KR20180053398A - Fc-함유 단백질의 발현 - Google Patents

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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 실질적으로 모든 Fc 도메인이 C-말단 라이신을 갖는, Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물을 제조하기 위한 숙주 세포, 상기 숙주 세포 및 조성물을 제조하는 방법, 및 이의 사용 방법이 추가로 제공된다.

Description

Fc-함유 단백질의 발현
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 9월 22일자로 출원된, 미국 가특허출원 제62/222,187호에 대한 우선권을 청구하며, 이의 기재내용은 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 화일에 대한 서열목록 제출
ASCII 텍스트 화일에 대한 하기 제출 내용은 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF) (파일명: 146392032640SEQLIST.TXT, 기록일자: 2016년 8월 18일, 크기: 5 KB).
기술 분야
본 발명은 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 대한 C-말단 라이신을 갖는다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 제조하기 위한 숙주 세포, 상기 숙주 세포의 제조 방법, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
치료학적 Fc 도메인-함유 단백질, 예를 들어, 단클론성 항체 및 Fc-함유 융합 단백질은 암, 자가면역 질환, 및 감염과 같은 질환 치료를 위한 중요 약물로서 떠올랐고, 현재 가장 빠르게 성장하는 치료학적 제제 그룹을 나타내고 있다 (참조: 예를 들어, Beck et al., Nat Rev Immunol, 10, 2010). 임상적으로, 폴리펩티드-기반 치료학적 제제는 그들의 높은 표적 특이성 정도 및 면역 반응에 관여하는 능력으로 인하여 효능있는 활성을 나타내왔다 (참조: 예를 들어, Sidhu, Nat Biotechnol, 25 , 2007). 그러나, 동종 폴리펩티드-기반 치료학적 제제의 상업적 제조는 폴리펩티드가 수많은 개질, 예를 들어, 상이한 디설파이드 쌍형성(pairing), 탈아미드화, 산화, N-말단 글루타민 고리화, 및 상이한 글리칸 구조에 적용되기 때문에 도전이 되고 있다 (참조: 예를 들어, Carson, Nat Biotechnol, 23, 2005). 더욱이, 폴리펩티드 개질의 존재 및 구조 일관성은 제조 조건에 상당히 민감하다. 생물학적 활성 폴리펩티드가 있는 면역글로불린 Fc 도메인의 포함은 생물학적 활성 제제에 증가된 혈장 반감기를 포함한, 유용한 생물학적 및 약물학적 특성을 제공함으로써, 치료학적 활성이 연장되고 투여가 덜 빈번해 질 수 있도록 한다 (참조: Czajkowsky et al., Mol Med, 4, 2012). 그러나, Fc 도메인의 존재는 Fc-함유 단백질 생성물의 이종성에 대한 잠재성, 예를 들어, 각각의 Fc 도메인에 대해 비교할 때, C-말단 라이신 존재의 변환을 추가로 증가시킨다.
생물 제제 (예: Fc-함유 단백질)의 제조에 대한 공업적 표준은 모든 임상용 및 상업용 배치에 대한 제품 일관성의 제시를 요한다. 폴리펩티드 생성물의 비교가능성 연구는 제조 파라미터, 예를 들어, 단계 I 내지 단계 III 동안 제조 최적화, 상업적 확장성, 및 상용화-후 변화를 일으키는 것들에 대한 변화가 따르는 일관성을 보장하기 위하여 수행되어야 한다. 제조 파라미터 변화는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 세포 배양 공정 파라미터, 세포 배양 배지, 숙주 세포, 정제, 저장 및 제형화에 대한 변화를 포함한다. 더욱이, 다중-부위 제조의 경우, 모든 제조 설비에 대한 제품 일관성이 보장되어야 한다. 폴리펩티드 속성 (예: Fc 도메인 C-말단 라이신 존재) 수준의 가변성 및 이종성은 제조 공정 제어의 결여 척도로 간주된다 (참조: Chirino et al., Nat Biotechnol, 22, 2004; 및 Kozlowski et al., J Pharm Sci, 97, 2006). 세포주의 차이 및 제조 공정, 예를 들어, 배양 조건에 대한 그들의 민감성은 최종 생성물의 특성에 영향을 준다. 예를 들어, 단클론성 항체 (2개의 중쇄로 이루어진)의 제조 도중, Fc 도메인 C-말단 라이신 가공, 즉, 절단은 0, 1 또는 2개의 Fc 도메인 C-말단 라이신 잔기를 함유하는 항체 동형체(isoform)의 혼합물을 생성한다. 상당한 Fc 도메인 C-말단 라이신 가공이 항체의 제조시 관찰될 수 있으며, 0 또는 1개의 Fc 도메인 C-말단 라이신을 함유하는 큰 퍼센트의 전체 항체 집단을 생성한다 (참조: Dick et al., Biotechnol Bioeng, 100, 2008). 이에 따라, Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 이종성은 치료학적 Fc-함유 단백질의 제조시 독특한 도전을 나타낸다.
광범위한 세포 배양 조건 최적화는 Fc-함유 단백질의 제조 도중 생성되는 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 이종성을 감소시키기 위해 연구되어 왔다. 예를 들어, 항체 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재에 대한 중금속(예: 아연)의 세포 배지 농도, 아미노산의 세포 배지 농도, pH 및 온도의 조절 효과가 미국 특허출원 제20130280274호에 기술되어 있다. 그러나, 미국 특허출원 제20130280274호에 제시된 바와 같이, 세포 배양 파라미터의 최적화는 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 이종성을 제거하지 못한다.
IgG1, IgG2 및 IgG4 이소형 면역글로불린의 Fc 도메인은 각각의 Fc 도메인의 C-말단에 보존된 염기성 아미노산 라이신을 함유한다. 이들 면역글로불린 이소 타입의 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 이종성은 세포 배양물 제조 동안 내인성 카복시펩티다제(들)에 의한 가단백질분해로부터 생성된다고 여겨진다 (참조: Harris, J Chromatogr A, 705, 1995; 및 Luo et al., Biotechnol Bioeng, 109, 2012). 카복시펩티다제는 단백질 및 펩티드의 C-말단으로부터 아미노산을 가수분해적으로 절단하는 효소이다. 대부분의 포유동물 종에서 발견된 13개의 공지된 카복시펩티다제 구성원이 있다 (참조: Reznik et al., Cell Mol Life Sci, 58, 2001). 상이한 카복시펩티다제 단백질 및 그들의 활성이 통상 사용되는 생성 숙주 세포인, CHO 세포에서 검출되었지만, 카복시펩티다제(들)가 Fc 도메인 C-말단 라이신의 제거에 책임이 있다고는 알려지지 않았다 (참조: Dick et al., Biotechnol Bioeng, 100, 2008). CpB 및 CpM을 포함하는 하나 이상의 카복시펩티다제가 Fc 도메인 C-말단 라이신 가공에 관여될 수 있음이 앞서 추측되었다 (참조: Dick et al., Biotechnol Bioeng, 100, 2008.; Harris, J Chromatogr A, 705, 1995; 및 Luoet al., Biotechnol Bioeng, 109, 2012).
본 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허, 특허출원 및 공개된 특허출원의 기재내용은 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된다.
Fc-함유 단백질의 발현을 위한 숙주 세포가 본원에서 제공되는데, 이때 숙주 세포는 CpD 유전자 비활성화가 없는 야생형(wild type) CpD 유전자를 포함하는 숙주 세포에 비하여, 카복시펩티다제 D (CpD) 발현 수준의 적어도 60% 감소를 갖는다.
상기 구현예중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예 있어서, 숙주 세포는 진핵세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) (CHO) 세포이다.
상기 구현예중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예 있어서, Fc-함유 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다.
상기 구현예중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예 있어서, Fc-함유 단백질은 Fc-함유 융합 단백질이다.
상기 구현예중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예 있어서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 siRNA에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 shRNA에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 결실에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 군집된, 주기적 간격을 둔, 짧은 회문 반복부 (clustered regularly interspaced, short palindromic repeats; CRISPR) 시스템을 사용하여 비활성화시킨다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease:TALEN)를 사용하여 비활성화시킨다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease;ZFN) 시스템을 사용하여 비활성화시킨다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 메가뉴클레아제(meganuclease) 시스템을 사용하여 비활성화시킨다.
상기 구현예중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예 있어서, 숙주 세포는 Fc-함유 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
상기 구현예중 어느 하나의 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 시스템이 본원에 제공된다.
숙주 세포의 제조 방법이 본원에 제공되는데, 이때 상기 방법은 숙주 세포에서 CpD 유전자를 비활성화시킴으로써, 상기 구현예중 어느 하나의 숙주 세포를 제조함을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 siRNA 시스템을 사용하여 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 shRNA 시스템을 사용하여 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 유전자 결실에 의해 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 유전자 부가 또는 치환에 의해 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 CRISPR 시스템을 사용하여 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용하여 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용하여 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포의 제조 방법은 메가뉴클레아제 시스템을 사용하여 CpD 유전자를 비활성화시킴을 포함한다.
a) 숙주 세포를 배양하는 단계; b) 상기 숙주 세포에 의해 발현된 Fc-함유 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 Fc-함유 단백질의 제조 방법이 본원에 제공된다.
복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물로, 이때 조성물중 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물의 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질은 하전 상태에서 실질적으로 균질하다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 Fc-함유 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 2개의 중쇄를 포함하며, 이때 각각의 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 약물에 콘주게이트된다. 일부 구현예에서, 조성물의 Fc-함유 단백질은 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 Fc-함유 단백질은 IgG2 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 Fc-함유 단백질은 IgG4 Fc 도메인을 포함한다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 멸균 약제학적 조성물이다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지이다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물은 세포 용해물이다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물은 단백질 정제 칼럼으로부터의 용리액이다.
상기 구현예에 기술된 약제학적 조성물 또는 멸균 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서의 질환 치료 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 개체에서의 질환 치료 방법은 조성물을 비경구적으로 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 개체에서의 질환 치료 방법은 조성물을 정맥내 또는 피하 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 개체에서의 질환 치료 방법은 조성물을 국부 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 개체에서의 질환 치료 방법은 조성물을 국소 투여함을 포함한다.
이들 및 본 발명의 다른 측면과 이점은 후속되는 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 분명해질 것이다. 본 명세서에 기술된 다양한 구현예의 특성중 하나, 일부 또는 모두는 본 발명의 다른 구현예를 형성하기 위하여 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1a 내지 1b는 세포주에서 내인성 카복시펩티다제의 qPCR mRNA 분석을 나타낸다. 각각의 오차 바(error bar)는 1 표준편차를 나타낸다. 도 1a는 DP12 및 CHOK1 숙주 세포에서 상대적인 카복시펩티다제 B (CpB), 카복시펩티다제 E (CpE), 카복시펩티다제 M (CpM), 카복시펩티다제 N1 (CpN1), 및 카복시펩티다제 D (CpD) mRNA 발현 수준을 나타낸다. 각각의 카복시펩티다제에 대한 mRNA의 발현 수준은 하우스키핑(housekeeping) 유전자 β-2-마이크로글로불린 (b2m)에 대해 정규화시켰다. 흰색 바는 DP12 숙주로부터의 측정치를 나타내며, 흑색 바는 CHOK1 숙주로부터 의 측정치를 나타낸다. 도 1b는 항체-발현 세포주에서 상대적인 카복시펩티다제 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 각각의 카복시펩티다제에 대한 mRNA의 발현 수준은 하우스키핑 유전자 b2m에 대해 정규화시켰다. 흰색 바는 항체-발현 세포주 A로부터의 측정치를 나타내며, 흑색 바는 항체-발현 세포주 B로부터의 측정치를 나타낸다.
도 2a 내지 2b는 항체-발현 세포주 A (흰색 바) 및 항체-발현 세포주 B (흑색 바)에서 카복시펩티다제 특이적 siRNA 작제물에 의한 형질감염에 이어지는 카복시펩티다제 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 각각의 오차 바는 1 표준편차를 나타낸다. 도 2a는 항체-발현 세포주 A 및 항체-발현 세포주 B에서 상대적인 CpD mRNA 발현 수준을 나타낸다. 회색 바는 세포주 A 및 세포주 B 모두에 대한 스크램블 작제물 형질감염 후 세포주에서의 CpD mRNA 수준을 나타내며; 흰색 바는 CpDi 작제물 형질감염 후 세포주 A에서의 CpD mRNA 수준을 나타내고; 흑색 바는 CpDi 작제물 형질감염 후 세포주 B에서의 CpD mRNA를 나타낸다. 각 세포주에서의 CpD mRNA 발현 수준은 스크램블 작제물에 의한 형질감염에 이어지는 각각의 세포주에서의 CpD 발현 수준과 비교하였다. 도 2b는 항체-발현 세포주 A 및 항체-발현 세포주 B에서 상대적인 CpN mRNA 발현 수준을 나타낸다. 회색 바는 스크램블 작제물 형질감염 후 세포주에서의 mRNA 수준을 나타내며; 흰색 바는 CpNi 작제물 형질감염 후 세포주 A에서의 mRNA 수준을 나타내고; 흑색 바는 CpNi 작제물 형질감염 후 세포주 B에서의 mRNA를 나타낸다. 각 세포주에서의 CpN mRNA 발현 수준은 스크램블 작제물에 의한 형질감염에 이어지는 각각의 세포주에서의 CpN 발현 수준과 비교하였다.
도 3은 항체-발현 세포주 A (흑색 바) 및 항체-발현 세포주 B (회색 바)에서 카복시펩티다제 특이적 siRNA 작제물에 의한 형질감염에 이어지는 발현된 항체의 C-말단 라이신 수준을 나타낸다.
도 4a 내지 4b는 야생형(wild type) (WT) 및 녹아웃(knockout)(KO) CpD 대립유전자의 모식도를 나타낸다. 도 4a는 야생형 CpD 대립유전자의 모식도를 나타낸다. 2개의 가이드 RNA (gRNA) 서열 (gRNA 1 및 gRNA 2)이 CRISPR을 통한 유전자 녹아웃을 위해, 각각 CHO CpD 유전자의 엑손 2 및 엑손 21을 표적으로 하기 위해 사용되었다. 두 gRNA 사이의 거리는 약 46 kb이다. CRISPR에 의해 제거시키려는 WT CpD 서열을 검출하기 위해 사용되는 정방향(forward) 및 역방향(reverse) PCR 프라이머는 WT.F 및 WT.R로 각각 나타낸다. 도 4b는 KO CpD 대립유전자의 모식도를 나타낸다. KO CpD 대립유전자를 검출하기 위해 사용되는 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 KO.F 및 KO.R로 각각 나타낸다.
