BG64061B1 - Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза i - Google Patents

Abstract

Аминокиселинните варианти на човешка ДН-аза I имат редуцирана активност за свързване на актин. Изобретението се отнася и до последователности на нуклеинови киселини, които кодират такива актинрезистентни варианти, при което става възможно тяхното продуциране в количества, достатъчни за клинично приложение. Изобретението се отнася също до фармацевтични състави и терапевтични приложения на актинрезистентните варианти на човешка ДН-аза I.

Description

(54) ВАРИАНТИ НА ЧОВЕШКА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗАI

Област на техниката

Изобретението се отнася до човешка дезоксирибонуклеаза I (ДНаза I), една фосфодиестераза, която може да хибридизира полидезоксирибонуклеиновата киселина. Най-общо, то се отнася до модифицирани (вариантни) форми на човешка ДНаза I и продуктите им, получени по методите на рекомбинантната ДНК технология, до фармацевтични състави за клинично приложение и до методи за приложение на тези ДНазни варианти и техните състави.

Предшестващо състояние на техниката

ДНаза I е фосфодиестераза, способна да хидролизира полидезоксирибонуклеиновата киселина. Към настоящия момент ДНаза I от различни видове е пречиствана вече до различни степени.

Така, говеждата ДНаза I е подробно изследвана биохимично. Виж напр. Moore, in The Enzymes (Boyer, P. D., ed), pp. 281-295, Academic Press, New York (1981). Пълната аминокиселинна последователност на говеждата ДНаза I е известна (Liao et al., Mol. Biol. 192: 605-636 (1986); Laham etal., J. Mol. Biol. 221: 645-667 (1991), а ДНаза I е клонирана и ekспресирана (Worrall et al., J. Biol. Chem. 265: 21889-21895 (1990)). Структурата на говеждата ДНаза I е определена чрез рентгенова кристалография (Suck et al., Nature 321: 620625 (1986); Oefner et al., J. Mol. Biol. 192: 605632 (1986).

ДНК, кодираща човешката ДНаза I, е била изолирана и съгласувана, след което е била експресирана в рекомбинантни гостоприемникови клетки, което позволява продуцирането на човешка ДНаза I в търговски количества. Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990).

ДНаза I има множество известни приложения и е използвана за терапевтични цели. Нейното принципно терапевтично приложение е да редуцира вискозитета на белодробното секретиране при такива заболявания като пневмония и цистофиброза (CF), а то по този начин съдейства за прочистване на респираторните пътища. Виж напр., Lourenco et al., Arch.

Intern. Med. 142: 2299-2308 (1982); Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Hubbard et al., New Engl. J. Med. 326: 812-815 (1992); Fuchs et al., New Engl. J. Med. 331: 637-642 (1994); Bryson et al., Drugs 48: 894906 (1994). Белодробното секретиране предопределя също патологията на хроничния бронхит, бронхиестазиса, емфиземата, острият и хроничен синузит, дори общата простуда.

Белодробните секреции на лица с такива заболявания са комплекс от материали, които включват гликопротеини, мукополизахариди, протеази, актин и ДНК. Някои от материалите в пулмонарните секрети се освобождават от левкоцити (неутрофили), които инфилтрират белодробната тъкан в отговор на присъствието на микроби (напр. бактериални щамове от родовете Pseudomonas, Pneumococcus или Staphylococcus) или други дразнители (напр. тютюнев дим, полен). В процеса на взаимодействие с такива микроби или дразнители, левкоцитите могат да дегенерират и да освободят своето съдържимо, което определя вискозитета на белодробната секреция.

Способността на ДНаза I да редуцира вискозитета на белодробната секреция се приписва на нейното ензимно разграждане от големите количества ДНК, освобождавани от неутрофилите. Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Aitken et al., J. Am. Med. Assoc. 267: 1947-1951 (1992). Напоследък са предположени различни механизми за миколитичния ефект на ДНаза I, включително дисагрегацията на актина. Vasconcellos et al., Science 263: 969-971 (1994). Актинът е един от протеините, намиращи се в най-голямо количество в еукариотичните клетки (напр. актинът съдържа около 10% от общото количество протеин) и е добре изследван. Kabasch et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Strukt. 21: 49-76 (1992); Sheterline et al., Prot. Profile 1:1-121 (1994). Актинът съществува в две форми - мономерна (Gактин) и филаментозна (F-актин), съставен от G-актинови мономери. Полимерните филаменти на актина са силно еластични и са особено определящи за вискозитета на белодробните секреции. Momet et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 3680-3684 (1984); Newman et al., Biochemistry 24: 1538-1544 (1985); Janmey etal., Biochemistry 27: 8218-8226 (1988); Vasconcellos et al., Science 263: 969-971 (1994).

Тъй като е известно, че ДНаза I се свърз ва с актин (Lazarides et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Kabsch etal., Nature 347: 37-44 (1990) и c деполимеризирани актинови филаменти (както и че инхибира полимеризирането на G-актина във филаменти) (Mannherz et al., FEBS Lett. 60: 34-38 (1975); Hitchkock et al., Cell 7: 531-542 (1976); Pinder et al., Biochemistry 21: 4886-4890 (1982); Weber etal., Biochemistry 33: 4780-4786 (1994)), предполага се, че миколитичният ефект на ДНаза I върху храчките и други белодробни секреции се дължи на актиновата дисагрегация (деполимеризация), вместо на ДНК хидролизата (Vasconcellos etal., Science 263: 960-971 (1994). На базата на този възглед се знае, че в присъствието на актин, ДНК-хидролитичната активност на ДНаза I е инхибирана (Lazarides et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71: 4742-4746 (1974); Mannhertz et al., Eur. J. Biochem. 104: 367-379 (1980). Също на базата на този възглед е докладвано, че разделящите актина протеини (например гелсолин) са ефективни при понижаване вискозитета на цистична фиброзна храчка. Vasconcellos et al., Science 263: 960-971 (1994). Stossel et al., PCT Patent Publ. No. WO 94/ 22465 (publ. 13. October 1994).

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение е основано на част от изследването на изобретателите за определяне биохимичната основа на муколитичната активност на ДНаза I. Това изследване включва конструиране и синтез на различни варианти на човешка ДНаза I, както и изпитването на тези варианти за преценка на способността им да хидролизират ДНК, да се свързват към актин и да редуцират васкоеластичността на спутума in vitro. Изобретателите създават няколко класа от варианти на човешка ДНаза I. Един клас от вариантите (актинрезистентни варианти) имат понижена муколитична активност и в някои случаи - повишена муколитична активност в сравнение с нативната човешка ДНаза I. Тези устойчиви на актин варианти имат почти същата ДНК-хидролитична активност като нативната човешка ДНаза I, но подобна активност е по-малко податлива на инхибиране от актина. Втори клас на вариантите свързва актин с афинитет, сходен на този, намерен за нативната човешка ДНаза I, но има понижена муколитична ак тивност и понижена ДНК-хидролитична активност в сравнение с нативната човешка ДНаза I.

Тези резултати показват, че терапевтичната ефективност на човешката ДНаза I за редуциране на вискозитета на белодробните секреции се дължи на нейната каталитична, ДНКхидролитична активност, отколкото на способността й да деполимеризира филаментозен актин. Съответно, варианти на ДНаза I, които свързват актин с нисък афинитет в сравнение с човешка ДНаза I, но които все още имат ДНаза I хидролитична активност, би трябвало да са полезни терапевтични средства, специално при третиране на пациенти с белодробни секреции, включващи относително големи количества актин. Тъй като такива варианти имат редуциран афинитет спрямо актин, тяхната ДНК хидролитична активност е по-малко инхибирана в присъствие на актин и имат поголяма муколитична активност в присъствие на актин, в сравнение с нативна човешка ДНаза I.

Поради това, обект на настоящото изобретение е осигуряване на такива варианти на ДНаза I, които имат ДНК-хидролитична активност, но свързват актин с по-нисък афинитет в сравнение с нативната човешка ДНаза I.

Друг обект на изобретението е осигуряване на нуклеинови киселини, кодиращи такива устойчиви на актин варианти на човешка ДНаза I, рекомбинантни вектори, включващи такива нуклеинови киселини, рекомбинантни гостоприемникови клетки, трансформирани с тези нуклеинови киселини или вектори, и имащи възможности за продуциране на човешки ДНаза I варианти със средствата на рекомбинантната ДНК технология.

