BG62870B2

BG62870B2 - Метод за получаване на човешка дезоксирибонуклеаза

Info

Publication number: BG62870B2
Application number: BG098613A
Authority: BG
Inventors: Steven Shak
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 2000-09-29
Also published as: HU211232A9; US20030044403A1; DE68928934D1; ATE176924T1; AU4826590A; US20050009056A1; JP3162372B2; CA2006473A1; AU630658B2; EP0853121A3; JPH04502406A; CA2006473C; EP0853121A2; EP0853121B1; US20080026426A1; DE68929551T2; EP0449968A1; ATE358176T1; EP0449968B1; US7297526B2

Abstract

Изобретението се отнася до ДНК изолати, кодиращи човешка дезоксирибонуклеаза, и до методи за получаване на такива ДНК изолати заедно с експресиращи системи за рекомбинантно продуциране на човешка дезоксирибонуклеаза. Те се прилагат при изработването на терапевтични и диагностични състави.@

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Дезоксирибонуклеазата ЩНК-аза) е фосфодиестераза, хидролизираща полндезоксирибонуклеинови киселини. Тя действа в широк спектър и неспецифично за разграждане на ДНК и в това отношение се отличава от относително ограничените и секвенционно-специфични рестрикционни ендонуклеази. Изобретението се отнася по принцип до ДНК-аза I и ДНК-аза II. ДНК-аза I има pH оптимум.близо до неутралната област, задължително изискване за двувалентни катиони, и продуцира нуклеотид-5'-фосфат чрез хидролиза на ДНК. ДНК-аза II показва pH оптимум в киселата област, може да бъде активирана чрез двувалентни катиони и води до получаване на нуклеотид-3'-фосфат чрез хидролиза на ДНК. Също така са известни множество молекулни форми на ДНК-аза I и II.

ДНК-аза от различен произход може да бъде пречистена до различна степен. Говежда ДНК-аза А, В, С и D е пречистена и напълно секвенирана още през 1973 (Liao etal., J.Biol. Chem. 248: 1489(1973]; Salnikow eia/., J. Biol. Chem. 248:1499(1973]; Liao etal., J. Biol. Chem. 249:2354(1973]. Свинска и овнешка ДНКаза са били пречистени и напълно секвенирани (Paudel etal, J. Biol. Chem. 261: 16006(1986], Paudel etal., J. Biol. Chem. 261:16012(1986].

Докладвано е, че човешка пикочна ДНК-аза е била пречистена до електрофоретично хомогенно състояние и е установено, че N-крайната аминокиселина е лейцин; друга последователност не е описвана (Ito etal., J. Biochem. SS: 1399(1984]; вж. също Funacoshietal., J. Biochem. 82:1771 (1977]; Murai etal., Biochim. et Biophys. Acta 517:186(1978] и Wroblewski etal., P.S.E.B.M. Z4: 443(1950].

Въпреки, че пълната последователност на ДНК-аза от бозайници става известна още през 1973 г., едва в последно време се появяват съобщения за опити

-2да се клонира и изолира този клас ензими. Shields и сътр. описва експресионно клониране на част от гена на говежда ДНК-аза I и експресия на съвместния продукт в E.coli, която част е биологично и имунологично активна (Biochem. Soc. Trans. 16:195 [ 1988]). Продуктът ДНК-аза на Shields и сътр. обаче е бил токсичен към клетките гостоприемници и би могъл да бъде получен само с използване на индуциращ промотор. Освен това, опитите да се изолира плазмид ДНК от произволен клон срещат големи затруднения, вследствие конститутивните нива на експресия на ДНК-аза от клоновете, така че тези автори не са могли да определят последователността на кодиращата ДНК-аза нуклеинова киселина. Според Shields и сътр. невъзможността да бъде изолиран плазмидЕГе в резултат от конститутивната експресия на ДНК-аза, както и когато промоторът е репресиран при ниска температура. Това би могло да създаде значителна пречка, тъй като Shields et al. са идентифицирали само един клон чрез експресионно клониране, който изисква ДНК-азата да бъде поставена под контрола на промотор от същия вид.

ДНК-азата има приложение в много области и се използва главно за терапевтични цели. Главното терапевтично приложение е за понижаване на вискозитета на белодробния секрет при такива заболявания като пневмонията, при които спомага за прочистването на дихателните пътища. Запушването на дихателните пътища от секрет може да предизвика дихателна недостатъчност и в някои случаи може да доведе до прекъсване на дишането и смърт. Говежда панкреатична ДНК-аза е била продавана под търговското наименование Domavac (Merck), но този продукт е изтеглен от пазара. В различни доклади се съобщава за известна клинична ефективност на този продукт. Въпреки това, някои клиницисти наблюдават незначителни странични ефекти (Lieberman, JAMA 205:312(19681. други отбелязват сериозни усложнения като белодробно възпаление и анафилаксия (Raskin, Am. Rev. Resp. Dis, ££:697(1968]. Тези усложнения биха

-3могли да бъдат обяснени с това, че изходните продукти са били контаминирани с протеази и са били имуногенни за човека. Наистина, въпреки, че усложненията, свързани с вискозни белодробни секрети са често хронични и рецидивиращи, продължително лечение с говежда панкреатична ДНК-аза не се препоръчва. Тези проблеми могат да бъдат рошени с извличането на ДНК-аза от човешки източник и произвеждането й в големи количества в непанкретични екзокринни клетки за постигане на пречистване без наличие на контаминиращи протеази.

Първият предмет на настоящото изобретение е метод за получаване на полипептид, имащ ДНК-азна активност, включващ (I) трансформиране на клетки гостоприемници с нуклеинова киселина, кодираща полипептида, която включва показаната на фиг.1 пълна човешка аминокиселинна последователност на ДНКаза, или производни, получени чрез заместване, включване или делеция и които притежават ДНК-азна активност и не са имуногенни за човека, (II) култивиране в хранителна среда на клетките приемници, които отделят полипептида, имащ

ДНК-азна активност, и (III) отделяне на полипептида от културалната среда. Средата, включваща култивираните клетки, отделящи този полипептид^юже също така да бъде създадена за целта.

Вторият предмет на настоящото изобретение е метод за получаване на полипептид с ДНК-азна активност, включващ (I) трансформиране на клеткиприемници с нуклеинова киселина, кодираща полипептид, съдържащ аминокиселинна последователност, която е тази на пълна човешка ДНК-азна аминокиселинна последователност и е показана на фигура 1, с изключение на просто заместване с аминокиселина в един остатък от показаната на фигура 1 пълна аминокиселинна последователност, (II) култивиране на клеткитеприемници, които отделят полипептида, притежаващ ДНК-азна активност, и (III) отделяне на полипептида от културалната среда. Освен това, може да бъде създадена среда за култивиране на клетките, отделящи посочения полипептид.

-4В предпочитани изпълнения на изобретението ДНК-аза от бозайници е цялостна, зряла¹ човешка ДНК-аза, имаща аминокиселинна последователност на нативна човешка ДНК-аза, нейни естествено съществуващи алели, или определящата аминокиселинна последователност или гликозилните производни от нея. Нуклеиновата киселина^одираща ДНК-азецпо-специално кодира протеин, който се продуцира и секретира от клетките гостоприемници, по-специално клетки от бозайници.

Фигура 1 изобразява аминокиселина и ДНК последователност на човешка ДНК-аза. Подчертана е нативна сигнална последователност, потенциалните иницииращи кодони са заградени в кръг и пълната последователност е заградена в скоби.

фигура 2 показва съпоставяне между аминокиселинна последователност от човек (hDNase) и говежда (bDNase) ДНК-аза.Звездичките обозначават точната хомоложност, точките обозначават запазените субституции.

фигура 3 показва структурата на експресионните вектори рНК.ДНК-аза.З и pSVe.ДНК-аза.

фигура 4 показва структурата на експресионния вектор pSVI.

ДНК-аза, който съдържа съединяваща единица от pRK5 вектор без модификация.

Фигура 5 показва структурата на експресионните вектори pSVI2. ДНК-аза, р8\ДЗ.ДНК-аза, рвУб.ДНК-аза и рвУб.ДНК-аза,съдържащи модификации в съединяващата единица и обкръжаваща ги ДНК.

Фигура 6 показва пълната нуклеотидна последователност на р8У1.ДНК-аза до( но без да се включва) кодиращата област от ДНК-азата.

Фигура 7 показва пълната нуклеотидна последователност на pSVI2.ДНК-аза до( но без да се включва) кодиращата област от ДНК-азата.

Фигура 8 показва пълната нуклеотидна последователност на pSVI3. ДНК-аза до( но без да се включва) кодиращата област от ДНК-азата.

-5фигура 9 показва пълната нуклеотидна последователност на pSVI5. ДНК-аза до^но без да се включва) кодиращата област от ДНК-азата.

фигура 10 показва пълната нуклеотидна последователност на pSVI6.flHKаза до( но без да се включва) кодиращата област от ДНК-азата.

фигура 11 показва схематично представяне на нуклеотидните последователности на съшиващите единици, включени в получаването на векторите в този пример, т.е., SVI, SVI2, SVI3, SVI5 и SVI6B. Квадратчетата ограждат промените в SVI последователността: подчертаното с две линии е *лъжлив’АТО кодон: подчертаното показва 'лъжливи¹ сплайс-участъци и добавени или променени, означени със стрелки, секвенционни области (BPS): прекъсването в последователността представя изваждането на нуклеотиди за SVI3-SVI5: кавичките отбелязват непоказана последователност и каретата ограждат 5' и 3' разцепени участъци вътре в сплайс-донора и сплайс-акцептора, респективно, на сплайс-единицата.

Човешката ДНК-аза се дефинира като полипептид, имащ аминокиселинната последователност, показана на фиг.1 „заедно с аминокиселинните секвенционни нейни варианти, запазващи качествено ензимна активност на ДНК-аза. Предпочитаните варианти са тези, които не са имуногенни за хората. Вариантите могат да проявават по-висока ензимна активност, повишена резистентност спрямо инхибитори (в частност - актин), по-добра разтворимост или могат да се експресират в по-големи количества от клетките гостоприемници.

Аминокиселинните секвенционни варианти на ДНК-азата попадат в един или повече от трите класа: субституционен (съдържащ заместване), инсерционен (съдържащ включване) и делеционен (получен с изключване) варианти. Тези варианти обикновено се получават чрез сайтспецифична мутагенеза на нуклеотиди в ДНК, кодираща ДНК-азата, чрез които ДНК^кодираща варианта^ получена и след това експресирайки ДНК в рекомбинантна клетъчна култура.

-6Вариантни ДНК-азни фрагментиращи до около 100-150 остатъка^иогат да бъдат получени конвенционално чрез in vitro синтеза.

Аминокиселинните секвенционни варианти на човешка ДНК-аза са предетерминирани или са естествено съществуващи алели. Например, говежда панкреатична ДНК-аза е намерена като 4 молекулни варианта, които проявяват същата ензимна активност, но различна в гликозилната картина или заместване на ниво аминокиселини. Освен това, открита е природна човешка ДНК-аза с аргининов или глутаминов заместител при аминокиселина 222. Вариантите обикновено проявяват качествено същата биологична активност като природно съществуващия аналог. Специално се изключват от така описаната тук човешка ДНК-аза последователностите от естествено съществуващите говежда, свинска и овнешка ДНК-аза.

Когато мястото за осъществяване на аминокиселинна секвенционна промяна е предетерминирано, мутацията per se няма нужда да бъде предетерминирана. Например, за да се оптимизира извършването на мутация на дадено място, в носещия кодон или област се извърша пълна мутагенеза и след това ДНК-азните варианти се проверяват за оптимална комбинация от желани активности.

Замествания с аминокиселини обикновено се провеждат за прости остатъци; включванията обикновено ще бъдат от порядъка на около 1 до 10 аминокиселинни остатъка, и деленията се провежда при около 1 до 30 остатъка. Делеции или включвания за предпочитане се провеждат в два съседни остатъка, т.е. делеция на 2 остатъка или въвеждане на 2 остатъка. За постигане на желаната крайна структура могат да се използват заместване, делеция или включване или комбинация от тях.

Субституционните варианти са тези, в които най-малко един остатък в последователностга/токазана на фиг.1,е отделен и на негово място е включен

-7различен от него остатък. Такива замествания обикновено се извършват според посоченото в следващата таблица 1, където е посочено и окончателното модулиране на характеристиките на ДНК-аза.

ТАБЛИЦА 1.

Оригинален остатък	Примерни замествания
Ala	ser
Arg	lys
Asn	gin; his
Asp	g’u
Cys	ser
Gin	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gin
lie	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gin; glu
Met	leu; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Vai	ile; leu

-8Когато се извършва заместване, промени във функциите или имунологичната специфичност се постигат чрез селективни замествания, които са по-малко консервативни от тези, посочени в таблица 1, т.е. избирайки остатъци, които се различават повече главно по (а) структурата на основната полипептидната верига в областта на заместването, например равнинна или спираловидна конформация, (б) товара или хидрофобността на молекулата близо до носещия участък или (в) големината на страничната верига. Заместванията, от които обикновено се очаква да доведат до най-големи изменения в свойствата на ДНК-азата, би трябвало да бъдат такива, в които (а) хидрофилен остатък, например серил или треонил, е заместен за (или с) хидрофобен остатък, например лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (б) цистеин или пролин е заместен за (или с) друг остатък; (в) остатък, имащ електроположителна странична верига, например лизил, аргинил или хистидил, е заместен за (или с) електроотрицателен остатък, например глутамил или аспартил; или (г) остатък, имащ голяма по обем странична верига, като например фенилаланин, е заместен за (или чрез) остатък^ямащ странична верига, например глицин.

