JP2016086814A - 組換えヒトDNaseIの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.組換えヒトDNaseIの製造方法であって,
(a)組換えヒトDNaseIを産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換えヒトDNaseIを培養液中に分泌させるステップと,
(b)上記ステップ(a)で得られた培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収するステップと,
(c)上記ステップ(b)で得られた培養上清を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(d)上記ステップ(c)で回収された該画分をリン酸基に親和性をもつ材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(e)上記ステップ(d)で回収された該画分を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(f)上記ステップ(e)で回収された該画分を色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
をこの順で含んでなるものである,製造方法。
2.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,強陰イオン交換体である,上記1に記載の製造方法。
3.該強イオン交換体が,トリメチルアンモニウム基をもつものである,上記2に記載の方法。
4.リン酸基に親和性をもつ該材料が,フルオロアパタイト又はハイドロキシアパタイトのいずれかである,上記1乃至3のいずれかに記載の製造方法。
5.リン酸基に親和性をもつ該材料が,ハイドロキシアパタイトである,上記4に記載の製造方法。
6.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,強陽イオン交換体である,上記1乃至5のいずれかに記載の製造方法。
7.該強イオン交換体が,スルホ基をもつものである,上記6に記載の製造方法。
8.該色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素が,トリアジン色素である,上記1乃至7のいずれかに記載の製造方法。
9.上記1乃至8のいずれかに記載の製造方法により得られた組換えヒトDNaseIを含有する画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して,組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップを更に含むものである,組換えヒトDNaseIの製造方法。
10.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが,0.5〜2.0mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至9のいずれかに記載の製造方法。
11.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが,0.8〜1.2mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至9のいずれかに記載の製造方法。
12.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが,2〜20mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至11のいずれかに記載の製造方法。
13.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが,8〜12mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至11のいずれかに記載の製造方法。
14.該哺乳動物細胞が,rhDNaseIを発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1アルファプロモーター,その下流にrhDNaseIをコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子を更に含む発現ベクターが導入されたものである,上記1乃至13のいずれかに記載の製造方法。
15.該内部リボソーム結合部位が,野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域の内部リボソーム結合部位に由来するものであり,且つ該内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである,上記14に記載の製造方法。
16.該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,上記15に記載の製造方法。
17.該哺乳動物細胞が,rhDNaseIを発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1アルファプロモーター,その下流にrhDNaseIをコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターが導入されたものである,上記1乃至13のいずれかに記載の製造方法。
18.該内部リボソーム結合部位が,野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域の内部リボソーム結合部位に由来するものであり,且つ該内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである,上記17に記載の製造方法。
19.該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,上記18に記載の製造方法。
20.上記1乃至19に記載の何れかの製造法により製造され,且つ960U/mg以上の比活性を示す組換えヒトDNaseI。
21.上記1乃至19に記載の何れかの製造法により製造され,且つ960〜1000U/mgの比活性を示す組換えヒトDNaseI。
