NO326612B1 - Variant av human DNase I, isolert nukleinsyre og preparat for reduksjon av viskoelastisiteten til pulmonale sekreter. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en variant av human DNase I, en isolert nukleinsyre og et preparat for reduksjon

av viskoelastisiteten til pulmonale sekreter. Resultatene er oppnådd fra forskning på humandeoksyribonuklease I (DNase I),

en fosfodiesterase som er i stand til å hydrolysere polydeoksyribonukleinsyre. Den vedrører generelt modifiserte (variant-) former av human-DNase I.

Oppfinnelsens bakgrunn

DNase I er en fosfodiesterase som er i stand til å hydrolysere polydeoksyribonukleinsyre. DNase I er blitt renset fra forskjellige arter i varierende grader.

Bovin DNase I er blitt grundig undersøkt biokjemisk.

Se f.eks. Moore, i The Enzymes (Boyer, P.D., red), side 281-

296, Academic press, New York (1981). Den fullstendige aminosyresekvensen til bovin DNase I er kjent (Liao et al., J.

Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefner et al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986); Lahm et al., J. Mol. Biol. 221:645-667

(1991)), og DNA som koder for bovin DNase I, er blitt klonet

og uttrykt (Worrall et al.,. J. Biol. Chem. 265:21889-21895

(1990)). Strukturen til bovin DNase I er blitt undersøkt ved

hjelp av røntgenkrystallografi. Suck et al., EMBO J. 3:2423-

2430 (1984); Suck et al., Nature 321:620-625 (1986); Oefner et al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986).

DNA som koder for human-DNase I, er blitt isolert og sekvensert, og den DNA er blitt uttrykt i rekombinante vertsceller, hvorved fremstillingen av human-DNase I er blitt muliggjort i kommersielt nyttige mengder. Shak et al., Proe.

Nat. Acad. Sei. 87:9188-9192 (1990).

DNase I har en rekke kjente anvendelser og er blitt brukt til terapeutiske formål. Dens viktigste terapeutiske anvendelse har vært å redusere viskoelastisiteten til pulmon-

ale sekresjoner (slim) ved slike sykdommer som lungebetennelse og cystisk fibrose (CF) for derved å hjelpe til ved tømmingen av luftveiene. Se f.eks. Lourenco et al., Arch. Intern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 87:9188-9192 (1990); Hubbard et al., New Engl. J. Med.

326:812-815 (1992); Fuchs et al., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Bryson et al., Drugs 48:894-906 (1994). Slim bidrar også til sykeligheten ved kronisk bronkitt, astmatisk bronkitt, bronkiektase, emfysem, akutt og kronisk sinusitt og til og med vanlig forkjølelse.

De pulmonale sekresjoner hos personer som har slike sykdommer, er komplekse materialer som omfatter slimglykopro-teiner, mukopolysakkarider, proteaser, aktin og DNA. Noen av materialene i pulmonale sekresjoner frigjøres fra leukocytter (nøytrofiler) som infiltrerer pulmonalt vev som svar på tilstedeværelsen av mikrober (f.eks. stammer av Pseudomonas-, Pneumococcus- eller Staphylococcus-bakterier) eller andre irriterende stoffer (f.eks. tobakksrøyk, pollen). Under reak-sjonen med slike mikrober eller irriterende stoffer kan leuko-cyttene degenereres og frigjøre sitt innhold som bidrar til viskoelastisiteten til de pulmonale sekresjoner.

Evnen til DNase I til å redusere viskoelastisiteten til pulmonale sekresjoner, er blitt tilskrevet dens enzymat-iske nedbrytning ved de store mengdene av DNA som frigjøres av nøytrofiler. Shak et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 87:9188-9192

(1990); Aitken et al.,J. Am. Med. Assoc. 267:1947-1951 (1992).

Det er nylig blitt foreslått en annen mekanisme for den mukolytiske effekt av DNase I, som involverer desaggrega-sjon av aktin. Vasconcellos et al., Science 263:969-971

(1994) . Aktin er ett av de mest rikelige proteiner i eukaryote

celler (f.eks. utgjør aktin ca. 10% av det totale leukocytt-protein) og er blitt grundig undersøkt. Kabsch et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992); Sheterline et al., Prot. Profile 1:1-121 (1994). Aktin foreligger i to former, en monomerform (G-aktin) og en filamentærform (F-aktin) som er sammensatt av G-aktinmonomerer. Polymere filamenter av aktin er svært viskoelastiske og bidrar betydelig til viskositeten til pulmonale sekresjoner. Mornet et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 81:3680-3684 (1984); Newman et al., Biochemistry 24:1538-1544 (1985); Janmey et al., Biochemistry 27:8218-8226 (1988); Vasconcellos et al.. Science 263:969-971

(1994). Ettersom DNase I er kjent for å bindes til aktin

(Lazarides et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 71:4742-4746 (1974); Kabsch et al., Nature 347:37-44 (1990)), og for å depolymerisere aktinfilamenter (samt inhibere polymerisasjon av G-aktin til filamenter) (Mannherz et al., FEBS Lett. 60:34-38 (1975); Hitchcock et al., Cell 7:531-542 (1976); Pinder et al., Biochemistry 21:4886-4890 (1982); Weber et al., Biochemistry 33:4780-4786 (1994)), er det blitt foreslått at den mukolytiske effekt av DNase I på spytt og andre pulmonale sekresjoner skyldes aktindesaggregasjon (depolymerisering) snarere enn DNA-hydrolyse. Vasconcellos et al., Science 263:969-971

(1994). I overensstemmelse med dette syn er det kjent at den" DNA-hydrolytiske aktivitet av DNase I inhiberes i nærvær av aktin. Lazarides et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 71:4742-4746

(1974); Mannherz et al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Også i overensstemmelse med dette syn er det blitt rapportert at aktinspaltende proteiner (f.eks. gelsolin) er effektive når det gjelder å redusere viskoelastisiteten til spyttet fra cystisk fibrose. Vasconcellos et al., Science 263:969-971 (1994); Stossel et al., PCT patentsøknad nr. WO 94/22465 (publisert

13. oktober 1994).

WO 9007572 gjør kjent isolerte DNA-sekvenser som koder for human DNase, og fremstilling av varianter av DNase med forskjellig aminosyresekvens og glykosylering av en naturlig forekommende DNase med forbedrede egenskaper og spesifikk aktivitet.

WO 9422465 vedrører en metode, og et farmasøytisk preparat egnet til å redusere viskositeten til slim i luftveiene forårsaket av patologiske tilstander, spesielt cystisk fibrose.

Foreliggende oppfinnelse er basert delvis på forskning av oppfinnerne for å bestemme det biokjemiske grunnlag for den mukolytiske aktivitet av DNase I. Denne forskning omfattet utformingen og syntesen av forskjellige human-DNase I-varianter og analysen av disse variantene for å fastlegge deres evne til å hydrolysere DNA, å bindes til aktin og redusere viskoelastisiteten til spytt in vitro. Oppfinnerne skapte flere klasser av human-DNase I-varianter. Én klasse av varianter (aktin-resistente varianter) har redusert evne til å binde aktin, men har fortsatt mukolytisk aktivitet og i noen tilfeller forøkt mukolytisk aktivitet sammenlignet med naturlig forekommende human-DNase I. Disse aktinresistente variantene har omtrent den samme DNA-hydrolytiske aktivitet som naturlig forekommende human-DNase I, men slik aktivitet er mindre mottakelig for inhibering ved hjelp av aktin. En andre klasse av varianter binder aktin med en lignende affinitet som den som finnes for naturlig forekommende human-DNase I, men har redusert mukolytisk aktivitet og redusert DNA-hydrolytisk aktivitet sammenlignet med naturlig forekommende human-DNase

I.

Disse resultatene indikerer at den terapeutiske virk-ningsfullhet av human-DNase I når det gjelder å redusere viskoelastisiteten til pulmonale sekresjoner, skyldes dens kata-lytiske, DNA-hydrolytiske aktivitet snarere enn dens evne til å depolymerisere filamentært aktin. Følgelig burde varianter av human-DNase I som binder aktin med lavere affinitet enn naturlig forekommende human-DNase I, men som fortsatt har DNA-hydrolytisk aktivitet, være anvendbare terapeutiske midler, spesielt ved behandlingen av pasienter med pulmonale sekresjoner som omfatter forholdsvis store mengder aktin. Ettersom slike varianter har redusert affinitet for aktin, inhiberes deres DNA-hydrolytiske aktivitet mindre i nærvær av aktin, og følgelig har disse variantene større mukolytisk aktivitet i nærvær av aktin sammenlignet med naturlig forekommende human-DNase I.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en variant av human DNase I, kjennetegnet ved at den har DNA-hydrolytisk aktivitet og minst 90 % identitet med aminosyresekvensen til nativ DNase I som vist ifølge figur 1, der nevnte variant omfatter minst

én aminosyresubstitusjon som er valgt fra gruppen som består av: E13A, E13H, E13R, E13W, E13Y, Y65W, E69K og E69R.