도 5a 내지 5b는 항체-발현 세포주 B로부터의 2개의 CpD 녹아웃 클론에서의 CpD 발현 수준을 나타낸다. 도 5a는 2개의 CpD KO 클론 및 2개의 CpD WT 클론의 CpD RNA 발현 수준을 나타낸다. 도 5b는 2개의 CpD KO 클론 및 2개의 CpD WT 클론의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 6a 내지 6c는 항체-생성 세포주 B의 2개의 CpD KO 클론 및 2개의 CpD WT 클론의 유가식(fed-batch) 진탕 플라스크 평가 데이터를 나타낸다. 각각의 바는 두 복제물로부터의 평균을 나타낸다. 각각의 오차 바는 1 표준편차를 나타낸다. 도 6a는 14일째에 발현된 항체의 역가를 나타낸다. 도 6b는 하루당 세포당 피코그램(pg/cell/day)인 특정 생산성(Qp)을 나타낸다. 도 6c는 배양한 지 14일 후 1억 세포-일(cells-days)/리터(liter)인 통합된 생능 세포 계수(viable cell counts)를 나타낸다.
도 7은 항체-생성 세포주 B의 2개의 CpD KO 클론 및 2개의 CpD WT 클론에서 C-말단 라이신 수준을 나타낸다.
본 출원은 단백질의 단일 C-말단 아미노산을 가수분해하는 아연-결합 효소인, 카복시펩티다제 D (CpD)가 Fc 도메인 C-말단 라이신 가공 (즉, 절단)에 관여되는 유일한 카복시펩티다제라는 놀라운 발견을 기반으로 한다. 특히, 질량 분석기 분석을 사용하여, 본 발명자는 Fc 도메인 C-말단 라이신 절단이 CpD 녹아웃 세포에서 완전히 제거되었고, 이에 따라 CpD가 CHO 세포에서 항체 Fc 도메인 C-말단 라이신을 절단하는 유일한 내인성 카복시펩티다제임을 입증함을 보여줬다.
이에 따라, 본 출원은 감소된 CpD 발현 수준을 갖는 숙주 세포를 사용함으로써 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는 Fc-함유 단백질의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 제조된 생성물은 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재에 있어서 100% 동종성을 유도할 수 있다. 상기 방법은 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 상태에 대한 제조 조건을 변화시키는 효과를 고려할 필요성을 제거함으로써, Fc-함유 단백질의 제조 공정을 상당히 용이하게 한다. 예를 들어, Fc-함유 단백질의 제조를 위해 상기 방법의 사용은 복수의 제조 배치와 비교하여 (예: 복수의 임상용 및 상업용 배치의 비교) Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 가변성을 최소화하기 위해 세포 배양 조건을 최적화할 필요성을 제거한다. 또한, 예를 들어, Fc-함유 단백질의 제조를 위해 상기 방법의 사용은 Fc-함유 단백질의 다른 특성 (예: Fc-함유 단백질의 역가 및 번역후 개질의 존재)의 가변성 및 상태와 Fc 도메인 C-말단 라이신 존재의 가변성 최소화의 밸런스를 맞추기 위해 세포 배양 조건을 최적화할 필요성을 제거한다. 더욱이, Fc-함유 단백질을 제조하는 상기 방법은 Fc-함유 단백질의 후속 분석을 상당히 용이하게 한다. 예를 들어, Fc-함유 단백질의 제조를 위해 상기 방법의 사용은 이종 Fc 도메인 C-말단 라이신이 존재하는 복수의 Fc-함유 단백질의 전하 변이체를 검정하는 부가 단계 (예: 모든 Fc 도메인 C-말단 라이신을 제거하기 위해 CpB와의 항온처리를 포함하는 단계)를 포함시킬 필요성을 제거한다.
더욱이, Fc 도메인 C-말단 라이신의 보유는 Fc-함유 단백질 제조 동안 Fc 도메인 C-말단 아미노산의 후속 변화를 억제할 수 있다. 예를 들어, IgG1, IgG2 및 IgG3 면역글로불린의 보존된 Fc 도메인 C-말단 아미노산 서열은 프롤린-글라이신-라이신이다. Fc 도메인 C-말단 라이신의 절단은 말단 글라이신을 생성하여, 펩티딜글라이신 α-아미드화 모노옥시게나제가 2-단계 아미드화 반응을 촉매화하여 글라이신 잔기를 제거하고 IgG1, IgG2 및 IgG3의 프롤린에 아미드 잔기를 부가하도록 할 수 있다 (이 효소의 활성은 또한 배양 배지에서 구리 농도에 따라 좌우된다). Fc 도메인 C-말단 프롤린 아미드화 및 그의 정도는 Fc-함유 단백질 집단 내에서 전하 변이체를 추가로 생성할 수 있다.
따라서, 본 출원은 한 측면에 있어서, Fc-함유 단백질의 발현을 위한 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 감소된 카복시펩티다제 D (CpD) 발현 수준을 갖는다. 본 출원은 다른 측면에 있어서, 상기 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다. 본 출원은 또 다른 측면에 있어서, 숙주 세포의 제조 방법을 제공하는데, 이때 상기 방법은 숙주 세포에서 CpD 유전자를 비활성화시킴으로써, 숙주 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 본 출원은 숙주 세포를 배양시키고, 숙주 세포에 의해 발현된 Fc-함유 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 Fc-함유 단백질의 제조 방법을 제공한다. 본 출원은 또 다른 측면에 있어서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 조성물의 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다. 본 출원은 또 다른 측면에 있어서, 개체에 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서의 질환 치료 방법을 제공하며, 이때 상기 조성물은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, "Fc 도메인"은 면역글로불린 중쇄 또는 그의 C-말단 단편의 Fc 영역을 칭한다. 상기 용어는 야생형 Fc 도메인 및 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 도메인은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장된다 [아미노산 번호는 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)에 기술된 바와 같이, EU 인덱스라 또한 불리우는 EU 넘버링 시스템에 따른다). 일부 구현예에서, 상기 용어는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 단편 및 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3과, CH1 및 CH2 사이의 힌지를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "Fc-함유 단백질"은 Fc 도메인을 포함하는 단백질 (예: 항체 또는 Fc-함유 융합 단백질)을 칭한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 단백질 서브유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "Fc-함유 융합 단백질"은 적어도 한 개의 다른 이종성 단백질 유닛 또는 폴리펩티드에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 단백질을 칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단일 폴리펩티드 쇄를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "중쇄(heavy chain)"는 면역글로불린 중쇄를 칭한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예: 이중특이적 항체), 및 그들이 Fc 도메인을 포함하는 한 항체 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특별한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간화(humanized)" 항체는 비-인간 초가변성 영역 (HVR)으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인중 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 이때 HVR (예: CDR)중 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, FR중 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화된 항체를 칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단클론성 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득된 항체를 칭한다, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 동일하고/하거나, 예를 들어, 자연적으로 발생되는 돌연변이를 함유하거나 단클론성 항체 제제의 제조 도중 발생되는 가능한 변이체 항체, 예를 들어, 일반적으로 소량으로 존재하는 변이체를 제외하고, 동일한 에피토프에 결합된다. 통상적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 포함하는, 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 특성을 실질적으로 항체의 동종 집단으로부터 수득되는 것으로서 나타내고, 어떤 특별한 방법에 의한 항체 제조를 요하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체(immunoadhesin)"는 면역글로불린 불변 도메인의 효과기(effector) 기능과 이종 단백질 ("접합체")의 결합 특이성을 조합한 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역접합체는 아미노산 서열이 항원 인지 및 항체의 결합 부위가 아닌 다른 것인 (즉, 항체의 불변 영역에 비교되는 "이종성(heterologous)"인), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열, 및 면역글로불린 불변 도메인 서열 (예: IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열)의 융합을 포함한다. 예시적인 접합체 서열은 관심 단백질에 결합되는 수용체 또는 리간드의 일부를 포함하는 인접 아미노산 서열을 포함한다. 접합체 서열은 또한 관심 단백질에 결합하는 서열일 수 있지만, 수용체 또는 리간드 서열은 아니다 (예: 펩티바디의 접합체 서열). 상기 폴리펩티드 서열은 다양한 방법에 의해 선택되거나 확인될 수 있고, 파지 디스플레이 기술 및 고출력 분류법을 포함한다. 면역접합체의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, IgA (IgA1 및 IgA2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 단백질 또는 폴리펩티드 생성물을 생성할 수 있는 세포를 말한다. 예를 들어, 숙주 세포는 Fc-함유 단백질을 생성할 수 있다.
용어 "개체(individual)"는 포유동물을 칭하며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 임상적 결과를 포함한 유익하거나 바람직한 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명을 위하여, 유용하거나 바람직한 임상적 결과는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 질환으로부터 생성된 하나 이상의 증상 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화 (예: 질환 악화의 방지 또는 지연), 질환 확산 (예: 전이)의 방지 또는 지연, 질환 재발의 방지 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선, 질환의 회복(부분적 또는 완전) 제공, 질환을 치료하는데 필요한 하나 이상의 다른 약제의 용량 감소, 질환 진행의 지연, 삶의 질 증가, 및/또는 연장된 수명. 본 발명의 방법은 이들 치료 측면중 어느 하나 이상을 고려한다.
"치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 적어도 특별한 장애의 측정 가능한 개선을 수행하는데 필요한 최소 농도이다. 본 명세서에서 치료학적 유효량은 질환 상태, 나이, 성별 및 환자 체중과, 개체에서 원하는 반응을 나타내는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항체의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유용한 효과에 의해 보충되고도 남는 것이다. "예방학적 유효량(prophylactically effective amount)"은 필요한 용량 및 기간동안, 원하는 예방학적 효과를 성취하기 위한 유효량을 말한다. 통상적으로, 반드시는 아니지만, 예방학적 용량이 질환의 초기 단계 전에 또는 초기 단계에 대상에 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 수 있다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 측면 및 구현예는 측면 및 구현예로 "이루어짐(consisting)" 및/또는 "필수적으로 이루어짐"을 포함하는 것으로 이해한다.
"약(about)"에 대해, 본 명세서에서 값 또는 파라미터는 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 변화를 포함한다(및 기술한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "또는" 및 "the"는 내용이 달리 확실히 제시되지 않는 한 복수 관계를 포함한다.
숙주 세포
본 출원은 Fc-함유 단백질의 발현을 위한 숙주 세포를 제공하며, 이때 숙주 세포는 감소된 카복시펩티다제 D (CpD) 발현 수준을 갖는다.
사용될 수 있는 숙주 세포중에 진핵 세포, 예를 들어, 효모 또는 고등 진핵세포가 있다. 고등 진핵세포는 곤충 세포 및 완전 포유동물 기원의 세포주를 포함한다.
적절한 포유동물 숙주 세포의 예는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell, 23, 1981), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그들의 유도체, 예를 들어, 혈청-부재 배지에서 성장하는 Veggie CHO 및 관련 세포주 (Rasmussen et al., Cytotechnology, 28, 1998), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL10) 세포주, 및 문헌[McMahan et al., EMBO J, 10, 1991]에 기술된 바와 같은 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CVI로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70), 인간 배아 신장 세포 (예: 293, 293 EBNA, 또는 MSR 293), 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상적인 이배체 세포, 1차 조직의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포 균주, 1차 이식편, HL-60, U937, HaK, 또는 주카트(Jurkat) 세포를 포함한다. 선택적으로, 예를 들어, 포유동물 세포주 (예: HepG2/3B, KB, NIH 3T3 또는 S49)가 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. CHO 세포는 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Xu et al., Nat Biotechnol, 29, 2011). 일부 구현예에서, 숙주 세포는 DP12 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 DUXB-11 유래 DHFR-결핍 DP12 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHOK1 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 DHFR-양성 CHOK1 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHOK1M 숙주 세포이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 마우스 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Sp2/0 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 NS0 숙주 세포이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 하이브리도마이다. 일부 구현예에서, 하이브리도마는 항체-생성 세포이며, 이때 항체-생성 세포는 숙주를 항원으로 면역화시킨 다음 숙주로부터 수집한다. 일부 구현예에서, 항체-생성 세포는 골수종 세포와 융합된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 마우스 골수종-유래된 세포주이다.
대안적으로, 숙주 세포는 하등 진핵세포 (예: 효모)일 수 있다. 적절한 효모는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 균주(Kluyveromyces strains), 칸디다(Candida), 또는 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있는 어떤 효모 균주를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "감소된 CpD 발현 수준"은 CpD 유전자 비활성화가 없는 야생형 CpD 유전자를 포함하는 숙주 세포에 비하여, CpD 발현 수준의 적어도 60% 감소를 의미한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 비활성화 전 숙주 세포에 비하여, CpD 발현 수준의 적어도 60% 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%까지 감소된다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 적어도 95%까지 감소된다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 100%까지 감소된다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 약 60 내지 100%, 약 70% 내지 100%, 약 80% 내지 100%, 약 90% 내지 100%, 또는 약 95% 내지 100%까지 감소된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준의 감소는 DNA 수준을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준의 감소는 RNA 수준을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준의 감소는 폴리펩티드 수준을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 감소된 발현 수준은 유전자 비활성화에 이은 CpD 발현 수준을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 감소된 발현 수준은 DNA 수준을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 감소된 발현 수준은 RNA 수준을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 감소된 발현 수준은 폴리펩티드 수준을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준은 적어도 60%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준은 적어도 90%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준은 적어도 95%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화되며, 이때 CpD 발현 수준은 100%까지 감소된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 CpD 유전자는 비활성화된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "비활성화됨(inactivated)"은 유전자의 번역, 또는 잠재적인 향후 번역 (즉, 단백질 발현)의 억제를 의미한다. 비활성화는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 전사, 번역 및 단백질 발현을 포함한, 유전자 발현의 임의 단계 또는 공정에서 일어날 수 있고, 비활성화는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, DNA, RNA(예: mRNA) 및 폴리펩티드를 포함한, 임의 유전자 또는 유전자 생성물에 영향을 줄 수 있다.
숙주 세포의 CpD 유전자를 비활성화시키는 방법 및 기술은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 소간섭 RNA (siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA; 짧은 헤어핀 RNA로서 또한 언급됨), 군집된, 주기적 간격을 둔, 짧은 회문 반복부 (clustered regularly interspaced, short palindromic repeats; CRISPR), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 동종 재조합, 비-동종 말단-결합, 및 메가뉴클레아제를 포함한다 (참조: 예를 들어, O'Keefe, Mater Methods, 3, 2013; Doench et al., Nat Biotechnol, 32, 2014; Gaj et al., Trends Biotechnol, 31, 2014; 및 Silva et al., Curr Gene Ther, 11, 2011).
