱
した。電気泳動は室温、一定電流で行った。電気泳動の
後、得られたゲルを水ですすぎ、４０mＭ トリス-ＨＣ
ｌpＨ７．５、２mＭ ＭgＣl２、０．０２％アジドの２
５０mｌ中でインキュベートした。ＤＮアーゼ活性を調
べるため、２mＭ ＣaＣl２および１μｇ/mｌ臭化エチジ
ウムを含有する新鮮緩衝液中にゲルを入れ、次いで５分
から２４時間の間隔で短波長ＵＶ光の下に調査した。反
応を停止させるため、ＥＤＴＡを加え(終濃度１５m
Ｍ)、キモグラムを撮影した。次いで、そのゲルはタン
パク質のためにクーマシーブルーによって染色すること
ができる。
泳動およびキモグラフィー(xymography) RosenthalおよびLacks[Anal.Biochem.80:76(1977)]の操
作の変法によって、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動およびキモグラフィーを行った。簡単に説明すれ
ば、Ｌaemmliの緩衝系を使用し、１２％ポリアクリルア
ミドゲルを調製した。ポリマー化の前に、サケ精液ＤＮ
Ａ(１０μｇ/ml)およびＥＤＴＡ(２mＭ)を、積み重ねゲ
ルおよび溶解ゲルの両者に添加した。適用の前に、タン
パク質を試料緩衝液中に懸濁し、１００℃で３分間加熱
した。電気泳動は室温、一定電流で行った。電気泳動の
後、得られたゲルを水ですすぎ、４０mＭ トリス-ＨＣ
ｌpＨ７．５、２mＭ ＭgＣl２、０．０２％アジドの２
５０mｌ中でインキュベートした。ＤＮアーゼ活性を調
べるため、２mＭ ＣaＣl２および１μｇ/mｌ臭化エチジ
ウムを含有する新鮮緩衝液中にゲルを入れ、次いで５分
から２４時間の間隔で短波長ＵＶ光の下に調査した。反
応を停止させるため、ＥＤＴＡを加え(終濃度１５m
Ｍ)、キモグラムを撮影した。次いで、そのゲルはタン
パク質のためにクーマシーブルーによって染色すること
ができる。
【００９５】実施例３ ヒトＤＮアーゼＩの発現 １．pＲＫ.ＤＮase７ プラスミドpＲＫ.ＤＮase７を既述のようにして以下の
ようにクローン１８−１から構築した：プラスミドpＲ
Ｋ５をＥcoＲＩで消化し、脱リン酸化し、プラスミドの
バルクからなるフラグメント１を単離した。pＲＫ５は
ＳuvaらのScience 237:896(1987)および１９８９年３月
１５日公開のＥＰ公開307,247に記載されており、ここ
に使用されるpＣＩＳ２.８c２８Ｄ出発プラスミドは１
９８８年８月１７日公開のＥＰ278,776に記載されてい
る。λＤＮアーゼクローン１８−１をＥcoＲＩで消化
し、挿入体(フラグメント２)を単離した。フラグメント
１およびフラグメント２を連結させ、その連結混合物を
Ｅ.coli 株２９４に導入した。形質転換培養物をアンピ
シリン培地平板に載せ、耐性コロニーを選択した。プラ
スミドＤＮＡを形質転換体から調製し、正しいフラグメ
ントの存在を制限分析によって確認した。
ようにクローン１８−１から構築した：プラスミドpＲ
Ｋ５をＥcoＲＩで消化し、脱リン酸化し、プラスミドの
バルクからなるフラグメント１を単離した。pＲＫ５は
ＳuvaらのScience 237:896(1987)および１９８９年３月
１５日公開のＥＰ公開307,247に記載されており、ここ
に使用されるpＣＩＳ２.８c２８Ｄ出発プラスミドは１
９８８年８月１７日公開のＥＰ278,776に記載されてい
る。λＤＮアーゼクローン１８−１をＥcoＲＩで消化
し、挿入体(フラグメント２)を単離した。フラグメント
１およびフラグメント２を連結させ、その連結混合物を
Ｅ.coli 株２９４に導入した。形質転換培養物をアンピ
シリン培地平板に載せ、耐性コロニーを選択した。プラ
スミドＤＮＡを形質転換体から調製し、正しいフラグメ
ントの存在を制限分析によって確認した。
【００９６】pＲＫ.ＤＮase７をヒト胚腎-２９３細胞に
トランスフェクトし、一時的および安定に発現させた。
ヒトＤＮアーゼＩを一時的に発現させるため、既述(Eat
onらの1986)のようにして、リン酸カルシウム法[Wigler
らの1979]によって全面成長ＨＥＫ-２９３細胞(５０％)
の６０mm平板をトランスフェクトした。ヒトＤＮアーゼ
Ｉを安定に発現させるため、pＲＫ.ＤＮase７および、
ネオマイシン耐性遺伝子pＲＳＶneoを発現するプラスミ
ド(Gormanらの1985)を同時に同様にしてＨＥＫ-２９３
細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの
２日後、安定なラインを選択するために０.５mｇ/mｌＧ
４１８[硫酸ジェンチシン；ギブコ]を含有している標準
培地(Ｌ-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン
および１０％ＦＢＳを加えた１：１ Ｆ１２／ＤＭＥ)中
に、得られた細胞を継代した。
トランスフェクトし、一時的および安定に発現させた。
ヒトＤＮアーゼＩを一時的に発現させるため、既述(Eat
onらの1986)のようにして、リン酸カルシウム法[Wigler
らの1979]によって全面成長ＨＥＫ-２９３細胞(５０％)
の６０mm平板をトランスフェクトした。ヒトＤＮアーゼ
Ｉを安定に発現させるため、pＲＫ.ＤＮase７および、
ネオマイシン耐性遺伝子pＲＳＶneoを発現するプラスミ
ド(Gormanらの1985)を同時に同様にしてＨＥＫ-２９３
細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの
２日後、安定なラインを選択するために０.５mｇ/mｌＧ
４１８[硫酸ジェンチシン；ギブコ]を含有している標準
培地(Ｌ-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン
および１０％ＦＢＳを加えた１：１ Ｆ１２／ＤＭＥ)中
に、得られた細胞を継代した。
【００９７】ＤＮアーゼプラスミドによって一時的に、
または安定にトランスフェクトされた２９３細胞の上清
を分析するに当たり、それを32Ｐ-ＤＮＡの加水分解検
定またはグリーン寒天平板ＤＮアーゼ検定のいずれかに
よって測定し、ＤＮアーゼ活性が０.２−１.０μｇ/mｌ
であることが判明した。トランスフェクトされた細胞上
清をＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびキシモグラフィーによって
分析し、ＤＮアーゼ活性を有する約３５−３７kＤの新
たなタンパク質バンドを認めた。さらなる研究により、
２９３細胞から産生される組換えヒトＤＮアーゼＩは活
性のためにカルシウムが必要であり、これはＥＤＴＡ、
熱、およびアクチンによって阻害され、そして１本鎖Ｄ
ＮＡよりも２本鎖ＤＮＡの活性のほうが大きいことが示
された。２９３細胞で発現されるヒトＤＮアーゼの比活
性はウシＤＮアーゼのものに匹敵しているようであっ
た。
または安定にトランスフェクトされた２９３細胞の上清
を分析するに当たり、それを32Ｐ-ＤＮＡの加水分解検
定またはグリーン寒天平板ＤＮアーゼ検定のいずれかに
よって測定し、ＤＮアーゼ活性が０.２−１.０μｇ/mｌ
であることが判明した。トランスフェクトされた細胞上
清をＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびキシモグラフィーによって
分析し、ＤＮアーゼ活性を有する約３５−３７kＤの新
たなタンパク質バンドを認めた。さらなる研究により、
２９３細胞から産生される組換えヒトＤＮアーゼＩは活
性のためにカルシウムが必要であり、これはＥＤＴＡ、
熱、およびアクチンによって阻害され、そして１本鎖Ｄ
ＮＡよりも２本鎖ＤＮＡの活性のほうが大きいことが示
された。２９３細胞で発現されるヒトＤＮアーゼの比活
性はウシＤＮアーゼのものに匹敵しているようであっ
た。
【００９８】２．pＳＶeＤＮaseＤＨＦＲ３ ヒトＤＮアーゼＩをＣＨＯ細胞で組換え合成するのに適
したプラスミドであるpＳＶeＤＮaseＤＨＦＲ３を以下
のようにして構築した：リダンダントな(重複した)ポリ
リンカー領域を除去するため、中間プラスミドを構築し
た。プラスミドpＲＫ.ＤＮase７をＥcoＲＩおよびＳph
Ｉで消化し、ＤＮアーゼのコード領域の５'部分を含有
する最も大きなフラグメントを単離した(フラグメント
３)。プラスミドpＲＫ.ＤＮase７をＳalＩで消化し、ク
レノーで平滑末端化し、ＳphＩで消化し、次いでＤＮア
ーゼコード領域の３'部分を含有する中間サイズのフラ
グメントを単離した(フラグメント４)。pＲＫ５をＳma
