JPH06502544A - 組織プラスミノーゲン活性化因子置換変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織プラスミノーゲン活性化因子置換変異体本発明は特定の組織プラスミノーゲ ン活性化因子（ｔ−ＰＡ）変異体、該変異体を製造する方法、該変異体を医薬組 成物の製造に用いる方法および組成物に関する。

ＩＩ、発明の背景および関連技術の説明プラスミノーゲン活性化因子は、プラス ミノーゲンのペプチド結合をアミノ酸残基５６１および５６２の間で開裂し、プ ラスミンに変換する酵素である。プラスミンはフィブリンを初めとする様々なタ ンパク質を分解する、活性なセリンプロテアーゼである。ストレプトキナーゼ（ 細菌タンパク質）、ウロキナーゼ（腎臓その他で合成され、元々は尿から抽出さ れた）、およびｔ−ＰＡと呼ばれるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（血管 内壁の細胞により製造される）を初めとする幾つかのプラスミノーゲン活性化因 子が同定された。

これらプラスミノーゲン活性化因子の作用機序は幾分異なっている。ストレプト キナーゼはプラスミノーゲンまたはプラスミンと複合体（コンプレックス）を形 成してプラスミノーゲン活性化活性を生じ、ウロキナーゼはプラスミノーゲンを 直接開裂し、ｔ−ＰＡはその最適な活性のためにプラスミノーゲンおよびフィブ リンの両方と相互作用する。

一部は、その高いフィブリン特異性とインビボでの強力な血餅溶解能力のために 、ｔ−ＰＡは心筋梗塞等の血管性疾患の治療のための重要な、新らしい生物学的 医薬製剤とされている。

コレンら（Ｃｏｌｌｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４．７５２．６０３号、 １９８８年６月２１日発行）は初めて実買上純粋な形のｔ−ＰＡを天然起源から 製造し、インビボ活性を試験した［リケンら（Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　 、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、　２５６：７０３５（１９８１）をも参照］。ぺ 二力ら［Ｐｅｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０１：２１４　（ １９８３）］はｔ−ＰＡのＤＮＡ配列を決定し、このＤＮＡ配列からアミノ酸配 列を推定した（米国特許第４．７６６、０７５号、１９８８年８月２３日発行を 参照）。

ヒト天然ｔ−ＰＡはそのアミノ酸位置１１７．１８４．２１８および４４８に潜 在的なＮ−結合グリコシル化部位を有する。１１７位に高マンノースのオＩＪゴ サッカリドが存在し、１８４および４４８位に複雑なオリゴサ・ツカリドが存在 する。１１７および４４８位は常にグリコジル化されていると思われるが、１８ ４位は、５０％の分子でグリコジル化されていると思われる。１８４位での部分 的なグリコジル化のパターンは、１８４位が分子の暴露されていない領域に存在 していることによるかもしれない。１８４位がグリコジル化されて（するｔ−Ｐ Ａ分子は■型ｔ−ＰＡと呼ばれ、１８４位がグリコジル化されていなｕ％ｔ−Ｐ Ａ分子はＩＩ型ｔ−ＰＡと呼ばれる。２１８位がグリコジル化された天然ｔ−Ｐ ＡＩＲ発見されていない。

ｔ−ＰＡの構造に関する研究で、該分子が５つのドメインを有することが明らか になった。各ドメインは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、プ ロトロンビン、フィブロネクチン、および上皮成長因子（ＥＧＦ）等の他のタン パク質の構造的または機能的領域との相同性を参考にして定義された。これらの ドメインはｔ−ＰＡのアミノ酸配列のＮ−末端から始まり、アミノ酸１から約４ ４までのフィンガー（Ｆ）　ドメイン（領域）、アミノ酸約４５力）ら９１まで の成長因子（Ｇ）ドメイン（ＥＧＦとの相同性に基づいて）、アミノ酸約９２か ら１７３までのクリングル−１（Ｋｌ）　ドメイン、アミノ酸約１８０から２６ １までのり１ルグルー２　（Ｋ２）　ドメイン、およびアミノ酸約２６４からア ミノ酸５２７のカルボキシ末端までのセリンプロテアーゼ（Ｐ）　ドメインと、 命名された。

これらのドメインは基本的に互いに隣あっており、その幾つかは短（１「リンカ −」領域によって連結されている。前駆体分子の不完全プロセシングによるであ ろう３個の余分な残基（Ｇ　１　ｙ　−Ａ　１　ａ−Ａ　ｒ　ｇ）がアミノ末端 に見し）だされるが、これらリンカ−領域とで、成熟ポリペプチドのアミノ酸数 は５２７となっている。

各ドメインはｔ−ＰＡ分子上のある重要な生物学的特性に寄与していると考えら れている。フィンガー領域はｔ−ＰＡのフィブリンへの高い結合親和性に重要と 考えられている。血漿クリアランス（浄化）の構造的決定基はフィンガー、成長 因子およびクリングル−１ドメインにあると考えられている。クリングル−２ド メインはりシンとの結合に関与している。セリンプロテアーゼドメインは、ｔ− ＰＡの酵素活性およびフィブリン特異性に関与している。ｔ−ＰＡは、２７５位 と２７６位の間（セリンプロテアーゼドメインにある）で開裂され、２鎖形の分 子を生じる。

個々のアミノ酸、部分領域、または完全な領域を分子から除去することで、クリ アランス（浄化）の低いｔ−ＰＡ変異体が製造された。例えば、米国特許第４゜ ９３５、２３７号（１９９０年６月１９日発効）の記載では、ｔ−ＰＡのフィン ガー領域の一部または全部を除去すると、クリアランスの低下した分子が得られ るが、フィブリン結合特性が実質上、減少していた。ブランランら［Ｂｒｖｎｅ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６３：１５９９　（１９８８）］はアミノ酸５７か ら８１の間の領域を欠失させ、得られた変異体が、血漿からのクリアランスが低 下していることを見いだした。

コレンら［Ｃｏ１１ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、　７１：２１６　（１ ９８８）コはアミノ酸６−８６（フィンガードメインと成長ドメインの一部）を 欠失させ、この変異体の兎肉での半減期が野生型ｔ−ＰＡの５分に対して１５分 であることを見いだした。同様に、カイランら［Ｋａｙｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＣ１１ｅ、、　２６３：３９７１（１９８８）コはアミノ酸 １−８９を欠失させ、この変異体の、マウス内での半減期が野生型ｔ−ＰＡの約 ２分に対して約１５分であることを見いだした。カンビニールら［Ｃａｍｂｉｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　１ １：４６８（１９８８）］はフィンガードメインと成長因子ドメインが欠失され 、３つのアスパラギングリコジル化部位が除去された変異体を構築した。この変 異体は、犬で試験したところ、野生型のものよりも長い半減期を有することが分 かった。成長因子ドメインまたはフィンガードメインのみが欠失された変異体も ウサギ、モルモットおよびラットで、クリアランスの低下を示した［ヒギンスお よびベネット（Ｈｉｇｇｉｎｓ　＆　Ｂｅｎｎｅｔ）　、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｐｈａｒｍｃｏｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ。

３０：９１　（１９９０）およびその中の文献］。

特許文献には、成長因子領域での様々な欠失も報告されている。ＥＰＯ公開第２ ４１．２０８号（アミノ酸５１−８７の欠失、およびアミノ酸５１−１７３の欠 失）。ＥＰＯ公開第２４０，３３４号（成熟天然ｔ−ＰＡのアミノ酸６７−６９ 領域の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失または置換で修飾）をも参照。

他のｔ−ＰＡの浄化率または浄化速度（クリアランスレート）および／または半 減期の改善策は、ｔ−ＰＡ分子を第２の分子との複合体（コンプレ・ソクス）の 形成テアル。例、ｔば、ＥＰＯ第３０４．３１１号（１９８９年２月２２日公開 ）に記載されているように、ｔ−ＰＡとポリエチレングリコールとのコンジュゲ ートがｔ−ＰＡの浄化率を低下すると報告されている。ｔ−ＰＡに対するモノク ローナル抗体が、その活性を低下することな（、インビボでのｔ−ＰＡの機能的 半減期を増大すると報告された（ＥＰＯ第３３９．５０５号、１９８９年１１月 ２日公開）。

様々なアミノ酸置換ｔ−ＰＡ変異体が、そのｔ−ＰＡの浄化率低下または半減期 増大の能力に関して評価された。変異体Ｒ２７５Ｅ　（天然の成熟ｔ−ＰＡの２ ７５位のアルギニンをグルタミン酸で置換）は霊長類および兎で試験したとき、 野生型ｔ−ＰＡの浄化率の約２倍遅い浄化速度を有したホッチキスら［Ｈｏｔｃ ｈｋｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏａ＋ｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　５８：４９ １　（１９８７）コ。天然の成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸６３−７２領域、特にアミ ノ酸６７位および６８位での置換はｔ−ＰＡの血漿半減期を増大すると報告され た（Ｗｏ８９／１２６８１．１９８８年１２月２８日公開）。

他の置換変異体の製造は、ｔ−ＰＡのグリコジル化部位を非グリコジル化部位に 変換することに集中している。ホッチキスら［Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、６０：２５５　（１９８８）］は、ｔ− ＰＡ分子からオリゴサツカリド残基を選択的に除去し、これら残基の除去がウサ ギで試験したとき、ｔ−ＰＡの浄化速度を減少することを示した。１１７位の高 マンノースオリゴサ・ツカリドを酵素エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ ーゼＨ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）で除去すると浄化速度が約２倍減少した。過ヨウ素酸ナ トリウムによるほぼ全オリゴサ・ツカリドの酸化により野生型ｔ−ＰＡの浄化速 度の約３倍減少がみられた。これらの研究者（ま、また、１１７位のグリコジル 化を阻止するためにｔ−ＰＡ変異体Ｎ−１１７０（天然の成熟型ｔ−ＰＡの１１ ７位のアスパラギンがグルタミンで置換されたもの）を生産した。この変異体の 浄化速度も野生型ｔ−ＰＡのそれよりも低かった。ＥＰ２３８．３０４１．９８ ７年９月２３日公開およびＥＰ２２７．４６２．１９８７年７月１日公開をも参 照。

循環中の半減期が長く、浄化速度が遅いｔ−ＰＡ変異体を生産する他の試みは、 分子にグリコジル化部位を付加することであった。この試みの例として、６０． ６４．６５．６６．６７．７８．７９．８０．８１．８２、および１０３位の内 、あるものの位置、またはその近辺でグリコジル化部位を作るのに適当なアミノ 酸で置換さｔした（ＷＯ８９／１１５３１．１９８９年１１月３０日公開参照） 。

ヒトｔ−ＰＡ分子の修飾のための他の鍵となる位置は、プロテアーゼドメインを 通して存在しており、例えば、２７５位（ＥＰ２３３．０１３．１９８７年８月 １９日公開、およびＷＯ３７１０４７２２，１９８７年８月１３日公開）；２７ ７位（ＥＰ２９７．０６６．１９８８年１２月２８日公開、ＷＯ３６１０１５３ ８（米国特許４，７５３．８７９と同等）：およびＥＰ２０１，１５３．１９８ ６年１１月１２日公開）　、４１４−４３３位（ＥＰ３５１，２４６．１９９０ 年１月１７日公開）および２９６−２９９．４１６−４１８位、および４２６． ４２７．４２９．４３０の各位置（Ｗ０９０１０７９８．１９９０年３月２２日 公開）である。２９６−２９９の全領域を含む突然変異は、ｔ−ＦＡ分子にフィ ブリン特異性や酵素前駆体性等のある種の望ましい性質を付与するが、フィブリ ン特異性がなお一層高い分子が有用である。ｄ２９６−３０２ｔ−ＰＡ、Ｒ３０ ４Ｓｔ−ＰＡ、およびＲ３０４Ｅｔ−ＰＡを初めとする、プロテアーゼ領域内の 変化を有するヒトｔ−ＰＡのセルピン（ｓｅｒｐｉｎｅ）耐性変異体がマジラン ら［Ｍａｄｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３９ニア２１−７２ ４　（１９８９）］により開示された。同じ出版物のＤａｇｍｅｒ　Ｒｉｎｇｅ の記事も参照されたい。

