PL180773B1 - Warianty ludzkiej DNazy I, izolowane kwasy nukleinowe oraz kompozycje farmaceutyczne - Google Patents

Abstract

1 Wariant ludzkiej DNazy i o zdolnosci hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolnosci wiazania aktyny niz zdolnosc wiazania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, znamienny tym, ze posiada sekwencje amonokwasowa identyczna w zakresie od 90% do 95% z sekwencja natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig 1, przy czym sekwencja ta rozni sie od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamiana jednego aminokwasu na inny tylko w jednej z pozycji sekwencji przedstawionej na fig 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub A la114 2 Wariant ludzkiej DNazy I o zdolnosci hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolnosci wiazania aktyny niz zdolnosc wiazania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, znamienny tym, ze posiada sekwencje aminokwasowa identyczna w zakresie od 90% do 95% z sekwencja natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig I, przy czym sekwencja ta rozni sie od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamiana jednego aminokwasu na inny w dwóch lub wiecej pozycjach sekwencji przedstawionej na fig 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub A la 114 3 Izolowany kwas nukleinowy kodujacy wariant ludzkiej DNazy I posiadajacy sekwencje nukleotydowa kodujaca wariant ludzkiej DNazy I o zdolnosci hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolnosci wiazania aktyny niz zdolnosc wiazania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, zna- mienny tym, ze posiada sekwencje nukleotydowa kodujaca sekwencie aminokwasowa identyczna w zakresie od 90% do 95% z sekwencja natywnej ludzkiej DNazy 1 przedstawionej na fig 1, przy czym sekwencja ta rózni sie od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamiana jednego aminokwasu na inny tylko w jednej z pozycji sekwencji przedstawionej na fig 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub A la 114 4 Izolowany kwas nukleinowy kodujacy wariant ludzkiej DNazy I posiadajacy sekwencje nukleotydowa kodujaca wariant ludzkiej DNazy I o zdolnosci hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolnosci wiazania aktyny niz zdolnosc wiazania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, zna- mienny tym, ze posiada sekwencje nukleotydowa kodujaca sekwencje aminokwasowa identyczna w zakresie od 90% do 95% z sekwencja natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig 1, przy czym sekwencja ta rózni sie od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamiana jednego aminokwasu na inny w dwóch lub wiecej pozycjach sekwencji przedstawionej na fig 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Gtu69 lub A la114 5 Kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów chorych na choroby lub zaburzenia pracy pluc zawierajaca czynnik aktywny oraz fannaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienna tym , ze jako czynnik aktywny zawiera wariant ludzkiej DNazy I o zdolnosci hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolnosci wiazania aktyny niz zdolnosc wiazania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, charakteryzujaca sie tym, ze posiada sekwencje aminok- wasowa identyczna w zakresie od 90% do 95% z sekwencja natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig 1, przy czym sekwencja ta rózni sie od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamiana jednego aminokwasu na inny tylko w jednej z pozycji sekwencji przedstawionej na fig 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub A la 114 8 Kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów chorych na choroby lub zaburzenia pracy pluc zawierajaca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienna tym , ze jako czynnik aktywny zawiera wariant ludzkiej DNazy I o zdolnosci hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 1 00 krotnie mniejszej zdolnosci wiazania aktyny niz zdolnosc wiazania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, charakteryzujaca sie tym, ze posiada sekwencje aminok- w a s o w a identyczna w zakresie od 90% do 95% z sekwencja natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig 1, przy czym sekwencja ta rózni sie od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zam i ana jednego aminokwasu na inny w dwóch lub wiecej pozycjach sekwencji przedstawionej na fig 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Gtu69 lub A la114 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest ludzka deoksyrybonukleaza 1 (DNaza 1), fosfodiesteraza, która jest zdolna do hydrolizy kwasów polideoksyrybonukleinowych. Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana forma (wariant) ludzkiej DNazy I i jej wytwarzanie metodami rekombinacji DNA, kompozycje farmaceutyczne, w których własności DNazy I mogą być wykorzystane klinicznie oraz sposoby użycia DNazy I i jej preparatów wytworzonych sposobem według wynalazku.

DNaza I jest fosfodiesterazą zdolną do hydrolizy kwasów polideoksyrybonukleinowych. DNazę I oczyszczono z różnych źródeł w różnym stopniu czystości.

Bydlęca DNaza I była intensywnie badana biochemicznie. Patrz na przykład, Moore, w The Enzymes (Boyer, P., ed.), pp. 281 -296, Academic press, New York (1981). Znana jest kompletna sekwencja aminokwasowa bydlęcej DNazy I (Liao i wsp., J. Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefner i wsp., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986); Lahm i wsp., J. Mol. Biol. 221:645-667 (1991). Został także sklonowany i poddany ekspresji DNA kodujący bydlęcąDNazę I (Worral i wsp., J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Metodą krystalografii za pomocą promieni X określono także strukturę bydlęcej DNazy I. Suck i wsp., EMBO J. 3:2423-2430 (1984); Suck i wsp., Naturę 321:620-625 (1986); Oefner i wsp., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986).

DNA kodujący ludzką DNazę I został także wyizolowany i zsekwencjonowany. DNA ludzkiej DNazy I został poddany ekspresji w zrekombinowanych komórkach gospodarza, co umożliwia wytwarzanie ludzkiej DNazy I w odpowiednich ilościach. Shak i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990). ’

DNaza I ma kilka znanych własności i była używana w celach terapeutycznych. Jej głównym zastosowaniem terapeutycznym jest zmniejszenie lepkosprężystości wydzielin płucnych (śluzu) w przebiegu takich chorób jak zapalenie płuc i mukowiscydoza (CF), w ten sposób pomaga oczyszczaniu się dróg oddechowych. Patrz na przykład: Lourenco i wsp., Arch. Intern. Med. 142:2299-2308(1982); Shaki wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Hubbardi wsp., New Engl. J. Med. 326:812-815 (1992); Fuchs i wsp., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Bryson i wsp., Drugs 48:894-906 (1994). Sluzbierze także udział w chorobowości chronicznego zapalenia oskrzeli, astmatycznego zapalenia oskrzeli, rozstrzenia oskrzelowego, rozedmy płuc, ostrego i chronicznego zapalenia zatok, a nawet popularnego przeziębienia.