Примери за аминокиселинни секвенционни варианти на човешка ДНК-аза са описани в таблицата по-долу. Остатъкът, следващ номера на остатъка/юказва заместените или включените аминокиселини.

ТАБЛИЦА 2,

ЗАМЕСТВАНИЯ
Н134К, N, R или Q	FGW, L, I, МилиУ
A135S	I8F, L, V, М или W
L133V, 1илиА	И41КилиН
Р132А	S43T, С или Y

-9ТАБЛИЦА 2- продължение

N18K, Н, R или Q	K77R или Н
S17T	R79K или Н
T20S илиУ	N110D, S, Т, Τ,ΥηληΟ
N106K, Н. R или Q	G167P
G105P или А	F169L, V, I или М
D107E или Т	A171G, V или М
R140A	S250T, Υ или М
R121KhahH	Υ253Τ, вилиМ
T108ShahY	R73N
P103S, ТилиУ	R73C + D139C
C101S, Т.УилиМ	K260RhahS
C104S, Т. Y или М	L259V, I или М
Делеции	Включвания
Δ34Η-Δ39Ε	K260RA-COOH
Δ159Θ-161Ε	V131AP132
Δ204Α-208Η	Р132А L133
A121R-127E
Δ188Τ-191Τ
Δ204Α-208Η
A223G-231L
Δ260Κ

Обикновено промените в последователностите се правят в остатъци 6-10, 41 - 43, 77 - 79,110 -112,167 -171, 250 -253, 73, 93,157,149,185,17 - 20,105 -108 и 131 -139. За предпочитане, вариантите представляват консервативни замествания. Разбира се, някои варианти могат да проявяват слаба или изобщо да нямат

-10хидролитична активност. Въпреки това, тези варианти са полезни с това, че могат да служат като стандарти в имунологични изследвания във връзка с ДНК-аза, доколкото те остават най-малкото един имунен епитоп на нативната човешка ДНК-аза.

В обхвата на човешка ДНК-аза се включват гликозилирани варианти. Включват се и негликозилирани аминокиселинни секвенционни варианти, негликозилирана ДНК-аза/маща нативната, немодифицирана аминокиселинна последователност на ДНК-аза, и гликозилирани варианти. Например, заместваща или делеционна мутагенеза се прилага за елиминиране на N-свързани гликозилирани участъци от човешка ДНК-аза, намерени при остатъци 18 и 106, например, аспарагиновия остатък се изважда или замества с друг базичен остатък като лизин или хистидин.При друг вариант на изобретението фланкиращите (странични) остатъци, превръщащи се в гликозилирани участъци^ се заместват или се изваждат, даже ако аспарагиновите остатъци останат непроменени, за да се предоврати гликозилирането чрез елиминиране на разпознатия за гликозилиране участък. Негликозилирана ДНК-аза, която има аминокиселинна последователност на нативна човешка ДНК-аза,се продуцира в култура на рекомбинантни прокариотни клетки, тъй като при прокариотните клетки не може да се проведе гликозилиране в полипептидите. Освен това, гликозилираните варианти могат да бъдат образувани чрез добавяне на потенциални N-свързани гликозилирани участъци посредством включване (или чрез заместване или изваждане на аминокиселини) на годни за N-присъдинително гликозилиране последователности: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr. Гликозилираните варианти могат да бъдат образувани както чрез елиминиране на N-свързаните гликозилирани участъци при остатък 18 и 106, така и чрез добавяне на нови такива.

-11Гликозилирани варианти, т.е. такива, които са различни от тези на човешката панкреатична или пикочна ДНК-аза, се продуцират от селекционирани клетки гостоприемници или чрез in vitro методи. Например дрожди интродуцират гликозилирани варианти, които се различават значително от тези в системите на бозайници. Подобно, клетките на бозайници, имащи различен произход (напр. от хамстер, морско свинче, насекоми, свински, говежди, овнешки) или от органни тъкани (напр. език, дроб, лимфоидни, мезенхимални или епидермални) като източник на ДНК-аза,се изследват за способност да интродуцират гликозилирани варианти_?като се охарактеризират например с нивото на излъчване на маноза или различни съотношения на маноза, фукоза, сиалова киселина и други захари, обикновено включващи се в гликопротеините на бозайниците. Освен това, клетки от бозайници или дрождени клетки, които претърпяват мутация с оглед на гликозилиран фенотип могат да бъдат идентифицирани, селекционирани за последваща мутация или конструирани и използвани за продуциране на ДНК-аза. In vitro получаване на ДНК-аза обикновено се осъществява чрез ензимна хидролиза, например с неураминидаза или ендогликозидаза Н.

Инсерционни аминокиселинни секвенционни варианти на ДНК-аза се тези, в които един или повече аминокиселинни остатъци са въведени в предварително определени участъци на носеща ДНК-аза и които остатъци се поместват между съществуващите остатъци. Най-често инсерционни варианти представляват присъединени хетероложни протеини или полипептиди към аминоили карбоксилните краища на ДНК-аза. Производните на ДНК-аза, които са имуногенни за хоратаце се предпочитат, например тези,които се получават чрез присъединяване на имуногенен полипептид към ДНК-аза чрез кръстосано свързване in vitro или от рекомбинантни клетъчни култури^трансформирани с ДНК, кодираща имуногенни сливания като например lacZ. От тази гледна точка, типични

-12инсерционни варианти, в смисъла на изобретението са сигналните секвенционни варианти, описани по-горе.

Ковалентни модификации на ДНК-азна молекула също се включват в посочения обхват. Такива модификации се осъществяват чрез реакция на натоварени аминокиселинни остатъци от отделените протеини с органичен агент, който е способен да реагира с избрани странични вериги или крайни остатъци, или чрез механизъм на впрягане* на пост-транслационни модификация, който функционира в избрани рекомбинантни клетки гостоприемници. Резултантните ковалентни производни могат да се използват в програми, целящи идентифициране на остатъци, важни за биологичната активност, за имунологичните изследвания на ДНК-аза или за получаване на анти-човешки ДНК-аза-антитела за имуноафинитетно пречистване на рекомбинантна ДНК-аза. Например, пълното дезактивиране на биологичната активност на протеина след реакция с нинхидрин ще покаже, че най-малко един аргинил- или лизил-остатък е критичен за неговата активност, след което отделните остатъци, които са модифицирани при подбрани условия^се идентифицират посредством изолиране на пептиден фрагмент, съдържащ модифициран аминокиселинен остатък.

Цистеинилови остатъци най-често взаимодействат с а-халоацетати (и съответни амини), такива като хлороцетна киселина или хлорацетамидуза да дадат карбоксиметилови или карбоксамидометилови производни. Цистеинилови остатъци също така дават производни чрез взаимодействие с бромтрифлуорацетон, сс-бром-р-(5-имидазоил)пропионова киселина, хлорацетол фосфат, N-алкилмалеимиди, З-нитро-2-пиридилдисулфид, р-хлормеркурибензоат, 2-хлормеркури-4-нитрофенол или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол.

Хистидилови остатъци се превръщат в производни за предпочитане чрез взаимодействие с диетилпирокарбонат при pH 5,5 до 7,0, тъй като този реагент е относително специфичен за хистидилова странична верига. Също така може да се

-13използва р-бром-фенацил бромид; желателно е реакцията да се провежда в

0,1 М натриев какодилат при pH 6,0.

Лизинилови и аминови крайни остатъци взаимодействат със сукцинов анхидрид или анхидриди на други карбоксилни киселини. При получаването на производни с помощта на тези агенти се запазва товарсгна лизиниловите остатъци. Други подходящи агенти за преобразуването на съдържащи а-аминогрупа остатъци са имидоестери като метил-пиколинамидат, пиридоксалфосфат, пиридоксал, хлорборхидрид, тринитробензолсулфонова киселина, О-метилизокарбамид, 2,4-пентандион; и катализирана от трансаминаза реакция с глиоксалат.

Аргиниловите остатъци се модифицират чрез взаимодействие с един от няколко известни конвенционални агенти, между които фенилглиоксал,

2,3-бутандион, 1,2-циклохександион, и нинхидрин. Преобразуването на аргининовия остатък изисква провеждане на реакцията в алкална среда,поради високото рКа на гуанидиновата функционална група.Освен това, тези реагенти могат да реагират с групите на лизина също така^акто с аргининовите ε-аминогрупи.

Специфичното преобразуване на тирозиловите остатъци per se е било продължително време изучавано, със специален интерес към въвеждането на спектрални маркери в тирозиловите остатъци с ароматни диазониеви съединения или тетранитрометан. N-ацетилимидазол и тетранитрометан се използват найчесто за получаването на О-ацетил тирозил- и респ. З-нитро-производни. Тирозиловите остатъци се йодират с използване на ¹²⁵1 или¹³¹1 за получаване на белязани протеини за използване в радиоимунния анализ: хлорамин Т-методЕГе широко прилаган per se за тази цел.

Карбоксилни странични групи (аспартил или глутамил) се модифицират селективно чрез реакция с карбодиимиди (R'-N=C=N-R') като например

-циклохексил-3-(2-морфолинил-(4)-етил)карбодиимид или 1 -етил-3-(4-азо-4,4-диметилпентил)-карбодиимид. Освен това, аспарагилови и глутамилови остатъци се превръщат в аспарагинилови и съответно глутаминилови остатъци чрез реакция с амониеви йони, което е алтернатива на мутирането на нуклеиновата киселина за кодиране аспарагин или глутамин.

Преобразуването с помощта на бифункционални агенти може да се използва за получаване на вътрешномолекулни агрегати на протеина с имуногенни полипептиди, както и за напречно свързване на протеина към водоразтворима носеща матрица или повърхност за използване в изследвания или афинитетно пречистване на антитела.

Освен това, изучаването на вътрешномолекулното напречно свързване ще даде директна информация за конформационната структура. Обикновено използваните омрежващи агенти включват 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилетан, глутаров алдехид, Nхидроксисукцинимидоестери, например естери с 4-азидосалицилова киселина, хомобифункционални имидоестери, включително дисукцинимидил естери като 3,3’дитиобис(сукцинимидил-пропионат), и бифункционални малеинимиди като бис-Nмалеимидо-1,8-октан. Преобразуващите агенти като метил-3-[(р-азидофенил)дитио] пропиоимидат дават фотореактивни междинни съединения, които могат да образуват напречни връзки при наличие на светлина. Алтернативно, реакционноспособни водоразтворими матрици като активирани с бромциан въглехидрати и реакционноспособни вещества, описани в US патенти 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 и 4 330 440, се прилагат за имобилизиране на протеини.

Определени посттранслационни производни представляват резултат от действието на рекомбинантни клетки гостоприемници върху експресиран полипептид. Глутаминилов и аспарагинилов остатък често са пост-транслационно деамидирани до съответните глутамилов и арпарагилов остатък. Алтернативно,

-15тези остатъци се деамидират в условия на умерена киселинност. И едните и другите производни попадат в обхвата на настоящето изобретение.

Други пост-транслационни модификации са;хидроксилиране на пролин и лизин, фосфорилиране на хидроксилни групи от серил или треонил остатъци, метилиране на α-аминогрупите на лизинова, аргинининова и хистидинова странични вериги (Т.Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties· W.H.Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]),, ацетилиране на N-крайни аминогрупи и в някои случаи-амидиране на С-крайна карбоксилна група.

Други производни съдържат полйпептида съгласно изобретението, ковалентно свързан към непротеинов полимер. Непротеиновият полимер обикновено е хидрофилен синтетичен полимер, т.е. полимер, който не се среща по друг начин в природата. Въпреки това полимери, които съществуват в природата и се продуцират чрез рекомбинантни или in vitro методи,са приложими, тъй като са полимери, които са извлечени от природни продукти. Хидрофилните поливинилови полимери попадат в обхвата на изобретението, например поливинилалкохол и поливинилпиролидон. Особено полезни са полиалкиленови етери като полиетиленгликол, полипропиленгликол, полиоксиетиленови естери или метокси-полиетиленгликол; полиоксиалкилени като полиоксиетилен, полиоксипропилен и блокиьполимери на полиоксиетилен и полиоксипропилен (Pluronics); полиметакрилати; карбомери; разклонени или неразклонени полизахариди, които съдържат захаридните мономери D-маноза, D- и L-галактоза, фукоза, фруктоза, D-ксилоза, L-арабиноза, D-глюкуронова киселина, сиалова киселина, D-галактуронова киселина, D-мануронова киселина (например полимануронова киселина/или алгинова киселина), D-глюкозамин, D-галактозамин, D-глюкоза и неураминова киселина,включително хомополизахариди и хетерополизахариди като лактоза, амилопектин, скорбяла,

-16хидроксиетилскорбяла, амилоза, дестран сулфат, декстран, декстрини, гликоген, или полизахаридни субединици на киселинни мукополизахариди, например хиалуронова киселина; полимери на захарни алкохоли като полисорбитол и полиманитол; и хепарин или хепарон. Когато полизахаридът е нативен гликозилиран или гликозилирането съпътства рекомбинантна експресия, мястото на заместването може да бъде локализирано към различен от нативния N- или О-свързан гликозилиран участък, при което един добавен или заместен N- или О-свързан участък може да бъде въведен в молекулата. Използва се или смес от такива полимери или хомогенен полимер. Полимерът, подходящ за напречно свързване,не е необходимо, но се предпочита да бъде водоразтворим, но крайният конюгат трябва да бъде водоразтворим. Освен това, полимерът не трябва да бъде силно имуногенен във формата на конюгат, нито да е вискозен, което би го направило несъвместим с интравенозните инфузионни или инжекционни форми, ако се желае прилагането му по такъв начин.