ワレ：ｚ（ｆａｌｌｅｎ）のＥＰ２５３．５８２はＣｙｓ　（４０９）からＣｙ ｓ　（４４１）の間の１またはそれ以上の位置で開裂されたとき、チモーゲン的 性質を表す修飾ｔ−ＰＡを開示した。開裂は、１本領ヒトｔ−ＰＡの好ましくは キモトリプシンによるタンパク質加水分解的または適当な化学処理で達成できる 。開裂された分子は次いでプラスミンの存在下で活性化されることができ、この ようにして２重に開裂された生成物が形成される。

スミスら（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　ｆ０８４１０１９６０）はアシル基のよ うなある種の基類を導入することにより、線維素溶解的に活性な糖タンパク質の 線維素溶解活性に必須と思われる触媒部位を破壊することを目指した。

プラスミノーゲン活性化因子およびその第２世代誘導体に関する総説が／％リス によりなされた［Ｈａｒｒｉｓ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 　１：４４９−４５８（１９８７）コ。他のｔ−ＰＡの総説には、以下のものが あるしバネコックら（Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｆｉｂｒｉ ｎｏｌｙｓｉｓ、　２：１２３−１３２　（１９８８）　；ロスら（Ｒｏｓｓ　 ｅｔ　ａｌ、　）　、　ｉｎ　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ@ｉｎ　Ｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　２３．　Ｃｈａｐｔｅｒ　１ ２（１９８ｇ）およびヒギンスおよびベネ、ット（Ｈｉｇｇｉｎｓ　ａｎｄ　Ｂ ｅｎｎｅｔｔ）前掲］。

野生型ｔ−ＰＡに比較して高い血餅溶解活性を有すると同時に、同等またはそれ 以上のフィブリン特異性を有するｔ−ＰＡ分子を提供することが望ましい。

従うて、本発明の１つの目的は、血餅溶解活性およびフィブリン特異性に関して 劇的に改良された治療および薬剤特性を有するｔ−ＰＡ分子を提供することにあ る。この目的および他の目的は当業者には明らかになるだろう。

発明の要約 従って、本発明は、野生型ｔ−ＰＡの２９９位のアルギニンをアスパラギン酸で 置換したｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体を提供するものである。

他の実施態様では、本発明は上記変異体をコードするＤＮＡ配列、このＤＮＡ配 列を形質転換された宿主細胞内で発現し得る複製可能な発現ベクター、形質転換 された細胞、およびｔ−ＰＡ変異体をコードするＤＮＡが発現されるように宿主 細胞を培養することからなる方法に関する。

また他の実施態様では、本発明は治療上有効な量のｔ−ＰＡ変異体を、薬剤的に 許容される担体との混合物として含有する血管症状または疾患の治療のための組 成物に関する。

また他の実施態様では、本発明は、有効量のｔ−ＰＡ変異体を哺乳類に適用する ことからなる、哺乳類での血管症状または疾患を治療する方法を提供するもので ある。

さらに他の実施態様では、本発明は治療上有効な量のｔ−Ｐ、Ａ変異体を、薬剤 的に許容される担体との混合物として含有するフィブリン沈着物または付着（接 着）物の形成または再形成の予防のための組成物を提供するものである。

また他の実施態様では、本発明は、有効量のｔ−ＰＡ変異体を哺乳類に適用する ことからなる、哺乳類でのフィブリン沈着物または付着物の形成または再形成の 予防のための方法に関する。

図面の簡単な説明 図１はｐＲＫ、ｔ−ＰＡの構築のダイアグラムである。ヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡを ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａ１ｌで消化し、真核性発現ベクターｐ　ＲＫ　７　（ ”：ｙＨ１ｎｄＩＩＩとＢａｔＩとの間に挿入した。

ｒｔ−ＰＡＪ、［ヒトｔ−ＰＡＪ、および「ヒト組織プラスミノーゲン活性化因 子」という語句は、典型的に５つのドメイン（フィンガー、成長因子、クリング ル−１、クリングル−２およびプロテアーゼの各ドメイン）構造を有するヒトで なおも機能するならば、ドメインの少ない物をも含む。少なくとも、ｔ−ＰＡは プラスミノーゲンをプラスミンに変換し得るプロテアーゼドメインと、少な（と も、部分的にフィブリンとの結合に関与すると信じられているＮ−末端領域とか らなる２つの機能的な領域からなる。従って、これらの語句はポリペプチドのア ミノ酸配列の部分として、少なくともこれらの機能的なドメインを含有するポリ ペプチドを包含する。生物学的に活性な形のｔ、　−Ｐ　Ａは、ｔ−ＰＡの天然 起源のものでなくとも、組換え細胞培養系により、ｔ−ＰＡ分子の２つの機能的 なドメイン、さもなくばｔ−ＰＡ起源固有のｔ−ＰＡの任意の他の部分とからな る形で製造し得るかもしれない。各個体のｔ−ＰＡのアミノ酸配列における１ま たはそれ以上のアミノ酸配列の相違によって分かるように、天然のアレル変異体 が存在し、それが個体間で起こり得ることは理解できるであろう。

「野生型ｔ−ＰＡＪまたは「天然型ｔ−ＰＡＪという語句は、天然配列ヒトｔ− ＰＡ、即ち、米国特許第４．７６６．０７５　（１９８８年８月２３日発行）で 報告されたｃＤＮＡによってコードされているものを指す。ｔ−ＰＡ分子内のア ミノ酸部位の番号または位置は米国特許第４，７６６．０７５号に従って記され ている。ｔ−ＰＡは任意の天然起源のものでよく、ヒトのような様々な動物の対 応するタンパク質を含んでいてよい。加えて、ｔ−ＰＡは任意の組換え発現系、 例えば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）またはヒト胚腎２９３細 胞等、により得られたものでもよい。

「アミノ酸」および「アミノ酸類」という語句はあらゆる天然に存在するＬ−α −アミノ酸を指す。この定義はノルロイシン、オルニチン、およびホモンステイ ンを包含することを意図する。アミノ酸は１文字または３文字定義により表され る。

Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸　１１ｅ　Ｉ　イソロイシンＴｈｒ　Ｔ　スレオニ ン　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシンＳｅｒ　Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　 Ｅ　グルタミン酸　Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｉ ｓ　ＨヒスチジンＧｌｙ　Ｇ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リシンＡｌａ　Ａ　アラ ニン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃシスティン　ＴｒｐＷ）リブトファンＶ ａｌ　Ｖ　バｌＪ：／　Ｇｌｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メチオニン　Ａｓ ｎ　Ｎ　アスパラギンこれらのアミノ酸は化学的組成およびそれらの側鎖の性質 に従い、分類される。

それらは広義には２つの群、荷電および非荷電、に分類される。これらの群の各 々はより正確なアミノ酸の分類のためにさらにサブグループに分類される。

「変化」、「アミノ酸配列の変化」、「変異体」および「アミノ酸配列変異体」 という語句は、天然のｔ−ＰＡに比較してそのアミノ酸配に何かの変化を有する ｔ−ＰＡ分子を指す。通常、変異体は天然ｔ−ＰＡに対し、少なくとも８０％相 同性を有し、好ましくは、天然ｔ−ＰＡに対し少なくとも約９０の相同性を有す る。本発明の範囲内に包含されるｔ−ＰＡのアミノ酸配列変異体は２９９位に置 換を有し、かつ所望により、他の幾つかの位置での置換、欠失および／または挿 入をも有する。

置換ｔ−ＰＡ変異体は、天然ｔ−ＰＡ配列から少なくとも１個のアミノ酸残基が 欠失され、異なるアミノ酸がその同じ位置に挿入されている。置換は単一（分子 のただ１個のアミノ酸が置換されている）か複数（同じ分子の２個又はそれ以上 のアミノ酸が置換されている）のいずれでもよい。

ｔ−ＰＡ分子の実質的な活性の変化は天然のアミノ酸と電荷および／または構造 が有意に異なる側鎖を有するアミノ酸による置換で得られる。この型の置換はポ リペプチドバックボーンの構造および／または置換領域の分子の電荷または疎水 性に影響を与えると予測される。

ｔ−ＰＡ分子の活性のゆるやかな変化は、天然のアミノ酸と電荷および／または 構造が同様な側鎖を有するアミノ酸による置換で得られる。この型の置換は、保 存的置換と呼ばれ、ポリペプチドバックボーンの構造または置換領域の分子の電 荷または疎水性を実質的に変化しないと予測される。

挿入的なｔ−ＰＡ変異体は、天然ｔ−ＰＡ分子の特定のアミノ酸の直ぐ隣に１ま たはそれ以上のアミノ酸が挿入されたものである。アミノ酸の直ぐ隣ということ は、アミノ酸のαカルボキシまたはαアミノ官能基のいずれかに連結しているこ とを意味する。挿入は１またはそれ以上のアミノ酸であってよい。通常、挿入は １または２個の保存的なアミノ酸からなる。挿入部位に隣接するアミノ酸と電荷 および／または構造が同様のアミノ酸を保存的であると定義する。あるいは、本 発明は、挿入部位に隣接するアミノ酸と電荷および／または構造において実質上 翼なるアミノ酸の挿入をも包含する。

欠失的な変異体とは、天然ｔ−ＰＡ分子から１またはそれ以上のアミノ酸が除去 されたものである。通常、欠失変異体はｔ−ＰＡ分子の特定領域の１または２個 のアミノ酸の欠失を有するであろう。

本出願を通してｔ−ＰＡアミノ酸配列を記述するのに用いる表記法について、以 下に説明する。ｔ−ＰＡのポリペプチド鎖内の特定のアミノ酸の位置は番号で示 す。番号は、米国特許第４，７６６．０７５．１９８８年８月２３日発行に記載 の成熟、野生型ヒトｔ−ＰＡポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸の位 置による。本出願では、ｔ−ＰＡ変異体において、実際の残基は、分子内の欠失 または挿入変異により、そのような番号ではないが、同様の位置の残基を、これ らの番号で示す。このことは、例えば、部位特異的な分子への欠失又は挿入で起 こるであろう。アミノ酸は１文字表記で表される。置換されたアミノ酸は、野生 型アミノ酸を、そのアミノ酸のポリペプチド鎖内の位置を示す番号の左側に示し 、置換されたアミノ酸をその番号の右側に示すことで明らかにする。

例えば、ｔ−ＰＡの２９９位のアルギニン（Ｒ）をアスパラギン酸（Ｄ）で置換 したとき、Ｒ９９Ｄと表す。欠失変異体は、アミノ酸残基と欠失のいずれもの端 の位置とで表し、ギリンヤ文字デルタ「△」を指示されたアミノ酸の左側に配す る。例えば、アミノ酸２９６−２９９の欠失を有するｔ−ＰＡ変異体は、Δに２ ９６−Ｒ２９７−Ｒ２９８−Ｒ２９９ｔ−ＰＡと表され、ここにに１ＨおよびＲ は、それぞれアミノ酸すンン、ヒスチジンおよびアルギニンを表す。例えばに２ ９６単独の欠失は△に２９６と表される。挿入ｔ−ＰＡ変異体は括弧「［］」を 挿入されたアミノ酸の周りに配すと共に、挿入のいずれもの側のアミノ酸の位置 で示す。例えば、９４位グルタミン酸と９５位アスパラギン酸との間にアミノ酸 アラニン（Ａ）を挿入すると、Ｅ９２　［Ａｌ　Ｄ９５となる。読み易いように 、単一分子内に存在する複数の変異を分離するのにカンマ巳」を用い、幾つかの ｔ−ＰＡ変異体を一緒に記載する場合には、構築された個々のｔ−ＰＡ変異体を 分離するのに、セミコロン「：」を用いる。