ＩおよびＥcoＲＩで切断し、プラスミドのバルクを含有
するフラグメントを単離した(フラグメント５)。フラグ
メント３、４および５を連結し、得られた混合物をＥ.c
oli 株２９４に形質転換した。形質転換培養物をアンピ
シリン培地平板にプレートし、耐性コロニーを選択し
た。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製し、正しい
フラグメントの存在を制限分析によって確認した。得ら
れたプラスミドをpＲＫＤＮaseＩntと呼ぶ。
したプラスミドであるpＳＶeＤＮaseＤＨＦＲ３を以下
のようにして構築した：リダンダントな(重複した)ポリ
リンカー領域を除去するため、中間プラスミドを構築し
た。プラスミドpＲＫ.ＤＮase７をＥcoＲＩおよびＳph
Ｉで消化し、ＤＮアーゼのコード領域の５'部分を含有
する最も大きなフラグメントを単離した(フラグメント
３)。プラスミドpＲＫ.ＤＮase７をＳalＩで消化し、ク
レノーで平滑末端化し、ＳphＩで消化し、次いでＤＮア
ーゼコード領域の３'部分を含有する中間サイズのフラ
グメントを単離した(フラグメント４)。pＲＫ５をＳma
ＩおよびＥcoＲＩで切断し、プラスミドのバルクを含有
するフラグメントを単離した(フラグメント５)。フラグ
メント３、４および５を連結し、得られた混合物をＥ.c
oli 株２９４に形質転換した。形質転換培養物をアンピ
シリン培地平板にプレートし、耐性コロニーを選択し
た。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製し、正しい
フラグメントの存在を制限分析によって確認した。得ら
れたプラスミドをpＲＫＤＮaseＩntと呼ぶ。
【００９９】プラスミドpＥ３４２ＨＢＶ.Ｅ４００Ｄ２
２[クローレイ(Crowley)らのMol.Cell Biol.3:44(198
3)]をＥcoＲＩおよびＰvuIIで消化し、ＳＶ４０初期プ
ロモーターおよびβ-ラクタマーゼ遺伝子部分を含有す
る最も小さなフラグメントを単離した(プラスミド５)。
プラスミドpＥ３４２ＨＢＶ.Ｅ４００Ｄ２２をＢamＨＩ
およびＰvuIIでも消化し、β-ラクタマーゼ遺伝子なら
びにＳＶ４０初期プロモーターおよびＤＨＦＲ遺伝子の
平衡(バランス)を含有するプラスミドのバルクを含有す
るフラグメントを単離した(フラグメント６)。プラスミ
ドpＲＫＤＮaseＩntをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化
し、ＤＮアーゼをコードしているフラグメントを単離し
た(フラグメント７)。フラグメント５、６および７を連
結し、その混合物をＥ.coli 株２９４に形質転換した。
得られた形質転換培養物をアンピシリン培地平板上にプ
レートし、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡ
を形質転換体から調製し、正しいフラグメントの存在を
制限分析によって確認した。得られたプラスミドをpＳ
ＶeＤＮaseＤＨＦＲ３と呼ぶ。
２[クローレイ(Crowley)らのMol.Cell Biol.3:44(198
3)]をＥcoＲＩおよびＰvuIIで消化し、ＳＶ４０初期プ
ロモーターおよびβ-ラクタマーゼ遺伝子部分を含有す
る最も小さなフラグメントを単離した(プラスミド５)。
プラスミドpＥ３４２ＨＢＶ.Ｅ４００Ｄ２２をＢamＨＩ
およびＰvuIIでも消化し、β-ラクタマーゼ遺伝子なら
びにＳＶ４０初期プロモーターおよびＤＨＦＲ遺伝子の
平衡(バランス)を含有するプラスミドのバルクを含有す
るフラグメントを単離した(フラグメント６)。プラスミ
ドpＲＫＤＮaseＩntをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化
し、ＤＮアーゼをコードしているフラグメントを単離し
た(フラグメント７)。フラグメント５、６および７を連
結し、その混合物をＥ.coli 株２９４に形質転換した。
得られた形質転換培養物をアンピシリン培地平板上にプ
レートし、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡ
を形質転換体から調製し、正しいフラグメントの存在を
制限分析によって確認した。得られたプラスミドをpＳ
ＶeＤＮaseＤＨＦＲ３と呼ぶ。
【０１００】ヒトＤＮアーゼＩの安定な発現のため、上
記プラスミドを使用し、全面成長ＣＨＯ細胞(ＤＰ-７)
の６０mm平板をリン酸カルシウム法によってトランスフ
ェクトし、始めは選択培地中で増殖させた。32Ｐ-ＤＮ
Ａ加水分解検定またはグリーン寒天平板ＤＮアーゼ検定
のいずれかによって測定される、約０.０２−０.１μｇ
/mｌＤＮアーゼ活性を含有する培地から、非増幅セルラ
インを増殖させる。これら細胞を発酵槽中で高密度にま
で増殖させた場合に、より高いレベル(約５倍)の発現が
得られたと考えられる。個々のクローンをその個々のＤ
Ｎアーゼの発現レベルについて選択すれば、高い分泌性
細胞を取り上げることができ、次いで各選択クローンを
ＭＴＸの増大濃度(１２.５−２０００nＭ)の存在下に増
幅させる。
記プラスミドを使用し、全面成長ＣＨＯ細胞(ＤＰ-７)
の６０mm平板をリン酸カルシウム法によってトランスフ
ェクトし、始めは選択培地中で増殖させた。32Ｐ-ＤＮ
Ａ加水分解検定またはグリーン寒天平板ＤＮアーゼ検定
のいずれかによって測定される、約０.０２−０.１μｇ
/mｌＤＮアーゼ活性を含有する培地から、非増幅セルラ
インを増殖させる。これら細胞を発酵槽中で高密度にま
で増殖させた場合に、より高いレベル(約５倍)の発現が
得られたと考えられる。個々のクローンをその個々のＤ
Ｎアーゼの発現レベルについて選択すれば、高い分泌性
細胞を取り上げることができ、次いで各選択クローンを
ＭＴＸの増大濃度(１２.５−２０００nＭ)の存在下に増
幅させる。
【０１０１】３．pＤＮＡ１１ 分泌タンパク質としてのＥ.coli のＤＮアーゼを組換え
的に合成するのに適しているプラスミドを構築した。こ
のプラスミドをpＤＮＡ１１と呼び、これは以下のよう
にして構築した：プラスミドpＴＦ.III(ＥＰ公開第278,
776号)をＮsiＩおよびＳalＩで消化し、プラスミドのバ
ルクを含有する最も大きなフラグメントを単離した(フ
ラグメント８)。プラスミドpＲＫＤＮase７をＳalＩお
よびＢstＸＩで消化し、殆どのコード遺伝子を含有する
７９８bp フラグメントを単離した(フラグメント９)。
２つの合成オリゴヌクレオチドを合成した： ＤＬink１：５'TTG-AAG-ATC-GCA-GCC-TTC-AAC-ATC-CAG-
ACA-T(３１mer) ＤＬink３：５'CTG-GAT-GTT-GAA-GGV-TGC-GAT-CTT-CAA-
TGC-A(３１mer) フラグメント８および９および合成オリゴヌクレオチド
ＤＬink１およびＤＬink３を連結し、その混合物をＥ.c
oli 株２９４に形質転換した。得られた形質転換培養物
をアンピシリン培地平板上にプレートし、耐性コロニー
を選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製
し、正しいフラグメント存在、およびＮsiＩとＢstＸＩ
の制限部位の保存性を制限分析によって確認した。幾つ
かのプラスミドを配列決定し、正しい合成ＤＮＡの組込
みを確認した。pＤＮＡ１１で形質転換した２９４細胞
は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって明らかにされるように２
つの新たな主要タンパク質を＞５００mｇ／Ｌで発現し
た−−約３２kＤの主要バンドおよび約３０kＤの小さな
バンドである。この２つのバンドのアミノ酸配列分析に
より、Ｎ-末端配列がそれぞれＭet-Ｌys-Ｌys-Ａsn-Ｉl
e-Ａla、およびＬeu-Ｌys-Ｉle-Ａla-Ａla-Ｐheである
ことが判明した。従って、高分子量のバンドはプロセッ
シングされていないヒトＤＮアーゼを、低分子量のそれ
は適切にプロセッシングされた天然のヒトＤＮアーゼを
示すものである。
的に合成するのに適しているプラスミドを構築した。こ
のプラスミドをpＤＮＡ１１と呼び、これは以下のよう
にして構築した：プラスミドpＴＦ.III(ＥＰ公開第278,
776号)をＮsiＩおよびＳalＩで消化し、プラスミドのバ
ルクを含有する最も大きなフラグメントを単離した(フ
ラグメント８)。プラスミドpＲＫＤＮase７をＳalＩお