За предпочитане е полимерът да съдържа само една реактивоспособна група. Това подпомага напречното свързване на протеиновите молекули. Въпреки това, в обхвата на изобретението се включва оптимизиране на реакционните условия, насочено към редуциране на омрежването или към пречистване на реакционните продукти посредством гел-филтрация или хроматографско разделяне за получаване на в значителна степен хомогенни производни.

Молекулното тегло на полимера е в границите от 100 до 500 000 и за предпочитане от 1 000 до 20 000. Молекулното тегло се избира в зависимост от природата на полимера и степента на заместване. Най-общо,колкото поголеми са хидрофилността на полимера и степента на заместване, толкова помалко е молекулното тегло, което може да бъде използвано. Оптималните молекулни тегла се определят чрез рутинни експерименти.

Полимерът обикновено се свързва ковалентно към полипептида съгласно изобретението посредством полифункционален свързващ агент, който реагира с полимера и с един или повече аминокиселинни или захарни остатъци на протеина.

-17Въпреки това, в обхвата на изобретението се включва и директно свързване на полимера чрез взаимодействие на модифициран полимер с протеин или обратно. Ковалентно свързаните участъци от полипептида включват

N-крайни аминогрупи и ε-аминогрупи, намиращи се в лизиновия остатък, както и други амино-, имино-, карбоксилни, сулфхидрилни, хидроксилни и други хидрофилни групи. Полимерът може да бъде ковалентно свързан директно към протеина без използването на полифункционални (обикновено бифункционални) свързващи агенти. Примери за такива напречносвързващи агенти са 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилетан, глутаров алдехид, N-хидроксисукцинимидни естери, като например естери с 4-азидосалицилова киселина, хомобифункционални имидоестери,включително дисукцинимидилови естери като 3,3'-дитио-бис(сукцинимидил-пропионат) и бифункционални малеимиди като бис-1Ч-малеимидо-1,8-октан. Модифициращите агенти като метил-3-{ (р-азидофенил)дитио]пропиоамидат дават фотореактивни междинни съединения^които могат да създадат напречни връзки под въздействието на светлина. При друг вариант на изобретението реактивоспособни водоразтворими матрици като активирани с бромциан въглехидрати и системите, описани в US патенти 3 959 080,

969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 И

330 44О.са подходящо модифицирани за напречно свързване. Ковалентното свързване към аминогрупите се осъществява по известни химически реакции, основаващи се на циануров хлорид, карбонилдиимидазол, алдехидни реактивни групи (ПЕГ алкоксид плюс диетилацетал на бромацеталдехид; ПЕГ плюс ДМСО и оцетен анхидрид или ПЕГ хлорид плюс феноксид на 4-хидроксибензалдехид,сукцинимидшюви активни естери, активиран дитиокарбонатен ПЕГ, 2,4,5трихлорфенилхлорформиат или ПЕГ, активиран с р-нитрофенилхлорформиат. Карбоксилните групи се преобразуват чрез присъединяване на ПЕГ-амин_;използвайки карбодиимид.

Полимерите се конюгират с олигозахаридни групи чрез оксидиране с използване на химикали като метаперйодат, или ензими, например глюкозооксидаза или галактозооксидаза, (всяка от които произвежда алдехидни производни на въглехидратите), последвано от взаимодействие с хидразид или амино-производни на полимерите, по същия начин, както е описан от Heitzmann et al., P.N.A.S., Zl:3537-3541 (1974) или Bayer etal., Methods in Enzymology, 62:310 (1979), за маркиране на олигозахаридите с биотин или авидин. По-нататък, за свързване на олигозахаридите могат да се използват успешно други химически реактиви или ензимни методи. Заместени олигозахариди са особено подходящи тъй като, най-общо, те съдържат по-малко заместители отколкото аминокиселинни участъци за преобразуване, и олигозахаридните продукти по тази причина ще бъдат по-хомогенни. Олигозахаридните заместители също така могат по избор да се модифицират чрез ензимно разграждане за отделяне на захарите, например с неураминидаза, преди модифицирането на полимера.

Полимерът ще съдържа група, която директно реагира с аминокиселинна странична верига, или N- или С-краища на полипептида, или която реагира с полифункционален напречно-свързващ агент. Общо, полимери, носещи такива реактивни групи, са известни за получаването на имобилизирани протеини. За да се използват такива химически вещества тук, трябва да се използва водоразтворим полимер, иначе получен по същия начин както неразтворимите полимери, прилагани до този момент за протеинова имобилизация. Активирането с бромциан е особено успешна операция за целта на омрежването на полизахариди.

Определението водоразтворим¹¹ отнесено към полимерните конюгати означава, че конюгатът е разтворим във физиологични течности като кръв например в количество,което е достатъчно да се достигне терапевтично-ефективна концентрация.

-19Водоразтворим*. отнесено към изходния полимер^означава, че полимерът или реактивоспособните междинни съединения, използвани за конюгиране, са достатъчно разтворими във вода_?за да участват в реакцията на преобразуване.

Степента на заместване с полимер ще варира в зависимост от броя на реактивните участъци в протеина, дали целиятили част от протеина ще бъде използван, дали протеинът е съединен с хетероложен протеин, от молекулното тегло, хидрофилността и други характеристики на полимера, и избраните специални протеинови модифицирани участъци. Общо, конюгатьт съдържа около от 1 до 10 полимерни молекули, докато една хетероложна последователност може да бъде заместена с по същество неограничен брой полимерни молекули с дължина, доколкото позволява запазването на желаната активност. Оптималната степен на напречно свързване се определя лесно с използването на експериментална матрица, в която времето, температурата и други реакционни условия варират до промяна на степента на заместване, след което се определя способността на конюгатите да функционират по желания начин.

Полимерът, например ПЕГ. се свързва напречно посредством голям брой различни методи, известни per se за ковалентно модифициране на протеини с непротеинови полимери, такива като ПЕГ. Някои от тези методи, обаче, не са подходящи за целите на настоящото изобретение. Цианурхлоридните химически средства водят до много странични реакции, включително омрежване на протеините. Освен това, те могат особено лесно да доведат до дезактивиране на протеините, съдържащи сулфхидрилни групи. Карбонилимидазоловите средства (Beauchamp etal,, Anal. Biochem. 131:25-33 [1983]) изискват високо pH (>8,5), което може да дезактивира протеините. Нещо повече, доколкото активираният ПЕГ междинен продукт може да реагира с вода, е необходим твърде голям моларен излишък от активиран ПЕГ спрямо протеина. Високата концентрация на ПЕГ, необходима за карбонилимидазоловите средства„също така води до

-20проблеми с пречистването, като и гелфилтрационната хроматография, и хидрофобната реакционна хроматография се осъществяват трудно. Освен това, високата концентрация на 'активирания ПЕГ* може да доведе до преципитиране на протеина, проблем, който сам по себе си предварително е бил отбелязан (Davis, US patent 4179 337). От друга страна, алдехидните химически средства (Royer, US patent 4 002 531) са по-ефикасни, доколкото изискват само 40-кратен моларен излишък на ПЕГ и 1-2 часа инкубиране. Въпреки това, мангановият диоксид. предложен от Royer за получаване на ПЕГ алдехид, е проблематичен,'поради очевидната тенденция ПЕГ да образува комплекси с метални оксидиращи агенти' (Harris etai, 'J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed.'22:341-352[1984]. Осъществяването на оксидиране c използване на ДМСО и оцетен анхидрид преодолява този проблем. Допълнително, натриевият борхидрид, предложен от Royer,трябва да бъде използван при високо pH и има изразена склонност към редуциране на дисулфидните връзки. Обратно, предпочита се натриевият цианборхидрид, който е ефективен при неутрално pH и проявява многа слаба склонност към редуциране на дисулфидните връзки.

Конюгатите съгласно настоящото изобретение се отделят от нереагиралите изходни вещества чрез гел-филтрация. Хетероложните видове конюгати се . отделят един от друг по същия начин. Полимерът също така може да бъде водонеразтворим, като хидрофилен гел или с определена форма. Специално полезни са полимери,използвани за хирургически тръбички като катетри или дренажни тръби и резервоари.

ДНК, кодираща човешка ДНК-аза,се синтезира чрез in vitro методи или се получава в готов вид от банки на човешка панкреатична сДНК. Доколкото фиг.1 дава пълната ДНК последователност на човешка ДНК-аза, специалистът от областта има нужда само да проведе хибридизационен скрининг с маркирана ДНК, кодираща човешка ДНК-аза или фрагменти от нея (обикновено по-големи от

-21около 50bp), за да установят клоновете в банката сДНК, които съдържат хомоложни последователности, последвано от анализиране на клоновете чрез рестрикционен ензимен анализ и определяне на последователностите на нуклеиновите киселини за идентифициране на целите клонове. Ако в банката няма цели клонове, тогава могат да бъдат отделени подходящи фрагменти от различни клонове и лигирани на рестрикционни сайтове, обикновено фрагменти за комплектовене на цялостния клон. ДНКладираща ДНК-аза от други животински видовете получава чрез изпитване на банки от тези видове с човешка последователност, или чрез синтезиране на гени in vitro (за говежда, свинска или овнешка ДНК-аза).

В обхвата на настоящото изобретение се включват и НК-сонди, които могат да се хибридизират при строго специфични условия с комплементарна ДНК(сДНК) на човешка ДНК-аза или с геномен ген за човешка ДНК-аза (включващ интрони и 5' или 3' странични участъци,простиращи се към съседните гени или около 5 000 Ьр* който е по-голям). Идентифицирането на геномната ДНК за ДНК-аза е елементарен въпрос на сондиране на банка човешки геноми с сДНК или нейни фрагменти, които са били белязани с маркерна група, например радиоактивен фосфор, и отделяне на клона (клоновете),съдържащи гена. Пълният ген се съединява с разхождащ се, ако е необходимо. Обикновено, сондите не кодират говежда, свинска или овнешка ДНК-аза и те варират от около 10 до 100Ьр по дължина.

Общо, прокариотите се използват за клониране на ДНК последователности в конструирането на векторите, използвани в изобретението. Например, E.coli 12 щам 294 (АТСС No 31446) е особено полезен. Други щамове микроорганизми, които могат да бъдат използвани^ключват E.coli В и E.coli Х1776 (АТСС No 31537). Тези примери са илюстриращи, а не ограничаващи обхвата на изобретението. Също така, подходящи са и in vitro методи за клониране.

-22ДНК-азата се излъчва директно в рекомбинантни клетъчни култури, като аналог с метионил като N-край, или слята с полипептид, хетероложен спрямо ДНКазата, за предпочитане сигнална последователност, или друг полипептид^мащ специфичен отделящ сайт при N-края на ДНК-азата. Например, при конструирането на прокариотен секреторен експресионен вектор сигналът на нативна ДНК-аза се прилага с гостоприемници, които разпознават човешкия сигнал. Когато секреторната водеща последователност (водач) е ’разпозната от гостоприемника, сигналната пептидаза на гостоприемника може да отдели свързания с полипептида водач, присъединен към неговия С-край към желаната ‘зряла’ДНК-аза. За гостоприемници прокариоти, които не произвеждат човешки сигнал, сигналът е заместен с прокариотен сигнал,избран например от групата на алкалната фосфатаза, пеницилиназа, 1рр или термостабилен ентеротоксин II водачи. За секретиране от дрожди сигналът на човешка ДНК-аза трябва да бъде заместен с водачи - дрождена инвертаза, алфа фактор или кисела фосфатаза. В клетки на бозайници излъчването на нативен сигнал е задоволително, въпреки че други секреторни протеинови сигнали от бозайници също са подходящи, ако са вирусни секреторни водачи, като например Херпес симплекс gD - сигнал.

ДНК-аза се излъчва в които и да е клетки-гостоприемници, но се предпочита да бъде синтезирана в клетки от бозайници. Въпреки това, за получаването й се използват също така и клетки-гостоприемници от прокариоти, фунги, дрожди, броненосци, инсекти и др.подобни. Примерни прокариоти са щамове, подходящи за клониране, като E.coli W3110 (F‘, λ’ фототрофна, ATCC No 27325), други ентеробактерии като Serratia marcescans. бацили и различни псевдомонади. Предпочита се гостоприемниците да секретират минимални количества протеолитични ензими.

Експресиращите гостоприемници обикновено са трансформирани с ДНК? кодираща човешка ДНК-аза, която е била лигирана в експресионен вектор.Такива

-23вектори като правило носят репликационен сайт (въпреки, че той не е необходим там, където ще настъпи хромозомално интегриране). Тук се предпочита да се използва експресионен вектор, както е описано в пример 4 по-долу, където векторът съдържа последователност или единица: сплайс-донор-интрон-сплайсакцептор.