「血餅溶解活性」という表現は、精製フィブリンまたは血漿のいずれから導かれ たにしても、以下の分析法による、ｔ−ＰＡ分子の血餅を溶解する活性を指す。

「をコードするＤＮＡ配列」、「をコードするＤＮＡＪおよび「をコードする核 酸配列」という語句は、デオキシリポ核酸の鎖に沿った、デオキシリボヌクレオ チドの順序または配列を指す。これらデオキシリボヌクレオチドの順序がポリペ プチド鎖に沿ったアミノ酸の配列を決定する。このように、ＤＮＡ配列はアミノ 酸配列をコードする。

「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」という語句は通常２本鎖の ＤＮＡ片を指し、それには１片の外来性ＤＮＡが挿入されていてもよい。外来性 ＤＮＡは天然には宿主細胞に見いだされないＤＮＡである、ヘテロローガス（異 種）ＤＮＡと定義する。ベクターは外来性または異種ＤＮＡを適当な宿主細胞に 運搬するために用いられる。宿主細胞内で宿主細胞の染色体ＤＮＡと独立してベ クターが複製することができ、ベクターの幾つかのコピーおよびその挿入された （外来性’）ＤＮＡが生成される。加えて、ベクターは外来性ＤＮＡをポリペプ チドに翻訳させるに必要な要素をも有する。このようにして外来性ＤＮＡにコー ドされているポリペプチド分子が多数、迅速に合成される。

「形質転換された宿主細胞」および「形質転換された」という語句は、ＤＮＡを 宿主細胞に導入することを意味する。細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、それは原核 性または真核性細胞であってよい。代表的な原核性宿主細胞には大腸菌の様々な 株が含まれる。代表的な真核性宿主細胞には、チャイニーズノλムスター卵巣細 胞またはヒト肝腎２９３細胞等の哺乳類細胞である。導入されるＤＮＡ配列は、 宿主細胞と同じ種または宿主細胞と異なる種から得たものでよく、あるいはそれ はある外来性ＤＮＡと、ある同種（ホモローガス）ＤＮＡの／Ｓ（ブ１ルソドで あつ本発明の変異体は野生型ｔ−ＰＡの２９９位に存在するアルギニンの代わり に、アスパラギン酸を有する必要がある。このＲ２９９Ｄ変異体は、その活性に 実質的な影響を与えないならば、他のアミノ酸置換、欠失または挿入を有してい ても良い。そのような可能な変異の例には、分子の浄化を減少する可能性のため の、１０３位のスレオニンまたは６７位のチロシンのアスパラギンによる置換、 あるいは１０５位のセリンのアスパラギンによる置換と１０７位のアラニンのセ リンによる置換の組み合わせ（Ｗ○８９／１１５３１　１９８９年１１月３０日 公開参照）、および／または１１７位または１８４位のアスパラギンの、アラニ ンまたはセリン、または好ましくはグルタミンによる置換がある。

さらに、本発明の分子は、チモーゲン性をも含めて、他の望ましい性質を付与す るために、ある位置で置換または欠失があってもよい。ヒトｔ−ＰＡでのこれら の位置には、例えば、それぞれ４１６−４１８位のりシン、ヒスチジンおよびグ ルタミン酸それぞれのアラニンによる置換、９４位のグルタミン酸のアラニンに よる置換および／または９５位のアスパラギン酸のアラニンまたはグリシンによ る置換、および位置４２６．４２７．４２９および４３０のグルタミン酸、アル ギニン、リシン、およびグルタミン酸のアラニンによる置換が含まれる（例、Ｗ ０９０１０２７９８．１９９０年３月２２日公開）。

適当な複数変異の例を以下に挙げるｏ　Ｒ２９９０，Ｔｉ０３Ｎ　ｔ−ＰＡ；　 Ｒ２９９Ｄ、Ｙ６７Ｎ　ｔ、ＰＡ；Ｒ２９９Ｄ、Ｎ１１７Ａ　ｔ−ｐＡ：　Ｒ２ ９９Ｄ、ＮＮ７Ｓ　ｔ−ＰＡ；　Ｒ２９９Ｄ、ＮＮ７０　ｔ・ＰＡ：　Ｒ２９９ Ｄ、Ｎ＋８４Ａ@ｔ、ＰＡ； Ｒ２９９Ｄ、Ｎ＋８４５＋−ＰＡ；Ｒ２９９Ｄ、Ｎ　１８４０１−ＰＡ：Ｒ２９ ９Ｄ、Ｔｌ０３Ｎ、Ｎ　１＋７Ａτ−ＰＡ、Ｒ２９９Ｄ、ＹU７Ｎ、Ｎ１１７Ａ ＋、ＰＡ；　Ｒ２９９Ｃ１，丁１０３Ｎ、Ｎ＋　＋７５　ｔ−ＰＡ；　Ｒ２９９ Ｄ、Ｙ６７Ｎ、Ｎｉ　１７Ｓ　ｔ□ＰＡ：　Ｒ２９９Ｄ、Ｔ奄O３Ｎ、Ｎｉ　１ ７０　ｒ−ＰＡ： Ｒ２９９Ｄ、Ｙ６７Ｎ、Ｎｉ＋７０　トＰＡ：　Ｒ２９９Ｄ、Ｔｉ０３Ｎ、Ｎ＋ ８４Ａ　＋−ＰＡ；　Ｒ２９９Ｄ、Ｙ６７Ｎ、Ｎ＋８４Ａ　煤|ＰＡ。

Ｒ２９９Ｄ、Ｔｉ０３Ｎ、Ｎ＋８４Ｓ　ｔ−ＰＡ；　Ｒ２９９Ｄ、Ｙ６７Ｎ、Ｎ ｉ８４Ｓ　ｔ・ＰＡ：　Ｒ２９９Ｄ、Ｔｉ０３Ｎ、Ｎ＋８４O　ｔ−ｐＡ； Ｒ２９９Ｄ、Ｙ６７Ｎ、Ｎ＋８４Ｑ　ｔ−ＰＡ：　Ｒ２９９Ｄ、Ｄ９５Ｇ　ｔ− ＰＡ；　Ｒ２９９Ｄ、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ　ｔ・ＰＡ、Ｒ２９９Ｄ、５１０５Ｎ 、Ａ１０７Ｓ　ｔ−ＰＡ、Ｒ２９９Ｄ、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ、Ｔｉ０３Ｎ　ｔ− ＰＡ：　Ｒ２９９Ｄ、Ｅ９４Ａ、ＤX５Ａ、Ｎ＋１７０ トＰＡ、　Ｒ２９９Ｄ、Ｓ＋０５Ｎ、Ａｌ０７Ｓ、Ｅ９４Ａ、Ｄ９５Ａ　Ｉ−Ｐ Ａ；　Ｒ２９９Ｄ、５１０３Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ｎ１１７０　{−ＰＡ。

Ｒ２９９Ｄ、に４＋６Ａ、＋４１７Ａ、Ｅ４１８Ａ　＋−ＰＡ；日２９９Ｄ、ε ４２６Ａ、Ｒ４２７Ａ、に４２９Ａ、Ｅ４３０Ａ　ｔ・ＰＡＢ、変異体の構築 本発明のｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体は好ましくは野生型ｔ−ＰＡをコードする ＤＮＡ配列の突然変異により構築する。一般に、特定の領域または部位が突然変 異誘発における標的となるので、これを達成するための一般的な方法は、部位特 異的突然変異誘発と称される。突然変異は、制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡを 特定の位置で開裂する）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解する）および／またはポ リメラーゼ（ＤＮＡを合成する）等のＤＮＡ修飾酵素類を用いてなされる。

１、単純な欠失および挿入 ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化の後、連結（リゲーション、ｌｉｇａｔｉ ｏｎ）することが、サムプルツクら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　）のＭ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｎｕａｌ 、　５ｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ■唐刀A　Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ　（１９８９）の１５．３節に記載されているように欠失の生成に用い られる。この方法の使用には、外来性ＤＮＡをプラスミドベクターに挿入するこ とが好ましい。外来性（挿入される）ＤＮＡとベクターＤＮＡの両者の制限地図 が手に入るか、外来性ＤＮＡとベクターＤＮＡの両者の配列が知られていなけれ ばならない。

外来性ＤＮＡはベクターにはない唯一の（ユニークな）制限部位を有する必要が ある。従って、外来性ＤＮＡを、適当な制限エンドヌクレアーゼを該酵素の供給 者の指示に従った条件下で用いて、これらユニークな制限部位の間で消化するこ とで欠失を起こす。もしも用いた制限酵素が平滑末端または適合末端（ｃｏｍｐ ｅｔｉｔｉｖｅ　ｅｎｄ）を生じたら、サムプルツクら（前掲）の１．６８節に 記載のように、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのようなりガーゼを用い 、混合物をＡＴＰおよびリガーゼバッファーの存在下、１６℃で１−４時間イン キュベートすることで末端を直接連結させる。もしも末端が平滑でないときは、 ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントまたはバクテリオファージＴ４Ｄ ＮＡポリメラーゼを用い（これらのいずれも消化されたＤＮＡの突出１本鎖末端 を充填するのにデオキシヌクレオチドトリホスフエートを必要とする）、まずそ れらを平滑末端にする必要がある。あるいは、末端を、ヌクレアーゼＳ１または ヤエナリ（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（これらはいずれもＤＮＡの突出 した１本鎖を切り戻す作用をする）を用いて平滑末端にしてもよい。次いでＤＮ Ａをリガーゼを用いて連結する。得られた分子はｔ−ＰＡの欠失変異体である。

同様の戦略を用いてサムプルツクら（前掲）の１５．３節に記載のごと（挿入変 異体を構築することができる。外来性ＤＮＡを唯一の制限部位（群）で消化した 後、オリゴヌクレオチドを外来性ＤＮＡの切断された部位に挿入する。オリゴヌ クレオチドは、挿入が望まれるアミノ酸をコードすると共に、直接連結が可能な ように、消化された外来性ＤＮＡに適合する５°および３′末端を有するもので ある。

２、　オリゴヌクレオチドに仲介される突然変異誘発オリゴヌクレオチド−指向 突然変異誘発は本発明の置換変異体の調製に適した方法である。それはまた、本 発明の欠失および挿入変異体の調製にも好都合に用いることができる。この技術 はアデルマンら（Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ、　２：１８３（１ ９ｇ３））に記載されているように、当業者に周知である。

ｔ−ＰＡ分子に２またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換をもた らすのに、一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチドを用 いる。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異を突然変異をコードするヌクレオ チドのいずれかの側のヌクレオチドと完璧に適合する１２から１５のヌクレオチ ドを有している。これにより、オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡ鋳型分子と適 切に／ゾブリダイズする。このオリゴヌクレオチドは、フレア（Ｃｒｅａ）ら［ Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、　７５．５７６５（１９ ７８）］に記載されている手法などの当業界周知の手法によって容易に合成する ことができる。

ＤＮＡ鋳型分子は、野生型ｔ−ＰＡのｃＤＮＡ挿入体を有する１本領形ベクター である。この１本鎖の鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販されて いるＭ１３ａ＋ｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９が適当である）、又はベイラ（Ｖｅｉ ｒａ）ら［Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３．３（１９８７）］に記載されている１本領ファージ 複製起点を含有するそれらのベクターのいずれかから誘導されるベクターによっ てのみ作成することができる。従って、１本鎖鋳型の創製のために、突然変異し ようとするｃＤＮＡ　ｔ−ＰＡをこれらのベクターの１つに挿入しなければなら ない。１本鎖の鋳型の生産はサムプルツクら（前掲）の４．２１−４．４１項に 記載されている。

野生型ｔ−ＰＡを突然変異するためには、適当なハイブリダイゼーション条件下 でオリゴヌクレオチドを１本鎖ＤＮＡ鋳型分子とアニーリングする。次いで、Ｄ ＮＡポリマー化酵素、通常は大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラー ゼＩのクレノー断片を加える。この酵素は、突然変異を有するＤ　Ｎ　Ａ鎖の合 成の完了にプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用する。従って、ＤＮＡの １つの鎖がベクターに挿入されている野生型ｔ−ＰＡをコードしており、第２の ＤＮＡの鎖が同じベクターに挿入された突然変異形のｔ−ＰＡをコードしている ヘテロ二重ラセン分子が形成される。次いで、このへテロ二重ラセン分子を適当 な宿主細胞、通常はＥ、ｃｏｌｉＪＭｌｏｌなどの原核細胞に導入する。細胞を 増殖させた後、それをアガロース平板にプレートし、３２−Ｐで放射能標識した オリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングし、突然変異ｔ−ＰＡ を含有するコロニーを同定する。