일부 구현예에서, CpD 유전자는 소간섭 RNA (siRNA) 시스템에 의해 비활성화된다. CpD 유전자 비활성화에 적합한 siRNA 서열을 확인하는 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, CpD 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 개발 및 확인하기 위한 일반적인 고려는 다음을 포함한다: a) 먼저 길이가 바람직하게는 21 내지 23개 뉴클레오티드인 서열을 찾음 (필요에 따라 서열 길이의 감소가 이어짐), b) 개시 코돈 및 종결 코돈의 50 내지 100개 염기쌍 내에 영역을 피함, c) 인트론 영역을 피함, d) 4개 이상의 염기 연신부 (예: AAAA)를 피함, e) 30% 미만 또는 60% 초과인 GC 함량을 갖는 영역을 피함, f) 반복부 및 낮은 서열 복잡도를 피함, g) 단일 뉴클레오티드 다형성 부위를 피함, 및 h) 다른 오프-타겟(off-target) 유전자의 서열에 상보적인 서열을 피함 (참조: 예를 들어, Rules of siRNA design for RNA interference, Protocol Online, May 29, 2004; 및 Reynolds et al., Nat Biotechnol, 22, 2004).
일부 구현예에서, siRNA 시스템은 길이가 약 10 내지 200개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 30개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드인 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 뉴클레오티드 서열은 길이가 대략 10 내지 25개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, siRNA 뉴클레오티드 서열은 길이가 대략 15 내지 25개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, siRNA 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 또는 적어도 약 25개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, siRNA 시스템은 CpD mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 시스템은 CpD pro-mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 시스템은 이중 가닥 RNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 시스템은 단일 가닥 RNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 siRNA 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 활성 siRNA 분자로 처리되는 pro-siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보성인 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 siRNA 분자를 암호화하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 pro-siRNA 분자를 암호화하는 발현 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, siRNA 시스템은 전달 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 전달 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 pro-siRNA 및/또는 siRNA 분자를 포함한다.
예시적인 CpD siRNA 표적 서열이 표 1에 제시되어 있다.
예시적인 CpD siRNA 표적 서열 siRNA.
서열 번호: CpD siRNA 뉴클레오티드 서열:
19 GGA AGA GAA CTG CTA CTA A
일부 구현예에서, CpD 유전자는 작은 헤어핀 RNA (shRNA; 짧은 헤어핀 RNA로서 또한 언급됨) 시스템에 의해 비활성화된다. shRNA 시스템에 의한 유전자 비활성화가 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, shRNA 시스템은 길이가 약 10 내지 200개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 30개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA 뉴클레오티드 서열은 길이가 대략 10 내지 25개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, shRNA 뉴클레오티드 서열은 길이가 대략 15 내지 25개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, shRNA 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 또는 적어도 약 25개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, shRNA 시스템은 CpD mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA 시스템은 CpD pro-mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA 시스템은 이중 가닥 RNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA 시스템은 단일 가닥 RNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 shRNA 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 활성 shRNA 뉴클레오티드 서열로 처리되는 pre-shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, pro-shRNA 분자는 DNA로 구성된다. 일부 구현예에서, pro-shRNA 분자는 DNA 작제물이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보성인 shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 shRNA 분자를 암호화하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 pro-shRNA 분자를 암호화하는 발현 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, shRNA 시스템은 전달 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 전달 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 pro-shRNA 및/또는 shRNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 결실에 의해 비활성화된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "유전자 결실"은 유전자로부터 또는 이에 근접해서 DNA 서열의 적어도 일부를 제거함을 의미한다. 일부 구현예에서, 유전자 결실된 서열은 유전자의 엑손 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 결실된 서열은 유전자의 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 결실된 서열은 유전자의 플랭킹(flanking) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 서열의 일부는 유전자로부터 제거된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 서열의 일부는 CpD 유전자로부터 또는 이에 근접해서 제거된다. 일부 구현예에서, 완전 유전자 서열이 염색체로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 완전 CpD 서열이 염색체로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 유전자 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD 유전자에서의 유전자 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD 유전자에 근접한 유전자 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의해 비활성화된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "유전자 부가" 또는 "유전자 치환"은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 삽입 또는 치환을 포함한, 유전자 서열의 변화를 의미한다. 일부 구현예에서, 유전자의 인트론 서열이 변경된다. 일부 구현예에서, 유전자의 엑손 서열이 변경된다. 일부 구현예에서, 유전자의 프로모터 서열이 변경된다. 일부 구현예에서, 유전자의 플랭킹 서열이 변경된다. 일부 구현예에서, 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍이 유전자 서열에 부가된다. 일부 구현예에서, 적어도 1개의 연속 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍이 유전자 서열에 부가된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서의 구현예중 어느 하나에 기술된 바와 같은 유전자 부가 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD 유전자에서의 유전자 부가 또는 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 결실에 의해 비활성화되며, 이때 유전자 서열에서 적어도 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 결실로 비-관능성 유전자 생성물이 생성된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 결실에 의해 비활성화되며, 이때 유전자 서열에 대한 적어도 1개 뉴클레오티드의 결실로 더 이상 고유 유전자 생성물 관능 또는 활성을 갖지 않는 유전자 생성물이 생성된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 결실에 의해 비활성화되며, 이때 유전자 서열에 대한 적어도 1개 뉴클레오티드의 결실로 기능이상 유전자 생성물이 생성된다.
일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의해 비활성화되며, 이때 CpD 유전자 서열로 적어도 1개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 부가 또는 치환으로 비-관능성 유전자 생성물이 생성된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 비활성화에 의해 비활성화되며, 이때 CpD 유전자 서열에 대한 적어도 1개 뉴클레오티드의 혼입 또는 치환으로 더 이상 고유 유전자 생성물 관능 또는 활성을 갖지 않는 유전자 생성물이 생성된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의해 비활성화되며, 이때 CpD 유전자 서열로 적어도 1개 뉴클레오티드의 혼입 또는 치환으로 기능이상 유전자 생성물이 생성된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 비-관능성 CpD 유전자 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 고유 CpD 유전자 생성물 관능 또는 활성을 갖지 않는 CpD 유전자 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 기능이상 CpD 유전자 생성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 비활성화된 CpD 유전자를 포함하며, 이때 비활성화된 CpD 유전자는 전장 및 관능성, CpD 유전자 생성물 (예: 전장 CpD 폴리펩티드 서열)을 발현하지 못할 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 비활성화된 CpD 유전자를 포함하며, 이때 비활성화된 CpD 유전자는 내인성 CpD 유전자 생성물 서열을 발현하지 못할 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 비활성화된 CpD 유전자를 포함하며, 이때 비활성화된 CpD 유전자는 변이체 CpD 유전자 생성물을 발현하지 못할 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 변이체 CpD 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 전달 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 아데노바이러스이다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 무변성 녹다운(knockdown) 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 무변성 CpD 녹다운 세포주이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 일시적(transient) 녹다운 세포주이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 일시적 CpD 녹다운 세포주이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD가 아닌 다른 비활성화된 유전자를 추가로 포함한다.
일반적으로, 숙주 세포는 원하는 Fc-함유 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질감염시킨다. 게다가, 본 출원의 숙주 세포는 블랭크 숙주 세포일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "블랭크 숙주(blank host)"는 Fc-함유 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 함유하지 않는 세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 블랭크 숙주 세포는 CHO 세포이다. 일부 구현예에서, 블랭크 숙주 세포는 마우스 세포이다.
본 명세서에 기술된 Fc-함유 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한 본 출원에 의해 제공된다. 본 발명에 의해 제공되는 핵산 분자는 모두 단일-가닥 및 이중-가닥 형태뿐만 아니라, 상응하는 상보적 서열인 DNA 및 RNA를 포함한다. DNA는, 예를 들어, cDNA, 게놈성 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 전장 유전자 또는 cDNA 분자뿐만 아니라, 이의 단편들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 제공된 핵산은 우선적으로 인간 공급원으로부터 유래된다.
본 명세서에 걸쳐 주지된 바와 같이, "단리된(isolated)" 핵산은 자연적으로-발생되는 공급원으로부터 단리된 핵산의 경우에, 핵산이 분리된 유기체의 게놈에 존재하는 인접한 유전적 서열로부터 단리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산 (예: PCR 생성물, cDNA 분자 또는 올리고뉴클레오티드)의 경우에, 상기 공정으로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산임을 이해한다. 단리된 핵산 분자는 별도의 단편 형태인 또는 더 큰 핵산 작제물의 성분으로서의 핵산 분자를 의미한다.
특정 구현예에서, 핵산은 실질적으로 내인성 물질의 오염으로부터 간섭받지 않는다. 핵산 분자는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태로 그리고, 표준 생화학적 방법에 의해 그의 성분 뉴클레오티드 서열을 확인, 조작 및 회수할 수 있도록 하는 양 또는 농도로 적어도 1회 분리된 DNA 또는 RNA로부터 유래되었다 [예: 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989))에 제시된 것들]. 상기 서열은 바람직하게는 통상 진핵생물 유전자에 존재하는 내부 비-번역된 서열, 또는 인트란에 의해 간섭받지 않는 개방 판독 프레임(open reading frame)의 형태로 제공되고/되거나 작제된다. 번역되지 않은 DNA 서열은 개방 판독 프레임으로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있으며, 이때 이들은 암호화 영역의 조작 또는 발현을 간섭하지 않는다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 Fc-함유 단백질을 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Fc-함유 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Fc-함유 단백질을 분비할 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD 유전자 비활성화 전에 유사한 숙주 세포의 생산 속도로 Fc-함유 단백질을 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD 유전자 비활성화 전에 동일한 숙주 세포의 생산 속도로 Fc-함유 단백질을 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CpD 유전자 비활성화 전에 숙주 세포의 생산 속도의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%로 Fc-함유 단백질을 발현시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 추가로 유전자 개질을 포함한다. 유전자 개질을 통한 Fc-함유 단백질의 제조를 위한 숙주 세포의 최적화가 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 글리코실화 패턴, 통합법을 위한 벡터 선택 특성, 및 Fc-함유 단백질의 제조를 위해 조작하는 것이 바람직한 임의의 다른 세포 특성에 관한 고려사항을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 개질은 표적화된 유전자 개질이다. 일부 구현예에서, 유전자 개질은 녹아웃 유전자 개질이다. 일부 구현예에서, 유전자 개질은 녹-인(knock-in) 유전자 개질이다.
Fc -함유 단백질
본 출원은 Fc-함유 단백질을 제공하며, 이때 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 갖는다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 2개의 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 적어도 1개의 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 2개의 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 Fc 도메인을 포함하며, 이때 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 적어도 1개의 Fc 도메인을 포함하며, 이때 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 Fc 도메인을 포함하며, 이때 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 2개의 Fc 도메인을 포함하며, 이때 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 중쇄를 포함하며, 이때 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 적어도 1개의 중쇄를 포함하며, 이때 각각의 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 중쇄를 포함하며, 이때 각각의 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 2개의 중쇄를 포함하며, 이때 각각의 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 다합체(multimeric) 단백질이다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 Fc-함유 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질은 하나 이상의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질은 각각 C-말단 라이신을 포함하는, 하나 이상의 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질의 Fc 도메인은 Fc-함유 융합 단백질의 혈장 반감기를 연장시킨다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질의 Fc 도메인은 Fc-함유 융합 단백질의 생물학적 활성을 연장시킨다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질의 Fc 도메인은 Fc-함유 융합 단백질의 신장 청소율을 감소시킨다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질의 Fc 도메인은 Fc-함유 융합 단백질의 용해도를 증가시킨다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질의 Fc 도메인은 Fc-함유 융합 단백질의 안정성을 증가시킨다.
Fc-함유 융합 단백질이 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Czajkowsky et al., EMBO Mol Med, 4, 2012). 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질은 면역접합체이다. 일부 구현예에서, Fc-함유 융합 단백질은 사이토카인-Fc 융합 단백질이다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 한 제제에 콘주게이트된다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 한 제제의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 분자에 콘주게이트된다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 한 제제의 약 2-10, 약 4-10, 약 6-10 또는 약 8-10개 분자에 콘주게이트된다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 한 제제에 콘주게이트되며, 이때 제제는 Fc-함유 단백질의 Fc 도메인에 콘주게이트된다. 일부 구현예에서, 제제는 치료학적 제제이다. 일부 구현예에서, 치료학적 제제는 소분자 치료학적 제제이다. 일부 구현예에서, 치료학적 제제는 화학요법 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 검출제이다. 일부 구현예에서, 검출제는 방사성표지이다. 일부 구현예에서, 검출제는 형광성 표지이다. 일부 구현예에서, 검출제는 면역표지이다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 동반진단성(companion diagnostic)이다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신을 포함하는 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG1 Fc 도메인을 포함하며, 각각 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 IgG1 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신을 포함하는 IgG1 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG1 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG1 중쇄를 포함하며, 각각 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 IgG2 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신을 포함하는 IgG2 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG2 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG2 Fc 도메인을 포함하며, 각각 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 IgG2 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신을 포함하는 IgG2 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG2 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG2 중쇄를 포함하며, 각각 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신을 포함하는 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG4 Fc 도메인을 포함하며, 각각 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 IgG4 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신을 포함하는 IgG4 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG4 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 하나 이상의 IgG4 중쇄를 포함하며, 각각 중쇄는 C-말단 라이신을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질은 번역-후 개질을 포함한다. 일부 구현예에서, 번역후 개질은 비-효소적으로 일어난다. 일부 구현예에서, 번역후 개질은 효소적으로 일어난다. 일부 구현예에서, 번역후 개질은 디설파이드 쌍형성, 탈아미드화, 산화, N-말단 글루타민 고리화, 및 글리코실화로 이루어진 군으로부터 선택된다.