Изобретението е насочено също към фармацевтични състави, включващи човешката ДНаза I устойчиви на актин варианти, незадължително заедно с приемлив във фармацевтично отношение пълнител.

Изобретението също е насочено към метод за редуциране на вискоеластичността или вискозната консистенция на ДНК-съдьржащ материал у даден пациент, който включва въвеждане на терапевтично ефективна доза от актинрезистентен вариант на ДНаза I у пациента.

Изобретението по-специално е насочено към метод за лечение на пациент със заболяване като цистофиброза, хроничен бронхит, пневмония, бронхоектазис, емфизема, астма или сис темна лупус еритематоза, който включва въвеждане у пациента на терапевтично ефективно количество от устойчив на актина вариант на ДНаза I.

Изобретението е насочено също към при- 5 ложение на актинрезистентни варианти на човешка ДНаза I в in vitro диагностични проби от вискозен материал (напр. храчки) от даден пациент, за измерване количеството наличен актин и за определяне на това дали пациентът е подходящ кандидат за лечение с устойчив на актин вариант на ДНаза I.

Тези и други варианти на изобретението биха били очевидни за специалиста в областта, съобразявайки се с изложеното в описанието като цяло.

Пояснение на приложените фигури

Фигура 1 показва аминокиселинната последователност на зряла човешка ДНаза I (SEQ ID N0:1). Номерата посочват секвенционните позиции на аминокиселините остатъци в рамките на последователността;

Фигура 2 - относителната специфична активност на нативна човешка ДНаза I и варианти. Ивиците представляват стандартното отклонение (η-измерено). Относителната специфична активност на Pulmozyme^R човешка ДНаза I (Genentech, Inc., South San Francisco, California USA) се определя като 1,0. Относителната специфична активност на нативна човешка ДНаза I е по-голяма от тази на Pulmozyme^R, което се дължи на появяването в Pulmozyme^R на деаминизирана форма на ДНаза I, 35 имаща редуцирана ДНК-хидролитична активност (Frenz et al., РСТ Patent Publ. No. WO 93/ 25670, публ. на 23 декември 1993).

Фигура 3 показва ДНК-хидролитичната активност на нативна човешка ДНаза I и ва- 40 рианти на ДНаза I с единични остатъци в присъствието на актин, както е определено в хиперхромна проба. “Процентна активност” е процентът ДНК-хидролитична активност на ДНаза I (нативен или вариант), изчислена както е 45 описано в пример 3; ДНК-хидролитичната активност на ДНаза I в отсъствието на актин се определя като 100% активност. “Грешните” ивици представят стандартното отклонение.

Фигура 4 представя ДНК-хидролитичната 50 активност на нативна човешка ДНаза I и варианти на човешка ДНаза I с множество оста тъци в присъствие на актин, както е определено в хиперхромна проба. “Процент активност” е присъствието на ДНК-хидролитичната активност на ДНаза I (нативна или варианти), пресметнати както е описано в пример 3; ДНК-хидролитичната активност на ДНаза I в отсъствие на актин се определя като 100% активност. Грешните ивици представят стандартното отклонение.

Фигура 5 представя относителния афинитет на свързване на варианти на човешката ДНаза I с актин, както е определено в свързващо актина ELISA изследване (описано в пример 3). Стойността EC_J0 е концентрацията на ДНаза I (нативна или вариант), необходима да даде половината от максималния сигнал в пробата. Ивиците Ерор представят стандартното отклонение. Стойностите на EC_J0 за Pulmozyme^R и нативна човешка ДНаза I са 72 ± р М (п=21) и 85 ± 14 рМ (п=14), съответно. Относителната свързваща активност, показана на фигурата, е стойността EC_J0 за варианти на човешка ДНаза I, разделена на стойността на i*. EC_J0, определена за нативна човешка ДНаза &25 I. Вариантите, където стойността на EC_J0 е Ж< по-голяма, отколкото би могло да бъде измерена в пробата, са означени като >35, >350, : . г >1750, >3500 или >35 000. SS'

Фигура 6 показва муколитичната ак30 тивност на нативна човешка ДНаза I и варианти на човешка ДНаза I в изследване на ш храчки от пациенти с цистофиброза, както е ® определено с компактна проба. Грешните ивици л представят стандартната грешка на стойността.

Фигура 7 показва схематичното представяне на актинсвързващото ELISA изпитване, описано в пример 3.

Техническа същност на изобретението

I. Определения

Както е използван тук, терминът “човешка ДНаза I” и “див тип ДНаза I”, се отнася до полипептид, имащ аминокиселинната последователност на човешка зряла ДНаза I, показана на фиг. 1.

“Вариант” или “аминокиселинен вариант” на човешка ДНаза I е полипептид, който включва аминокиселинна последователност, различна от тази на нативната човешка ДНаза I. Най-общо, вариантът ще има поне 80% секвенционна идентичност (хомоложност), за предпочитане поне 90% секвенционна идентичност, най-добре поне 95% секвенционна идентичност, и най-добре 98% секвенционна идентичност, се определя например по Fitch et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 1382-1386 (1983), версия на алгоритъма, описан от Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), след изравняване на последователностите за получаване на максимална хомоложност.

Терминът “човешка ДНаза I, устойчив на актин вариант”, “актинрезистентен вариант” и “устойчив на актин вариант на човешка ДНаза I”, се отнася до вариант на нативна човешка ДНаза I, която има 1) ДНК-хидролитична активност и 2) понижен афинитет на свързване с актин.

“ДНК-хидролитична активност” се отнася до ензимната активност на нативна човешка ДНаза I в хидролизираща субстратна ДНК за добиване на 5’-фосфорилирани олигонуклеотидни крайни продукти. ДНК-хидролизиращата активност се определя по който и да е от различните методи, известни на специалиста в областта, включително аналитичен полиакриламид и агарозна тел електрофореза, хиперхромоцитна проба (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 3693-377 (1950)) или проба c метиленово зелено (Kumick, Arch. Biochem. 29: 41-53 (1950); Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222: 351-358 (1994)).

“Афинитет за свързване на нативна човешка ДНаза I или на устойчив на актин вариант на човешка ДНаза I се отнася до способността на ДНаза I да се свързва нековалентно към актин. Афинитетът на свързване може да бъде определен по който и да е от известните на специалистите в областта методи, например, както е описано от Mannherz, et al., Eur. J. Biochem. 104: 367-379 (1980). Обратно, относителните афинитета за свързване на различни ДНази (напр. нативна човешка ДНаза I и нейни варианти) се определят чрез измерване свързването на ДНази към имобилизиран актин в проба на ELISA (описано в пример 3) или чрез сравняване на ДНК-хидролитичната активност на ДНази при наличие и при отсъствие на актин (също описано в пример 3). Методите, описани в примерите, са особено удобни за изследване на варианти на чо вешка ДНаза I за бързо идентифициране на онези варианта, които имат понижена свързваща активност за актин.

Човешки ДНаза I, устойчив на актин вариант с “понижен афинитет на свързване на актина” е имащият афинитет на свързване на актана, който е относително по-малък от афинитета, с който натавната човешка ДНаза I свързва актин, определен при сравними условия. Ако актинсвързваща ELISA проба, както е описана в пример 3, се използва за определяне на свързващия афинитет на човешка ДНаза I (нативна или вариант) за актин, тогава устойчив на актин вариант, който има “понижен афинитет за свързване на актана” би бил този, който има стойност EC_J0, по-голяма от натавната човешка ДНаза I. В такава проба, един устойчив на актин вариант обикновено ще има стойност на EC_J0 пет пъти по-голяма до 100 пъти по-голяма от тази на нативна човешка ДНаза I; но устойчиви на актин варианти, имащи стойност на EC_S0, повече от 500 пъта по-голяма от тази на натавната човешка ДНаза I, също се продуцират, по-специално чрез изменение на множество аминокиселинни остатъци от последователността на натавната човешка ДНаза I (вж. например фигура 5).

