HU211232A9 - Human deoxyribonuclease - Google Patents

Human deoxyribonuclease Download PDF

Info

Publication number
HU211232A9
HU211232A9 HU95P/P00277P HU9500277P HU211232A9 HU 211232 A9 HU211232 A9 HU 211232A9 HU 9500277 P HU9500277 P HU 9500277P HU 211232 A9 HU211232 A9 HU 211232A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
human
deoxyribonuclease
dnase
cell
Prior art date
Application number
HU95P/P00277P
Other languages
English (en)
Inventor
Steven Shak
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26965935&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU211232(A9) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HU211232A9 publication Critical patent/HU211232A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Humán dezoxiribonukleáz
A dezoxiribonukleáz olyan foszfodieszteráz, amely hidrolizálni képes a poli-dezoxiribonukleinsavat. Extenzív mértékben és nemspecifikus módon bontja le a DNS-t és ebben a tekintetben megkülönböztetett jelentőséggel bír a viszonylagosan korlátozott és az aminosavsorrendre specifikus restrikciós endonukleázokkal szemben. A jelen találmány főleg a dezoxiribonukleáz 1-gyel és Π-vel foglalkozik. A dezoxiribonukleáz I tevékenysége szempontjából optimális pH érték közel van a semlegeshez, amely egyébként elengedhetetlen követelmény a divalens kationok számára, és a DNS hidrolízisével 5’-foszfát nukleotidokat hoz létre. A dezoxiribonukleáz II savas pH optimumot mutat, divalens kationok aktiválhatják és a DNS hidrolízisével 3’-foszfát nukleotidok keletkezését idézi elő. A dezoxiribonukleáz I és II molekula többféle formában fordul elő.
A különféle fajokból származó dezoxiribonukleázt különböző mértékig sikerült megtisztítani. A szarvasmarhából származó dezoxiribonukleáz A, B, C és D tisztítása és aminosavsorrendjének teljes megállapítása már 1973-ban megtörtént (Liao et al., J. Bioi. Chem. 248: 1489 [1973]; Salnikow et al., J. Bioi. Chem. 248: 1499 [1973]; Liao et al., J. Bioi. Chem. 249: 2354 [ 1973]). A sertés és a birka dezoxiribonukleáz tisztítása is sikeres volt és teljes mértékben feltárták a szekvenciáját (Paudel et al.. J. Bioi. Chem. 261: 16006 [1986] és Paudel et al.. J. Bioi. Chem. 261: 16012 [1986]). Az emberi vizeletből származó dezoxiribonukleinsavat elektroforetikusan homogén állapotig tisztították és az N-terminális aminosavról azt állapították meg. hogy az leucin; más szekvenciáról mind ez ideig nem számoltak be (Ito et al.. J. Biochem. 95: 1399 [1984]; lásd még Funakoshi etal.,J. Biochem. 82: 1771 [1977]; Murai et al.. Biochim. et Biophys. Acta 517: 186 [1978] és Wroblewski et al., P.S.E.B.M. 74: 443 [1950]).
Annak ellenére, hogy az emlős dezoxiribonukleinsav teljes aminosav sorrendjéről szóló információ már 1973-ban nyilvánosságra került, csak a közelmúltban jelent meg olyan beszámoló, amely az enzimek ezen osztályának klónozására és expressziójára való törekvésekről szólt. Shields és munkatársai leírják a szarvasmarha dezoxiribonukleáz I génjének részbeni expressziós klónozását és egy, fúziós termék expresszióját E. coliban, amely biológiailag és immunológiailag aktívnak bizonyult (Biochem. Soc. Trans. 16:195 [1988]). A Shields és munkatársai által előállított dezoxiribonukleáz termék mindazonáltal toxikus volt a gazdasejtekre és csak egy indukálható promoter segítségével lehetett kinyerni. Sőt mi több, nagy nehézségekkel találták szembe magukat akkor, amikor bármelyik kiónból megpróbálták izolálni a plazmid DNS-t és ezt az akadályt a dezoxiribonukleáz klónjaiból történő expresszió konstitutív szintjeinek tulajdonították. így ezek a szerzők nem voltak képesek meghatározni a dezoxiribonukleázt kódoló nukleinsav szekvenciát. Shields és munkatársai szerint a plazmid kinyerésére való képtelenség a dezoxiribonukleáz konstitutív expressziójának volt az eredménye, még akkor is, amikor a promoter alacsony hőmérsékleten el lett nyomva. Ez egy meglehetősen komoly akadályt jelent, mivel Shields és munkatársai expressziós klónozás segítségével csak azonosították a kiónt, amelyik szükségszerűen azt igényli, hogy a dezoxiribonukleázt valamilyen fajta promoter ellenőrzése alá helyezzék.
A dezoxiribonukleáz nagy számú ismert felhasználási területtel rendelkezik és terápiás célokra is használatos. Fő terápiás alkalmazási területe a tüdőváladékok viszkozitásának csökkentése olyan fajta megbetegedésekben, mint például a tüdőgyulladás, amelyben az ismertetett módon segíti a légutak tisztítását. A légutak váladékok általi elzáródása respiratorikus distresszt okozhat és ez bizonyos esetekben légzési elégtelenséghez, illetve akár halálhoz is vezethet. A szarvasmarha hasnyálmirigyből származó dezoxiribonukleáz a Dornavac kereskedelmi név alatt került forgalomba (Merck), de ezt a terméket vissza kellett vonni a piacról. A beszámolók arra utalnak, hogy a szóban forgó termék rendelkezett némi klinikai hatékonysággal. Mindazonáltal jóllehet néhány klinikus nem figyelte meg jelentősebb fokú mellékhatások kialakulását (Lieberman, JAMA 205: 312 [1968]), mások olyan súlyos szövődmények fellépésére hívták fel a figyelmet, mint például a tüdőirritáció, valamint az anafilaxiás reakció kialakulása (Raskin, Am. Rév. Resp. Dis., 98: 697 [1968]). Az ilyen szövődmények annak a ténynek a számlájára írhatók, hogy a korábban piacra került készítmények proteázokkal voltak szennyeződve és ennek következtében az emberi szervezetben immunogéneknek bizonyultak. Ténylegesen, bár a sűrű halmazállapotú tüdőváladékok által okozott klinikai problémák gyakran idült és visszatérő jellegűek, a szarvasmarha hasnyálmirigy dezoxiribonukleázzal való elhúzódó gyógykezelés nem volt javallható. Ezek a problémák leküzdhetők, amennyiben emberi eredetű dezoxiribonukleáz áll rendelkezésre és azt nagy mennyiségben sikerül előállítani, nem-pankreatikus exokrin sejtekből, amelynek segítségével jobban meg lehet tisztítani a szennyező proteázoktól.
Ennek megfelelően a jelen találmány célja az emberi dezoxiribonukleázt kódoló nukleinsav rendelkezésre bocsátása.
Egy másik célja a jelen találmánynak, hogy megfelelő módszert biztosítson az emberi dezoxiribonukleáz expressziójára rekombináns sejttenyészetekben.
Egy további célja abban áll, hogy lehetőséget biztosítson olyan dezoxiribonukleáz előállítására, amely változó amonisav sorrenddel vagy olyan glikozilációval bír, amely egyébként a természetben nem található meg, valamint olyan egyéb dezoxirobinukleáz származékok előállítására, amelyek feljavított sajátosságokkal rendelkeznek, ideértve a fokozott mértékű specifikus aktivitást is.
A jelen találmány célkitűzéseit egy olyan eljárással sikerült megvalósítani, amely magában foglalja a humán dezoxiribonukleázt kódoló nukleinsav előállítását; a gazdasejt transzformálását a nukleinsavval; a gazdasejt tenyésztését, hogy lehetőség nyíljon a dezoxiribonukleáz felhalmozására a kultúrában, valamint a dezoxiribonukleáz kinyerését a sejtkultúrából. Meglepő
HU 211 232 A9 módon az emberi dezoxiribonukleázt kódoló teljes hosszúságú kiónt sikerült azonosítani és kinyerni és ezen felül a DNS minden különösebb nehézség nélkül expresszálódott a rekombináns gazdasejtek által.
A preferált megvalósítási formában az emlős dezoxiribonukleáz teljes hosszúságú, érett emberi dezoxiribonukleáz, amelynek az aminosav-sorrendje megegyezik a natív emberi dezoxiribonukleázéval, valamint ennek terményeiben előforduló alléljai, vagy előre meghatározott aminosav szekvenciájú vagy glikozilációs variánsai. A dezoxiribonukleázt kódoló nukleinsav előnyösen egy preproteint kódol, amelyet a gazdasejtek termelnek és választanak ki, különösképpen az emlős sejtek.
Az 1. ábra a humán dezoxiribonukleáz aminosav- és DNS szekvenciáját ábrázolja. A natív jel szekvencia alá van húzva, a lehetséges iniciációs kodonok körbe vannak zárva és az érett szekvencia pedig szögletes zárójelben van.
A 2. ábra az érett humán (hDNase) és szarvasmarha (bDNase) dezoxiribonukleáz aminosav sorrendjei közötti összehasonlítást mutatja. A csillagok jelzik a pontos homológiát, a pontok a konzerválódott szubsztitúciókat jelölik.
A 3. ábra pRK.DNase.3 és a pSVe.DNase expreszsziós vektorok konstrukcióját mutatja be.
A 4. ábra a pSVI.DNase expressziós vektor konstrukcióját mutatja be, amely minden módosítás nélkül tartalmazza a pRK.5 vektor splice-egységét.
Az 5. ábra a pSVI 2.DNase, a pSVI3.DNase, pSVI5.DNase éa pSVlóB.DNase expressziós vektorok konstrukcióját mutatja be, amelyek a splice-egység és az azt körülvevő DNS módosításait tartalmazzák.
A 6. ábra mutatja a pSVI.DNase nukleotid szekvenciáját egészen a dezoxiribonukleináz kódoló régiójáig, de azt már nem tartalmazva.
A 7. ábra mutatja a pSVI2.DNase nukleotid szekvenciáját egészen a dezoxiribonukleináz kódoló régiójáig, de azt már nem tartalmazva.
A 8. ábra mutatja a pSVI3.DNase nukleotid szekvenciáját egészen a dezoxiribonukleináz kódoló régiójáig, de azt már nem tartalmazva.
A 9. ábra mutatja a pSVI5.DNase nukleotid szekvenciáját egészen a dezoxiribonukleináz kódoló régiójáig, de azt már nem tartalmazva.
A 10. ábra mutatja a pSVlóB.DNase nukleotid szekvenciáját egészen a dezoxiribonukleináz kódoló régiójáig, de azt már nem tartalmazva.
All. ábrán található a példában szereplő vektorok elkészítésében érintett splice-egység nukleotid szekvenciáinak, azaz az SVI, az SVI2, az SVI3, az SVI5 és az SVI6B szekvenciáknak sematikus reprezentációja. A bekeretezések az SVI szekvenciától történő eltéréseket képviselik, a kettős aláhúzás egy rejtett ATG kodon, az aláhúzás a rejtett kötési helyeket mutatja és a hozzáadott vagy megváltozott elágazási pont szekvencia (BPS; branchpoint sequence) régiókat, a szünetek a szekvenciában az SVI3-SVI5 nuleotidok delécióit jelzik. az.....jelölés a nem mutatott szekvenciát jelzi és a karettek az 5' és 3’ hasítási helyeket jelölik a spliceegység és splice-donor, illetve a splice-akceptor helyén belül.
A humán dezoxiribonukleáz olyan polipeptidként van definiálva, amelynek aminosav sorrendje az 1. ábrán található annak aminosav szekvencia variánsaival együtt, amelyek még megtartják a dezoxiribonukleáz kvalitatív enzimatikus aktivitását. Lehetőség szerint a változatok nem immunogének az emberi szervezetben. A variánsoknak kifejezettebb lehet az enzimatikus aktivitásuk, fokozott lehet gátlással szembeni ellenállásuk (különösen az aktinéval szemben), fokozódott lehet az olvadékonyságuk vagy pedig expressziójuk a gazdasejtekben magasabb szinteken folyhat.
A dezoxiribonukleáz aminosav sorrend szerinti változatai a következő három osztály egyikébe vagy többikébe eshetnek: lehetnek szubsztitúciós, inzerciós, vagy deléciós variánsok. Ezeket a táltozatokat rendszerint a dezoxiribonukleázt kódoló DNS-ben található nukleotidok helyspecifikus mutagenezisével állítják elő, amely folyamatban először a variánst kódoló DNS-t nyernek, majd ezután kerül sor a DNS expressziójára rekombináns sejttenyészetben. Mindazonáltal a variáns dezoxiribonukleáz fragmentumokat, amelyek kb. 100-150 aminosav maradékkal rendelkeznek, a leginkább in vitro szintézissel lehet előállítani.
A humán dezoxiribonukleáz aminosav sorrend szerinti változatai vagy előre megatározottak, vagy pedig a természetben is előforduló allélok. Például a szarvasmarha hasnyálmirigy dezoxiribonukleáz a természetben négy olyan molekuláris változat formájában fordul elő. amelyek ugyanazzal az enzim-aktivitással rendelkeznek, de glikozilációs mintázatuk vagy az aminosav szubsztitúciójuk terén eltérnek egymástól. Ezen túlmenőleg az emberi dezoxiribonukleáz a természetben a 222-es aminosav helyen arginin vagy glutamin maradékot tartalmaz. A változatok típusosán ugyanazt a kvalitatív biológiai aktivitást mutatják, mint a természetben előforduló analógok. Az itt leírt dezoxiribonukleázok oltalmi köréből specifikusan ki vannak zárva azok a szekvenciák, amelyek a természetben előforduló szarvasmarha, sertés vagy birka dezoxiribonukleázokat jellemzik.
Bár egy aminosav szekvencia változat bevezetésének helye előre meg van határozva, attól még a mutációnak önmagában nem kell előre meghatározottnak lennie. Például ahhoz, hogy egy adott helyen optimalizálhassuk a mutáció teljesítményét, a cél kodonon vagy régión szaturációs mutagenezis bevezetésére kell, hogy sor kerüljön és ezt követően lehet a dezoxiribonukleáz variánsokat szűrni a kívánt aktivitás optimális kombinációja szempontjából.
Az aminosav szubsztitúciók típusosán egyes maradékok formájában kerülnek bevezetésre; az inzerciók általában az 1-től 10-ig terjedő aminosav maradékok nagyságrendjében szoktak előfordulni és a deléciók nagyságrendje 1 és 30 aminosav maradék között szokott mozogni. A deléciók vagy inzerciók lehetőség szerint egymással érintkező párokba történnek, azaz két aminosav deléciója vagy két aminosav maradék
HU 211 232 A9 inzerciója. A szusztitúciók, deléciók, inzerciók vagy ezek bármilyen fajta kombinációja együttesen használhatók fel egy kívánatos végső szerkezet elérése érdekében. Nyilvánvalóan a variáns dezoxiribonukleáz enzimet kódoló DNS-ben végrehajtott mutációknak nem szabad kiszorítani a szekvenciát a leolvasó keretből és nagy méretű oldallánccal rendelkező maradék, például fenilalanin kerül helyettesítésre egy olyannal, amelyiknek nincsen oldallánca, például glicinnel.
A humán dezoxiribonukleáz aminosav szekvencia 5 variánsaira az alábbi 2. táblázatban lehet példákat találni. Az aminosav maradék számát követő maradék jelzi
lehetőség szerint nem szabad olyan komplementre ré- a helyettesítő vagy beillesztett aminosavakat.
giókat előállítani, amelyek szekunder mRNS struktúrát
volnának képesek előállítani. (EP 75.444A). 2. sz- tablazat
A szubsztitúciós variánsok azok, amelyek esetében 10 Szubsztitúciók
az 1. ábrán bemutatott szekvencia legalább egy amino- H134K, N, R vagy Q FGW, L, I, M vagy V
sav maradéka el van távolítva és egy ettől eltérő mara- A135S I8F, L, V, M vagy W
dék van beillesztve a helyére. Az ilyen szubsztitúciókat L133V, I vagy A R41K vagy H
általában az alább következő 1. táblázatban található- Pl 32 A S43T, C vagy Y
aknak megfelelően készítik, amikor a dezoxiribonukle- 15 N18K, H, RvagyQ K77R vagy H
áz karakterisztikájának finom modulációjára van szűk- S17T R79K vagy H
ség. T20S vagy Y NU0D, S,T,R, YvagyQ
N106K, H, R vagy Q G167P
1. táblázat G105Pvagy A F169L, V, I vagy M
Eredeti maradék Példa szubsztitúciók 20 D107E vagy T A171G, V vagy M
Alá ser RHO A S250T, Y vagy M
Arg lys R121K vagy H Y253T, S vagy M
Asn gin; his T108S vagy Y R73N
Asp glu P103S. T vagy Y R73C + D139C
Cys ser 25 C101S.T. YvagyM K260R vagy S
Gin asn C104S.T. YvagyM L259V, I vagy M
Glu asp
Gly pro Törlés Beillesztés
His asn; gin Δ34Η- Δ39Ε K260RA-COOH
Ile leu; val 30 A159G-161E V131AP132
Leu ile; val Δ204Α-208Η P132AL133
Lys arg; gin; glu Δ121R-127E
Met leu; ile Δ188T-I91T
Phe met; leu; tyr Δ 2O4A-2O8H
Ser thr 35 A223G-231L
Thr ser Δ260Κ
Trp tyr Általában a szekvencia variánsokat a 6-10, 41-43,
Tyr trp; phe 77-79, 110-112, 167-171,250-253,73, 93, 157, 149,
Val ile; leu 185. 187, 198, 17-20, 105-108 és 131-139 helyeken
Az immunológiai azonosság vagy a funkció terén 40 szokták bevezetni. Lehetőség szerint a változatok kon-
alapvető változtatásokat lehet tenni az olyan szubsztitúciók kiválasztásával, amelyek kevésbé konzervatívak, mint az 1. táblázatban találhatók, azaz olyan aminosav maradékok kiválasztásában, amelyek hatásukban jelentősebben különböznek az (a) szubsztitúció térségében található polipeptid váz szerkezetének fenntartásában, például mint lemezes vagy helikális konformáció, (b) a molekula töltésének vagy hidrofób jellegének megtartásában, vagy (c) az oldallánc tömegének fenntartása terén. Azok a szubsztitúciók, amelyektől a legjelentősebb változások várhatók a dezoxiribonukleáz tulajdonságok terén azok, amelyekben (a) egy hidrofil jellegű maradék, például szeril vagy treonil szubsztitúciójára kerül sor egy hidrofób maradék, például leucil, izoleucil, fenilalanil, valil vagy alanil által; (b) ha egy ciszteint vagy prolint bármely más maradék helyettesít; (c) egy elektropozitív oldallánccal rendelkező aminosav maradékot, például lizilt, arginilt, vagy hiszlidilt egy olyan elektronegatív maradék helyettesít, mint például a glutamil vagy az aszpartil; vagy (d) egy zervatív szubsztitúciókat képviselnek. Érthető, hogy bizonyos változatok csökkent vagy hiányzó hidrolitikus aktivitási mutathatnak. Mindezzel együtt az ilyen variánsok is hasznosak lehetnek, mint a dezoxiribonuk45 leáz kimutatására szolgáló immunesszék standardjai, amennyiben megtartanak legalább egy, a natív humán dezoxiribonukleázra jellemző immun epitópot.