Oppfinnelsen omfatter også en isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at den koder for en variant av human DNase I ifølge foreliggende oppfinnelse.

Også omfattet av oppfinnelsen er et preparat for reduksjon av viskoelastisiteten til pulmonale sekreter, kjennetégnet ved at det omfatter en variant av human DNase I ifølge foreliggende oppfinnelse, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe human-DNase I-varianter som har DNA-hydrolytisk aktivitet, men som binder aktin med lavere affinitet enn naturlig forekommende human-DNase I.

Det er et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe nukleinsyrer som koder for slike aktinresistente varianter av human-DNase I, rekombinante vektorer som omfatter slike nukleinsyrer, rekombinante vertsceller transformert med disse nukleinsyrene eller vektorene, og fremgangsmåter for fremstilling av human-DNase I-variantene ved hjelp av tekno-logi med rekombinant DNA.

Oppfinnelsen er også rettet mot farmasøytiske preparater som omfatter de human-DNase I-aktinresistente variantene, eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser aminosyresekvensen til moden human-DNase I (SEKV.ID. NR. 1). Tallene angir rekkefølgéstillingen til aminosyrerester i sekvensen. Figur 2 viser den relative spesifikke aktivitet til naturlig forekommende human-DNase I og varianter. Feilstolpene viser standardavviket (n-veiet). Den relative spesifikke aktivitet til "Pulmozyme" human-DNase I (Genehtech, Inc., South San Francisco, California, USA) er definert som 1,0. Den relative spesifikke aktivitet til naturlig forekommende human-DNase I er større enn aktiviteten til "Pulmozyme" på grunn av tilstedeværelsen av "Pulmozyme" i en deamidert form av human-DNase I som har redusert DNA-hydrolytisk aktivitet (Frenz et al., PCT patentsøknad nr. WO 93/25670, publisert 23. desember 1993). Figur 3 viser den DNA-hydrolytiske aktivitet til naturlig forekommende human-DNase I og enkeltrestvarianter av human-DNase I i nærvær av aktin, som bestemt i en hyperkromisitetsanalyse. "Prosent aktivitet" er prosenten av DNA-hydrolytisk aktivitet, av DNase I (naturlig forekommende eller variant) beregnet som beskrevet i eksempel 3; den DNA-hydrolytiske aktivitet av DNase I i fravær av aktin er definert som 100% aktivitet. Feilstolpene utgjør standardavviket.

Figur 4 viser den DNA-hydrolytiske aktivitet av

naturlig forekommende human-DNase I og multippelrestvarianter av human-DNase I i nærvær av aktin, som bestemt i en hyperkromisitetsanalyse eller en metylgrøntanalyse. "Prosent akti-

vitet" er prosenten av DNA-hydrolytisk aktivitet av DNase I (naturlig forekommende eller variant) beregnet som beskrevet i eksempel 3; den DNA-hydrolytiske aktivitet av DNase I i fravær av aktin er definert som 100% aktivitet. Feilstolpene utgjør standardavviket.

Figurene 5 viser den relative bindingsaffinitet til human-DNase I-varianter for aktin som bestemt i en aktinbin-dings-ELISA-analyse (som beskrevet i eksempel 3). EC50-verdien er den konsentrasjon av DNase I (naturlig forekommende eller variant) som er påkrevet for å gi et halvmaksimalt signal ved analysen. Feilstolpene utgjør standardavviket. EC50-verdiene for "Pulmozyme" og naturlig forekommende human DNase I er hhv.

72 ± 21 pM (n=21) og 85 ± 14 pM (n=14). Den relative bindings-affinltet vist i figuren, er EC50-verdien bestemt for human-

DNase I-varianten dividert med EC50-verdien bestemt for natur-

lig forekommende human-DNase I. Varianter hvor EC50-verdien var større enn det som kunne måles ved analysen, er angitt som

>35, >350, >1 750, >3 500 eller >35 000. Figur 6 viser den mukolytiske aktivitet til naturlig forekommende human-DNase I og varianter av human-DNase I i spyttprøver fra pasienter med cystisk fibrose, som bestemt ved hjelp av en komprimeringsanalyse. Feilstolpene utgjør stand-ardfeilen for gjennomsnittsverdien. Figur 7 viser en skjematisk fremstilling av aktinbin-dings-ELISA-analysen beskrevet i eksempel 3.

Nærmere beskrivelse

I. Definisjoner

Slik de her er brukt, henviser uttrykkene "human-

DNase I", "nativ human-DNase I" og "villtype-DNase I" til polypeptidet som har aminosyresekvensen til moden human-DNase I angitt i figur 1.

En "variant" eller "aminosyresekvensvariant" av human-DNase I er et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er forskjellig fra sekvensen til nativ human-DNase I. Generelt vil en variant ha minst 80% sekvensidentitet (homologi), fortrinnsvis minst 90% sekvensidentitet, mer foretrukket minst 95% sekvensidentitet, og mest foretrukket minst 98% sekvensidentitet med nativ human-DNase I. Prosent sekvensidentitet bestemmes f.eks. ved hjelp av versjonen til Fitch et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 80:1382-1386 (1983) av algorit-men beskrevet av Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453

(1970), etter sammenstilling av sekvensene for å gi den maksi-male homologi.

Uttrykkene "human-DNase I-aktinresistent variant", "aktinresistent variant" og "aktinresistent variant av human-DNase I" henviser til en variant av nativ human-DNase I som har (1) DNA-hydrolytisk aktivitet og (2) redusert bindingsaffinitet for aktin.

"DNA-hydrolytisk aktivitet" henviser til den enzym-atiske aktivitet til nativ human-DNase I eller en variant av human-DNase I når det gjelder å hydrolysere (spalte) substrat-DNA slik at man får 5'-fosforylerte oligonukleotidsluttproduk-ter. DNA-hydrolytisk aktivitet bestemmes lett ved hjelp av hvilken som helst av flere forskjellige fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, inkludert analytisk polyakrylamid- og agarosegelelektroforese, hyperkromisitetsanalyse (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)), eller metylgrøntanalyse (Kurnick, Arch." Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)).

"Bindingsaffiniteten" til nativ human-DNase I eller en aktinresistent variant av human-DNase I for aktin henviser til evnen til nevnte DNase I når det gjelder å bindes ikke-kovalent til aktin. Bindingsaffinitet kan bestemmes ved hjelp av hvilken som helst av forskjellige fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, f.eks. som beskrevet i Mannherz et al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Alternativt bestemmes de relative bindingsaffinitetene til forskjellige DNaser (f.eks nativ human-DNase I og varianter derav) ved å måle bindingen av

DNasene til immobilisert aktin i en ELISA-analyse (beskrevet i eksempel 3), eller ved å sammenligne den DNA-hydrolytiske aktivitet til DNasene i nærvær og i fravær av aktin (også beskrevet i eksempel 3). Fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene, er spesielt passende for screening av varianter av human-DNase I for hurtig å identifisere de variantene som har en redusert bindingsaffinitet for aktin.

En human-DNase I-aktinresistent variant med "redusert bindingsaffinitet for aktin", er én som har en bindingsaffinitet for aktin som er forholdsvis mindre enn affiniteten som nativ human-DNase I bindes til aktin med, bestemt under sam-menlignbare betingelser. Dersom den aktin-bindende ELISA-analyse som beskrevet i eksempel 3 anvendes for å bestemme bindingsaffiniteten til en human-DNase I (nativ eller variant) for aktin, så vil en aktinresistent variant som har "redusert bindingsaffinitet for aktin" være én som har en EC50-verdi som er større enn verdien til nativ human-DNase I. I den analysen vil en aktinresistent variant vanligvis ha en ECS0-verdi som er 5 til 100 ganger høyere enn verdien til nativ human-DNase; men

aktinresistente varianter som har en EC50-verdi over 500 ganger høyere enn verdien til nativ human-DNase I, fremstilles også

lett, spesielt ved å endre flere aminosyrerester i den native human-DNase I-aminosyresekvens (se f.eks. figur 5).

"Mukolytisk aktivitet" henviser til reduksjonen av viskoelastisitet (viskositet) til spytt eller annet biologisk materiale, f.eks. som observert etter behandling av materialet med nativ human-DNase I eller en variant av human-DNase I. Mukolytisk aktivitet bestemmes lett ved hjelp av hvilken som helst av flere forskjellige fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, inkludert spytt-komprimeringsanalyse (PCT patent-søknad nr. WO 94/10567 publisert 11. mai 1994), analyser hvor det anvendes en torsjonspendel (Janmey, J. Biochem. Biophys. Methods 22:41-53 (1991)), eller andre reologiske metoder.