“Муколитична активност” се отнася до редуциране на вискозитета на храчката или друг биологичен материал, например както е наблюдавано при третиране на материала с нативна човешка ДНаза I или неин вариант. Муколитичната активност се определя по който и да е от известните на специалистите в областта методи, включително пробата за уплътняване на храчката (РСТ описание на патент № WO 94/10567, публ. на 11.05.1994), проба с торсионен пендулум (Jamney, J. Biochem. Biophys. Methods 22: 41-53 (1991)) или други peoлогични методики.

“Полимеразна верижна реакция” или “PCR” обикновено се отнася до метод за амплификация на желана нуклеотидна последователност in vitro, както е описано например, в US 4 683 195. Най-общо, PCR-методът включва повторяеми цикли на праймерен екстензионен синтез, с помощта на олигонуклеотидни праймери, способни да се хибридизират за предпочитане към матрична нуклеинова киселина.

“Клетка”, “гостоприемникова клетка”, “клетъчна линия” и “клетъчна култура” се из ползват без изменение и всички подобни термини следва да се разбират така, че включват потомство, получено от развитието или култивирането на дадена клетка. “Трансформация” и “трансфекция” се използват без изменение, за да означат метода за въвеждане на ДНК в дадена клетка.

“Оперативно свързан” се отнася до ковалентно свързване на две или повече ДНК последователности, посредством ензимно свързване или друго, в конфигурация, релативна на друга, така че да може да протече нормалното функциониране на последователностите. Например, ДНК за предварително секвениране или секреторен лидер, са оперативно свързани към ДНК за полипептид, ако той се експресира като препротеин, който участва в секретирането на полипептида; промотор или енхансер е оперативно свързан към кодираща последователност, ако тя въздейства на транскрипцията на последователността; или място за свързване на рибозома е оперативно свързана към 5 кодираща последователност, ако тя е позиционирана така, че да улесни транслацията. Найобщо, “оперативно свързан” означава, че ДНК последователностите, които са свързани, са прилежащи и, в случая на секреторен лидер, 10 са прилежащи и във фаза на разчитане. Ако такива места не съществуват, тогава се използват синтетични олигонуклеотидни адаптери и линкери, в съчетание със стандартните рекомбинантни ДНК методи.

Аминокиселините са идентифицирани тук с трибуквено или еднобуквено означение, както следва:

Asp	D	аспартат	Не	1	изолевцин
Thr	T	треонин	Leu	L	левцин
Ser	s	сери н	Tyr	Y	тирозин
Glu	E	глутамат	Phe	F	фенилаланин
Pro	P	πролиΗ	His	H	хистидин
Gly	G	глицин	Lys	K	лизин
Ala	A	аланин	Arg	R	аргинин
Cys	C	цистеин	Trp	W	трилтофан
Vai	V	валин	Gin	Q	глутамин
Met	M	метионин	Asn	N	аспарагин

ΐ»ί >>i » 'ί

-«SeSW**· '-W * чО*’. *

Ϊ

Ж :4 ♦ί

II. Подбор на устойчиви на актин варианти

Изобретението се основава на изследването на структурата, свойството да свързват актина, ДНК-хидролитичната активност и муколитичната активност на варианти на ДНаза I по отношение на аминокиселинната й последователност. Устойчивите на актин варианти от настоящото изобретение имат ДНК-хидролитична активност, но свързват актин с послаб афинитет в сравнение с нативна човешка ДНаза I. Понижението на активността на свързване на актина се постига чрез мутации при/или около онези аминокиселинни остатъци в рамките на нативна човешка ДНаза I, която очевидно въздейства на свързването на актин, включително например, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 или Alai 14 (номерът, следващ три буквеното означение на аминокиселините обозначава специфичната позиция на аминокиселинния остатък в рамките на последователността от фиг. 1).

Известни са различни начини за получаване на устойчиви на актин варианти на човешка ДНаза I. В един от вариантите съгласно настоящото изобретение, устойчив на актин вариант се получава чрез въвеждане на единични или множество аминокиселинни замествания, инсерции и/или делеции при или в непосредствена близост до (например в рамките на около пет аминокиселинни остатъка) онези аминокиселинни остатъци на нативна човешка ДНаза 1, които може да повлияят на свързването на актина. Някои илюстративни примери на подобни мутации са както следва: D53R, D53K, D53Y, D53A, Υ65Α, Υ65Ε, Y65R, V67E, V67K или E69R (виж фиг. 2-6). На фигурите и в целия текст описването на аминокиселинните субституционни мутации, намиращи се във варианта на ДНаза I, е представено съкратено с първа буква, номер и втора буква, като първата буква е еднобуквено съкращение на аминокиселинния остатък в нативната (див тип) човешка зряла ДНаза I, номерът показва позицията на този остатък в нативната ДНаза I, а втората буква е еднобуквено съкращение на аминокиселинния остатък в тази позиция на вариантната ДНаза I. Например, във варианта на ДНаза I, имащ мутация D53R, аспартатният остатък (D) в позиция 53 на нативната зряла ДНаза I е заместен с аргининов (R) остатък. Множество мутации в отделен вариант са означени по сходен начин с двоеточие, разделяйки всяка от различните мутации, намиращи се във варианта. Например, означението D53R: Y65A означава, че вариантът има мутация D53R и мутация Y65A.

В друг вариант на изпълнение на настоящото изобретение, устойчив на актин вариант на ДНаза I се изготвя чрез въвеждане на мутация (и), които създават ново място на гликозилация при или в съседство с (например в рамките на пет аминокиселинни остатъка) аминокиселините остатъци на нативна човешка ДНаза I, която повлиява актиновото свързване. Например, използва се сайтнасочена мутагенеза за въвеждане на една от трипептидните последователности аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин (където X е която и да е аминокиселина с изключение на прион), които са разпознаваеми последователности за ензимна атака на въглехидратната част към аспарагиновата странична верига. Creigton, Proteins, рр. 76-78 (W. Н. Freeman, 1984). Пространствено препятствие, явяващо се между въглехидратната част на получения N-гликозилиран вариант на ДНаза I и актина, може да понижи или да предотврати свързването на актин и съответно инхибирането на ДНаза I ДНК-хидролитичната активност в сравнение с нативна човешка ДНаза I. Някои илюстративни примери на такива мутации за въвеждане на нов сайт на гликозилация са: D53R, Y65A, Н44А, E69R, Н44А, D53R: Y65A, Н44А: D53R: Y65A, H44A.Y65A: E69R, D53R: Y65A, D53R.E69R и V67K.

Незадължително, във връзка с подобни мутации за създаване на нов сайт на гликозилация, природно срещаното място на гликози лация в позиции 18 и/или 106 в рамките на последователността на нативна човешка ДНаза I може да бъде делетирано в зависимост от размера на желаното гликозилиране в актинрезистентния вариант.

В друг вариант на изобретението, сайтнасочената мутагенеза се използва за въвеждане на остатъци при или в съседство с (например в рамките на около пет аминокиселинни остатъка) онези аминокиселинни остатъци на нативна човешка ДНаза I, които са включени в свързването на актин, и които са подходящи за посттранслационна модификация както биологична, така и химична (вж. по-долу). Means, et al., Chemical Modification of Proteins (HoldenDay, 1971); Glazer et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analitical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pp. 70-87 (W. H. Freeman, 1984), Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Подобни посттранслационни модификации могат да въведат етерични препятствия или променени електростатични свойства в ДНаза I, които биха понижили или предотвратили свързването на актина и следващо инхибиране на ДНК-хидролитичната активност, в сравнение с нативна човешка ДНаза I. Например, може да бъде въведен цистеинов остатък при или в съседство с остатък на нативна човешка ДНаза I, която участва в свързването на актина. Свободният тиол от цистеиновия остатък може да формира вътремолекулна бисулфидна връзка с друг такъв вариант на ДНаза I, за получаване на ДНаза I димер, или може да бъде модифициран например, с тиолепецифично алкилиращо средство. Някои илюстративни примери за такива мутации са следните: Н44А, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, Е69С, А114С.

За удобство, замествания, инсерции и/или делеции в аминокиселинната последователност на нативна човешка ДНаза I са обикновено получени чрез въвеждащи мутации в съответната нуклеотидна последователност на ДНК кодиращата нативна човешка ДНаза I, например чрез сайтнасочена мутагенеза. Експресия на мутантната ДНК след това води до продуциране на варианта на човешка ДНаза I, имаща желаната (неприродна) аминокиселинна последователност.