よびＢstＸＩで消化し、殆どのコード遺伝子を含有する
７９８bp フラグメントを単離した(フラグメント９)。
２つの合成オリゴヌクレオチドを合成した： ＤＬink１：５'TTG-AAG-ATC-GCA-GCC-TTC-AAC-ATC-CAG-
ACA-T(３１mer) ＤＬink３：５'CTG-GAT-GTT-GAA-GGV-TGC-GAT-CTT-CAA-
TGC-A(３１mer) フラグメント８および９および合成オリゴヌクレオチド
ＤＬink１およびＤＬink３を連結し、その混合物をＥ.c
oli 株２９４に形質転換した。得られた形質転換培養物
をアンピシリン培地平板上にプレートし、耐性コロニー
を選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製
し、正しいフラグメント存在、およびＮsiＩとＢstＸＩ
の制限部位の保存性を制限分析によって確認した。幾つ
かのプラスミドを配列決定し、正しい合成ＤＮＡの組込
みを確認した。pＤＮＡ１１で形質転換した２９４細胞
は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって明らかにされるように２
つの新たな主要タンパク質を＞５００mｇ／Ｌで発現し
た−−約３２kＤの主要バンドおよび約３０kＤの小さな
バンドである。この２つのバンドのアミノ酸配列分析に
より、Ｎ-末端配列がそれぞれＭet-Ｌys-Ｌys-Ａsn-Ｉl
e-Ａla、およびＬeu-Ｌys-Ｉle-Ａla-Ａla-Ｐheである
ことが判明した。従って、高分子量のバンドはプロセッ
シングされていないヒトＤＮアーゼを、低分子量のそれ
は適切にプロセッシングされた天然のヒトＤＮアーゼを
示すものである。
【０１０２】Ｅ.coli において発現されるヒトＤＮアー
ゼは活性である。pＤＮＡ１１で形質転換し、カルシウ
ム、マグネシウムおよび低リン酸塩を加えた寒天平板上
で増殖させた２９４細胞は、活性ＤＮアーゼを分泌する
ことが、その形質転換細胞の回りの、対照細胞の回りに
はない明瞭なゾーンの存在から判明した。さらに、ＳＤ
Ｓおよびβ-メルカプトエタノールによって可溶化され
た形質転換細胞をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにかけ、キモグ
ラフィーを行った。ＤＮアーゼ活性は適切にプロセッシ
ングされたヒトＤＮアーゼのバンドに関連しており、プ
ロセッシングされていないヒトＤＮアーゼとは関連して
いなかった。
ゼは活性である。pＤＮＡ１１で形質転換し、カルシウ
ム、マグネシウムおよび低リン酸塩を加えた寒天平板上
で増殖させた２９４細胞は、活性ＤＮアーゼを分泌する
ことが、その形質転換細胞の回りの、対照細胞の回りに
はない明瞭なゾーンの存在から判明した。さらに、ＳＤ
Ｓおよびβ-メルカプトエタノールによって可溶化され
た形質転換細胞をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにかけ、キモグ
ラフィーを行った。ＤＮアーゼ活性は適切にプロセッシ
ングされたヒトＤＮアーゼのバンドに関連しており、プ
ロセッシングされていないヒトＤＮアーゼとは関連して
いなかった。
【０１０３】４．pＤＮＡ２ ヒトＤＮアーゼＩをＥ.coli において細胞内タンパク質
として組換え的に発現させるためのプラスミドを構築し
た。このプラスミドをpＤＮＡ２と呼び、それは以下の
ようにして構築した：プラスミドpＨＧＨ２０７／３０
７をpＨＧＨ２０７(米国特許第4,663,283号)から調製す
るに当たり、trpプロモーターから上流にあるＥcoＲＩ
部位を除去した(ＥcoＲＩ消化、平滑末端化および再連
結)。プラスミドpＨＧＨ２０７／３０７をＸbaＩおよび
ＳalＩで消化し、プラスミドのバルクを含有する最も大
きなフラグメントを単離した(フラグメント１０)。プラ
スミドpＲＫ.ＤＮase７をＳalＩおよびＢstＸＩで消化
し、殆どのコード領域を含有する７９８bp フラグメン
トを単離した(フラグメント９)。２つの合成オリゴヌク
レオチドを合成した： ＤＬink４：５'CTAGAATTATG-TTA-AAA-ATT-GCA-GCA-TTT-
AAT-ATT-CAA-ACA-T(42mer) ＤＬink５：５'TTG-AAT-ATT-AAA-TGC-TGC-AAT-TTT-TAAC
ATAATT(34mer) フラグメント９および１０および合成オリゴヌクレオチ
ドＤＬink４およびＤＬink５を連結し、その混合物を
Ｅ.coli ２９４株に導入した。得られた形質転換培養物
をアンピシリン培地平板上にプレートし、耐性コロニー
を選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製
し、正しいフラグメントの存在、およびＸbaＩとＢstＸ
Ｉの制限部位の保存性を制限分析によって確認した。幾
つかのプラスミドを配列決定し、正しい合成ＤＮＡの組
込みを確認した。
として組換え的に発現させるためのプラスミドを構築し
た。このプラスミドをpＤＮＡ２と呼び、それは以下の
ようにして構築した：プラスミドpＨＧＨ２０７／３０
７をpＨＧＨ２０７(米国特許第4,663,283号)から調製す
るに当たり、trpプロモーターから上流にあるＥcoＲＩ
部位を除去した(ＥcoＲＩ消化、平滑末端化および再連
結)。プラスミドpＨＧＨ２０７／３０７をＸbaＩおよび
ＳalＩで消化し、プラスミドのバルクを含有する最も大
きなフラグメントを単離した(フラグメント１０)。プラ
スミドpＲＫ.ＤＮase７をＳalＩおよびＢstＸＩで消化
し、殆どのコード領域を含有する７９８bp フラグメン
トを単離した(フラグメント９)。２つの合成オリゴヌク
レオチドを合成した： ＤＬink４：５'CTAGAATTATG-TTA-AAA-ATT-GCA-GCA-TTT-
AAT-ATT-CAA-ACA-T(42mer) ＤＬink５：５'TTG-AAT-ATT-AAA-TGC-TGC-AAT-TTT-TAAC
ATAATT(34mer) フラグメント９および１０および合成オリゴヌクレオチ
ドＤＬink４およびＤＬink５を連結し、その混合物を
Ｅ.coli ２９４株に導入した。得られた形質転換培養物
をアンピシリン培地平板上にプレートし、耐性コロニー
を選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製
し、正しいフラグメントの存在、およびＸbaＩとＢstＸ
Ｉの制限部位の保存性を制限分析によって確認した。幾
つかのプラスミドを配列決定し、正しい合成ＤＮＡの組
込みを確認した。
【０１０４】pＤＮＡ２で形質転換した２９４細胞は、
ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって明らかにされるように約３０k
Ｄの１つの新たな主要なバンドを発現した。タンパク質
のアミノ酸配列分析により、Ｎ-末端配列が、ヒトＭet-
ＤＮアーゼに相当するＭet-Ｌeu-Ｌys-Ｉle-Ａla-Ａla-
Ｐheであることが判明した。Ｅ.coli で直接発現される
ヒトＭet-ＤＮアーゼも活性である。ＳＤＳおよびβ-メ
ルカプトエタノールによって可溶化された形質転換細胞
をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにかけ、キモグラフィーを行っ
た。ＤＮアーゼ活性はヒトＭet-ＤＮアーゼのバンドに
関連していた。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって明らかにされるように約３０k
Ｄの１つの新たな主要なバンドを発現した。タンパク質
のアミノ酸配列分析により、Ｎ-末端配列が、ヒトＭet-
ＤＮアーゼに相当するＭet-Ｌeu-Ｌys-Ｉle-Ａla-Ａla-
Ｐheであることが判明した。Ｅ.coli で直接発現される
ヒトＭet-ＤＮアーゼも活性である。ＳＤＳおよびβ-メ
ルカプトエタノールによって可溶化された形質転換細胞
をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにかけ、キモグラフィーを行っ
た。ＤＮアーゼ活性はヒトＭet-ＤＮアーゼのバンドに
関連していた。
【０１０５】実施例４ ＤＮアーゼ発現の別の分析 (a)ＤＮアーゼ発現ベクター ベクターpＲＫ５内のλgt１０ヒト膵cＤＮＡライブラリ
ーから単離されるＤＮアーゼcＤＮＡクローン１８−１
由来の完全挿入体を含有する、既述のプラスミドpＲＫ.