Wydzielmy płucne osób chorych na tę choroby sąmateriałem złożonym, który zawiera ghkoproteiny śluzowe, mukopolisacharydy, proteazy, aktynę i DNA. Niektóre składniki wydzielin płucnych uwalniane są przez leukocyty (neutrofile), które przechodzą do tkanek płucnych w odpowiedzi na obecność bakterii (na przykład, szczepów bakterii z rodzaju Pseudomonas, Pseudococcus czy Staphylococcus) lub innych czynników drażniących (na przykład, dym papierosowy, pyłek). W czasie oddziaływania z takimi bakteriami i czynnikami drażniącymi leukocyty mogą degenerować i uwalniać swoją zawartość, która zwiększa lepkoelastyczność wydzielin płucnych.

180 773

Zdolność DNazy I do zmniejszania lepkoelastyczności wydzielin płucnych przypisuje się enzymatycznej degradacji dużych ilości DNA uwalnianych przez neutrofile. Shak i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Aitken i wsp., J. Am. Med. Assoc. 267:1947-1951(1992).

Ostatnio zaproponowano inny mechanizm mukolitycznego działania DNazy I polegający na rozkładzie aktyny. Vasconellos i wsp., Science 263:969-971 (1994). Aktyna jest jednym z białek występujących w największej ilości w komórkach eukariotycznych (na przykład, aktyna stanowi około 10% całkowitego białka limfocytów i jest bardzo intensywnie badana. Kabsch i wsp., Ann. Rev., Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1991); Sheterline. I wsp., Prot. Profile 1:1-121 (1994). Aktyna występuje w dwóch formach, formie monomerycznej (aktyna-G) i formie włókienkowej (aktyna F), która tworzy się z monomerów aktyny G. Pohmeryczne filamenty aktyny charakteryzują się wysoką lepkoelastycznością i w dużym stopniu decydują o lepkoelastyczności wydzielin płucnych. Momet i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:3680-3684 (1984); Newman i wsp., Biochemistry 24:1538-1544 (1985); Janmey i wsp., Biochemistry 27:8218-8226 (1988); Vasconcellos i wsp., Science 263:969-871 (1994).

Ponieważ wiadomo, że DNaza I wiąże się z aktyną(Lazandes i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Kabsch i wsp., Naturę 347:37-44 (1990)) i może rozkładać filamenty aktyny (a także hamuje polimeryzację aktyny G w filamenty) (Manherz i wsp., FEBS Lett. 60:34-38 (1975); Hitchcock i wsp., Celi 7:531-542 (1976); Pinder i wsp., Biochemistry 21:4886-4890 (1982); Weber i wsp., Biochemistry 33:4780-4786 (1994)), uważa się, że mukohtyczne działanie DNazy I na plwocinę i inne wydzieliny płucne wynika raczej z rozkładu (depolimeryzacji) aktyny niż z hydrolizy DNA. Vasconcellos i wsp., Science 263:969-971 (1994). Zgodnie z tym poglądem wiadomo, że w obecności aktyny zahamowana jest zdolność hydrolizy DNA DNazy I. Lazarides i wsp., Proc.Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Mannherz i wsp., Eur. J. Blochem. 104:367-379 (1980). Zgodnie z tym poglądem, stwierdzono, że białka przecinające aktynę (na przykład, gelsolin) wydajnie zmniejszająlepkoelastyczność plwociny w przebiegu mukowiscydozy. Vasconcellos i wsp., Science 263:969-971 (1994); Stoessel i wsp., publikacja opisu patentowego PCT nr WO 94/22465 (opublikowana 13 października 1994).

Sposób według wynalazku oparty jest na badaniach w celu określenia biochemicznych podstaw aktywności mukolitycznej DNazy I. Badania te obejmują zaprojektowanie i wytworzenie wariantów ludzkiej DNazy I i przetestowanie wariantów wytworzonych sposobem według wynalazku w celu określenia ich zdolności hydrolizy DNA, wiązania aktyny i zmniejszenia lepkoelastyczności plwociny in vitro. Sposobem według wynalazku wytworzono kilka klas wariantów ludzkiej DNazy I. Jedna klasa wariantów wytworzonych sposobem według wynalazku (wariant oporny na aktynę) ma zmniejszoną zdolność wiązania aktyny, ale ciągle posiada działanie mukolityczne, a w niektórych przypadkach ma działanie mukolityczne większe niż natywnej ludzkiej DNazy I. Takie warianty oporne na aktynę wytworzone sposobem według wynalazku mają prawie taką samą zdolność hydrolizy DNA jak natywna ludzka DNaza I, ale zdolność hydrolizy DNA jest mniej podatna na hamowanie przez aktynę. Druga klasa wariantów wiąże aktynę z powinowactwem podobnym do powinowactwa natywnej ludzkiej DNazy I, ale ma zmniejszoną aktywność mukolityczną i zmniejszoną zdolność hydrolizy DNA w porównaniu z natywną ludzką DNazą I.

Wyniki te wskazują że zastosowanie terapeutyczne ludzkiej DNazy I do zmniejszania lepkoelastyczności wydzielin płucnych wynika raczej z jej katalicznej zdolności hydrolizy DNA niż zjej zdolności rozkładu filamentów aktyny. Warianty ludzkiej DNazy I wiążące się z aktynąz mniejszym powinowactwem niż natywna ludzka DNaza I ciągle mają zdolność hydrolizy DNA i mogą być użytecznym środkiem terapeutycznym, szczególnie w leczeniu pacjentów mających wydzieliny płucne zawierające duże ilości aktyny. Ponieważ takie warianty mają zmniejszone powinowactwo do aktyny ich zdolność hydrolizy DNA jest w mniejszym stopniu hamowana przez obecność aktyny, tak więc mają większą aktywność mukolityczną w obecności aktyny w porównaniu z natywną ludzką DNazą I.

180 773

Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie wariantów ludzkiej DNazy I mających zdolność hydrolizy DNA ale wiążących się z aktyną z mniejszym powinowactwem niż natywna ludzka DNaza I.