そのようなコロニーを選択し、ｔ−ＰＡ分子に突然変異が存在しているかを確認 するため、ＤＮＡの配列を決定する。

１つ以上のアミノ酸が置換されている突然変異体は、幾つかの方法の中の１つの 方法によって生成させることができる。ポリペプチド鎖中に数個のアミノ酸が近 接して一緒に配置される場合は、それら所望のアミノ酸置換のすべてをコードす る１つのオリゴヌクレオチドを使用して同時に突然変異することができる。しか し、アミノ酸が互いに若干距離をおいて位置している場合（例えば、１０アミノ 酸以上で分割されている場合）は、所望の変化をすべてコードしている単一のオ リゴヌクレオチドを製造することは比較的困難である。代わりに、２者択一の２ 方法のいずれかを使用すればよい。第１方法では、置換させる各アミノ酸のオリ ゴヌクレオチドを別々に創製する。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを１本 鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングすれば、この鋳型から合成された第２のＤＮ Ａ鎖は所望のアミノ酸置換をすべてコードすることになる。別の方法は、２又は それ以上の突然変異誘発工程によって所望の突然変異体を生産することに関する 。第１工程は単一突然変異について記載しているとおりの方法である：野生型ｔ −ＰＡ　ＤＮＡを鋳型として使用し、第１の所望のアミノ酸置換（群）をコード するオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニーリングし、次いでヘテロ二重ラセン ＤＮＡ分子を生成させる。第２の突然変異誘発工程は、突然変異誘発の第１工程 で調製した突然変異ＤＮＡを鋳型として使用する。従って、この鋳型は既に１つ 又はそれ以上の突然変異を含有している。次いで、付加的な所望のアミノ酸置換 （群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型とアニーリングすると、 得られるＤＮＡの鎖は、第１及び第２工程の突然変異誘発の両者に由来する突然 変異をコードしている。この得られたＤＮＡは、第３の突然変異誘発工程におけ る鋳型として使用することができ、以後同様である。

ｔ−ＰＡ変異体をコードするＤＮＡをポリペプチドとして発現させるため、この ＤＮＡをベクターから切り取り、真核性宿主細胞での発現にとって適切な発現ベ クターに挿入する。長期の安定なｔ−ＰＡ生産のためには、チャイニーズハムス ター卵巣（ＣＨＯ）細胞が好ましい。しかし、本発明はＣＨ○細胞におけるｔ− ＰＡ変異体の発現に限定されるものでなく、多くの他の型の細胞を用いることが できることが知られており、特に、実験目的でｔ−ＰＡ変異体を一時的にしか発 現させる必要がない場合などはそうである。

本発明の最初のクローニング工程にとっては原核生物が好ましい。原核細胞は、 ＤＮＡの迅速な大量生産、部位特異的突然変異に使用される１本鎖ＤＮＡの鋳型 の生産、多くの突然変異体の同時スクリーニング、及び生成された突然変異体の ＤＮＡの配列決定にとって特に有用である。適当な原核生物宿主細胞には、Ｅ、 ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．４４６）、Ｅ、 ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（＾ＴＣＣＮｏ、　２７．３２５）、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ　 １７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．５３７）、及びＥ、ｃｏｌｉ　Ｂなどがあ る。

しかし、ＨＢＩＯＩ、ＪＭｌｏｌ、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９などの Ｅ、ｃｏｌｉの他の多くの株、並びに他の多くの原核生物の種及び属も同様に使 用することができる。

原核生物はＤＮＡ配列の発現のためにも宿主として使用できる。上記に挙げたＥ 、ｃｏｌｉ株のほか、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ）などのバシラス属、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｉ）又はセラチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　 ｍａｒｃｅｓａｎｓ）などの他の腸内細菌、及び種々のシュードモナス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ）種などもすべて宿主として使用できる。

これらの宿主は、その宿主細胞と適合する種由来のレプリコン及び制御配列を含 有するプラスミドベクターと共に使用する。そのベクターは通常、複製部位、形 質転換された細胞内において表現型の選択性を付与できるマーカー遺伝子、１つ 又はそれ以上のプロモーター、及び外来遺伝子を挿入するための幾つかの制限部 位を含有するポリリンカー領域を含有する。Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換するために 通常使用されるプラスミドには例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９ 、ｐＵｃ１１８、ｐＵＣ１１９、及びブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ）Ｍ　１３などがあり、これらはすべてサムプルツクら（前掲）の１．１２−１ ．２０項に記載されている。しかし、多（の他の適切なベクターも同様に利用可 能である。これらのベクターはアンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性を コードする遺伝子を含有しており、それによりこれらのベクターによって形質転 換された細胞はそれらの抗生物質の存在下に増殖させることが可能となる。

原核性ベクターに最も普通に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマー ゼ（ペニシリカーゼ）及びラクトースプロモーター系［チャン（Ｃｈａｎｇ）ら のＮａｔｕｒｅ３７５、６１５（１９７８）　；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら の５ｃｉｅｎｃｅ　１９８．１０５６（１９７７）　：ゲラデル（Ｇ。

ｅｄｄｅｌ）らのＮａｔｕｒｅ　２８１，５４４（１９７９）］、並びにトリプ トファン（ｔｒｐ）プロモーター系［ゲラデルらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　８．４０５７（１９８０）　；　Ｅ　Ｐ　Ｏ出願公開第３６．７７ ６号コ、並びにアルカリホスファターゼ系が挙げられる。これらは最も普通に使 用されるものであるが、他の微生物系プロモーターも利用されており、それらの ヌクレオチド配列に関する詳細が開示され、当業者ならば、それらをプラスミド ベクターに機能的に連結することができる［シーベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉ ｓｔ）らのＣｅ１ｌ　２０．２６９（１９８０）を参照］。

２、真核性微生物 本発明を実施するには酵母などの真核性微生物が使用できる。パン酵母、す・ソ カロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）力（普通（こ使用される真核微生物であるが、他の幾つかの株も利用する ことができる。サツカロマイセスにおける発現ベクターとしては、プラスミドＹ Ｒｐ７が普通に使用される［スチンクコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｎｂ）らのＮａｔ ｕｒｅ　２８２：３９（１９７９）　：キックスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）らの Ｇミドは、トリプトファン環境下での増殖能を欠いている酵母の突然変異株、例 えばＡＴＣＣＮｏ、　４４．０７６株又はＰＥＰ４−１株［（ンヨーンズ（Ｊｏ ｎｅｓ）のＧｅｎｅｔｉｃｓ、　１１１５：１２（１９７７））］に選択マーカ ーを付与できるｔｒｐｌ遺伝子を含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴とし てｔｒｐｌ欠損が存在することので、トリプトファンの不存在下で増殖させるこ とにより形質転換を検出する上で有効な環境が提供される。

酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキ ナーゼのプロモーター（ヒフ　ラマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）らのＪ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、　２５５：２０７３（１９８０）］、又はエノラーゼ、グリセル アルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３− ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセホスフェートイソ メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグある。適当な発現プラスミドを 構築するに当たっては、これらの遺伝子に付随する終止配列も、発現させようと する配列の３“側で発現ベクターに連結させ、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終 止機能を付与する。培養条件によって転写が制御されるという付加的な利点を有 している他のプロモーターには、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ １酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、及び上記のグリセルアルデ ヒド−３−リン酸脱水素酵素及びマルトースとガラクトースの利用に関与する酵 素、のプロモーター領域がある。酵母に適合するプロモーター、複製起点及び終 止配列を含有するプラスミドベクターが好適である。

３、真核性多細胞生物 本発明を実施するためには、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使用するこ とができる。を推動物又は無を推動物培養のいずれの由来であっても許容できる が、を推動物細胞培養、特に哺乳動物培養が好ましい。適当なセルライン（細胞 系）としては例えば、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶＩライン［Ｃ ０８−７、ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１コニヒト腎胚ライン２９３　Ｓ　［Ｇｒａ ｈａｍら、　Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、。

３６・５９（１９７７）］　；幼若ハムスター腎細胞［ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ 　１０コ：チャイニーズハムスター卵巣細胞［ウララブおよびチャッシン（Ｌｌ ｒｌａｂ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ）　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

６、ＡＴＣＣＣＣＬ　７０コ；アフリカミドリザル腎細胞［ＶＥＲＯ−７６、Ａ ＴＣＣＣＲＬ　１５８７コ；ヒト子宮癌細胞［ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２］ 　；イヌ腎細胞［ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４コニバツフアロー・ラット肝 細胞［ＢＲＬ　３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２］　；ヒト肺細胞［Ｗ１３８、 　ＡＴＣＣＣＣＬ　７５コ；ヒト肝細胞［Ｈｅ　ｐ　Ｇ２．　ＨＢ　８０６５］ 　ニアウス乳がん細胞［ＭＭＴ　０６０５６２．ＡＴＣＣＣＣＬ　５１コニラツ ト肝がん細胞［ＨＴＣ，Ｍｌ、５４．ポウマーは普通、（要すれば）複製起点、 発現すべき遺伝子の前に位！するプロモーター、リポソーム結合部位、ＲＮＡス プライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ一部位のＤＮＡ配列 を含有している。

哺乳動物発現ベクターに使用されるプロモーターは、ウィルス起源のものが多い 。これらウィルスプロモーターは通常、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２ 、及び最も頻繁にはアカゲザルウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。Ｓ■ ４０ウィルスは初期及び後期プロモーターと呼ばれる２つのプロモーターを含有 する。これらのプロモーターはいずれもウィルスの複製起点をも含有する１つの ＤＮＡ断片として該ウィルスから容易に入手されるので、特に有用である［ファ イア（Ｆｉｅｒｓ）らのＮａｔｕｒｅ、　２７３：１１３（１９７８）］。また 、このウィルスの複製起点内に位置するＨｉｎｄＩ［［部位からＢｇｌＩ部位に 伸びる約２５０ｂｐ配列を含有することを条件として、それよりも小さい、又は 大きなＳＶ４０　ＤＮＡ断片を使用することもできる。

あるいは、形質転換のために選択する宿主セルラインと適合することを条件とし て、外来遺伝子が天然に伴っているプロモーター（同種プロモーター）を使用し てもよい。

複製起点は、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ 、ＢＰＶ）などの外因性供給源から入手することができ、それをクローニングベ クターに挿入すればよい。あるいは、複製起点は宿主細胞の染色体における複製 機構によって与えられ得る。外来遺伝子を含有するベクターが宿主細胞の染色体 に組み込まれるなら、後者で十分である場合が多い。

形質転換された細胞培養によって満足のいく量のｔ−ＰＡが生産される。しかし 、第２のコード化配列を使用すれば、さらに生産レベルを向上させることができ る。この第２のコード化配列は通常、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含有 している。野生型のＤＨＦＲは正常では化学物質メトトレキサート（ＭＴＸ）に よって阻害される。細胞内のＤＨＦＲ発現レベルは、培養宿主細胞に加えられる ＭＴＸの量に依存して変動する。ＤＨＦＲを第２の配列として特に有用とする、 他の性質は、それが形質転換細胞を同定するための選択マーカーとして使用でき ることである。

ＤＨＦＲを第２の配列として使用するには、野生型ＤＨＦＲ及びＭＴＸ＝耐性Ｄ ＨＦＲの２つの型が利用できる。個々の宿主細胞に使用するＤＨＦＲの型は、宿 主細胞がＤＨＦＲ欠損であるか否か（例えば、非常に低レベルのＤＨＦＲを内因 的に産生ずるか、又は機能的なりＨＦＲを全（産生じないか）に依存する。ウル ラウブ及びチャッンン（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ）の［Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　V７　： ４２１６（１９８０）］に記載されているＣＨＯセルラインなどのＤＨＦＲＨＦ 上ルラインを野生型ＤＨＦＲコード化配列で形質転換する。形質転換された後で は、これらのＤＨＦＲＨＦ上ルラインは機能的なりＨＦＲを発現し、ヒポキサン チン、グリシン及びチミジン栄養素を欠く培養培地中で増殖することができる。