Доколкото за осъществяване на сайтнасочената мутагенеза може да бъде използвана която и да е известна на специалистите в областта техника, например тази, описана от Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), олигонуклеотиднасочената мутагенеза е предпочитаният метод за получаване на варианти на човешка ДНаза I съгласно изобретението. Този метод, който е добре известен на специалистите (Zoller et al., Meth. Επζ. 100: 4668-500 (1983); Zoller et al., Meth. Enz. 154: 329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154: 382-403 (1987); Kunkel et al., Meth. Enz. 154: 367-382 (1987); Horwitz, et al., Meth. Enz. 185: 599-611 (1990), е отчасти подходящ за получаване на субституционни варианти, макар че може да бъде използван също и за обичайното получаване на делеционни и инсерционни варианти.

Техниката на сайтнасочената мутагенеза обикновено използва фагов вектор, който съществува както в едноверижна, така и в двуверижна форма. Типични вектори, приложими в сайтнасочената мутагенеза включва вектори като М13 фаг и плазмиден вектор, който съдържа едноверижен фагов източник на репликация (Messing et al., Meth. Enz. 101: 20-78 (1983); Veitra etai., Meth. Enz. 153: 3-11 (1987); Short et al., Nuc. Acids. Res. 16: 7583-7600 (1988)). Репликацията на тези вектори в подходяща гостоприемникова клетка води до синтезата на едноверижна ДНК, която може да бъде използвана за сайтнасочена мутагенеза.

Накратко, при провеждане на сайтнасочена мутагенеза на ДНК, кодираща нативна човешка ДНаза I (или нейни варианти), ДНК се променя чрез първото хибридизиране на олигонуклеотид, кодиращ желаната мутация в единична верига на ДНК. След хибридизация се използва ДНК полимераза за синтезиране на пълната втора верига, с участието на хибридизирания олигонуклеотид като праймер и с помощта на единичната верига като матрица. Така олигонуклеотидът, кодиращ желаната мутация, се включва в получената в резултат двойноверижна ДНК.

Олигонуклеотиди за приложение като хибридизационни сонди или праймери може да бъдат изготвени по всеки подходящ метод, като например чрез пречистване на природносрещана ДНК или чрез in vitro синтеза. Например, олигонуклеотиди лесно се синтезират с помощта на различни техники, известни от органич ната химия, като тези описани от Narang et al., Meth. Enzym. 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzym. 68: 109-151 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzym. 154: 287-313 (1985). Общият подход за подбор на подходяща хибридизационна сонда или праймер е добре известен. (Keller et al., DNA probes, pp. 11-18 (Stockton Press, 1989). Обикновено хибридизационната сонда или праймер съдържа от 10 до 25 или повече нуклеотида и ще включва поне 5 нуклеотида от всяка страна на последователността, кодираща желаната мутация, така че олигонуклеотидът да се хибридизира за предпочитане в желаното място на едноверижната матрична ДНК молекула.

Разбира се, сайтнасочената мутагенеза може да бъде използвана за въвеждане на множество субституционни, инсерционни или делеционни мутации в изходната ДНК. Ако местата за мутации са разположени в близост, мутациите могат да бъдат въведени едновременно с помощта на отделен нуклеотид, който кодира всички желани мутации. Ако, обаче V* ;

местата, които следва да бъдат подложени на Wΐ мутация, са локализирани на известно разстоя-ί ние едно от друго (разделени от повече отί десет нуклеотида), е по-трудно генериране наΪ отделен олигонуклеотид, който кодира всичкиΪ желани изменения. Поради това могат да бъ-I дат използвани един или два алтернативни ме-Ϊ тода.·£

За първия метод, за всяка желана мута- ция се генерира отделен олигонуклеотид, които след това се подравняват към едноверижната матрица на ДНК едновременно, и втората верига на ДНК, която се синтезира от матрицата, ще кодира всички желани аминокиселинни замествания.

Алтернативният метод включва два или повече кръга на мутагенеза за получаване на желаните варианти. Първият кръг е такъв, какъвто е описан за въвеждане на единична мутация. Вторият кръг на мутагенеза използва в качеството на матрица мутиралата в първия кръг ДНК. Така, тази матрица вече съдържа една или повече мутации. Олигонуклеотидът, кодиращ допълнителните желани аминокиселинни субституции, след това се изравнява към тази матрица, и получената в резултат верига на ДНК сега кодира мутации както от първия, така и от втория кръг на мутагенезата. Тази резултантна ДНК може да бъде изпол8 звана като матрица в трети мутагенетичен кръг, и т.н.

PCR мутагенезата (Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette etal., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989) също е подходяща за създаване на варианти на човешка ДНаза I. Накратко, когато малки количества матрична ДНК се използват като изходен материал в PCR, праймери, които слабо се отличават в последователността си от съответния участък в матричната ДНК, може също да бъдат използвани за генериране на относително големи количества специфичен ДНК фрагмент, който се отличава от матричната последователност само в позициите, където праймерите се отличават от матрицата. За въвеждане на мутация в плазмидна ДНК например, последователността на един праймер включва желаната мутация и е конструирана така, че да се хибридизира към една верига на плазмидната ДНК в позицията на мутацията; последователността на другия праймер следва да бъде идентична на нуклеотидна последователност в рамките на противоположната верига от плазмидната ДНК, но тази последователност може да бъде локализирана навсякъде по продължение на плазмидната ДНК. За предпочитане е, обаче, последователността от втория праймер да бъде локализирана в рамките на 200 нуклеотида от този първи, така че в края целият амплифициран участък на ДНК, свързан от праймерите, да може да бъде съгласуван лесно. PCR амплификация с участието на двойка праймери като току-що описаната, води до популация от ДНК фрагменти, които се отличават в мястото на мутацията, специфично определена от праймера, и вероятно в други позиции, тъй като е вероятно понякога копираната матрица да бъде грешна (Wanger et al., in PCR Topics, pp. 69-71 (SpringerVerlag, 1991).

Ако съотношението на матрицата спрямо получената амплифицирана ДНК е екстензивно ниско, по-голямата част от продуцираните ДНК фрагменти съдържат желаните мутации. Тази продуцирана ДНК се използва, за да замести съответния участък в плазмида, който служи като PCR матрица с помощта на стандартни рекомбинантни ДНК методи. Мутации при отделни позиции могат да бъдат въведени едновременно както с мутантния втори праймер, така и с осъществяването на вто ра PCR с различни мутантни праймери и лигатирайки двата резултантни PCR фрагмента едновременно към плазмидния фрагмент в тройно (или повече) лигатиране.

Друг метод за получаване на варианти, т.нар. Касетен мутагенезис, се основава на техниката, описана от Wells et al., Gene, 34: 315323 (1985). Изходният материал е плазмид, (или друг вектор), съдържащ ДНК последователността, която следва да мутира. Кодона(ите) в тази изходна ДНК са идентифицирани. Тук следва да има уникален сайт на рестрикция от всяка страна на идентифицираните места за мутация. Ако не съществуват такива места за рестрикция, те следва да бъдат генерирани с помощта на описания по-горе олигонуклеотид-медииран метод за въвеждането им в подходящо място в ДНК. Плазмидната ДНК е срязана в тези места за линеаризирането й. Двойноверижният олигонуклеотид, кодиращ последователността на ДНК между местата на рестрикция, но съдържащ желаната (ите) мутация (и) , се синтезира с помощта на стандартни методики, където двете вериги на олигонуклеотида се синтезират поотделно и след това се хибридизират заедно с помощта на стандартни техники. Двойноверижният олигонуклеотид се отнася както към касетата. Тази касета е конструирана така, че да има 5’ и 3’ краища, които са конкурентни с краищата на линеаризирания плазмид, така че той (олигонуклеотидът) да може директно да се свърже към плазмида. Полученият в резултат плазмид съдържа мутантната ДНК последователност.

Присъствието на мутация (и) в ДНК се определя с методи, добре известни на специалистите в областта, включително рестрикционното картиране и/или ДНК съгласуване. Предпочитан метод за съгласуване е метода на дидезокси верижното терминиране на Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72: 3918-3921 (1979).