Експресионните вектори също така съдържат маркиращи последователности, които могат да осигурят фенотипна селекция в трансформираните клетки. Например, Е. coli се трансформира обикновено с използване на pBR322, плазмид^зтделен от вид Е. coli (Bolivar, et al., Gene 2:95 [1977]). pBR322 съдържа гени за ампицилин- и тетрациклин-резистентост и така осигурява лесен начин за идентифициране на трансформирани клетки, за целите на клонирането или експресията. Експресионните вектори също така оптимално трябва да съдържат последователности, които могат да се използват за контрол на транскрипцията и транслацията, например промотори и Shine-Dalgamoпоследователности (за прокариоти) или промотори и усилващи последователности (енхансери) (за клетки на бозайници). Промоторите могат да бъдат, но не е задължително, индуцируеми; неочаквано беше установено, че дори мощен образуващ промотор като CMV-промотор за гостоприемници от бозайници, продуцира ДНК-аза без токсичност спрямо клетките гостоприемници. Докато е разбираемо, че експресионните вектори няма нужда да съдържат контролираща експресията част, репликиращи последователности или селекционни гени, тяхното отсъствие може да затрудни идентифицирането на ДНК-азните трансформанти и постигането на високо ниво на експресия на ДНК-аза.

Промотори, подходящи за използване с прокариотни гостоприемници, примерно включват β-лактамаза и лактозно-промоторни системи (Chang eial., •Nature, 2Z5:615[1978]; Goeddel eta!., Nature, 281:544 [1979]), алкална фосфатаза,

-24триптофан (trp) промоторна система (Goeddel, 'Nucleic Acid Res.' 8:4057(1980] и EPO заявка No 36 776) и хибридни промотори като tac-промотор (Н. de Boer eta!., 'Proc. Natl. Acad. Sci. USA* 8Q: 21-25 [1983]). Въпреки това, подходящи са и други функционални бактериални промотори. Техните нуклеотидни последователности са най-общо известни, което позволява специалист от областта да извърши лигиране до ДНК, кодираща ДНК-аза (Siebenlist et al., 'Cell' 20:269 [1980], използвайки съшиващи или адаптиращи агентища осигури необходими рестрикционни сайтове. Промотори за използване в бактериални системи също ще съдържат Shine-Dalgarno (S.D.) последователност, която може да бъде свързана към ДНК, кодираща ДНК-аза.

Освен прокариотите, подходящи за целтапа и еукариотни микроорганизми като дрожди или хифомицети. Saccharomyces cerevisiae е най-често използваният еукариотен микроорганизъм, въпреки това, използваеми са и голям брой други щамове. Щамове Saccharomyces cerevisiae, имащи идентификационни характеристики на щам AB 107-30 (4)-VN#2 (ATCC Accession No 20937), особено неговата резистентност спрямо 4М ортованадат, е особено подходящ за експресия на ДНК-аза. С този VN#2 щам, е желателно да се трансформират клетките с плазмид с високо копирно число, получен от дрожден 2-микрон плазмид. Обикновено, плазмид YRp7 е задоволително експресиращ вектор в дрожди (Stinchcomb, etal., Nature282:39(1979]; Kingsmanetal., Gene7:141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10:157 [ 1980]). Този плазмид винаги съдържа trpl ген, който осигурява маркер за подбор на мутантен щам от дрожди, проявяващ способност да расте в триптофан, например ATCC No 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics 85:12 [1977]). Наличието на trpl лезии като характеристика на дрожевия клетъчен геном след това осигурява ефективна среда за установяване на трансформация по растежа в отсъствие на триптофан. Експресията в броненосец (US патент 4 808 537) е също задоволителна.

-25Подходящи промотиращи последователности за използване с дрождеви клетки-гостоприемници, включват промотори за 3-фосфоглицерат киназа (Hitzeman et al„ 'J.Biol. Chem.' 255:2073 [1980] или други гликолитични ензими (Hess etal., J.Adv. Enzyme Reg.' 7:149(1968]; и Holland, 'Biochemistry¹17:4900 [1978]), такива като енолаза, глицералдехид-З-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, гриозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.

Други дрождеви промотори, които са индуцируеми промотори и имат допълнително преимущество, че могат да бъдат контролирани чрез условията на култивиране, са промотиращите региони на алкохолдехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензимиузвързани с азотния метаболизъм, металотионеин, глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназа, и ензими, отговорни за усвояването на малтозата и галактозата. Подходящи вектори и промотори за използване при дрождевата експресия са описани по-подробно в R.Hitzeman et al., ЕР 73 657 A.

Контролиращи експресията последователности са познати при еукариотите. Всъщност всички еукариотни гени имат АТ регион^локализиран приблизително на 25 до 30 бази над участъка, където се инициира транскрипцията. Друга последователност, намерена на 70 до 80 бази над началото на транскрипцията на много гени, е СХСААТ регион, където X може да бъде който е и да е нуклеотид. При 3' край на повечето еукариотни гени е ААТААА последователност, която може да бъде сигнал за добавяне на поли А придатък към 3' края на кодиращата последователност. Всички тези последователности могат да бъдат включени в експресиращи вектори от бозайници.

Подходящи промотори за контролиране на транскрипцията от вектори в клетки гостоприемници от бозайници са получени готови от различни източници,

-26например, геномите на вируси като полиома вирус, SV40-enpyc, аденовируси, MMV (стероид-индуцируем), ретровируси (например LTR-последователност на HIV), хепатит В - вирус и най-предпочитаните цитомегаловируси или от хетероложни промотори от бозайници, например бета-актин промотор. Началните и по-късните промотори на SV40 се получават конвенционално като SV40 рестрикционен фрагмент, който също съдържа SV40 вирусно начало на репликацията. Hers etaL, Nature, 2Z3:113(1978]. Междинният начален промотор от човешки цитомегаловирус се получава конвенционално като Hindlll Е. рестрикционен фрагмент (Greenaway, P.J. etaL, Gene 18:355-360 [1982].

Т ранскрипцията на ДНК, кодираща ДНК-аза при по-висшите еукариоти^се засилва чрез включване на усилваща последователност във вектора. Усилващите последователности са cis-действащи елементи от ДНК, обикновено от около 10ЗООЬр, които действат върху промотора за засилване на неговата транскрипция. Те са относително независими по отношение на ориентиране и разположение и е установено, че имат 5' (Laimins, L. etaL, PNAS 78. 993(1981] и 3' (Lusky, M.L, etaL, Mol. Cell Bio._3: 1108(1983]) към транскрипционната единица вътре в интрона (Banerji, J.L. etaL, Cell 33:729 [1983]^както и в самата кодираща последователност (Osborne, T.F., etaL, Mol. Cell Bio. 4:1293(1984]). Сега са известни много усилващи последователности от гени от бозайници (глобин, еластаза, албумин, афетопротеин и инсулин). Въпреки тежа, обикновено се използва усилваща последователност от еукариотно-клетъчен вирус. Примерно, SV40 усилител при късната част на репликационно начало (Ьр 100-270), усилител на цитомегаловирусен начален промотор, полиома-усилител върху късна част на репликационно начало, и аденовирусни усилители.

Експресиращите вектори, използвани в еукариотни клетки гостоприемници (дрожди, фунги, инсекти, растения, животни, човек или образувалите ядра клетки от други многоглетъчни организми),също ще съдържат последователности,

-27необходими за ограничаване на транскрипцията, която може да предизвика експресия на тРНК. Тези области се транскрибират като полиаденилирани сегменти в нетранслирана част от тРНК, кодираща ДНК-аза. 3'- нетранслираните области също така включват ограничаващи транксрипцията участъци.

Експресионните вектори могат да съдържат селекциониращ ген, също ограничен от селекциониращ маркер. Примери за подходящи избиращи маркери за клетки на бозайници са дихидрофолатредуктаза (DHFR), тимидинкиназа (ТК) или неомицин. Когато такива избиращи маркери са трансферирани успешно в клетките гостоприемници от бозайници, трансформираните клетки от бозайници са способни да оцелеят, ако са подложени на селективно налягане. Има две широко използвани отчетливи категории селективни режими. Първата категория се базира на метаболизма на клетките и използването на мутантна клетъчна линия, която има способността да расте независимо от хранителната среда. Два примера са: CHO DHFR^- клетки и миши LTK-клетки. Тези клетки имат способността да растат без добавяне на такива хранителни вещества като тимидин или хипоксантин. Тъй като тези клетки имат определена генетична потребност за синтезиране на пълни нуклеотиди, те не могат да оцелеят, ако липсващите нуклеотиди не бъдат осигурени в хранителната среда. Алтернатива на добавките към средата е въвеждането на интактен DHFR или ТК ген в клетките, имащи съответните гени: така се променят изикванията за растежа им. Отделни клетки, които не са трансформирани с DHFR или ТК ген, не могат да оцелеят в хранителна среда,в която няма добавки.

Втората категория е доминантна селекция, която се отнася до селекционна схема, използвана при който и да е клетъчен тип и не изисква използването на мутантна клетъчна линия. Тези схеми обикновено използват лекарствено средство за спиране на растежа на клетките гостоприемници. Тези клетки, които са трансформирани успешно с хетероложен ген,излъчват протеин/1ридаващ

-28лекарствена резистентност;и оцеляват при режимите на селекционирана Примери за такава доминантна селекция използват лекарствата неомицин (Southern etai, J.Molec. Appl.Genet. 1:327(1982]), микофенолова киселина (Mulligan etal., Science 209:1422(1980]) или хигромицин (Sugden etal., Mol. Cell. Biol. 5:410413 [1985]). Трите примера, дадени по-горе,използват бактериални гени под еукариотен контрол за предаване на резистентност към съответно лекарство G418 или неомицин (генетицин), xgpt (микофенолова киселина) или хигромицин, респективно.

Подходящи еукариотни клетки гостоприемници за експресия на човешка ДНК-аза включват маймунска бъбречна CV1 линия трансформирана с SV40 (COS7, АТСС CRL1651); човешка ембрионална бъбречна линия (293 или 293 клетки субклонирани за култивиране в суспезионна среда, Graham, F.L. etal, J. Gen. Virol. 36:59(1977]; бъбречни клетки от бебета хамстери (ВНК, АТСС CCL10); яйчникови клетки DHFR от китайски хамстери (СНО, Urlaub and Chassin, PNAS (USA) 77:4216 [1980]); миши sertoli клетки (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]; миши бъбречни клетки (CV1 АТСС CCL 2); бъбречни клетки от африканска зелена маймуна (VERO-76, АТСС CRL-1587); човешки цервикални ракови клетки (HELD, АТСС, CCL 2); кучешки бъбречни клетки (MDCK, АТСС CCL 34)чернодробни клетки от bufallo rat (BRL ЗА,АТСС CRL 1442); човешки белодробни клетки (W138, АТСС CCL 75); човешки чернодробни клетки (Hep G2, НВ 8065); миши мамаларен тумор (ММТ 060562, АТСС CCL51); и TRI клетки (Mather, J.P. etal, Annals N.Y.Acad. Sci.363:44-68[1982].

При конструирането на подходящи вектори, съдържащи желани кодиращи и контролиращи последователностите© прилагат стандартни техники на свързване. Изолирани плазмиди или ДНК фрагменти се нарязват, съшиват и лигират отново в желана форма за образуване на необходимите плазмиди.

-29За анализ за формирането на коректни последователности в конструираните плазмиди лигационните смеси се използват за трансформиране на Е. coli К12 щам 294 (АТСС 31446) и успешните трансформанти се избират според тяхната резистентност към ампицилин или тетрациклин, където е подходящо. Плазмидите се отделят от трансформантите, анализират се чрез рестрикция и/или се секвенират по метода на Messing etal., Nucleic Acids Res. 9:309 [1981] или по метода на Махат eta!., Method in Enzimology 65:499 [1980].

Клетките гостоприемници се трансформират с експресиращи вектори, съгласно настоящото изобретение и култивират в конвенционални хранителни среди, модифицирани с подходящи за индуциране промотори, селекциониране на трансформанти или амплифициране на ДНК-азен ген. Условията на култивиране, като температура, pH и др.п., са тези, използвани по-рано при клеткитегостоприемници, избрани за експресия, и са очевидни за обикновен специалист от областта.

*Трансформация* означава въвеждане на ДНК в организъм,така че ДНК да може да бъде репликирана, или като екстрахромозомален елемент или чрез хромозомно интегриране. Ако не се открият други начини, методът, използван тук за трансформация на клетки гостоприемници,е метод на Graham, F. and van der Eb, A., Virology 52:456-457 [1973]. Въпреки това, могат да бъдат използвани и други методи за въвеждане на ДНК в клетките като нуклеарно инжектиране или чрез протопластно сливане. Ако прокариотните клетки или клетки, които имат по същество структура с клетъчна стена, предпочитаният метод за трансфекция е третиране с калций като се използва калциев двухлорид, както е описано от Cohen, F.N. eta!., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69:2110 [1972].