복수의 Fc -함유 단백질을 포함하는 조성물
본 출원은 다른 측면에 있어서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질의 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 모두(substantially all)"는, 예를 들어, 95% 또는 100%를 포함한, 적어도 약 90%를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 100%가 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 약 90% 내지 100%가 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 100%가 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질이 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 동일한 Fc 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 동일한 중쇄 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 Fc 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 중쇄 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 90% 내지 100%가 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 90% 내지 100%가 동일한 Fc 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 약 90% 내지 100%가 동일한 중쇄 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 100%가 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 100%가 동일한 Fc 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 100%가 동일한 중쇄 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질은 전하 상태에서 실질적으로 동종성이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "전하 상태에서 실질적으로 동종성"은 복수의 Fc-함유 단백질중 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 전하를 가짐을 의미한다. Fc-함유 단백질의 전하 (예: 표면 전하 및 순전하)가 상기 Fc-함유 단백질의 분자 조성에 따라 상당히 좌우됨이 당해 분야에서 잘 이해되고 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 전하 상태에서 실질적으로 동종성인 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 표면 전하를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 전하 상태에서 실질적으로 동종성인 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 순전하를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 전하 상태에서 실질적으로 균질한 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 각각의 Fc-함유 단백질은 복수의 Fc-함유 단백질중 각각에 대해 비교할 때, 아미노산 서열의 위치에서 아미노산 잔기에 대해 동일한 전하를 갖는다 (예: -1, 0, +1). 일부 구현예에서, 조성물은 전하 상태에서 실질적으로 동종성인 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 각각의 Fc-함유 단백질은 동일한 표면 전하를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 전하 상태에서 실질적으로 균질한 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 각각의 Fc-함유 단백질은 동일한 순전하를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 전하 상태에서 실질적으로 동종성인 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는데, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 동일한 pI를 갖는다. 일부 구현예에서, 전하는 Fc-함유 단백질 (예: 아미노산 잔기)과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 전하는 Fc-함유 단백질의 번역-후 개질과 관련이 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 저장을 위한 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 제품 수송을 위한 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결시킨다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결건조시킨다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 재구성된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 투여 조성물이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 투여하기 위한 형태로 존재한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 멸균 약제학적 조성물이다. 멸균 약제학적 제제는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 약제학적-등급 멸균화 표준에 따라 화합되거나 제조된다 (예: United States Pharmacopeia Chapters 797, 1072, and 1211; California Business&Professions Code 4127.7; 16 California Code of Regulations 1751, 21 Code of Federal Regulations 21, 또는 상기 규정에 대한 전직-미국 관계자).
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 무변성 제형이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "무변성" 제형은 그 안의 Fc-함유 단백질이 저장시 필수적으로 물리적 및 화학적 안정성과 완전성을 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당해 분야에서 이용가능하고, 예를 들어, 문헌(Jones, Adv Drug Delivery Rev, 10, 1993)에서 검토된다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 저장 도중 응집 정도가 단백질 안정성의 척도로서 사용될 수 있다. 따라서, "무변성" 제형은 Fc-함유 단백질의 약 10% 미만 및 바람직하게는 약 5% 미만이 제형에서 응집체로서 존재하는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 재구성된 제형이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "재구성된(reconstituted)" 제형은 Fc-함유 단백질이 철저히 분산되도록 동결건조된 Fc-함유 단백질 제형을 희석제에 용해시킴으로써 제조된 것이다. 재구성된 제형은 그것이 필요한 개체에 투여하기에 적합하다 (예: 정맥내 또는 피하 투여).
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 등장성 제형이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "등장성(isotonic)" 제형은 필수적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성 제형은 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 용어 "저장성(hypotonic)"은 인간 혈액의 것 미만의 삼투압을 갖는 제형을 기술한다. 상응하게, 용어 "고장성(hypertonic)"은 인간 혈액의 것보다 높은 삼투압을 갖는 제형을 기술하기 위하여 사용된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 명시된 pH에서 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5-7, 약 5-6, 또는 약 5-5.5의 pH로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5.3의 pH로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5.4의 pH로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 pH 조절된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분이 아닌 다른, 약제학적 조성물의 성분을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 용량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 완충제 (예: 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산); 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 (예: 메틸 또는 프로필 파라벤); 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질 (예: 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 친수성 중합체 (예: 폴리비닐피롤리돈); 아미노산 (예: 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신); 단당류, 이당류, 및 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 (예: EDTA); 당 (예: 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨); 염-형성 카운터-이온 (예: 나트륨); 금속 복합체 (예: Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 (예: 폴리에틸렌 글리콜(PEG)). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용가능한 담체는 간극 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질 [예: rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)]을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 나트륨 아세테이트, 수크로즈, 폴리소르베이트 (예: 폴리소르베이트 20), 나트륨 석시네이트, 히스티딘 HCl 및 염화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 산을 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 산"은 그들이 제형화된 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기산을 포함한다. 예를 들어, 적절한 무기산은 염산, 과염소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 술폰산, 술핀산, 술파닐산, 인산, 카본산 등을 포함한다. 적절한 유기산은, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 2-하이드록시아세트산, 트리플루오로아세트산, 페닐아세트산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸 아세트산, 안트라닐산, 프로파노산, 2-하이드록시프로파노산, 2-옥소프로파노산, 프로판디오산, 사이클로펜탄프로피온산, 사이클로펜탄 프로피온산, 3-페닐프로피온산, 부타노산, 부탄디오산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 아스코르브산, 신남산, 라우릴 술푸르산, 스테아르산, 무콘산, 만델산, 숙신산, 엠본산, 푸마르산, 말산, 말레산, 하이드록시말레산, 말론산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 글리콜산, 글리콘산, 글루콘산, 피루브산, 글리옥살산, 옥살산, 메실산, 숙신산, 살리실산, 프탈산, 팔모산, 말메산, 티오시안산, 메틴술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, p-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸바이사이클로[2,2,2]-옥트-2-에네-1-카복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-3-(하이드록시-2-에네-1-카복실산), 하이드록시나프토산을 포함한, 직쇄 및 분지형-쇄 알킬, 방향족, 사이클릭, 지환족, 아릴지방족, 헤테로사이클릭, 포화, 불포화, 모노, 디- 및 트리-카복실산을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 염기를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염기"는 그들이 제형화된 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기 염기를 포함한다. 예를 들어, 적절한 염기는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, N-메틸글루카민, 모르폴린, 피페리딘과 같은 금속을 형성하는 무기 염기 및 1차, 2차 및 3차 아민, 치환된 아민, 사이클릭아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 트리메타민, 디사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 및 폴리아민 수지 등을 포함하는 유기 비독성 염기로부터 형성되는 것들을 포함한다. 특히 바람직한 유기 비-독성 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리에타민, 디사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
본 발명에 사용될 수 있는 추가의 약제학적으로 허용가능한 산 및 염기는 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 글라이신, 페닐알라민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신 및 아스파라긴으로부터 유래되는 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 완충제 또는 염, 예를 들어, 상기 제시된 산 및 염기의 산 및 염기 부가염으로부터 모두 유래된 것들을 추가로 포함한다. 특정 완충제 및/또는 염은 히스티딘, 숙시네이트 및 아세테이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 당을 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 당"은 Fc-함유 단백질과 합해진 경우, 저장시 Fc-함유 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 상당히 방지하거나 감소시키는 분자이다. 제형이 동결건조된 다음 재구성되는 경우에, "약제학적으로 허용가능한 당"은 또한 "동결건조보호제(lyoprotectant)"로서 공지될 수 있다. 예시적인 당 및 그들의 상응하는 당 알콜은 다음을 포함한다: 아미노산(예: 일나트륨 글루타메이트 또는 히스티딘); 메틸아민(예: 베타인); 유방성(lyotropic) 염(예: 황산마그네슘); 폴리올(예: 3가 또는 더 큰 분자량의 당 알콜, 예를 들어, 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨); 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; PLURONICS®; 및 이들의 조합. 부가의 예시적인 동결건조보호제는 글리세린 및 젤라틴과, 당 밀리비오즈, 말레지토즈, 라피노즈, 만노트리오즈 및 스타키오즈를 포함한다. 환원당의 예는 글루코즈, 말토즈, 락토즈, 말툴로즈, 이소-말툴로즈 및 락툴로즈를 포함한다. 비-환원당의 예는 당 알콜 및 다른 직쇄 폴리알콜로부터 선택되는 폴리하이드록시 화합물의 비-환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알콜은 모노글리코시드, 특히 이당류(예: 락토즈, 말토즈, 락툴로즈 및 말툴로즈)의 환원에 의해 수득되는 화합물이다. 글리코시드 측쇄 그룹은 글루코시딕 또는 갈락토시딕일 수 있다. 당 알콜의 부가 예는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말툴로즈이다. 바람직한 약제학적으로 허용가능한 당은 비-환원당 트레할로즈 또는 수크로즈이다. 약제학적으로 허용가능한 당은 "보호량" (예: 동결-전)으로 제형에 부가되는데, 이는 단백질이 저장 동안 (예: 재구성 및 저장 후) 필수적으로 그의 물리적 및 화학적 안정성과 완전성을 보유함을 의미하는 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 보존제를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 보존제"는 세균 활성을 감소시키기 위하여 본 원의 제형에 부가될 수 있는 화합물이다. 잠재적인 보존제의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 그룹이 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물) 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 형태의 보존제는 방향족 알콜 (예: 페놀, 부틸 및 벤질 알콜), 알킬 파라벤 (예: 메틸 또는 프로필 파라벤), 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물은 세포 배양 배지이며, 여기서 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 영양 배지이다. 영양 배지는 숙주 세포 성장에 필요한 모든 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 최소 배지이다. 최소 배지는, 예를 들어, 일반적으로 아미노산의 존재없이, 숙주 세포 성장을 위해 가능한 최소 영양소를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 선택 배지이다. 선택 배지는 선택된 유기체의 성장을 억제하는 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 세포 지지 및/또는 성장을 위한 세포 배양 배지 영양소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지 영양소는, 예를 들어, 다음으로부터 선택된다: 단백질; 펩티드; 아미노산; 탄수화물; 금속 및 무기물, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 철; 미량 금속, 예를 들어, 인산염 및 황산염; 완충제; pH 지시제, 예를 들어, 페놀 레드, 브로모-크레졸 퍼플; 및 항미생물제.
일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 숙주 세포를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 실질적으로 숙주 세포가 없다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포 용해물이다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 복수의 Fc-함유 단백질 및 숙주 세포 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 원심분리된 세포 용해물이다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 세포 용해물의 침전 부분 및 세포 용해물의 상청액 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 세포 용해물의 펠릿화 부분 및 세포 용해물의 상청액 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 단백질 정제 칼럼으로부터의 용리액이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "용리액(eluate)"은 단백질 정제 칼럼을 통해 통과된 임의의 유체를 의미한다. 일부 구현예에서, 용리액은 유동-관통(flow-through) 유체로부터 분리된 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리액은 세척 유체로부터 분리된 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리액은 하나 이상의 세척 유체로부터 분리된 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리액은 용출 유체로부터 분리된 유체를 포함한다.
Fc-함유 단백질을 농축하기 위한 단백질 정제 칼럼이 당해 분야에 공지되어 있다. 다음은 단백질 정제 칼럼의 예시적 형태이다: 면역친화성, 단백질 A, 단백질 G, 이온-교환, 역상, 양이온-교환, 강양이온-교환, 음이온 교환, 소수성, 혼합 모달, 하이드록실아파타이트 및 겔 여과.
일부 구현예에서, 조성물은 복수의 Fc-함유 단백질중 Fc-함유 단백질의 적어도 2개가 상이한, Fc-함유 단백질의 라이브러리이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 상이한 항원에 결합된 적어도 2개의 Fc-함유 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 상이한 에피토프에 결합된 적어도 2개의 Fc-함유 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 Fc-함유 단백질이 상이한 용기에 함유된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 30, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 10000, 25000, 50000, 75000, 100000, 250000, 500000, 750000, 1000000, 2500000, 5000000, 7500000, 10000000, 또는 10000000개 초과의 상이한 Fc-함유 단백질을 포함하는 라이브러리를 제공한다.
배치
본 출원은 본원 구현예에 기술된 조성물중 어느 하나의 대규모 배치 (예: 상업용 배치 또는 제조 스케일의 배치)를 제공한다.
일부 구현예에서, 배치는 적어도 약 5 g, 10 g, 50 g, 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1,000 g, 1,500 g, 2,000 g, 2,500 g, 3,000 g, 3,500 g, 4,000 g, 4,500 g, 또는 5,000 g의 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 각각의 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 배치는 적어도 약 5-5,000 g, 50-4,000 g, 또는 약 100-1,000 g의 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 이때 복수의 Fc-함유 단백질중 각각의 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
일부 구현예에서, 배치는 약물 저장을 위한 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 배치는 제품 수송을 위한 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 배치는 이를 필요로 하는 개체에 투여하기 위한 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 배치는 동결건조시킨다. 일부 구현예에서, 배치는 제제에 콘주게이트되지 않는다. 일부 구현예에서, 배치는 제제에 콘주게이트된다. 일부 구현예에서, 배치는 제형 성분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 배치는 세포 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 배치는 세포 용해물이다.
일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 용기에 존재한다. 일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 바이알에 존재한다. 일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 복수의 바이알에 존재한다. 일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 시린지에 존재한다.
일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 복수의 바이알에 존재하며, 이때 각각의 바이알은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하고, 여기서 각각의 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 복수의 바이알에 존재하며, 이때 각각의 바이알은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하며, 각각의 바이알의 복수의 Fc-함유 단백질중 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 배치 또는 이의 일부는 복수의 바이알에 존재하며, 이때 바이알의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 포함하는 복수의 Fc-함유 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 배치는 단위 투여량으로 나뉜다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "단위 투여량(unit dosage)"은 단일 단위 용량으로서 투여하기 위한 Fc-함유 단백질의 양이다. 일부 구현예에서, 단일 단위 용량은 약 1 내지 약 500 mg의 Fc-함유 단백질이다. 일부 구현예에서, 단위 투여량은 용기에 포장된다. 일부 구현예에서, 단위 투여량은 바이알에 포장된다.
일부 구현예에서, 상업용 배치의 크기는 임상용 배치 크기의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 이하이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "상업용 배치(commercial batch)"는 상업적 제조 및/또는 분배를 위해 완결된 하나 이상의 제조 수행 도중 생성된 Fc-함유 단백질의 양을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "임상용 배치(clinical batch)"는 임상적 시험을 위해 완결된 하나 이상의 제조 수행 도중 생성된 Fc-함유 단백질의 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 상업용 배치의 크기는 임상용 배치 크기의 10배 이하이다.
일부 구현예에서, 용기는 본 명세서에 기술된 바와 같은 상업용 배치 모액을 포함하며, 이때 상업용 배치는 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 바이알은 본 명세서에 기술된 바와 같은 상업용 배치 모액을 포함하며, 이때 상업용 배치는 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 시린지는 본 명세서에 기술된 바와 같은 상업용 배치 모액을 포함하며, 이때 상업용 배치는 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 갖는다.
세포 배양 시스템
본 발명은 본 명세서의 구현예에 기술된 임의의 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 Fc-함유 단백질의 제조를 위한 환경에서 숙주 세포를 유지한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 성장을 위한 환경에서 숙주 세포를 유지한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 씨드 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 접종물 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, 접종물 배양은 1차 접종물 배양이다. 일부 구현예에서, 접종물 배양은 2차 접종물이다. 일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 생산 배양을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 특정 환경에서 숙주 세포를 유지하기 위한 메카니즘을 포함한다. 일부 구현예에서, 특정 환경은 특정 온도이다. 일부 구현예에서, 특정 온도는 약 15 °C 내지 약 45 °C이다. 일부 구현예에서, 특정 온도는 약 30 °C이다. 일부 구현예에서, 특정 환경은 특정 pH이다. 일부 구현예에서, 특정 환경은 특정 용해 산소 농도이다. 일부 구현예에서, 특정 환경은 특정 영양 수준이다.