形質転換されていない細胞はこの培地中では生存しない。

ＭＴＸ耐性型のＤＨＦＲは、ＭＴＸ感受性の機能的ＤＨＦＲを正常量、内因的に 産生ずる宿主細胞中の、形質転換された宿主細胞を選択する手段として使用でき る。ＣＨＯ−Ｋ　１　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ　６１）はこの特性を有してお り、従ってこの目的にとって有用なセルラインである。細胞培養培地にＭＴＸを 添加すれば、ＭＴＸ耐性Ｄ　ＨＦ　ＲをコードするＤＮＡで形質転換された細胞 のみを発育させることができる。形質転換されていない細胞はこの培地中で生存 することができない。

本発明の変異体の製造に用いる哺乳類宿主細胞は様々な培地で培養することが出 来る。ハムのＦｌｏ（シグマ）、最少必須培地（ｒＭＥＭＪシグマ）　、ＲＰＭ ｌ−１６４０（シグマ）およびダルベツコの改良イーグル培地（ｒＤＭＥＭＪシ グマ）等の市販の培地が宿主細胞の培養に適する。加えて、ハム（Ｈａｍ）およ びワラス（Ｗａｌｌａｃｅ）の（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、、　５８：　４４　（１ ９７９））、バーンス（Ｂａｒｎｅｓ）およびサト（Ｓａｔｏ）の（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０２：２５５１　（１９８９））、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ 　Ｎｏｓ、４，７６７．７０S：　４゜ ６５７、８６６：　４．９２７．７６２；　４．５６０．６５５；　ｔｏ　９０ １０３４３０：　ｔｏ　８７１００１９５：　Ｕ、　Ｓ、　oａｔｅｎｔ、　Ｒ ｅ、　３ ０、９８５２）に記載の任意の培地がある。

例えば、哺乳類、特にＣＨＯ細胞に適した培養培地は以下の成分を含んでいて良 い。

アスパラギン　３００−７４０１１＋ｇ／ｌアスパラギン酸　３００−６５０ｍ ｇ／ｌグリシン　３００−５００１１１ｇ／　１イソロイシン　３００−５００ ｍｇ／　１０イシン　４００−７００ｍｇ／ｌ リシン　１０００−２２５０ｍｇ／ｌ メチオニン　８０−３５０ｍｇ／ｌ セリン　５００−７５０ｍｇ／ｌ スレオニン　５５０−９５０ｍｇ／ｌ トリプトファン　７５−２３０ｍｇ／ｌチロシン　１７５−４００ｍｇ／ｌ バリン　２４０−６４０ｍｇ／ｌ 様々な哺乳類細胞系の増殖を支える他の培養培地には、下記の主要成分が含まれ る。

アスパラギン　１５０　４５０ｍｇ／ｌアスパラギン酸　１５０−４５０ｍｇ／ ｌリンン　４００−８００ｍｇ／ｌ メチオニン　５０−２００ｍｇ／ｌ セリン　１００−３００ｍｇ／ｌ トリプトファン　５０−２００ｍｇ／ｌ哺乳類細胞の高密度培養および大量の商 業規模生産には、両方の培養培地とも、好ましくは血清不含であるものが適する 。

どの培地も、必要ならホルモンおよび／または他の成長因子（インシュリン、ト ランスフェリン、上皮成長因子等）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグ ネシウム、リン酸塩等）、バッファー（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノ シン、チミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシン等）、微量元素（通常、最終濃 度マイクロモル程度で存在する無機化合物と定義する）、およびグルコースまた は同等のエネルギー源）で補充されていてよい。当業者既知の、その他のいかな る必要な補充物質が適当な濃度で含有されていてもよい。

４、分泌系 細胞から普通分泌される多くの真核生物タンパク質は、そのアミノ酸配列の一部 として内因性シグナル配列を含有している。この配列は小胞体及びゴルジ装置を 介して細胞からタンパク質を輸出させる。このシグナル配列は通常タンパク質の アミノ末端に位置しており、約１３から約３６のアミノ成長の範囲にある。実際 の配列はタンパク質毎に異なっているが、既知のすべての真核生物シグナル配列 は、そのシグナル配列の中心付近に、少なくとも１個の正に荷電した残基と、高 度の疎水性の１０−１５アミノ酸（通常はアミノ酸類、ロイシン、イソロイシン 、アラニン、バリン及びフェニルアラニンに富む）を含有している。このシグナ ル配列は、タンパク質が細胞質内部の小胞体内に移動する際に円買小胞体上に存 在するシグナルペプチダーゼによって開裂されるので、通常、分泌形態のタンパ ク質からは除去されている。そのシグナル配列が依然として結合しているタンパ ク質は、「プレタンパク質」又はタンパク質の非成熟型と呼ばれることが多い。

しかし、分泌されるタンパク質のすべてが、開裂されるアミノ末端シグナル配列 を含有しているわけでない。オバルブミンなどのある種のタンパク質は、タンパ ク質の内部領域に位置するシグナル配列を含有している。この配列は移動時に正 常では開裂されない。

細胞質中に通常見いだされるタンパク質は、そのタンパク質にシグナル配列を連 結させることにより分泌させることができる。これは、シグナル配列をコードす るＤＮＡを、タンパク質をコードするＤＮＡの５°末端に連結し、次いでこの融 合タンパク質を適当な宿主細胞において発現させることにより、容易に実施する ことができる。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタン パク質をコードする遺伝子から制限断片として入手できる。従って、本発明を実 施するために利用する宿主細胞の型に応じて、原核生物、酵母、及び真核生物シ グナル配列を本発明では使用できる。遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤ ＮＡは適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して切除され、次いでそれを分泌さ せようとするタンパク質、即ちｔ−ＰＡをコードするＤＮＡに連結する。

機能的なシグナル配列の選択には、シグナル配列が宿主細胞シグナルペプチダー ゼによって認識される結果、シグナル配列の開裂及びタンパク質の分泌が起こる ことが要件となる。幾つかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤ ＮＡ及びアミノ酸配列は既知であり［例えば、ヒト成長因子、プロインスリン、 及びプロアルブミン（ストライヤー（Ｓｔｒｙｅｒ）のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　Ｗ、　ＩＩｌ、　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク （１９８８）、　７６９頁を参照）］、これらは適当な真核生物宿主細胞におい てシグナル配列として使用することができる。例えば、酸ホスファターゼ［アリ ア　（Ａｒｉｍａ）らのＮｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、旦：　１６５７（ １９８３）］、α−因子、アルカリホスファターゼ及びインベルターゼなどの酵 母シグナル配列は、酵母宿主細胞から分泌させるために使用できる。例えば、Ｌ ａｍＢ又はＯｍｐＦ［ウオン（ｌｏｎｇ）らのＧｅｎｅ　６８：１９３１９８８ ］、ＭａｌＥＳＰｈｏＡ、又ハβ−ラクタマーセヲコートスル遺伝子、並びに他 の遺伝子由来の原核生物シグナル配列は、原核生物細胞から培養培地にタンパク 質を向かわせるのに使用できる。

目的のタンパク質が分泌できるようにするためにそれにシグナル配列を付与する 別の手法は、シグナル配列をコードするＤＮＡを化学的に合成することである。

この方法では、選択したシグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドの両鎮を 化学的に合成し、次いで互いにアニーリングさせて二重ラセンを形成させる。次 に、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、タンパク質をコードするＤＮＡの５ °末端に連結させる。

次いで、タンパク質をそれに連結されたシグナル配列と共にコードしているＤＮ Ａを含有する構築物を適当な発現ベクターに連結すればよい。この発現ベクター を適当な宿主細胞に形質転換し、目的のタンパク質を発現させ、分泌させる。

Ｄ、形質転換方法 哺乳動物宿主細胞及び頑強な細胞膜障壁を有していない他の宿主細胞の培養物は 、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びフォノ・デルニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）［ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．５４６（１９７８）］に最初に開示され、サムプルツ クら（前掲）の１６．３２−１６．３７項にて改変を施されたリン酸カルシウム 法によって普通は形質転換される。しかし、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ） 　［カワイ（Ｋａｗａｉ）及びニシザワ（Ｎｉｓｈｉｚａｖａ）　、　Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉベツチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）　、　Ｃｅ１１．２２：４７９ （１９８０）］などの、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法も使用できる。

酵母宿主細胞は、ハイネン（Ｈｆｎｎｅｎ）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７５　：　１X２９−１ ９３３（１９７ｇ）によって教示されているように、ポリエチレングリコール法 によって形質転換するのが一般的である。

原核生物細胞又は頑強な細胞壁を有する細胞を形質転換するには、サムプルツク ら（前掲）の１．８２項に記載されている塩化カルシウム法によって行うのが好 ましい。また、これらの細胞を形質転換するにはエレクトロポルーンヨンも使用 できる。

Ｅ、クローニング法 復製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡ及び目的の外来ＤＮ Ａを含有する適当なベクターの構築には、標準的な組換えＤＮＡ手法を使用する 。単離したプラスミド及びＤＮＡ断片を開裂し、仕立て、そして特定の順序で互 いに連結し、所望のベクターを生成させる。

ＤＮＡの開裂は、適当な緩衝液中にて適当な制限酵素又は酵素群を使用して行う 。一般には、緩衝溶液約２０μｌ中、適当な制限酵素的１−２単位と共に、プラ スミド又はＤＮＡ断片約１２−１μｇを使用する（適当な緩衝液、ＤＮＡ濃度、 及びインキュベート時間及び温度は、その制限酵素の製造元によって特定されて いる）。一般には、３７℃での約１又は２時間のインキュベート時間が適当であ るが、酵素の中にはそれよりも高い温度が必要であるものがある。インキュベー トした後に、フェノール及びクロロホルムの混液で消化溶液を抽出することによ って酵素及び他の夾雑物を除去し、次いでエタノール沈殿によってその水性画分 からＤＮＡを回収する。

ＤＮＡ断片類を一緒に連結して機能的ベクターを形成させるためには、それらＤ ＮＡ断片の末端は互いに適合していなければならない。ある場合には、エンドヌ クレアーゼ消化で、直接適合する末端が得られる。しかし、エンドヌクレアーゼ 消化によって普通に生成される粘着末端を、連結に適合させるために、まず平滑 末端に変換しなければならない場合がある。平滑末端にするためには、４つのデ オキシヌクレオチド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ クレノー）１０単位と共に少なくとも１５分間、１５℃において適当な緩衝液中 で得られたＤＮＡを処理する。次いで、それをフェノール−クロロホルム抽出し 、エタノール沈殿して精製する。

開裂させたＤＮＡ断片は、ＤＮＡゲル電気泳動によってサイズ分離し、選択する ことができる。ＤＮＡはアガロース又はポリアクリルアミドマトリックスのいず れかによって電気泳動できる。マトリックスの選択は、分離しようとするＤＮＡ 断片のサイズ（大きさ）に左右される。電気泳動した後に、電気溶離（ｅｌｅｃ ｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によってＤＮＡをマトリックスから抽出するか、あるい は低融点アガロースをマトリックスとして使用した場合は、サムプルツクら（前 掲）の６．　３０−６゜３３項に記載されているようにしてアガロースを融解し 、それからＤＮＡを抽出する。

互いに連結させようとするＤＮＡ断片（適当な制限酵素で消化してそれぞれの断 片の連結させるべき末端を適合させておく）のほぼ等モル量を溶液中に存在させ る。この溶液はＡＴＰ、リガーゼ緩衝液及びリガーゼ、例えばＤＮＡ０．５μｇ 当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ約１０単位をも含有している。ＤＮＡ断片をベクター に連結する場合は、まず、適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）によってベクタ ーを切断して線状化し、次いで細菌アルカリホスファターゼ又は子牛腸内アルカ リホスファターゼのいずれかでリン酸化する。この操作によって、開裂したベク ターが連結工程の際に自己連結するのを防止できる。