"Polymerasekjedereaksjon" eller "PCR" henviser generelt til en fremgangsmåte for amplifikasjon av en ønsket nukleotidsekvens in vi tro, som beskrevet f.eks. i US patentskrift

nr'. 4.683.195. Generelt omfatter PCR-metoden gjentatte

.sykluser med primerforlengelsessyntese, under anvendelse av

oligonukleotidprimere som er i stand til å hybridisere fortrinnsvis til en templatnukleinsyre.

"Celle", "vertscelle", "cellelinje" og "cellekultur" brukes her om hverandre, og alle slike uttrykk skal forstås å omfatte avkom som skriver seg fra vekst eller dyrking av en celle. "Transformasjon" og "transfeksjon" brukes om hverandre for å henvise til fremgangsmåten for innføring av DNA i en celle.

"Operativt bundet" henviser til den kovalente sammen-knytning av to eller flere DNA-sekvenser ved hjelp av enzymatisk ligering eller på "Snnen måte, i en konfigurasjon i for^ hold til hverandre slik at den normale funksjonen til sekvensene kan utføres. F.eks. er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operativt bundet til DNA for et polypeptid dersom den uttrykkes som et preprotein som deltar i utskillelsen av polypeptidet; en promoter eller fremmer er operativt bundet til en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operativt bundet

til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det let-ter translasjon. Generelt betyr "operativt bundet" at DNA-sekvensene som er bundet sammen, er sammenhengende og, i tilfel-let med en sekretorisk leder, sammenhengende og i lesefase. Binding utføres ved ligering i passende restriksjonsseter. Dersom det ikke foreligger slike seter, så anvendes syntetiske oligonukleotidadapterer eller linkere sammen med standardfrem-gangsmåter med rekombinant DNA.

Aminosyrer identifiseres her ved hjelp av trebok-stavs- eller enbokstavsbetegnelser på følgende måter:

II. Utvelgelse av aktinresistente varianter

Foreliggende oppfinnelse er basert på undersøkelsen av struktur-, aktinbindende egenskaper, DNA-hydrolytisk aktivitet og mukolytisk aktivitet til aminosyresekvensvarianter av human-DNase I. De aktinresistente variantene ifølge foreliggende oppfinnelse har DNA-hydrolytisk aktivitet, men binder aktin med lavere affinitet enn nativ human-DNase I. Reduksjonen i aktinbinding oppnås fortrinnsvis ved å lage mutasjoner i og/eller rundt de aminosyrerestene innenfor nativ human-DNase I som synes å påvirke bindingen av aktin, inkludert f.eks. Glul3-, His44-, Leu45-, Val48-, Gly49-, Leu52-, Asp53-, Asn56-, Tyr65-, Val67-, Glu69- og Alall4-restene i nativ human-DNase I (tallet etter trebokstavaminosyrebetegnelsen angir den bestemte stillingen til aminosyreresten i sekvensen i fig. 1)..

Det finnes mange forskjellige måter hvorved man kan lage aktinresistente varianter av human-DNase I. I én utførel-sesform ifølge denne oppfinnelsen fremstilles en aktinresistent variant ved å innføre enten enkelt- eller multippelamino-syresubstitusjoner, -innføyelser og/eller -delesjoner i eller like ved (dvs. innenfor ca. 5 aminosyrerester fra) de aminosyrerestene i nativ human-DNase I som påvirker aktinbinding. Noen illustrerende eksempler på slike mutasjoner er som føl-ger: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, H44A: Y65A:E69R (se figurene 2-6).

Ved en annen utførelsesform av denne oppfinnelsen fremstilles en aktinresistent variant ved å innføre mutasjon (er) som skaper et nytt glykosyleringssete i eller like

ved (dvs. innenfor ca. 5 aminosyrerester fra) en aminosyrerest i nativ human-DNase I som påvirker aktinbinding. F.eks. brukes seterettet mutagenese for å innføre én av tripeptidsekvensene, asparagin-X-serin eller asparagin-X-treonin (hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin), som er gjenkjennel-sessekvenser for enzymatisk festing av en karbohydratrest til asparaginsidekjeden. Creighton, Proteins, side 76-78 (W.H. Freeman, 1984) . Sterisk hindring som inntrer mellom karbo-hydrat res ten i den resulterende N-glykosylerte variant-DNase I og aktin, kan redusere eller forhindre'aktinbinding og derav.

følgende inhibering av den DNase I-DNA-hydrolytiske aktivitet, sammenlignet med nativ human-DNase I. Noen illustrerende eksempler på slike mutasjoner for å innføre et nytt glykosyleringssete, er som følger: H44N, D58S, D58T, H64N:V66T, H64N:V66S, V67N:E69S, V67N:E69T.

I sammenheng med slike mutasjoner for å danne et nytt glykosyleringssete kan eventuelt det naturlig forekommende glykosyleringssete i 18- og/eller 106-stilling i den native human-DNase I-aminosyresekvens deleres, avhengig av glykosyl-eringsomfanget som er ønsket i den aktinresistente variant.

Ved en ytterligere utførelsesform av denne oppfinnelsen brukes seterettet mutagenese for å innføre rester i eller like ved (dvs. innenfor ca. 5 aminosyrerester fra) de aminosyrerestene i nativ human-DNase I som er involvert i aktinbinding, og som er egnet for posttranslasjonell modifikasjon, enten biologisk eller kjemisk (se nedenunder). Means et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971) ; Glazer et al., Chemical Modification of Protéins: Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975) ; Creighton, Proteins, side 70-87 (W.H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991) . Slike posttranslasjonelle modifikasjoner kan innføre sterisk hindring eller endrede elektrostatiske egenskaper i DNase I som vil redusere eller forhindre aktinbinding og etterfølgende inhibering av DNA-hydrolytisk aktivitet, sammenlignet med nativ human-DNase I. F.eks. kan en cysteinrest innføres i eller like ved en rest i nativ human-DNase I som er involvert i aktinbinding. Den frie tiol i cysteinresten kan danne en intermolekylær disulfidbinding med en annen slik DNase I-variant for å danne en DNase I-dimer, eller kan f.eks. modifiseres med et tiolspesifikt alkyleringsmiddel. Noen illustrerende eksempler på slike mutasjoner er som følger: H44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E69C, A114C.

For lettvinthets skyld lages vanligvis substitu-sjoner, innføyelser og/eller delesjoner i aminosyresekvensen-til nativ human-DNase I ved å innføre mutasjoner i den tilsvarende nukleotidsekvens i den DNA som koder for nativ human-DNase I, f.eks. ved seterettet mutagenese. Ekspresjon av den-muterte DNA resulterer så i fremstilling av variant human-DNase I som har den ønskede (ikke-native) aminosyresekvens.

Selv om hvilken som helst teknikk som er kjent innen fagområdet, kan anvendes til å utføre seterettet mutagenese, f.eks. som beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), er oligonukleotidrettet mutagenese den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av human-DNase I-variantene ifølge denne oppfinnelse. Denne fremgangsmåten som er godt kjent innen fagområdet (Zoller et al., Meth. Enz. 100:4668-500 (1983); Zoller et al., Meth. Enz. 154:329-350