A glikozilációs változatok benne foglaltatnak a humán dezoxiribonukleáz által felölelt hatástani terület50 be. Ide tartoznak a nem-glikozilált aminosav szekvencia variánsok, az olyan nem-glikozilált dezoxiribonukleázok, amelyek a dezoxiribonukleáz natív, nem módosított aminosav sorrendjével rendelkeznek, valamint a glikozilációs variánsok. Például a szubsztitúciós vagy deléciós mutagenezis alkalmazható a N-hez kötött glikozilációs helyek kiküszöbölésére, amelyeket a humán dezoxiribonukleáz 18-as és 106-os helyén lehet találni, pl. az aszparagin maradékot deletáljuk vagy egy olyan másik bázikus aminosavval helyettesítjük, mint ami60 lyen a lizin vagy a hisztidin. Egy másik megoldás
HU 211 232 A9 szerint a glikozilációs helyet szegélyező maradékok kerülnek szubsztitúcióra vagy delécióra, még ha az aszparigin maradékok változatlanul is maradnak, hogy a glikozilációs felismerési hely kiküszöbölésével meg lehessen előzni a glikozilációt. Az olyan nem-glikozilált dezoxiribonukleáz, amelyiknek az aminosav sorrendje megegyezik a natív emberi dezoxiribonukleázével, előállítható rekombináns prokarióta sejttenyészetből, mivel a prokarióták nem képesek a polipeptidek glikozilációjára. Ezen túlmenőleg a glikozilációs variánsok olyan módon is előállfthatóak, hogy potenciális N-hez kötött glikozilációs helyeket adunk hozzá konszenzus szekvenciák inzertálásával (akár aminosav szubsztitúcióval, akár delécióval) az N-hez kötött glikoziláció érdekében: Asn-X-Ser vagy Asn-X-Thr. Glikozilációs változatokat úgy lehet létrehozni, hogy vagy kiküszöböljük az N-hez kötött glikozilációs helyeket a 18. és 106. maradéknál, vagy pedig hozzáadunk újakat.
A glikozilációs változatok, azaz az olyan glikoziláció, amely különbözik az emberi hasnyálmirigy vagy vizelet-dezoxiribonukleáztól, úgy hozhatóak létre, hogy kiválogatjuk a megfelelő gazdasejteket vagy pedig in vitro módszerek segítségével. Az élesztő például olyan glikozilációt képes bevezetni, amely jelentősen különbözik az emlős rendszerekben megfigyeitektől. Hasonlóképpen a különböző fajokból (pl. hörcsög, egér, rovar, sertés, szarvasmarha vagy birka) származó vagy különböző szöveti (pl. tüdő, máj, nyirok, embrionális kötőszövet vagy epidermisz) eredetű sejteket, mint a dezoxiribonukleáz forrása, szűrni kell azon képességük szempontjából, hogy mennyire tudnak bevezetni variáns glikozilációt, amelyet például a mannóz vagy a különféle arányban előforduló mannóz, fukóz, sziálsav és egyéb az emlős glikoproteinekben tipikusan megtalálható cukorféleségek megemelkedett koncentációi jellemeznek. Ezen túlmenőleg a glikozilációs fenotípus tekintetében mutációkat hordozó emlős vagy élesztősejtek azonosíthatóak és kiválogathatóak a következő mutáció számára vagy pedig megkonstruálhatóak és hasznosíthatóak a dezoxiribonulkeáz termelés vonatkozásában. A dezoxiribonukleáz in vitro feldolgozása típusos esetben enzimatikus hidrolízis segítségével történik, például neuraminidáz vagy endoglikozidáz H emésztés útján.
A dezoxiribonukleázok inzerciós aminosav sorrend változatai azok, amelyekben egy a cél dezoxiribonukleáz előre meghatározott helyére egy vagy több aminosav maradék bevezetésére kerül sor és amelyek elfoglalják a korábban ott lévő maradékok helyét. Legtöbbnyíre az inzerciós variánsok a dezoxiribonukleáz amino- vagy karboxil-terminálishoz kapcsolódó heterológ proteinek polipeptidek fúziójából jönnek létre. Az olyan dezoxiribonukleáz származékok, amelyek az emberi szervezetben immunogének, nem kívánatosak, például azok, amelyeket egy immunogén polipeptid és egy dezoxiribonukleáz keresztkötése (cross-linking) segítségével fuzionáltak in vitro vagy amelyet rekombináns sejttenyészet segítségével állítottak elő, melyet immunogén fúziókat, mint pl. a lacZ, kódoló DNS-sel transzformáltak. Ennél az oknál fogva az itt fontolóra vett típusos inzerciós variánsok azok a szignálszekvencia variánsok, amelyek fentebb kerültek ismertetésre.
A dezoxiribonukleáz molekula kovalens modifikációi ugyancsak beletartoznak a találmány oltalmi körébe. Az ilyen modifikációk a célba vett aminosav maradékok szerves derivatizáló ágenssel történt reagáltatása útján vezethetőek be, amelyek képesek a kiválasztott oldalláncokkal vagy terminális maradékokkal reakcióba lépni vagy pedig a kiválasztott rekombináns gazdasejtekben működő poszt-transzlációs modikfikációs mechanizmusok hasznosítása útján. Az ilyen módon keletkező kovalens származékok hasznosak a biológiai aktivitás szempontjából jelentős maradékok azonosítására irányuló programok számára, a dezoxiribonukleáz kimutatására szolgáló immunesszékben, vagy a rekombináns dezoxiribonukleáz immunaffinitásos uszítására szánt anti-humán dezoxiribonukleáz antitestek készítésére. Például a biológiai aktivitás komplett inaktiválása a protein ninhidrin reakcióját követően azt sugallja, hogy legalább egy aiginil vagy lizil maradék kritikus jelentőséggel bír az aktivitás fennmaradása szempontjából, miközben a megválasztott feltételek között modifikált egyes maradékok azonosíthatóak a modifikált aminosav maradékot tartalmazó peptid fragmentum izolálásának segítségével.
A ciszteinil maradékok leggyakrabban az a- haloacetátokkal (és a megfelelő aminokkal) reagálnak mint pl. a klórecetsav vagy a klóracetamid, hogy karboximetil vagy karboxamidometil származékokat hozzanak létre. A ciszteinil maradékok ugyancsak származtathatók bróm-trifluor-aceton, a-bróm-P-(5-imidazoil)-propionsav, klóracetol-foszfát, N-alki-maleimidek, 3-nitro-2-piridil-diszulfid, metil-2-piridil-diszulfid, p-klórmerkuribenzoát, 2-klór-merkuri-4-nitrofenol vagy kór7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
A hisztidil maradékok derivatizálása lehetőség szerint 5,5 és 7,0 közötti pH-η dietil-pirokarbonáttal reagáltatva történik, mivel ez a vegyület viszonylag specifikus a hisztidil oldalláncra. A para-bromo-fenacil bromid ugyancsak jól használható; a reakciót O,1M nátrium kakodilátban kell végrehajtani 6,0-os pH mellett.
A lizinil és amino terminális maradékok borostyánkősav - vagy egyéb karbonsav - anhidridekkel reagálnak. Az ezekkel a hatóanyagokkal végzett derivitizációnak meg van az a hatása, hogy visszájára fordítják a lizinil maradékok töltését. Az a-aminosavat tartalmazó maradékok derivatizálására alkalmas reagensek közé tartoznak az olyan imidoészterek, mint pl. a metil-pikolinimidát; a piridoxál-foszfát; a piridoxál; a klór-bórhidrid; a trinitro-benzolszulfonsav; az o-metilizourea; a 2,4-pentándion és a glioxiláttal történő, transzamináz által katalizált reakció.
Az arginil maradékok modifikációja egy vagy több konvencionális reagenssel történik, egyebek között fenilglíoxállal, 2,3-butándionnal, 1,2-ciklohexándionnal és ninhidrinnel. Az arginin maradékok derivatizációja megkívánja, hogy a reakció alkalikus feltételek között menjen végbe, mivel a guanidin funkcionális csoport magas pKa értékkel rendelkezik. Továbbá ezek a reagensek a lizin csoportjaival ugyanolyan jól reagálhatnak, mint az arginin ε-amino csoportjával.
HU 211 232 A9
A tirozil maradékok specifikus modifikációját önmagában kiterjedt vizsgálatoknak vetették alá, különös tekintettel a spektrális jelzések bevezetésére a tirozil maradékokba, amelyet olyan aromás diazónium vegyületekkel vagy tetranitro-metánnal történő reakcióval lehet kivitelezni. Az O-acetil-tirozil- és a 3-nitroszármazékok előállítására legtöbbnyire N-acetil-imidazolt és tetranitrometánt használnak. A tirozil maradékokat 125I vagy 131I felhasználásával jódozzák, hogy jelzett fehérjéket állítsanak elő radioimmunesszé céljára, a kloramin T módszert széles körben alkalmazzák önmagában erre a célra.
A karboxil oldalcsoportok (aszpartil vagy glutamil) szelektíven modifikálhatók karbodiimidekkel (R’N=C=N-R’), mint például l-ciklohexil-3-(2-morfolinil-(4)-etil) karbodiimid vagy l-etil-3-(4-azonia-4,4dimetilpentilj-karbodiimid segítségével. Továbbá az aszpartil és glutamil maradékokat ammónium ionokkal ragáltatva konvertálnak aszparaginil és glutaminil maradékokká, amely alternatívája a nukleinsav mutálásának, hogy aszparagint és glutamint kódoljon.
A bifunkcionális ágensekkel végzett derivatizáció felhasználható mind a protein immunogén polipeptidekkel való intermolekuláris aggregátumainak elkészítésére, mind pedig a protein és egy vízben oldhatatlan támasztó mátrix vagy felület keresztkapcsolódásának kialakítására, hogy fel lehessen használni az esszében vagy az ellenanyag affinitásos tisztítása terén. Ezen túlmenó'leg a láncok közötti keresztkötések tanulmányozása közvetlen információt biztosít a konformációs struktúráról. Az általánosan használt keresztkötést létrehozó szerek közé tartozik az 1,1-bisz (diazoacetil) 2-feniletán, a glutáraldehid, az N-hidroxi-szukcinimid észterek, mint pl. a 4-azido-szalicilsavval létrejött észterek, a homobifunkcionális imidoészterek, ideértve az olyan diszukcinimidil észtereket, mint pl. a 3,3’-ditiobisz (szukcinimid-propionát), és az olyan bifunkcionális maleimideket, mint pl. a bisz-N-maleimido-l,8-oktán. Az olyan derivatizáló ágensek, mint pl. a metil-3[(p-azidofenil)ditio]-propioimidát fotoaktiválható intermediereket hoznak létre, amelyek fény hatására képesek keresztkötéseket létrehozni. Egy másik megoldásként reaktív vízben oldhatatlan mátrixok, mint pl. a cianogén bromid által aktivált szénhidrátok és a következő számú U.S. szabadalmakban leírt vegyületek használhatók protein immobilizációra: 3 969 287:
691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537 és
330 440.
Bizonyos poszt-transzlációs derivatizációk a rekombináns gazdasejteknek a képződött polipeptidre gyakorolt hatásának eredményeképpen jönnek létre. A glutaminil és az aszparaginil maradékok gyakran poszt-transzlációsan dezaminálódnak a megfelelő glutamil és asztartil maradékokká. Ennek alternatívájaként az említett maradékok dezaminálódhatnak enyhén savas környezetben. A szóban forgó maradékok bármelyik formája beleesik a jelen találmány oltalmi körébe.
Az egyéb poszt-transzlációs modifikációk közé tartozik a prolin és lizin hidroxilációja. a szeril vagy a treonil maradékok hidroxil csoportjainak foszforilációja a lizin, arginin és hisztidin oldalláncok a-amino csoportjainak metilálása (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), az N-terminális amin acetilezése és néhány esetben a C-terminális karboxil amidálása.
Az egyéb származékok közé tartoznak a jelen találmányban szereplő polipeptid kovalens kötései egy nem-fehérje természetű polimerhez. Ez a nem-fehérje természetű polimer rendszerint egy hidrofil szintetikus polimer, azaz egy olyan polimer, amely egyébként a természetben nem található meg. Mindazonáltal a természetben megtalálható és a rekombináns vagy in vitro módszerekkel előállított polimerek ugyanolyan hasznosak, mint a természetből izolált polimerek. A hidrofil polivinil polimerek a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, mint például a polivinil-alkohol és a polivinil-pirrolidon. Különösen hasznosak a polialkilén-étere, így a polietilén-glikol, a polipropilén-glikol, a polioxietilén-észterek vagy a metoxi-polietilén-glikol; az olyan polioxi-alkilének, mint pl. a polioxietilén, a polioxipropilén, valamint a polioxietilénből és polioxipropilénből álló tömb-kopolimekek (Pluronics); a polimetarkilátok; a karbomerek; az olyan elágazó vagy nemelágazó poliszacharidok, amelyek a következő szacharid monemereket tartalmazzák: D-mannóz, a D- és L-galaktóz, a fukóz, a ffuktóz, a D-xilóz, az L-arabinóz, a D-gluküronsav, a sziálsav, a D-galaktorunsav, a D-mannuronsav (pl. polimannuronsav vagy alginsav), a D-glukózamin, a D-galaktózamin, D-glukóz és a neuraminsav, beleértve az olyan homopoliszacharidokat és heteropoliszacharidokat, mint pl. a laktóz, az amilopektin, a keményítő, a hidroxietil-keményítő, az amilóz, a dextránszulfát, a dextrán, a dextrinek, a glikogén, vagy a savanyú mukopoliszacharidok, mint pl. a hialuronsav poliszacharid alegysége; az olyan cukoralkohol polimerek, mint pl. a poliszorbitol és a polimannitol; és a heparin vagy a heparon. Ahol a poliszacharid szerepel a natív glikozilációban vagy a rekombináns expresszióban résztvevő glikozilációban, a szubsztitúció helye máshol is lokalizálható, mint a natív N- vagy O-hoz kapcsot glikozilációs helyen, ahol egy hozzáadott vagy helyettesítő N-vagy O-hoz kapcsolt hely bevezetésére került sor a molekulában. Az ilyen polimerek keverékeit alkalmazzák, vagy a polimer lehet éppen homogén is. A polimernek a keresztkapcsolódás előtt nem szükséges vízoldékonynak lenni, de előnyös körülménynek számít, ha az, ezzel szemben viszont a végső konjugátumnak már mindenképpen vízoldékonynak kell lenni. Ezen túlmenőleg nem szabad, hogy a polimer konjugált formájában erősebben immunogén legyen és olyan viszkozitása sem szabad, hogy legyen, amely nem egyeztethető össze az intravénás infúzióban vagy injekcióban történő adagolással, amennyiben ilyen bejuttatási módon szánják alkalmazni.
A polimer lehetőség szerint csak egyetlen reaktív csoportot tartalmaz. Ez segít elkerülni a fehérje molekulák keresztkölődésének kialakulását. Mindazonáltal a jelen találmány oltalmi körébe tartozik az olyan reakció körülmények optimalizálása, amely csökkenti a ke6
HU 211 232 A9 resztkötődés jelenségét vagy amely olyan módon tisztítja meg a reakció termékeket pl. gélfiltráció vagy kromatográfiás szűrők alkalmazásával, hogy lényegében homogén derivatívumokat lehessen nyerni.
A polimer relatív molekulatömege mintegy 100 és 500 000 dalton között mozog és lehetőség szerint 1000 és 20 000 dalton között van. A választott relatív molekulatömeg a polimer természetétől és a szubsztitúció fokától függ. Általában minél erőteljesebb a polimer hidrofil jellege és minél nagyobb a szubsztitúció mértéke, annál alacsonyabb relatív molekulatömeget lehet alkalmazni. Az optimális relatív molekulatömegek szokványos kísérletekkel meghatározhatóak.