Innym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie kwasu nukleinowego kodującego takie oporne na aktynę warianty ludzkiej DNazy I, zrekombinowanych wektorów zawierających taki kwas nukleinowy, zrekombinowane komórki gospodarza transformowane takim kwasem nukleinowym lub wektorem i sposób wytwarzania ludzkiej DNazy I metodami rekombinacji DNA.

Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające kodującego takie oporne na aktynę warianty ludzkiej DNazy I, ewentualnie z farmaceutycznie akceptowanymi dodatkami.

Przedmiotem wynalazku jest sposób zmniejszania lepkoelastyczności lub lepkiej konsystencji pochodzącego od pacjentów materiału zawierającego DNA, obejmujący podanie pacjentowi skutecznej terapeutycznie dawki opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób leczenia pacjentów chorych na mukowiscydozę, chroniczne zapalenie oskrzeli, zapalenie płuc, rozstrzeń oskrzelowy, rozedmę płuc, astmę i toczeń rumieniowaty systemowy, obejmujący podanie pacjentowi skutecznej terapeutycznie dawki opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I.

Przedmiotem wynalazku jest także użycie in vitro opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I w testach diagnostycznych do testowania materiałów śluzowych (na przykład, plwociny) pochodzących od pacjentów, w celu zmierzenia ilości obecnej aktyny i określenia czy pacjenta należy poddać leczeniu opornym na aktynę wariantem ludzkiej DNazy I.

Te i inne przedmioty wynalazku staną się jasne dla postronnych po zapoznaniu się ze specyfikacją.

Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasową dojrzałej ludzkiej DNazy I (SEQ.ID.NO: 1). Numery wskazują na pozycję reszt aminokwasowych w sekwencji.

Figura 2 przedstawia względną akty wność właściwą natywnej ludzkiej DNazy I i wariantów. Błędy oznaczają odchylenie standardowe (n-ważone). Względną aktywność właściwą ludzkiej DNazy I Pulmozyme ® (Genentech, Inc. South San Francisco, Califomia USA) określono jako 1,0. Względna aktywność właściwa natywnej ludzkiej DNazy I jest większa niż Pulmozyme ®, ze względu na obecność w Pulmozyme ® deaminowanej formy ludzkiej DNazy I, która ma zmniejszoną zdolność hydrolizy DNA (Frenz i wsp. publikacja opisu patentowego PCT nr WO 93/25670 (opublikowana 23 grudnia 1994).

Figura 3 przedstawia zdolność hydrolizowania DNA natywnej ludzkiej DNazy 11 wariantu ludzkiej DNazy I z jednym podstawieniem reszty aminokwasowej w obecności aktyny, oznaczonej testem nadbarwhwości. „Procent aktywności” oznacza procent zdolności hydrolizowania DNA DNazy I (natywnej lub wariantu) obliczony tak jak opisano w przykładzie 3; zdolność hydrolizowania DNA, DNazy I w nieobecności aktyny, zdefiniowano jako 100% aktywności. Błędy oznaczają odchylenie standardowe.

Figura 4 przedstawia zdolność hydrolizowania DNA natywnej ludzkiej DNazy 11 wariantu ludzkiej DNazy I z wieloma podstawieniami reszt aminokwasowych w obecności aktyny, oznaczonej testem nadbarwliwości i testem z zastosowaniem zieleni metylowej. „Procent aktywności” oznacza procent zdolności hydrolizowania DNA DNazy I (natywnej lub wariantu) obliczony tak jak opisano w przykładzie 3; zdolność hydrolizowania DNA, DNazy I w nieobecności aktyny zdefiniowano jako 100% aktywności. Błędy oznaczają odchylenie standardowe.

Figura 5 przedstawia względną zdolność wiązania aktyny przez warianty ludzkiej DNazy I oznaczoną (ELISA) testem wiązania aktyny (jak opisano w przykładzie 3). Wartość EC₅₀ oznacza stężenie DNazy I (natywnej lub wariantu), które jest konieczne do uzyskania w teście sygnału o wartości równej połowie sygnału maksymalnego. Błędy oznaczają odchylenie standardowe. Wartość EC_5o Pulmozyme ® i natywnej ludzkiej DNazy I wynosiły odpowiednio 72 ± 21 pM (n=21) i 85 ± 14 pM (n+14). Względna zdolność wiązania aktyny przedstawiona na figurze jest wartością EC₅₀ otrzymaną dla wariantu ludzkiej DNazy I podzieloną przez wartość EC₅₀ oznaczoną dla natywnej ludzkiej DNazy I. Warianty dla których otrzymane wartości EC₅₀ były

180 773 większe niż możliwości pomiarowe testu oznaczono, jako mające stosunek (EC₅₀ (wariant DNazy I) / EC₅₀ (natywnej DNazy I)) większy niż określona wartość (na przykład, >10, >100, >300, >20000, >35000).

Figura 6 przedstawia aktywność mukolitycznąnatywnej ludzkiej DNazy I i wariantów ludzkiej DNazy I w próbkach plwociny od pacjentów chorych na mukowiscydozę, oznaczoną testem zagęszczenia. Błędy oznaczają odchylenie standardowe.

Figura 7 przedstawia schematycznie immunosorpcyjny test wiązania aktyny (ELISA) opisany w przykładzie 3.

Szczegółowy opis wynalazku

I. Definicje

Użyte tu określenia „ludzka DNaza I”, „natywna ludzka DNaza I” i „DNaza I typu dzikiego” oznacza polipeptyd mający sekwencję aminokwasową dojrzałej ludzkiej DNazy I pokazaną na figurze 1.

Użyte tu określenia „wariant” lub „wariant sekwencji aminokwasowej” ludzkiej DNazy I oznacza polipeptyd mający sekwencje aminokwasową różną od natywnej ludzkiej DNazy I. Ogólnie, wariant charakteryzuje się przynajmniej 80% identycznością sekwencji (homologią), korzystnie przynajmniej 90% identycznością sekwencji, bardziej korzystnie przynajmniej 95% identycznością sekwencji, najbardziej korzystnie przynajmniej 98% identycznością sekwencji z natywną ludzką DNazą I. Procent identyczyności sekwencji oznaczono, na przykład, według Fitch i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:1382-1386 (1983), wersją algorytmu opisanego przez Needleman i wsp., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), po takim dopasowaniu sekwencji, żeby osiągnąć maksimum homologii.