(1987); Carter, Meth. Enz. 154:382-403 (1987); Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987); Horwitz et al., Meth. Enz. 185:599-611 (1990)), er særlig egnet for å lage substitusjons-varianter, selv om den også kan anvendes til å fremstille delesjons- og innføyelsesvarianter på en lettvint måte. Ved den seterettede mutageneseteknikk gjøres det vanligvis bruk av en fagvektor som foreligger både i enkelttrådet og dobbelttrådet form. Typiske vektorer som kan anvendes i seterettet mutagenese, omfatter slike vektorer som M13-fagen, og plasmidvektorer som inneholder et enkelttrådet fagreplika-sjonsorigo (Messing et al., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1983); Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3-11 (1987); Short et al., Nuc. Acids Res. 16:7583-7600 (1988)). Replikasjon av disse vektorene i egnede vertsceller resulterer i syntesen av enkelttrådet DNA som kan brukes til seterettet mutagenese. Ved utførelse av seterettet mutagenese av DNA som koder for nativ human-DNase I (eller en variant derav) endres i korte trekk DNA-en ved først å hybridisere et oligonukleotid som koder for den ønskede mutasjon, til en enkelttråd i DNA-en. Etter hybridisering brukes en DNA-polymerase for å synte-tisere en hel andretråd, under anvendelse av det hybridiserte oligonukleotid som en primer, og ved anvende enkelttråden i DNA-en som et templat. Oligonukleotid som koder for den ønskede mutasjon, inkorporeres således i den resulterende dob-belt tråde te DNA. Oligonukleotider for anvendelse som hybridiserings-prober eller -primere kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst egnet fremgangsmåte, slik som ved rensing av en naturlig forekommende DNA, eller ved syntese in vitro. F.eks. syntetiseres oligonukleotider lett ved å anvende forskjellige tek-nikker innen organisk kjemi, slik som beskrevet av Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154:287-313 (1985) . Den generelle fremgangsmåte for utvelgelse av en egnet hybridiseringsprobe eller -primer er velkjent. Keller et al., DNA Probes, side 11-18 (Stockton Press, 1989). Vanligvis vil hybridiseringsproben eller -primeren inneholde 10-25 eller flere nukleotider, og vil omfatte minst 5 nukleotider på enten den ene eller andre siden av sekvensen som koder for den ønskede mutasjon, for å sikre at oligonukleotidet vil hybridisere fortrinnsvis i det ønskede sted til det enkelttrådede DNA-templatmolekyl. Seterettet mutagenese kan selvsagt brukes for å inn-føre multiple substitusjons-, innføyelses- eller delesjons-mutasjoner i en start-DNA. Dersom setene som skal muteres befinner seg nært opptil hverandre, kan mutasjonene innføres samtidig ved å anvende et enkelt oligonukleotid som koder for alle de ønskede mutasjonene. Dersom setene som skal muteres imidlertid befinner seg i en viss avstand fra hverandre (at-skilt med mer enn ca. 10 nukleotider), er det vanskeligere å frembringe et enkelt oligonukleotid som koder for alle de ønskede endringene. I stedet kan det anvendes én eller to alternative fremgangsmåter. Ved den første fremgangsmåten frembringes et separat oligonukleotid for hver ønsket mutasjon. 01igonukleotidene annealeres så til den enkelttrådede templat-DNA samtidig, og den andre tråden med DNA som syntetiseres fra templatet, vil kode for alle de ønskede aminosyresubstitusjonene. Den alternative fremgangsmåte omfatter to eller flere runder med mutagenese for å fremstille den ønskede variant. Den første runden er som beskrevet for innføring av en enkeltmutasjon. I den andre runden med mutagenese gjøres det bruk av den muterte DNA fremstilt i den første runden med mutagenese, som templat. Dette templatet inneholder således .allerede én eller flere mutasjoner. 01igonukleotidet som koder for den eller de ytterligere, ønskede arainosyresubstitu-sj onen (e), annealerer så til dette templatet, og den resulterende DNA-tråd koder nå for mutasjoner fra både den første og andre runden med mutagenese. Denne resulterende DNA kan brukes som et templat i en tredje runde med mutagenese, osv. PCR-mutagenese (Higuchi, i PCR Protocols, side 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)) er også egnet for å lage variantene av human-DNase. I. Når små mengder templat-DNA anvendes som ut-gangsmateriale i en PCR, kan i korte trekk primere som atskiller seg' litt i sekvens fra det tilsvarende område i~ templat-DNA, anvendes til å frembringe forholdsvis store mengder av et bestemt DNA-fragment som atskiller seg fra templatsekvensen bare i stillingene hvor primerne atskiller seg fra templatet. F.eks. for innføring av en mutasjon i en plasmid-DNA, omfatter sekvensen til én av primerne den ønskede mutasjon og er utformet for å hybridisere til én tråd i plasmid-DNA-en i mutasjonsstillingen; sekvensen til den andre primeren må være identisk med en nukleotidsekvens i den mot-satte tråd i plasmid-DNA-en, men denne sekvensen kan befinne seg hvor som helst langs plasmid-DNA-en. Det er imidlertid foretrukket at sekvensen til den andre primeren befinner seg innenfor 200 nukleotider fra sekvensen til den første, slik at hele det amplifiserte DNA-område bundet av primerne, lett kan sekvenseres til sist. PCR-amplifikasjon under anvendelse av et slikt primerpar som det ene som nettopp er beskrevet, resulterer i en populasjon av DNA-fragmenter som atskiller seg i stillingen til mutasjonen angitt ved hjelp av primeren, og eventuelt i andre stillinger, ettersom templatkopiering er noe tilbøyelig til å være .beheftet med feil. Wagner et al., i PCR Topics, side 69-71 (Springer-Veriag, 1991). Dersom forholdet mellom templat- og produktamplifis-ert DNA er svært lavt, inkorporerer flesteparten av produkt-DNA-fragmentene den eller de ønskede mutasjon(er). Denne prod-ukt-DNA brukes til å erstatte det tilsvarende område i plasmidet som tjente som PCR-templat, under anvendelse av standard fremgangsmåter med rekombinant DNA..Mutasjoner i separate stillinger kan innføres samtidig ved enten å anvende en mutant andreprimer, eller ved å utføre en andre PCR med forskjellige mutantprimere og ligere de to resulterende PCR-fragmentene samtidig til plasmidfragmentet i en tredelt (eller mer) ligering. En annen fremgangsmåte for fremstilling av varianter, kassettmutagenese, er basert på teknikken beskrevet av Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985). Utgangsmaterialet er plasmidet (eller annen vektor) som omfatter DNA-sekvensen som skal muteres. Kodonet eller kodonene i utgangs-DNA-en som skal muteres, identifiseres. Det må være et unikt restriksjonsen-donukleasesete på hver side av det eller de identifiserte mutasjonssete(r). Dersom det ikke foreligger noen slike restriksjonsseter, kan de frembringes ved å anvende den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for oligonukleotidformidlet mutagenese for å innføre dem på passende steder i DNA-en. Plasmid-DNA-en kuttes i disse setene for å linearisere den. Et dobbelttrådet oligonukleotid som koder for sekvensen til DNA-en mellom restriksjonssetene, men som inneholder den eller de ønskede mutasjon(er), syntetiseres ved å anvende standardfremgangs-måter, idet de. to trådene i oligonukleotidet syntetiseres hver for seg og så hybridiseres sammen under anvendelse av stand-ardteknikker. Dette dobbelttrådete oligonukleotid henvises til som kassetten. Denne kassetten utformes slik at den har 5'- og 3<1->ender som er kompatible med endene til det lineariserte plasmid, slik at den kan ligeres direkte til plasmidet. Det resulterende plasmid inneholder den muterte DNA-sekvens. Tilstedeværelsen av mutasjon(er) i en DNA bestemmes ved hjelp av fremgangsmåter som er godt kjent innen teknikken, inkludert restriksjonskartlegging og/eller DNA-sekvensering. En foretrukket fremgangsmåte for DNA-sekvensering er dideok-sykjedetermineringsmetoden til Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 72:3918-3921 (1979). DNA som koder for en human-DNase I-variant, innføyes i en replikerbar vektor for videre kloning eller ekspresjon. "Vektorer" er plasmider og andre DNA-er som er i stand til å replikere i en vertscelle, og som sådan, kan anvendes til å utføre to funksjoner sammen med kompatible vertsceller (et vektor-vert-system). Én funksjon er å lette kloningen av nukleinsyren som koder for en human-DNase I-variant, dvs. å fremstille anvendbare mengder av nukleinsyren. Den andre funksjonen er å styre ekspresjonen av en human-DNase I-variant. Én av eller begge disse funksjonene utføres av vektoren i den bestemte vertscelle som brukes for kloning eller ekspresjon. Vektorene vil inneholde forskjellige komponenter avhengig av funksjonen som de skal utføre. For å fremstille en human-DNase I-variant, vil en ekspresjonsvektor omfatte DNA som koder for varianten, som beskrevet ovenfor, operativt bundet til en promoter og et ribosombindende sete. Varianten uttrykkes så direkte i rekom-binantcellekultur, eller som en fusjon med et heterologt polypeptid, fortrinnsvis en signalsekvens eller et annet polypeptid som har et spesifikt spaltingssete i sammenknytningen mellom det heterologe polypeptid og human-DNase I-varianten. Prokaryoter (f.eks. E. coli, og andre bakterier) er de foretrukne vertsceller for de innledende kloningstrinn ifølge denne oppfinnelsen. De er særlig nyttige for hurtig fremstilling av store mengder av DNA, for fremstilling av enkelttrådede DNA-templater som brukes til seterettet mutagenese, og for DNA-sekvensering av variantene som frembringes. Prokaryote vertsceller kan også brukes til ekspresjon av DNA som koder for en human-DNase I-variant. Polypeptider som fremstilles i prokaryote celler, vil vanligvis være ikke-glykosylerte. I tillegg kan human-DNase