ДНК, кодираща човешка ДНаза I, се инсертира във вектор на репликация за понататъшно клониране или експресия. “Вектори” са плазмиди или други ДНКи, способни на репликация в рамките на гостоприемникова клетка и като такива са полезни за провеждане на две функции в конкурентни гостоприемникови клетки (векторна гостоприемникова система). Една функция е улесняване то на клонирането на нуклеинова киселина, кодираща вариант на човешка ДНаза I, например за да продуцира полезни качества от нуклеиновата киселина. Другата функция е да насочи експресията на вариант на човешка ДНаза I. Едната или двете функции се осъществяват от вектора в определена гостоприемникова клетка, използвана за клониране или експресия. Векторите ще съдържат различни компоненти в зависимост от предназначението им.

За получаване на вариант на човешка ДНаза I, даден вектор на експресия ще съдържа ДНК кодираща варианта, както е описано по-горе, оперативно свързан към промотор и място за свързване на рибозомата. Вариантът след това се експресира директно в рекомбинантна клетъчна култура или като фузия с хетероложен полипептид, за предпочитане сигнална последователност или друг полипептид, имащ специфично място на разграждане в мястото на съприкосновение между хетероложния пептид и варианта на човешка ДНаза I.

Прокариоти, например Е. coli и други бактерии, са предпочитани гостоприемникови клетки за изходни етапи на клонирането съгласно настоящото изобретение. Те са особено полезни за бързо продуциране на големи количества ДНК, за продуциране на едноверижни ДНК матрици, приложими за сайтнасочена мутагенеза, и за ДНК съгласуване на продуцираните варианти. Прокариотичните гостоприемникови клетки също могат да бъдат използвани за експресия на ДНК, кодираща вариант на човешка ДНаза I. Полипептидите, които се продуцират в прокариотични клетки, обикновено са негликозилирани.

В допълнение, вариантите на ДНаза I съгласно настоящото изобретение могат да бъдат експресирани в еукариотични гостоприемникови клетки, включително еукариотични микроорганизми (например дрожди) или клетки, получени от животно или друг многоклетъчен организъм (като овариални клетки на Китайски хамстер) или в живи организми (например крави, кози, овце).

Методите за клониране и експресия са добре известни на специалистите в областта. Примери за прокариотични и еукариотични гостоприемникови клетки, както и вектори за експресия, подходящи за получаване на варианти на човешка ДНаза I съгласно настоящото изобретение, например, са тези описани от Shak,

РСТ publ. No. WO 90/07572 (publication date 12.07.1992).

Ако в качеството на гостоприемници се използват прокариотични клетки, които по същество съдържат структури на клетъчни стени, предпочитаните методи за трансфекция на клетките с ДНК е методът на третиране с калций, описан от Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci 69: 2120-2114 (1972) или полиетиленгликоловият метод на Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16: 3580 (1988). Ако в качеството на гостоприемник се използват клетки на бозайник, трансфекцията обикновено се осъществява по метода на преципитация с калциев фосфат, Graham et al., Virology 52: 546 (1978), Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tach. 2: 3-10 (1990). Известни са и други методи за въвеждане на ДНК в прокариотични и еукариотични клетки, като например ядрено инжектиране, електропорация или протопластна фузия, * които са също подходящи за целите на наетоящото изобретение.

Специално приложими по изобретението са вектори на експресия, които осигуряват неустойчивата експресия на ДНК в клетки на бозайник, която ДНК кодира вариант на човешка ДНаза I. Най-общо, неустойчивата експресия включва използване на вектор на експресия, който също е способен ефективно да * се репликира в гостоприемникови клетки така, че гостоприемниковата клетка да акуму- * лира много копия на вектора на експресия и, ’ на свой ред, синтезира високи нива от желания полипептид, кодиран от вектора на експресия. Системата на неустойчиво експресиране, включваща подходящ вектор на експресия и гостоприемникова клетка, позволяват удобно позитивно идентифициране на полипептиди, кодирани от клонираните ДНКи, а така също и бързото скриниране на такива полипептиди за желани биологични или физиологични свойства. Wong et al., Science 228: 810-815 (1985); Lee et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 4360-4364 (1985); Yang et al., Cell 47: 3-10 (1986). Така, системите за неустойчива експресия удобно се използват за експресия на ДНК, кодираща аминокиселинна последователност, вариант на нативна човешка ДНаза I, във връзка с изпитания за идентифициране на онези варианти, които свързват актин с по-нисък афинитет в сравнение с нативна човешка ДНаза I, както и с изпитания за измерване на такива варианти с ДНК-хидролитична активност.

Вариант на човешка ДНаза I за предпочитане се секретира от гостоприемниковата клетка, в която се експресира, в който случай вариантът се възстановява от културалната среда, в която расте гостоприемниковата клетка. В този случай, желателно е клетките да се развиват в свободна на серум културална среда, доколкото отсъствието на серумни протеини и други серумни компоненти в средата могат да улеснят пречистването на варианта. Ако той не бъде секретиран, тогава вариант на човешка ДНаза I се възстановява от лизатите на гостоприемниковите клетки. Когато вариантът се експресира в гостоприемникова клетка, различна от тази с човешки произход, вариантът би бил напълно свободен от протеини с човешки произход. Във всеки случай, би било необходимо да се пречисти вариантът от рекомбинантни клетъчни протеини с оглед получаване на по същество хомогенни продукти на вариант на човешка ДНаза I. За терапевтични нужди пречистеният вариант би бил за предпочитане с чистота по-висока от 99% (т.е. всички други протеини ще включват по-малко от 1 % от общия протеин в пречистения състав).

Най-общо, пречистването на вариант на човешка ДНаза I се осъществява, като се използват предимствата на различията във физико-химичните свойства на варианта в сравнение с контаминантите, с които той може да бъде свързан. Например, като първи етап, културалната среда или лизат на гостоприемниковата клетка се центрофугира за отстраняване на разкъсани клетъчни дебриси. След това вариантът на човешка ДНаза I се подлага на пречистване, например, от разтворените контаминиращи протеини и полипептиди чрез преципитация с амониев сулфат или етанол, ситова гел филтрация (течна хроматография за разделяне на веществата според размера на молекулите им), йонообменна хроматография, хидрофобна хроматография, имуноафинитетна хроматография (например, с използването на колона, включваща античовешки ДНаза I антитела, включени към Сефароза), тентаклова катионообменна хроматография (Frenz et al., РСТ publ. No. WO 93/25670, 23.12.1993), обратно фазова HPLC и/или гел електрофореза.

Разбира се, специалистът в областта може да прецени дали методите за пречистване, използвани за нативна човешка ДНаза I, изискват известна модификация с оглед пречистване на вариантите на човешка ДНаза I, отчитайки структурните и други различия между протеините на варианта и нативните протеини. Например, в някои гостоприемникови клетки (специално при бактериални гостоприемници), вариантът на човешка ДНаза I може да бъде експресиран отначало в неразтворима, агрегирана форма (известна в литературата като “рефрактивни тела” или “инклузивни тела”), в който случай би било необходимо разтварянето и ренатурирането на варианта на човешка ДНаза I по време на нейното пречистване. Методи за разтваряне и ренатуриране на рекомбинантни протеинови рефрактивни тела са известни в областта (виж напр., Builder et al., US Pat. No. 4 511 502).

В друг вариант на изпълнение на настоящото изобретение, варианти на човешка ДНаза I се изготвят чрез създаване на ковалентни модификации директно в протеина на нативна или вариантна ДНаза I. Подобни модификации се създават, за да предизвикат свързване на актина или друго свойство на протеина (например стабилност, биологичен полуживот, имуногенност) и може да се осъществи вместо или в допълнение към заместването на аминокиселинни последователности, инсерцията и делеционните мутации, описани по-горе.

Ковалентни модификации могат да бъдат включени чрез взаимодействие на аминокиселинни остатъци от нативна или вариантна човешка ДНаза I с органично модифициращо средство, което е способно да реагира с подбрани аминокиселинни странични вериги или с N-крайни или С-крайни остатъци. Подобни разклоняващи средства и методи са добре известни на специалистите в областта.

Например, цистеинилови остатъци найчесто реагират α-халоацетати (съответни амини), като хлорооцетна киселина или хлороацетамин, за получаване на карбоксиамидометилови производни. Цистеинилови остатъци се образуват също чрез взаимодействие с бромотрифлуороацетон, а-бромо-β- (5-имидазоил) пропионова киселина, хлороацетил фосфат, Nалкилмалеимиди, З-нитро-2-пиридилдисулфид, метил-2-пиридилдисулфид, р-хлоромеркурибензоат, 2-хлоромеркури-4-нитрофенол, или хлоро-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол.