A polimer általában kovalensen kötődik a polipeptidhez, mégpedig egy olyan multifunkcionális keresztkötő ágens segítségével, amely reagál egyrészt a polimerrel, másrészt a protein egy vagy több aminosav vagy cukor építő elemével. Mindazonáltal a jelen találmány oltalmi körébe tartozik a polimer közvetlen keresztkötésének megvalósítása egy derivatizált polimernek a proteinnel történő reakciója útján vagy megfordítva.
A polipeptiden található kovalens keresztkötési hely magában foglalja az N-terminális aminocsoportok és a lizin-maradékokon található epszilon-amino csoportokat, csakúgy, mint más amino, imino, karboxil, szulfhidril, hidroxil és egyéb hidrofil csoportokat. A polimer kovalens kötéssel közvetlenül kapcsolódhat a fehérjéhez, anélkül, hogy multifunkcionális (rendszerint bifunkcionális) keresztkötő ágens használatára kerülne sor. Az ilyen keresztkötő ágensek példái közé tartozik az l,I-bisz(diazoacelil)-2-feniletán, a glutáraldehid, az N-hidroxi-szukcinimid észterek, például a 4-azidoszalicilsav észterek, a homobifunkcionális imidoészterek, beleértve a diszukcinimidil észtereket, mint pélául a 3,3’ -ditiobisz(szukcinimidil-propionát) és az olyan bifunkcionális maleimideket, mint pl. a bisz-N-maleimido-l,8-oktán. Az olyan derivitizáló ágensek, mint pl. a metil-3-[(p-azido-fenil) ditio] - propioimidát fotoaktiválható intermediereket hoznak létre, amelyek fény hatására képesek keresztkötéseket létrehozni. Egy másik megoldásként reaktív vízoldékony mátrixok, mint pl. a cianogén-bromid által aktivált szénhidrátok és a következő számú U.S. szabadalmakban leírt vegyületek vannak megfelelően módosítva, hogy keresztkötéseket hozzanak létre: 3 959 080; 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537; 4 055 635; és 4 330 440. Az amino csoportokhoz történő kovalens kötéseket olyan ismert kémiai anyagokkal lehet elérni, amelyek cianursav-kloridon, karbonil-diimidazolon, aldehid reaktív csoportokon (PEG alkoxid + a brómacetaldehid dietilacetálja; PEG plusz DMSO és ecetsav-anhidrid, vagy PEG-klorid + a 4-hidroxibenzaldehid fenoxidja, a szukcinimidil aktiválta észterek, az aktivált ditiokarbonát-PEG, a 2,4,5-triklór-fenil-kloroformát vagy a p-nitrofenil-kloroformát által aktivált PEG) alapulva. A karboxil csoportok derivatizálása a PEG-amin karbodiimid segítségével folyó hozzákapcsolásával történik.
A polimereket az oligoszacharid csoportokkal oxidációval konjugálják olyan vegyületek felhasználásával, mint pl. a metaperjodát vagy olyan enzimekével, mint pl. a glukóz vagy galaktóz oxidáz (melyek mindegyike a szénhidrát aldehid származékát hozza létre), amelyet a hidraziddal vagy amino-derivatizált polimerekkel való reakció követ ugyanolyan módon, ahogyan annak leírása megtalálható a következő közleményekben: Heitzmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 71: 3537-3541 (1974), vagy Bayer et al., Methods in Enzymology, 62: 310 (1979), leírták az oligoszacharidok biotinnal vagy avidinnal történő jelzésére. Továbbá olyan egyéb kémiai vagy enzimatikus módszerek is alkalmasak lehetnek, amelyeket mind ez ideig használnak az oligoszacharidok és a polimerek összekapcsolására. A szubsztituált oligoszacharidok alkalmazása különösen előnyös, mivel általában kevesebb szubsztitúcióra kerül sor, mint a derivatizációra használt aminosav helyek esetében és így az oligoszacharid termékek homogénebbek lesznek. Az oligoszacharid szubsztituensek ugyancsak modifikálhatók enzimes emésztéssel a cukrok eltávolítása céljából, például neuraminidáz emésztéssel, megelőzve a polimer derivatizációt.
A polimer hordoz egy olyan csoportot, amely közvetlenül reakcióba lép a polipeptid egy aminosav oldalláncával, vagy pedig N- illetve C-terminálisával, vagy pedig a multifunkcionális keresztkötő ágenssel lép reakcióba. Általánosságban az ilyen reaktív csoportokat hordozó polimerek jól ismertek az immobilizált fehérjék előállítása terén. Az ilyen vegyületek használata érdekében egy olyan vízoldékony polimert kell itt alkalmazni, amely egyébként ugyanazon módon derivatizálódik, mint az eddig protein immobilizációra alkalmazott oldhatatlan polimerek. A cianogén-bromid aktiválása különösen hatékony eljárás, amelyet jól lehet alkalmazni a poliszacharidok keresztkapcsolódásának kialakítása terén.
A „vízoldékony” a polimer konjugátumra vonatkoztatva azt jelenti, hogy a konjugátum a terápiásán hatékony koncentráció eléréséhez kielégítő mennyiségben oldékony olyan élettani folyadékokban, mint amilyen például a vér is.
A „vízoldékony” kifejezés a kezdeti polimer vonatkozásában azt jelenti, hogy a polimer vagy a konjugációhoz használt reaktív intermedierje eléggé vízoldékony ahhoz, hogy részt tudjon venni a derivatizációs reakcióban.
A polimerrel való szubsztitúció foka a proteinen található reaktív helyek számától függően változó, valamint függ attól is, hogy teljes fehéije vagy fehérje töredék használatára kerül sor, hogy a protein egy heterológ proteinnel fuzionálódott-e, valamint függ a relatív molekulatömegtől, a hidrofilicitástól és a polimer egyéb jellemzőitől, és a választott tényleges protein derivatizációs helyektől. Általában a konjugátum mintegy 1 és 10 közötti számú polimer molekulát tartalmaz miközben bármilyen heterológ szekvencia lényegében korlátozatlan számú polimer molekulával szubsztituálható egészen addig, amíg a kívánt aktivitás nem képezi szignifikáns mértékben kedvezőtlen befolyás tárgyát. A keresztkapcsolódás optimális foka könnyen meghatá7
HU 211 232 A9 rozható egy olyan kísérleti mátrix segítségével, amelyben az idő, a hőmérséklet és az egyéb reakció körülmények változtathatók a szubsztitúció fokának megváltoztatása érdekében, melyet követően megatározható a konjugátumnak a kívánt módon való működés irányában mutatkozó képessége.
A polimer, például a PEG, sokféle módszer segítségével látható el keresztkötésekkel, melyek önmagukban ismeretesek a proteinek olyan nem-fehérje természetű polimerekkel történő kovalens modifikációjára, mint például a PEG. Ezek közül a módszerek közül néhány mindazonáltal nem kedvező az itt megfogalmazott célok szempontjából. A cianursav-klorid kémiai tulajdonságai számos mellékreakcióhoz vezetnek, ideértve a fehérje keresztkötések kialakulását is. Ezen túlmenőleg különösen nagy a valószínűsége annak, hogy a szulfhídril csoportokat tartalmazó proteinek inaktivációja következik be. A karbonil-diimidazol kémiai természete (Beauchamp et al., „Anal. Biochem.” 131: 25-33 [1983]) magas pH-t (>8,5) igényel, amely inaktiválhatja a proteineket. Sőt mi több, mivel az „aktivált PEG intermedier reakcióba képes lépni a vízzel, rendkívül nagy „aktivált PEG” moláris túlsúlyra van szükség a proteinhez viszonyítva. A karbonil-diimidazol vegyi reakcióihoz igényelt nagy koncentrációjú PEG ugyancsak problémákhoz vezetett a tisztítással kapcsolatosan, mivel mind a gélfiltrációs kromatográfiát, mind a hidrofób interakciós kromatográfiát kedvezőtlenül befolyásolja. Ehhez járul még, hogy az „aktivált PEG” magas koncentrációi fehérje kicsapódást okozhatnak, amely olyan probléma, amire természetszerűleg már korábban is felhívták a figyelmet (Davis, U.S. Patent 4 179 337). Másrészről viszont az aldehidek kémiai természete (Royer, U.S. Patent 4 002 531) jóval hatékonyabb, mivel csak negyvenszeres moláris túlsúlyt igényel a PEG vonatkozásában, valamint körülbelül egy-két órás inkubációs időt. Mindazonáltal a PEG aldehid készítésére Royer által javasolt mangán-dioxid problematikus „mert a PEG kifejezett tendenciával rendelkezik, hogy komplexeket képezzen fémbázisú oxidáló szerekkel” (Harris el al., ,J. Polym. Sci., Poym. Chem. Ed.” 22: 341-352 [1984]). A DMSO-t és ecetsav-anhidridet alkalmazó mofetta oxidáció használata elhárítja ezt a problémát. Ezen túlmenőleg a Royer által javasolt nátrium-bórhidridet magas pH-η kell használni és jelentős haljama van olyan irányban, hogy redukálja a diszulfid-kötéseket. Ezzel szemben a nátrium-ciánbórhidrid alkalmazása kedvezőbbnek tűnik, mivel ez a vegyület semleges pH-n is hatékony, és csak nagyon kevéssé hajlamos redukálni a diszulfid kötéseket.
A találmány szerinti konjugátumokat az el nem reagáltatott kiindulási anyagoktól gélfiltráció segítségével különítik el. A konjugátumok heterológ fajtáit ugyanezzel a módszerrel tisztítják meg egymástól. A polimer egyaránt lehet vízben oldhatatlan, mint pl. egy hidrofil gél, vagy egy megformált termék. Különösen használhatóak az olyan sebészeti csőféleségekhez használt polimerek, mint például a katéterekhez vagy a dréncsövekhez.
A humán dezoxiribonukleázt kódoló DNS vagy in vitro módszerekkel szintetizálható, vagy pedig viszonylag könnyen állítható elő emberi hasnyálmirigy cDNS könyvtárakból. Mivel az 1. ábra megadja az emberi dezoxiribonukleáz teljes aminosav sorrendjét, csak az emberi dezoxiribonukleázt vagy annak fragmentumait (általában nagyobbak, mint 50 bázispár) kódoló jelzett DNS-sel végzett hibridizációs szűrés végrehajtására van szükség ahhoz, hogy ki lehessen mutatni azokat a kiónokat a cDNS könyvtárakban, amelyek homológ szekvenciákat tartalmaznak. Ezt követi a kiónok elemzése restrikciós enzim analízis és nukleinsav sorrend megatározás segítségével a teljes hosszúságú kiónok azonosítása érdekében. Amennyiben a könyvtárban teljes hosszúságú kiónok nincsenek jelen, akkor a különböző klónokból alkalmas fragmentumokat lehet nyerni és fragmentumokat a szokásos restrikciós helyeken összeköttetésbe lehet ezeket hozni egymással, hogy egy teljes hosszúságú kiónt lehessen összeállítani. Az egyéb állatfajból származó dezoxiribonukleázt kódoló DNS-t vagy úgy lehet nyerni, hogy a humán szekvenciával átvizsgáljuk az illető állatfajból származó könyvtárakat, vagy pedig a gének in vitro szintézisével (szarvasmarha, sertés vagy birka dezoxiribonukleáz esetében).
A találmány oltalmi körébe tartoznak azok a nukleinsav szondák, amelyek rendkívül szigorú feltételek mellett képesek hibridizálni az emberi dezoxiribonukleáz cDNS-éhez, vagy az emberi dezoxiribonukleáz genomjában található génjéhez (beleértve az intronokat és a 5’ vagy 3’ oldalrégiókat, amelyek a szomszédos génekig terjednek vagy mintegy 5000 bp-ig, attól függően, hogy melyik a nagyobb). A dezoxiribonukleázt kódoló genomiális DNS azonosítása a humán genom könyvtár átvizsgálását jelenti kérdése egy detektálható csoporttal, például radioaktív foszforral jelzett cDNSsel vagy annak fragmense segítségével, majd a gént tartalmazó klón(ok) kinyerése. A komplett gént darabról darabra szükség esetén ún. „sétálással” kell összerakni. Típusos esetben a molekuláris szondák nem kódolnak szarvasmarha, juh vagy sertés dezoxiribonukleinsavat és hosszúságuk mintegy 10 és 100 bp között mozoghat.
Általában a találmány szempontjából hasznos vektorok felépítéséhez használt DNS szekvenciák klónozása prokarióták felhasználásával történik. Ilyen szempontból például az E. coli K12 K294 törzs (ATCC No. 31446) alkalmazása különösen hasznosnak bizonyulhat. Egyéb mikrobatörzseket is lehet használni, melyek közé tartozik az E. coli B és az E. coli XI776 (ATCC No. 31537). Ezek a példák inkább az illusztráció céljára szolgálnak, semminthogy korlátozó jellegűeknek lennének tekinthetők. Alternatív megoldásként alkalmasak a mondott célra, a klónozás olyan in vitro módszerei, mint például a PCR (polimeráz láncreakció).
A DNáz a rekombináns sejttenyészetben közvetlenül kifejeződhet, mint egy N-terminális metionil-analóg. vagy fúzióként, ahol a humán dezoxiribonukleázhoz fúzionált egy heterológ polipeptid, előnyösen egy szignálszekvencia vagy egyéb polipeptid, amely speci8
HU 211 232 A9 fikus hasítási hellyel rendelkezik a dezoxiribonukleáz N-terminálisánál. Például egy prokarióta szekréciós expressziós vektor konstrukciója esetén a natív dezoxiribonukleáz szignálszekvenciát alkalmazzák azokkal a gazdasejtekkel, amelyek elismerik a humán szignált. Amikor a gazdasejt „felismeri” a szekréciós leaderszekvenciát, a gazdasejt szignál peptidáza képes a kívánt, érett dezoxiribonukleáz C-teiminálisánál fúzionált leader polipeptidnek a lehasítására. Azoknál a gazda prokariótáknál, amelyeknél nincs jelen a humán szignálszekvencia, ezt a szignált egy olyan prokarióta szignál helyettesíti, amelyet például az alkalikus foszfatáz a penicillináz, az IPP vagy a hőstabil enterotoxin II leaderek csoportjából szelektáltak. Az élesztőben történő szekrécióhoz a humán dezoxiribonukleáz szignált lehet helyettesíteni az élesztő invertáz, alfa faktor vagy a savas foszfatáz káderekkel. Az emlős sejtben történő expresszió esetében a natív szignál kielégítő, emellett egyéb emlős szekréciós protein szignálok is alkalmasak, csakúgy mint a virális szekréciós leaderek, például a herpes simplex gD szignál.
A dezoxiribonukleáz expresszióra kerülhet bármely gazdasejtben, de lehetőség szerint emlős gazdasejteket célszerű használni szintéziséhez. Mindazonáltal prokariótákból, gombákból, élesztő pichiából, rovarokból és hasonlókból származó gazdasejtek ugyancsak használatosak az expresszióra. A példaként szereplő prokarióták között vannak a klónozásra alkalmas törzsek ugyanúgy, mint az E. coli W3110 (F~, λ' prototróf, ATTC No. 27235) az olyan enterobaktérium féleségek, mint például a Serratia marcescans, a bacillusok és a különféle pseudomonasok. Lehetőség szerint a gazdasejteknek csak minimális mennyiségű proteolitikus enzimet szabad kiválasztaniok.
Az expressziós gazdasejtek tipikusan a humán dezoxiribonukleázt kódoló DNS-sel vannak transzformálva, amely egy expressziós vektorba van ligáivá. Az ilyen vektorok rendszerint hordoznak egy replikációs helyet (jóllehet amennyiben kromoszómális integráció fordul elő, ez nem szükségszerű). Jelenleg egy olyan expressziós vektor használata preferált, amely az alább szereplő 4. példában van leírva, melyben a vektor egy splice-donor-intron-splice-akceptor szekvenciát vagy egységet tartalmaz.
Az expressziós vektorok közé tartoznak az olyan marker szekvenciák is, amelyek képesek a transzformáit sejtekben a fenotípusos szelekció biztosítására. Például az E. coli típusosán a pBR322 segítségével transzformálható, amely egy E. coli fajból származó plazmid (Bolivár et al., Gene 2:95 [1977]). A pBR322 ampicillin és tetracillin rezisztencia géneket tartalmaz és így könnyen használható eszközt biztosít a transzformáit sejtek azonosítására, történjék az akár a klónozás, akár expresszió céljaira. Az expressziós vektorok optimális esetben ugyancsak tartalmaznak olyan szekvenciákat, amelyek hasznosak a transzkripció és a transzláció kontrollja szempontjából, például promotereket és Shine-Dalgarno szekvenciákat (a prokarióták esetében) vagy promotereket és enhancereket (az emlős sejtek esetében). A promoterek indukálhatók lehetnek, de nem szükségszerűen azok; meglepő módon még az olyan erőteljes konstitutív promoterek, mint például az emlős gazdasejtek CMV promoteije anélkül képes dezoxiribonukleázt előállítani, hogy toxikus volna a gazdasejtre. Miközben elképzelhető, hogy az expressziós vektorok nem szükségszerűen tartalmaznak valamely expressziós kontrollt, replikatív szekvenciákat vagy szelekciós géneket, ezek hiánya akadályt gördíthet a dezoxiribonukleáz transzformánsok azonosítása és a magas fokú dezoxiribonukleáz expresszió elérésének útjába.