Określenia „wariant ludzkiej DNazy I oporny na aktynę”, „wariant oporny na aktynę” i „oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy I” oznacza wariant natywnej ludzkiej DNazy I, który ma (1) zdolność hydrolizy DNA i (2) zmniejszoną zdolność wiązania aktyny.

„Zdolność hydrolizy DNA” oznacza aktywność enzymatyczną natywnej ludzkiej DNazy I lub wariantu ludzkiej DNazy I hydrolizującą (tnącą) substrat DNA i dającą jako produkty ufosforylowane na 5'-końcu oligonukleotydy. Zdolność hydrolizy DNA można łatwo określić każdą z kilku różnych metod znanych w sztuce, włączając jakościową elektroforezę na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, test nadbarwliwości (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950), czy test zieleni metylowej (Kumick, Arch. Blochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi i wsp., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)).

„Zdolność wiązania” natywnej ludzkiej DNazy I lub opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I oznacza zdolność DNazy I do niekowalencyjnego wiązania aktyny. Zdolność wiązania można określić każdąz kilku różnych metod znanych w sztuce, na przykład, Mannherz i wsp., Eur. J. Biochem. 104:367-379(1980)). Względną zdolność wiązania różnych DNaz (na przykład, natywnej ludzkiej DNazy I i jej wariantów) określa się mierząc wiązania DNaz do immobihzowanej aktyny w teście immunosorpcyjnym (ELISA) (opisanym w przykładzie 3), lub porównując zdolność hydrolizy DNA przez DNazy w obecności i nieobecności aktyny (także opisanym w przykładzie 3). Sposoby opisane w przykładach są szczególnie użyteczne do skrmingu wariantów ludzkiej DNazy I w celu szybkiego znalezienia tych wariantów wytworzonych sposobem według wynalazku, które mają zmniejszoną zdolność wiązania aktyny.

Oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy I mający „zmniejszoną zdolność wiązania aktyny”, jest to wariant, który ma zdolność wiązania aktyny mniejszą niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, określonąw porównywalnych warunkach. Jeśli opisany w przykładzie 3 immunosorpcyjny test wiązania aktyny jest używany do określenia zdolności wiązania aktyny przez ludzką DNazę I (natywną lub wariant), to wariantem opornym na aktynę mającym „zmniejszonązdolność wiązania aktyny” jest wariant, którego wartość EC₅₀ jest większa niż wartość EC₅₀ natywnej ludzkiej DNazy I. W tym teście wariant oporny na aktynę ma typowo wartość EC₅₀ od 5-krotnie do 100-krotnie większą niż wartość EC₅₀ natywnej ludzkiej DNazy I, jednak sposobem według wynalazku łatwo można otrzymać oporne na aktynę warianty mające wartość EC₅₀ ponad 500-krotnie większą niż wartość EC₅₀ natywnej ludzkiej DNazy I,

180 773 szczególnie przez zmianę wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I (patrz, na przykład figura 5).

„Aktywność mukolityczna” oznacza zmniejszenie lepkoelastyczności (lepkości) plwociny lub innego materiału biologicznego, jakie obserwuje się na przykład, po traktowaniu takiego materiału natywnąludzka DNaząl lub wariantem natywnej ludzkiej DNazy I. Aktywność mukolityczną można łatwo określić każdą z kilku różnych metod znanych w sztuce, włączając test zwartości plwociny (publikacja opisu patentowego PCT nr WO 94/10567, opublikowana 11 maja 1994), test wykorzystujący wahadło torsyjne (Janmey, J. Biophys. Methods 22:41-53 (1991), lub inne metody reologiczne.

„Reakcja łańcuchowa polimerazy” lub „PCR” oznacza ogólnie sposób amplifikacji pożądanych sekwencji nukleotydowych in vitro, tak jak opisano, na przykład, w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4,683,195. Ogólnie, metoda PCR obejmuje powtarzalne cykle wydłużania primerów, wykorzystujące oligonukleotydowe pnmery zdolne do preferencyjnego wiązania się z matrycową sekwencją DNA.

Uważa się, że termin „komórka”, „komórka gospodarza”, „lima komórkowa” i „hodowla komórkowa” używane tu wymiennie i wszystkie takie terminy określają potomstwo powstające w wyniku wzrostu lub hodowli komórek. Terminów „transformacja” i „transfekcja” używa się wymiennie dla określenia procesu wprowadzenia DNA do komórki.

Termin „połączony funkcjonalnie” oznacza kowalencyjne związanie, metodą ligacji enzymatycznej lub inną, dwóch lub więcej sekwencji DNA w takim porządku jedna względem drugiej, że zostaje zachowane normalne funkcjonowanie połączonych sekwencji. Na przykład, DNA presekwencji lub lidera wydzielniczego jest funkcjonalnie połączone z DNA pohpeptydu, jeżeli ulega ekspresji jako białko poprzedzające, które bierze udział w wydzielaniu pohpeptydu: sekwencja promotora lub sekwencja wzmacniającajest funkcjonalnie połączona z sekwencjąkodującą, jeżeli wpływa na transkrypcję tej sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomów jest funkcjonalnie połączone z sekwencjąkodującą, jeżeli jest tak umiejscowione, że ułatwia translację. Ogólnie, „połączony funkcjonalnie” oznacza, że połączone sekwencje DNA przylegajądo siebie i w przypadku sekwencji lidera wydzielniczego przylegajądo siebie zachowując zgodność ramki odczytu. Połączenie osiąga się przez ligację w odpowiednich miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, to używa się syntetycznych adaptorów oligonukleotydowych, lub łączników, w połączeniu ze standardowymi sposobami rekombinacji DNA.