일부 구현예에서, 세포 배양은 세포 배지를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 시스템은 씨드 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 접종물 배양이다. 일부 구현예에서, 접종물 배양은 1차 접종물 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 접종물 배양 배지는 2차 접종물 배지이다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 생산 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 배양 시스템은 본 명세서의 구현예에 기술된 바와 같은 Fc-함유 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 시스템은 본 명세서의 구현예에 기술된 바와 같은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 시스템은 본 명세서의 구현예에 기술된 바와 같은 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 시스템은 Fc-함유 단백질을 포함하고, 여기서 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc 도메인은 C-말단 라이신을 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 시스템은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하고, 여기서 복수의 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc-함유 단백질은 C-말단 라이신 Fc 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 시스템은 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 복수의 Fc-함유 단백질의 각각의 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
CpD 발현 수준이 감소된 숙주 세포의 제조 방법
본 출원은 본 명세서의 구현예에 기술된 임의의 숙주 세포의 제조 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 숙주 세포의 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다.
일반적으로, 숙주 세포의 제조 방법은 숙주 세포의 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 CpD 발현 수준이 감소된, 숙주 세포의 제조 방법은 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 약 10 내지 200개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 30개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드인 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 대략 10-25개 뉴클레오티드인 siRNA 서열을 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 대략 15-25개 뉴클레오티드인 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 또는 적어도 약 25개 뉴클레오티드인 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD pro-mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상보성인 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 이중 가닥 RNA 분자를 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 단일 가닥 RNA 분자를 포함하는 siRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 예시적인 CpD siRNA 뉴클레오티드 서열이 표 1에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 siRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 siRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함하며, 이때 siRNA 시스템은 siRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 전기천공을 사용하여 siRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 형질감염 기술을 사용하여 siRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 바이러스를 사용하여 siRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 숙주 세포에서 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정은 숙주 세포로 siRNA 뉴클레오티드 서열을 전달하기 전에 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정은 숙주 세포로 siRNA 뉴클레오티드 서열을 전달한 후 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 RNA 수준에서 측정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 PCR을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 단백질 수준으로 측정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 면역조직화학을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 웨스턴 블롯(Western blot)을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 유세포 분석을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 대조군 값으로 siRNA를 전달한 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 야생형 값으로 siRNA를 전달한 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 CpD siRNA의 전달 전 CpD 발현 수준으로 siRNA를 전달한 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다.
RNA 수준으로 CpD 수준을 측정하기 위한 예시적인 프라이머 및 프로브가 표 2에 제공된다.
CpD의 RNA 발현 수준을 측정하기 위한 예시적인 뉴클레오티드 서열.
서열 번호: 뉴클레오티드 서열:
CpD 정방향 프라이머 1 CCC ACA CAT TAC AAA TCT TAC CA
CpD 역방향 프라이머 2 GAG ATT TCG AGG GAC CAA AT
CpD 프로브 3 TTG GGA CAG AGT GCT GAG TAT CGT CA
일부 구현예에서, 숙주 세포가 CpD 발현 수준이 감소된, 숙주 세포의 제조 방법은 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 약 10 내지 200개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 60개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 50개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 10 내지 30개 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 15 내지 30개 뉴클레오티드인 shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 대략 10-25개 뉴클레오티드인 shRNA 서열을 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 대략 15-25개 뉴클레오티드인 shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 길이가 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 또는 적어도 약 25개 뉴클레오티드인 shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD pro-mRNA 분자 영역에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상보성인 shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 이중 가닥 RNA 분자를 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 단일 가닥 RNA 분자를 포함하는 shRNA 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 예시적인 CpD shRNA 뉴클레오티드 서열이 표 1에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 shRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 shRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함하며, 이때 shRNA 시스템은 shRNA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 전기영동을 사용하여 shRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 형질감염 기술을 사용하여 shRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 바이러스를 사용하여 shRNA 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 숙주 세포에서 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정은 숙주 세포로 shRNA 뉴클레오티드 서열을 전달하기 전에 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정은 숙주 세포로 shRNA 뉴클레오티드 서열을 전달한 후 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 RNA 수준에서 측정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 PCR을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 단백질 수준으로 측정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 면역조직화학을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 웨스턴 블롯을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정 방법은 유세포 분석을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 대조군 값으로 shRNA를 전달한 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 야생형 값으로 shRNA를 전달한 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 CpD shRNA의 전달 전 CpD 발현 수준으로 shRNA를 전달한 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다.
RNA 수준에서 CpD 수준을 측정하기 위한 예시적인 프라이머 및 프로브가 표 2에 제공된다.
또한, 유전자 결실 또는 유전자 부가 또는 치환에 의한 숙주 세포의 제조 방법이 본 출원에 제공된다. 예를 들어, 방법은 이로써 제한되는 것은 아니지만, CRISPR, TALEN, ZFN 및 메가뉴클레아제 시스템을 포함한다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 카스파제 단백질 (예: Cas9), 및 관심 서열에 상보성인, 가이드 서열로서 언급되는, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 서열을 포함한다. 카스파제 및 RNA 서열은 숙주 세포의 DNA 서열을 확인하는 복합체를 형성하고, 이어서 카스파제의 뉴클레아제 활성은 DNA 가닥의 절단을 허용한다. 카스파제 이소형은 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA 뉴클레아제 활성을 갖는다. CRISPR 시스템에 사용된 가이드 RNA 서열의 설계 및 가이드 RNA 서열의 수는 유전자의 특정 연신부 제거 및/또는 DNA 서열의 부가를 허용한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 DNA 엔도뉴클레아제 유전자를 포함하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CAS 유전자를 포함하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CAS9 유전자를 포함하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CAS9 유전자를 암호화하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 Cas 단백질을 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 Cas9 단백질을 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 Cas9 단백질과 상호작용할 수 있는 RNA 분자를 암호화하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 가이드 RNA(gRNA) 유닛을 포함하는 RNA 분자를 암호화하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 gRNA 유닛은 CpD 유전자 서열의 일부에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 gRNA 유닛을 포함하는 RNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 gRNA 유닛은 CpD 유전자 서열의 일부에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA) 유닛을 포함하는 RNA 분자를 암호화하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 tracrRNA 유닛을 포함하는 RNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 gRNA 유닛 및 tracrRNA 유닛을 포함하는 RNA 분자를 암호화하는 암호화 벡터를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 gRNA 유닛은 유전자 서열의 일부에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 gRNA 유닛 및 tracrRNA 유닛을 포함하는 RNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 gRNA 유닛은 CpD 유전자 서열의 일부에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은: a) gRNA 유닛을 포함하는 제1 RNA 분자 (여기서, gRNA 유닛은 CpD 유전자 서열의 일부에 상보성인 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다); 및 b) gRNA 유닛을 포함하는 제2 RNA 분자 (여기서, gRNA 유닛은 CpD 유전자 서열의 일부에 상보성인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다)를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열에 상보성인 CpD 유전자 일부 영역보다 상이한 위치에 존재하는 CpD 유전자 서열의 일부에 상보성이다.
gRNA 서열에 포함된 예시적인 CpD 표적 서열이 표 3에 제시되어 있다.
gRNA 서열에 포함된 예시적인 CpD 표적 서열.
서열 번호: CpD 표적 서열:
21 GAA GAC GAG ACT TTC AAA GAC GG
22 TCA GTT AGG TGG CTT AGG TTC GG
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CRISPR 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 전달 벡터를 사용하여 CRISPR 시스템을 포함하는 벡터를 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 아데노바이러스이다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로모터이다.
일반적으로, TALEN 시스템은 DNA 서열의 인지 및 후속되는 이중-가닥 DNA 절단을 허용하는 1개 이상의 제한 뉴클레아제 및 2개 이상의 단백질 복합체를 포함한다. TALEN 시스템의 단백질 복합체는 각각 특정 뉴클레오티드 및 제한 뉴클레아제 도메인을 인지하는, 수많은 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE)를 포함한다. 일반적으로, TALEN 시스템은 제한 뉴클레아제의 2개 도메인 (각각의 단백질 복합체로부터의 것)이 활성 뉴클레아제를 형성하고 특정 DNA 서열을 절단할 수 있도록 하는 방식으로, 각각 TALE 및 제한 뉴클레아제 도메인을 포함하는, 2개의 단백질 복합체가 DNA 서열에 개별적으로 결합하도록 설계된다. TALEN 시스템으로 절단되는 단백질 복합체 및 서열 수의 설계는 유전자의 특정 연신부의 제거 및/또는 DNA 서열의 부가를 허용한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 제1 TALEN 유닛을 포함하는 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 TALEN 유닛은 제1 TALEN 결합 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 TALEN 결합 유닛은 적어도 1개의 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE) 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제1 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 TALE는 제1 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 TALEN 유닛은 제2 TALEN 결합 유닛을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 TALEN 결합 유닛은 적어도 1개의 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE) 및 제2 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제2 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 TALE는 제2 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 TALEN 결합 유닛 및 제2 TALEN 결합 유닛은 CpD 유전자의 상이한 서열에 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인 및 제2 뉴클레아제 도메인은 활성 제한 엔도뉴클레아제를 포함하도록 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인 및 제2 뉴클레아제 도메인은 활성 Fok1 효소를 포함하도록 결합된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 제2 TALEN 유닛을 추가로 포함하는 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 TALEN 유닛은 제3 TALEN 결합 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 TALEN 결합 유닛은 적어도 1개의 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE) 및 제3 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제3 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제3 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제3 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 TALE는 제3 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제2 TALEN 유닛은 제4 TALEN 결합 유닛을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 TALEN 결합 유닛은 적어도 1개의 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE) 및 제4 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제4 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제4 TALEN 결합 유닛은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 TALE 및 제4 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 TALE는 함께 결합되며, 결합된 TALE는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 TALE는 제4 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제3 TALEN 결합 유닛 및 제4 TALEN 결합 유닛은 CpD 유전자의 상이한 서열에 결합된다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제4 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제4 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제4 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인 및 제4 뉴클레아제 도메인은 활성 제한 엔도뉴클레아제를 포함하도록 결합된다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인 및 제4 뉴클레아제 도메인은 활성 Fok1 효소를 포함하도록 결합된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 CpD 유전자 서열의 상이한, 비-중첩 부분에 결합되는 제1 TALEN 유닛 및 제2 TALEN 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 제1 TALEN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 제1 TALEN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함하고, TALEN 시스템은 제2 TALEN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 제1 TALEN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함하고, TALEN 시스템은 제1 TALEN 유닛 및 제2 TALEN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 제1 TALEN 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 제2 TALEN 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 TALEN 시스템은 제1 TALEN 유닛 및 제2 TALEN 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 TALEN 결합 유닛은 결합된 TALE 그룹을 포함하며, 이때 TALE 그룹은 뉴클레오티드 서열을 인지한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 CpD 유전자 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 CpD 유전자 프로모터 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 CpD 유전자를 플랭킹하는 서열 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 CpD 유전자 부분과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상동성이다. 일부 구현예에서, 서열은 CpD 유전자 프로모터 부분과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상동성이다. 일부 구현예에서, 서열은 CpD 유전자를 플랭킹하는 서열 부분과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상동성이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 TALEN 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 전달 벡터를 사용하여 TALEN 시스템을 포함하는 벡터의 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 아데노바이러스이다.
일반적으로, ZFN 시스템은 DNA 서열의 인지 및 후속되는 이중-가닥 DNA 절단을 가능하게 하는 1개 이상의 제한 뉴클레아제 및 2개 이상의 단백질 복합체를 포함한다. ZFN 시스템의 단백질 복합체는 각각 특정 뉴클레오티드 코돈을 인지하는 수많은 아연 핑거, 및 제한 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일반적으로, ZFN 시스템은 제한 뉴클레아제의 두 도메인 (각각의 단백질 복합체로부터의 것)이 활성 뉴클레아제를 형성하고 특정 DNA 서열을 절단할 수 있도록 하는 방식으로, 각각 아연 핑거 및 제한 뉴클레아제 도메인을 포함하는, 2개의 단백질 복합체가 DNA 서열에 개별적으로 결합하도록 설계된다. ZFN 시스템으로 절단되는 단백질 복합체 및 서열 수의 설계는 유전자의 특정 연신부의 제거 및/또는 DNA 서열의 부가를 허용한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 제1 ZFN 유닛을 포함하는 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ZFN 유닛은 제1 ZFN 결합 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ZFN 결합 유닛은 적어도 1개의 아연 핑거 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제1 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제1 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 아연 핑거는 제1 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 ZFN 유닛은 제2 ZFN 결합 유닛을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 ZFN 결합 유닛은 적어도 1개의 아연 핑거 및 제2 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제2 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제2 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 아연 핑거는 제2 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 ZFN 결합 유닛 및 제2 ZFN 결합 유닛은 CpD 유전자의 상이한 서열에 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인 및 제2 뉴클레아제 도메인은 활성 제한 엔도뉴클레아제를 포함하도록 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레아제 도메인 및 제2 뉴클레아제 도메인은 활성 Fok1 효소를 포함하도록 결합된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 제2 ZFN 유닛을 추가로 포함하는 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 ZFN 유닛은 제3 ZFN 결합 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 ZFN 결합 유닛은 적어도 1개의 아연 핑거 및 제3 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제3 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제3 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 징거 핑커 및 제3 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 아연 핑거는 제3 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제2 ZFN 유닛은 제4 ZFN 결합 유닛을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 ZFN 결합 유닛은 적어도 1개의 아연 핑거 및 제4 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제4 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제4 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지한다. 일부 구현예에서, 제4 ZFN 결합 유닛은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아연 핑거 및 제4 뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이때 아연 핑거는 함께 결합되며, 결합된 아연 핑거는 CpD 뉴클레오티드 서열의 일부를 인지하고, 결합된 아연 핑거는 제4 뉴클레아제 도메인에 추가로 결합된다. 일부 구현예에서, 제3 ZFN 결합 유닛 및 제4 ZFN 결합 유닛은 CpD 유전자의 상이한 서열에 결합된다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제4 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제4 뉴클레아제 도메인은 제한 엔도뉴클레아제의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제4 뉴클레아제 도메인은 Fok1의 도메인이다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인 및 제4 뉴클레아제 도메인은 활성 제한 엔도뉴클레아제를 포함하도록 결합된다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레아제 도메인 및 제4 뉴클레아제 도메인은 활성 Fok1 효소를 포함하도록 결합된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 CpD 유전자 서열의 상이한, 비-중첩 부분에 결합되는 제1 ZFN 유닛 및 제2 TALEN 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 제1 ZFN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 제1 ZFN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함하고, ZFN 시스템은 제2 ZFN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 제1 ZFN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함하고, ZFN 시스템은 제1 ZFN 유닛 및 제2 ZFN 유닛을 암호화하는 암호화 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 제1 ZFN 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 제2 ZFN 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함하며, 이때 ZFN 시스템은 제1 ZFN 유닛 및 제2 ZFN 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 ZFN 결합 유닛은 결합된 아연 핑거 그룹을 포함하며, 이때 아연 핑거 그룹은 뉴클레오티드 서열을 인지한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 CpD 유전자 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 CpD 유전자 프로모터 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 CpD 유전자를 플랭킹하는 서열 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 서열은 CpD 유전자 부분과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상동성이다. 일부 구현예에서, 서열은 CpD 유전자 프로모터 부분과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상동성이다. 일부 구현예에서, 서열은 CpD 유전자를 플랭킹하는 서열 부분과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100% 상동성이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 ZFN 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 전달 벡터를 사용하여 ZFN 시스템을 포함하는 벡터의 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 아데노바이러스이다.