I-variantene ifølge denne oppfinnelsen uttrykkes i eukaryote vertsceller, inkludert eukaryote mikrober (f.eks. gjær) eller celler avledet fra et dyre eller annen flercellet organisme (f.eks. ovarieceller fra kinesisk hamster og andre pattedyrceller), eller i levende dyr (f.eks. kuer, geiter, sauer). Klonings- og ekspresjonsmetoder er velkjente innen teknikken. Eksempler på prokaryote og eukaryote vertsceller, og på ekspresjonsvektorer, som er egnet for anvendelse for fremstilling av human-DNase I-variantene ifølge foreliggende oppfinnelse, er f.eks. de som er beskrevet i Shak, PCT patentsøknad nr. WO 90/07572 (publisert 12. juli 1990). Dersom prokaryote celler eller celler som inneholder vesentlige celleveggkonstruksjoner brukes som verter, er de foretrukne fremgangsmåter for transfeksjon av cellene med DNA, kalsiumbehandlingsmetoden beskrevet av Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 69:2110-2114 (1972), eller polyetylenglykol-metoden til Chung et al., Nuc. Aclds. Res. 16:3580 (1988). Dersom gjær anvendes som vert, utføres transfeksjon generelt under anvendelse av polyetylenglykol, slik som angitt av Hin-nen, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75:1929-1933 (1978). Dersom pattedyrceller anvendes som vertsceller, utføres transfeksjon generelt ved hjelp av kalsiumfosfatutfellingsmetoden, Graham et al., Virology 52:546 (1978), Gorman et al., DNA og Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990). Andre kjente fremgangsmåter for Innføring av DNA i prokaryote og eukaryote celler, slik som kjerneinjeksjon, elektroporasjon eller protoplastfusjon, er imidlertid også egnet for anvendelse ved denne oppfinnelse. Særlig nyttig ved denne oppfinnelse er ekspresjonsvektorer som sørger for forbigående ekspresjon i pattedyrceller av DNA som koder for human-DNase I-varianter. Generelt involverer forbigående ekspresjon bruken av en ekspresjonsvektor som er i stand til å bli replikert effektivt i en vertscelle slik at vertscellen akkumulerer mange kopier av ekspresjonsvektoren og igjen syntetiserer høye nivåer av et ønsket polypeptid som kodes for av ekspresjonsvektoren. Transiente ekspresjonssystemer som omfatter en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle, muliggjør lettvint positiv identifi-kasjon av polypeptider kodet for av klonede DNA-er, samt for den hurtige screening av slike polypeptider med hensyn på ønskede biologiske eller fysiologiske egenskaper. Wong et al., Science 228:810-815 (1985); Lee et al., Proe. Nat Acad. Sei. USA 82: 4360-4364 (1985); Yang et al., Cell 47:3-10 (1986). Transiente ekspresjonssystemer brukes således passende for å uttrykke den DNA som koder for aminosyresekvensvarianter av naturlig forekommende human-DNase I, sammen med analyser for å identifisere de variantene som binder aktin med lavere affinitet enn det naturlig forekommende human-DNase I gjør, samt analyser for å måle de variantene med DNA-hydrolytisk aktivitet . En human-DNase I-variant utskilles fortrinnsvis fra vertscellen hvor den uttrykkes, i hvilket tilfelle varianten utvinnes fra dyrkningsmediet hvor vertscellene dyrkes. I det tilfelle kan det være ønskelig å dyrke cellene i et serumfritt dyrkningsmedium, ettersom fraværet av serumproteiner og andre serumkomponenter i mediet kan lette rensing av varianten. Dersom den ikke utskilles, så utvinnes human-DNase I-varianten fra lysater av vertscellene. Når varianten uttrykkes i en annen vertscelle enn en av human opprinnelse, vil varianten være fullstendig fri for proteiner av human opprinnelse. I alle tilfeller vil det være nødvendig å rense varianten fra rekombinante celleproteiner for å oppnå i det vesentlige homogene preparater av human-DNase I-varianten. For terapeutiske anvendelser vil den rensede variant fortrinnsvis være mer enn 99% ren (dvs. alle andre proteiner vil utgjøre mindre enn 1% av totalproteinet i det rensede preparat). Rensing av en human-DNase I-variant utføres generelt ved å dra fordel av de forskjellige fysikalsk-kjemiske egen-skapene til varianten sammenlignet med forurensningene som den kan være forbundet med. F.eks. sentrifugeres, som et første trinn, dyrkningsmediet eller vertscellelysatet for å fjerne partikkelformede cellerester. Human-DNase I-varianten renses deretter fra forurensende, oppløselige proteiner og polypeptider f.eks. ved hjelp av ammoniumsulfat- eller etanolutfel-ling, gelfiltrering (molekylær utelukkelseskromatografi), ionebytterkromatografi, hydrofob kromatografi, immunoaffini-tetskromatografi (f.eks.under anvendelse av en kolonne som omfatter anti-human-DNase I-antistoffer koblet til Sepharose), tentakkelkationbytterkromatografi (Frenz et al., PCT patent-søknad nr. WO 93/25670, publisert 23 desember 1993), revers-fase-HPLC og/eller gelelektroforese. Fagfolk innen teknikken vil selvsagt forstå at rensingsmetodene som anvendes for naturlig forekommende human-DNase I, kan kreve en viss modifikasjon for å kunne anvendes ved rensing av en human-DNase I-variant, for å bøte på struk-turelle og andre forskjeller mellom de naturlig forekommende protein og variantproteinene. F.eks. kan i noen vertsceller (spesielt bakterlevertsceller) kan human-DNase I-varianten først uttrykkes i en uoppløselig, aggregert form (henvist til innen teknikken som "refraktile legemer" eller "inklusjons-legemer"), i hvilket tilfelle det vil være nødvendig å opp-løseliggjøre og renaturere human-DNase I-varianten i løpet av dens rensing. Fremgangsmåter for oppløseliggjøring og renatur-ering av refraktile legemer av rekombinant protein er kjent innen teknikken (se f.eks. Builder et al., U.S. patentskrift nr. 4.511.502). Ved en annen utførelsesform av denne oppfinnelsen fremstilles human-DNase I-varianter ved å lage kovalente modifikasjoner direkte i et naturlig forekommende eller variant human-DNase I-protein. Slike modifikasjoner lages for å påvirke aktihbindende eller annen egenskap hos proteinet (f.eks. stabilitet, biologisk halveringstid, immunogenisitet), og kan lages i stedet for eller i tillegg til aminosyresekvenssub-stitusjons-, -innføyelses- og -delesjonsmutasjonene beskrevet ovenfor. Kovalente modifikasjoner kan innføres ved å omsette målrettede aminosyrerester i den naturlig forekommende eller variant human-DNase I med et organisk derivatiseringsmiddel som er i stand til å reagere med utvalgte aminosyresidekjeder eller N- eller C-terminale rester. Egnede derivatiseringsmid-ler og fremgangsmåter er godt kjent innen teknikken. F.eks. omsettes cysteinylrester vanligvis med a-halo-genacetater (og tilsvarende aminer), slik som kloreddiksyre eller kloracetamid, hvorved man får karboksymetyl- eller kar-boksyamidometylderivater. Cysteinylrester derivatiseres også ved omsetning med bromtrifluoraceton, a-brom-p-(5-imidozoyl)-propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmaleimider, 3-nitro-2-pyridyldisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuri-benzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol. Histidylrester derivatiseres ved omsetning med di-etylpyrokarbonat ved pH 5,5-7,0 ettersom dette midlet er forholdsvis spesifikt for histidylsidekjeden. Parabromfenacyl-bromid kan også anvendes; omsetningen utføres fortrinnsvis i 0,1 M natriumkakodylat ved pH 6,0. Lysinyl- og aminoterminale rester omsettes med rav-syre- eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midlene har den effekt at den reverserer ladningen til lysinylrestéhe. Andre egnede reagenser for derivatisering av a-aminoholdige rester,., omfatter imidoestere, slik som metyl-pikolinimidat og pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og transaminase-katalysert omsetning med glyoksylat. Arginylrester modifiseres ved omsetning med ett eller flere vanlige reagenser, blant dem fenylglyoksal, 2,3-butan-dion, 1,2-sykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av ar-gininrester krever at omsetningen utføres under alkaliske betingelser på grunn av den høye pKa til den funksjonelle guani-dingruppen. Dessuten kan disse reagensene reagere med lysin-gruppene samt epsilon-aminogruppen i arginin. Karboksylsidegrupper (aspartyl og glutamyl) modifiseres selektivt ved omsetning med karbodiimider (R'-N=C=N-R') hvor R og R<1> er forskjellige alkylgrupper, slik som 1-syklo-heksyl-3-(2-morfolinyl-4-etyl)karbodiimid eller l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Dessuten omdannes aspartyl- og glutamylrester til asparaginyl- og glutaminylrester ved omsetning med ammoniumioner. Kovalent kobling av glykosider til aminosyrerester i proteinet kan anvendes til å modifisere eller øke antallet av eller profilen til karbohydratsubstituenter, spesielt i eller like ved de restene som er involvert i aktinbinding. Avhengig av den anvendte koblingsmåte kan sukkeret eller sukkerne bindes til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydrylgrupper, slik som de i cystein, (d) frie hydroksylgrupper, slik som de i serin, treonin, eller hydrok-syprolin, (e) aromatiske rester, slik som de i fenylalanin, tyrosin, eller tryptofan, eller (f) amidgruppen i glutamin. Egnede fremgangsmåter er beskrevet f.eks. i PCT patentpublikasjon nr. WO 87/05330 (publisert 11. september 1987), og i Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., side 259-306 (1981). Den kovalente binding av midler, slik som polyetylenglykol (PEG) eller humanserumalbumin, til human-DNase I-varianter kan redusere immunogenisitet og/eller toksisitet til varianten og/eller forlenge dens halveringstid, slik det er blitt observert med andre proteiner. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Poznansky et al., FEBS Let-ters 239:18-22 (1988); Goodson et al., Biotechnology 8:343-346