Aminokwasy oznacza się tu za pomocą kodów trzy- lub jednoliterowych, jak następuje:

Asp D kwas asparaginowy Ile I izoleucyna

Thr T treonina Leu L leucyna

Ser S seryna Tyr Y tyrozyna

Glu E kwas glutaminowy Phe F fenyloalanina

Pro P prolina His H histydyna

Gly G glicyna Lys K lizyna

Ala A alanina Arg R arginina

Cys C cysteina Trp W tryptofan

Val V walina Gin Q glutamina

Met M metionina Asn N asparagina

II. Sekwencja wariantów opornych na aktynę

Sposób według wynalazku oparty jest na badaniach struktury, zdolności wiązania aktyny, zdolności hydrolizy DNA i aktywności mukolitycznej wariantów sekwencji aminokwasowych ludzkiej DNazy I. Oporne na aktynę warianty wytworzone sposobem według wynalazku mają zdolności hydrolizy DNA, ale ich zdolność wiązania aktyny jest mniejsza niż natywnej ludzkiej DNazy I. Takie zmniejszenie zdolności wiązania aktyny, korzystnie uzyskuje się przez wprowadzenie mutacji w miejscu i/lub obok tych reszt aminokwasowych natywnej ludzkiej DNazy I, które wydają się wpływać na miejsce wiązania aktyny, włączając na przykład, reszty Glu 13, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val67, Glu69 i Alal 14 natywnej

180 773 ludzkiej DNazy I (liczby następujące po trzyliterowym kodzie reszty aminokwasowej wskazują numer kolejny reszty aminokwasowej w sekwencji na figurze 1).

Istnieje wiele różnych sposobów wytworzenia opornych na aktynę wariantów ludzkiej DNazy I. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku oporny na aktynę wariant wytwarza się wprowadzając jedną lub wiele podstawień aminokwasowych, insercji i/lub delecji w region przylegający (to znaczy w obrębie około pięciu reszt aminokwasowych) do tych reszt aminokwasowych ludzkiej DNazy I, które wpływająna miejsce wiązania aktyny. Niektóre przykłady ilustrujące takie mutacje to: D53R, D53K, D53Y, D53A, R65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, Η44ΑΎ65Α: E69R (patrz figury 2-6).

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku oporny na aktynę wariant, wytwarza się wprowadzając mutację lub mutacje, które tworzą nowe miejsce glikozylacji w regionie przylegającym (to znaczy w obrębie około pięciu reszt aminokwasowych) do tych reszt aminokwasowych ludzkiej DNazy I, które wpływająna miejsce wiązania aktyny Na przykład, metody mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, używa się do wprowadzenia trójpeptydowej sekwencji, asparagina-X-seryna lub asparagina-X-treonina (w której X oznacza każdą resztę aminokwasową z wyjątkiem proliny), która jest sekwencją sygnalną do enzymatycznego przyczepienia reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Creighton, Proteins, str. 76-78 (W.H. Freeman, 1984). Przeszkody przestrzenne występujące pomiędzy resztą węglowodanową tak powstałego N-glikolizowego wariantu DNazy I a aktyną zmniejszają lub uniemożliwiają wiązanie aktyny, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia hamowania zdolności hydrołizowania DNA, DNazy I, w porównaniu do natywnej ludzkiej DNazy I. Niektóre przykłady ilustrujące takie mutacje to: H44N, D58S, D58T, H44N:V66T, H44N:V66S, V67N:E69S, V67N:E69T.

Ewentualnie, w połączeniu z takimi mutacjami powodującymi powstawanie nowych miejsc glikozylacji, występujące naturalnie w sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I miejsca glikozylacji w pozycji 18 i/lub 106 mogą być usunięte, w zależności od pożądanego stopnia glikozylacji cząsteczki wariantu opornego na aktynę.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku metody mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, używa się do wprowadzenia reszty aminokwasowej w regionie lub obok (to znaczy w obrębie około pięciu reszt aminokwasowych) tych reszt aminokwasowych natywnej ludzkiej DNazy I, które biorą udział w wiązaniu aktyny i które poddają się biologicznym lub chemicznym modyfikacjom post-translacyjnym (patrz poniżej). Means i wsp., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer i wsp., Chemical Modification of Proteins; Selected Methods and Analytical Preocedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, str. 70-87 (W. H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Takie modyfikacje post-translacyjne wprowadzają przeszkody przestrzenne lub zmieniająwłasności elektrostatyczne DNazy I, co zmniejsza lub uniemożliwia wiązanie aktyny i w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia hamowania zdolności hydrołizowania DNA DNazy I, w porównaniu do natywnej ludzkiej DNazy I. Na przykład, w miejsce lub pobliże reszty natywnej ludzkiej DNazy I biorącej udział w wiązaniu aktyny wprowadza się resztę cysteinową. Wolna grupa tiołowa reszty cysteinowej może tworzyć międzycząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe z drugą cząsteczką takiego wariantu DNazy I, co prowadzi do powstania dimerów DNazy I, lub może być modyfikowana, na przykład, za pomocą specyficznych do grup tiolowych związków alkilujących. Niektóre przykłady ilustrujące takie mutacje to: H44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E59C, A114C.

Substytucje, insercje i/lub delecja w sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I przeważnie wytwarza się wprowadzając mutacje w odpowiadającej sekwencji nukleotydowej DNA kodującego natywną ludzką DNazę I, na przykład, metodą mutagenezy ukierunkowanej miejscowo. Ekspresja zmutowanego DNA prowadzi do wytwarzania wariantu ludzkiej DNazy 1, mającego pożądaną (nie natywną) sekwencję aminokwasową.

Chociaż każda znana w sztuce technika może być użyta do prowadzenia mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, na przykład, metody opisane w Sambrook i wsp., Molecular

180 773

Cloning: A Laboratory Manuał, Drugie Wydanie (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), do wytwarzania wariantów ludzkiej DNazy I sposobem według wynalazku korzystnąmetodąjest mutageneza ukierunkowana na oligonukleotydy. Metoda ta jest dobrze znana w sztuce (Zoller i wsp., Meth. Enz. 100:4668-600 (1983); Zoller i wsp., Meth. Enz. 154:329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154:382-403 (1987); Kunkel i wsp., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987); Hortwitz i wsp., Meth. Enz. 185:599-611 (1990)) i jest szczególnie użyteczna do wytwarzania wariantów substytucyjnych, chociaż może być także użyta do wytwarzania wariantów delecyjnych i insercyjnych.