일반적으로, 메가뉴클레아제 시스템은 DNA 서열의 인지 및 후속 이중-가닥 DNA 절단을 가능하게 하는 하나 이상의 메가뉴클레아제를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 메가뉴클레아제 시스템을 사용한 CpD 유전자의 비활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 메가뉴클레아제는 길이가 약 8 내지 약 35개 뉴클레오티드 염기쌍인 DNA 인지 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 메가뉴클레아제는 길이가 약 12 내지 약 30개 뉴클레오티드 염기쌍인 DNA 인지 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, DNA 인지 서열은 CpD 유전자 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, DNA 인지 서열은 CpD 유전자 프로모터 부분을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, DNA 인지 서열은 CpD 유전자를 플랭킹하는 서열 부분을 포함하는 서열이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 메가뉴클레아제 시스템을 숙주 세포에 전달함을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 전달 벡터를 사용하여 메가뉴클레아제 시스템을 포함하는 벡터의 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 아데노바이러스이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 감소된 CpD 발현 수준을 갖는, 숙주 세포의 제조 방법은 유전자 결실 또는 유전자 부가 또는 치환과 같은, CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 유전자 결실이 검출된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 유전자 부가 또는 치환이 검출된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 발현의 수준은 숙주 세포에서 유전자 비활성화 시키기 전에 측정한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 발현 수준은 숙주 세포에서 CpD 유전자를 비활성화시키기 위해 CRISPR 시스템을 사용한 후 측정한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 발현 수준은 숙주 세포에서 CpD 유전자를 비활성화시키기 위해 TALEN 시스템을 사용한 후 측정한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 발현 수준은 숙주 세포에서 CpD 유전자를 비활성화시키기 위해 ZFN 시스템을 사용한 후 측정한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 CpD 유전자 비활성화 수준의 측정을 포함하며, 이때 CpD 발현 수준은 숙주 세포에서 CpD 유전자를 비활성화시키기 위해 메가뉴클레아제 시스템을 사용한 후 측정한다.
일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 DNA 수준으로 측정된다. 일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 RNA 수준에서 측정된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 PCR을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 PCR을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함하며, 이때 변이체 서열이 검출된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 qPCR을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 qPCR을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다.
일부 구현예에서, CpD 발현 수준은 단백질 수준으로 측정된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 면역조직화학을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 웨스턴 블롯을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 제조 방법은 유세포 분석을 사용한 CpD 발현 수준의 측정을 포함한다.
일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 대조군 값으로 CpD 유전자 비활성화 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, CpD 유전자 비활성화 수준은 CpD 유전자 비활성화 전 CpD 발현 수준으로 CpD 유전자 비활성화 후 CpD 발현 수준을 비교함으로써 결정된다.
또한, CpD 발현의 측정을 포함하는 Fc-함유 단백질의 발현 적합성에 대한 숙주 세포의 평가 방법이 제공되는데, 이때 감소된 CpD 발현 수준이 적합성의 척도이다.
Fc -함유 단백질의 제조 방법
본 출원은 본 명세서의 구현예에 기술된 Fc-함유 단백질의 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 제조 방법은: a) 숙주 세포를 배양하는 단계; b) 숙주 세포에 의해 발현된 Fc-함유 단백질을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 제조 방법은: a) Fc-함유 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; b)숙주 세포를 배양하는 단계; c) 숙주 세포에 의해 발현된 Fc-함유 단백질을 수득하는 단계를 포함한다.
발현 벡터를 사용한 숙주 세포의 형질전환 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Kim et al., Anal Bioanal Chem, 397, 2010). 숙주 세포의 형질감염 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 형질감염(transfection), 감염, 인산칼슘 공-침전, 전기천공술, 미세주입법, 리포펙션(lipofection), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 또는 다른 공지된 기술을 포함한다. 선택된 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포의 형태의 함수일 수 있다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법이 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
본 명세서에 기술된 적어도 1개의 Fc-함유 단백질을 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태인 발현 시스템 및 작제물이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트는 적어도 1개의 Fc-함유 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포에 사용된 발현 벡터는 플라스미드 유지 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유할 것이다. 특정 구현예에서, 집약적으로 "플랭킹 서열"로 언급되는 상기 서열은 통상 1개 이상의 하기 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다: 프로모터, 1개 이상의 인핸서(enhancer) 서열, 복제 기원, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이싱 부위를 함유하는 완전 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 Fc-함유 단백질을 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택 가능한 마커 요소. 이들 서열은 각각 하기에서 논의된다.
플랭킹 서열은 동종성 (즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종성 (즉, 숙주 세포 종 또는 균주와 다른 종으로부터), 하이브리드 (즉, 1개 이상의 공급원으로부터의 플랭킹 서열의 조합), 합성 또는 고유 상태일 수 있다. 또한, 플랭킹 서열의 공급원은 진핵세포 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있되, 단 플랭킹 서열은 숙주 세포 기작에서 작용하고, 이에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 플랭킹 서열은 당해 분야에 잘 공지된 몇몇 방법중 어느 하나에 의해 수득할 수 있다. 통상적으로, 본원에 유용한 플랭킹 서열은 맵핑 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 이미 확인되어 왔고, 이에 따라 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적절한 조직 공급원으로부터 분리시킬 수 있다. 어떤 경우에, 플랭킹 서열의 완전한 뉴클레오티드 서열이 알려질 수 있다. 여기서, 플랭킹 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위해 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
플랭킹 서열중 모두 또는 단지 일부만이 알려져있든지 간에, 그것은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하고/하거나, 동일하거나 다른 종으로부터 올리고뉴클레오티드 및/또는 플랭킹 서열 단편과 같은 적절한 프로브에 의해 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 플랭킹 서열이 알려져있지 않은 경우, 플랭킹 서열을 함유하는 DNA 단편은, 예를 들어, 암호화 서열 또는 심지어 다른 유전자 또는 유전자들을 함유할 수 있는 보다 큰 DNA 조작으로부터 단리될 수 있다. 단리는 적절한 DNA 단편을 생성하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 분해에 이은, 아가로즈 겔 정제, Qiagen® 칼럼 크로마토그래피 (Chatsworth, CA), 또는 숙련가에게 공지된 다른 방법을 사용한 단리에 의해 성취할 수 있다. 이 목적을 성취하기 위한 적절한 효소의 선택은 당해 분야의 통상의 숙련가중 누군가에게 용이하게 명확할 것이다.
복제 기원은 통상 상업적으로 구입되는 부분 발현 벡터이고, 기원은 숙주 세포에서 벡터의 증폭을 돕는다. 선택된 벡터가 복제 기원 부위를 함유하지 않는다면, 공지된 서열을 기반으로 하여 화학적으로 합성하고, 벡터로 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 다양한 바이러스 기원 (예: SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 유두종 바이러스 (예: HPV 또는 BPV))이 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요치 않다 (예를 들어, SV40 기원은 종종 단지 그것이 바이러스 초기 프로모터를 또한 함유하기 때문에 사용된다).
전사 종결 서열은 통상 폴리펩티드 암호화 영역의 말단에 대해 3'에 위치하며, 전사를 종결하는 역할을 한다. 서열이 라이브러리로부터 용이하게 클로닝되거나 심지어 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되지만, 그것은 또한 본 명세서에 기술된 것들과 같은 핵산 합성을 위한 방법을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다.
선택 가능한 마커 유전자는 선택 배양 배지에서 성장시킨 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 통상적인 선택 마커 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소에 대한 내성을 부여하거나; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하거나; 또는 (c) 복합체 또는 한정 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 특정 선택 가능한 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유용하게는, 네오마이신 내성 유전자가 또한 진핵 숙주 세포에서 선택을 위해 사용될 수 있다.
다른 선택 가능 유전자가 발현될 유전자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질 제조에 필요한 유전자가 재조합 세포의 연속적 세대의 염색체 내에서 병렬로 되풀이되는 과정이다. 포유동물 세포를 위한 적절한 선택 가능 마커의 예는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 프로모터없는 티르니딘 키나제 유전자를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환주를 선택 압력하에 놓는데, 이때 단지 형질전환주는 벡터에 존재하는 선택 가능한 유전자 덕분에 생존하도록 독특하게 채택된다. 선택 압력은 배지중 선택 제제의 농도가 연속적으로 증가되는 조건하에 형질전환된 세포를 배양하고, 이에 의해 다른 유전자 (예: 항체 경쇄 또는 중쇄)를 암호화하는 DNA 및 선택 가능한 유전자 모두의 증폭을 유도함으로써 부과된다. 결과적으로, 증가된 폴리펩티드 양이 증폭된 DNA로부터 합성된다.
리보솜-결합 부위는 대개 mRNA의 번역 개시에 필요하고, 예를 들어, Kozak 서열에 의해 특성화된다. 요소는 통상 프로모터에 대해 3' 및 발현될 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 5'에 위치한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 암호화 영역은 내부 리보솜 결합 부위 (IRES)에 작동가능하게 결합되어, 단일 RNA 전사물로부터 2개의 개방 판독 프레임의 번역을 허용할 수 있다.
본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는 통상 숙주 유기체에 의해 인지되고 폴리펩티드를 암호화하는 분자에 작동가능하게 결합된 프로모터를 함유할 것이다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 조절하는 구조 유전자의 개시 코돈 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)에 대해 상류 (즉, 5')에 위치한 비전사 서열이다. 프로모터는 통상적으로 두 그룹중 하나로 분류된다: 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터. 유도성 프로모터는 배양 조건(예: 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도 변화)에서 일부 변화에 대한 반응으로 그들의 조절하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 한편, 구성적 프로모터는 그들이 작동가능하게 결합된, 즉 유전자 발현에 대한 조절이 거의 없는 유전자를 균일하게 전사한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 복수의 프로모터가 잘 공지되어 있다. 적절한 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고, 원하는 프로모터 서열을 벡터에 삽입시킴으로써, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 결합시킨다.
효모 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터가 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유용하게 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 사용하기에 적절한 프로모터가 잘 공지되어 있고, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 바이러스 [예: 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 닭 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 가장 바람직하게는, 원숭이 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40)] 게놈으로부터 수득되는 것을 포함한다. 다른 적절한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 열-충격(heat-shock) 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
관심 대상일 수 있는 부가의 프로모터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: SV40 초기 프로모터 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터 (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터 (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); 메탈로티오닌 유전자로부터의 프로모터 및 조절 서열 (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물에 이용되어 온, 하기 동물 전사 조절 영역이 또한 관심대상이다: 췌장 선방 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역 (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); 림프성 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276); 간에서 활성인 알파-페타-단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171); 골수성 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역 (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason et al.,1986, Science 234: 1372-1378).
인핸서 서열은 고등 진핵생물에 의해 본 발명의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 벡터로 삽입시킬 수 있다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는, 길이가 대개 약 10-300 bp인, DNA의 시스-작용 요소이다. 인핸서는 비교적 배향 및 위치에 무관하며, 전사 유닛에 대해 위치 5' 및 3'에서 모두 발견되었다. 포유동물 유전자로부터 이용가능한 몇몇 인핸서 서열이 알려져 있다 (예: 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 통상적으로 바이러스로부터의 인핸서가 사용된다. 당해 분야에 알려진 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸싱 요소이다. 인핸서는 암호화 서열에 대해 5' 또는 3'로 벡터에 위치할 수 있지만, 통상적으로 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다. 적절한 고유 또는 이종성 신호 서열을 암호화하는 서열 (리더 서열 또는 신호 펩티드)이 발현 벡터로 혼입되어, 항체의 세포외 분비를 촉진시킬 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 항체가 생성되는 숙주 세포의 형태에 따라 좌우되고, 이종성 신호 서열은 고유 신호 서열을 대체할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 작용하는 신호 펩티드의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허 제4,965,195호에 기술된 인터류킨-7 (IL-7)에 대한 신호 서열; 문헌(Cosman et al.,1984, Nature 312:768)에 기술된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; 유럽 특허 제0367 566호에 기술된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; 미국 특허 제4,968,607호에 기술된 타입 I 인터류킨-I 수용체 신호 펩티드; 유럽 특허 제0 460 846호에 기술된 타입 II 인터류킨-I 수용체 신호 펩티드.
벡터는 그것이 숙주 세포 게놈으로 통합되는 경우 빌현을 용이하게 하는 하나 이상의 요소를 함유할 수 있다. 그 예는 EASE 요소 (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19: 1433-38) 및 기질 부착 영역 (MAR)을 포함한다. MAR은 염색질의 구조적 조직을 매개하며, "위치" 효과로부터 통합된 벡터를 분리할 수 있다. 따라서, MAR은 특히 벡터가 무변성 형질감염체를 생성하기 위해 사용되는 경우에 유용하다. 수많은 천연 및 합성 MAR-함유 핵산이 당해 분야에, 예를 들어, 미국 특허 제6,239,328호; 제7,326,567호; 제6,177,612호; 제6,388,066호; 제6,245,974호; 제7,259,010호; 제6,037,525호; 제7,422,874호; 제7.129,062호에 공지되어 있다.