Tрансфекция’ се отнася до въвеждането на ДНК в клетка гостоприемник, независимо от това дали са експресирани кодиращи последователности. Голям

-30брой методи за трансфекция са познати на средния специалист в областта, като например третиране с СаРОд и електропорация. Трансформацията на клетките гостоприемници е индикация за успешна трансфекция.

ДНК-азата се отделя и пречиства от рекомбинантните клетъчни култури по методи, използвани по-рано за човешка, говежда, овнешка и свинска ДНК-аза, включително преципитиране с амониев сулфат или етанол, киселинна екстракция, анионна и катионна йонообменна хроматография, фосфоцелулозна хроматография, хидрофобна реакционна хроматография, афинитетна хроматография (например с използване на ДНК или нуклеотиди върху твърд носител), хидроксиапатитна хроматография и лектин-хроматография. Освен това, за пречистване на ДНК-аза могат да се използват успешно HPLC с обърнати фази, и хроматография с използване на анти-ДНК-аза антитела. Както беше отбелязано преди, (Price etal., J. Biol. Chem. 244:917(1969] предпочита се да имаме ниски концентрации (приблизително 0,1-5 тМ) на калциеви йони при пречистването. Могат да се използват и други двувалентни катиони, които стабилизират ДНК-азата. ДНК-азата може да бъде пречистена и в присъствие на протеазен инхибитор, като PMSF.

Човешката ДНК-аза се влага в терапевтичти препарати заедно с необходимите кофактори и евентуално се прилага по същия начин^акто животинската ДНК-аза, като например говежда панкреатична ДНК-аза. Препаративната форма на ДНК-аза може да бъде течна и за предпочитане изотоничен солеви разтвор като например 150 тМ натриев хлорид, съдържащ 1,0 тМ калций при pH 7. Концентрацията на натревия хлорид може да варира в границите от 75 до 250 тМ. Концентрацията на калция може да варира в границите от 0,01 до 5 тМ и други двувалентни катиони, които стабилизират ДНК-азатецмогат да бъдат включени или да заместят калция. pH може да бъде в границите от 5,5 до 9,0 и могат да се използват буфери, съвместими с включените

-31двувалентни катиони. Препаратите могат да бъдат лиофилизиран прах, също така съдържащ калций.

Търговски достъпните приспособления за разпръскване на течни форми, включително струйни разпръскватели и ултразвукови разпръскватели^иогат да бъдат използвани при прилагането на препаратите. Течните форми могат да бъдат директно пръскани, а също така може да бъде пръскан и лиофилизиран прах след възстановяването му. При друг вариант на приложение, ДНК-азата може да бъде приготвена в аерозолна форма с използване на носител флоуоровъглерод и дозираща нагнетателна помпа, или сгъстена като лиофилизиран и смлян прах. Освен това, течната форма на ДНК-аза може да бъде директно капана в назотрахелната или ендотрахеалната тръба в интубирани пациенти.

Пречистената ДНК-аза се прилага за ензимно коригиране на вискозитета и еластичността или лепкавостта на мукозата. Човешката ДНК-аза е особено полезна за лечение на пациенти с белодробно заболяване, които имат неправилна, вискозна или сгъстена, гнойна секреция при състояния като остро или хронично бронхо-пулмонарно заболяване (инфекциозна пневмония, бронхит или трахеобронхит, бронхиектазис, цистична фиброза, астма, ТБ или гъбични инфекции), ателектаза, дължаща се на трахеална или бронхиална травма, и усложнения след трахеостомия,3а такава терапия, разтвор или окончателно отделен сух препарат на човешка ДНК-аза се вкарва по конвенционален начин в бронхите, например чрез аерозолно впръскване на разтвор на ДНК-аза. Човешка ДНК-аза е приложима също като допълнително средство за подобряване на лечението на абсцеси или някои капсулирани инфекции при състояния като емпиема, менингит, абсцес, перитонит, синузит, отит, периодонтит, перикардит, панкреатит, холелитиаза, ендокардит и септичен артрит, както и локално третиране на различни възпалителни и инфею-тирани рани като инфектирани рани на кожата и/или мукозни мембрани, хирургични рани, язви и изгаряния. Човешката

-32ДНК-аза намира приложение за поддържане на потока в медицински тръби, свързани към телесни кухини, включително хирургични дренажни тръби, катетри, перитонеални диализни приспособления, и интратрахеални кислородни катетри. ДНК-азата може да повиши ефекта на антибиотици при инфекции (например активността на гентамицина забележимо се намалява от обратимото свързване с интактна ДНК). Тя също може да бъде използвана като перорална добавка в случаите на панкреатична инсуфициенция. ДНК-азата ще бъде полезна и в случаите, когато е необходимо разграждане на ДНК, когато последната онечиства лекарствени препарати. Получаващите се вследствие разграждането на ДНК олигонуклеотиди и ДНК-азата се отделят след това от фармацевтичния препарат. В този случай ДНК-азата може да се приложи имобилизирана върху неразтворим във вода носител. И накрая ДНК-аза може да се използва за третиране на неинфекциозни състояния.при които има натрупване на остатъци от разрушаване на клетки, включително клетъчна ДНК. Например, ДНК-аза може да се приложи след системно лечение на пиелонефрити и тубуло-инстерстициални бъбречни заболявания (например със запушени тубули от клетъчни остатъци), включително предизвикана от лекарства нефропатия или остра тубуларна некроза.

ДНК-аза може също така да бъде приложена успоредно с други фармакологични препарати,използвани за лечение на посочените по-горе заболявания, като антибиотици, бронходилататори, противовъзпалителни средства, и муколитици (например п-ацетил-цистеин). ДНК-аза може да се прилага успоредно с други терапевтични човешки протеини като растежен хормон, протеазни инхибитори, гама-интерферон, енкефалиназа, белодробни сърфактантни, и колонийстимулиращи фактори.

За улесняване разбирането на следващите примери ще бъдат описани някои често срещащи се методи и/или термини.

“Плазмиди” са обозначени със знак малко “р”, предшестван и/или последван от главни букви и/или номера. Изходните плазмиди тук са или търговски достъпни, или са публично неограничено достъпни, или могат да бъдат създадени от достъпни плазмиди съгласно публикувани методи. Освен това, в областта са познати еквивалентни плазмиди на тези, описани тук, и са очевидни за специалисти от областта.

“Разграждане” на ДНК се отнася до каталитично разцепване на ДНК с рестрикционен ензим, който действа само на някои последователности в ДНК. Различните рестрикционни ензими, използвани тук, могат да бъдат намерени като търговски продукти и техните отнасяния, условия, кофактори и други изисквания, които са приложени тук, са известни за всеки среден специалист от областта. За аналитични цели, обикновено се използва 1 g от плазмид или ДНК-фрагмент с около две единици от ензим в около 20 I буферен разтвор. Когато се цели изолиране на ДНК-фрагменти за конструиране на плазмиди, обикновено 5 до 30 g ДНК се разцепват с 20 до 250 единици ензим в по-голям обем. Необходимите количества буфери и субстрати се определят от работещия според конкретния ензим. Обикновено инкубиранията продължават около 1 h при 37°С, но могат да варират според инструкциите на доставчика. След разцепването, реакционната среда директно се подлага на електрофореза върху полиакриламиден гел за изолиране на желания фрагмент.

Разделяне по размери на отцепените фрагменти се провежда с използване на 8процентен полиакриламиден гел, описан OTGoedel, et al., Nucleic acids Res., 8:4057 [1980].

“Дефосфорилиране” се отнася до отделяне на крайните 5’ фосфатни групи чрез третиране с бактериална алкална фосфатаза (ВАР). Тази операция предотвратява свързването на двата отцепени рестрикционно края на ДНК-фрагмента от свързване в цикъл или образуването на затворен пръстен, който ще пречи на

-34включването на друг ДНК-фрагмент към рестрикционния участък. Режимите и реагентите за дефосфорилирането са конвенционални (Maniatis, Т. eta!., Molecular Cloning pp. 133-134 [1982]. Реакциите използващи ВАР се провеждат в 50 тМ Трие при 68°С за подтискане активността на други екзонуклеази, евентуално присъстващи в ензимните препарати. Реакциите протичат за около 1 час. След реакцията ДНК-фрагментЯГсе пречиства с гел.

Олигонуклеотиди¹ се отнася до едноверижни полидезоксинуклеотиди или две комплементарни нуклеотидни вериги, които могат да бъдат химически синтезирани. Такива синтетични олигонуклеотиди нямат 5' -фосфат и по тази причина няма да лигират друг олигонуклеотид без добавяне на фосфат с АТР в присъствие на киназа. Синтетичният нуклеотид ще лигира към фрагмент, който не е бил дефосфорилиран.

Лигиране* се отнася до процес на образуване на фосфодиестерни връзки между два фрагмента с двойни вериги от нуклеинови киселини (Maniatis, Т. et al., Id., р. 146). Ако не е предвиден друг метод, лигирането може да бъде осъществено с използване на познати буфери и условия с 10 единици Т4 ДНК-лигаза (лигаза) на 0,5 цд от приблизително еквимоларни количества ДНК-фрагменти, които ще бъдат лигирани.

Запълване или затъпяване се отнася до операции, посредством които едноверижен завършек в кохезивен край на отцепена с рестрикционен ензим нуклеинова киселина се превръща в двойнсверижен. Това елиминира кохезивния край и образува тъп завършек. Този процес е универсален инструмент за превръщане на рестрикционно отрязан край, който би могъл да бъде кохезивен,с краища^талучени само с един или малко други рестрикционни ензими, в край, съвместим с която и да е затварящ рестрикционна ендонуклеаза или друг запълнен кохезивен край. Обикновено, затъпяването се осъществява чрез инкубиране на 2 -15 цд от носещата ДНК в 10 mM МдС^, 1 тМ дитиотреитол,

-3550mM NaCl, 10 mM Tрис (pH 7,5) буфер, при около 37oC в присъствие на 8 единици Klenow-фрагмент от ДНК-полимараза I и 250μΜ от всеки от четирите дезоксинуклеозидтрифосфати. Инкубирането обикновено след 30 мин е последвано от екстракция с фенол и хлороформ и преципитиране с етанол.

Пример 1,

Клониране на човешка панкреатична ДНК-аза I

Изготвяне на сДНК банка

Банка човешка панкреатична сДНК се създава в Xgt 10 с използване на полиаденилирана тРНКлриготвена от прясно получен и замразен в течен азот човешки панкреас (Lauffer etal., Nature 318:334(19851. Използвайки олиго-dTпраймери и EcoRI-Sall-Xhol-Sstil -адаптери, се получава сДНК банка от 0,9 χ 10⁶независими изолати от над 600 Ьр.

Олигонуклеотидни сонди

Синтезирани са две дълги сонди на базата на аминокиселинна последователност от говежда ДНК-аза I. Избрани са два сегмента от аминокиселинната последователност, които проявяват ниско излишество и са използвани обичайните таблици за кодони от бозайници.

Сонда 1: 5GTG-CTG-GAC-ACC-TAC-CAG-TAT-GAT-GAT-GGC-TGTGAG-TCC-TGT-GGC-AAT-GAC 3* (51-мер съответстващ на аминокиселинна последователност Val-Leu-Asp-Thr-Tyr-GIn-Tyr-Asp-Asp-Gly-Cye-Glu-SerCys-Glu-Asn-Asp)

Сонда 2: 5TAT-GAC-GTC-TAC-CTG-GAC-GTG-CAG-CAG-AAG-TGGCAT-CTG-AAT-GAT-GTG-ATG-CTG-ATG-GGC-GAC-TTC-AAC-GC 3' (71-мер съответстващ на аминокиселинна последователност Tyr-Aep-Val-Tyr-LeuAsp-Val-GIn-GIn-Lys-Trp-Hls-Leu-Aen-Aep-Val-Met-Leu-Met-Gly-Asp-PheAsn)

-36Изолиране на човешки ДНК-аза 1 с ДНК-клонове

Двете сонди бяха маркирани в краищата с Т4 полинуклеотидкиназа и [32pj аденозинтрифосфат (Maniatis et al., Molecular cloning, [Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]) и използвани поотделно за проверяване на банката човешка панкреатична сДНК при не строго фиксирани хибридизационни условия: 20 % формамид, 5xSSC (0,75 М NaCI, N,075 М натриев цитрат), 50 тМ натриев фосфат (pH 6,8), 0,1 % натриев пирофосфат, 5Х Denhardt-ов разтвор, обработена със звук ДНК от хайвер от сьомга (50 цд/т1), 0,1 % SDS, и 10 % декстрансулфат при 42°С. Извършват се не строго прецизирани промивания с 1XSSC и 0,1 % SDS при 42°С. Три (1,2 и 6) от 600 000 клона хибридизират с двете сонди и съдържат 1,3 кВ включвания. Същите се субклонират в М13 вектори (Messing eta/., Nucleic acids Res._9;309[1981] и секвенират чрез метод за определяне на вериги (Sanger eta/., J.Mol. Biol. 143:161 [1980]).

Сравняването на изведените аминокиселинни последователност на клон 6 с аминокиселинната последователност на говежда панкреатична ДНК-аза I разкрива екстензивна хомоложност. Въпреки това, бяха отбелязани голяма делеция и голямо включване в изведената аминокиселинна последователност на клон 6. Освен това, включването съдържа ограничител в края си и има характеристиките на задържащ интрон, дължащи се на информация за липсващо съшиване. Клонове 1 и 2 също съдържат мним интрон.