W metodzie mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, typowo wykorzystuje się wektory fagowe występujące zarówno w formie jednoniciowej jak i dwuniciowej. Typowy wektor użyteczny w metodzie mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, obejmujątakie wektory jak fag Ml 3 i wektory plazmidowe, zawierające jednoniciowe miejsce początku replikacji pochodzenia fagowego (Messing i wsp., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1983); Yeira i wsp. Meth. Enzymol. 153:3-11 (1987); Short i wsp. Nuc. Acids. Res. 16:7583-7600 (1988)). Replikacja tych wektorów o odpowiednich komórkach gospodarza powoduje syntezę jednoniciowego DNA, który może być użyty w metodzie mutagenezy ukierunkowanej miejscowo.

Krótko, podczas prowadzenia mutagenezy ukierunkowanej miejscowo DNA kodującego natywną ludzką DNazę I (lub jej wariant), DNA ten zmienia się najpierw przez hybrydyzację z oligonukleotydem kodującym pożądaną mutację jednej nici DNA. Po hybrydyzacji, używa się pohmerazy DNA do zsyntetyzowania całej pozostałej nici DNA, wykorzystując zhybrydyzowany oligonukleotyd jako primer i pojedynczą nić DNA jako matrycę. Tym sposobem oligonukleotyd zawierający pożądaną mutację jest włączony w powstający dwuniciowy DNA.

Oligonukleotydy używane jako sondy lub primery wytwarza się odpowiednimi sposobami, takimi jak oczyszczanie naturalnie występującego DNA lub przez syntezę in vitro. Na przykład, oligonukleotydy łatwo syntetyzuje się używając różnych metod chemii organicznej, takich jak opisane przez Narang i wsp., Meth. Enzymol. 68:90-98 (1979); Brown i wsp., Meth Enzymol. 68:109-151 (1979); Caruthers i wsp., Meth. Enzymol. 154:287-313 (1985). Ogólne podejście do selekcji odpowiednich sond lub primerów jest dobrze znane. Keller i wsp., DNA Probes, str. 11-18 (Stockton Press, 1989). Typowo, sonda hybrydyzacyjna lub primer zawiera 10-25 lub więcej nukleotydów i przynajmniej 5 nukleotydów po każdej ze stron pożądanej mutacji, pozwala to mieć pewność, że oligonukleotyd będzie hybrydyzował z jednoniciowącząsteczką matrycy preferencyjnie w pożądanym położeniu.

Oczywiście, metody mutagenezy ukierunkowanej miejscowo można użyć do wprowadzenia wielu podstawień, insercji lub delecji do wyjściowego DNA. Jeżeli miejsca mutowane leżą blisko siebie, mutacje można wprowadzić jednocześnie, używając jednego ohgonukleotydu kodującego wszystkie pożądane mutacje. Zamiast tego można także użyć jednego lub dwóch sposobów alternatywnych.

W sposobie pierwszym, dla każdej pożądanej mutacji wytwarza się oddzielny oligonukleotyd. Następnie oligonukleotydy łączy się w jednąjednoniciowącząsteczkę matrycowego DNA, a drugą nić DNA syntetyzuje się używając jako matrycy nici, zawierającej wszystkie pożądane podstawienia aminokwasowe.

W alternatywnym sposobie do wytworzenia wariantu zawierającego pożądane mutacje niezbędne są dwie lub więcej rund mutagenezy. Pierwsza runda jest taka sama jak przy wprowadzaniu pojedynczej mutacji. W drugiej rundzie jako matrycę wykorzystuje się DNA mutowany w pierwszej rundzie, tak więc matryca taka, od razu zawiera jedną lub więcej mutacji. Do takiej matrycy przyłącza się następnie oligonukleotyd kodujący dodatkowo pożądane podstawienie aminokwasowe. Powstający DNA koduje teraz mutacje z pierwszej i drugiej rundy mutagenezy. Takiego DNA używa się jako matrycy w trzeciej rundzie mutagenezy i tak dalej.

Mutageneza sposobem PCR (Higuchi, w PCR Protocols, str. 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette i wsp., Nuc.Acids Res. 17:723-733 (1989)) jest także przydatna do wytwarzania wariantów ludzkiej DNazy I. Krótko, jeżeli podczas reakcji PCR jako materiału wyjściowego używa się małych ilości matrycowego DNA, do wytwarzania stosunkowo dużych ilości

180 773 specyficznych fragmentów DNA używa się primerów nieznacznie różniących się sekwencją od odpowiednich sekwencji matrycy. Powstałe fragmenty DNA różnią się od sekwencji matrycowej tylko w tych pozycjach sekwencji, w których primery różniły się od matrycy. Na przykład, przy wprowadzaniu mutacji do plazmidu, sekwencja jednego z primerów zawiera pożądaną mutację i jest tak zaprojektowana, że hybrydyzuje z jedną nicią plazmidowego DNA w pozycji, w której występuje mutacja. Sekwencja drugiego primera musi być identyczna z sekwencjąnukleotydową przeciwnej nici DNA plazmidu, ale ta sekwencja może być komplementarna z dowolnym miejscem plazmidu. Korzystnie jest jeżeli sekwencja drugiego primera jest komplementarna z miejscem drugiej nici odległej nie więcej niż 200 nukleotydów od pierwszej, dzięki temu cały zamplifikowany region DNA, ograniczony przez primery, można łatwo zsekwencjonować. Reakcja PCR przy użyciu pary primerów jak opisana powyżej, daje zbiór fragmentów DNA różniących się pozycjami mutacji określonymi przez primery, a czasami także i innymi mutacjami, ponieważ reakcja PCR czasami jest niedokładna. Wagner i wsp., w PCR Topics, str. 69-71 (Springer- Verlag, 1991).

Jeżeli stosunek matrycy do amplifikowanego produktu jest wyjątkowo mały, większość wytworzonych fragmentów DNA zawiera pożądane mutacje. Stosując standardowe metody rekombinacji DNA, tak wytworzonego DNA, używa się do zastąpienia odpowiedniego fragmentu plazmidu, który służył za matrycę. Oddzielne mutacje można wprowadzić jednocześnie stosując drugi zmutowany primer, albo przeprowadzając drugi PCR z innymi zmutowanymi primerami i włączając dwa powstałe fragmenty DNA w plazmid w reakcji trzy- (lub więcej) częściowej ligacji.