天然型ヒトDNaseIの全長をコードする遺伝子を含むDNA断片を化学的に合成した(配列番号3)。これをMluIとNotIで消化し,哺乳動物細胞発現用ベクターである,pE−mIRES−GS−puroのMluIとNotI間に挿入し,これをrhDNaseI発現ベクター(pE−mIRES−GS−puro/DRNI)として(図1),以下の実験に用いた。なお,pE−mIRES−GS−puroは,国際特許公報(国際特許公報WO2012/063799)に記載された方法で構築したものを用いた。なお,配列番号3で示すDNAは282個のアミノ酸からなるペプチド鎖をコードするが(配列番号4),rhDNaseIのアミノ酸配列は,このペプチド鎖のN末端側の22個のアミノ酸からなるリーダーペプチドを除く,残りの260個からなるものである。
実施例1で作製したrhDNaseI発現ベクター(pE−mIRES−GS−puro/DRNI)を,AseIで消化して直鎖状にした後,エレクロトポレーション法又はリポフェクション法によりCHO−K1細胞に導入し,細胞を形質転換させた。形質転換後の細胞の培養は,10μg/mLのインスリンを含むCD−OptiCHOTM培地(Life technologies社)に,HT supplement 100×(Life technologies社)を1/100(v/v)量添加した培地を基本培地として用いて行った。なお,この基本培地はグルタミンを含有しない。
上記のエレクロトポレーション法又はリポフェクション法によりrhDNaseI発現ベクターを導入した後に24穴プレートの新たなウェルに移した細胞を,30μMのMSXを含むCD−OptiCHOTM培地で選択培養を開始した。数週間ごとにMSX濃度を徐々に上昇させながら,最終的に300μMのMSXと5μg/mLのピューロマイシンを含むCD−OptiCHOTM培地中で培養し,MSXへの耐性の高い細胞を得た。この細胞をバルク細胞,また,バルク細胞を得るための上記の培養工程をバルク培養と名付けた。
上記実施例3で得たバルク細胞を,300μMのMSXと10μg/mLのピューロマイシンを含む基本培地で懸濁させて細胞懸濁液とし,この細胞懸濁液を,1ウェルに凡そ1個の細胞が含まれるように,96穴プレートの各ウェルに200μLずつ播種した。このとき,各ウェルに,フィーダー細胞として,発現ベクターを導入していないCHO−K1細胞が,1×104個/ウェルの個数で含まれるようにした。培養14日目に,各ウェルのコロニー形成を確認し,単一のコロニーが形成されているウェルの培養上清を採取し,後述する酵素活性測定法により培養上清中のrhDNaseIの酵素活性を測定し,高い酵素活性を示す培養上清を含むウェルを52個選択した。選択したウェルの細胞を,それぞれ24穴プレートの各穴に播種して培養し,最終的に最も高い酵素活性を示すウェルの細胞を選択した。
実施例4で得たrhDNaseI産生細胞を段階的に拡大培養し,最終的に,2×105個/mLの密度で細胞を800mLの培地に懸濁させた。この細胞懸濁液を,バイオリアクター(Single−Use Bioreactor, サーモフィッシャーサイエンティフィック社)の1Lチャンバーに添加し,バイオリアクターを表1に示す条件に設定して,細胞を14日間培養した。また培養期間中,培養開始4日目,7日目及び10日目に,50mLのEfficient feed kit Aと50mLのEfficient feed kit Bからなるフィード液を,チャンバーに添加した。なお,拡大培養及び生産培養は,培地として,20μg/mLのインスリンを含むCD−OptiCHOTM培地に,HT supplement 100×を1/100(v/v)量添加したものを用いて行った。
生産培養の終了後に培地を回収し,膜フィルター(孔径0.22μm,Millipore社)でろ過して,培養上清とした。培養上清を75mL分取し,これに1mMのCaCl2を含む20mM Tris緩衝液(pH7.5)を等量加えて希釈した。この培養上清の希釈液を,カラム体積の2倍容の50mMのNaClと1mMのCaCl2を含む20mM Tris緩衝液(pH7.5)で平衡化した,陰イオン交換カラムであるNuviaQ media(カラム体積5mL,ベッド高25cm,BioRad社)に,1.8mL/分の流速で負荷し,rhDNaseIを樹脂に吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積の6倍容の1mMのCaCl2を含む40mM酢酸緩衝液(pH5.0)でカラムを洗浄した後,カラム体積の6倍容の200mMのNaClと1mMのCaCl2を含む40mM酢酸緩衝液(pH4.5)でrhDNaseIをカラムから溶出させた。
〔実施例7:抗rhDNaseI抗体の作製〕
0.1%BSAを含有するTBS−Tで,上記実施例7で調製したHRP標識抗hDNaseI抗体を0.0625μg/mLの濃度に希釈し,これをHRP標識抗hDNaseI抗体溶液とした。0.025Mクエン酸溶液を等量の0.05M NaHPO4溶液と混和しpH5.0に調整したものをOPD溶解液とした。o−フェニルジアミン塩酸塩(OPD錠,和光純薬)を0.4mg/mLの濃度でOPD溶解液に溶解し,これにH2O2を0.0086%となるように添加したものを基質溶液とした。また,rhDNaseI(PROSPEC社)を,0.1%BSAを含有するTBS−Tで希釈したものをrhDNaseIの標準品として用いた。
サケ精巣DNA(Sigma−Aldrich)を,1mM EDTAを含有する25mM HEPES緩衝液(pH7.5)に2mg/mLの濃度となるように添加し,室温で2日間撹拌してDNAを完全に溶解させて,0.2%DNA溶液を調製した。メチルグリーン粉末(Sigma−Aldrich)を20mM酢酸/NaOH(pH4.2)に,0.4(w/v)の濃度となるように溶解して,メチルグリーン溶液を調製した。0.2%DNA溶液とメチルグリーン溶液と希釈溶液(4mM CaCl2と4mM MaCl2と0.1% BSA と0.05% Tween20とを含有する25mM HEPES(pH7.5))を,128:7.7:114の割合で混和し,室温で1晩撹拌した後,膜フィルター(孔径0.22μm,コーニング社)でろ過して,これを基質溶液とした。基質溶液は凍結保存し,用時解凍して使用した。
10μLのrhDNaseI精製品を,等量のloading buffer(4% SDS,4% メルカプトエタノール,8M 尿素を含有する125mM Tris緩衝液(pH6.5))と混ぜて50℃で10分間加熱した後,ポリアクリルアミドゲル(Super SepTM Ace 10−20%,和光純薬)を用いて電気泳動した。電気泳動後,ゲルをオリオール染色した。オリオール染色したゲル上には,分子量35〜37kDに相当する位置にrhDNaseIに由来するバンドのみが認められた(図4)。