連結した後に、新たに外来遺伝子が挿入されたベクターを適当な宿主細胞、最も 普通にはＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株２９４　（ＡＴＣＣ番号３１．４４６）又は 別の適当なＥ、ｃｏｌｉ株などの原核生物に導入する。抗生物質、普通はテトラ サイクリン（ｔｅｔ）又はアンピシリン（ａｍｐ）と増殖させることにより、ベ クター内のｔｅｔ及び／又はａｍｐ耐性遺伝子のおかげでそれらに対して耐性に なっている形質転換細胞を選択する。連結混合物によって真核生物宿主細胞を形 質転換した場合は、形質転換細胞は上述のＤＨＦＲ／ＭＴＸ系によって選択でき る。形質転換細胞を培養物中で増殖させ、次いでプラスミドＤＮＡ（プラスミド は、目的の外来遺伝子に連結されたベクターを意味する）を単離する。このプラ スミドＤＮＡを次に、制限マツピング及び／又はＤＮＡ配列決定によって分析す る。ＤＮＡの配列決定は、メッシング（Ｍｅｓ哺乳動物宿主細胞がＤＮＡで安定 に形質転換された後、その宿主細胞培養をＭＴＸ約２００−５００ｎＭ濃度の存 在下で増殖させ、それによりＤＨＦＲタンパク質をコードしている配列の増幅を 行う。ＭＴＸの有効な濃度範囲は、ＤＨＦＲ遺伝子及びタンパク質の性質、及び 宿主の特性に大きく左右される。明らかに、一般的な上限及び下限の定義は確認 できない。他の葉酸同族体又はＤＨＦＲを阻害する他の化合物も適当な濃度で使 用することができる。しかし、ＭＴＸが簡便であり、容品に利用でき、かつ有効 である。

上述のように、ｔ−ＰＡ変異体は、部位特異的突然変異誘発法を使用して生成さ れる突然変異（類）によって製造するのが好ましい。この方法では、特異的なオ リゴヌクレオチドであうで、所望の突然変異の配列と、該オリゴヌクレオチドそ してＤＮＡの鋳型と安定にハイブリダイズせしめるに十分な数の隣接ヌクレオチ ドの配列の両方をコードしているオリゴヌクレオチドを合成し使用する必要があ る。

Ｆ、医薬組成物 本発明のｔ−ＰＡ産物を医薬的に許容され得る担体との混合物中で混合すること により、本発明の化合物は医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に よって製剤化することができる。適当な担体及び製剤化法は、オスロー（Ｏｓｌ ｏ）ら編のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　１６版、１９８０［７−／り・パブリッシングω、コに記載されて いる。このような組成物は通常、患者への効果的な投与に適した医薬的に許容さ れ得る組成物を調製する上で適当な量のビヒクルと共に、有効量の本発明のｔ− ＰＡ変異体、例えば約０．５から約５＊ｇｈＬ含有している。ｔ−ＰＡ変異体は 、心臓血管の疾患又は症状の患者に非経口的に、又はそれを確かに有効な形で血 流に供給する他の方法で投与することができる。

本発明を実施する上で使用されるｔ−ＰＡ変異体を臨床投与するのに特に適して いる組成物には、例えば滅菌水溶液剤、又は凍結乾燥タンパク質などの滅菌水和 性の粉末剤などがある。通常、製剤を等強性にするために、製剤中にさらに、医 薬的に許容され得る塩を適量使用する。また、通常、適当濃度のりん酸と組み合 わせたアルギニン塩基のバッファーを、適当なｐＨ１一般にはｐＨ５，５−７， ５を維持するために含有させる。さらに、貯蔵寿命を維持するために、グリセリ ンなどの化合物も含有させることができる。

本発明の医薬組成物の投与量及び望ましい薬物濃度は、目的とする個々の用途に 応じて変化し得る。例えば、深部静脈血栓又は末梢血管疾患の処置に当たっては 、約０．０５から約０．２ｍｇ／ｋｇオーダーの「ポーラス」投与が通常好まし く、その後は、血中レベルをほぼ一定に、好ましくは約３μｇ／寓ｌのオーダー で維持し得るよう約０．１から約０．２冨ｇ　／ｋｇの投与を行うのが好ましい 。

しかし、一般に潅流（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）が行えない場面である緊急医療に関連 して使用するためには、及び処置する疾患が一般に重篤な性質をもつ場合（塞栓 症、心筋梗塞）には、多めの初期投与量、例えば約０．３ｍｇ／ｋｇオーダーの 静脈内ポーラス投与が望ましい。

例えば、ｔ−ＰＡ変異体は、心血管疾患又は症状に罹患した患者に非経口的に投 与するのが適切である。投与量及び投与速度は、現在、臨床試験における他の心 血管渠、血栓溶解薬の用量、例えば心筋梗塞、肺塞栓症などに罹患したヒト患者 には、約１−２＋＋ｇ／ｋｇ体重を１．５−１２時間かけて静脈内又は動脈内投 与、と同等又は高いであろう。

適当な投与剤形の１例として、５Ｑｓ＋ｇ　ｔ−ＰＡ、アルギニン、リン酸、及 びポリソルベート８０を含有するバイアルを滅菌水５０寓ｌにより注射用に再構 成し、それを適量の０．９％塩化ナトリウム注射液と混合することが挙げられる 。

本発明のｔ−ＰＡ変異体はフィブリン沈着又は接着の形成もしくは再形成を防止 するためにも有用である。この用途の１態様は、１９８９年１月４日公開のＥＰ ｏ　２９７．８６０に記載されている。一般には、この使用法の１態様では潜在 的なフィブリンまたは接着形成部位に、治療有効量のｔ−ＰＡ変異体を、それが およそ３日から２週間にわたって持続的に放出されるよう、難溶性の形で含。

有する組成物を投与することを包含する。ｔ−ＰＡ変異体は通常、手術、感染、 外傷又は炎症後にフィブリン沈着または接着の形成を予防するに充分な投与量で 投与する。その量は普通、０．０２ｍｇ／ｇゲルから２５ｍｇ／ｇゲルであり、 ０．２０ｗｇ／ｇゲルから約２．５ｍｇ／ｇのゲルが好ましく、最も好ましくは ０．２５ｍｇ／ｇゲルから約１．Ｏ翼ｇ／ｇゲルである。接着形成及び／又はフ ィブリン沈着を防止するために使用する各ｔ−ＰＡ変異体は、潜在的な接着形成 の部位にｔ−ＰＡ酵素を配！するための半固形の粘液質の製薬的に不活性な担体 中で製剤化するのが普通である。このような担体には、長鎖の炭化水素又は植物 油及び、修飾された飽和及び不飽和脂肪酸グリセリドの混合物又は修飾された飽 和及び不飽和脂肪酸グリセリドの混合物から構成されるワックスなどがある。例 えば、石油ゼリーまたは半合成グリセリドなどの半固形ビヒクル、グリセリンな どのポリヒドロキシ溶媒、長鎖炭化水素、生体侵食性ポリマー（ｂｉｏｅｒｏｄ ａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、又はリポソームなどが挙げられる。

以下に記載する実施例を簡単にするため、共通して用いられる幾つかの方法を以 下に説明する。

「プラスミド」は、小文字のｐの後ろにアルファベットの名称を付して表してい る。本発明における出発プラスミドは市販されているか、非制限的な起源から一 般に入手可能となっており、又はそのような入手可能なプラスミドから文献開示 の方法によって構築することができる。さらに、他の同等のプラスミドも当業界 既知であり、当業者には明らかである。

ＤＮＡの「消化」、「切断」又は「開裂」とは、ＤＮＡ内のある特定の場所での み働（酵素によってそのＤＮＡを触媒的に開裂することを意味する。

このような酵素は制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、ＤＮＡ配列に沿った、各酵 素が開裂する部位は制限部位と呼ばれる。本明細書で使用している制限酵素は市 販されており、その供給元から提示されている教示に従って使用される。制限酵 素は、大文字の後ろに各制限酵素が得られる微生物を表す２又は３つの小文字を 付して命名される。これらの文字に続いて個々の酵素を示す１又はそれ以上のロ ーマ数字がある。一般に、プラスミド又はＤＮＡ断片約ｌμｇを緩衝溶液約２０ μ！中、酵素約２単位と共に使用する。個々の制限酵素にとって適当な緩衝液、 基質濃度、インキュベーション温度、及びインキュベート時間は製造会社によっ て特定されている。インキュベートした後、フェノール−クロロホルム溶液によ る抽出によってＤＮＡから酵素及び他の夾雑物を除去し、エタノール沈殿によっ て、消化されたＤＮＡを水性画分から回収する。制限酵素による消化の後には、 細菌アルカリホスファターゼ又は子牛腸内アルカリホスファターゼで処理する。

これは、別のＤＮＡ断片の制限部位への挿入を妨げかねない、ＤＮＡ断片の２つ の制限開裂末端の「環化」又は閉じたループの形成を防止するためである。しか し、特に明記しない限りは、プラスミドの消化後には５°末端の脱リン酸化は行 わない。

脱リン酸化のためのこれらの操作法及び試薬はサムプルツクら（前掲）の１゜６ ０−１．６１項及び３．３８−３．３９項に記載されている。

特定のＤＮＡ断片を制限消化物から「回収」または「単離」するとは、ポリアク リルアミド又はアガロースゲルを使用して電気泳動法により、得られたＤＮＡ断 片を分離し、目的とする断片を既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度と比 較してその同定を行い、所望の断片を含有するゲル切片を取り出し、そしてＤＮ Ａからゲルを分離することを意味する。この操作法は一般に既知である。例えば 、ローン（Ｒ，Ｌａｗｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９：６１ ０３−６１１４（１９８１）、及びゲラデル（Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ）らのＮｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　４０５７（１９８０）を参照のこ と。

「サザーン分析」とは、既知の標識化オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片とのハ イブリッド形成により、消化物またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を 確かめる方法である。サザーン分析とは、元来、サザーン［５ｏｕｔｈｅｒｎ、 　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８＋５０３（１９７５）］により記載され、サ ムプルツク（前掲）の９．３１−９．５７節で改良された方法を用いてアガロー スゲル上にて消化ＤＮＡを分離し、ＤＮＡを変性し、ＤＮＡをゲルからニトロセ ルロースまたはナイロンメンブラン上に移すことを指す。

「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体成分として複製できるよ うにそのＤＮＡを生物に導入することを意味する。形質転換するために使用する 方法は、宿主細胞が真核生物であるか、又は原核生物であるかによって変わる。

原核生物を形質転換する方法はサムプルツクら（前掲）の１゜８２項に記載され ている塩化カルシウム法である。真核生物は、サムプルツク（前掲）らの１６． ３２−１６．３７項に記載されているリン酸カルシウム法によって形質転換され る。

「連結」とは、ＡＴＰをも含有している適当な緩衝液中、リガーゼ酵素を使用し て、２つの２本鏑ＤＮＡ断片間にホスホジエステル結合を生成させる「オリゴヌ クレオチド」は、ホスホジエステル結合によって結合されているデオキシリボヌ クレオチドの短い長さの１本鎖又は２本領配列を意味する。