(1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Poly-ethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992). I tillegg kan modifikasjon av naturlig forekommende human-DNase I eller en variant derav ved hjelp av disse midlene i eller like ved (dvs. innenfor ca. fem aminosyrerester fra) en aminosyrerest som påvirker aktinbinding, resultere i en aktinresistent variant.

Ved en ytterligere utførelsesform kan en human-DNase

I aktinresistent variant omfatte en mutasjon i Asn-resten som inntrer i 74-stilling i den naturlig forekommende human-DNase I-aminosyresekvens (f.eks. en N74D-, N74K- eller N74S-mutasjon), for å redusere eller forhindre deamideringen av DNase I-varianten.. Frenz et al., PCT patentpublikasjon nr. WO 93/25670, publisert 23. desember 1993. Som et annet eksempel kan en human-DNase I-aktinresistent variant omfatte en amino-syresekvensmutasjon eller annen kovalent modifikasjon som red-userer variantens ømfintlighet for nedbrytning ved hjelp av proteaser (f.eks. nøytrofil elastase) som kan være til stede i spyttet og andre biologiske materialer.

Den DNA-hydrolytiske aktivitet og den aktinbindende affinitet til human-DNase I-variantene fremstilt som beskrevet ovenfor, bestemmes lett ved å anvende analyser og fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, og som er beskrevet her. Enhver slik variant som har DNA-hydrolytisk aktivitet og redusert bindingsaffinitet for aktin (som definert ovenfor), er en aktinresistent variant innenfor omfanget av denne oppfinnelsen.

De human-DNase I-aktinresistente varianter ifølge denne oppfinnelsen anvendes til å redusere viskoelastisiteten til DNA-holdig materiale, slik som spytt, slimhinne eller andre pulmonale sekresjoner. Slike varianter er særlig anvendbare til behandling av pasienter med pulmonal sykdom som har unormalt viskøse eller fortykkede sekresjoner, og slike tilstander som akutt eller kronisk bronkial pulmonal sykdom, inkludert infeksiøs lungebetennelse, bronkitt eller trakeo-bronkitt, bronkiektase, cystisk fibrose, astma, tuberkulose og soppinfeksjoner. For slike terapier dryppes en oppløsning eller et fint oppdelt tørrpreparat av den aktinresistente variant på passende måte i luftveiene, (f.eks. bronkiene) eller lungene til en pasient, f.eks< ved hjelp av trykkfor-

støvning.

De aktinresistente variantene kan også anvendes til hjelpebehandling av abscesser eller alvorlige innelukkede infeksjoner ved slike tilstander som empyem, meningitt, abscess, peritonitt, sinusitt, otitt, periodontitt, perikarditt, pankreatitt, kolelitiase, endokarditt og septisk artritt, samt ved topiske behandlinger ved flere forskjellige inflammator-iske og infiserte lesjoner, slik som infiserte lesjoner i huden og/eller slimhinnene, kirurgiske sår, sårlesjoner og forbrenninger. Den aktinresistente variant kan forbedre virk-ningsfullheten av antibiotika som brukes ved behandlingen av slike infeksjoner (f.eks. reduseres gentamicinaktivitet merk-bart ved reversibel binding til intakt DNA).

Naturlig forekommende human-DNase I og aktinresistente varianter derav kan også være nyttige for behandling av systemisk lupus erythematosus (SLE), en livstruende autoimmun-sykdom som er kjennetegnet ved produksjon av forskjellige autoantistoffer. DNA er en viktig antigenkomponent i immunkom-pleksene. I dette tilfelle kan human-DNase I (naturlig forekommende eller variant) gis systemisk, f.eks. ved intravenøs, subkutan, intratekal, eller intramuskulær administrering til den rammede pasient.

Naturlig forekommende human-DNase I og aktinresistente varianter derav kan også være nyttige til forhindring av nyutviklingen og/eller forverringen av infeksjoner i luftveiene, slik som kan inntre hos pasienter som har cystisk fibrose, kronisk bronkitt, astma, lungebetennelse eller annen pulmonal sykdom, eller hos pasienter som får hjelp av ventila-tor eller annen mekanisk anordning for å puste, eller andre pasienter med risiko for å utvikle infeksjoner i luftveiene, f.eks. pasienter som har gjennomgått kirurgisk behandling.

De aktinresistente variantene kan formuleres i henhold til kjente fremgangsmåter for å fremstille terapeutisk anvendbare preparater. Et foretrukket terapeutisk preparat er en oppløsning av en aktinresistent variant i en bufret eller ubufret, vandig oppløsning, og er fortrinnsvis en isoton salt-oppløsning slik som 150 mM natriumklorid inneholdende 1,0 mM kalsiumklorid ved pH 7. Disse oppløsningene er særlig tilpas-ningsdyktige for anvendelse i kommersielt tilgjengelige for-støvere, inkludert stråleforstøvere og ultralydforstøvere, som kan anvendes til administrering direkte i luftveiene eller lungene til en rammet pasient.

Ved en annen utførelsesform omfatter det terapeutiske preparat et tørt pulver av den aktinresistente variant, fortrinnsvis fremstilt ved sprøytetørking av en oppløsning av den aktinresistente variant, hovedsakelig som beskrevet i U.S patentsøknad nr. 08/206,020 (innlevert 4. mars 1994).

Ved en ytterligere utførelsesform omfatter det terapeutiske preparat celler som aktivt produserer en aktinresistent variant av human-DNase I. Slike celler kan innføres direkte i vevet til en pasient, eller kan innkapsles i porøse membraner som så implanteres i en pasient, og sørger i begge tilfeller for avleveringen av den aktinresistente variant til områder i kroppen til pasienten som trenger økte konsentrasjoner av DNA-hydrolytisk aktivitet. F.eks. kan pasientens egne celler transformeres, enten in vlvo eller ex vlvo, med DNA som koder for en aktinresistent variant av human-DNase I, og så brukes til å fremstille DNase I direkte i pasienten.

Den terapeutisk effektive mengde av en aktinresistent human-DNase I-variant vil f.eks. avhenge av mengden av DNA og aktin i materialet som skal behandles, de terapeutiske mål, administreringsveien og pasientens tilstand. Følgelig vil det være nødvendig for terapeuten å titrere doseringen og modifisere administreringsveien etter behov, for å oppnå den optimale terapeutiske effekt. På bakgrunn av dens reduserte bindingsaffinitet for aktin og derav følgende økte DNA-hydrolytiske aktivitet i nærvær av aktin i forhold til naturlig forekommende human-DNase I, kan mengden av en aktinresistent variant som er påkrevet for å oppnå en terapeutisk effekt, være mindre enn mengden av naturlig forekommende human-DNase I som er nødven-dig for å oppnå den samme effekt under de samme forhold. Generelt vil den terapeutisk effektive mengde av den aktinresistente variant være en dosering fra ca. 0,1 ug til ca. 5 mg av varianten pr. kilogram av pasientens kroppsvekt, administrert i farmasøytiske preparater som her beskrevet.

En aktinresistent DNase I-variant kombineres eventuelt med eller administreres sammen med ett eller flere andre farmakologiske midler som brukes til å behandle tilstandene angitt ovenfor, slik som antibiotika, bronkodilatorer, anti-inflammatoriske midler, mukolytika, (f.eks. n-acetylcystein), aktinbindende eller aktinspaltende proteiner (f.eks. gelsolin; Matsudaira et al., Cell 54:139-140 (1988); Stossel et al., PCT patentpublikasjon nr. WO 94/22465 (publisert 13. oktober 1994)), proteaseinhibitorer, eller genterapiprodukt (f.eks. omfattende genet for transmembrankonduktansregulator ved cystisk fibrose (CFTR), Riordan et al., Sience 245:1066-1073

(1989)).

EKSEMPEL 1

Mutagenese av human- DNase I

E. coli-stamme CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, California, USA) ble transformert med plasmid pRK.DNase.3 under anvendelse av metoden til Chung et al. (Nuc. Acids. Res. 16:3580 (1988)). Plasmidet pRK.DNase.3 som ble anvendt til å lage foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i PCT patentpublikasjon nr. WO 90/07572 (publisert 12. juli 1990), bortsett fra at nukleotidsekvensen som koder for human-DNase I, er som vist i figur 1. Transformerte celler ble platet ut på LB-agarplater inneholdende 50 ug/ml carbenicillin og dyrket over natten ved 37°C. 2YT-næringsvæske (5 ml) inneholdende 50 ug/ml carbenicillin og 10 pl VCSM13-hjelperfag (Stratagene, La Jolla, California, USA), ble inokulert med en individuell koloni fra agar-platen og dyrket over natten ved 37°C med risting. Enkelttrådet DNA blir isolert fra denne kulturen og brukt som templat for etterfølgende mutagenese.