본 발명에 의해 제공되는 발현 벡터는 출발 벡터 (예: 시판용 벡터)로부터 작제될 수 있다. 상기 벡터는 원하는 플랭킹 서열을 모두 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 본 명세서에 기술된 하나 이상의 플랭킹 서열이 이미 벡터에 존재하지 않는 경우, 그들은 개별적으로 수득되어 벡터로 결찰될 수 있다. 플랭킹 서열을 각각 수득하는데 사용되는 방법이 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
벡터가 작제되어 Fc-함유 단백질 서열을 암호화하는 핵산 분자를 벡터의 적절한 부위로 삽입시킨 후, 완전 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현에 적합한 숙주 세포로 삽입시킬 수 있다.
Fc-함유 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터의 제조 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,923,221호).
Fc-함유 단백질 및 원하는 암호화 및 조절 서열을 포함하는 적절한 벡터의 작제는 표준 결찰 기술을 사용한다. DNA 단편의 단리된 플라스미드는 필요한 플라스미드를 형성하는데 바람직한 형태로 절단하고, 맞추고, 재결합시킨다. 사용된 방법은 DNA 공급원, 또는 의도하는 숙주에 따라 좌우되지 않는다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 제조 방법은 숙주 세포로 도입시키기 위한 폴리뉴클레오티드의 최적비의 측정을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 질량분석법이 Fc-함유 단백질 수율을 측정하는데 사용되며, 그 비는 Fc-함유 단백질 수율을 최대화하도록 조절된다. 일부 구현예에서, 이중 항원 ELISA가 Fc-함유 단백질 수율을 측정하는데 사용되며, 그 비는 Fc-함유 단백질 수율을 최대화하도록 조절된다.
숙주 세포의 배양 방법이 당업자에게 잘 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Li et al., MAbs, 2, 2010). 본 명세서의 구현예의 원하는 Fc-함유 단백질을 제조하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양시킬 수 있다. 시판용 배지, 예를 들어, 햄스(Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth Enz, 58, 1979, Barnes et al., Anal Biochem, 102, 1980], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; 국제 특허출원 WO 90/03430 또는 WO 87/00195; 또는 미국 특허 재등록 제30,985호에 기술된 배지중 어느 하나가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지중 어느 하나는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (대개 마이크로몰(micromolar) 범위로 최종 농도에 존재하는 무기 화합물로서 정의된), 및 글루코즈 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충시킬 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건 (예: 온도, pH 등)은 앞서 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것들이며, 통상의 숙련가에게는 명확할 것이다.
일반적으로, Fc-함유 단백질의 제조는 대규모 (예: 상업적 규모)로 수행된다. 상업적 규모의 제조에 적합한 숙주 세포 집단을 성취하기 위하여, 당해 분야의 통상의 숙련가는 숙주 세포 집단을 확장시키기 위한 단계적 접근법을 사용하는 유용성을 인지할 것이다. 예를 들어, 상기 공정은 숙주 세포 집단 (예: 씨드 트레인)을 증가시킬 수 있도록 원하는 숙주 세포를 보다 작은 규모로 성장시킴을 포함한다. 숙주 세포 집단을 추가로 증가시키기 위하여, 방법은 일반적으로 보다 큰 배양 탱크 (예: 접종물 탱크)를 접종시키기 위해 씨드 트레인의 사용을 포함했다. 종종, 크기를 증가시킨 일련의 접종물 탱크가 숙주 세포 집단 (예: 접종물 트레인)을 확장시키는데 사용된다. 이 공정은 제조 배양시 배양을 위해 적합한 숙주 세포 집단을 제공할 것이다. 일부 구현예에서, 제조 배양은 1000 L 배양 탱크이다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 제조 방법은 배치 공급법을 사용한 숙주 세포의 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 제조 방법은 연속 공급법을 사용한 숙주 세포의 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 제조 방법은 배치 공급법 및 연속 공급법을 포함하는 공급법을 사용한 숙주 세포의 배양을 포함한다.
Fc-함유 단백질의 수득 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Huse et al. J Biochem Bioph Meth, 51, 2002). Fc-함유 단백질은 세포내 제조되거나 배지로 직접 분비될 수 있다. Fc-함유 단백질이 세포내 제조된다면, 제1 단계로서, 미립자 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편이, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Fc-함유 단백질이 배지로 분비된다면, 상기 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 먼저 시판용 단백질 농도 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 일부 구현예에서, 프로테아제 억제제가 가단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계중 어느 하나에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 조성물은, 예를 들어, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제시킬 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 Fc-함유 단백질에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 좌우된다. 단백질 A는 1, 2 또는 4개의 중쇄를 함유하는 인간 면역글로불린을 기반으로 하는 Fc-함유 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, Lindmark et al., J Immunol Meth, 62, 1983). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 3에 대해 권고된다 (참조: 예를 들어, Guss et al., EMBO, 5, 1986). 친화성 리간드가 부착되는 기질은 종종 아가로즈이지만, 다른 기질이 이용가능하다. 역학적으로 무변성 기질 (예: 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌-디비닐)벤젠)은 아가로즈에 의해 성취될 수 있는 것 보다 빠른 유량 및 보다 단축된 가공 시간을 허용한다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어, 이온-교환 칼럼상의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지상 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 (예: 폴리아스파르트산 칼럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수될 Fc-함유 단백질에 따라 이용가능하다.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 정제 방법은 필터의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 필터는 정용여과 시스템이다. 일부 구현예에서, 필터는 한외여과 시스템이다. 일부 구현예에서, 필터는 바이러스 여과 시스템이다. 일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 정제는 일련의 여과 단계의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 일련의 여과 단계는 다음중 적어도 하나로부터 선택된다: 정용여과, 한외여과 및 바이러스 여과.
일부 구현예에서, Fc-함유 단백질의 정제 방법은 여과, 단백질 A 정제, 양이온 교환 정제, 강양이온 교환 정제, 음이온 교환 정제, 역상 정제 및 멀티모드 정제로부터 선택된 일련의 단백질 정제 기술의 사용을 포함한다.
C-말단 라이신 존재의 측정 방법이 또한 본 출원에 제공된다. 일부 구현예에서, C-말단 라이신 존재의 측정 방법은 등전점 포커싱(isoelectric focusing), 예를 들어, 영상화된 모세관 등전점 포커싱(imaged capillary isoelectric focusing)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 라이신 존재의 측정 방법은 질량분석법의 사용을 포함한다.
치 료 방법
본 출원은 본 명세서의 구현예에 기술된 약제학적 조성물을 개체에 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 복수의 Fc-함유 단백질 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하며, 이때 실질적으로 모든 복수의 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인에 C-말단 라이신을 갖는다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 다양한 경로로, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 폐내, 경구, 흡입, 수포내, 근육내, 기관내, 피하, 안구내, 척수내 또는 경피를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 비경구 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 정맥내 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 피하 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 국소적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 국소 투여될 수 있다.
본 명세서의 방법에 의해 치료될 수 있는 질환은 Fc-함유 단백질로 치료될 수 있는 임의의 질환이다. 일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 질환은 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 질환은 감염이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 다른 투여 양상 또는 치료범과 병용하여 사용된다.
당해 분야의 숙련가는 몇몇 구현예가 본 발명의 범위 및 취지 내에서 가능함을 인지할 것이다. 본 발명은 이제 하기 비-제한적 실시예를 참조로 보다 상세히 기술될 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하는 것이지만, 물론 어떠한 방법으로든 그의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1:
카복시펩디다제 D는 차이니즈 햄스터 난소 ( CHO ) 세포에서 C-말단 라이신 절단에 관여한다
방법 :
세포주 A는 DUXB-11-기반 DHFR 결핍 DP12 숙주로부터 유래된 인-하우스 개발된 항체-생성(in-house developed antibody-producing) (IgG1) 세포주이다 (참조: Hu et al., Biotechnol Prog, 29, 2013; Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci, 77, 1980). 세포주 B는 CHOK1 숙주로부터 유래된 인-하우스 개발된 항체-생성 (IgG1) 세포주이다 (참조: Hu et al., Biotechnol Prog, 29, 2013). CHO 세포는 150 rpm, 37 °C 및 5% CO2 로 125 ml 진탕 플라스크에서 전매(proprietary) DMEM/F12-기반 배지에서 배양시켰다. 세포는 3 내지 4일 마다 3x105/mL의 씨딩 밀도로 통과시켰다.
총 RNA는 RNeasy 96 키트 (Cat# 74181, Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 분리시켰고, DNase 분해 (Cat# 79254, RNase 부재 DNase 키트, Qiagen, Valencia, CA)로 처리하여 단리된 RNA 샘플에 존재할 수 있는 임의의 잔류 DNA를 제거시켰다. Taqman은 제조업자의 지시에 따라 유니버설 qRT-PCR 매스터 혼합물을 사용하여 수행하였다 (Cat# 4309169, Applied Biosystems, Foster City, CA). 상이한 카복시펩티다제의 발현 수준은 하우스키핑 유전자, β-2-마이크로글로불린(β2m)으로 정규화시켰다.
Taqman 분석에 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 다음과 같다:
CpD 정방향 프라이머: CCC ACA CAT TAC AAA TCT TAC CA (서열 번호: 1);
CpD 역방향 프라이머: GAG ATT TCG AGG GAC CAA AT (서열 번호: 2);
CpD 프로브: TTG GGA CAG AGT GCT GAG TAT CGT CA (서열 번호: 3);
CpN 정방향 프라이머: GTG GGA TCA ATC ACG ATG TC (서열 번호: 4);
CpN 역방향 프라이머: CCT TGG CAG TGA CAA TGT AAG TA (서열 번호: 5);
CpN 프로브: ACA TGG GGA TTA CTT CCG TCT GCT G (서열 번호: 6);
CpM 정방향 프라이머: AAC TTG GAG AGT ACT ACC TGC TTC T (서열 번호: 7);
CpM 역방향 프라이머: TCA TGC CCA GGG ACT GTA (서열 번호: 8);
CpM 프로브: ATT GAT CAC GTA GGA CCC TGG CAA A (서열 번호: 9);
CpB 정방향 프라이머: TGA ATG CGC TGG TGA AAG G (서열 번호: 10);
CpB 역방향 프라이머: TCC TGG GCC ATA TGT GTA CTT G (서열 번호: 11);
CpB 프로브: CGG TCA AGG AAC TTG CCT CTC TGC A (서열 번호: 12);
CpE 정방향 프라이머: TGG CTA CCT GGC AAT AAC AA (서열 번호: 13);
CpE 역방향 프라이머: CGA CTC CAG CTC AAA GTC AA (서열 번호: 14);
CpE 프로브: AAG TGG CAG TTC CTT TCA AGC CTG C (서열 번호: 15);
β-마이크로글로불린 정방향 프라이머: TCC TCT CAG TGG TCT GCT TGG (서열 번호: 16);
β-마이크로글로불린 역방향 프라이머: TGG CGT GTG TAG ACT TGC ACT T (서열 번호: 17);
β-마이크로글로불린 프로브: TGC CAT CCA GCG TCC CCC A (서열 번호: 18).
모든 프라이머 및 프로브는 Genentech (Redwood City, CA)에서 합성하고 정제하였다.
웨스턴 블롯 분석은 CHO 세포에서 상대적인 카복시펩티다제 D 단백질 발현 수준을 측정하기 위하여 수행하였다. β-액틴, 세포기질 단백질이 샘플 부하 대조군으로서 사용되었다. 세포 펠릿을 수집하고, 1X 세포 용해 완충제로 용해시켰다 (Cat# 9803, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). 용해된 상청액의 총 단백질은 Bradford 검정법 (Cat# 1856210, Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 정량화시켰고, 환원 SDS-PAGE 겔 위로 부하 전에 3분 동안 95 °C에서 가열시켰다. 분리된 단백질은 전기블롯팅에 의해 니트로셀룰로즈 막으로 옮겼다. 이어서, 옮긴 막은 CpD 단백질 발현을 검출하기 위해 카복시펩티다제 D에 대한 토끼 다클론성 항체 (Cat# SAB2700486, Sigma, Saint Louis, MO) 및 동일한 샘플 부하에 대한 부하 대조군으로서 β-액틴에 대한 마우스 항체 (Cat# A2228, Sigma, Saint Louis, MO)와 함께 배양시켰다.
소간섭 RNA 설계자 (DSIR) 프로그램 (http://www.biomedcentral.com)이 CpD 및 CpN-특이적 소간섭 RNA (siRNA) 서열을 설계하는데 사용되었다:
CpD siRNA 표적 서열: GGAAGAGAACTGCTACTAA (서열 번호: 19);
CpN siRNA 표적 서열: GAATGGTGCTTGATGAGAA (서열 번호: 20).
상기 siRNA 서열을 합성하고, 개별적으로 siRNA 발현 작제물을 제조하기 위하여 pSilencer 3.1-H1벡터 (Cat# AM5766, Ambion, Austin,TX)로클로닝시켰다. 각각의 작제물은 일시적 형질감염으로 제조업자의 권고에 따라 리포펙타민 2000 CD (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 항체-발현 세포주 A 및 항체-발현 세포주 B로 도입시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포 펠릿을 수집하여 Taqman에 의해 각각의 카복시펩티다제 mRNA 발현을 평가하였다. 또한, 세포 배양 유체 (CCF)를 수집하고, 영상화된 모세관 등전점 포커싱 (IcIEF)에 의한 전하 변이체 생성물 특성 분석을 위해 Amicon Ultra-15 (30,000 MWCO, Millipore, Bedford, MA)에 의해 농축시켰다.
전하 변이체 분포는 플루오로카본 코팅된 모세관 카트리지 (100 ㎛ x 5 ㎝)가 있는 iCE280 분석기 (ProteinSimple)를 사용하여 평가하였다. 양성전해질 용액은 정제수중 0.35% 메틸 셀룰로즈(MC), 1.34% 3-10 담체 양성전해질, 1.34% 6.7-7.7 담체 양성전해질, pI 마커 (pI 6.61 및 pI 9.22), 및 10 mM L-아르기닌 부재 염기의 혼합물로 이루어졌다. 양극액(anolyte)은 80 mM 인산이었고, 음극액(catholyte)은 100 mM 수산화나트륨이었으며, 모두 0.1% MC에 존재한다. 샘플을 희석시키고, 양성전해질 용액과 혼합한 다음, 1분 동안 1500 V의 전위에 이어서, 8분 동안 3000 V의 전위를 도입시켜 포커싱시켰다. 포커싱된 전하 변이체의 영상은 모세관을 통해 전하 결합 소자 디지털 카메라 렌즈로 280 nm 자외선을 통과시켜 수득하였다. 중쇄 C-말단 Lys 잔기를 제거하기 위하여, 카복시펩티다제 B는 희석 단계에서 1:100 (w/w)의 효소-대-기질 비로 각 샘플에 가한 다음, 20분 동안 37 °C에서 항온처리시켰다.