Inny sposób wytwarzania wariantów sposobem według wynalazku, mutageneza kasetowa, oparty jest na metodzie opisanej przez Wells i wsp., Gene, 34:315-323 (1985). Materiałem wyjściowym jest plazmid (lub inny wektor) zawierający sekwencję, która ma być zmutowana. W wyjściowym DNA identyfikuje się kodon, który ma być zmutowany. Konieczna jest także obecność unikalnych miejsc restrykcyjnych po obu stronach zidentyfikowanego miejsca mutacji. Jeśli takie unikalne miejsca restrykcyjne nie istnieją można je stworzyć, używając do ich wprowadzenia w odpowiednie miejsca DNA, opisanej powyżej metody mutagenezy ukierunkowanej na oligonukleotydy. Plazmidowy DNA tnie się w tych miejscach w celu linearyzacji. Przy użyciu standardowych metod syntezy DNA, które pozwalająna syntezę oddzielnych mci DNA i ich hybrydyzacją, syntetyzuje się dwuniciowy oligonukleotyd kodujący sekwencję pomiędzy miejscami restrykcyjnymi, ale zawierający pożądaną mutację. Ten dwuniciowy fragment DNA nazywa się kasetą. Taką kasetę projektuje się tak, że ma 5' i 3' końce kompatybilne z końcami zlinearyzowanego plazmidu i może być połączona bezpośrednio z plazmidem. Powstały plazmid zawiera zmutowaną sekwencję DNA.

Obecność mutacji w DNA potwierdza się dobrze znanymi w sztuce sposobami, włączając mapowanie restrykcyjne i/lub sekwencjonowanie DNA. Korzystną metodą sekwencjonowania DNA jest metoda terminacji łańcucha za pomocą dwudeoksynukleotydów opisana przez Sanger i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72:3918-3921 (1979).

W celu dalszego klonowania lub ekspresji DNA kodujący wariant ludzkiej DNazy I łączy się z wektorem replikacyjnym. „Wektorami” sąplazmidy i inne cząsteczki DNA, które są zdolne do replikacji w komórkach gospodarza i w odpowiednich komórkach gospodarza (układ wektor-gospodarz) są zdolne do pełnienia dwóch funkcji. Pierwsza funkcja polega na ułatwieniu klonowania kwasu nukleinowego kodującego wariant ludzkiej DNazy I, to jest wytworzenia odpowiedniej ilości kwasu nukleinowego. Druga funkcja polega na umożliwieniu bezpośredniej ekspresji wariantu ludzkiej DNazy I. Jedna lub obie te funkcje są spełniane przez wektor w odpowiednich komórkach gospodarza używanych do klonowania lub ekspresji. Wektory zawierają różne składniki w zależności od funkcji jaką spełniają.

Wektor ekspresyjny do wytwarzania wariantu ludzkiej DNazy I zawiera opisany powyżej DNA kodujący ten wariant, połączony funkcjonalnie z promotorem i miejscem wiązania rybosomów. Następnie wariant poddaje się ekspresji bezpośredniej w hodowli zrekombinowanych komórek, lub jako białko połączone z polipeptydem heterologicznym, korzystnie sekwencją

180 773 sygnałową lub innym polipeptydem mającym specyficzne miejsce cięcia w miejscu połączenia polipeptydu heterologicznego i wariantu ludzkiej DNazy I.

Prokarionty (na przykład, E. coli i inne bakterie) są korzystnymi komórkami gospodarza w początkowych etapach klonowania sposobem według wynalazku. Są one szczególnie użyteczne do szybkiego wytwarzania dużych ilości DNA, wytwarzania jednoniciowych matryc używanych w metodzie mutagenezy ukierunkowanej miejscowo i do sekwencjonowania wytworzonych wariantów. Prokariotyczne komórki gospodarza mogą być także użyte do ekspresji DNA kodującego wariant ludzkiej DNazy I. Polipeptydy wytworzone w komórkach prokariotycznych typowo nie są glikolizowane.

Ponadto warianty ludzkiej DNazy I wytworzone sposobem według wynalazku można wytwarzać w eukariotycznych komórkach gospodarza, włączając eukariotyczne mikroorganizmy (na przykład, drożdże) lub komórki pochodzące ze zwierżąt lub innych organizmów wielokomórkowych (na przykład, komórki jajnika chomika chińskiego i inne komórki ssaków) lub żywe zwierzęta (na przykład, krowy, kozy, owce).

Metodologia klonowania i ekspresji jest dobrze znana w sztuce. Przykłady prokariotycznych i eukariotycznych komórek gospodarza, wektorów ekspresyjnych odpowiednich do użycia przy wytwarzaniu wariantów ludzkiej DNazy I sposobem według wynalazku są opisane, na przykład, w Shak, publikacja opisu patentowego PCT nr WO 90/07572 (opublikowana 12 hpca, 1990).

Jeżeli jako komórek gospodarza używa się komórek prokariotycznych lub innych mających ścianę komórkową, korzystną metodą transfekcji komórek jest metoda wapniowa opisana przez Cohen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110:2114(1974) lub metoda z użyciem glikolu polietylenowego opisana przez Chung i wsp., Nuc. Acids. Res. 16:3580 (1988). Jeżeli jako komórek gospodarza używa się komórek drożdży, transfekcję prowadzi się przede wszystkim metodą z użyciem glikolu polietylenowego opisaną przez Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 75:1929-1933 (1978). Jeżeli jako komórek gospodarza używa się komórek ssaków, transfekcję prowadzi się przede wszystkim metodą z precypitacji fosforanem wapniowym opisaną przez Graham i wsp., Virology 52:546 (1978), Gorman i wsp., DNA and Protein Eng. Techn. 2:3-10 (1990). Jednakże można także użyć innych znanych metod wprowadzania DNA do komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Metody, takie jak wstrzykiwanie dojądrowe, elektropacja czy fuzja protoplastów są odpowiednie do użycia sposobem według wynalazku.