ＤＮase７から得たヒト膵デオキシリボヌクレアーゼ(Ｄ
Ｎアーゼ)ＩのcＤＮＡをpＲＫ５に導入し、中間発現ベ
クターpＲＫ.ＤＮase３を作成した。このプラスミド(p
ＲＫ.ＤＮase３)には、ＤＮアーゼ合成がＣＭＶ転写調
節要素によって指令されている。上記のスプライス単位
は、転写および翻訳開始部位間に配置されている。ＤＮ
アーゼの発現ベクターを作成するため、ＣＭＶ転写調節
配列およびpＲＫ.ＤＮase３のスプライス単位をＳＶ４
０転写調節配列と以下に記載の種々のスプライスドナー
-イントロン-スプライスアクセプター単位とで置換し
た。比較のため、スプライス単位を欠いている対応する
ベクターも構築した(pＳve.ＤＮase)。
ーから単離されるＤＮアーゼcＤＮＡクローン１８−１
由来の完全挿入体を含有する、既述のプラスミドpＲＫ.
ＤＮase７から得たヒト膵デオキシリボヌクレアーゼ(Ｄ
Ｎアーゼ)ＩのcＤＮＡをpＲＫ５に導入し、中間発現ベ
クターpＲＫ.ＤＮase３を作成した。このプラスミド(p
ＲＫ.ＤＮase３)には、ＤＮアーゼ合成がＣＭＶ転写調
節要素によって指令されている。上記のスプライス単位
は、転写および翻訳開始部位間に配置されている。ＤＮ
アーゼの発現ベクターを作成するため、ＣＭＶ転写調節
配列およびpＲＫ.ＤＮase３のスプライス単位をＳＶ４
０転写調節配列と以下に記載の種々のスプライスドナー
-イントロン-スプライスアクセプター単位とで置換し
た。比較のため、スプライス単位を欠いている対応する
ベクターも構築した(pＳve.ＤＮase)。
【０１０６】１．pＲＫ.ＤＮase３ ベクターpＲＫ.ＤＮase３(図４)を以下のようにして構
築した： pＲＫ５を、５'および３'制御配列間のポリ
リンカー領域中を完全に切断するＳmaＩおよびＳalＩで
消化し、大きなフラグメントを単離した。pＲＫ５ベク
ターは、コード領域の上流にあってプロモーターの下流
にあるスプライスドナー-イントロン-スプライスアクセ
プター領域を含有しており、そこではイントロン領域は
サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)即座型スプライスドナー
およびイントロン配列、バクテリオファージＳＰ６プロ
モーター挿入体、および免疫グロブリン(Ｉg)の重鎖可
変領域(ＶＨ)イントロンおよびスプライスアクセプター
配列を含有している。ベクターpＲＫ.ＤＮase７をＢsm
Ｉで開裂し、３'突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで
刈り取り(trimmed back)、得られた材料をＳalＩで再消
化して、完全なヒトＤＮアーゼＩコード配列を９２１-n
tフラグメントとして遊離させる。ゲル単離した後、こ
のフラグメントを通常の連結法[Maniatisらの1982,前
掲]によってpＲＫ５巨大フラグメントと連結し、ベクタ
ーpＲＫ.ＤＮase３を作成した。
築した： pＲＫ５を、５'および３'制御配列間のポリ
リンカー領域中を完全に切断するＳmaＩおよびＳalＩで
消化し、大きなフラグメントを単離した。pＲＫ５ベク
ターは、コード領域の上流にあってプロモーターの下流
にあるスプライスドナー-イントロン-スプライスアクセ
プター領域を含有しており、そこではイントロン領域は
サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)即座型スプライスドナー
およびイントロン配列、バクテリオファージＳＰ６プロ
モーター挿入体、および免疫グロブリン(Ｉg)の重鎖可
変領域(ＶＨ)イントロンおよびスプライスアクセプター
配列を含有している。ベクターpＲＫ.ＤＮase７をＢsm
Ｉで開裂し、３'突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで
刈り取り(trimmed back)、得られた材料をＳalＩで再消
化して、完全なヒトＤＮアーゼＩコード配列を９２１-n
tフラグメントとして遊離させる。ゲル単離した後、こ
のフラグメントを通常の連結法[Maniatisらの1982,前
掲]によってpＲＫ５巨大フラグメントと連結し、ベクタ
ーpＲＫ.ＤＮase３を作成した。
【０１０７】pＲＫ.ＤＮase３はＣＭＶ転写調節要素お
よび、転写および翻訳開始部位間に位置するスプライス
単位(図４では「イントロン」)を含有している。このベ
クターでは、pＲＫ５ベクターのスプライス単位は何等
修飾を受けずに存在している。
よび、転写および翻訳開始部位間に位置するスプライス
単位(図４では「イントロン」)を含有している。このベ
クターでは、pＲＫ５ベクターのスプライス単位は何等
修飾を受けずに存在している。
【０１０８】２．pＳＶe.ＤＮase ベクターpＳＶe.ＤＮaseを以下のようにして構築した
(図３および４)： pＲＫ.ＤＮase３内にあるＤＮアー
ゼコード領域に先行する調節配列を、ＳstＩおよびＣla
Ｉの消化によってそのベクターの残余部分から分離し
た；dam+細菌宿主細胞から調製したＤＮＡを使用し、こ
のベクター内のＳＶ４０初期ポリアデニル化領域の３'
末端側に位置する第２のＣlaＩ部位が開裂するのを防止
した。５'制御領域を欠いている最も大きなフラグメン
トをゲル単離した。
(図３および４)： pＲＫ.ＤＮase３内にあるＤＮアー
ゼコード領域に先行する調節配列を、ＳstＩおよびＣla
Ｉの消化によってそのベクターの残余部分から分離し
た；dam+細菌宿主細胞から調製したＤＮＡを使用し、こ
のベクター内のＳＶ４０初期ポリアデニル化領域の３'
末端側に位置する第２のＣlaＩ部位が開裂するのを防止
した。５'制御領域を欠いている最も大きなフラグメン
トをゲル単離した。
【０１０９】ＤＨＦＲ発現ベクターpＥ３４８ＤＨＦＲ
ＵＣは、ＳＶ４０転写調節配列の供給源として役立つ。
pＥ３４８ＤＨＦＲＵＣベクター[VanniceおよびLevinso
nのJ.Virology,62:1305-1313,1988。ここでは図１にお
いてpＥと命名されている。]は、ＨindIII部位の上流に
あるＳＶ４０エンハンサーおよび初期プロモーター領域
であって、例えば転写開始のＳＶ４０初期部分(sties)
[ウイルス中、５１７１位]、ＨＢＶのＧamＨＩからＢＧ
１II部位由来のプラスミドpＭＬ１内の５８４bpＢ型肝
炎(ＨＢＶ)ポリＡシグナルに後続するネズミジヒドロ葉
酸還元酵素(ＤＨＦＲ)をコードしているcＤＮＡに先行
するものを含有している。このプラスミドはＳＶ４０配
列の直ぐ上流にあるポリリンカーを含有している。ＳＶ
４０転写調節配列を、ＳstＩおよびＣlaＩ消化によって
遊離させ、４つすべてのデオキシリボヌクレオチド(dＮ
ＴＰs：dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ、dＴＴＰ)の存在
下、得られた５'突出末端をクレノーポリＩを使用して
充填した。次いでＸbaＩで消化する際、より小さなＸba
Ｉ-ＣlaＩフラグメント(３６０ヌクレオチド)に存在す
るＳＶ４０転写調節配列(転写開始のＳＶ４０初期部位
などのエンハンサーおよび初期プロモーター)をゲル単
離した。
ＵＣは、ＳＶ４０転写調節配列の供給源として役立つ。
pＥ３４８ＤＨＦＲＵＣベクター[VanniceおよびLevinso
nのJ.Virology,62:1305-1313,1988。ここでは図１にお
いてpＥと命名されている。]は、ＨindIII部位の上流に
あるＳＶ４０エンハンサーおよび初期プロモーター領域
であって、例えば転写開始のＳＶ４０初期部分(sties)
[ウイルス中、５１７１位]、ＨＢＶのＧamＨＩからＢＧ
１II部位由来のプラスミドpＭＬ１内の５８４bpＢ型肝
炎(ＨＢＶ)ポリＡシグナルに後続するネズミジヒドロ葉