A prokarióta gazdasejtekhez alkalmas promoterek közé tartoznak illusztrációképpen a β-laktamáz és laktóz promoter rendszerek (Chang et al., „Natúré”, 275: 615 [1978]; és Goeddel et al., „Natúré” 281: 544 [1979]), az alkalikus foszfatáz, a triptofán (trp) promoter rendszer (Goeddel, „Nucleic Acids Rés.” 8: 4057 [1980] és EPO Appln. Publ., No. 36,776) és az olyan hibrid promoterek, mint például a tac promoter (H. de Boer et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. USA” 80: 21-25 [1983]). Mindazonáltal egyéb funkcionális bakteriális promoterek is alkalmasak erre a célra. Ezeknek általában ismeretes a nukleotid sorrendje, ezáltal egy képzett szakember operábilisan hozzá tudja őket kapcsolni a dezoxiribonukleázt kódoló DNS-hez (Siebenlist et al., „Cell” 20: 269 [1980]) olyan linkerekkel vagy adapterokkal, amelyek bármilyen szükséges restrikciós hely rendelkezésre bocsátásához szükségesek. A bakteriális rendszerek vonatkozásában felhasználható promoterek ugyancsak tartalmaznak egy Shine-Dalgarno (S.D.) szekvenciát operábilisan a dezoxiribonázt kódoló DNS-hez kapcsolva.
A prokariótákon kívül alkalmazhatók a fentebb vázolt célokra olyan eukarióták is, mint példának okából az élesztő, vagy a fonalas gombaféleségek. A Saccharomyces cerevisiae a leggyakrabban használt eukarióta mikroorganizmus, jóllehet nagyszámú egyéb törzs is széles körben rendelkezésre áll. A Saccharomyces cerevisiae törzsei rendelkeznek az AB 107-30 (4) - VN#2 (ATCC Accession No. 20937), különösen ami a 4M ortovanadát iránti rezisztenciát illeti, különösképpen alkalmas a dezoxiribonukleáz expresszió céljaira. Ezzel a VN#2 törzzsel kívánatos stabilan transzformálni a sejteket egy az élesztő 2-mikronos plazmidból származó nagy példányszámú plazmid sejtjeivel, (ld. ugyanott). Általában élesztőben a plazmid YRp7 megfelelő expressziós vektor (Stinchcomb, et al., Natúré 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 20: 157 [1980]). Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, amely szelekciós markert biztosít egy olyan mutáns élesztőtörzs számára, amely nem rendelkezik a növekedés képességével triptofánban, mint például az ATCC No. 44076 vagy a PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 [1977]). A trpl lézió jelenléte karakterisztikus az élesztő gazdasejt genomra, amely így effektív környezetet biztosít triptofán hiányában a növekedés általi transzformáció detektálására. Az expresszió pichiában (US 4 808 537) szintén kielégítő.
Az élesztő gazdasejtekhez való használatra megfelelő promoter szekvenciák közé tartoznak a 3-foszfo9
HU 211 232 A9 glicerát kináz (Hitzeman et al., „J. Bioi. Chem.” 255: 2073 [1980]), vagy egyéb olyan glikolitikus enzimek (Hess et al., „J. Adv. Enzyme Reg.” 7: 149 [1968]; és Holland, „Biochemistry” 17: 4900 [1978] promoterei, mint az enoláz, a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, a hexokináz, a piroszőlősav-dekarboxiláz, a foszfofruktokináz, a glukóz-6-foszfát izomeráz, a 3-foszfoglicerát-mutáz, a piroszőlősav-kináz, a trióz-foszfát izomeráz, a foszfoglukóz izomeráz és a glukokináz.
A növekedési feltételek között a kontrollált transzkripció további előnyös tulajdonságával bíró egyéb indukálható élesztő promoterek közé tartoznak az alkohol dehidrogenáz 2, az izo-citokróm C, a savanyú foszfatáz, a nitrogén anyagcserével kapcsolatos bontó enzimek, a metallotionein, a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, valamint a maltóz és galaktóz felhasználását felelős enzimek promoter régiói. Az élesztő expresszió terén felhasználható alkalmas vektorok és promoterek részletesebb leírása megtalálható a következő közleményben: R. Hitzeman et al„ Európai szabadalom No. 73.657A.
Jól ismertek az eukarióták vonatkozásában alkalmazható expressziós kontroll szekvenciák is. Látszólag az összes eukarióta gén rendelkezik egy olyan AT-ben gazdag régióval, amely megközelítőleg mintegy 25-30 bázissal felfelé helyezkedik el attól a helytől, ahol a transzkripció megkezdődik. A transzkripció kezdeti helyétől mintegy 70-80 bázisnyira felfelé számos gén esetében találtak egy olyan CXCAAT régiót, amelyben az X bármely nukleotid lehet. A legtöbb eukarióta gén 3’ végénél található egy olyan AATAAA szekvencia, amely kódolást végző szekvencia 3' végéhez történő poli A hozzáadásának a szignálja lehet. Valamennyi említett szekvencia beilleszthető az emlős expressziós vektorokba.
Az emlős gazdasejtekben található vektorokból történő transzkripció ellenőrzésére megfelelően alkalmas promoterek számos forrásból minden különösebb nehézség nélkül kinyerhetőek, így például az olyan vírusok genomjaiból, mint amilyen a polióma vírus, az SV40, az adenovírus, az MMV (szteroiddal indukálható), a retrovírusok (pl. a HÍV LTR-je) a hepatitis-B vírus és leginkább a citomegalovírus, vagy olyan heterológ emlős promoterekből, mint például a béta aktin promoter. Az SV40 korai és késői promoterei megfelelőképpen kinyerhetők egy olyan SV40 restrikciós fragmentum formájában, amely ugyancsak tartalmazza a replikáció SV40 virális eredetű origóját. Fiers et al.. Natúré, 273: 113 (1978). A humán citomegalovírus közvetlen korai promotere alkalmasan kinyerhető a HindlII E restrikciós fragmentum formájában. Greenaway, P. J. et al„ Gene 18: 355 - 360 (1982).
A magasabb szintű eukarióták dezoxiribonukleázát kódoló DNS transzkripciója fokozható egy enhancer szekvencia beillesztésével a vektorba. Az enhancerek a DNS cisz-tevékenységű elemei, általában mintegy 10 300 bázispár méretűek, melyek oly módon hatnak egy adott promoterre, hogy ezáltal növeljék transzkripcióját. Az enhancerek viszonylag orientáció és pozíció függetlenek, amelyek a transzkripciós egységhez képest 5’ irányban (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 993 [1981]) és 3’ irányban (Lusky, M. L„ et al., Mól. Cell Bio. 3: 1108 [1983]) helyezkednek el vagy az intronon belül (Banerji, J. L. et al., Cell 33: 729 [1983]), vagy magán a kódolást végző szekvencián belül (Osborne, T. E, et al., Mól. Cell Bioi. 4: 1293 [1984]). Számos enhancer szekvencia ismeretes már jelenleg emlős génekből (globin, elasztáz, albumin, α-fötoprotein és inzulin). Típusos esetben mindazonáltal eukarióta sejtvírusból származó enhancert használnak. Erre való példák közé tartozik a replikációs origó (bp 100 - 270) késői oldalán található SV40 enhancer, a citomegalovírus korai promoter enhancer, a replikációs origó késői oldalán található polióma enhancer, valamint a különféle adenovírus enhancerek.
Az eukarióta gazdasejtekben (élesztő, gomba, rovar, növényi, állati, emberi vagy egyéb soksejtű szervezetekből származó sejtmaggal rendelkező sejtek) ugyancsak tartalmaznak a transzkripció befejezéséhez szükséges olyan szekvenciákat, amelyek befolyásolhatják a mRNS expressziót. Ezek a régiók a dezoxiribonukleázt kódoló mRNS transzlációra nem került szakaszában található poliadenilát szegmensek formájában kerülnek átírásra. A 3’ nem-átírt régiók közé tartoznak a transzkripciós terminációs helyek is.
Az expressziós vektorok tartalmazhatnak egy szelekciós gént is, amelyet szelekciós markemek is neveznek. Az emlős sejtek vonatkozásában alkalmas módon használható szelekciós markerek közé tartozik a dihidrofolsav reduktáz (DHFR), a timidin kináz (TK), vagy a neomicin. Amikor az ilyen szelekciós markerek sikeres bevitelre kerülnek emlős gazdasejtekbe, szelekciós nyomás alá helyezve a transzformált emlős gazdasejtek képesek túlélni. A szelekciós rendszernek két széles körben használt egymástól eltérő kategóriája van. Az első kategória a sejt metabolizmuson alapul, és egy olyan mutáns sejtsor alkalmazásán, amely nem képes a kiegészített médiumoktól függetlenül növekedni. Két ilyen példa ezekre: a CHO DHFR' sejtek és az egér LTK* sejtek. Ezek a sejtek képtelenek növekedni az olyan tápanyagok hozzáadása nélkül, mint a timidin vagy a hipoxantin. Mivel ezekből a sejtekből hiányzanak bizonyos a komplett nukleotid szintetikus reakcióút megjárásához szükséges gének, ezért nem képesek túlélni, csak abban az esetben, ha a hiányzó nukleotidok rendelkezésre állnak a kiegészített médiumban. A médiumok kiegészítésének egyik alternatívája intakt DHFR vagy TK gén bevezetése a megfelelő géneket nélkülöző sejtekbe, ilyen módon változtatva meg növekedési igényeiket. A DHFR vagy TK génnel előzetesen nem transzformált individuális sejtek nem lesznek képesek túlélni a kiegészítetten médiumokban.
A második kategória a domináns szelekció, amely egy olyan szelekciós sémára utal, amely bármilyen fajta sejttípusban használatos és nem igényli mutáns sejtsorok alkalmazását. Ezek a sémák típusos esetben egy vegyszert használnak a gazdasejt növekedésének előállítására. A heterológ génnel sikeresen transzformáit sejtek egy olyan proteint állítanak elő, amely a gyógyszerrezisztencia átviteléért felelős és így az adott
HU 211 232 A9 sejtek túlélik a szelekciós eljárást. Az ilyen domináns szelekcióra például szolgálhatnak a következő vegyületek: neomicin (Southern et al., J. Molec. Appl. Génét. 1: 327 [1982]), a mikofenolsav (Mulligan et al„ Science 209: 1422 [1980]) vagy a higromicin (Sugden et al., Mól. Cell. Bioi. 5: 410-413 [1985]). A fentebb megadott három példa eukarióta kontroll alatt levő bakteriális géneket alkalmaz a rezisztencia továbbadására a megfelelő vegyülettel szemben, amely lehet G418 vagy neomicin (geneticin), xgpt (mikofenolsav) vagy higromicin.
A humán dezoxiribonukleáz expressziójára alkalmas eukarióta gazdasejtek közé tartoznak a következők: az SV40 által transzformált majomvese CV1 sejtvonal (COS-7, ATCC CRL 1651); a humán embrionális vese sejtvonal (293 vagy 293 sejtek növekedésre szubklónozva szuszpenziós kultúrában; Graham, F. L. et al., J. Gén. Virol. 36: 59 [1977]); bébi hörcsög vese sejtek (BHK, ATCC CCL 10); kínai hörcsög DHFRpetefészek sejtek (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, [1980]); egér Sertoli sejtek (TM4, Mather, J. P, Bioi. Repród. 23: 243-251 [1980]); majomvese sejtek (CV1 ATCC CCL 70); afrikai zöldmajom vese sejtek (VERO-76, ATCC CRL 1587); humán cervikális karcinóma sejtek (HELA, ATCC CCL 2); kutyavese sejtek (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo patkány májsejtek (BRL 3A, ATCC CRL 1442); emberi tüdősejtek (W138, ATCC CCL 75); emberi májsejtek (Hep G2, HB 8065); egér emlőtumor sejtek (MMT 060562, ATCC, CCL 51), és TRI sejtek (Mather, J. P, et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44 68 [1982]).
A kívánatos kódoló és kontroll szekvenciákat tartalmazó megfelelően alkalmas vektorok konstrukciója szabványos ligációs technikai eljárások felhasználásával történik. Az izolált plazmidokat vagy DNS fragmenseket lehasítják, szabják, és olyan módon kötik össze újra, hogy megfeleljen a kívánt plazmidok formájának.
A konstruált plazmidok szerkezeti helyességének megerősítését célzó analízis céljaira a ligációs keveréket az E. coli KI2 294 törzs (ATCC 31446) transzformációjára használják, majd a sikeresen transzformált sejteket szükség esetén ampicillin vagy tetraciklin rezisztencia szempontjából szelektálják. A transzformánsokból származó plazmidokat preparálják, restrikció segítségével analizálják és/vagy szekvenálják Messing et al., Nucleic Acids Rés. 9: 309 (1981), vagy pedig Maxam et al„ Methods is Enzymology 65: 499 (1980) módszere szerint.
A gazdasejteket a jelen találmányban szereplő expressziós vektorokkal transzformálják, majd a promoterek indukciója szempontjából megfelelőképpen módosított konvencionális tápközegben tenyésztik, szelektálva a transzformánsokat vagy amplifikálva a dezoxiribonukleáz génjét. A sejttenyésztéshez szükséges olyan feltételek, mint a hőmérséklet, a pH és az ezekhez hasonlóak, megegyeznek azokkal, amelyeket már korábban is alkalmaztak az expresszióra szelektált gazdasejtek vonatkozásában és ezek egy a mesterségben jártas szakember számára nyilvánvalóak.
A „transzformáció” kifejezés azt a folyamatot jelenti, melynek során a DNS olyan módon kerül bevezetésre egy adott szervezetbe, hogy a szóban forgó DNS molekula replikálhatő legyen akár mint extrakromoszómális elem, akár pedig beintegrálódva a kromoszómába. Amennyiben az külön nincsen másképpen feltüntetve, a gazdasejtek transzformációja céljából a jelen munka folyamán alkalmazott módszer megegyezik azzal a módszerrel, amelynek leírása a következő közleményben található meg: Graham, F. and van dér Eb, A., Virology 52: 456 - 457 (1973). Mindazonáltal a DNS gazdasejtekbe történő bevezetésére szolgáló olyan egyéb módszerek is felhasználhatók, mint a nukleáris injekció, vagy a protoplaszt fúzió alkalmazása. Amennyiben prokarióta sejtek, vagy lényeges mennyiségű sejtfal szerkezeteket tartalmazó sejtek felhasználására kerül sor, akkor a transzfekció számára a leginkább előnyben részesíteni célszerű módszer a kalciumklorid felhasználásával végrehajtott kalcium kezelés, a következő közleményben leírt módszer szerint kivitelezve: Cohen, Ε N. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. (USA), 69:2110(1972).
A „transzfekció” kifejezés arra a folyamatra utal, melynek során DNS bevezetésére kerül sor valamely gazdasejtbe, tekintet nélkül ama, hogy végül is valamilyen kódoló szekvencia expressziójára sor kerül-e, vagy nem kerül-e sor. A transzfekcióval kapcsolatosan nagy számú módszer ismeretes a mesterségben szokásos készségeket elsajátított szakember számára, példának okából a CaPO4 és az elektroporáció. A gazdasejt sikeres transzformációja jelzi azt, hogy a transzfekció eredménnyel járt.
A dezoxiribonukleáz rekombináns sejttenyészetekből történő kinyerésére és tisztítására olyan módszerek alkalmazása segítségével került sor a szóban forgó találmánnyal összefüggő munkákban, melyeknek során emberi, szarvasmarha, birka vagy sertés dezoxiribonukleázt használtak, beleértve az ammóniumszulfátos vagy az etanolos kicsapást, a savas extrakciót, az anion- vagy kation-cserélő kromatográfiát, a foszfocellulóz kromatográfiát, a hidrofób interakciós kromatográfiát, az affinitás kromatográfiát (pl. DNS vagy nukleotidok használatával szilárd támasztóközegben), a hidroxi apatit kromatográáfiát és a lektin kromatográfiát. Ezen túlmenőleg fordított fázisú HPLC és anti-dezoxiribonukleáz ellenagyagok segítségével végzett kromatográfia ugyancsak eredményesen használhatók a dezoxiribonukleáz tisztítás terén. Ahogy azt korábban megjegyezték (Price et al., J. Bioi. Chem,, 244: 917 [1969]) előnyös alacsony kalciumion koncentrációt (megközelítőleg 0,1-5 mM) tartani fenn a tisztítás folyamán. A dezoxiribonukleázt stabilizáló egyéb divalens kationok ugyancsak használatra kerülhetnek. A dezoxiribonukleáz olyan proteáz gátlók jelenlétében tisztítható, mint pl. a PMSF.
Az emberi dezoxiribonukleáz a szükséges kofaktorokkal együtt lett elhelyezve terápiás készítményekben és opcionálisan ugyanolyan módon került alkalmazásra mint az olyan állati dezoxiribonukleáz esetében, mint pl. a szarvasmarha hasnyálmirigy dezoxiribonukleáz. A dez11
HU 211 232 A9 oxiribonukleáz kiszerelése lehet folyadék halmazállapotú és lehetőség szerint olyan izotóniás sóoldatban helyezkedik el, mint pl. a 150 mM nátriumklorid, amely pH 7 esetén 1,0 mM kalciumot tartalmaz. A nátriumklorid koncentrációja 75 és 250 mM között mozoghat. A kalcium koncentrációja 0.01 mM-tól 5 mM-ig teijedhet és a dezoxiribonukleázt stabilizálni képes egyéb divalens kationok is bekerülhetnek az oldatba, vagy akár helyettesíthetik is a kalciumot. A pH értéke 5,5 és 9,0 között változhat és az oldat által tartalmazott divalens kationokkal kompatibilis pufferek ugyancsak felhasználhatók. A kiszerelési forma lehet liofilizált por is, mely ugyancsak kalciumot tartalmaz.