Бяха синтезирани две допълнителни екзактни нуклеотидни сонди от последователността от клон 6 за получаване на допълнителни клонове.

Сонда 4 (N-крайна сонда): 5* CTG-AAG- АТС- GCA-GCC-TTC-AAC-ATCCAG-ACA-TTT-GGG-GAG-ACC (42мвр)

-37Сонда 5 (сонда с мним интрон): 5'TCC-GCA-TGT-CCC-AGG-GCC-ACAGGC-AGC-GTT-TCC-TGG-TAG-GAC (42мер)

Сондите се бележат с ³²Р и използват за повторен скрининг на 1,3 х 10⁶клона от банка човешка панкреатична сДНК при строго спазвани условия: 50 % формамид, 5 х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М натриев цитрат), 50 mM натриев фосфат (pH 7,8), 0,1 % натриев пирофосфат, 5Х Denhardt-ов разтвор, обработена със звук ДНК от хайвер от сьомга (50 gg/ml), 0,1 % SDS и 10 % декстрансулфат, при 42°С. се провеждат промивания при 42°С в 0,2Х SSC и 0,1 %SDS. Четири клона хибридизираха със сонда 4 (сонда с N-край) и не хибридизираха със сонда 5 (с мним интрон). От тях, клон 18-1, който съдържаше инсърт от около 1,1 кВ при PAGE, се субклонира в М13 и секвенира. Пълната нуклеотидна последователност на клон 18-1 и изведената аминокиселинна последователност са показани на фиг. 1.

Клон 18-1 е съставен от 1039 Ьр и има дълга отворена четяща рамка,без да се открие интрон в клон 6. Както беше отбелязано, има два възможни иницииращи кодона (ATG) (позиции 160-162 и 169-171). Всеки един от тях може да бъде използван. Шаблонът ATG с пурин в позиция -3 по-точно съответствува на правилото на Kozak (Kozak, Cell 44:283(1986]. Между мнимите* инициращи кодони и нуклеотидите, кореспондиращи на N-крайния лейцин (CTG в позиции 226-228)?са нуклеотиди, кодиращи къса относително хидрофобна аминокиселинна последователност (19-22 аминокиселини дълга), която е вероятно секретиране сигнална последователност.

Сравняването на изведената аминокиселинна последователност на човешка ДНК-аза I с говежда ДНК-аза I показва екстензивна аминокиселинна хомоложност (фиг.2). Човешки и говежди протеин са 260 аа дълги и имат N-краен лейцин. Главните структурни особености на говеждия протеин, който включва четири

-38цистеинови остатъка (101,104,173 и 209), два потенциални N-свързани гликозилирани участъка (18 и 106), и активен участък хистидин (134), са запазени. Като цяло, налице е приблизително 77 % аминокиселинна идентичност.

Всяка от шестте области от най-голямото многообразие от аминокиселини (аминокиселинни остатъци 27-39,83-96,115-126,156-161,219-234 и 243-247) съдържа повече от три различия и над 54 % от аминокиселините могат да се променят. Интересно е, че тези области също са вариабилни, когато говеждата последователност се сравни с овнешка и свинска. Някои от тези области показват бримкова структура, съгласно рентгенографската кристална структура на говежда ДНК-аза (Oefner etaL, J. Mol. Biol. 192:605(1986]). поради което може да бъде предположено, че ще бъдат имуногенни. Така, вероятно е тези разлики в аминокиселините между човешка и говежда последователност да водят до имунологични реакции.

Пример 2, Изследване на активността на ДНК-аза

В допълнение към стандартно ELISA (виж пример 4) и радиоимунен анализ (RIA) бяха разработени три метода за анализ за определяне на активността на ДНК-аза.

1. Хидролиза на ³²Р-белязана ДНК. Белязана с ³²Р ДНК се получава с използване на М13 моноверижна матрица, 17-мер секвениращ праймер, ³²P-dCTP, нерадиоактивен dATP, dTTP и dGTP, и Klenow. Накратко, 1,5 λ MgCl2 (32mM), 1,5 λ 10x рестрикционен буфер (70mM Tris-HCI, pH 7,6; 35mM дитиотреитол; 1mM EDTA) и 6λ HjjO се смесват c 1λ матрица (приблизително 1 μς) и 1,5 λ Palmer (0,5 μΜ) и нагряти до 55°С за 7 мин. Нуклеотидната смес се приготвя чрез обработване 40 λ S^P-dCTP (sp.act 3000 Ci/mmol; 400 μθί) плюс 1 λ всяко от 2 mM изходен разтвор на нерадиоактивен dATP, dTTP и dGTP до сухо и след това възстановяване на нукдеотидите в 7 λ 1Х рестрикционен буфер. Нуклеотидната смес и 11 Klenow се прибавят към сместа матрица-праймер и реакцията се провежда при 37°С. След 15 мин. се прибавят 2λ от нерадиоактивните дезоксинуклеотиди и инкубирането продължава още 15 мин. Белязаната ДНК се отделя след това от свободните нуклеотиди чрез центрофугиране през Сефадекс G-50 (Maniatis et al., [ 1982]).

Активността на ДНК-азата се измерва чрез инкубиране на проби със 100 000 срт 32р-ДНК плюс 80 gg/ml нерадиоактивна ДНК от хайвер от сьомга в ДНК-азен буфер (10 тМ Трис-HCI pH 7, 4тМ MgCI₂, 4 тМ CaCIg) за 45 мин. при 37°С. Реакцията се прекъсва чрез добавяне на един и половина обем от нерадиоактивна ДНК (2 mg/ml) и един обем ледена 20 %-на трихлороцетна киселина. След 10 мин. при 4°С сместа се центрофугира при 12 000 дХЮ мин. и се изчислява една аликвотна част от супернатантата. Присъствието на киселинно разтворими изчислени и примеси в супернатантата отразяват активността на ДНК-азата. Всеки ден се прави стандартна крива чрез тестване на 0,1 - 200 ng говежда ДНК-аза I (Sigma D-5025).

2. Изследване върху агарова плака. Smith, Hankock, and Rhoden (Applied Microbiology, 18:991 [1969] описват тест-агар, съдържащ метил-зелено и ДНК за определяне на ДНК-азната активност на микроорганизми.

Това изследване беше модифицирано за разработване на бърз полуколичествен метод за анализ на активността на разтворима ДНК-аза за отсяване и супернатанти за контролирана експресия и отсяване на колонни фракции за контролирано пречистване. За изготвянето на агара, бакто-агар (7,5 д) се размива в 500 ml буфер (25mM Tris pH 7,5,5тМ MgCl2,5 тМ CaCl2,0,1 % натриев азид). Добавят се ДНК от хайвер на сьомга (1,0 д) и метил-зелено (17,5 mg). След разбъркване в продължение на 1 - 2 часа при 55°С, и автоклавиране, плаките се измиват и съхраняват при 4°С. ДНК-азната активност се измерва чрез накапване

-40на 0,5 - 5^аликвоти върху плаките, които след това се инкубират при стайна температура или при 37°С в продължение на 4 до 48 часа. Стандартните криви се построяват чрез разделяне на аликвотни части на 0,1 -1000 ng говежда ДНК-аза I. ДНК-азата се измерва лесно чрез размера на чистите зони в агара, имайки логаритмичното съотношение между концентрацията на ДНК-азата и диаметъра на чистите зони. Така оформен, този анализ също така е приложим за бързо идентифициране на високо-експресионни ДНК-аза продуциращи клонове или с оглед получаване на ДНК-аза,или с оглед пресяване на трансформанти^в които ДНК-азата се използва като избиращ маркер или като пренасящ ген.

Реагентите метил-зелено и ДНК освен в агаровата плака, могат също да се използват във водни форми (например в 96-ямкови плаки) за бързо, чувствително и специфично количествено определяне на ДНК-азната активност.

3. Електрофореза в натриев додецил/сулфат -полиакриламиден гел и xymography. SDS-PAGE и xymography се осъществяват по модифициран метод на Rosenthal and Lacks (Anal. Biochem. 8Q: 76(1977]).

Накратко, буферна система на Laemmli се използва за изготвяне на 12 %-ен полиакриламиден гел. ДНК от хайвер на сьомга (10mg/ml) и EDTA (2mM) се прибавят към концентриращ и към разреждащ гелове преди полимеризацията. Протеините се суспендират в буферен разтвор, нагряват се до 100°С за 3 мин преди нанасянето им върху гела. Електрофорезата се провежда при стайна температура при постоянен ток. След електрофорезата, гелегсе промива с вода и инкубира в 250 ml от 40 тМ Трис-HCI, pH 7,5, 2 тМ MgCl2, 0,02 % азид. След 1 час се добавя свеж буфер и гелггсе оставя за 12 часа при 24°С. За определяне на ДНК-азната активност, гелът се поставя в свеж буфер,съдържащ 2 mM CaCIg и 1 gg/ml етидиев бромид^и след това се изпитва под UV-светлина при интервали от 5 мин до 24 часа. За спиране на реакцията се прибавя EDTA (крайна концентрация

-4115 mM), и ксимограмата се заснема. Петната в гела могат да се проявят за откриване на протеин с Кумаси-синьо.

Пример 3. Експресия на човешка ДНК-аза

1, pRK, ДНК-аза 7

Плазмид pRK.ДНК-аза 7 се изгражда от клон 18-1, описан по-горе, както следва:

Плазмид pRK5 се разкъсва с EcoRI, дефосфорилира и се изолира фрагмент 1, съставен главно от плазмида. pRK5 е описан от Suva etal., Science 237:896 [1987]; и ЕР публикация 307 247, публикувана на 15 март 1989 г„ a pCLS2.8c28D изходен плазмид е описан в ЕР 278 776, публикуван 17 август 1988 г. λ ДНК-аза клон 18-1 се разкъсва с EcoRI и се изолира инсърП5г(фрагмент 2). Фрагмент 1 и фрагмент 2 се съединяват и лигационната смес се транформира в E.coli щам 294. Трансформираната култура се нанася върху плаки с ампицилинова среда и се подбират резистентните колонии. Плазмид ДНК се получава от трансформантите и проверява чрез рестрикционен анализ за наличие на точните фрагменти.

рНК.ДНК-аза.7се трансфектира в човешки ембрионни бъбречни клетки-293 за моментна и стабилна експресия. За моментна експресия на човешка ДНК-аза I, 60 mm от плаки,сливащи се НЕК-293 клетки (50%) се трансфектира^ както е описано по-рано (Eeton eta!., 1986) чрез калциевофосфатен метод (Wigler eta!., 1979). За стабилна експресия на човешка ДНК-аза I НЕК-293 клетките се трансформират по подобен начин едновременно с pRK. ДНК-аза. 7 и плазмид, експресиращ резистентен към неомицин ген pRSV neo (Gorman etal., 1985). Два дни след трансфекцията клетките се посяват в стандартна среда (1:1 F12/DME

-42допълнена с L-глутамин, пеницилин-стрептомицин и 10 % FBS) с 0,5 mg/ml G418 (Genticin sulfat; Gibco) за подбор на устойчиви линии.

Провежда се анализ на супернатантата от 293 клетки,трансфектирани временно или устойчиво с ДНК-аза плазмид?проявил 0,2 -1,0 mg/ml ДНК-азна активност, както е определено чрез 32р-ДНК хидролизен метод или метод , използващ зелена агарова пластинка за ДНК-аза. Анализът на супернатантата от трансфектираните клетки чрез SDS-PAGE и ксимографията разкрива нова протеинова ивица при приблизително 35 - 37 kD с ДНК-азна активност. Допълнителните изследвания показаха, че рекомбинантна ДНК-аза 1,продуцирана в 293 клетки и изискваща калций за проявяване на активност, се инхибира от EDTA, нагряване и актин, и има по-висока активност спрямо двойноверижна ДНК, отколкото спрямо едноверижна ДНК. Специфичната активност на човешка ДНКаза, експресирана в 293 клетки,е съпоставима с тази на говежда ДНК-аза.

2. pSVe, ДНК-аза DHFR3.

pSVe. ДНК-аза. DHFR3, плазмид за рекомбинантна синтеза на човешка ДНК-аза I в СНО-клетки, се конструира^акто следва.