Хистидилови остатъци се образуват чрез взаимодействие с диетилкарбонат при pH 5,57,0, тъй като това средство е относително специфично за хистидиловата странична верига. Парабромофенацил бромид също се използва; реакцията се осъществява за предпочитане с 0,1 М натриев какодилат при pH 6,0.

Лизинил и аминокрайни остатъци взаимодействат със сукцинилови или други карбокси кисели анхидриди. Модификацията на тези средства има ефекта на обръщане на знака на натоварването на лизиниловите остатъци. Други подходящи реагенти за преобразуване на ааминосъдържащи остатъци включват имидоестери като метилпиколинимидат; пиридоксал фосфат; пиридоксал; хлороборохидрид; тринитробензенсулфонова киселина; 0-метилизоуреа; 2,4-пентандион; и трансаминазнокатализирана реакция с глиоксилат.

Аргинилови остатъци се модифицират чрез взаимодействие с един или няколко конвенционални реагента, сред тях фенилглиоксал, 2,3бутандион, 1,2-циклохександион и нинхидрин. Дериватизацията на аргининови остатъци изисква реакцията да бъде осъществявана в алкална среда, поради високата стойност на рКа на гуанидиновата функционална група. Нещо повече, тези реагенти могат да взаимодействат с групите на лизина, а така също и с епсилонаминогрупа.

Страничните карбоксигрупи (аспартил и глутамил) са селективно модифицирани чрез взаимодействие с карбодиимиди (R’-N=C=N-R’), където R и R’ са различни алкилови групи, като 1 -циклохексил-3- (2-морфолинил-4-етил) карбодиимил или 1-етил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил) карбодиимид. Нещо повече, аспартилови и глутамилови остатъци се превръщат в аспарагинилови и глутаминилови остатъци чрез взаимодействие с амониеви йони.

Ковалентното куплиране на гликозиди до аминокиселинни остатъци на протеина може да бъде използвано за модифициране или повишаване на числото или профила на въглеводородните заместители, по-специално при или в съседство с онези остатъци, които участват в свързването на актина. В зависимост от използвания начин на куплиране, захарта (те) могат да бъдат прикачени към а) аргинин и хистидин, Ь) свободни карбоксилни групи, с) свободни сулфхидрилни групи като тези на цистеина, или d) свободни хидроксилни групи като тези на серина, треонина или хидроксипроли40 на, е) ароматни остатъци като тези на фенилаланин, тирозин или триптофан или f) амидни групи на глутамин. Подходящи методи са описани, например, в РСТ патентна публика5 ция № WO 87/05330 (публикувана на 11.09.1987) и в Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Ковалентното присъединяване на агенти като полиетиленгликол (PEG) или човеш10 ки серумен албумин към варианти на човешка ДНаза I може да редуцира имуногенността и/ или токсичността на варианта и/или да пролонгира времето му на полуживот, както е наблюдавано с други протеини. Abuchovski et 15 al., J. Biol. Chem. 252: 3582-3586 (1977); Poznansky et al., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson etal., Biotechnology 8: 343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144: 209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glicol Chemistry (Plenum Press, 20 1992). В допълнение, модификация на нативна човешка ДНаза I или неин вариант чрез тези агенти при или в съседство с един аминокиселинен остатък (в рамките на около пет аминокиселинни остатъка), който способства 25 свързването на актина, може да доведе до получаване на устойчив на актин вариант.

ДНК-хидролитичната активност и афинитетът за свързване на актин на вариантите на човешка ДНаза I, изготвени както е опи30 сано по-горе, се определят чрез изпитвания и методи, известни на специалистите в областта и както са описани тук. Всеки такъв вариант, имащ ДНК-хидролитична активност и понижен афинитет за свързване на актин (както е 35 определен по-горе), е актинрезистентен вариант в рамките на обхвата на настоящото изобретение.

Вариантите на устойчива на актин човешка ДНаза I съгласно изобретението се използват за понижаване вискозитета на ДНКсъдържащ материал, например храчка, мукус или други белодробни секрети. Подобни варианти са специално приложими за третиране на пациенти с белодробно заболяване, които имат абнормени вискозни или уплътнени секрети и условия като остро или хронично белодробно заболяване, включващи инфекциозна пневмония, бронхит или трахеобронхит, бронхоектоза, цистофиброза, астма, туберкулоза и гьбични инфекции. За подобно лечение, във въздушните пътища на пациента (например бронхите или сливиците) се въвежда по конвенционален начин, например аерозолно впръскване, разтвор или фино диспергиран сух препарат от актинрезистентния вариант.

Актинрезистентните варианти се използват също за лечение на абсцеси или различни инфекции в затворено пространство като гнойник, менингит, абсцес, перитонит, синузит, отит, периодонтит, панкреатит, холелитиазис, ендокардит и септичен артрит, а така също и за локално лечение на различни възпалени и инфектирани поражения, като инфектирани увреждания на кожата и/или мукозните мембрани, хирургични рани, язвени поражения и изгаряния. Актинрезистентният вариант може да подобри ефективността на антибиотиците, използвани при лечението на такива инфекции (например гентамициновата активност забележимо се редуцира от обратимото свързване към интактна ДНК).

Нативна човешка ДНаза I и нейни актинрезистентни варианти също могат да бъдат полезни за лечение на системен лупус еритематозис (SLE), лечение на автоимунно заболяване, характеризиращо се с продуцирането на разнообразни антитела. ДНК е голям антигенен компонент на имунните комплекси. В този смисъл, човешката ДНК (нативна или вариант) , може да бъде системно прилагана, например чрез вътревенозно, подкожно, интраректално (вътре в обвивката на гръбначния мозък) или чрез мускулно инжектиране на пациента.

Нативна човешка ДНаза I и нейни актинрезистентни варианти могат също да бъдат използвани за предотвратяване на повторно развиване и/или обостряне на респираторни инфекции, което може да се случи и при пациенти с цистофиброза, хроничен бронхит, астма, пневмония или друго белодробно заболяване, или пациенти, чието дишане се подпомага от вентилатор или друго механично съоръжение или други пациенти с риск от респираторни инфекции, например постхирургични случаи.

Устойчивите на актин варианти могат да бъдат създадени по известните методи за получаване на терапевтично приложими състави. Предпочитаният терапевтичен състав е разтвор на актинрезистентен вариант в буферен или небуферен разтвор, и за предпочитане е изотоничен разтвор на сол като 150 тМ натриев хлорид, съдържащ 1,0 тМ калциев хло рид с pH 7,0. Тези разтвори са особено подходящи за използване в разпрашители, включително реактивни и ултразвукови пулверизатори за въвеждане директно в респираторните пътища или сливиците на пациента.

В друг вариант на изпълнение, терапевтичният състав включва сух прах от актинрезистентен вариант, за предпочитане изготвен чрез разпрашително сушене на разтвор от актинрезистентния вариант, както е описано по същество в заявка за US 08/206020 (заявена на 04.03.1994 г.).

Понякога един устойчив на актин вариант на ДНаза I се комбинира или прилага в съчетание с едно или повече други фармацевтични средства, които се използват за създаване на условията, изброени по-горе, като антибиотици, бронходилататори, противовъзпалителни средства, муколитици (като п-ацетилцистеин), актинсвързващи или актинразделящи протеини (като гелсолин); Matsudara et al., Cell 54: 139-140 (1988); Stossel et al., PCT WO 94/22465 (publ. date 13.10.1994), инхибитори на протеазата или продукти на генна терапия (например включващи въвеждането на цистофиброзен трансмембранен регулаторен ген (CFTR) Riordan et al., Science 245: 1066-1073 (1989)).

Предложените по-долу примери са с оглед илюстрация и без да ограничават обхвата на изобретението. Всички цитирани патентни и литературни източници са включени в литературната справка.