このオリゴヌクレオチドは既知の方法によって化学的に合成され、ポリアクリル アミドゲル上にて精製される。

以下に、本発明を実施する上で現在知られている最も最良の方法を説明するため に実施例を挙げるが、これは本発明の限定を意図するものではない。

ｔ−ＰＡ突然変異体を作成するためのベクターとしてプラスミドｐＲＫ７を使用 した。ｐＲＫ７は、Ｃ１ａｌ及びＨｉｎｄｌｌＩ間のポリリンカー領域内のエン ドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆である以外はｐ　ＲＫ　５　（１９８９年３ 月１５日公開のＥＰ公開番号第３０７．２４７号）と同一である。このベクター に挿入するために、ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ［ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃａ）らのＮａｔ ｕｒｅ　３０１：２１４（１９８３）］を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍ （ＡＴＧ開始コドンの５°側４９６塩基対を切断する）及び制限エンドヌクレア ーゼＢａ１Ｉ（ＴＧＡ終止コドンの下流２７６塩基対を切断する）で切断するこ とにより調製した。このｃＤＮＡを、サムプルツク（３ａｍｂｒｏｏｋ）ら（前 掲）の１．６８−１．６９項に記載されている標準的な連結（リゲーション）法 を使用し、ＨｉｎｄＩｆｆ及びＳｍａｌで前もって切断しておいたｐＲＫ７に連 結した。得られた構築物をｐＲＫ、ｔ−ＰＡと命名した。（図１参照） ＩＩ、ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡの部位特異的突然変異誘発アマ−ジャム・コーポレー ション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入したキット（カ タログ番号ＲＰＮ　１２５３）を使用し、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）らのＮｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　、　１３：８７６５（１９８５）の方法によっ てｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を行った。所望の突然変異を生 成させるため、所望のアミノ酸置換をコードする配列を有するオリゴヌクレオチ ドを合成し、それをプライマーとして使用した。このオリゴヌクレオチドを、標 準的な手法［Ｖｉｅｒａらの１ｌｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　、　１４影３（１９８７ ）コにより調製した１本領ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡと７ニーリングさせた。

デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、 及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の３つのデオキシリボヌクレオチドの混 合物を、上記キットの製造元から供されているそのキット中のｄＣＴＰ（ａＳ） と呼ばれる改変チオ−デオキシリボシトシンと混合し、それをオリゴヌクレオチ ドとアニーリングさせた１本領ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡに加えた。

この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然変異した塩基以外はｐＲＫ７ −ｔ−ＰＡと同一のＤＮＡの鏑が生成した。さらに、この新たなりＮＡの鎖はｄ ｃＴＰの代わりに、それを制限エンドヌクレアーゼ消化から保護するのに役立つ ｄｃＴＰ（ａＳ）を含有していた。得られた２本鎖へテロ二重鎮の鋳型の鎖に適 当な制限酵素により切れ目にツク）を作成した後、その鋳型の鎖を、突然変異オ リゴマーを含有している領域を通過するようＥｘａｍヌクレアーゼによって消化 した。次いで、この反応を停止させると、部分的にのみ１本鎖となった分子が得 られた。次に、４つのみすべてのデオキシリボヌク−レオチド３リン酸、ＡＴＰ 、及びＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼにより、完全な２本ｌＤＮ Ａのへテロ二重鎖分子を形成させた。

Ｒ２９９Ｄｔ−ＰＡの製造に用いたオリゴヌクレオチドは下記のとおりである。

５’　ＴＣＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣ（配列番号１）Ｒ２ ９９Ｄ、５３０ＯＮｔ−ＰＡおよびＲ２９９Ｇ、５３００Ｔｔ−ＰＡの製造に用 いたオリゴヌクレオチドは下記のとおりである。

５’　ＣＣＧＣＴＣＴＣＣＧＧＧＮＮ　（Ｇ／Ｃ）ＮＮ　（Ｇ／Ｃ）ＣＣＴＣ； ＴＧＣＴＴ　（配列番号２） ここにＮは任意のヌクレオチド、Ｇ／Ｃはその位置のヌクレオチドがＧまたはＣ のいずれでもよいことを意味する。

ＩＩｌ、細菌形質転換及びＤＮＡ調製 コンピテント細胞の調製と形質転換するための標準的な塩化カルシウム法［Ｓａ ａ＋ｂｒｏｏｋら（前掲）の１．７６−１．８４項コを使用し、上記のプロトコ ールを使用して作成した突然変異ｔ−ＰＡ構築物をＥ、ｃｏｌｉ宿主株ＭＭ　２ ９４　ｔｏｎＡに導入した。ＴｎｌＯ）ランスボゾンをｔｏｎ　Ａ遺伝子に挿入 した後、不正確に切除することにより、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＭ２９４ｔｏｎＡ（こ れはＴ１ファージに耐性である）を調製した。次いで、この遺伝子をトランスポ ゾン挿入突然変異［クレックカー（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ）らのＪ、１ｌｏｉ、Ｂｉ ｏｌ、　、　１１６　：　１２５−１５９（１９７７）］を使用し、Ｅ、ｃｏｌ ｉ宿主ＭＭ　２９４　（ＡＴＴＣＮｏ、　３１．４４６）に挿入した。

Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）の１．２５−１．３１項に記載されている標準的な ミニブレブ法を使用し、細菌形質転換体のコロニーそれぞれからＤＮＡを抽出し た。得られたプラスミドをセファクリルＣＬ６Ｂスピンカラムに通してさらに精 製し、次いでＤＮＡ配列決定並びに制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロース ゲル電気泳動によって分析した。

■、真核生物細胞の形質転換 ヒト腎肝２９３細胞（温度感受性ラージＴ抗原遺伝子でトランスフェクトしたサ ブクローン２９３ＴＳＡ）を６ウエル平板にて１０％全ウシつ児血清を補充Ｌ７ ’：ＩＩＭ　ＨＥＰＥＳバッファー、０．２９　ｇ／　１グルタミン、２．４４ ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム、０．５５　ｇ／　Ｉピルビン酸ナトリウム、ｐＨ６ ゜９５を含有スル、ＤＭＥＭ：Ｆ１２　（１：１）培地Ｔ７０％全面成長マで増 殖させた。トランスフェクションの前日に細胞を計数し、培地を吸引して除き、 細胞をトリプシン処理し、あらがじめリシン含有カラムに通してプラスミノーゲ ンを除去しておいた１０％全ウシつ児血清を含有する、同じＤＭＥＭ：　Ｆ１２ 　（１：　１）に基づく培地に再けんだくした。次いで、懸濁液を２６６．００ ０細胞／ｌ１１１に調節し、６ウエルプレートに３ｍ１／ウエル（８ｏｏ、ｏｏ ｏ細胞／ウェル）では種し、トランスフェクションの日までインキュベーション した。

ｔ−ＰＡ突然変異体をコードするプラスミド２．５μｇを１ｍＭ　トリス−ＨＣ ｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣＪ２（１５０μＡ’）中に溶 解シタ。

これに、５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，３５）、２８０ｍＭ　ＮａＣＬ　 １゜５ｍＭ　ＮａＰＯ３（１５０μｌ）を加え（旋回下に滴加）、２５℃で１０ 分間沈殿物を形成せしめた。次いで、得られた懸濁沈殿物を６ウエル平板の各ウ ェル中の細胞に加え、インキュベーター中に１夜放置した。次いで、培地を吸引 除去し、インシュリン、トランスフェリン、微量元素および脂質を含むＤＭＥＭ ：　Ｆ１２　（１：　１）Ｊ、：基づく血清不含培地（ＰＳ−０４と呼称）　（ Ｕ、Ｓ。

Ｓ、Ｎ、　０７１５９２．１４．１前掲に記載）で置き換えた。細胞を６日間イ ンキュベートした後、培地を採取し、検定した。

野生型ｔ−ＰＡに対しで調製したポリクローナル抗体を使用し、ＥＬＩＳＡ（酵 素結合免疫吸着検定ン法によって１．細胞培養上清中に存在するｔ−ＰＡの濃度 を測定した。以下で説明する各検定に使用したｔ−ＰＡ量はこのＥＬＩＳＡ法の 結果に基づく。

Ｂ、Ｓ−２２８８検定 Ｓ−２２８８検定を使用し、２本鎖形の本発明突然変異体のタンパク質分解活性 を測定した。この検定は、ｔ−ＰＡのタンパク質分解活性のための直接的な検定 法である；ｔ−ＰＡは小ペプチドとバラニトロアニリド発色団との間の結合を開 裂させる。

野生型組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）を細胞培養培地で希釈して標準曲線試料を 調製する。この標準曲線試料及びｒｔ−ＰＡ突然変異体試料をマイクロ多イター 平板のウェルに加えた。この検定法を使用して２本領ｒｔ−ＰＡの活性を測定す るので、ヒトプラスミンとのインキュベーション工程を操作に包含させた。ヒト プラスミン（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）を終濃度０．１３ＣＵ（カゼイン単位）／ 諺ｌまで加えた。試料を室温で９０分間インキュベートした。

アプロチニン［シグマ、約１４ＴＩＵ（トリプシンインヒビタ一単位）／＋＋ｇ ］を終濃度７２μｇｈｌまで加えてプラスミン活性を阻害し、得られた試料を室 温で１５分間インキュベートした。Ｓ−２２８８の２．１６ｍＭ溶液を０゜１Ｍ 　トリス、０．１０６＋Ｍ　ＮａＣＬ　０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８゜ ４を用いて１゜４５ｍＭにまで希釈し、この溶液工ＯＯμｌをマイクロタイター 平板の各ウェルに加えた（各ウェルにおける最終容量は２００μｌであった）。

４０５止において発色をモニターした。それぞれの標準及び試料についての吸光 度対時間曲線の勾配を測定した。標準曲線は、ｒｔ−ＰＡ欅品に対するｒｔ−Ｐ Ａ濃度の関数として、吸光度対時間の曲線勾配をプロットすることで作成した。

次いで、突然変異体の相対活性濃度を標準曲線から測定した。各突然変異体の活 性濃度をｒｔ−ＰＡ　ＥＬＩＳＡにて得られた突然変異体についての濃度で除し 、得られた比活性を、１．０値と帰属した野生型ｔ−ＰＡに関連させて表した。

Ｃ，Ｓ−２２５１検定 この検定はｔ−ＰＡ活性の間接検定法である。この検定法では、プラスミノーゲ ンをｔ−Ｐ、Ａの作用によりプラスミンに変換させるが、そのプラスミンがＳ− ２２５１基質を開裂してバラニトロアニリド発色団を放出するものである。次い で、この発色団の発色を経時的に測定する。

１、フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定 Ｓ−２２８８検定について記載しているようにして標準曲線試料を調製した。そ の試料をプラスミン−セファ０−スと共にインキュベートすることにより、試料 を２本鎖に変換した。プラスミン−セファロースは、ヒトプラスミン（Ｋａｂｉ Ｖｉｔｒｕｍ）約２０．８ＣＵを臭化シアン活性化セファロース（ファルマンア ）１ｍｆとカップリングさせて調製した。このプラスミン−セファロース（５％ スラリー５０μＩりを試料１５０μｌと共に室温で９０分間撹拌させながらイン キュベートした。インキュベートの後、得られた樹脂を遠心によって除去し、試 料１０μｌをマイクロタイター平板のウェルに加えた。

ヒトトロンビン（４２単位／１溶液１０μｌ）を各ウェルに加えた。ヒトＧ１ロ ープラスミノーゲン（５，３μＭ）２８μ１１プラスミノーゲン不含のヒトフィ ブリーゲン（１０μＭ）１０μｚ、３ｍＭ　Ｓ−２２５１（ＫａｂｉＶｉｔｒｕ ｔｒｒ）３０　ｔｔｌ、及びＰＢＳ６２μｌから構成される混合物（１３０μｌ ）を加え、各ウェル中の反応を開始させた。４０５ｎｍにおいて発色をモニター し、４９２ｎｍの参考波長における吸光度を各時点の吸光度から差し引いた。吸 光度対時間の二乗の曲線勾配を標準及び突然変異体試料の各々について測定した 。標準曲線は、ｒｔ−ＰＡ標品についてのｒｔ−ＰＡ濃度の関数として、吸光度 対時間の二乗の曲線勾配をプロットすることにより作成した。突然変異体の相対 比活性は、Ｓ−２２８８検定について記載したようにして測定した。