Seterettet mutagenese ble utført ved å anvende syntetiske oligonukleotider i henhold til metoden til Kunkel et al. (Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987)). De mutagene oligonuk-leotidene var 21-merer eller 24-merer med enten 9 eller 12 nøyaktige basetilpasninger 5' i forhold til umakekodonet, og 9 nøyaktige basetilpasninger 31 i forhold til umakekodonet. Etter mutagenese ble enkelttrådet DNA fra individuelle kloner underkastet dideoksysekvensering (Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)). DNA med variantnukleotid-sekvenser ble så transformert som beskrevet ovenfor i E. coll-stamme XLI Blue MRF' (Stratagene). Etter utplating og enkelt-koloniisolering som tidligere, ble individuelle kolonier brukt til å inokulere 0,5 1 LB-næringsvæske inneholdende 50 ug/ml carbenicillin. Etter dyrking over natten med risting ved 37°C ble cellene innhøstet ved sentrifugering, og variant-DNA-en (i ekspresjonsvektoren) ble renset ved å anvende "Qiagen tip-500"r-kolonner (Qiagen Ine., Chatsworth, California, USA,).

Figurene 2-6 identifiserer de forskjellige human-DNase I-variantene som ble laget. I figurene og gjennom beskrivelsen er beskrivelsen av aminosyresubstitusjonsmuta-sjonen(e) som er til stede i en DNase I-variant, forkortet ved hjelp av en første alfabetisk bokstav, et tall og en andre alfabetisk bokstav. Den første alfabetiske bokstav er enbokstavforkortelsen til aminosyreresten i naturlig forekommende (vill-type) human, moden DNase I, tallet angir stillingen til resten i naturlig forekommende, moden humane-DNase I (nummer-ering som vist i figur 1), og den andre alfabetiske bokstav er enbokstavforkortelsen til aminosyreresten i den stillingen i variant-DNase I. I DNase I-varianten som har en D53R-mutasjon, er f.eks. asparaginsyreresten (D) i 53-stilling i naturlig

forekommende moden human-DNase I blitt erstattet med en argin-inrest (R). Flere mutasjoner i en enkeltvariant er betegnet på samme måte, med et kolon (:) som skiller hver av de forskjellige mutasjonene som er til stede i varianten. F.eks. angir betegnelsen D53R:Y65A at varianten har en D53R-mutasjon og en Y65A-mutasjon.

EKSEMPEL 2

Ekspresjon av human- DNase I- varianter

Humanembryonyre 293-celler (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) ble dyrket i serumholdig medium i 150 mm petriskåler av plast. Logfase-celler ble transient samtransfektert med 22,5 ug renset variant -DNA (fremstilt som beskrevet ovenfor) og 17 ug adenovirus-DNA under anvendelse av kalslumfosfatutfellingsmetoden (Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). Omtrent 16 timer etter transfeksjon ble cellene vasket med 15 ml fosfatbufret saltoppløsning, og mediet ble skiftet til serumfritt medium. To innhøstinger av cellekulturmediet ble tatt fra hver plate, den første enten etter 24 eller 72 timer og den siste 96 timer etter skiftingen til serumfritt medium. I alt omtrent 50 ml cellekultursupernatant inneholdende DNase I-varianten, ble erholdt på denne måte. Blandingen av kultur-supernatant samlet opp fra hver plate, ble konsentrert 5 til 50 ganger ved å anvende "Centriprep 10"-konsentratorer, og konsentratene ble analysert for å bestemme forskjellige biokjemiske og biologiske aktiviteter av DNase I-variantene.

Konsentrat inneholdende naturlig forekommende human-DNase I, ble fremstilt ved hjelp av den samme fremgangsmåte

som beskrevet ovenfor, bortsett fra at 293-cellene ble trans-fektert transient med plasmid pRK.DNase.3.

EKSEMPEL 3

Biokjemiske og biologiske aktiviteter av human- DNase I- varianter

I. Relativ spesifikk aktivitet

Den relative spesifikke aktivitet av DNase I-varianter ble fastslått ved å sammenligne aktiviteten til varianten med aktiviteten til naturlig forekommende human-DNase I i to forskjellige analyser. Nærmere bestemt er den relative spesifikke aktivitet til variantene definert som konsentrasjonen av varianten (i ug/ml) bestemt i en metylgrønt-aktivi-tetsanalyse (Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222:351-358

(1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)) dividert med konsentrasjonen av varianten (i ug/ml) bestemt i en DNase I-ELISA-analyse (beskrevet nedenunder). Både ved metyIgrønt-ak-tivi tetsanalysen og DNase I-ELISA-analysen ble standardkurvene bestemt ved é anvende "Pulmozyme" human-DNase I. Den relative spesifikke aktivitet av naturlig forekommende human-DNase I og varianter er vist i figurene 2.

Ved metylgrønt-aktivitetsanalysen (Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem.

29:41-53 (1950)) gjøres det bruk av metyIgrøntfargestoff som interkalerer omtrent hver tiende base i DNA-en, noe som resulterer et grønt stoff. Etter hvert som DNA-en spaltes ved hjelp av DNase I, frigjøres metyIgrøntfargestoffet og oksideres til en fargeløs form. Tapet av grønnfarge er således proporsjonalt med mengden av DNase I som tilsettes til analyseprøven.

Mengden av DNase I som er til stede i analysen, kvantifiseres så ved sammenligning med en standardkurve som fremstilles ved å analysere kjente mengder av DNase I.

DNase I-ELISA-analysen omfatter belegning av mikro-titerplater med et polyklonalt geite-anti-DNase I-antistoff, tilsetning av prøven som skal analyseres, og påvisning av eventuell resulterende bundet DNase I med et polyklonalt kanin-anti-DNase I-antistoff som er konjugert til pepperrot-peroksidase (HRP). Når HRP-substrat og fargefremkallingsreagens tilsettes, er fargen som fremkalles, proporsjonal med mengden av DNase I som er til stede i prøven. Mengden av DNase I som er til stede i analysen, kvantifiseres så ved sammenligning med en standardkurve som er fremstilt ved å analysere kjente mengder av DNase I.

Ved begge analysene ble flere fortynninger av prøvene analysert, og for de verdiene som falt innenfor midtområdet i standardkurven, ble det beregnet gjennomsnittsverdi og stan-dardavvik .

DNase I-konsentrasjonen som bestemt ved hjelp av DNase I-ELISA-analysen, ble også brukt til å standardisere DNase I-konsentrasjoner i andre analyser hvor DNase I-variantene ble karakterisert (f.eks. i analyser av inhibering ved hjelp av aktin, beskrevet nedenunder). II. Aktininhiberinq av DNase I- hvdrolvtisk aktivitet

G-aktin (Kabsch et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992)) ble fremstilt mindre enn 10 dager før bruk ved å dialysere over natten en 1 mg/ml oppløsning av et kommersielt tilgjengelig aktinpreparat (Sigma, St.Louis, Missouri, USA) mot 5 mM HEPES, pH 7,2, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM ATP, 0,5 mM p-merkaptoetanol ved 4°C. Etter sentrifuger ing ved 13.000 x g i 5 min. ble mengden av G-åktin kvantifisert ved å måle absorbansen ved 290 nm; en 1 mg/ml oppløsning har en absorbans på 0,66 OD. Mengden av G-aktinpreparat som er påkrevet for 1 det vesentlige (>50% inhibering), men ikke fullstendig, å inhibere den DNA-hydrolytiske aktivitet til naturlig forekommende human-DNase I, ble bestemt i preliminære forsøk under de samme betingelsene som ble brukt for hver analyse.

Sensitivitet overfor aktininhibering ble fastlagt ved å måle den DNA-hydrolytiske aktivitet til variantene i nærvær og fravær av aktin ved én av to forskjellige analyser, metyl-grøntanalysen som tidligere er beskrevet, og en hyperkromisitetsanalyse som er basert på økningen i absorbans ved 260 nm etter denaturering og depolymer i sering av DNA (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)). Den prosentvise inhibering av utvalgte varianter i disse analysene er vist i figurene 3 og 4.

Ved hyperkromisitetsanalysen ble konsentrerte kultur-supernatanter (fremstilt som beskrevet ovenfor, inneholdende DNase I-varianter) inkubert enten uten noe tilsatt eller med et 2 til 3 gangers molart overskudd av aktin i buffer A (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 0,1% BSA) i én time ved romtemperatur før de ble tilsatt en kyvette inneholdende 40 ug DNA i et totalt analysevolum på 1,0 ml. Sluttkonsentrasjonen av DNase I-varianten i analysen var omtrent 26 nM, som bestemt ved hjelp av DNase I-ELISA-analyse. Gradene av DNA-hydrolyse ved hjelp av DNase I-variantene i nærvær og fravær av aktin ble målt. Den prosentvise aktivitet vist i figurene 3 og 4, ble beregnet ved å bestemme forholdet mellom den DNA-hydrolytiske aktivitet av human-DNase I (naturlig forekommende eller variant) i nærvær av aktin, og dens DNA-hydrolytiske aktivitet i fravær av aktin, og multiplisere med 100.