Пример 1. Мутагенеза на човешка ДНаза I

Щам на Е. coli CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, California USA) се трансформира c плазмида pRK.Dnaze. Плазмидът е такъв, какъвто е описан в РСТ публикация WO 90/07572 (publ. 12.07.1990), с изключение на това, че нуклеотидната последователност, кодираща човешка ДНаза I, е както е показана на фигура 1. Трансформираните клетки се посяват върху LB агарни пластинки, съдържащи 50 pg/ml карбеницилин и се култивират в продължение на една нощ при 37°С. Бульон 2YT (5 ml), съдържащ 50 pg/ml карбеницилин и 10 μΐ VCSM13 хелперен фаг (Stratagene, La Jolla, California USA), се инокулира c отделна колония от агарната пластинка и се култивират в продължение на една нощ при 37°С и при разклащане. От тази култура се изолира едноверижна ДНК и се използва като матрица за последваща мутагенеза.

Сайтнасочена мутагенеза се осъществява с помощта на синтетични олигонуклеотиди съгласно метода на Kunkel et al. (Meth. Enzymol. 5 154: 367-382 (1987)). Мутагенните нуклеотиди са 21-мери или 24-мери, имащи или 9, или 12 правилни двойни бази 5’ спрямо безсмисления кодон и 9 правилни двойни бази 3’ спрямо безсмисления кодон. След мутагенезата, еднове- 10 рижна ДНК от отделни клонове се подлага на дидезокси съгласуване (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 74: 5463-5467 (1977)). ДНК, имаща вариантни нуклеотидни последователности, след това се трансформира както е опи- 15 сано по-горе в щам на Е. coli XL1 Blue MRF’ (Stratagene). След посяване и изолиране на отделна колония както по-горе, една отделна колония се използва за инокулиране на 0,5 1 бульон LB, съдържащ 50 pg/ml карбеницилин. След 20 култивиране в продължение на 1 h при разклащане и при 37°С, клетките се събират чрез центрофугиране и вариантната ДНК (във вектор на експресия) се пречиства с помощта на колони Qiagen тип-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, 25 California USA).

Фигури 2-6 идентифицират създадените различни варианти на ДНаза I. На фигурите и в целия текст описването на аминокиселинните субституционни мутации, намиращи се във ва- 30 рианта на ДНаза I, е представено съкратено с първа буква, номер и втора буква, като първата буква е еднобуквено съкращение на аминокиселинния остатък в нативната (див тип) човешка зряла ДНаза I, а втората буква е едно- 35 буквено съкращение на аминокиселинния остатък в тази позиция на вариантната ДНаза I. Множество мутации в отделен вариант са означени по сходен начин с двоеточие (:), разделяйки всяка от различните мутации, намиращи 40 се във варианта. Например, означението D53R:Y65A означава, че вариантът има мутация D53R и мутация Y65A.

Пример 2. Експресия на варианти на човешка ДНаза I 45

Човешки ембрионални бъбречни клетки 293 (АТСС CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Mayland USA) се култивират в серум, съдържащ среда в 150 mm петриеви панички. Клетките в логаритмична фаза 50 се котрансфектират с 22,5 μg пречистена вариантна ДНК (изготвена както е описано по горе) и 17 μg аденовирусна ДНК с помощта на метода на преципитиране с калциев фосфат (Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)). Приблизително 16 hслед трансфектирането, клетките се промиват с 15 ml фосфатно буфериран разтвор на сол и средата се сменя със свободна на серум среда. От всяка пластина се събират по две поколения клетъчна култура, като първото - на всеки 24 h или 72 h и последното на 96 h след смяната със свободна от серум среда. По този начин се получават общо приблизително по 50 ml от супернатантата на клетъчната култура, съдържаща вариант на ДНаза I. Събраната от всяка пластина културална супернатанта се концентрира от 5 до 50-кратно с помощта на концентратори Centriprep 10 и получените концентрати се изпитват за определяне на различните биологични и биохимични свойства на вариантите на ДНаза I.

Концентрат, съдържащ нативна човешка ДНаза I, се изготвя по процедурата, описана по-горе с изключение на това, че клетките 293 се трансфектират с плазмида pRK. Dnaze.3.

Пример 3. Биохимични и биологични свойства на варианти на човешка ДНаза I.

I. Относителна специфична активност > Относителната специфична активност на «' вариантите на ДНаза I се изпитва чрез срав- '·' няване активността на варианта с тази на на- ^у тивна човешка ДНаза I. По-специално, относителната специфична активност на вариантите се определя като концентрацията на варианта (в μβ/ml), определена с проба с метиленово зелено (Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222: 351-358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29: 41-53 (1950)), се разделя на концентрацията на варианта (в pg/ml), определена в ELISA проба на ДНаза I (описано по-долу). И в двете проби - с метиленово зелено и ДНаза I ELISA, стандартните криви се определят с помощта на човешка ДНаза I Pulmozyme®. Относителната специфична активност на нативната човешка ДНаза I и на вариантите са показани на фиг. 2.

Изпитването на активността с метиленово зелено (Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222: 351-358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29: 41-53 (1950) се осъществява c помощта на багрилото метиленово зелено, което се вмъква приблизително на всеки десет бази в ДНК и води до образуване на зелен субстрат. Тъй като ДНК се разгражда от ДНаза I, багрилото се освобождава и окислява до безцветна форма. Така загубата на зеленото оцветяване е пропорционално на количеството на добавената в пробата за изпитване ДНаза I. Количеството на ДНаза I, намиращо се в пробата след това се определя чрез сравняване със стандартна крива, изготвена чрез изпитване на познати количества от ДНаза I.

Изпитването на ДНаза I с ELISA включва покриване на микротитърни пластинки с козе анти-ДНаза I поликлонално антитяло, добавяне на пробата, която трябва да бъде изпитвана и установяване на полученото в резултат от свързването на ДНаза I със заешкото антиДНаза I поликлонално антитяло, което е конюгирало с пероксидаза (HRP). Когато се добавят HPR субстратът и предизвикващият оцветяването агент, полученото оцветяване е пропорционално на количеството ДНаза I, намиращо се в пробата. Количеството на ДНаза I, намиращо се в пробата, след това се определя чрез сравняване със стандартна крива, изготвена чрез изпитване на известни количества ДНаза I.

И в двете изпитвания се правят множество разреждания на пробата и онези стойности, които попадат в интервала, определен от стандартната крива, се осредняват, като се изчисляват стандартните отклонения.

Така също, концентрацията на ДНаза I, както е определена с ELISA, се използва за стандартизиране на ДНаза I концентрациите в други изпитвания, където се характеризират вариантите на ДНаза I (например, в изпитвания за инхибиране от актин, описано по-долу).

II. Инхибиране на хидролитичната активност на ДНаза I от катина

В-актин (Kabish et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. 21: 49-76 (1992) се изготвя поне 10 дни преди използване чрез диализиране в продължение на едно денонощие на 1 mg/ml разтвор на търговско достъпен актинов препарат (Sigma, St. Louis, Missouri USA) срещу 5 mM HEPES, pH 7,2, 0,2 mM CaCl₂, 0,5 mM ATP, 0,5 mM меркаптоетанол при 4°C. След центрофугиране при 13 000 х g за 5 min, количеството на G-актина се определя чрез измерване на абсорбцията при 290 nm; 1 mg/ml разтвор е с абсорбция 0,66 OD. Количеството на G-акти новия препарат, необходимо за съществено (>50% инхибиране), но не напълно инхибиране на ДНК-хидролитичната активност на нативна човешка ДНаза I се определя в предварителни експерименти при едни и същи условия за всяко запитване. Чувствителността на актиновото инхибиране се изпитва чрез измерване на ДНК-хидролитичната активност на вариантите в присъствието и отсъствието на актин във всяко от двете различни изпитвания, като изпитването с метиленово зелено, описано по-горе и хиперхромно изпитване, което се основава на повишаването на абсорбцията при 260 пш при денатуриране и деполимеризиране на ДНК (Kunitz, J. Gen. Physiol. 23: 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 363-377 (1950)). Процентите на инхибиране на подбраните варианти в тези изпитвания са показани на фиг. 3 и 4.