Az alkalmazáshoz jól használhatók a kereskedelmi forgalomban is kapható porlasztók a folyadék halmazállapotú gyógyszeralakok számára, beleértve a jet porlasztókat és az ultrahangos porlasztókat is. A folyadék halmazállapotú kiszerelési formák közvetlenül porlaszthatók és a liofilizált por pedig a rekonstitúciót követően porlasztható. Egy másik megoldási mód, hogy a dezoxiribonukleázt fluorkarbon formuláció és kimért dózisú inhaláló készülék segítségével aerosol formájában használják vagy pedig liofilizált és őrölt por formájában inhalálják. Ezen túlmenőleg a dezoxiribonukleáz folyadék kiszerelési formája közvetlenül becsepegtethető az intubáit betegek nazotracheális vagy endotracheális lélegeztető csöveibe.
A tisztított dezoxiribonukleázt a nyák viszko-elaszticitásának vagy fapadosságának enzimatikus megváltoztatására lehet alkalmazni. Az emberi dezoxiribonukleáz különösen alkalmas az olyan tüdőmegbetegedésekben szenvedő betegek kezelésére, akiknek esetében viszkózus vagy besűrűsödött gennyes váladékok gyűlnek össze légutaikban olyan heveny vagy idült bronhopulmonális megbetegedések során (fertőzéses tüdőgyulladás, hörghurut vagy tracheobronchitis, bronchiektázia. cisztikus fibrózis, asztma, gümőkóros vagy gombás fertőzések), a tracheális vagy bronchiális behatások következtében létrejött atelektázia, illetve a tracheosztomia szövődményeiként. Az ilyen terápiák céljára az oldatok vagy a finoman eloszlatott készítmények konvencionális módon történő becsepegtetése célszerű a bronchusokba, pl. egy dezoxiribonukleáz oldat aerosol formájában alkalmazva. Az emberi dezoxiribonukleáz ugyancsak alkalmas olyan kórállapotok kezelésére, mint a tályogok vagy az olyan kórképekben fellépő zárt téri fertőzések, mint az empiéma, az agyhártyagyulladás, a gennyes tályog, a hashártyagyulladás, az orrmelléküreg gyulladás, a fülgyulladás, a periodontitisz, szívburokgyulladás, hasnyálmirigy-gyulladás, epekövesség, szív belhártyagyulladás és szeptikus ízületi gyulladás, csakúgy, mint az olyan különféle gyulladásos és befertőződött léziók, mint a bőr illetve a nyálkahártyák sérüléseinek befertőződése, a műtéti sebek, a kifekélyesedések és az égési sérülések. Az emberi dezoxiribonukleáz jól használható a testüregekbe behatoló orvosi vezetékek átjárhatóságának fenntartása terén, ideértve a sebészeti dréncsöveket, a vizelet katétereket, a peritoneális dialízises kapukat és a légcsőbe bevezetett oxigén katétereket. A dezoxiribonukleáz fokozhatja az antibiotikumok hatékonyságát fertőzésekben (pl. a gentamicin aktivitása jelentősen lecsökkent az intakt DNS-hez történt reverzibilis kötődés által). Ugyancsak hasznos lehet orális kiegészítés alkalmazása hasnyálmirigy elégtelenségnél. A dezoxiribonukleáz hasznos a gyógyszerészeti készítmények DNS szenynyeződései lebontása terén: a készítmény olyan feltételek között kerül kontaktusba a dezoxiribonukleázzal, hogy az lebontja a DNS-t oligonukleotidokra és ezt követően eltávolítja az oligonukleotidot és a dezoxiribonukleázt a készítményből. Ezen felhasználási terület szempontjából a vízben oldhatatlan támasztó közegben immmobilizált dezoxiribonukleáz használatát célszerű előnyben részesíteni. Végezetül a dezoxiribonukleáz hasznos lehet olyan nem-fertőzéses kórállapotok kezelésében, amelyekben fölhalmozódik a sejttörmelék, beleértve a celluláris DNS-t is. Például a dezoxiribonukleáz hasznos lehet szisztémás adagolást követően a vesemedence gyulladás és a tubulointersticiális vesemegbetegedésben (pl. a sejttörmelékek által elzáródott vesetubulusok esetén), ideértve a gyógyszerek által előidézett vesebántalmat vagy a heveny tubuláris nekrózist.
A dezoxiribonukleáz ugyancsak együtt alkalmazható a föntebb felsorolt kórképek kezelésére használatos egyéb gyógyszerkészítményekkel, mint pl. az antibiotikumok, a gyulladásgátló szerek, és a nyákoldó szerek (pl. az N-acetil cisztein). A dezoxiribonukleáz adagolása ugyancsak hasznos lehet más olyan emberi terápiás proteinek társaságában, mint pl. a növekedési hormon, a proteázgátló szerek, a gamma interferon, az enkefalináz. a tüdő surfactans és a kolónia stimuláló faktorok.
A következő példák megértésének megkönnyítése céljából leírásra került néhány gyakran előforduló módszer illetve szakkifejezés.
Az „plazmidok” kis p-vel vannak jelölve, amelyet megelőznek illetve követnek nagybetűk illetve számok. A kiindulási plazmidok a jelen szabadalommal kapcsolatos munkában vagy kereskedelmi fogalomban kaphatók és a nyilvánosság számára minden megkötöttség nélkül hozzáférhetőek voltak vagy pedig létre lehet őket hozni a már meglévő plazmidokból a nyilvánosságra hozott eljárásoknak megfelelő módon. Ezen túmenőleg a szakmában ismeretesek az itt leírtakkal egyenértékű plazmidok is, és ezek egy normál képzettséggel és készségekkel rendelkező szakember számára nyilvánvaló jellegűek.
A DNS „emésztése” a DNS molekula olyan restrikciós enzimmel történő katalitikus hasítására utal, amely csak bizonyos, a DNS-ben található szekvenciákra hat. Az itt használt különféle restrikciós enzimek beszerezhetők a kereskedelmi forgalomban és reakciófeltételeik, kofaktoraik és egyéb szükségleteik olyan módon nyertek felhasználást, ahogyan az ismeretes a normál képzésben részesült bármely szakember előtt. Analitikai célokból típusosán 1 pg plazmid vagy DNS fragmens használatára került sor, mintegy 2 egység enzimmmel körülbelül 20 pl puffer oldatban. A DNS fragmensek plazmid konstrukció számára történő izolálása céljából típusos esetben 5 és 50 pg közötti DNS-t emésztettek mintegy 20 és 250 egy12
HU 211 232 A9 ség közötti mennyiségű enzimmel egy nagyobb térfogatban. A megfelelő puffer és szubsztrát mennyiségek megatározását egy bizonyos restrikciós enzim vonatkozásában az előállító végezte. Általában 37 °C mellett kb. egy órás inkubációs idők alkalmazására kerül sor, de az előállító a használati utasításával egyezésben eltérhet a megadott értéktől. Miután az emésztés megtörtént, a reakció a kívánt fragmentum izolálása érdekében a reakciótermék közvetlen elektroforézisre kerül egy poliakrilamid gélen.
A lehasított fragmentumok méret szerinti elkülönítése 8 százalékos poliakrilamid géllel történik, mint az a következő közleményben is le van írva: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Rés., 8: 4057 (1980).
Az „defoszforiláció” a bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) kezelés segítségével történő terminális 5’ foszfátok eltávolítására utal. Ez a folyamat megakadályozza, hogy a DNS fragmens két restrikciósán hasított vége „cirkularizálódjon” vagy zárt hurkot formáljon oly módon, hogy az gátolná egy másik DNS fragmens beilleszkedését a restrikciós helyen. A defoszforiláció céljaira szolgáló eljárások konvencionálisoknak tekinthetők. Maniatis. T. et al., Molecular Cloning, pp. 133134 (1982). A BAP alkalmazásával végzett reakciókat 50mM Tris használatával lehet végrehajtani 68 °C-on az olyan összes exonukleáz aktivitás elnyomására, amely jelen lehet az enzimkészítményekben. A reakciók lefolyási ideje egy óra volt. A DNS-fragmenssel történt reakciót követően a gél tisztítására került sor.
Az „oligonukleotidok” szakkifejezés vagy egy szimpla szálú polidezoxinukleotidot, vagy két komplementer polidezoxinukleotid szálat jelöl, melyeket vegyi úton szintetizáltak. Az ilyen szintetikus oligonukleotidoknak nincsen 5’ foszfátjuk és így nem is kapcsolódnak össze egymással addig, míg egy ATP-t nem adunk hozzá egy kináz jelenlétében. Egy szintetikus oligonukleotid kapcsolódni fog egy olyan fragmenshez, amelyik nincsen defoszforizálva.
A „ligáció’' azt a folyamatot jelöli, melynek során foszfodiészter kötések alakulnak ki két kettős szálú nukleinsav fragmens között. (Maniatis, T, et al., mint föntebb, p. 146). Ha másképpen nincs jelölve a kötés ismert pufferek segítségével és ismert körülmények között 10 egység T4 DNS ligáz („ligáz”) alkalmazásával vihető végbe 0,5 μg megközelítőleg equilmoláris mennyiségű DNS fragmensekként.
A „kitöltés” vagy „tompítás” azokat a folyamatokat jelöli, amelynek során az egyes szálú vég a restrikciós enzim által hasított nukleinsavban a kohéziós végnél konvertálódik kettős szálúvá. Ez kiküszöböli a kohéziós véget és egy tompa végződést alakít ki. Ez a folyamat rendkívül rugalmas eszköze a restrikciós hasítási vég konvertálásának és csak egy vagy néhány restrikciós enzim által létrehozott vég esetében lehet kohéziv egy bármiféle tompán vágó restrikció endonukleázzal vagy egyéb kitöltött kohéziójú véggel kompatibilis terminusban. Típusos esetben a tompítást a cél DNS 2-15 gg-jának inkubálásával lehet véghezvinni 10 mM MgCl2’ 1 mM ditiotreitol, 50 mM NaCl. 10 mM Tris (pH 7,5) puffer alkalmazásával és mintegy 37 °C-os hőmérsékleten 8 egység DNS polimeráz I Klenow fragmensének jelenlétében és mind a négy dezoxinukleozid trifoszfátból egyaránt 250 - 250 mM rendelkezésre bocsátása mellett. Az inkubáció általában 30 perces fenolos vagy kloroformos extrakció és alkoholos precipitáció végzése után fejeződik be.
]. Példa
Az emberi hasnyálmirigy dezoxiribonukleáz I klónozása cDNS könyvtár készítés
Az emberi hasnyálmirigy cDNS könyvtárat XgtlO segítségével lehet megszerkeszteni poliadenilált mRNS segítségével, amelyet frissen nyert és folyékony nitrogénnel lefagyasztott humán hasnyálmirigyből nyertek (Laufferet al., Natúré: 318: 334 [1985]). Oligo dT primerek és EcoRI-Sall-XhoI-SstlI adapterek alkalmazásával egy 0,9 x 106 független izolátumból álló, nagyobb, mint 600 bázispár méretű cDNS könyvtárat sikerült nyerni.
Oligonukleotid szondák (próbák)
A szarvasmarha dezoxiribonukleáz I aminosav sorrendjére alapozva két hosszú szondát szintetizáltak. Az aminosavszekvencia két alacsony redundanciát mutató szegmensét választották ki és emlős kodon felhasználási táblázatokat használtak.
1. szonda: 5’ GTG-CTG-GAC-ACC-TAC-CAGTAT-GAT-GAT-GGC-TGT-GAG-TOC-TGT-GGCAAT-GAC 3’ (az 51 mer megfelel a következő aminosav szekvenciának: Val-Leu-Asp-Thr-Tyr-Gln-TyrAsp-Asp-Gly-Cys-Glu-Ser-Cys-Gly-Asn-Asp).
2. szonda: 5’ TAT-GAC-GTC-TAC-CTG-GACGTG-CAG-CAG-AAG-TGG-CAT-CTG-AAT-GATGTG-ATG-CTG-ATG-GGC-GAC-TTC-AAC-GC 3’ (a 71 mer megfelel a következő aminosav szekvenciának: Tyr-Asp-Val-Tyr-Leu-Asp-Val-Gln-Gln-Lys-TrpHis-Leu-Asn-Asp-Val-Met-Leu-Met-Gly-Asp-PheAsn).
Az emberi dezoxiribonukleáz I cDNS klánok izolálása
A két szonda T4 polinukleotid kinázzal és [32P] adenozin trifoszfáttal (Maniatis et al., Molecular Cloning, [Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]) voltak jelezve és elkülönítetten lettek felhasználva az emberi hasnyálmirigy cDNS könyvtár szűrésére alacsony szigorúságú hibridizációs feltételek között: 20% formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M nátrium-citrát), 50 mM nátrium-foszfát (pH 6,8), 0,1 % nátrium-pirofoszfát, 5X Denhardt-oldat, szonikált lazac sperma DNS (50 gg/ml), 0,1 % SDS és 10 % dextrán-szulfát 42 °C-on. Az alacsony szigorúsági fokú kimosások 1 X SSC-ben és 0,1 % SDS-ben történtek 42 °C-on. A 600 000 klón közül három (1, 2 és 6) hibridizálódott mindkét szondával és tartalmazott 1,3 kB inzerteket. Ezek szubklónozásra kerültek az M13 vektorokba (Messing et al., Nucleic Acids Rés. 9: 309 [1981] és szekvenciájuk meghatározása a lánc-terminációs módszerrel történt (Sanger et al„ J. Mól. Bioi. 143: 161 [1980]).
A 6. klón levezetett aminosav szekvenciájának a szarvasmarha hasnyálmirigy dezoxiribonukleáz I-gyel
HU 211 232 A9 történt összehasonlítása kiterjedt mértékű homológja jelenlétére derített fény. Megjegyzendő mindazonáltal, hogy egy nagy méretű deléció és ugyancsak nagy méretű inzerció volt jelen a hatodik klón levezetett aminosav szekvenciájában. Ezen túlmenőleg az inzerció tartalmazott egy stop jelet a befejeződésénél és egy hibásan szeletelt üzenet következtében egy megtartott intron jellemzőit mutatta. Az 1. és 2. kiónok ugyancsak tartalmazták a feltételezett intront.
A 6. klón szekvenciájából két további pontos nukleotid szonda szintézisére került sor további kiónok nyerése céljából.
4. szonda: (N-terminális szonda): 5’ CTG-AAGATC-GCA-GCC-TTC-AAC-ATC-CAG-ACA-TTTGGG-GAG-ACC (42 mer)
5. szonda: (feltételezett intron szonda): 5’ TCCGCA-TGT-CCC-AGG-GCC-ACA-GGC-AGC-GTTTCC-TGG-TAG-GAC (42 mer)
A szondákat 32P-vel jelöltük és használtuk fel az emberi hasnyálmirigy cDNS könyvtárból 1,3 x 106 klón újraszűrésére magas fokú szigorúság feltételei mellett: 50% formamid, 5 x SSC (O.75M NaCl, 0.075M nátrium-citrát), 50mM nátrium-foszfát (pH 6,8), 0.1% nátrium-pirofoszfát, 5X Denhart-reagens, szonikált lazac sperma DNS (50 pg/ml) 0,1% SDS és 10% dextrán-szulfát 42 °C-on. Az átmosások 42 °C-on történtek 0,2X SSC-ben és 0,1% SDS-ben. Négy klón hibridizálódott a 4-es szondával (N-terminális szonda). Ezek közül a PAGE-vel megközelítőleg 1,1 kB inzertet tartalmazó 18-1 klón szubklónozásra került M 13-ba és szekvenciameghatározás következett. A 18-1 klón teljes nukleotid szekvenciája és a levezetett aminosav szekvencia az első ábrán látható.
A18-1 klón 1039 bázispárból áll és hosszú, nyitott olvasókerete van, anélkül, hogy tartalmazná a 6. kiónban talált intront. Ahogy azt megjegyeztük, két lehetséges iniciációs kodon (ATG) van jelen (160-162 és 169-171 pozíciók). Ezek bármelyike használható. Az előbbi ATG egy purinnal a -3 pozícióval szorosan követi a Kozák szabályt (Kozák. Cell 44: 283 [1986]). A feltételezett iniciációs kodonok és az N-terminális leucin CTG a 226 228 pozícióval olyan nukleotidok vannak, amelyek egy rövid viszonylag hidrofób aminosav szekvenciát kódolnak (19-22 aminosav hosszúsággal), amely valószínűleg szekréciós szignál szekvencia.
Az emberi dezoxiribonukleáz I és a szarvasmarha dezoxiribonukleáz I levezetett aminosav sorrendjének összehasonlítása kiterjedt mértékű aminosav homológja jelenlétére derített fényt (2. ábra.). Az emberi és a szarvasmarha fehérjék 260 aminosavnyi hosszúságúak és az N-terminálisukon leucint tartalmaznak. Megtartottak a szarvasmarha protein fő szerkezeti vonásai, amelyek közé tartozik 4 cisztein (101, 104, 173 és 209), a két potenciális N-kötött glikozilációs hely (18 és 106), és az aktív hisztidin hely (134). Egészében véve az aminosav azonoság megközelítőleg 77 százalékra tehető.
A legnagyobb aminosav eltérést mutató 6 régió (a
27-39. a 83-96. a 115-126, a 156-161. a 219-234, és a
243-247. aminosav maradékok) mindegyike 3-nál több eltérést tartalmaz, és az aminosavak több mint 54%-a variábilis. Érdekességképpen megállapítható, hogy ezek a régiók ugyancsak variábilisak, ha a szarvasmarha szekvenciát a birka vagy a sertés szekvenciával hasonlítjuk össze. Ezek közül a régiók közül néhány hurok szerkezetet mutatott a szarvasmarha dezoxiribonukleáz röntgen krisztallográfíás szerkezetének megfelelően (Oefner et al., J.Mol. Bioi. 192: 605 [1986] és így előre meg lehetett jósolni, hogy viszonylag immunogén lesz. így valószínű, hogy az emberi és a szarvasmarha szekvenciák közötti eltérések immunológiai reakciókhoz vezethetnek.