Конструира се един междинен плазмид за отделяне на излишна полисвързваща област. Плазмид pRK. ДНК-аза; 7 се разкъсва с EcoRI и Spill и се изолира най-големия фрагмент,съдържащ 5'участък от ДНК-аза кодираща област (фрагмент 3). Плазмид рНК.ДНК-аза.7 се разкъсва със Sall, получените краища се свързват с фрагмента Klenow, разкъсва се със Sphl и се изолира средния по размери фрагмент, съдържащ 3' участък от ДНК-аза кодираща област (фрагмент 4). pRK5 се срязва със Small и EcoRI и се изолира фрагмент, състоящ се главно от плазмида (фрагмент 5). фрагментите 3,4 и 5 се лигират и сместа се трансформира в Е. coli щам 294. Трансформираната култура се нанася върху плаки с ампицилинова среда и се подбират резистентните колонии. Плазмидът

-43ДНК се получава от трансформантите и проверява чрез рестрикционен анализ за наличие на точните фрагменти. Полученият плазмид се означава като pRKDNasealnt

Плазмид pE342HBV.E400D22 (Crowley eta!., Mol. Cell Biol.* 3:44 [1983] се разкъсва c EcoRI и Pvul и се изолира най-малкия фрагмент^съдържащ SV40 началния промотор и част от β-лактамазния ген (фрагмент 5). Плазмид pE342HBV.E400D22 също така се разкъсва с BamHI и Pvul и се изолира фрагментгт^ъстоящ се основно от плазмид, съдържащ в равновесие β-лактамазния ген, както и SV40 начален промотор и DHFR ген (фрагмент 6). Плазмидът pRKDNaselnt се разкъсва с EcoRI и BamHI и се изолира ДНК-аза кодиращият фрагмент (фрагмент 7). Фрагментите 5, 6 и 7 се лигират и сместа се трансформира в E.coli щам 294. Трансформираната култура се нанася върху плаки с ампицилинова среда и се подбират резистентните колонии. Плазмидът ДНК се получава от трансформантите и се проверява за наличие на точните фрагменти. Резултантният плазмид се обозначава като pSVeDNaseDHFR3.

За стабилна експресия на човешка ДНК-аза I, използвайки описания плазмид, 60 mm плаки от събраните СНО-клетки (DP-7) се трансфектират чрез метода,използващ калциев фосфат и култивират първоначално в селективна хранителна среда. Ненарастналите клетъчни линии нарастват силно в среда, която съдържа приблизително 0,02 - 0,1 mg/ml ДНК-азна активност, както е измерено или азно изследване с плака зелен чрез ^Р-ДНК хидролизен метод^или чрез ДНК агар. Очаква се, че по-високи нива (най-малко 5Х) на експресия ще бъдат достигнати, ако тези клетки се култивират до висока плътност във ферментор. Отделни клонове биват избрани заради техните индивидуални нива на ДНК-азна експресия за избиране високо секретиращи клетки и след това-нарастване на всеки избран клон в среда с повишаващи се концентрации на МТХ (12,5 до 2000 пМ).

3. pDNAII.

Създаден е плазмид за рекомбинантна синтеза на ДНК-аза в Е. coli като секретиран протеин. Този плазмид е наречен pDNAII и се конструира,както следва.

Плазмид pTF.HI (ЕР публ.Ио 278 776) се разкъсва с Nsil и Sall и се изолира най-големият фрагмент състоящ се главно от плазмида (фрагмент 8). Плазмид pRK.DNase.7 се разкъсва с Sall и ElsiXI и се изолира 798 Ьр фрагмент, съдържащ най-много от кодиращата област (фрагмент 9).Синтезират се два синтетични олигонуклеотида:

DLink 1: 5'TTG-AAG-ATC-GCA-GCC-TTC-AAC-ATC-CAG-ACA-T (31-мер)

DLink 3: 5'CTG-GAT-GTT-GAA-GGV-TGC-GAT-CTT-CAA-TGC-A (31-мер)

Фрагментите 8 и 9 и синтетичните олигонуклеотиди DLink 1 и DLink 3 се лигират и сместа се трансформира в Е. coli щам 294. Трансформираната култура се нанася върху плака с ампицилинова среда и резистентните колонии се отбират. Плазмид ДНК се получава от трансформантите и се проверява чрез рестрикционен анализ за наличие на точните фрагменти,предпазени от Nsil и BstXI рестрикционни участъци. Няколко плазмида бяха секвенирани за извършване на включване на коректна синтетична ДНК. 294 клетки, трансформирани с pDNAII експресират >500mg/L от два нови главни протеина^акто се вижда от SDS-PAGE-главна ивица при приблизително 32 kD и малка ивица-при приблизително 30 kD. Секвенционният анализ на аминокиселините в двете ивици разкрива

-45последователност с N-край - Met-Lys-Lys-Asn-lle-Ala и респективно - Leu-Lys-lleAla-Ala-Phe. Така, по-високата MW ивица представлява необработена човешка ДНК-аза и по-ниската MW ивица представлява частично обработена нативна човешка ДНК-аза.

Човешката ДНК-аза, експресирана в Е. coli е активна. 294 клетки? трансформирани с рОИАП^култивирани върху агарова пластинка, допълнена с калций, магнезий и фосфат, показват секретиране на активна ДНК-аза, както доказва наличието на чисти зони, обхващащи трансформираните клетки, и липса на такива зони около контролните клетки. Освен това, трансформирани клетки , разтворени със SDS и бета-меркаптоетанолДяха изследвани с SDS-PAGE и ксимография.ДНК-азната активност се асоциира с ивицата на частично обработена човешка ДНК-аза, но не с необработена човешка ДНК-аза.

Създаден е плазмид за рекомбинантна експресия на човешка ДНК-аза I като вътрешноклетъчен протеин в Е. coli. Плазмидът е наречен pDNA2, и е конструиран,както следва.

Плазмид pHGH207/307 се получава от плазмид pHGH207 (US патент 4 663 283) чрез отделяне на EcoRI участък в противоположна посока на trp промотор (EcoRI разкъсване, 'затъпяване' и отново лигиране).

Плазмид pHGH207/307 се разцепва с Xbal и Sall и се изолира най-големият фрагмент, състоящ се главно от плазмида (фрагмент 10). ПлазмидьТрНК.01Чазе.7 се разцепва с Sall и SstXI и се изолира 798 Ьр фрагмент_тсъстоящ се главно от кодиращата област (фрагмент 9). Синтезират се два синтетични олигонуклеотида.

-46DLlnk 4: 5' CTAGAATTATG-TTA-AAA-ATT-GCA-GCA-TTT-AAT-ATT-CAAACA-T (42-мер)

DLlnk 5: 5¹ TTG-AAT-ATT-AAA-TGC-TGC-AAT-TTT-TAACATAATT (34-мер)

Фрагментите 9 и 10 и синтетичните олигонуклеотиди DLink 4 и DLink 5 се смесват и сместа се трансформира в Е. coli щам 294. Трансформираната култура се нанася върху плаки с ампицилинова среда и се подбират резистентните колонии. Плазмидът ДНК се получава от трансформантите и се проверява чрез рестрикционен анализ за наличия на точните фрагменти и предпазване на Xbal и BstXI рестрикционни участъци. Няколко плазмида се секвенират за осъществяване на вграждане на коректна синтетична ДНК.

294 клетки,трансформирани с рОМА2,експресират един нов главен протеин от приблизително 30 kD, както се установява с SDS-PAGE. Секвенционният анализ на протеина показва N-ограничена последователност Met-Leu-Lys-lle-AlaAla-Phe, кореспондираща на човешка Met-ДНК-аза.

Човешка Met-ДНК-аза, експресирана директно в Е. со1|\също е активна. Трансформираните клетки, солубилизирани с SDS бета-меркатпоетанол,се изследват с SDS-PAGE и ксимография.ДНК-азната активност се асоциира с ивицата на човешката Met-ДНК-аза.

Пример 4. Допълнително изследване на ДНК-азната експресия а, ДНК-азни експресионни вектори

Човешката панкреатична дезоксирибонуклеаза (ДНК-аза) I сДНК от плазмид pRK. DNase. 7, описана по-горе, която съдържа цял инсерт от ДНК-аза сДНК клон 18-1,изолиран от Xgt10 банка на човешка панкреатична сДНК във

-47вектор pRK5, се трансформира в pRK5 за създаване на междинен експресионен вектор pRK. ДНК-аза. 3. В този плазмид (рНК.ДНК-аза.З), синтезата на ДНК-аза се осъществява директно посредством CMV транскрипционни регулаторни елементи. Сплайс единицата, описана по-долу, е локализирана между транскрипционния и транслационния инициращ участък. За генерирането на експресиращи ДНК-аза вектори, CMV транскрипционни регулаторни последователности и сплайс-единици от pRK.DNase.3 се заместват от SV40 транскрипционна регулаторна последователност и различни съшиващи донор-интрон-сплайс акцепторни единици^акто е описано по-долу. За сравнение е създаден също съответният вектор,в който липсва съшиваща единица (pSve.ДНК-аза).

1, рИК.ДНК-аза.З.

Вектор pRK-ДНК-аза.З (фиг.З) се конструира^както следва.

pRK5 се разцепва със Smal и Sall, които отрязват изключително в полилинкерния регион между 5' и 3' контролни последователности и най-големият фрагмент се изолира. pRK5 векторът съдържа съшиващ донор-интрон-сплайс акцепторен регион в обратна посока на кодиращия регион и по посока на промотора, като интронният регион се състои от цитомегаловирусен (CMV) най-близък начален същиващ донор и интронна последователност, промоторен инсерт от бактериофаг SP6 и имуноглобулинов (Ig) тежковерижен променлив регионен (VH) интрон и сплайс-акцепторна последователност. Вектор рИК.ДНК-аза.7 се накъсва с Sami, 3' стърчащите краища се отрязват с Т4 ДНК-полимераза и продуктът се разцепва отново със Sall за получаване на цяла кодираща човешка ДНК-аза I последователност като 921-и фрагмент. След изолирането с гел този фрагмент се лигира към pRK5 голям фрагмент,използвайки стандартни техники на лигиране (Maniatis etaL, 1982, supra} за създаване на вектор рИК.ДНК-аза.З.

-48рБК.ДНК-аза.З съдържа CMV транскрипционни регулаторни елементи и съшиваща единица, локализирана между транскрипционен и транслационен инициращи сайтове (Интрон· на фиг.З). В този вектор съшиващата единица на рНК5-вектора е представена без каквито и да било модификации.

2, pSVe.ДНК-аза.

Вектор pSVe. ДНК-аза се създава^както следва (фиг.З).

Регулиращите последователности, предшестващи кодиращия ДНК-аза регион от вектор рИК.ДНК-аза.З се отделят от останалата част на вектора чрез отцепване с SstI и Glal; ДНК, получена от dam+ бактериални клетки гостоприемници/» използва за предотвратяване отцепването на втори Clal- - участък от вектора, локализиран към 3' -края на начален полиаденилиран SV40 - регион. Най-големият фрагмент, в който липсва 5' контролен регион, се изолира с гел.

DHFR експресионен вектор pE348DHFRUC служи за източник на SV40 транскрипционни регулаторни последователности. Векторът pE348DHFRUC (Vannice and Levinson, J. Virology, 62:1305-1313,1988, където е означен с рЕ, фиг.1) съдържа SV40 усилващ и начално-промоторен регион в обратна посока на Hindlll - участък, включвайки SV40 начални сайтове за иниициране на транскрипция (позиция 5171 във вируса), предшестваща сДНК, кодираща миша дихидрофолатредуктаза (DHFR), която е последвана от 584-Ьр хепатитен вирус В (HBV) поли А сигнал в плазмид pML1 от GamHI до UGIII участъци на HBV. Този плазмид съдържа полилинкер в непосредствена близост обратно на посоката на SV40 последователностите. SV40 транскрипционните регулаторни последователности се получават чрез разцепване с SstI и Clal. и резултантните 5' стърчащи краища се 'запълват с използване на Klenow - отрязване в присъствие и на четирите дезоксирибонуклеотида (dNTPs, dGTP, dCTP, TTP). След последващо разцепване с Xbal се изолират с гел SV40 транскрипционните регулаторни последователности (усилващ и начален промотор, включително SV40 начални

-49участъци на инициирането на транскрипцията), представени от по-малкия XbalClal -фрагмент (360 нуклеотида).

По-малкият фрагмент от pE34DHFRUC, описан непосредствено по-горе,се изолира с гел и лигира към големия рНК.ДНК-аза.З фрагмент за генериране на вектор pSVe.ДНК-аза. В този вектор синтезата на ДНК-аза се насочва от SV40 транскрипционни контролиращи последователности, но липсват съшиващи единици между тях и кодиращия ДНК-аза регион.

ЗЦ22УШНК=аза.

Вектор рЗУ1.ДНК-аза (фиг.4) се получава след включване на

ДНК-аза кодираща последователност в междинен плазмид, pRKS.SVe. Този междинен плазмид се създава чрез заместване на pRK5 CMV транскрипционни регулаторни елементи, локализирани между Spel и Sacll рестрикционни сайтове, с малък Xbal-Hindlll фрагмент от pE348DHFRUC който съдържа SV40 начален промотор и усилите 3'- стърчащи краиша^енерирани чрез Sacll разцепване на pRK5,ce обработват обратно с Т4 ДНК-полимераза и 5' стърчащите краища, резултат от Hindlll разцепване на pE348DHFRUC се запълват* при използване на Т4 полимераза в присъствие и на четирите dNTP.

За конструирането на pSVI.ДНК-аза. ДНК-аза кодиращата последователност се отделя от вектора рЕЖ.ДНК-аза.З чрез отцепване с EcoRI и Hindlll, и се вгражда в големия фрагмент на pRKS.Sve, който е бил изолиран след разцепване с същите два ензима. Векторът pSVI.ДНК-аза съдържа SV40 транскрипционни регулаторни елементи (усилващ и начален промотор, включително SV40 начални участъци на иницирането на транскрипцията) и тРНК връхни участъци, последвани от съшиващата донор-интрон-сплайс акцепторна единица на pRK5 вектора без модификация, сДНК кодираща ДНК-аза, SV40

-50начален полиаденилиран (поли А¹) регион, и 8У40-начало на репликационните Cori) региони от SV40.