하기의 가이드 RNA (gRNA) 서열은 각각 CpD 엑손 2 및 엑손 21 위에 방치되도록 설계하였다:
엑손 2에 대한 CpD 가이드 RNA1 서열 (gRNA 1): GAA GAC GAG ACT TTC AAA GAC GG (서열 번호: 21);
엑손 21에 대한 CpD 가이드 RNA2 서열 (gRNA 2): TCA GTT AGG TGG CTT AGG TTC GG (서열 번호: 22).
카스파제 9 (Cas9)과 함께 공-형질감염되었으면, gRNA 서열은 주해가 달린 CpD 좌위의 대부분을 포함하는 ~46 kb 결실이 가능하게 하리라 예상된다.
개별적인 gRNA는 클로닝시키고, pLKO.5 벡터의 인간 U6 프로모터 (Cat# SHC-201, Sigma, St. Louis, MO)의 조절하에 전사시켰다. 2개의 gRNA 및 Cas9 작제물은 등몰비로 함께 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 세포는 제한 희석에 의해 384-웰 플레이트로 씨딩시켰다. 3주 후, 콜로니를 택하고, 96-웰 플레이트로 옮겨, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 스크리닝시켰다. CpD 녹아웃 (~46 kb 결실) 및 야생형 대립인자를 스크리닝하기 위한 PCR 프라이머는 다음과 같았다:
CpD 녹아웃 대립유전자에 대한 정방향 프라이머: AGT TCA TTT ATG AAA GAT CCT GTG G (서열 번호: 23);
CpD 녹아웃 대립유전자에 대한 역방향 프라이머: GGA AAG GAG TCC TTC AGT GAA CAC (서열 번호: 24);
CpD 야생형 대립유전자에 대한 정방향 프라이머: CCA GTT CTG CTG TTA CAC TTT GAG (서열 번호: 25);
CpD 야생형 대립유전자에 대한 역방향 프라이머: AAT GTT TCC TCT TTC CTG GAC CTT (서열 번호: 26);
희석된 단백질 샘플 (1 mg/mL)은 1:1 비로 20 mg/mL TCEP 용액과 혼합시켰고, 경쇄 및 중쇄로 항체를 환원 및 해리시키기 위하여 60 °C에서 10분 동안 항온처리시켰다. 그 다음에, 각각의 샘플은 나노-칩 LC-ESI 공급원과 결합된 Agilent 6210 비행시간법 질량분석계(time-of-flight mass spectrometer)를 사용하는 액체 크로마토그래피 전자분무 이온화 질량분석기 (LC-ESI-MS)에 의해 분석하였다. 요약하면, 약 5 ng의 단백질 샘플은 탈염을 위해 40 nL 트랩 칼럼 및, 400 nL/min으로 분리를 위해 43 mm x 75 ㎛의 이퀴발런트 분석 칼럼(equivalent analytical column) 칫수인, Zorbax 300SB-C8 (5 ㎛, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 의해 통상적인 칩으로 주입시켰다 (참조: Lu et al., Mabs, 5, 2013). 이동상 A는 물 중 0.1% 포름산이었고, 이동상 B는 아세토니트릴중 0.1% 포름산이었다. MS 데이터를 뽑아내고, Agilent MassHunter 정량분석 Workstation 소프트웨어 B.04.00를 사용하여 복잡하지 않게 하였다. C-말단 라이신의 %를 측정하기 위하여, C-말단 라이신의 존재 또는 부재하에 항체 중쇄에 상응하는 복잡하지 않은 질량 세기를 사용하였다.
공급-배치 제조는 3, 7 및 10일째에 볼루스(bolus) 공급으로 전매 화학적으로 한정된 배지에서 진탕 플라스크 용기에서 수행하였다. 37 °C에서 35 °C로 온도 이동은 3일째에 수행하였다. 14일째 역가는 UV 검출에 의한 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다.
결과 :
qPCR 분석은 DUXB-11-기반 DHFR 결핍 DP12, DHFR 양성 CHOK1 숙주, 및 각각의 숙주 (세포주 A 및 세포주 B)로부터의 항체-생성 세포주에서 가능한 내인성 카복시펩티다제의 mRNA 수준을 측정하기 위하여 수행하였다. 세포주 A는 DHFR 결핍 DP12 숙주로부터 유래되었고, 세포주 B는 DHFR 양성 CHOK1 숙주로부터 유래되었다.
5개의 카복시펩티다제, CpD, CpN, CpM, CpB, 및 CpE는 qPCR에 의한 mRNA 발현 분석을 위해 선택되었다. CpD는 CHO 숙주 및 그들 각각의 항체-발현 주에서 모두 최고 mRNA 발현 수준을 가졌다 (도 1a 및 도 1b). CpD 및 CpN mRNA 수준은 세포주 A 및 세포주 B에서 CpM, CpE, 및 CpB에 대한 것들 보다 더 높았다 (도 1b).
siRNA-매개된 녹다운 (참조: 예를 들어, Rao et al., Adv Drug Deliv Rev, 61, 2009) 실험은 2개의 가장 풍부한 카복시펩티다제, 즉 CpD 및 CpN에 의한 2개의 항체-생성 세포주를 사용하여 수행하였다. 각각의 세포주는 일시적으로 특히 CpD (CpDi 작제물) 또는 CpN (CpNi 작제물)을 각각 표적으로 하는 siRNA 작제물로 형질감염시켰다. 스크램블 벡터 조절 작제물도 또한 음성 대조군으로서 형질감염시켰다. 도 2a에 제시된 바와 같이, CpD mRNA 수준은 세포주 A에서 39% 및 세포주 B에서 28%로 녹다운시켰다. 유사한 결과는 CpNi 작제물에 의한 CpN mRNA 억제에 대해 관찰되었고, 이때 CpN mRNA 수준은 세포주 A에서 43% 및 세포주 B에서 35%로 감소되었다 (도 2b).
세포 배양시 항체에 존재하는 C-말단 라이신의 %를 계산했다. 세포 배양시 항체에 존재하는 C-말단 라이신의 %를 계산하기 위하여, CpB 처리의 존재 및 부재하에, CpDi 및 CpNi 형질감염된 세포주로부터의 상청액은 단백질-A 친화성 크로마토그래피로 정제하였고, IcIEF(Imaged Capillary Isoelectric Focusing)에 의해 분석하였다. CpB 처리 및 미처리 샘플 간의 미분 값은 온전한 C-말단 라이신을 갖는 항체 %를 나타낸다. 상당히 증가된 C-말단 라이신 수준은 CpD mRNA를 대략 30-40%로 녹다운시킨 두 세포주에서 관찰되었다 (도 2a 및 도 3). 최소 C-말단 라이신 수준 변화는 스크램블 RNAi 작제물 (음성 대조군) 또는 CpN mRNA를 대략 40%로 녹다운시킨 CpNi 작제물에 의해 형질감염시킨 2개의 세포주에서 관찰되었다 (도 2b 및 도 3). 이들 결과는 CpN mRNA 수준의 변화가 2개의 시험된 항체-생성 주에서 C-말단 라이신에 영향을 주지 않았지만, CpD mRNA 수준의 감소가 증가된 C-말단 라이신 수준을 유도함을 나타내고 있었다.
CRISPR 기술 (참조: 예를 들어, He et al., Biotechnol Bioeng, 2014; Jinek et al., Elife, 2, 2013)을 사용하는 녹아웃 실험을 수행하였다. NCBI 데이터베이스에서 공지된 CHOK1 CpD 게놈 서열은 CHO CpD에 대한 암호화 영역 서열의 대부분을 포함하는 대략 55 kb이다. 2개의 가이드 RNA 서열은 도 4a에 예시된 바와 같이 2개의 엑손 사이에 46 kb 서열을 결실시키고자 하는 차이니즈 햄스터 CpD 유전자의 엑손 2 및 21을 동시에 표적으로 하도록 설계되었다. 2개의 gRNA 작제물 및 Cas9 엔도뉴클레아제 작제물이 항체-발현 세포주 B로 공-형질감염된 경우에, Cas9 엔도뉴클레아제는 gRNA에 상보성인 특정 DNA 서열을 절단한다. 이러한 절단은 표적 유전자의 발현을 없앨 수 있는 결실 또는 삽입에 의한 이중-가닥 DNA 돌연변이(breaks) 및 후속되는 비-상동 말단-부착(NHEJ) DNA 수선을 유도한다. gRNA 서열의 인접하고 상류인 PCR 프라이머를 사용하여, CpD 녹아웃 세포는 2개의 gRNA 사이에 개입 서열이 도 4b에 예시된 바와 같이 결실된 경우 대략 600개 염기쌍의 PCR 생성물을 수득해야 한다. 총 180개의 클론은 CpD 서열 결실에 대해 스크리닝했고, PCR 생성물 크기 및 서열 분석을 기반으로 하여, CpD 대립유전자가 모두 결실된 2개의 클론이 수득되었고, CpD mRNA 및 단백질 발현 분석을 위해 사용되었다 (데이터는 제시되지 않음). 도 5a에 제시된 바와 같이, CpD mRNA는 qPCR 분석에 의해 2개의 CpD KO 클론에서 검출할 수 없었다. 더욱이, 항-CpD 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석은 도 5b에 제시된 바와 같이 분자량이 대략 180 kDa인 단백질이 2개의 CpD KO 클론에 존재하지 않았지만, CpD WT 클론에는 존재하였다.
CpD KO 및 WT 클론은 생산성 및 생성물 특징 속성에 대해 평가하였다. 2개의 KO 및 2개의 WT 클론 중에 통합된 생능세포 계수 세포 (IVCC), 특정 생산성(Qp), 및 역가에 있어서 명백한 차이는 관찰되지 않았고 (도 6), CHO 세포에서 CpD 발현의 부재는 공급-배치 진탕 플라스크 생성 검정법으로 평가한 경우 세포 생산성 및 성장에 영향을 주지 않았음을 나타내는 것이다. 중요하게, C-말단 라이신 수준은, 대략 4-6%의 C-말단 라이신이 2개의 WT 클론에서 관찰된 반면에, C-말단 라이신의 100%는 2개의 KO 클론에서 관찰되었음을 보여주는, 감소된 항체의 질량 분석기-기반 분석에 의해 측정되었다 (도 7). 이에 따라, CpD는 CHO 세포에서 항체 중쇄의 C-말단 라이신을 제거하는데 관여하는 유일한 카복시펩티다제임을 나타내었다. 동일한 결과는 또한 IcIEF 검정법에 의해 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 다른 생성물 특징 속성 및 세포 배양 대사물질 프로파일은 CpD KO 및 WT 클론 사이에서 필적가능하였다 (데이터는 제시되지 않음).
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Claims (50)

  1. Fc-함유 단백질의 발현을 위한 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 CpD 유전자 비활성화가 없는 야생형(wild type) CpD 유전자를 포함하는 숙주 세포에 비하여, 카복시펩티다제 D (CpD) 발현 수준의 적어도 60% 감소를 갖는, 숙주 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵생물 세포인, 숙주 세포.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인, 숙주 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 Fc-함유 단백질은 항체인, 숙주 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체인, 숙주 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 Fc-함유 단백질은 Fc-함유 융합 단백질인, 숙주 세포.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포 내 상기 CpD 유전자는 비활성화된 것인, 숙주 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 CpD 유전자는 siRNA에 의하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 CpD 유전자는 shRNA에 의하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 CpD 유전자는 유전자 결실에 의하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 CpD 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 CpD 유전자는, 군집된, 주기적 간격을 둔, 짧은 회문 반복부 (clustered regularly interspaced, short palindromic repeats; CRISPR) 시스템을 사용하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  14. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 CpD 유전자는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease:TALEN) 시스템을 사용하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  15. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 CpD 유전자는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템을 사용하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  16. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 CpD 유전자는 메가뉴클레아제 시스템을 사용하여 비활성화되는, 숙주 세포.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-함유 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  19. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 숙주 세포를 생산하는 방법으로서,
    상기 숙주 세포에서 상기 CpD 유전자를 비활성화시킴으로써, 상기 숙주 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 CpD 유전자는 siRNA 시스템을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 CpD 유전자는 shRNA 시스템을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 CpD 유전자는 유전자 결실에 의하여 비활성화되는, 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 CpD 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의하여 비활성화되는, 방법.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 CpD 유전자는 CRISPR 시스템을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  25. 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 CpD 유전자는 TALEN 시스템을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  26. 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 CpD 유전자는 ZFN 시스템을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  27. 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 CpD 유전자는 메가뉴클레아제 시스템을 사용하여 비활성화되는, 방법.
  28. Fc-함유 단백질의 제조 방법으로서,
    a) 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계;
    b) 상기 숙주 세포에 의하여 발현된 상기 Fc-함유 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 복수의 Fc-함유 단백질을 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물 중 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 각각의 Fc 도메인 상에 C-말단 라이신을 갖는, 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 조성물의 실질적으로 모든 Fc-함유 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  31. 청구항 29 또는 30에 있어서, 상기 복수의 Fc-함유 단백질은 하전 상태에서 실질적으로 균질한 것인, 조성물.
  32. 청구항 29 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-함유 단백질은 Fc-함유 융합 단백질인, 조성물.
  33. 청구항 29 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-함유 단백질은 항체인, 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 항체가 인간 항체인, 조성물.
  35. 청구항 33에 있어서, 상기 항체가 인간화된 항체인, 조성물.
  36. 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 2개의 중쇄를 포함하며, 그리고 각각의 중쇄는 C-말단 라이신을 포함하는, 조성물.
  37. 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-함유 단백질은 약물에 콘주게이트된 것인, 조성물.
  38. 청구항 32 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 Fc-함유 단백질은 IgG1 Fc 도메인을 포함하는, 조성물.
  39. 청구항 32 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 Fc-함유 단백질은 IgG2 Fc 도메인을 포함하는, 조성물.
  40. 청구항 32 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 상기 Fc-함유 단백질은 IgG4 Fc 도메인을 포함하는, 조성물.
  41. 청구항 29 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인, 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 멸균성 약제학적 조성물인, 조성물.
  43. 청구항 29 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 세포 배양 배지(cell culture medium)인, 조성물.
  44. 청구항 29 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 세포 용해물인, 조성물.
  45. 청구항 29 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단백질 정제 칼럼 유래의 용리액인 것인, 조성물.
  46. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하는 방법으로서,
    청구항 41 또는 42의 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 조성물이 비경구로 투여되는, 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 조성물이 정맥내로, 또는 피하로 투여되는, 방법.
  49. 청구항 46에 있어서, 상기 조성물이 국소적으로(locally) 투여되는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 조성물이 국소로(topically) 투여되는, 방법.
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