酸還元酵素(ＤＨＦＲ)をコードしているcＤＮＡに先行
するものを含有している。このプラスミドはＳＶ４０配
列の直ぐ上流にあるポリリンカーを含有している。ＳＶ
４０転写調節配列を、ＳstＩおよびＣlaＩ消化によって
遊離させ、４つすべてのデオキシリボヌクレオチド(dＮ
ＴＰs：dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ、dＴＴＰ)の存在
下、得られた５'突出末端をクレノーポリＩを使用して
充填した。次いでＸbaＩで消化する際、より小さなＸba
Ｉ-ＣlaＩフラグメント(３６０ヌクレオチド)に存在す
るＳＶ４０転写調節配列(転写開始のＳＶ４０初期部位
などのエンハンサーおよび初期プロモーター)をゲル単
離した。
【０１１０】前記のpＥ３４ＤＨＦＲＵＣ由来のそれよ
り小さなフラグメントをゲル単離し、大きなpＲＫ.ＤＮ
ase３フラグメントと連結し、ベクターpＳＶe.ＤＮase
を作成した。このベクターでは、ＤＮアーゼ合成は、Ｓ
Ｖ４０転写制御配列によって指令されるが、それらとＤ
Ｎアーゼコード領域との間にはスプライス単位は存在し
ない。
り小さなフラグメントをゲル単離し、大きなpＲＫ.ＤＮ
ase３フラグメントと連結し、ベクターpＳＶe.ＤＮase
を作成した。このベクターでは、ＤＮアーゼ合成は、Ｓ
Ｖ４０転写制御配列によって指令されるが、それらとＤ
Ｎアーゼコード領域との間にはスプライス単位は存在し
ない。
【０１１１】３．pＳＶＩ.ＤＮase ＤＮアーゼのコード配列を中間プラスミド、pＲＫ５.Ｓ
Ｖeに挿入した後、ベクターpＳＶＩ.ＤＮase(図５およ
び６)を調製した。この中間プラスミドは、ＳpeＩおよ
びＳacII制限部位間に位置するpＲＫ５ＣＭＶ転写調節
要素を、ＳＶ４０初期プロモーターおよびエンハンサー
を含有するpＥ３４８ＤＨＦＲＵＣ由来の小さなＸbaＩ-
ＨindIIIフラグメントと置換することにより作成した。
pＲＫ５のＳacＩ消化により生成される３'突出末端をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼによりかみ砕き、pＥ３４８ＤＨ
ＦＲＵＣのＨindIII消化により生成される５'突出末端
を４つすべてのdＮＴＰの存在下にＴ４ポリメラーゼを
使用して充填した。
Ｖeに挿入した後、ベクターpＳＶＩ.ＤＮase(図５およ
び６)を調製した。この中間プラスミドは、ＳpeＩおよ
びＳacII制限部位間に位置するpＲＫ５ＣＭＶ転写調節
要素を、ＳＶ４０初期プロモーターおよびエンハンサー
を含有するpＥ３４８ＤＨＦＲＵＣ由来の小さなＸbaＩ-
ＨindIIIフラグメントと置換することにより作成した。
pＲＫ５のＳacＩ消化により生成される３'突出末端をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼによりかみ砕き、pＥ３４８ＤＨ
ＦＲＵＣのＨindIII消化により生成される５'突出末端
を４つすべてのdＮＴＰの存在下にＴ４ポリメラーゼを
使用して充填した。
【０１１２】pＳＶＩ.ＤＮaseを構築するため、ベクタ
ーpＲＫ.ＤＮase３をＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化し
てＤＮアーゼをコードする配列を単離し、それを、同じ
２つの酵素で消化した後に単離しておいたpＲＫ５.Ｓve
の大きなフラグメントに挿入した。ベクターpＳＶＩ.Ｄ
ＮaseはＳＶ４０転写調節要素(転写開始のＳＶ４０初期
部位などのエンハンサーおよび初期プロモーター)、お
よびmＲＮＡキャップ部位、次にpＲＫ５ベクターにおけ
る修飾を何等受けていないスプライス-ドナー-イントロ
ン-スプライスアクセプター単位、ＤＮアーゼをコード
しているcＤＮＡ、ＳＶ４０初期ポリアデニル化(ポリ
Ａ)領域、およびＳＶ４０由来のＳＶ４０複製起点(ori)
領域を含有している。ＤＮアーゼのコード領域までの
(この領域を含まない)pＳＶＩ.ＤＮアーゼの完全なヌク
レオチド配列を図８および９に示す。
ーpＲＫ.ＤＮase３をＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化し
てＤＮアーゼをコードする配列を単離し、それを、同じ
２つの酵素で消化した後に単離しておいたpＲＫ５.Ｓve
の大きなフラグメントに挿入した。ベクターpＳＶＩ.Ｄ
ＮaseはＳＶ４０転写調節要素(転写開始のＳＶ４０初期
部位などのエンハンサーおよび初期プロモーター)、お
よびmＲＮＡキャップ部位、次にpＲＫ５ベクターにおけ
る修飾を何等受けていないスプライス-ドナー-イントロ
ン-スプライスアクセプター単位、ＤＮアーゼをコード
しているcＤＮＡ、ＳＶ４０初期ポリアデニル化(ポリ
Ａ)領域、およびＳＶ４０由来のＳＶ４０複製起点(ori)
領域を含有している。ＤＮアーゼのコード領域までの
(この領域を含まない)pＳＶＩ.ＤＮアーゼの完全なヌク
レオチド配列を図８および９に示す。
【０１１３】４．pＳＶＩ２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮa
se、pＳＶＩ５.ＤＮaseおよびpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮase ベクターpＳＶＩ２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳ
ＶＩ５.ＤＮaseおよびpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseを、それぞ
れ２つのフラグメントを組換えて構築した(図７)。第１
は、ＥcoＲＩで消化し、dＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処置し、次いでＳstＩで開裂することに
より得られた大きなpＲＫ.ＤＮase３フラグメントであ
った。第２は、それぞれ、ＳＶ４０の５'調節配列およ
び修飾スプライス単位を含有する小さなフラグメントで
あった。
se、pＳＶＩ５.ＤＮaseおよびpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮase ベクターpＳＶＩ２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳ
ＶＩ５.ＤＮaseおよびpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseを、それぞ
れ２つのフラグメントを組換えて構築した(図７)。第１
は、ＥcoＲＩで消化し、dＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処置し、次いでＳstＩで開裂することに
より得られた大きなpＲＫ.ＤＮase３フラグメントであ
った。第２は、それぞれ、ＳＶ４０の５'調節配列およ
び修飾スプライス単位を含有する小さなフラグメントで
あった。
【０１１４】哺乳動物細胞における組換え的発現を増大
するためのスプライス単位への修飾は当業者に既知であ
る。図１８は、本実施例のベクター、すなわちＳＶＩ、
ＳＶＩ２、ＳＶＩ３、ＳＶＩ５およびＳＶＩ６Ｂを調製
するうえで関連するスプライス単位のヌクレオチド配列
を表す模式図を示すものである。ボックスは、ＳＶＩ配
列からの変動を示しており、二重線の下線は疑似ＡＴＧ
コドンであり、下線は付加または変動された分岐点配列
(ＢＰＳ)領域の疑似スプライス部位を、配列中の中断は
ＳＶＩ３-ＳＶＩ５のヌクレオチドの欠失を、「...」は
明記していない配列を示しており、脱字記号はスプライ
ス単位のスプライスドナーおよびスプライスアクセプタ
ー内のそれぞれ５'および３'開裂部位を示している。こ