Ved metylgrøntanalysen ble konsentrerte kultursuper-natanter (fremstilt som beskrevet ovenfor, inneholdende DNase I-varianter) inkubert enten uten noe tilsatt aktin eller med et 1000 ganger molart overskudd av aktin i buffer B (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 0,1% BSA, 0,01% timero-sal og 0,05% "Tween 20") ved 37°C i 16 timer. Konsentrasjonen av aktivt enzym i hvert tilfelle ble beregnet ved sammenligning med standardkurven for "Pulmozyme". "Den prosentvise aktivitet" som er tilbake i varianten, henviser til 100 ganger forholdet mellom aktiviteten i nærvær av aktin og aktiviteten i fravær av aktin.

Som vist i figurene 3 og 4, reduseres den DNA-hydrolytiske aktivitet til naturlig forekommende human-DNase ves-entlig i nærvær av aktin. Ved sammenligning er forskjellige enkelt- og multippelrestvarianter av naturlig forekommende human-DNase forholdsvis resistente overfor inhibering ved hjelp av aktin, som indikert ved at de har større DNA-hydrolytisk aktivitet i nærvær av aktin enn naturlig forekommende human-DNase I.

III. Aktinbindinas- ELISA

En mikrotiterbasert analyse ble utviklet for å måle bindingen av naturlig forekommende human-DNase I og DNase I-varianter til immobilisert aktin. Først ble brønnene i en "MaxiSorp"-plate (Nunc, Inc., Naperville, Illinois, USA) be-lagt med 100 ul pr. brønn av human-GC-globulin (Calbiochem, La Jolla, California, USA), et aktinbindende protein (Gold-schmidt-Clermont et al, Biochem, J. 228:471-477 (1985), McLeod et al., J. Biol. Chem. 264:1260-1267 (1989), Houmeida et al., Eur. J. Biochem. 203:499-503 (1992)), ved en konsentrasjon på 10 ug/ml i 25 mM HEPES, 4 mM MgCl2, 4 mM Cacl2, pH 7,2, ved 4°C i 16-24 timer. Etter å ha kassert GC-globulinet, ble overskudd av reaktive seter blokkert ved tilsetning av 200 ul pr. brønn av buffer C (buffer C er den samme som buffer B, ovenfor, med tilsetning av 0,5 mM adenosintrifosfat; buffer C ble brukt som analysefortynningsmidlet i alle etterfølgende trinn, med mindre annet er angitt), og platen ble inkubert på et risteap-parat i 1-2 timer ved romtemperatur. Hvert inkubasjonstrinn som følger, ble utført ved romtemperatur i 1 time på et "Mini Orbital"-risteapparat (Bellco Biotechnology, Vineland, New Jersey, USA); mellom hvert av trinnene ble platen tømt og vasket 6 ganger med fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,05% "Tween 20" med en "Microwash II"-platevasker (Skatron A/S, Norge). Deretter ble G-aktin, fremstilt som beskrevet ovenfor, fortynnet til 50 ug/ml i buffer C og 100 ul ble tilsatt til hver brønn; platene ble inkubert og vasket, og 100 ul av forskjellige fortynninger av "Pulmozyme" og celledyrknings-medium inneholdende enten aktiv human-DNase I eller varianter derav, ble tilsatt til brønnene og platene ble inkubert og vasket. Til sist ble 100 ul av en 1/25.000 fortynning av et polyklonalt anti-human-DNase I-kanin-antistoff-pepperrotperok-sidase-konjugat (opprinnelig standardkonsentrasjon var 465 ug/ml) tilsatt til hver brønn. Etter inkubasjon og vasking ble fargefremkalling startet opp ved tilsetning av 100 ul pr. brønn med fargefremkallingsreagens (Sigma Fast o-fenylendiamin og urea/H202-tabletter oppløseliggjort i henhold til produsen-tens, anbefaling) og stanset ved tilsetning av 100 ul pr. brønn 4,5 N H2S04. Absorbansen ved 492 nm ble målt og plottet mot konsentrasjonen av DNase I som opprinnelig ble tilsatt til brønnen. Man fikk S-formede kurver for naturlig forekommende human-DNase I og de variantene som ble bundet til aktin; disse kurvene ble tilpasset en fire-parameters ligning ved ikke-lineær regresjonsanalyse (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:431-441 (1963)). Konsentrasjonen av hver DNase I (naturlig forekommende variant) som var påkrevet for å gi et halv-maksimalt signal i analysen, ble beregnet ut fra kurvene og er henvist til som EC50-verdien. Molekylvekten til naturlig forekommende human-DNase I og variantene ble antatt å være 37.000 dalton.

Den relative bindingsaffinitet til hver human-DNase I-variant ble beregnet ved å dividere EC50-verdien til varianten med EC50-verdien til naturlig forekommende human-DNase I bestemt i ELISA-analysen, og resultatene er vist i figur 5. Som eksempel, dersom den relative bindingsaffinitet til human-DNase I-varianten ble beregnet til å være 5, ville denne verdien indikere at EC50-verdien til varianten er fem ganger større enn EC50-verdien til naturlig forekommende human-DNase, eller med andre ord, at varianten har en affinitet for aktin som er fem ganger mindre enn affiniteten til naturlig forekommende human-DNase I for aktin ved denne ELISA-analysen.

>

IV. Spvttkomprimerinasanalvser

En spyttkomprimeringsanalyse (PCT patentpublikasjon nr. WO 94/10567, publisert 11. mai 1994) ble brukt til å måle den relative viskoelastisitet til spytt fra pasienter med cystisk fibrose ("CF-spytt") før og etter inkubasjon med naturlig forekommende human-DNase I og forskjellige DNase I-varianter. Etter å ha blandet CF-spytt med en DNase I-prøve og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur, ble de halvfaste oppløsningene fylt i kapillarrør som så ble sentrifugert ved 12.000 rpm i 20 minutter. Etter sentrifugering ble pellethøyden målt og sammenlignet med høyden av oppløsningen pluss pellet. Disse målingene ble så brukt til å beregne den prosentvise komprimering av spyttet som korrelerer med viskoelastisiteten til spyttet.

Den prosentvise komprimering bestemt etter behandling av CF-spytt med naturlig forekommende human-DNase I og human DNase I-aktinresistente varianter, er vist i fig. 6. Disse resultatene indikerer at de human-DNase I-aktinresistente variantene er mer effektive enn naturlig forekommende human-DNase I når det gjelder å redusere viskoelastisiteten til CF-spytt, som bestemt ved hjelp av komprimeringsanalysen.

Claims (8)

1. Variant av human DNase I, karakterisert ved at den har DNA-hydrolytisk aktivitet og minst 90 % identitet med aminosyresekvensen til nativ DNase I som vist ifølge figur 1, der nevnte variant omfatter minst én aminosyresubstitusjon som er valgt fra gruppen som består av: E13A, E13H, E13R, E13W, E13Y, Y65W, E69K og E69R.

2. Variant ifølge krav 1, karakterisert ved at den har minst én aminosyresubstitusjon som er valgt fra gruppen som består av: E13A, E13H, E13R, E13Y, Y65W, E69K, E69R.

3. Variant ifølge krav 1, karakterisert ved at den har aminosyresubstitusjonen E69R.

4. Variant av human DNase I, karakterisert ved at den har DNA-hydrolytisk aktivitet, med minst 5 ganger mindre bindingsaffinitet til aktin sammenlignet med nativ DNase I og minst 90 % identitet med aminosyresekvensen til nativ DNase I som vist ifølge figur 1, der nevnte variant omfatter minst én aminosyresubstitusjon som er valgt fra gruppen som består av:H44A, D53A, D53K, D53R, D53Y, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, D53R:H44A, D53R:Y65A, D53R:E69R, D53R:Y65A:H44A og H44A:Y65A:E69R.

5. Variant ifølge krav 4, karakterisert ved at den har minst én av de følgende aminosyresubstitusjonene: H44A:D53R, D53R:E69R, D53R:Y65A, H44A:D53R:Y65A eller H44A:Y65A:E69R.

6. Variant ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at den omfatter en aminosyresekvens som har minst 95 % identitet med .aminosyresekvensen til nativ human DNase I som vist ifølge Figur 1.

7. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for en variant av human DNase I ifølge ethvert av kravene 1-6.

8. Preparat for reduksjon av viskoelastisiteten til pulmonale sekreter, karakterisert ved at det omfatter en variant av human DNase I ifølge ethvert av kravene 1-6, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel eksipiens.