2. Példa
A dezoxiribonukleáz aktivitás kimutatására végzett esszék
A standard ELISA (lásd 4. példa) és RIA mellett három esszé kifejlesztésére került sor a dezoxiribonukleáz aktivitás detektálása céljából.
1. A 32P-vel jelzett DNS hidrolízise. A radioaktívan jelzett 32P-DNS elkészítésére Ml3 egyetlen szálú templál egy 17 mer szekvenáló primer, 32P-dCTP, nem radioaktív dATP, dTTP és dGPT illetve Klenow alkalmazásával került sor. Röviden ismertetve 1,5 λ MgC12 (35mM), 1,5 λ lOx restrikciós puffer (70mM TrisHCL, pH 7,6; 35 mM ditiotreitol; ImM EDTA), és 6 λ H2O volt összekeverve 1 λ templáttal (megközelítőleg pg) és 1,5 λ Palmer (0,5 μΜ) és melegítve 55 °C-on 7 percig. A nukleotid keverék preparálása a következőképpen történt: 40 λ 32P-dCTP (fajlagos aktivitás: 3000 Ci/mmol; 400 pCi) plusz mindegyikhez 1 λ 2mM nem-radioaktív dATP, dTTP és dGTP törzsoldat a szárításhoz majd a nukleotidok rekonstituálása következett 7 λ IX restrikciós pufferban. A templát-primer elegyhez nukleotid keverék és 1 λ Klenow hozzáadása után a reakciót 37 °C-on inkubálták. 15 perc elteltével λ nem-radioaktív dezoxinukleotidot adtak hozzá és az inkubáció további 15 percen keresztül folytatódott. Ezt követően a radioaktívan jelzett DNS-t elválasztották a szabad nukleotidoktól Sephadex G-50-en keresztül áthaladva centrifugálás segítségével (Maniatis et al. [1982]).
A dezoxiribonukleáz aktivitást a minták 100 000 cpm 32P-DNS plusz 80 pg/ml nem-radioaktív lazac spermium DNS 45 percen át történő 37 °C melletti inkubálásával mérték dezoxiribonukleáz pufferban (lOmM Tris-HCL, pH 7, 4mM MgCl2,4mM CaCl2). A reakciót fél térfogat rész nem-radioaktív DNS (2 mg/ml) és 1 térfogatrész jéghideg 20%-os triklórecetsav hozzáadásával fejezték be. 10 perc után 4 °C-on a keveréket 10 percen keresztül 12 000 g-n centrifugálták és a felül úszóból levett mintán mérték a beütésszámot. A felülúszó savban oldható radioaktivitással rendelkező részének jelenléte tükrözi a dezoxiribonukleáz aktivitást. Minden nap 0,1-tői 200 ng szarvasmarha dezoxiribonukleáz I (Sigma D-5025) tesztelésével standard görbét generáltak.
2. Agarlemezes dezoxiribonukleáz esszé. Smith, Hancock és Rhoden (Applied Microbiology, 18:991 [1969]) leírtak egy metilzöldet és DNS-t tartalmazó
HU 211 232 A9 teszt agart a mikroorganizmusok dezoxiribonukleáz aktivitásának meghatározására. Egy gyors, az oldható dezoxiribonukleáz aktivitás mérésére szolgáló szemikvantitatív esszé kifejlesztése érdekében módosították ezt az esszét, hogy szűrhessék a sejt felülúszőkat, az expresszió figyelemmel kísérése végett és hogy szűrhessék az oszlopfrakciókat a tisztítás figyelemmel kísérése végett. Az agar preparálásához bacto-agart (7,5 g) elegyítették 500 ml pufferban (25mM Tris pH 7,5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2,0,1% nátrium-azid). Ezután lazac spermából származó DNS-t (1,0 g) és metilzöldet (17,5 mg) tettek hozzá. Egy-két órán keresztül tartó kavarás után 55 °C-on és autoklávozást követően a lemezeket leöntötték és 4 °C-on tárolták. A dezoxiribonukleáz aktivitást 0,5-5 λ aliquot lemezekre kipöttyözésével mérték, amelyeket ezután szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on inkubálták 4-48 óra hosszat. Szarvasmarha dezoxiribonukleáz I 0,1-tői 1000 mg-ig terjedő mintái segítségével standard görbét állítottak elő. A dezoxiribonukleáz könnyen meghatározható az agaron található tiszta zónák méretének alapján, mivel logaritmikus viszony áll fenn a dezoxiribonukleáz koncentráció és a tiszta zónák átmérője között. Ez az esszé formátum ugyancsak alkalmazható a magas fokon exprimálódó dezoxiribonukleázt termelő kiónok gyors azonosítására akár a dezoxiribonukleáz termelés tekintetében. akár a transzformánsok szűrése tekintetében, amelyben a dezoxiribonukleáz mint kiválasztható marker vagy mint riporter gén használatos.
A metilzöld és a DNS agarlemez formátumú való használatán túlmenőleg ezek a reagensek használhatók vizes formátumban (pl. 96-mélyedéses lemezekben) a dezoxiribonukleáz gyors, szenzitív és specifikus mennyiségi meghatározására.
3. SDS-poliakrilamid gél elektroforézis és ximográfia. Az SDS-poliakrilamid gél elektroforézist és ximográfiát Rosenthal és Lacks módszerek módosításával (Anal. Biochem. 80: 76 [1977]) végezték. Röviden ismertetve, a Laemmli-féle puffer rendszert használtak a 12%-os poliakrilamid gélek preparálására. A polimerizációt megelőzőleg lazacsperma DNS-t (10 gg/ml) és EDTA-t (2 mM) adtak mind a halmozódó, mind a rezolváló gélhez. A proteineket egy mintapufferban szuszpendálták és a gélekre való kihelyezés előtt 100 °C-on melegítették 3 percen keresztül. Az elektroforézist szobahőmérsékleten végezték állandó áramerősség mellett. Az elektroforézist követően a gélt átöblítették vízzel és 250 ml 40mM TrisC1H pH 7,5, 2mM MgCl2 0,02% azid formátumban inkubálták. Egy óra elteltével friss puffért adtak hozzá és a gélt 12 órán keresztül áztatták 24 °C-on. A dezoxiribonukleáz aktivitás meghatározására a gélt 2mM CaCl2-t tartalmazó friss pufferbe rakták és 1 pg/ml homidium-bromidba és azután 5 perctől 24 óráig terjedő intervallumokban rövid hullámhosszú ultraibolya fény alatt vizsgálták. A reakció megállítása céljából EDTA-t adtak hozzá (a végső koncentráció: 15 mM) és a ximogramot lefényképezték. A gélt ezután a fehérjék kimutatására Coomassie kékkel festették meg.
3. Példa
A humán dezoxiribonukleáz 1 expressziója
1. pRK.DNase.7
A fentebbiekben ismertetett, 18-1 klónból konstruált plazmid pRK.DNase.7 előállítása a következő módon történt:
A pRK5 plazmidot EcoRI-vel emésztették, defoszforilálták és a plazmid zömét tartalmazó 1. fragmentumot izolálták. A pRK5 leírása megtalálható a következő közleményben: Suva et al., Science, 237:896 (1987); és EP Publ. 307 247, publikálva 1989. március 15-én, ahol a pCIS2.8c28D kezdő plazmid leírása az 1988. aug. 17-én publikált EP278 776-ban található. A 18-1 λ dezoxiribonukleáz kiónt EcoRI-val emésztették, majd izolálták az inzertet (2. fragmentum). Az 1. fragmentumot és a 2. fragmentumot ligálták, és a ligációs keveréket az E. coli 294-es törzsbe transzformálták. A transzformált tenyészetet ampicillines közeget tartalmazó lemezekre vitték, és szelektálták a rezisztens telepeket. A plazmid DNS-t leválasztották a transzformánsokról és restrikciós analízissel ellenőrizték a helyes fragmentum jelenlétét.
A pRK.DNase.7-t humán embrionális vese-293 sejtekbe transzfektálták átmeneti és stabil expresszió céljából. A humán dezoxiribonukleáz I tranziens expressziója céljából 60 mm-es lemezeken konfluens HEK-293 sejteket (50%) transzfektálták a korábban leírtaknak megfelelően (Eaton et al., 1986) a kalciumfoszfát módszerrel (Wigler et al., 1979). A humán dezoxiribonukleáz I stabil expressziója céljából a HEK293 sejteket hasonlóképpen transzfektálták egyidejűleg a pRK.DNase.7 plazmiddal és egy, a pRSV neo elnevezésű neomicin rezisztencia gént expresszáló plazmiddal (Gorman et al., 1985). Két nappal a transzfekciót követően a sejteket standard táptalajra (1:1 F12/DME L-glutaminnal, penicillin-streptomicinnel és 10% FBSsel kiegészítve) passzálták 0,5 mg/ml G418 (Genticin szulfát; Gibco) a stabil sejtvonalak szelekciója érdekében.
A vagy átmenetileg, vagy stabilan a dezoxiribonukleáz plazmiddal transzfektált 293 sejtek felülúszóin végrehajtott analízis 0,2-1 pg/ml dezoxiribonukleáz aktivitásra derített fényt, ahogyan azt akár 32P-DNS hidrolízis esszével akár a zöld agarlemez dezoxiribonukleáz esszével mérték. A transzfektált sejtek felülúszóinak SDS-PAGE és ximográfia segítségével végzett analízise során egy új fehérje sávot észleltek megközelítőleg 35-37 kD-nál, amely dezoxiribonukleáz aktivitással rendelkezett. A további vizsgálatok kimutatták, hogy a 293-as sejtekben termelődött rekombináns emberi dezoxiribonukleáz I aktivitásához kalciumot igényelt, az EDTA-val hővel és aktinnal gátolható volt és a kettős szálú DNS irányába nagyobb aktivitást mutatott, mint az egyes szálú DNS irányában. A 293-as sejtekben expresszióra került emberi dezoxiribonukleáz specifikus aktivitása összehasonlíthatónak látszott a szarvasmarha dezoxiribonukleázéval.
2. PSVeDNaseDHFR3
A pSVeDNaseDHFR3 jelzésű, az emberi dezoxiribonukleáz 1 rekombináns szintézisére alkalmas plaz15
HU 211 232 A9 mid konstrukciója a következő módon történt CHOsejtekben:
Egy redundáns polilinker régió eltávolítása érdekében egy intermedier plazmid konstrukciójára került sor. A plazmid pRK.DNase7-et EcoRI és Sphl segítségével emésztették és a dezoxiribonukleáz kódoló régió 5' szakaszát tartalmazó legnagyobb fragmenst (3 fragmens) izolálták. A plazmid pRK.DNase.7-et emésztették Sall-el, Klenow-val tompították és SphI-el emésztették és a dezoxiribonukleázt kódoló régió 3’ szakaszát tartalmazó közepes méretű fragmenst (4 fragmens) izolálták. A pRK5-öt Smal és EcoRI segítségével hasították és a plazmid zömét tartalmazó fragmenst (5 fragmens) izolálták. A 3, 4 és 5 fragmenseket ligálták és a keveréket az E. coli 294 törzsbe transzformálták. A transzformált tenyészetet ampicillint és táptalajt tartalmazó lemezre vitték és kiválogatták a rezisztens telepeket. A plazmid DNS-t elválasztották a transzformánsoktól és restrikciós analízissel ellenőrizték a helyes fragmens jelenlétét. Az így kapott plazmidra pRKDNaselnt megjelöléssel hivatkoznak.
A pE342HBV.E400D22 plazmidot (Crowley et al. „Mól. Cell Bioi.” 3:44 [1983]) EcoRI-vel és Pvul-el emésztették és az SV40 korai promoter, valamint a β-laktamáz promoter gén egy részét tartalmazó legkisebb fragmenst (5 fragmens) izolálták. A pE342HBV.E400D22 plazmidot BamHI-vei és Pvul-es is emésztették és a β-laktamáz maradékát, valamint az SV40 korai pormoter és a DHFR gént tartalmazó plazmid zöméből álló fragmensét (6 fragmens) izolálták. A pRKDNaselnt plazmidot EcoRI-vel és BamHI-vel emésztették és izolálták a dezoxiribonukleázt kódoló fragmenst (7 fragmens). Az 5, 6, és 7 fragmenseket ligálták és keveréküket E. coli 294 törzsbe transzformálták. A transzformált sejttenyészetet ampicillint és táptalajt tartalmazó lemezre vitték és kiválogatták a rezisztens telepeket. A plazmid DNS-t elválasztották a transzformánsoktól és restrikciós analízissel ellenőrizték a helyes fragmens jelenlétét. Az így kapott plazmidra pSVeDNaseDHFR3 megjelöléssel hivatkoznak.
A humán dezoxiribonukleáz I stabil expressziója céljából a fenti plazmidot alkalmazva konfluáló CHO sejtek (DP-7) 60 mm-es lemezeit transzfektálták a kalcium foszfát módszerrel és kezdetben szelektív táptalajon tenyésztették. Nem-amplifikált sejtvonalak tenyésztek ki ilyen módon, melyek táptalaja megközelítőleg 0,02-0,1 pg/ml dezoxiribonukleáz aktivitást tartalmaz, akár ’2PDNS hidrolízis esszével, akár a zöld agar lemez dezoxiribonukleáz esszé segítségével meghatározva. Az várható, hogy magasabb szintű (legalább ötszörös) expresszió lenne elérhető, ha ezek a sejtek nagy sűrűségben tenyésznének egy fermentorban. Az egyes kiónokat szelektálni lehetne a dezoxiribonukleáz expressziós szintjük alapján a legmagasabb fokon szekretáló sejtek kiemelése céljából, majd ezt követően minden kiválogatott kiónt amplifikálni lehetne növekvő koncentrációjú MTX segítségéve] (12,5-től 2000nM-ig).
3. pDNSll
Egy olyan plazmid konstrukciójára került sor, amely alkalmas rekombináns dezoxiribonukleáz szintézisre E. coli baktériumokban. A plazmid elnevezése pDNSl 1 és konstrukciója a következőképpen történt:
A pTF.III (EP Publ. No. 278 776) plazmidot Nsil és Sáli segítségével emésztették és a plazmid zöméből álló legnagyobb fragmenst (8 fragmens) izolálták. A pRKDNase7 plazmidot BstXI-vel és Sall-el emésztették, és a kódoló régió legnagyobb részét tartalmazó 798 bp fragmenst (9 fragmens) izolálták. Két szintetikus oligonukleotidot szintetizáltak:
DLink 1: 5’TTG-AAG-ATC-GCA-GCC-TTCAAC-ATC-CAG-ACA-T (31 mer)
DLink 3: 5’CTG-GAT-GTT-GAA-GGV-TGCGAT-CTT-CAA-TGC-A (31 mer)
A 8. és 9. fragmenseket és a DLink 1 és DLink 3 szintetikus oligonukleotidokat ligálták és a keveréket E. coli 294 törzsbe transzformálták. A transzformált sejttenyészetet ampicillint és táptalajt tartalmazó lemezre vitték és kiválogatták a rezisztens telepeket. A plazmid DNS-t elválasztották a transzformánsoktól és restrikciós analízissel ellenőrizték a helyes fragmens jelenlétét és az Nsil és BstXI restrikciós hely megőrzését. A helyes szintetikus DNS inkorporációjának megerősítése céljából számos plazmid nukleinsav sorrendjének meghatározására került sor. A pDNSll-lel transzformált 294 sejtek a két új fő fehérjét >500 mg/1 koncentrációban termelték, ahogyan azt SDS-PAGE segítségével meg lehetett megállapítani - egy nagyobb sáv megközelítőleg 32 kD-nál és egy kisebb sáv megközelítőleg 30 kD-nál. A két sáv aminosav sorrendjének analízise során a következő N-terminális szekveniák jelenlétére derült fény: Met-Lys-Lys-Asn-Ile-Ala és Leu-Lys-Ile-Ala-Ala-Phe. így a nagyobb relatív molekulatömegű sáv képviseli a feldolgozatlan humán dezoxiribonukleázt és az alacsonyabb relatív molekulatömegű sáv képviseli a megfelelőképpen feldolgozott natív emberi dezoxiribonukleázt.
Az E. coli-ban termelődött emberi dezoxiribonukleáz aktív, a pDNSl 1-lel transzformált és kalciummal, magnéziummal és kevés foszfáttal kiegészített agar lemezeken tenyésztett 294 sejtekről kiderült, hogy aktív dezoxiribonukleázt választanak ki, ahogyan azt a transzformált sejteket körülvevő tiszta zóna jelenléte bizonyította, míg a kontroll sejtek esetében ez nem állt fenn. Továbbá a transzformált sejteket SDS segítségével oldatba vitték, béta-merkaptoetanollal futtatták SDS-PAGE gélen, majd ximográfiát hajtottak végre. A dezoxiribonukleáz aktivitás a megfelelőképpen feldolgozott humán dezoxiribonukleáz sávjához kötődik, ellenben a feldolgozatlan emberi dezoxiribonukleáz sávjához nem.
4. pDNS2
Egy plazmid konstrukciójára került sor a humán dezoxiribonukleáz I E. coli intracelluláris proteinjeként való rekombináns expressziója céljából. Aplazmid elnevezése: pDNS2, és konstrukciója a következőképpen történt.
A pHGH2O7/3O7 plazmid pHGH207-ből készült (U.S. Patent 4 663 283) a trp promotertől felfele található EcoRI hely eltávolításával (emésztve, tompítva és újra ligáivá az EcoRI-t).