れらの配列は、タンパク質合成の既知の方法、またはp
ＳＶＩ配列の標準的な修飾によって調製することができ
る。
するためのスプライス単位への修飾は当業者に既知であ
る。図１８は、本実施例のベクター、すなわちＳＶＩ、
ＳＶＩ２、ＳＶＩ３、ＳＶＩ５およびＳＶＩ６Ｂを調製
するうえで関連するスプライス単位のヌクレオチド配列
を表す模式図を示すものである。ボックスは、ＳＶＩ配
列からの変動を示しており、二重線の下線は疑似ＡＴＧ
コドンであり、下線は付加または変動された分岐点配列
(ＢＰＳ)領域の疑似スプライス部位を、配列中の中断は
ＳＶＩ３-ＳＶＩ５のヌクレオチドの欠失を、「...」は
明記していない配列を示しており、脱字記号はスプライ
ス単位のスプライスドナーおよびスプライスアクセプタ
ー内のそれぞれ５'および３'開裂部位を示している。こ
れらの配列は、タンパク質合成の既知の方法、またはp
ＳＶＩ配列の標準的な修飾によって調製することができ
る。
【０１１５】図１０および１１、図１２および１３、図
１４および１５、図１６および１７はそれぞれ、ＰＳＶ
Ｉ２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳＶＩ５.ＤＮase
およびpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseのＤＮアーゼのコード領域
までの(この領域は含まない)完全なヌクレオチド配列を
示すものである。図１８のスプライス単位配列を図１０
−図１７に加えている。
１４および１５、図１６および１７はそれぞれ、ＰＳＶ
Ｉ２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳＶＩ５.ＤＮase
およびpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseのＤＮアーゼのコード領域
までの(この領域は含まない)完全なヌクレオチド配列を
示すものである。図１８のスプライス単位配列を図１０
−図１７に加えている。
【０１１６】(b)ＤＮアーゼの一時的な発現 種々のＤＮアーゼベクターからの一時的な発現を、ＣＨ
Ｏ dhfr-細胞にトランスフェクトした後分析した。ＤＥ
ＡＥ-デキストラン法の変法によって細胞をトランスフ
ェクトし、そのトランスフェクト後、３６から４８時
間、細胞媒質内のＤＮアーゼレベルを蓄積した。６-ウ
エルの３５mm培養皿内のウエル１個当たりに約４×１０
5個の細胞をプレートした。翌日、ＴＢＳ[１３７mＭ Ｎ
aＣl、５mＭ ＫＣl、１．４mＭ Ｎa２ＰＯ４、２４．７
mＭ トリスＨＣl、１．３５mＭ ＣaＣl２、１．０５mＭ
ＭgＣl２、pＨ７．５]を添加して容量２μｇのＤＮア
ーゼ発現ベクターを１５μｌに調節した。次いで、ＤＥ
ＡＥ-デキストラン(１０mｇ/ml)３０μｌおよび、１０
０μＭ クロロキノンを含有する血清不含の培養培地２m
ｌを加えた。細胞媒質を除去し、ＰＢＳ(リン酸緩衝化
食塩水、pＨ７．５)で１回すすぎ、ＤＮＡ混合物を加え
た。２−３時間後、グリセロールストックを加え、細胞
を標準成長培地２mｌで覆い、検定した。ＤＮアーゼベ
クターを対照プラスミドpＲＳＶ.hＧＨ(２μｇ)と共に
同時形質転換した。この対照プラスミドは、ロース肉腫
(Rous sarcoma)ウイルスの長い末端反復(ＬＴＲ)内の転
写調節配列によって制御されているヒト成長ホルモン(h
ＧＨ)を発現させるものである。このプラスミドは、Coh
enおよびLevinsonのNature 334:119-124(1988)に記載さ
れているrasＰ.hＧＨのrasプロモーターをＲＳＶプロモ
ーターと置き換えることによって、調製することができ
る。各場合において合成されたhＧＨの量は、種々のト
ランスフェクションで得られたＤＮアーゼレベルをより
正確に比較することのできる標品として役立った。２回
行った通常実験において得られたＤＮアーゼおよびhＧ
Ｈのレベルを以下に示す。
Ｏ dhfr-細胞にトランスフェクトした後分析した。ＤＥ
ＡＥ-デキストラン法の変法によって細胞をトランスフ
ェクトし、そのトランスフェクト後、３６から４８時
間、細胞媒質内のＤＮアーゼレベルを蓄積した。６-ウ
エルの３５mm培養皿内のウエル１個当たりに約４×１０
5個の細胞をプレートした。翌日、ＴＢＳ[１３７mＭ Ｎ
aＣl、５mＭ ＫＣl、１．４mＭ Ｎa２ＰＯ４、２４．７
mＭ トリスＨＣl、１．３５mＭ ＣaＣl２、１．０５mＭ
ＭgＣl２、pＨ７．５]を添加して容量２μｇのＤＮア
ーゼ発現ベクターを１５μｌに調節した。次いで、ＤＥ
ＡＥ-デキストラン(１０mｇ/ml)３０μｌおよび、１０
０μＭ クロロキノンを含有する血清不含の培養培地２m
ｌを加えた。細胞媒質を除去し、ＰＢＳ(リン酸緩衝化
食塩水、pＨ７．５)で１回すすぎ、ＤＮＡ混合物を加え
た。２−３時間後、グリセロールストックを加え、細胞
を標準成長培地２mｌで覆い、検定した。ＤＮアーゼベ
クターを対照プラスミドpＲＳＶ.hＧＨ(２μｇ)と共に
同時形質転換した。この対照プラスミドは、ロース肉腫
(Rous sarcoma)ウイルスの長い末端反復(ＬＴＲ)内の転
写調節配列によって制御されているヒト成長ホルモン(h
ＧＨ)を発現させるものである。このプラスミドは、Coh
enおよびLevinsonのNature 334:119-124(1988)に記載さ
れているrasＰ.hＧＨのrasプロモーターをＲＳＶプロモ
ーターと置き換えることによって、調製することができ
る。各場合において合成されたhＧＨの量は、種々のト
ランスフェクションで得られたＤＮアーゼレベルをより
正確に比較することのできる標品として役立った。２回
行った通常実験において得られたＤＮアーゼおよびhＧ
Ｈのレベルを以下に示す。
【０１１７】
【表３】 ベクター ng/mｌDNアーゼ ng/mｌhGH ng/mｌDNアーゼ(補正) １回 ２回 １回 ２回 １回 ２回 pSVe.DNase 19.7 17.4 50.1 42.0 8.6 9.2 pSVI.DNase 17.9 13.8 29.7 20.4 12.8 14.7 pSVI2.DNase 34.2 30.5 41.9 40.3 18.0 17.0 pSVI3.DNase 37.8 28.7 45.2 40.5 18.0 15.1 pSVI5.DNase 28.4 22.1 37.2 28.7 16.7 17.0 pSVI6B.DNase 28.5 37.8 61.3 67.5 10.2 12.2
【０１１８】ＤＮアーゼの培地中のレベルは、ヒトＤＮ
アーゼまたはウシＤＮアーゼおよびアジュバントを注射
したウサギから入手される血清を使用し、標準的なＥＬ
ＩＳＡによって測定した[Practice and Theory of Enzy
me Immunoassays,P.Tijssen,5章,「Production of antib
odies」,43-78頁(エリセビア,アムステルダム 1985)]。h
ＧＨレベルは、ハイブリッック,Inc.[La Jolla,CA]から
入手した市販のアッセイキット(ＩＲＭＡ，免疫放射測
定アッセイ)を使用し、測定した。
アーゼまたはウシＤＮアーゼおよびアジュバントを注射
したウサギから入手される血清を使用し、標準的なＥＬ
ＩＳＡによって測定した[Practice and Theory of Enzy
me Immunoassays,P.Tijssen,5章,「Production of antib
odies」,43-78頁(エリセビア,アムステルダム 1985)]。h
ＧＨレベルは、ハイブリッック,Inc.[La Jolla,CA]から
入手した市販のアッセイキット(ＩＲＭＡ，免疫放射測
定アッセイ)を使用し、測定した。
【０１１９】最後の欄のデータは、ベクターpＳＶＩ２.
ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮaseおよびpＳＶＩ５.ＤＮase
によって発現されるＤＮアーゼ発現が、親ベクターであ
るpＳＶＩ.ＤＮaseから得られるものよりも若干高いこ
とを示している。最初の欄の数字は、pＳＶＩ６Ｂ.ＤＮ
aseにも当てはまるより有意な相違を示している。３番
目の欄にはより信頼のおけるデータが示されているよう
であるが、有効なhＧＨ合成がＤＮアーゼ合成のレベル
に悪影響を及ぼさないことは確かではない。例えば、１
つの理論に拘束されないが、このレベルの発現は、分泌
経路における成分の拮抗の原因となるようであり、それ
はhＧＨ発現が高い場合、結果としてＤＮアーゼのレベ
ルが減少される。他の拮抗的作用もこの結果に影響を与
える場合があり、第１の欄のデータは種々のＤＮアーゼ
ベクター間における発現能の実際上の相違を十分に示し
得るものである。いずれにしても、修飾スプライス単位
を含有する少なくとも幾つかのベクターは一時的検定に
おいて、最初のスプライス単位を有する対応ベクターよ
りもＤＮアーゼをより高いレベルで発現することは明ら
かである。
ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮaseおよびpＳＶＩ５.ＤＮase
によって発現されるＤＮアーゼ発現が、親ベクターであ
るpＳＶＩ.ＤＮaseから得られるものよりも若干高いこ
とを示している。最初の欄の数字は、pＳＶＩ６Ｂ.ＤＮ
aseにも当てはまるより有意な相違を示している。３番
目の欄にはより信頼のおけるデータが示されているよう
であるが、有効なhＧＨ合成がＤＮアーゼ合成のレベル
に悪影響を及ぼさないことは確かではない。例えば、１
つの理論に拘束されないが、このレベルの発現は、分泌
経路における成分の拮抗の原因となるようであり、それ
はhＧＨ発現が高い場合、結果としてＤＮアーゼのレベ
ルが減少される。他の拮抗的作用もこの結果に影響を与
える場合があり、第１の欄のデータは種々のＤＮアーゼ
ベクター間における発現能の実際上の相違を十分に示し
得るものである。いずれにしても、修飾スプライス単位
を含有する少なくとも幾つかのベクターは一時的検定に
おいて、最初のスプライス単位を有する対応ベクターよ
りもＤＮアーゼをより高いレベルで発現することは明ら
かである。
【０１２０】(c)ＤＮアーゼの安定な発現 pＦＤ１１(０.１μｇ)を入れた６０-mm皿において、プ
ラスミドpＳＶe.ＤＮase、pＳＶＩ.ＤＮase、pＳＶＩ
２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳＶＩ５.ＤＮase、
またはpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮase２μｇをＣＨＯ-dhfr-細胞
にトランスフェクトした。２日後、１０cm皿の細胞を９
０％と１０％に分けた。コロニーが現れたなら、それら
をカウントし、混合コロニーとして検定した。１回しか
測定しなかったpＳＶＩ２.ＤＮaseを除いて、パー・セ
ル検定(per cell assay)を２回(以下の表ではＡまたは
Ｂで表している)行った。この検定では、セルラインを
３mｌ中、２×１０5細胞／ウエル-６ウエル皿に設定し
た。３日後、細胞をカウントし、０.２から２５nｇ／m
ｌの範囲の上記ＤＮアーゼＥＬＩＳＡによって培地をＤ
Ｎアーゼについて検定した。得られた結果を以下に示
す。
ラスミドpＳＶe.ＤＮase、pＳＶＩ.ＤＮase、pＳＶＩ
２.ＤＮase、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳＶＩ５.ＤＮase、
またはpＳＶＩ６Ｂ.ＤＮase２μｇをＣＨＯ-dhfr-細胞
にトランスフェクトした。２日後、１０cm皿の細胞を９
０％と１０％に分けた。コロニーが現れたなら、それら
をカウントし、混合コロニーとして検定した。１回しか
測定しなかったpＳＶＩ２.ＤＮaseを除いて、パー・セ
ル検定(per cell assay)を２回(以下の表ではＡまたは
Ｂで表している)行った。この検定では、セルラインを
３mｌ中、２×１０5細胞／ウエル-６ウエル皿に設定し
た。３日後、細胞をカウントし、０.２から２５nｇ／m
ｌの範囲の上記ＤＮアーゼＥＬＩＳＡによって培地をＤ
Ｎアーゼについて検定した。得られた結果を以下に示
す。
【表４】
【０１２１】実施例５ 組換えヒトＤＮアーゼによる化膿性喀痰の粘性の減少 嚢胞性繊維症の患者から得られた化膿性喀痰に対する組
換えヒトＤＮアーゼＩおよび純粋ウシＤＮアーゼＩ(Wor
thington)の効果を単純な流出能を使用して調査した。
簡単に説明すれば、試料をエッペンドルフ試験管中で喀
痰約１００μｌと一緒にインキュベートした。３７℃に
おいて種々の時間経過後、その試験管を反転させ、喀痰
が試験管の側面を流れ落ちるその流出能を０(動かない)
から５＋(試験管の側面を自由に流動する)までのスケー
ルで評価した。ヒトＤＮアーゼＩでトランスフェクトし
た細胞由来の２９３上清は３０分のインキュベートによ
りスケールを４−５＋に変動させたが、非トランスフェ
クト細胞の上清は全く効果を示さなかった。ウシおよび
ヒトＤＮアーゼを阻害するＥＤＴＡが、ヒトＤＮアーゼ
Ｉトランスフェクト細胞由来の２９３上清による嚢胞性
繊維症の喀痰の液化を完全に防止することが判明したこ
とから、その特異性が確認された。さらに、プロテアー
ゼを含まない純粋なウシＤＮアーゼの喀痰に対する効果
が初めて試験された。従来報告された刊行物では、それ
自身喀痰に対する活性を有すると示されているタンパク
質であるキモトリプシンおよびトリプシンが意義ある量
で混入していると考えられていたウシＤＮアーゼを利用
していた。プロテアーゼを含まない純粋なウシＤＮアー
ゼＩは、化膿性喀痰を迅速に液化した。したがって、純
粋なＤＮアーゼ単独で、喀痰の粘性は効果的に減少され
る。
換えヒトＤＮアーゼＩおよび純粋ウシＤＮアーゼＩ(Wor
thington)の効果を単純な流出能を使用して調査した。
簡単に説明すれば、試料をエッペンドルフ試験管中で喀
痰約１００μｌと一緒にインキュベートした。３７℃に
おいて種々の時間経過後、その試験管を反転させ、喀痰
が試験管の側面を流れ落ちるその流出能を０(動かない)
から５＋(試験管の側面を自由に流動する)までのスケー
ルで評価した。ヒトＤＮアーゼＩでトランスフェクトし
た細胞由来の２９３上清は３０分のインキュベートによ
りスケールを４−５＋に変動させたが、非トランスフェ
クト細胞の上清は全く効果を示さなかった。ウシおよび
ヒトＤＮアーゼを阻害するＥＤＴＡが、ヒトＤＮアーゼ
Ｉトランスフェクト細胞由来の２９３上清による嚢胞性
繊維症の喀痰の液化を完全に防止することが判明したこ
とから、その特異性が確認された。さらに、プロテアー
ゼを含まない純粋なウシＤＮアーゼの喀痰に対する効果
が初めて試験された。従来報告された刊行物では、それ
自身喀痰に対する活性を有すると示されているタンパク
質であるキモトリプシンおよびトリプシンが意義ある量
で混入していると考えられていたウシＤＮアーゼを利用
していた。プロテアーゼを含まない純粋なウシＤＮアー
ゼＩは、化膿性喀痰を迅速に液化した。したがって、純
粋なＤＮアーゼ単独で、喀痰の粘性は効果的に減少され
る。
【図１】 ヒトＤＮアーゼのアミノ酸およびＤＮＡ配列
を示すものである。天然のシグナル配列には下線を施
し、可能性ある開始コドンは線で囲み、成熟配列は括弧
でくくっている。
を示すものである。天然のシグナル配列には下線を施
し、可能性ある開始コドンは線で囲み、成熟配列は括弧
でくくっている。
【図２】 成熟ヒトおよびウシのＤＮアーゼ(それぞれh
ＤＮアーゼおよびbＤＮアーゼ)のアミノ酸配列の比較を
示している。星印は正確な相同性(ホモロジー)を示し、
ピリオドは保存置換を意味している。
ＤＮアーゼおよびbＤＮアーゼ)のアミノ酸配列の比較を
示している。星印は正確な相同性(ホモロジー)を示し、
ピリオドは保存置換を意味している。
【図３】 発現ベクターpＲＫ.ＤＮase３およびpＳＶe.