Пълната нуклеотидна последователност на pSVI.DNase до, но без да включва, кодиращия регион за ДНК-аза, е показана на фиг. 6.

4, рЗУ12.ДНК-аза, р5У13.ДНК-аза, р5У15,ДНК-аза и pSVI6B.flHK-a3a

Вектори pSVI2. ДНК-аза, pSVI3.flHK-a3a, pSVI5.flHK-a3a и pSVI6B.flHK-a3a се конструират (фиг.5) чрез рекомбиниране на два фрагмента за всеки един от случаите. Първият е голям рИК.ДНК-аза.З фрагмент, получен чрез разцепване с EcoRI. третиране с Т4 ДНК-полимераза в присъствието на dNTP, и последващо отцепване с £sti; вторият е, при всички случаи, малък фрагмент, съдържащ SV40 5' регулаторни последователности и модифицирана съшиваща единица.

Известни са различни методи за модифициране на сплайс -единици за усилваща рекомбинантна експресия в клетки на бозайници. На фиг. 11 е показано схематично представяне на нуклеотидните последователности на сплайс-единицте, включени в получаването на векторите от този пример, т.е. SVI, SVI2, SVI3, SVI5 и SVI6B. Кутийките показват промените от SVI последователността, подчертаното с две линии е лъжлив* ATG-кодон, подчертаването посочва лъжливи сплайсучастъци и добавени или променени, означени със стрелки, секвенционни области (BPS), прекъсването в последователността представя изваждането на нуклеотиди за SVI3-SVI5, кавичките отбелязват непоказана последователност и каретата ограждат 5' и 3' разцепени участъци вътре в сплайс-донора и сплайс-акцептора, респективно, на сплайс-единицата. Тези последователности могат да бъдат получени по известни методи за синтез на протеини или чрез стандартно модифициране на SVI последователност.

-51 Фиг. 7-10 показват пълните нуклеотидни последователности на р8У12.ДНк-аза, р8У13.ДНК-аза, pSVI5.flHK-a3a и pSVI6B.flHK-a3a, респективно, до, но без да го включва, кодиращия регион на ДНК-аза. Последователностите на сплайс-единиците от фиг. 11 са включени във фигури от 7 до 10.

б. Временна (моментна)експресия на ДНК-аза

Временна експресия, насочена чрез различни ДНК-азни вектори, беше анализирана след трансфекция в CHO DHFR клетки. Клетките се трансфектират чрез модификация на DEAE-декстранов метод и се определят нивата на ДНК-аза, акумулирана в клетъчна среда 36 до 48 часа след трансфекцията. Прибизително 4 х 10⁵ клетки се поставят във всяка ямка на 6-ямкови 35 mm културални плаки. На следващия ден обем от 2 gg ДНК-азен експресионен вектор се допълва до 15 ml с TBS (137 mM NaCl, 5тМ KCI, 1,4 тМ Na₂PO4, 24,7 тМ TrisHCI, 1,35 тМ СаС^, 1,05 тМ MgCl2, pH 7,5). След това се прибавят 30 μΙ DEAE-декстран (10 mg/ml) и 2 ml несъдържаща серум културална среда, съдържаща 100 μΜ хлорокин. Клетъчната маса се отделя, клетките се промиват еднократно с PBS (фосфатен буферен разтвор, pH 7,5) и се прибавя ДНК сместа. 3 до 4 часа след това се прибавя глицерол и клетките се покриват с 2 ml регулираща нарастването среда, докато бъдат изследвани. ДНК-аза векторите се трансфектират зеадно с 2 gg контролен плазмид, pRSV.hGH, който насочва експресията на ген на човешки растежен хормон (ТЮН^контролирана чрез транскрипционна регулираща последователност в дълъг краен повтор (LTR-последователност) на Rous-саркома вирус. Този плазмид може да бъде получен чрез заместване на ras-промотор от rasP.hGH, описан от Cohen and Levinson, Nature, 334:119-124 [1988] c RSVпромотор. Количеството синтезиран при всичките случаи hGH, служи за стандарт, даващ възможност за по-прецизно сравняване на нивата на ДНК-аза/юлучена чрез различните трансфекцции. ПО-долу са показани нивата на ДНК-аза и

ИбН.продуцирани в типови експерименти, правени по два пъти.

Вектор	ng/ml	ДНК-аза	ng/ml hGH	Kop.ng/ml ДНК-аза
ОПИТ 1	опит 2	ОПИТ 1	опит 2	опит1	ОПИТ 2
рв\/е.ДНК*аза	19.7	17,4	50,1	42,0	8,6	9.2
pSVI-ДНК-аза	17,9	13,8	29,7	20,4	12,8	14,7
pSVI2.flHK-a3a	34,2	30,5	41.3	40,3	18,0	17,0
pSVI3.ДНК-аза	37,8	28,7	45,2	40,5	18,0	15.1
pSVI5.flHK-a3a	28,4	22,1	37,2	28,7	16,7	17,0
pSVI6B .ДНК-аза	28,5	37,8	61,3	67,5	10,2	12,2

Нивата на ДНК-аза в средата се определят чрез стандартен ELISA с използване на серум от зайци, инжектиран или с човешка ДНК-аза или с говежда ДНК-аза, и помощни вещества (Practice and Theorie of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen, Chapter 5, “Production of antibodies: pg. 43-78 (Elsevier, Amsterdam, 1985)). Нивата на hGH се определят c използване на търговски достъпни аналитични китове (IRMA, Immunoradiometric assay), доставяни от Hybritech, Inc., La Jolla, Са.

Данните в последната колона показват, че експресията на ДНК-аза, насочена от векторите рБ\/12.ДНК-аза, рв\/13.ДНК-аза, pSVI5.flHK-a3a и р8У16В.ДНК-аза, е до известна степен по-висока от тази, получена с изходния вектор рБУДИК-аза. Числата в първата колона показват по-вероятна серия от данни, не е много сигурно, че ефективна hGH синтеза не се отразява отрицателно на нивото на синтезата ДНК-аза. Например, без да се ограничаваме до една теория, експресията до това ниво може да предизвика конкуриране между компонентите в секреторния път, и като резултат - понижаване на нивото на ДНК-аза, докато експресията на hGH е висока. Други ефекти на конкуриране могат също да отклонят резултатите, така че данните от първата колона могат добре да представят действителните разлики в експресионната способност на различните вектори за ДНК-аза. Във всеки случай, ясно е, че най-малко няколко от векторите, съдържащи модифицирана сплайс-единица, излъчват ДНК-аза в по-големи количества в кратковременно изследване, отколкото съответния вектор, който има оригинална съш и ваща-е ди н и ца.

в. Стабилна експресия на ДНК-аза g от плазмид рБ\/12.ДНК-аза, рв\/13.ДНК-аза, pSVI5.flHK-a3a и pSVI6B.flHK-a3a се трансфектират в CHO-DHFR клетки в 60-милиметрова паничка с 0,1 g от pFDII. След два дни клетките се разделят на 90% и 10% в 10-сантиметрови панички. Когато се появят колонии, те се преброяват и изследват като смесени колонии. За клетка измерванията се извършват два пъти (означени с А или В в таблицата по-долу), с изключение на pSVI2.ДНК-аза, който се измерва само веднъж. В това изпитване клетъчната линия е разпределена по 2 х 10⁵ клетки в ямка от 6-ямкова плака, в 3 ml. Три дни по-късно клетки се преброяват и средата се изследва за ДНК-аза чрез ДНК-аза-ELISA, описана по-горе с параметри в границите от 0,2 до 25 ng/ml. Резултатите са представени подолу.

Вектор	pg/клетки/ден	ДНК-аза
A	В
pSVe-ДНК-аза	0,057	0,040
pSVI-ДНК-аза	0,079	0,016
pSVI2.flHK-asa	0,067
pSVI3.flHK-a3a	0,048	0,043
р5У15.ДНК-аза	0,014	0,005
pSVI6B.flHK-a3a	0,039	0,062

Пример 5« Намаляване на вискозитета на гнойна слюнка чрез рекомбинантна човешка ДНК-аза

Ефекпгот прилагането на рекомбинантна човешка ДНК-аза I и чиста говежда ДНК-аза I (Worthington) върху гнойна слюнка от пациент с цистофиброза, се определя чрез изследване на течливостта. Накратко, пробите с приблизително 100 ml слюнка се инкубират в Eppendorf - епруветки. След различни периоди от време при 37°С епруветките се обръщат и се определя способността на слюнката да протече надолу по стената на епруветката^като се използва скала от 0 (никакво движение) до 5+ (свободно изтичане надолу по стената на епруветката). Докато 293 супернатанти от трансфектирани с ДНК-аза I клетки предизвикват промени от 4 до 5+ след 30 мин инкубиране, нетрансфектираните клетъчни супернатанти нямат ефект. Специфичността се потвърждава от факта, че EDTA-^която инхибира говежда и човешка ДНК-аза-^апълно предпазва 293 супернатанти от трансфектирани с ДНК-аза I клетки от втечнена цистофиброзна слюнка. Освен това, ефекгътвърху слюнка на говеждата ДНК-аза, която е пречистена и не съдържа протеази, се изпитва за първи път. Предишна публикация съобщава всички приложения на говежда ДНК-аза, за които е известно, че е имала контаминиране на ДНК-азата с значителни количества химотрипсин и трипсин, протеиназа които проявяват активност спрямо слюнката. Чиста говежда ДНК-аза I, несъдържаща протеаза, бързо втечнява гнойната слюнка. Така, единствено чистата ДНК-аза има ефект на намаляване на вискозитета на слюнката.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на полипептид, притежаващ ДНК-азна активност, характеризиращ се с това, че включва трансформиране на клетки гостоприемници с нуклеинова киселина, кодираща полипептид, който съдържа пълна аминокиселинна последователност на човешка ДНК-аза или неин субституционен, инсерционен или делеционен вариант, имащ ДНК-азна активност, който вариант не е имуногенен за човека; култивиране на клетките гостоприемници, които експресират полипептида, имащ ДНКазна активност, и отделяне на полипептида от културата.
2. Метод за получаване на полипептид, имащ ДНК-азна активност, характеризиращ се с това, че включва трансформиране на клетки гостоприемници с нуклеинова киселина, кодираща полипептид, съдържащ аминокиселинна последователност, показана на фиг.1, която е пълна аминокиселинна последователност на човешка ДНК-аза, с изкл. на единично аминокиселинно заместване при един остатък от пълната аминокиселинна последователност на човешка ДНК-аза (фиг.1); култивиране на клетките гостоприемници, които експресират полипептида, имащ ДНК-азна активност, и отделяне на полипептида от културата.
3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че кодиращата нуклеинова киселина съдържа нуклеотидна последователност, която е показана на фиг.1, кодираща пълна аминокиселинна последователност на ДНК-аза или неин субституционен, инсерционен или делеционен вариант.
4. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 3, при който полипептидът, имащ ДНК-азна активност, се отделя от културалната среда на клетките гостоприемници.
5. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 4, в който клетката гостоприемник е еукариотна клетка.
6. Метод съгласно претенция 5, в който еукариотната клетка е човешка ембрионална бъбречна клетъчна линия.
7. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 3, при който кодиращата нуклеинова киселина съдържа нуклеотидна последователност, кодираща предпротеин.
8. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 3, при който полипептидът, имащ ДНК-азна активност, се секретира в културалната среда.
9. Метод съгласно една от претенциите от 1 до 3, при който полипептидът, имащ ДНК-азна активност, е негликозилиран.
10. Метод съгласно една от предходните претенции, при който терапевтично ефективно количество от полипептида се включва във фармацевтичен препарат, приложим за ензимно лечение.
11. Метод съгласно претенция 10, при който фармацевтичният препарат е стерилизиран.
12. Метод съгласно претенция 10 или 11, при който фармацевтичният препарат е напълно чист по отношение на протеази.
13. Метод съгласно една от претенциите от 10 до 12, в който фармацевтичният препарат е под формата на аерозол.
14. Метод съгласно една от предходните претенции, при който полипептидът, имащ ДНК-азна активност, е конюгиран с непротеинен полимер.
15. Метод съгласно претенция 14, в който полимерът е хирургическа тръбичка, избрана от групата на катетри и дренажни тръби.
16. Метод съгласно претенция 15, при който конюгатът е водоразтворим.
17. Метод съгласно претенция 15, при който полимерът е полиоксиетилен или полиалкиленгликол.
18. Състав, съдържащ клетка, трансформирана с нуклеинова киселина, кодираща полипептид, който съдържа пълна аминокиселинна последователност, показана на фиг.1, на човешка ДНК-аза или неин субституционен, инсерционен или делеционен вариант, имащ ДНК-азна активност, който вариант е неимуногенен за човека, при което клетката е култивирана в среда и има способност да експресира посочения полипептид.
19. Състав, съдържащ клетка, трансформирана с нуклеинова киселина, кодираща полипептид, съдържащ аминокиселинна последователност, която е пълна аминокиселинна последователност на човешка ДНК-аза, показана на фиг.1, с изкл. на единично аминокиселинно заместване при един остатък в пълната аминокиселинна последователност на човешка ДНК-аза, показана на фиг.1, при което клетката е култивирана в среда и има способност да експресира посочения полипептид.