A pHGH207/307 plazmidot Xbal és Sáli segítségével emésztették és a plazmid zömét tartalmazó legna16
HU 211 232 A9 gyobb fragmenst (10 fragmens) izolálták. A pRK.DNase.7 plazmidot Sáli és BstXI segítségéve, emésztették és a kódoló régió legnagyobb részét tartalmazó 798 bp fragmenst (9 fragmens) izolálták. Ilyen módon két szintetikus oligonukleotid előállítására került sor:
DLink 4: 5’CTAGAATTATG-TTA-AAA-ATTGCA-GCA-TTT-AAT-ATT-CAA-ACA-T (42 mer)
DLink 5: 5’TTG-AAT-ATT-AAA-TGC-TGC-AATTTT-TAACATAATT (34 mer)
A 9. és 10. fragmentumokat és a DLink 4 és DLink 5 szintetikus oligonukleotidokat ligálták és a keveréket az E. coli 294 törzsbe transzformálták. A transzformált sejttenyészetet ampicillint és táptalajt tartalmazó lemezre vitték és kiválogatták a rezisztens telepeket. A plazmid DNS-t elválasztották a transzformánsoktól és restrikciós analízissel ellenőrizték a helyes fragmens jelenlétét és az Xbal és BstXI restrikciós hely megőrzését. A helyes szintetikus DNS inkorporációjának megerősítése céljából számos plazmid nukleinsav sorrendjének megatározására került sor.
A pDNS2-vel transzformált 294 sejtek egy új nagyobb proteint állítottak elő, ahogyan az SDS-PAGE segítségével kimutatható volt megközelítőleg 30 kDnál. A fehérje aminosav sorrendjének analízise során a következő N-terminális szekvencia megatározására került sor: Met-Leu-Lys-Ile-Ala-Ala-Phe, amely megfelel az emberi Met-dezoxiribonukleáznak.
Az emberi Met-dezoxiribonukleáz, amely közvetlenül E. Coli-ban termelődött, ugyancsak aktívnak bizonyult. A transzformált sejteket SDS-sel és béta-merkaptoelanollal oldatba vitték, és SDS-PAGE gélen futtatták. majd ximográfiát hajtottak végre. A dezoxiribonukleáz aktivitás kapcsolatban állt az emberi Met-dezoxiribonukleáz sávjával.
4. Példa
A dezoxiribonukleáz expresszió további analízise a. Dezoxiribonukleáz expressziós vektorok A fentebb leírt pRK-DNase.7 plazmidból származó
Xgt 10 emberi hasnyálmirigy dezoxiribonukleáz I cDNS, mely tartalmazza a pRK5 vektorban a XgtlO humán hasnyálmirigy cDNS könyvtárból izolált 18-1 cDNS klón dezoxiribonukleázból származó teljes inzertet, átvitelre került a pRK5-be, hogy létrehozza a pRK.DNase.3 expressziós vektort. Ebben a plazmidban (pRKD.Nase.3) a dezoxiribonukleáz szintézist a CMV transzkripciós regulátoros elemek irányítják. A transzkripciós és transzlációs iniciációs helyek között a fentebb ismertetett módon egy splice-egység helyezkedik el. A dezoxiribonukleáz expressziós vektorok előállítása céljából a CMV transzkripciós regulátoros szekvenciákat és a pRK.DNase.3 spliceegységét SV40 transzkripciós, regulátoros szekvenciával helyettesítették, valamint különféle splice-donor-intronsplice-akceptor egységekkel, mint az alább le van írva. Összehasonlítási célokra ugyancsak létrehoztak egy megfelelő vektort, melyből a splice-egység hiányzik (pSve.DNSse).
/. pRK.DNase.3
A pRK.DNase.3. vektor (3. ábra) konstrukciója a következőképpen történt: a pRK5-öt az 5’ és 3’ kontroll szekvenciák között elhelyezkedő polilinker régióban kizárólagosan hasító Smal és Sáli segítségével emésztették, majd izolálták a nagy fragmenst. A pRK5 vektor a kódoló régiótól felfelé és a promotertől lefelé egy splicedonor-intron-splice-akceptor régiót tartalmaz, ahol az intron régió egy citomegalovfirus (CMV) közvetlen korai splice-donor és intron szekvenciáiból, egy SP6 bakteriofág promoter inzertből és immunglobulin (lg) nehéz lánc variábilis régió (VH) intron és splice-akceptor szekvenciákból áll. ApRK.DNase.7 vektort BsmI-vel hasították, a túlnyúló 3’ végeket T4 DNS polimeráz segítségével visszavágták és az anyagot SlI-el újra emésztették, hogy 921-nt fragmens formájában felszabaduljon a teljes humán dezoxiribonukleáz I-et kódoló szekvencia. Gél izolációt követően standard ligációs metodikákat alkalmazva ezt a fragmenst a pRK5 nagy ltagmenséhez ligálták (Maniatis et al., 1982, lást fentebb), hogy megkapják a pRK.DNase.3 vektort.
A pRK.DNase.3 a transzkripciós és az iniciációs helyek között egy CMV transzkripciós szabályozó elemeket tartalmaz, és egy splice-egységet tartalmaz („Intron” a 3. ábrán). Ezen vektor esetében a pRK5 vektor spliceegysége minden módosítás nélkül van jelen.
2. pSVe.DNase
A pSVe.DNase vektor konstrukciója a következő módon történt (3. ábra): A pRK.DNase.3 vektorban található dezoxiribonukleáz kódoló régiót megelőző regulátor szekvenciákat SstI és Clal segítségével elkülönítették a vektor többi részétől; a dam+ bakteriális gazdasejtekből preparált DNS-t alkalmaztak a vektor SV40 korai poliadenilációs régiójának 3’ vége felé elhelyezkedő második Clal helyen történő hasítás megelőzésére. Az 5’ kontroll régiót nem tartalmazó legnagyobb fragmentumot gél-izolálták.
Az SV40 transzkripciós regulátoros szekvenciák forrásaként a pE348DHFRUC jelzésű DHFR expressziós vektor szolgált. A pE348DHFRUC vektor (Vannice and Levinson, J. Virology, 62: 1305-1313,1988, amelyet pEnek jelölnek, 1. ábra) a Hindin helytől felfelé tartalmazza az SV40 enhancer és korai promoter régiót, beleértve az SV40 korai transzkripciós iniciációs helyét (5171-es pozíció a vírusban), amely megelőzi a murin dihidrofolsav reduktázt (DHFR) kódoló cDNS-t és amelyet a (HBV) hepatitis B vírus GamHI-től BG1II helyéig terjedő részéből származó pMLI plazmidban levő 584 bp hosszúságú HBV poliA szignál követ. Ez a plazmid tartalmaz egy poli linkért, közvetlenül az SV40 szekvenciáktól felfelé. Az SV40 transzkripciós szekvenciákat SstI és Clal segítségével történt emésztéssel szabadították fel és a keletkező 5’ túlnyúló végeket Klenow poli segítségével töltötték ki mind a négy dezoxiribonukleotid (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, TTP) jelenlétében. Az ezt követő Xbal emésztés nyomán a kisebbik Xbal-Clal fragmensen (360 nukleotid) jelen levő SV40 transzkripciós, regulátor szekvenciák (enhancer és korai promoter, beleértve az SV40 korai transzkripciós, iniciációs helyeit is) gél-izolációja megtörtént.
A közvetlenül fentebb leírt, a pE34DHFRUC-ból származó kisebb fragmens gél-izolálás után a pSVe.DNase vektor létrehozása céljából ligációra került a nagy
HU 211 232 A9 pRK.DNase.3 fragmenshez. Ebben a vektorban a dezoxiribonukleáz szintézist az SV40 transzkripciós kontroll szekvenciák irányították, de ezek és a dezoxiribonukleázt kódoló régiók között splice-egység nincsen jelen.
3. pSVl.DNase
A pSVl.DNase vektort (4. ábra) a dezoxiribonukleázt kódoló szekvencia pRK5.SVe intermedier plazmidba történt inzertálása után preparálták. Az intermediert a Spel és SacII restrikciós helyek között elhelyezkedő pRK5 CMV transzkripciós regulációs elemeknek az SV40 korai promotert és enhancert tartalmazó, a pE348DHFRUC-ból származó kis Xbal-HindlII fragmenssel történő helyettesítésével hozták létre. A pRK5 SacII emésztése által létrehozott 3’ túlnyúló végeket T4 DNS polimeráz segítségével vágták vissza, és a pE348DHFRUC Hindin emésztése következében túlnyúló 5’ végeket T4 polimeráz segítségével töltötték ki mind a négy dNTP jelenlétében.
A pSVl.DNase konstrukciójához EcoRI és HindlII hasítással izolálták a pRK.DNase.3 vektorból a dezoxiribonukleázt kódoló szekvenciái, és inzertálták azt az ugyanazon két enzimmel végzett emésztés segítségével izolált pRK5.Sve nagyméretű fragmensébe. A pSVl.DNase vektor tartalmazza az SV40 transzkripciós regulátor elemeket (enhancer és korai promoter, beleértve az SV40 korai transzkripciós iniciációs helyeit is) és a mRNS cap helyeket, melyeket a pRK5 vektor splice-donor-intron-splice-akceptor egysége minden fajta módosítás nélkül, valamint a dezoxiribonukleázt kódoló cDNS, az SV40 korai poliadenilációs („poli A”) régiója, illetve az SV40 replikációs origó („őri”) régiók követnek.
A pSVl.DNase komplett nukleotid szekvenciája a dezoxiribonukleáz kódoló régiójáig, de azt nem tartalmazva. a 6. ábrán található.
4. pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSV15.DNase, és pSVIÓB.DNase
A pSVI2.DNase. pSVI3.DNase. pSVI5.DNase, és pSVIÓB.DNase konstrukciója (5. ábra) minden esetben két fragmentum rekombinációjával történt. Az első a pRK.DNase.3 nagy fragmense volt. amely az EcoRI emésztés dNTP-k jelenlétében történt T4 DNS polimeráz kezelés és az azt követő SstI hasítás következtében jött létre; a második pedig minden esetben az SV40 5’ regulátoros szekvenciákat és a módosított splice-egységet tartalmazó kis fragmentum volt.
Az emlős sejtekben történő rekombináns expresszió elősegítésére szolgáló splice egységek modifikációja a szakmában jól ismeretes. All. ábra bemutatja az ebben a példában szereplő vektorok preparálása során érintett splice egységeket, azaz az SVI-et, SVI2-t, SVI3-at, SVI5-öt és SVI6B-t. A keretek az SVI szekvenciától való eltéréseket képviselik, a kettős aláhúzás egy hamis ATG kodont, az aláhúzás a hamis splice helyeket és a hozzáadott vagy megváltoztatott elágazó szekvencia (BPS), a szünetek az SVI3-SVI5 nukleotidok delécióit jelentik a szekvenciákban, „...jelölések a nem mutatott szekvenciát jelölik, és a Λ-k az 5’ és 3’ hasítási helyeket a spliceegység, splice-donor, illetve splice-akceptor részén. Ezeket a szekvenciákat a fehérjeszintézisre szolgáló módszerekkel el lehet készíteni, vagy pedig a pSVI szekvencia standard modifikációival.
A 7-10. ábrák mutatják a pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase és a pSVIÓB.DNase komplett nukleotid szekvenciáit, egészen a dezoxiribonukleázt kódoló régióig, de azt nem tartalmazva. All. ábra splice-egység szekvenciái be vannak építve a 710-ig terjedő ábrákba.
b. Tranziens dezoxiribonukleináz expresszió
A különféle dezoxiribonukleináz vektorok által irányított tranziens expresszió analízisére a CHO dhfr sejtekbe történt transzfekciót követően került sor. A sejtek transzfekciója a DEAE-dextrán eljárás módosított változatával történt és a táptalajban felhalmozódott dezoxiribonukleáz koncentrációit mintegy 36-48 órával a transzfekció után határozták meg. Bemélyedésenként hatbemélyedéses 35 mm-es tenyészetnövelő edényben kb. 4 x 105 sejt előkészítésére került sor. A rákövetkező napon 2 pg térfogatú dezoxiribonukleáz expressziós vektort 15 μΙ-re egészítettek ki TBS (137 mM NaCl, 5 mM KC1, 1,4 mM Na2PO4, 24,7 mM TrisHCl, 1,35 mM CaCl2, 1,05 mM MgCl2, pH 7,5) hozzáadásával. Ezután 30 μΐ DEAEdextránt (10/mg/ml) és 2 ml térfogatú 100 μΜ kloroquint tartalmazó szérummentes táptalajt adtak hozzá a rendszerhez.
Ezt követően a sejtmédiumokat eltávolították és a sejteket egyszer átöblítették PBS-sel (fiziológiás sóoldat foszfáttal pufferelve, pH 7,5), majd hozzáadták a DNS keveréket. Ezt mintegy két-három órával később glicerinsokk követte, majd az esszé időpontjáig a sejteket 2 ml szabályos táptalajjal fedték. A dezoxiribonukleáz vektorok 2 pg pRSV.hGH kontroll plazmiddal kotranszfekcióra kerültek. Ez utóbbi a Rous szarkóma vírus hosszú terminális ismétlődő szakaszában (LTR; long terminál repeat) található transzkripciós regulátor szekvenciák által ellenőrzött emberi növekedési hormon (hGH) génjének expresszióját irányítja. A plazmid úgy preparálható, hogy a ras promotert helyettesíteni kell a rasP.hGH promoterrel, mely eljárásnak a leírása a következő közleményben található: Cohen and Levinson, Natúré, 334: 119-124 (1988). A szintetizált hGH mennyisége mindegyik esetben standardként szolgált, hogy még pontosabban lehessen összehasonlítani a különféle transzfekciós eljárásokkal nyert dezoxiribonukleáz koncentárciókat. Az alábbiakban egy duplikátumokkal végzett tipikus kísérletben tapasztalt dezoxiribonukleáz és hGH koncentráció értékek bemutatására kerül sor.
(javított)
Vektor ng/ml DNase ng/ml HGH ng/ml DNase
1. futás 2.futás 1. futás 2. futás 1. futás 2. futás
i pSVe.DNase 19,7 17,4 50,1 42.0 8,6 9,2
pSVl.DNase 17,9 13,8 29,7 20.4 12,8 14,7
HU 211 232 A9
Vektor ng/ml DNase ng/ml HGH ng/ml DNase
1. futás 2.fii tás 1. futás 2. futás 1. futás 2. futás
pSV12.DNase 34,2 30,5 41,9 40,3 18,0 17,0
pSVI3.DNase 37,8 28,7 45,2 40,5 18,0 15,1
pSVI5.DNase 28,4 22,1 37,2 28,7 16,7 17,0
pSVIóB.DNase 28,5 37,8 61,3 67,5 10,2 12,2
A táptalajban található dezoxiribonukleáz koncentrációk meghatározását standard ELISA módszerrel vé- 10 gezték, melynek során emberi dezoxiribonukleázzal vagy szarvasmarha dezoxiribonukleázzal beoltott nyulakból származó szérumot alkalmaztak (Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen, Chapter 5., „Production of antibodies”, pp. 43-78 [Elsevier, 15 Amsterdam, 1985]). A hGH koncentrációkat a kereskedelmi forgalomban is hozzáférhető esszékészlet (IRMA; immunradiometriás esszé) segítségével hajtották végre, amelyet a Hybritech Inc., La Jolla, CA, U.S.A. állított elő.