２、フィブリノーゲン刺激Ｓ−２２５１検定この検定は、トロンビンをＰＢＳで 置き換える以外はフィブリン刺激Ｓ−２２５１検定について記載しているように して行った。

３、血漿血餅Ｓ−２２５１検定 標準曲線試料の調製及び、プラスミン−セファ０−スを使用する１本領ｒｔ−Ｐ Ａから２本領ｒｔ−ＰＡへの変換をフィブリン−刺激Ｓ−２２５１検定につ　− いて記載しているようにして行った。ヒトトロンビン（３１ａｇ／＋＋１溶液１ ０μｌ）をマイクロタイター平板の各ウェルに加えた。標準及び突然変異体試料 （４０μｌ）をその平板に加え、酸クエン酸デキストロースヒト血漿９０μ！及 び９．　１ｉＭ　Ｓ−２２５１（ＫａｂｉＶｉｔｒ＋ｍ）　１０　Ｉｌｌの混合 物１００１を加え、反応を開始させた。４０５止において発色をモニターし、４ ９２止の参考波長における吸光度を各時点の吸光度から差し引いた。得られたデ ータの分析は、フィブリン刺激Ｓ−２２５１検定について記載したようにして行 った。

血漿Ｓ−２２５１検定 この検定は、トロンビンをＰＢＳで置き換え、参考波長を用いないことを除き、 血漿血餅Ｓ−２２５１検定に関して記載したと同様に行った。

上記Ｂおよび０項に記載の検定の結果を表１に示す。表中、Ｒ２９９Ｄｔ−ＰＡ は本発明の変異体であり、ＫＨＲＲ２９６−２９９ＡＡＡＡ　ｔ−ＰＡ　（Ｗ０ ９０１０２７９８．１９９０年３月２２日公開に記載の変異体）、Ｒ２９９Ｄ、 ５３０ＯＮｔ−ＰＡ、およびＲ２９９位にアミノ酸置換変異を有する幾つかの他 の変異体（適当なオリゴヌクレオチドを用いて上記のようにして調製した）につ いても比較の目的で試験した。

Ｓ−２２８８検定の結果は、本発明の変異体が野生型ｔ−ＰＡに概ね匹敵するア ミド分解活性を有することを示している。Ｒ２９９Ｄ変異体と野生型ｔ−ＰＡと の活性の差異は５２２５１検定で見られるが、ここに、フィブリンの存在下での Ｒ２９９Ｄのプラスミノーゲン活性化因子活性と、フィブリノーゲンの存在下で のそれとの比は、この変異体がこの検定系において、野生型ｔ−ＰＡの４倍以上 、フィブリン特異的であることを示している。ヒト血漿および血餅形成したヒト 血漿の存在下でプラスミノーゲン活性化因子検定を行った場合にも同様のパター ンが認められる。本発明の変異体は血漿中で野生型ｔ−ＰＡよりも活性が低いが 、血漿血餅の存在下では活性が高く、野生型ｔ−ＰＡに比較して、血漿血餅への 特異性が約３．７倍に増大している。

表１ Ｄ　血漿血餅溶解検定 表１に記載のｔ−ＰＡ変異体試料およびＲ２９９Ｇ、５３００Ｒｔ−ＰＡを、上 述のフィブリン刺激Ｓ−２２５１検定にて説明したプラスミン−セファロースを 使用し、１本鎖から２本鎖形に変換した。

血漿血餅溶解検定は以下のようにして行った二　〇、１５Ｍ塩化カルシウム１０ １１をマイクロタイター平板ウェルに加えた。次いで、各ウェルに、遠心し０． ４５マイクロン濾過したヒトクエン酸処理血漿プールを加えた。

その内容物を完全に混合し、血漿血餅を形成させた。ｒｔ−ＰＡの標準試料及び 検定すべきｔ−ＰＡ変異体を、それらの終濃度の２倍濃度（１８−８００ｎｇ／ ｌｌ）にまで検定緩衝液で希釈した。希釈緩衝液はＯ，ＬＭ　ＮａＣＬ　０．０ ３Ｍ重炭酸ナトリウム（実験の開始直前に新たに加える）、４ｍＭＫＣ４，１ｍ Ｍ塩化カルシウム、ｌｌ１１Ｍ二塩基性二塩酸ナトリウム、０．３ｍＭ塩化マグ ネシウム、Ｑ、４ｍＭ硫酸マグネシウム、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［４−［２−ヒ ドロキシエチル］−１−ピペラジンエタンスルホン酸コ、及び０．０１％ポリソ ルベート８０、ｐＨ７，４を含有している。次いで、各標品又は変異体を１容量 の血漿プールと混合した。この混合物１００μ！全体を、周囲温度で６−８時間 放置して血餅を生じさせた後の血漿血餅の上に重層した。次いで、各平板の光学 密度を４０５ｎｍにて読みとった。次いで、その平板を３７℃で約１５時間イン キュベートし、光学密度の測定を繰り返した。各ウェルについて、０から１５時 間までの光学密度値の差異を引き算によって計算した。標品では、光学密度を標 品の濃度のｌｏｇの関数としてプロットした。

この標準曲線から未知量を内挿した。同じ（処理した野生型ｔ−ＰＡ対照に標準 化した。標準曲線は４つのパラメーター適合プログラムを使用して決定した。使 用した平板解読装置は、５ＬＴ−ラボラトリーズのＥＡＲ３４０ＡＴ型であった （オーストリア）。

得られた結果を以下の第２表に示す。

表２ Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　＋−ＰＡ　＋、０　＋、０Ｒ２９９Ｄ　ｔ・ＰＡ　４．１ °　４９°０ＫＨＲＲ２９６・２９９ＡＡＡＡ　ｔ−ＰＡ　１．６”　２．２° ０Ｒ２９９Ａ　ｔ・ＰＡ　Ｌ８°　１６＋０Ｒ２９９Ｆｔ−ＰＡ　Ｏ，ａ°　０ ．４”Ｒ２９９Ｌｔ・ＰＡ　１．７°”　ＮＣｌＲ２９９Ｖ　ｔ−ＰＡ　Ｏ，９ °　１０°″１Ｒ２９９Ｓ　ｔ−ＰＡ　１．７”″”　Ｌ７−”Ｒ２９９Ｙ　ｔ −ｐＡ　ｏ、４”　Ｎ０Ｒ２９９Ｈｔ−ｐＡ　Ｌ７”　２４＋＋Ｒ２９９１＋・ ＰＡ　１．’ｌ°　１０°。

Ｒ２９９Ｗｔ−ＰＡ　Ｏ，８”　０．６°＋Ｒ２９９Ｇ　ｔ−ＰＡ　１５”　Ｌ ３”Ｒ２９９Ｐｔ−ＰＡ　Ｏ，６°”　Ｎ０Ｒ２９９Ｈｔ−ｐＡ　１．２””　 Ｎ０Ｒ２９９Ｈｔ−ＦＡ　２．７・１１１１ＮＯＲ２９９Ｄ、５３０ＯＮ　ｔ− ＰＡ　２．８”　Ｎ０Ｒ２９９Ｈ，５３００Ｔ　ｔ−ＰＡ　０・８””　ＮＤ＊ 測定数は３ ＊＊測定数は１ ＊＊＊測定数は２ 驚（べきことには、本発明の変異体は野生型ｔ−ＰＡおよびＫＨＲＲ２９６−２ ９９ＡＡＡＡｔ−ＰＡ変異体、並びに２９９位における他のアミノ酸置換変異体 の大多数よりも血餅溶解活性が劇的に増大している。それはまた２重突然変異体 Ｒ２９９Ｄ、５３０ＯＮおよびＲ２９９Ｇ、５３００Ｔｔ−ＰＡよりも活性が増 大しており、これは３００位における突然変異が実は、２９９位突然変異体の血 漿血餅溶解活性を減少させることを示している。

このように、Ｒ２９９Ｄ変異体は野生型ｔ−ＰＡに比較して、実質上増大した血 餅溶解活性を持つと同時に増大したフィブリンおよび血漿血餅特異性を有する。

配列表 （１）一般的な情報 （ｉ）出願人：ンエネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）発明の名称：組織 プラスミノーゲン活性化因子置換変異体（ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）あて名：ジエネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）通り＝４６０ポイン ト　サン　プルノ　プルバード（Ｃ）市：サウス　サン　フランシスコ（Ｄ）州 ：カリフォルニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）　ジップコード：　９４０８０ （Ｖ）コンピューター読み取り可能な形式：（Ａ）媒体型：５．２５インチ３６ ０　Ｋｂフロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブ ル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフ トウェアー：　ｐａｔｉｎ　（ジエネンテク）（ｖｉ）現出願のデータ： （＾）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号二〇７／６２９．６８３（Ｂ）出願臼：　１８−ＤＥＣ−１９９ ０（ｖｉｉｉ）代理人／エージェントの情報：（Ａ）氏名：　ドレッガー、ギン ガーアール（Ｄｒｅｇｅｒ、　Ｇｉｎｇｅｒ　Ｒ，）（Ｂ）登録番号：　３３． ０５５ （Ｃ）参照／整理番号：６６９ （ｉｘ）電話連絡情報： （Ａ）電話＋　４１５／２６６−１８９６（Ｂ）ファクンミリ：　４１５／９５ ２−９８８１（Ｃ）テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）配列番号、 ｌに関する情報： （ｉ）配列の特徴 （＾）長さ；２４塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｖ）配列番号＋１：　Ｒ２９９ＤのためのプローブＩＴＣＣＧＧＧＣＧＡＧ 　ＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴ　ＴＧＧＣ２４（２）配列番号＝２に関する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２７塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｖ）　配列ｌｔ号：２：　Ｒ２９９Ｄ、５３０ＯＮとＲ２９９Ｇ、５３００ Ｔのためのプローブ２ ＣＣＧＣＴＣＴＣＣＧ　ＧＧＮＮＧＮＮＧＣＣＴＧＴＧＣＴＴ　２７国際調査報 告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　５／１０ ９／６４　９１６１−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．野生型ｔ−ＰＡの２９９位のアルギニンのアスパラギン酸による置換を有す るｔ−ＰＡアミノ酸配列変異体。
2. ２．さらに、野生型ｔ−ＰＡの１０３位のスレオニンのアスパラギンによる置換 をも含有する請求項１の変異体。
3. ３．さらに、野生型ｔ−ＰＡの１１７位のアスパラギンのグルタミン、アラニン またはセリンによる置換をも含有する請求項１または２の変異体。
4. ４．さらに、野生型ｔ−ＰＡの１０５位のセリンのアスパラギンによる置換およ び１０７位のアラニンのセリンによる置換をも含有する請求項１−３項のいずれ かの変異体。
5. ５．Ｒ２９９Ｄｔ−ＰＡ。
6. ６．請求項１−５のいずれかに記載の変異体をコードするＤＮＡ配列。
7. ７．形質転換体内で請求項６のＤＮＡ配列を発現し得る複製可能な発現ベクター 。
8. ８．請求項７のベクターで形質転換された宿主細胞。
9. ９．真核生物細胞である請求項８の宿主細胞。
10. １０．哺乳動物である請求項８の宿主細胞。
11. １１．ヒト腎胚２９３細胞である請求項１０の宿主細胞。
12. １２．チャイニーズハムスターの卵巣細胞である請求項１０の宿主細胞。
13. １３．ｔ−ＰＡ変異体をコードするＤＮＡを発現するよう請求項８の宿主細胞を 培養することを含む方法。
14. １４．宿主細胞が真核性細胞である請求項１３の方法。
15. １５．宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１４の方法。
16. １６．さらに、宿主細胞培養から変異体を回収することを含む請求項１３の方法 。
17. １７．変異体を宿主細胞培養培地から回収する請求項１６の方法。
18. １８．治療上有効な量の請求項１−５のいずれかに記載の変異体と製剤的に許容 し得る担体との混合物を含む血管状態または疾患の治療のための組成物。
19. １９．請求項１８の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物 における血管状態又は疾患を処置する方法。
20. ２０．請求項１−５のいずれかに記載の変異体の治療有効量を製剤的に許容し得 る担体と共に含有する、フイブリン沈着もしくは付着の形成又は再形成を予防す るための組成物。
21. ２１．請求項２０に記載の組成物の有効量を哺乳動物の潜在的なフィブリン沈着 又は付着形成部位に投与することを特徴とする、フィブリン沈着もしくは付着形 成又は再形成を予防するために哺乳動物を処置する方法。