ＤＮaseの構築の一部を示している（図４に続く）。
ＤＮaseの構築の一部を示している（図４に続く）。
【図４】 発現ベクターpＲＫ.ＤＮase３およびpＳＶe.
ＤＮaseの構築の一部を示している（図３の続き）。
ＤＮaseの構築の一部を示している（図３の続き）。
【図５】 修飾のないpＲＫ５ベクターのスプライスユ
ニットを含有する発現ベクターpＳＶＩ.ＤＮaseの構築
の一部を示している（図６に続く）。
ニットを含有する発現ベクターpＳＶＩ.ＤＮaseの構築
の一部を示している（図６に続く）。
【図６】 修飾のないpＲＫ５ベクターのスプライスユ
ニットを含有する発現ベクターpＳＶＩ.ＤＮaseの構築
の一部を示している（図５の続き）。
ニットを含有する発現ベクターpＳＶＩ.ＤＮaseの構築
の一部を示している（図５の続き）。
【図７】 スプライスユニットが修飾され、および周囲
ＤＮＡを含有している発現ベクターpＳＶＩ１２.ＤＮas
e、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳＶＩ５.ＤＮaseおよびpＳＶ
１６b.ＤＮaseの構築を示している。
ＤＮＡを含有している発現ベクターpＳＶＩ１２.ＤＮas
e、pＳＶＩ３.ＤＮase、pＳＶＩ５.ＤＮaseおよびpＳＶ
１６b.ＤＮaseの構築を示している。
【図８】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード領
域は含まない)pＳＶＩ.ＤＮaseの完全ヌクレオチド配列
の一部を示している（図９に続く）。
域は含まない)pＳＶＩ.ＤＮaseの完全ヌクレオチド配列
の一部を示している（図９に続く）。
【図９】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード領
域は含まない)pＳＶＩ.ＤＮaseの完全ヌクレオチド配列
の一部を示している（図８の続き）。
域は含まない)pＳＶＩ.ＤＮaseの完全ヌクレオチド配列
の一部を示している（図８の続き）。
【図１０】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ２.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１１に続く）。
領域は含まない)pＳＶＩ２.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１１に続く）。
【図１１】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ２.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１０の続き）。
領域は含まない)pＳＶＩ２.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１０の続き）。
【図１２】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ３.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１３に続く）。
領域は含まない)pＳＶＩ３.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１３に続く）。
【図１３】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ３.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１２の続き）。
領域は含まない)pＳＶＩ３.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１２の続き）。
【図１４】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ５.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１５に続く）。
領域は含まない)pＳＶＩ５.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１５に続く）。
【図１５】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ５.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１４の続き）。
領域は含まない)pＳＶＩ５.ＤＮaseの完全ヌクレオチド
配列の一部を示している（図１４の続き）。
【図１６】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseの完全ヌクレオチ
ド配列の一部を示している（図１７に続く）。
領域は含まない)pＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseの完全ヌクレオチ
ド配列の一部を示している（図１７に続く）。
【図１７】 ＤＮアーゼのコード領域までの(該コード
領域は含まない)pＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseの完全ヌクレオチ
ド配列の一部を示している（図１６の続き）。
領域は含まない)pＳＶＩ６Ｂ.ＤＮaseの完全ヌクレオチ
ド配列の一部を示している（図１６の続き）。
【図１８】 ＳＶＩ、ＳＶＩ２、ＳＶＩ３、ＳＶＩ５お
よびＳＶＩ６Ｂのベクターの調製に関連するスプライス
ユニットのヌクレオチド配列を模式図的に示したもので
ある。図中のボックスはＳＶＩ配列との変動を示してお
り、二重下線は疑似ＡＴＧコドンであり、下線は疑似ス
プライス部位および付加または変動した分岐点配列(Ｂ
ＰＳ)領域を示しており、配列内の中断はＳＶＩ３−Ｓ
ＶＩ５のヌクレオチドの欠損を示しており、「...」は
示していない配列であり、脱字記号はスプライスユニッ
トのスプライスドナーおよびスプライスアクセプター内
それぞれにおける５'および３'開裂部位を示している。
よびＳＶＩ６Ｂのベクターの調製に関連するスプライス
ユニットのヌクレオチド配列を模式図的に示したもので
ある。図中のボックスはＳＶＩ配列との変動を示してお
り、二重下線は疑似ＡＴＧコドンであり、下線は疑似ス
プライス部位および付加または変動した分岐点配列(Ｂ
ＰＳ)領域を示しており、配列内の中断はＳＶＩ３−Ｓ
ＶＩ５のヌクレオチドの欠損を示しており、「...」は
示していない配列であり、脱字記号はスプライスユニッ
トのスプライスドナーおよびスプライスアクセプター内
それぞれにおける５'および３'開裂部位を示している。
Claims (9)
- 【請求項１】 以下のアミノ酸配列 Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Arg Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val Glu Val Met Leu Lys で示される成熟ヒトＤＮアーゼアミノ酸配列を含む、組
換えヒトＤＮアーゼ。 - 【請求項２】 請求項１記載のアミノ酸配列の１つの残
基における１つのアミノ酸置換を除いては、請求項１記
載のアミノ酸配列を有している組換えヒトＤＮアーゼ。 - 【請求項３】 治療学的有効量の、請求項１に示される
成熟ヒトＤＮアーゼアミノ酸配列を含む組換えヒトＤＮ
アーゼおよび製薬的に許容され得る担体を含有する、嚢
胞性繊維症の処置に有用である医薬調製物。 - 【請求項４】 滅菌されている請求項３に記載の調製
物。 - 【請求項５】 ヒトＤＮアーゼが全くプロテアーゼを含
んでいない請求項３に記載の調製物。 - 【請求項６】 エアロゾルの形態にある請求項５に記載
の調製物。 - 【請求項７】 ＤＮアーゼが、請求項１に示される成熟
ヒトＤＮアーゼアミノ酸配列を有している請求項３に記
載の調製物。 - 【請求項８】 夾雑ＤＮＡがオリゴヌクレオチドにまで
分解される条件下で医薬調製物を請求項１に示される成
熟ヒトＤＮアーゼアミノ酸配列を含む組換えヒトＤＮア
ーゼと接触させ、生成したオリゴヌクレオチドおよびヒ
トＤＮアーゼを該調製物から除去することを特徴とす
る、夾雑ＤＮＡを含まないように医薬調製物を精製する
ための方法。 - 【請求項９】 ヒトＤＮアーゼが水不溶性支持体に固定
化されている請求項８に記載の方法。
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