Az utolsó oszlopban szereplő adatok arra engednek következtetni, hogy a pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, valamint pSVI5.DNase által irányított dezoxiribonukleáz expresszió valamivel felülmúlja azt, amit ezek szülő vektora, a pSVI.DNase esetében lehetett megfi- 25 gyelni. Az első oszlop számadatai ennél jelentősebb mértékű eltéréseket mutatnak és ebben az esetben a fentebbi megállapítások vonatkoznak a pSVIóB.DNase által végzett gén expresszióra is. Jóllehet úgy tűnhet, hogy a harmadik oszlop biztosítja a hihetőbb adathal- 30 mázt, nem biztos, hogy a hatékony hGH szintézis nem befolyásolja-e kedvezőtlen irányban a dezoxiribonukleáz szintézist. Például anélkül hogy bármelyik elmélet számára korlátozást vezetnénk be, az ezen a szinten történő expresszió valószínűleg versenyhelyzetet hoz 35 létre a szekréciós reakcióút egyes összetevői között, és ennek eredményeképpen amikor a hGH expressziója magas fokú, csökkent dezoxiribonukleáz-szint jöhet létre. Egyéb kopetitív jellegű hatások ugyancsak torzíthatják az eredményeket, úgyhogy ennek értelmében az 40 első oszlop adatai ugyancsak jól képviselhetik a különféle dezoxiribonukleáz vektorok expressziós képessége között ténylegesen fennálló különbségeket. Bármi legyen is a helyzet, az teljesen egyértelműnek tűnik, hogy legalábbis a módosított splice-egységet tartalma- 45 zó vektorok egynémelyike magasabb szinteken állít elő dezoxiribonukleázt egy tranziens esszében, mint az eredeti splice-egységet tartalmazó egyébként neki megfelelő vektor.
c. Stabil dezoxiribonukleáz expresszió gg pSVe.DNase, pSVI.DNase, pSVI2.DNase, pSVI3.DNase, pSVI5.DNase, pSVIóB.DNase, plazmidot CHO-dhfr sejtekbe történő transzfekciónak vetettek alá egy 60 mm-es edényben 0,1 gg pFDl 1-gyel. Két nap elteltével a sejteket 90%-os és 10%-os arányban lehasí- 55 tották 10 cm-es edényekbe. Amennyiben telepek jelentek meg. azokat leszámolták és kevert kolóniaként esszét végeztek rajtuk. A sejtenkénti esszéket duplikátumokkal (a lentebbi táblázatban A-val és B-vel jelölve) végezték a pSVI2.DNase kivételével, amelyet csak egyszer mértek. 60
Ebben az esszében a sejtvonal beállítása a következő volt: 2 x 105 sejt/mélyedés-6 mélyedéses edény 3 ml-ben. Három nappal később leszámlálták a sejteket és a táptalajt a föntebb ismertetett dezoxiribonukleáz ELISA segítségével esszének vetették alá a 0,2-től 25 ng/ml-ig terjedő tartományban. A kapott eredmények összefoglalása az itt következő táblázatban található meg:
Vektor dezoxiribonukleáz pg/sejt/nap
A B
pSVe.DNase 0,057 0,040
pSVI.DNase 0,079 0,016
pSV12.DNase 0,067
pSVI3.DNase 0,048 0,043
pSVI5.DNase 0,014 0,005
pSVIóB.DNase 0,039 0,062
5. Példa
A purulens köpet viszkozitásának csökkentése rekombináns emberi dezoxiribonukleázzal A rekombináns humán dezoxiribonukleáz I és a tiszta szarvasmarha dezoxiribonukleáz I (Worthington) egy cisztikus fibrózisban szenvedő beteg köpetére kifejtett hatásait egy egyszerű önthetőségi esszé segítségével tanulmányozták. Röviden ismertetve, a mintákat megközelítőleg 100 gl köpette! együtt Eppendorf kémcsövekben inkubálták. Különböző időtartamok elteltével 37 °C-on a csöveket felfordították és a cső abbeli képességét, hogy mennyire képes a cső falán végigömleni egy O-tól (semmi mozgás) +5-ig (szabad végigömlés a kémcső oldalán) terjedő skálán értékelték. Míg a humán dezoxiribonukleáz I-gyel transzferált 293 sejtekről származó felülúszó 30 perces inkubálás után mintegy 4-5+ változást idézett elő, addig a transzfekción át nem esett sejtek felülúszói esetében semmilyen hatást nem lehetett megfigyelni ezen téren. A hatás specificitását olyan módon erősítették meg, hogy kimutatták, miszerint az EDTA - amely gátolja az emberi és a szarvasmarha dezoxiribonukleázt - hozzáadása a rendszerhez teljesen meg tudta akadályozni, hogy a 50 humán dezoxiribonukleáz I transzfekción átesett 293 sejtekről származó felülúszó elfolyósítsa a cisztikus fibrózisos váladékot. Ezen túlmenőleg ez a vizsgálat volt az első olyan, amelynek során tiszta és proteázoktól mentes szarvasmarha dezoxiribonukleáz sputumra kifejtett hatásait tanulmányozták. A megelőzőleg nyilvánossára hozott beszámolók mindegyike során olyan szarvasmarha dezoxiribonukleázt alkalmaztak, amelyről elimerték, hogy lényeges mennyiségekben tartalmazott tripszint és kimotripszint, ezek viszont bizonyítottan olyan fehérje féleségek, amelyeknek önma19
HU 211 232 A9 gukban is van hatása a sputumra. A proteáz enzimektől mentes, tiszta szarvasmarha dezoxiribonukleáz 1 gyors ütemben elfolyósította a gennyes köpetet. Ilyenféleképpen megállapítható, hogy a tiszta dezoxiribonukleáz önmagában is hatékony a sputum viszkozitásának csökkentése terén.

Claims (32)

1. Humán dezoxiribonukleáz, amelyhez nem társul natív glikolizáció.
2. Egy humán dezoxiribonukleázt kódoló DNS izolátum.
3. Egy, a 2. igénypont szerinti izolátum, amelyben az izolátum mentes a dezoxiribonukleáz-intronoktól.
4. A 2. igénypont szerinti izolátum, ahol az izolátum mentes az olyan genomiális DNS-től, amely a DNS lelőhelyétől eltérő polipeptidet kódol.
5. A 2. igénypont szerinti izolátum, ahol a DNS egy. az 1. ábrán látható aminosav-sorrenddel rendelkező polipeptidet kódol.
6. Egy rekombináns expressziós vektor, amely a humán dezoxiribonukleázt kódoló DNS-t tartalmazza.
7. Egy kompozíció, amely a 6. igénypont szerinti rekombináns expressziós vektor által transzformált sejtet tartalmazza.
8. A 7. igénypont szerinti kompozíció, amelyben a szóban forgó sejt emlős sejt.
9. Egy, a humán dezoxiribonukleáz előállítására szolgáló eljárás, amely egy gazdasejtnek a humán dezoxiribonukleázt kódoló nukleinsavval történő transzformálásából, a transzformált sejtek tenyésztéséből és a humán dezoxiribonukleáznak a tenyészetből történő kinyeréséből áll.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a humán dezoxiribonukleázt a gazdasejt táptalajából lehet kinyerni.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol a gazdasejt egy eukarióta sejt.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol az eukarióta sejt egy humán embrió vesesejtvonal.
13. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a nukleinsav a humán dezoxiribonukleáz preproteint kódolja.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás humán dezoxiribonukleáz előállítására, amely egy gazdasejtnek a humán dezoxiribonukleáz preproteint kódoló nukleinsavval történő transzformálásából, a transzformált sejt tenyésztéséből és a dezoxiribonukleáznak a tenyészetből történő kinyeréséből áll.
15. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a humán dezoxiribonukleáz a táptaljba szekretálódik.
16. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a humán dezoxiribonukleáz nem glikozilált.
17. Egy, enzimatikus kezelésre alkalmas gyógyszerészeti készítmény, amely az 1. igénypont szerinti humán dezoxiribonukleáz terápiásán hatékony mennyiségét tartalmazza.
18. A 17. igénypont szerinti készítmény, amely steril.
19. A 17. igénypont szerinti készítmény, amely teljesen mentes proleázoktól.
20. A 19. igénypont szerinti készítmény areosol formában.
21. A 17. igénypont szerinti készítmény, amelyben a dezoxiribonukleáz szekvenciája megegyezik az 1. ábrán bemutatott érett dezoxiribonukleáz szekvenciájával.
22. Egy polinukleotid próba, amely legalább mintegy 10 bázisból áll, és amely szigorú körülmények között képes hibridizálni a humán dezoxiribonukleáz génnel.
23. Az 1. igénypont szerinti humán dezoxiribonukleázból és egy nem-fehéije természetű polimerből álló konjugátum.
24. A 23. igénypont szerinti konjugátum, ahol a polimer egy sebészeti csőféleség, amelyet a katéterek és a dréncsövek csoportjából választunk ki.
25. A 23. igénypont szerinti konjugátum, amely vízoldékony.
26. A 23. igénypont szerinti konjugátum, ahol a polimer egy polioxialkilén- vagy polialkilén-glikol.
27. Egy kezelési módszer betegek számára, akiknek a szervezetében purulens anyag halmozódott föl, amely kezelés a 17. igénypont szerinti készítmény terápiásán hatékony mennyiségének beadásából áll az említett anyag viszko-elaszticitásának csökkentése érdekében.
28. Egy módszer antibiotikumok hatásának fokozására, amely az 1. igénypont szerinti dezoxiribonukleáz terápiásán hatékony mennyiségének beadásából áll.
29. Egy módszer a folyadékáram fenntartására a beteg testüregébe vezető vezetékekben, amely az 1. igénypont szerinti dezoxiribonukleáz és a vezeték belsejének érintkezésbe hozásából áll.
30. A 29. igénypont szerinti módszer, ahol a dezoxiribonukleáz kovalensen van kötve a vezetékhez.
31. A 29. igénypont szerinti módszer, ahol a dezoxiribonukleáz-oldat a vezetéken keresztül bejut a testüregbe.
32. Egy módszer cisztikus fibrózisban szenvedő betegek kezelésére, amely az 1. igénypont szerinti dezoxiribonukleáz hatékony dózisainak beadásából áll az ilyen betegnek.
HU95P/P00277P 1988-12-23 1995-06-20 Human deoxyribonuclease HU211232A9 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28995888A 1988-12-23 1988-12-23
US44803889A 1989-12-08 1989-12-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211232A9 true HU211232A9 (en) 1995-11-28

Family

ID=26965935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00277P HU211232A9 (en) 1988-12-23 1995-06-20 Human deoxyribonuclease

Country Status (11)

Country Link
US (3) US20030044403A1 (hu)
EP (2) EP0853121B1 (hu)
JP (2) JP3162372B2 (hu)
AT (2) ATE358176T1 (hu)
AU (1) AU630658B2 (hu)
BG (1) BG62870B2 (hu)
CA (1) CA2006473C (hu)
DE (2) DE68929551T2 (hu)
ES (1) ES2130120T3 (hu)
HU (1) HU211232A9 (hu)
WO (1) WO1990007572A1 (hu)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929551T2 (de) * 1988-12-23 2008-03-06 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche DNase
US5279823A (en) * 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE
EP0748225B1 (en) * 1994-03-04 2004-06-09 Genentech, Inc. PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE DNase FORMULATION
CA2184581C (en) 1994-03-04 2005-02-22 Hak-Kim Chan Improved dnase liquid solutions
US6251648B1 (en) 1998-04-03 2001-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
US5830744A (en) * 1995-06-06 1998-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
EP0817839A1 (en) * 1994-05-05 1998-01-14 Human Genome Sciences, Inc. Human dnase
DE69522799T2 (de) * 1994-09-06 2002-06-20 Seiichi Tanuma Neuartige desoxyribonuklease
SK284191B6 (sk) * 1995-02-24 2004-10-05 Genentech, Inc. Aktín-rezistentný variant humánnej DNázy I
JPH11505408A (ja) * 1995-02-24 1999-05-21 ジェネンテック インコーポレーテッド ヒトｄｎアーゼ変異体
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
DE19521046C1 (de) * 1995-06-09 1996-08-08 Deutsches Krebsforsch Protein mit DNase-Aktivität
PT854927E (pt) * 1995-10-10 2008-09-08 Genentech Inc Variantes da adnase i humana
NZ331063A (en) * 1996-02-05 2000-03-27 Inc Genentech Isolated nucleotide sequences encoding for mature LS- DNase which is resistant to actin inhibition
US6482626B2 (en) * 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6265195B1 (en) * 1996-04-25 2001-07-24 Genentech, Inc. Human DNase II
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
DE60035851D1 (de) * 1999-08-17 2007-09-20 Tanuma Deoxyribonuklease, dafür kodierendes gen und verfahren
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
EP2279755B1 (en) 2001-10-10 2014-02-26 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of Fibroblast Growth Factor (FGF)
US7265085B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7297511B2 (en) 2001-10-10 2007-11-20 Neose Technologies, Inc. Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7399613B2 (en) 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7226903B2 (en) 2001-10-10 2007-06-05 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
EP1433842B1 (en) * 2002-12-18 2011-01-05 Roche Diagnostics GmbH Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity
ATE494367T1 (de) 2002-12-18 2011-01-15 Hoffmann La Roche Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität
BRPI0408358A (pt) 2003-03-14 2006-03-21 Neose Technologies Inc polìmeros hidrossolúveis ramificados e seus conjugados
WO2004091707A2 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Nektar Therapeutics Aerosolization apparatus with capsule puncture alignment guide
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
US8710012B2 (en) * 2003-07-14 2014-04-29 Cls Therapeutics Limited Method for treating oncological diseases
US8388951B2 (en) 2003-07-14 2013-03-05 Cls Therapeutics Limited Method for treating systemic DNA mutation disease
US8431123B2 (en) * 2003-07-14 2013-04-30 Cls Therapeutics Limited Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20070254834A1 (en) 2003-11-24 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Erythropoietin
CA2552892C (en) 2004-01-08 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
DE602005019038D1 (de) 2004-05-04 2010-03-11 Novo Nordisk Healthcare Ag O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP1880733A4 (en) * 2005-04-25 2009-08-12 Genkin Dmitry Dmitrievich METHOD FOR EXTENDING THE LIFE OF A HUMAN AND ANIMALS
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
CN105664141A (zh) 2006-10-18 2016-06-15 派利尼斯有限公司 脱氧核糖核酸酶在制备用于治疗男性低生育力的药物中的应用
JP5372769B2 (ja) * 2006-11-28 2013-12-18 シーエルエス セラピューティック リミティド 組織の細胞外間隙においてデオキシリボ核酸の量が増量することに関連するヒトの病気の治療方法及び該方法を実施するための医薬製剤
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
ES2476690T3 (es) 2008-02-27 2014-07-15 Novo Nordisk A/S Moléculas conjugadas del Factor VIII
US9198957B2 (en) * 2011-01-31 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Treatment and prevention of bacterial vaginosis and Gardnerella vaginalis infections
US20150010527A1 (en) 2012-02-01 2015-01-08 Protalix Ltd. Dnase i polypeptides, polynucleotides encoding same, methods of producing dnase i and uses thereof in therapy
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
WO2014160284A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of stroke
US10988745B2 (en) * 2013-10-31 2021-04-27 Resolve Therapeutics, Llc Therapeutic nuclease-albumin fusions and methods
US10617743B2 (en) 2014-06-19 2020-04-14 Cls Therapeutics Limited Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy
WO2016067944A1 (ja) * 2014-10-31 2016-05-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えヒトＤＮａｓｅＩの製造方法
EP3240896A1 (en) * 2015-01-04 2017-11-08 Protalix Ltd. Modified dnase and uses thereof
JP2018503685A (ja) 2015-01-20 2018-02-08 ザ・チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレーション 線維化を処置および予防するためのならびに創傷治癒を促進するための抗ｎｅｔ化合物
RU2726131C2 (ru) 2015-05-22 2020-07-09 Дмитрий Дмитриевич Генкин Внеклеточная днк в качестве терапевтической мишени при нейродегенерации
DE102015118011A1 (de) * 2015-10-22 2017-04-27 Human Med Ag Vorrichtung zur Transplantation von Körperfett
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
TWI826360B (zh) 2016-11-17 2023-12-21 美商艾歐凡斯生物治療公司 殘餘腫瘤浸潤性淋巴細胞及製備和使用彼之方法
EP3351263A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-25 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Pharmaceutical preparation for treating or preventing tissue adhesion
AU2019209770A1 (en) 2018-01-16 2020-09-03 Cls Therapeutics Limited Treatment of diseases by liver expression of an enzyme which has a deoxyribonuclease (DNase) activity
IL301970A (en) 2020-10-07 2023-06-01 Protalix Ltd A long-acting DNase
US11993792B2 (en) 2021-05-27 2024-05-28 New England Biolabs, Inc. DNase I variants, compositions, methods, and kits

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2801956A (en) * 1954-08-24 1957-08-06 Merck & Co Inc Process for preparing pancreatic desoxyribonuclease
US2834710A (en) * 1955-06-29 1958-05-13 Merck & Co Inc Pancreatic desoxyribonuclease penicillin composition and process of preparation
US3208908A (en) * 1961-11-16 1965-09-28 Parke Davis & Co Fibrinolysin-desoxyribonuclease for enzymatic debridement
US3663690A (en) * 1969-08-12 1972-05-16 Hoechst Co American Mucolytic composition and method of treatment of broncho-pulmonary disorders therewith
CA1059937A (en) * 1975-03-25 1979-08-07 Boen T. Khouw Isolation and purification of deoxyribonuclease
JPS55131389A (en) * 1979-04-02 1980-10-13 Amano Pharmaceut Co Ltd Purification of deoxyribonuclease i
DE68929551T2 (de) * 1988-12-23 2008-03-06 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche DNase
US5279823A (en) * 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE
US5830744A (en) * 1995-06-06 1998-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
US6251648B1 (en) * 1998-04-03 2001-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
US6348343B2 (en) * 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US6482626B2 (en) * 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase

Also Published As

Publication number Publication date
US20050009056A1 (en) 2005-01-13
EP0449968A1 (en) 1991-10-09
EP0853121B1 (en) 2007-03-28
DE68928934D1 (de) 1999-04-01
AU630658B2 (en) 1992-11-05
ATE176924T1 (de) 1999-03-15
US20030044403A1 (en) 2003-03-06
AU4826590A (en) 1990-08-01
EP0449968B1 (en) 1999-02-24
CA2006473A1 (en) 1990-06-23
BG62870B2 (bg) 2000-09-29
JP3162372B2 (ja) 2001-04-25
ES2130120T3 (es) 1999-07-01
CA2006473C (en) 2002-02-05
US20080026426A1 (en) 2008-01-31
DE68929551D1 (de) 2007-05-10
EP0853121A3 (en) 1998-08-05
ATE358176T1 (de) 2007-04-15
US7297526B2 (en) 2007-11-20
WO1990007572A1 (en) 1990-07-12
JPH04502406A (ja) 1992-05-07
DE68929551T2 (de) 2008-03-06
EP0853121A2 (en) 1998-07-15
JP2001157580A (ja) 2001-06-12
DE68928934T2 (de) 1999-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211232A9 (en) Human deoxyribonuclease
KR100547402B1 (ko) α-갈락토시다아제 Ａ 결핍을 치료하는 방법
JP2016178950A (ja) 高度にリン酸化された活性なヒトｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼの製造およびその使用
JP6084653B2 (ja) 組換えエラスターゼタンパク質ならびにその製造方法および使用
AU612572B2 (en) Nucleic acid and methods for the synthesis of novel DAF compositions
US20030199073A1 (en) Production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase
JPH03500843A (ja) 新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体
WO1995030428A1 (en) Human dnase
AU2003220717B2 (en) Therapy for alpha-galactosidase a deficiency
AU2012227349A1 (en) Therapy for alpha-galactosidase A deficiency
HU210529A9 (hu) Zimogén vagy fibrinspecifikus tulajdonságokkal rendelkező szöveti plazminogén aktivátor Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontra vonatkozik.