TSKgelG3000SWXLカラム(内径7.8 mm×30 cm,東ソー)をLC−20Aシステム,SPD−20AVのUV/VIS検出器(島津製作所)にセットした。10μLのrhDNaseI精製品を,25 mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で平衡化されたカラムに,流速0.5mL/分で負荷した。溶出プロファイルは,215nmにおける吸光度を測定して作成した。得られた溶出プロファイルは,ほぼrhDNaseIに由来する単一のピークのみを示した(図5)。
5 ヒトEF−1αプロモーター及び第一イントロンを含む塩基配列
6 SV40後期ポリポリアデニル化領域
7 SV40初期プロモーターを含む領域
8 合成ポリポリアデニル化領域
10 グルタミン合成酵素遺伝子
11 ヒトDNaseI遺伝子
配列番号3 ヒトDNaseIをコードする配列,合成
1.組換えヒトDNaseIの製造方法であって,
(a)組換えヒトDNaseIを産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換えヒトDNaseIを培養液中に分泌させるステップと,
(b)上記ステップ(a)で得られた培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収するステップと,
(c)上記ステップ(b)で得られた培養上清を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(d)上記ステップ(c)で回収された該画分をリン酸基に親和性をもつ材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(e)上記ステップ(d)で回収された該画分を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(f)上記ステップ(e)で回収された該画分を色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
をこの順で含んでなるものである,製造方法。
2.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,強陰イオン交換体である,上記1に記載の製造方法。
3.該強陰イオン交換体が,トリメチルアンモニウム基をもつものである,上記2に記載の方法。
4.リン酸基に親和性をもつ該材料が,フルオロアパタイト又はハイドロキシアパタイトのいずれかである,上記1乃至3のいずれかに記載の製造方法。
5.リン酸基に親和性をもつ該材料が,ハイドロキシアパタイトである,上記4に記載の製造方法。
6.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,強陽イオン交換体である,上記1乃至5のいずれかに記載の製造方法。
7.該強陽イオン交換体が,スルホ基をもつものである,上記6に記載の製造方法。
8.該色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素が,トリアジン色素である,上記1乃至7のいずれかに記載の製造方法。
9.上記1乃至8のいずれかに記載の製造方法により得られた組換えヒトDNaseIを含有する画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して,組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップを更に含むものである,組換えヒトDNaseIの製造方法。
10.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが,0.5〜2.0mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至9のいずれかに記載の製造方法。
11.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが,0.8〜1.2mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至9のいずれかに記載の製造方法。
12.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが,2〜20mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至11のいずれかに記載の製造方法。
13.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが,8〜12mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,上記1乃至11のいずれかに記載の製造方法。
14.該哺乳動物細胞が,rhDNaseIを発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1アルファプロモーター,その下流にrhDNaseIをコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子を更に含む発現ベクターが導入されたものである,上記1乃至13のいずれかに記載の製造方法。
15.該内部リボソーム結合部位が,野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域の内部リボソーム結合部位に由来するものであり,且つ該内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである,上記14に記載の製造方法。
16.該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,上記15に記載の製造方法。
17.該哺乳動物細胞が,rhDNaseIを発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1アルファプロモーター,その下流にrhDNaseIをコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターが導入されたものである,上記1乃至13のいずれかに記載の製造方法。
18.該内部リボソーム結合部位が,野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域の内部リボソーム結合部位に由来するものであり,且つ該内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである,上記17に記載の製造方法。
19.該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,上記18に記載の製造方法。