В хиперхромното изпитване концентрирани културални супернатанти (изготвени както е описано по-горе, съдържащи варианти на ДНаза I) се инкубират както без добавяне, така и с добавяне на 2- до 3-кратно по-големи количества на актин в буфер А (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 тМ СаС1₂, 4 тМ MgCl₂, 0,1% BSA) за 1 h при стайна температура преди поставянето им в епруветка, съдържаща 40 цж ДНК в общ обем на пробата 1,0 ml. Крайната концентрация на варианта на ДНаза I в пробата е приблизително 26 пМ, както е определено чрез изпитване на ДНаза I с ELISA. Измерват се стойностите на ДНК хидролизата от вариантите на ДНаза I в присъствие или отсъствие на актин. Процентът активност, показана на фиг. 3 и 4, се изчислява чрез определяне на отношението ДНК хидролитичната активност на човешка ДНаза I (нативна или вариант) в присъствието на актин спрямо нейната ДНКхидролитична ативност и в отсъствие на актин и умножаване по 100.

В изпитването с метиленово зелено, концентрирани културални супернатанти (изготвени както е описано по-горе, съдържащи варианти на ДНаза I), се инкубират както без добавяне на актин, така и с 1000 пъти поголямо количество актин в буфер В (25 тМ HEPES, pH 7,5, 4 mM СаС1₂, 4 тМ MgCl₂, 0,1 % тимерозал и 0,5% Tween 20) при 37°С за 16 h). Концентрацията на активния ензим във всеки случай се определя чрез сравняване със стандартната крива от Pulmozym®. “Процен тът активност”, оставаща за варианта, се отнася до 100 пъти отношението на активността в присъствие на актин спрямо активността при липса на актин.

Както е показано на фиг. 3 и 4, ДНКхидролитичната активност на нативна човешка ДНаза I е съществено редуцирана в присъствието на актин. При сравняване, различни варианти с един или множество остатъка са относително устойчиви на инхибиране от актин, както е видно от тяхната по-голяма ДНК-хидролитична активност в присъствието на актин по сравнение с нативна човешка ДНаза I.

III. Свързваща актина ELISA

Провежда се микротитърно изпитване за измерване на свързването на нативна човешка ДНаза I и варианти на ДНаза I от имобилизиран актин. Най-напред, кладенчетата на пластинка MaxiSorp (Nunc, Inc., Naperville, Illinois, USA) се покриват със 100 ul/за едно кладенче човешки GC глобулин (Calbiochem, La Jolla, California USA), актинсвързващ протеин (Goldsmidt-Clermont, et al., Biochem. J. 228: 471 (1985), McLeod, etal., J. Biol. Chem. 264: 12601267 (1989), Houmeid et al., Eur. J. Biochem. 203: 499-503 (1992)), при концентрация 10 ug/ ml в 25 mM HEPES, 4 mM MgClj, 4 mM CaCl₂, pH 7,2, при 4°C за 16 до 24 h. След изчистване на GC глобулина, излишъкът от реактивни места се блокира с добавяне на 200 ug за кладенче от буфер С (буфер С е същият като буфер В, по-горе, но с добавка от аденозин трифосфат; буфер С се използва като разредител във всички следващи етапи до посочване на друг) и инкубиране на пластинката в шейкер за 1-2 h на стайна температура, за един час на Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Vineland, New Jersey, USA); между всеки от етапите пластинката се изпразва и промива 6-кратно с фосфатно буфериран разтвор на сол, съдържащ 0,05 % Tween 20 с устройство за промиване на пластини Microwash II (Skatron A/S, Norway). След това, G-актин, приготвен както е описано по-горе, се разрежда до 50 ug/ml в буфер С и към всяко кладенче се добавят 100 ul и пластинките се инкубират и промиват, и към кладенчетата се добавят 100 ul от различни разреждания на Pulmozym® и клетъчно-културална среда, съдържаща както нативна човешка ДНаза I, така и нейни варианти, след което пластинките се инкубират и промиват. Накрая, към всяко кладенче се добавят по 100 ul от 1/

000 разреждане на античовешки ДНаза I заешки поликлонално антитяло - пероксидазен конюгат (концентрацията на оригиналния източник е 465 ug/ml). След инкубиране и промиване се инициира цветообразувани чрез добавяне на 100 ul за кладенче цветообразуващ реагент (Sigma Fast о-фенилендиамин и таблетки карбамид) Н₂О₂, разтворени съгласно препоръките на производителя и се стопира чрез добавяне на 100 ul 4,5 N H₂SO₄ за кладенче. Установява се абсорбцията при 492 шп и се съпоставя с концентрацията на ДНаза I, първоначално добавена към кладенчето. Получават се сигмоидални криви за нативна човешка ДНаза I и за тези варианти, които се свързват с актина; тези криви се изразяват с уравнение с четири параметъра посредством нелинеен регресионен анализ (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11: 431-441 (1963); концентрацията на всяка ДНаза I (нативна или вариант), необходима за получаване на наполовина максимален сигнал в пробата, се изчислява от кривите и се отнася както към EC_J0 стойността. Молекулната маса на нативна човешка ДНаза I и на вариантите се предполага, че е 37 000 Da.

Относителният афинитет на свързване на всеки вариант на ДНаза I се изчислява чрез разделяне на EC_J0 стойността на варианта на EC_J0 стойността на нативна човешка ДНаза I, определена в проба на ELISA и получените резултати са показани на фиг. 5. Като пример, ако относителният афинитет на свързване на вариант на човешка ДНаза I е изчислен, че възлиза на 5, тази стойност би означавала, че EC_J() стойността на варианта е петкратно по-голяма от EC_S0 стойността на нативна човешка ДНаза, или с други думи, вариантът има афинитет за актин, който е петкратно по-малък от афинитета на нативна човешка ДНаза I за актин в тази ELISA проба.

IV. Изпитване на уплътнена храчка Изпитването на уплътнена храчка (РСТ патентно описание, публикувано на 11 май 1994) се използва за измерване на относителния вискозитет на храчката от цистофиброзни пациенти (“CF sputum”) преди или след инкубация с нативна човешка ДНаза I и различни ДНазни варианти. След смесване на CF храчка с проба на ДНаза I и инкубиране в продължение на 20 min при стайна температура, полутвърдите разтвори се поставят в капилярни епруветки, които след това се центрофугират на 12 000 rpm за 20 min. След центрофугирането, височината на утайката се измерва и сравнява с височината на разтвора плюс утайката. Тези измервания след това се използват за изчисляване на процента на уплътняване на храчката, който съответства на нейния вискозитет.

Процентът на уплътняване, определен при третиране на CF храчка с нативна човешка ДНаза I и устойчиви на актин варианти на човешка ДНаза I, е показан на фиг. 6. Тези резултати показват, че актинрезистентните варианти на човешка ДНаза I са по-ефективни в сравнение с нативна човешка ДНаза I при редуциране на вискозитета на CF храчката, както е определено чрез изпитване на уплътнението.

Claims (9)

1. Патентни претенции

   1. Вариант на човешка ДНаза, характеризиращ се с това, че има най-малко 90% идентичност с аминокиселинната последователност на нативна ДНаза I и най-малко едно аминокиселинно заместване с една или повече аминокиселини от следните позиции: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 или Alai 14.
2. 2. Вариант на ДНаза I съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че има наймалко 90% идентичност с аминокиселинната последователност на нативна ДНаза I и наймалко едно аминокиселинно заместване с една или повече аминокиселини от следните позиции: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53,

   Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 или Ahl 14.
3. 3. Вариант на човешка ДНаза I съгласно която и да е от претенции 1 и 2, имащ наймалко една от следните аминокиселинни замествания: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K или E69R.
4. 4. Вариант на ДНаза I съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че има най-малко едно от следните аминокиселинни замествания: D53R, Y65A, Н44А, E69R, Н44А. D53R: Y65A, H44A.D53R: Y65A, Η44Α.Υ65Λ E69R, D53R: Y65A, D53R.E69R и V67K.
5. 5. Вариант на ДНаза I съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че включва аминокиселинна последователност, имаща най-малко 95% идентичност с аминокиселинната последователност на нативна човешка ДНаза I, показана на фигура 1.
6. 6. Изолирана нуклеинова киселина, характеризираща се с това, че кодира един актинрезистентен вариант на човешка ДНаза I, от която и да е претенция от 1 до 5.
7. 7. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва вариант на човешка ДНаза I съгласно която и да е претенция от 1 до 5 и при желание фармацевтично приемлив пълнител.
8. 8. Състав съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че е изготвен в течна форма.
9. 9. Състав съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че е изготвен под форма на прах.

   Приложение: 7 фигури