20.上記1乃至19に記載の何れかの製造法により製造され,且つ960U/mg以上の比活性を示す組換えヒトDNaseI。
21.上記1乃至19に記載の何れかの製造法により製造され,且つ960〜1000U/mgの比活性を示す組換えヒトDNaseI。
Claims (21)
- 組換えヒトDNaseIの製造方法であって,
(a)組換えヒトDNaseIを産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換えヒトDNaseIを培養液中に分泌させるステップと,
(b)上記ステップ(a)で得られた培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収するステップと,
(c)上記ステップ(b)で得られた培養上清を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(d)上記ステップ(c)で回収された該画分をリン酸基に親和性をもつ材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(e)上記ステップ(d)で回収された該画分を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
(f)上記ステップ(e)で回収された該画分を色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップと,
をこの順で含んでなるものである,製造方法。 - 該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,強陰イオン交換体である,請求項1に記載の製造方法。
- 該強イオン交換体が,トリメチルアンモニウム基をもつものである,請求項2に記載の方法。
- リン酸基に親和性をもつ該材料が,フルオロアパタイト又はハイドロキシアパタイトのいずれかである,請求項1乃至3のいずれかに記載の製造方法。
- リン酸基に親和性をもつ該材料が,ハイドロキシアパタイトである,請求項4に記載の製造方法。
- 該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,強陽イオン交換体である,請求項1乃至5のいずれかに記載の製造方法。
- 該強イオン交換体が,スルホ基をもつものである,請求項6に記載の製造方法。
- 該色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素が,トリアジン色素である,請求項1乃至7のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1乃至8のいずれかに記載の製造方法により得られた組換えヒトDNaseIを含有する画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して,組換えヒトDNaseIを含有する画分を回収するステップを更に含むものである,組換えヒトDNaseIの製造方法。
- 該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが,0.5〜2.0mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,請求項1乃至9のいずれかに記載の製造方法。
- 該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが,0.8〜1.2mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,請求項1乃至9のいずれかに記載の製造方法。
- 該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが,2〜20mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,請求項1乃至11のいずれかに記載の製造方法。
- 該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーが,8〜12mMのカルシウムイオン存在下で行わるものである,請求項1乃至11のいずれかに記載の製造方法。
- 該哺乳動物細胞が,rhDNaseIを発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1アルファプロモーター,その下流にrhDNaseIをコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子を更に含む発現ベクターが導入されたものである,請求項1乃至13のいずれかに記載の製造方法。
- 該内部リボソーム結合部位が,野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域の内部リボソーム結合部位に由来するものであり,且つ該内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである,請求項14に記載の製造方法。
- 該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,請求項15に記載の製造方法。
- 該哺乳動物細胞が,rhDNaseIを発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1アルファプロモーター,その下流にrhDNaseIをコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターが導入されたものである,請求項1乃至13のいずれかに記載の製造方法。
- 該内部リボソーム結合部位が,野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域の内部リボソーム結合部位に由来するものであり,且つ該内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである,請求項17に記載の製造方法。
- 該内部リボソーム結合部位が,配列番号2の塩基配列を含むものである,請求項18に記載の製造方法。
- 請求項1乃至19に記載の何れかの製造法により製造され,且つ960U/mg以上の比活性を示す組換えヒトDNaseI。
- 請求項1乃至19に記載の何れかの製造法により製造され,且つ960〜1000U/mgの比活性を示す組換えヒトDNaseI。
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