Wektory ekspresyjne szczególnie użyteczne sposobem według wynalazku powinny zapewnić w komórkach ssaków przejściową ekspresję DNA kodującego warianty ludzkiej DNazy I. Ogólnie, przejściowa ekspresja oznacza, że używa się wektora ekspresyjnego, który jest zdolny do namnażania w komórkach gospodarza i gromadzą one wiele kopii wektora ekspresyjnego, co z kolei powoduje syntezę dużej ilości polipeptydu kodowanego przez wektor ekspresyjny. Systemy wykorzystujące przejściową ekspresję składająsię z odpowiedniego wektora ekspresyjnego i odpowiedniej komórki gospodarza i pozwalają na wygodna identyfikację polipeptydu kodowanego przez klonowane DNA, a także na szybki przegląd takich polipeptydów pod kątem pożądanych właściwości biologicznych i fizjologicznych. Wong i wsp., Science 228:810-815 (1985); Lee i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1986); Yang i wsp., Celi 47:3-10 (1986). Systemów wykorzystujących przejściową ekspresję używa się do ekspresji DNA kodującego sekwencję aminokwasową wariantów natywnej ludzkiej DNazy I, korzystnie w połączeniu z testami pozwalającymi na identyfikację tych wariantów, które wiążą aktynę z mniejszym powinowactwem, niż natywna ludzka DNaza I, a także z testami pozwalającymi na zmierzenie zdolności tych wariantów do hydrolizy DNA.

Wariant ludzkiej DNazy I korzystnie jest wydzielany przez komórki gospodarza, w których ulega ekspresji. W takim przypadku, białko wariant odzyskuje się z podłoża hodowlanego, w którym rosną komórki gospodarza. Korzystnie jest wtedy hodować komórki w podłożu pozbawionym surowicy, ponieważ brak białek surowicy i innych składników surowicy ułatwia oczyszczanie białka wariantu. Jeżeli białko wariantu nie jest wydzielane przez komórki gospodarza wtedy białko wariantu ludzkiej DNazy I odzyskuje się z lizatu komórek gospodarza. Jeżeli wariant ulega ekspresji w komórkach gospodarza innych niż komórki ludzkie, białko wariantu

180 773 będzie całkowicie wolne od białek ludzkiego pochodzenia. W każdym przypadku w celu wytworzenia homogennego preparatu białka wariantu ludzkiej DNazy I konieczne jest oczyszczenie białka wariantu od białek zrekombinowanych komórek gospodarza. Do użycia terapeutycznego, oczyszczony wariant korzystnie ma czystość większą niż 99% (to znaczy, że wszystkie inne białka stanowią mniej niż 1% białka całkowitego w oczyszczonej kompozycji).

Ogólnie oczyszczanie białka wariantu ludzkiej DNazy I prowadzi się wykorzystując różne własności fizykochemiczne białka wariantu i białek zanieczyszczających kompozycję. Na przykład, w pierwszym etapie podłoże hodowlane lub lizat komórek gospodarza odwirowuje się, żeby usunąć cząsteczkowe pozostałości komórkowe. Następnie, wariant ludzkiej DNazy I oczyszcza się z zanieczyszczających rozpuszczalnych białek i polipeptydów, na przykład, za pomocą wytrącania siarczanem amonowym lub alkoholem etylowym, filtracji na żelu (chromatografii sita molekularnego), chromatografii jonowymiennej, chromatografii hydrofobowej, chromatografii immunopowinowactwa (na przykład, z użyciem kolumn zawierających sprzężone z Sepharose przeciwciała przeciw ludzkiej DNazie I), chromatografii kationowymiennej (Frenz i wsp., publikacja opisu patentowego PCT nr WO 93/2570, opublikowana 23 grudnia, 1993), HPLC z wykorzystaniem fazy odwróconej i/lub elektroforezy na żelu.

Oczywiście biegli w sztuce wiedzą że sposoby oczyszczania używane w przypadku natywnej ludzkiej DNazy I wymagają pewnych modyfikacji, żeby były przydatne do oczyszczania wariantu ludzkiej DNazy I, ze względu na strukturalne i inne różnice między natywnym białkiem i białkiem wariantu. Na przykład, w niektórych komórkach gospodarza (szczególnie komórkach prokariotycznych) wariant ludzkiej DNazy I może ulegać ekspresji początkowo w postaci nierozpuszczalnej, zagregowanej formy (znanej w sztuce jako „ciała refrakcyjne” lub „ciała wtrętowe”), wtedy w celu oczyszczenia konieczne jest jego rozpuszczenie i późniejsze odtworzenie. Sposoby rozpuszczenia i późniejszego odtworzenia zrekombinowanych białkowych ciał refrakcyjnych są znane w sztuce (patrz, na przykład, Builder i wsp., Patent Stanów Zjednoczonych No.4,511,502).

W innym sposobie wykonania sposobu według wynalazku, warianty ludzkiej DNazy I wytwarza się przez bezpośrednią kowalencyjną modyfikację białka natywnej ludzkiej DNazy I. Takie modyfikacje robi się, żeby zmienić zdolność wiązania aktyny lub inne właściwości białka (na przykład, stabilność, okres półtrwania biologicznego, immunogenność). Modyfikacje takie można wytwarzać zamiast lub jako dodatek do podstawień, insercji lub delecji ammokwasowych opisanych powyżej.

Modyfikacje kowalencyjne wprowadza się w reakcji reszt aminokwasowych natywnej ludzkiej DNazy I lub jej wariantu z związkiem organicznym, który jest zdolny do reakcji z wybranym aminokwasowym łańcuchem bocznym lub resztą na N- lub C-końcu.

Na przykład, reszty cysteinylowe najczęściej poddaje się reakcji ζα-haloacetatami (i odpowiednimi aminami), takimi jak kwas chlorooctowy lub chloroacetamid. W wyniku reakcji otrzymuje się pochodne karboksymetylowe lub karboksyamidometylowe. Reszty cystenylowe poddaje się także reakcji z bromotrójfluoroacetonem, kwasem a-bromo-P-(5-imidozoilo)propionowym, fosforanem chloroacetylu, imidami kwasu N-alkilomaleinowego, dwusiarczkiem 3-nitro-2-pirydylu, dwusiarczkiem metylo-2-pirydylu, p-chlorortęciobenzoesanem, 2-chlorortęcio-4-nitrofenolem lub chloro-7-nitrobenzo-2-oksy-l,3-diazołem.

Reszty histydynylowe poddaje się reakcji z dietyłopirowęglanem w pH 5,5-7,0, ponieważ związek ten stosunkowo specyficznie reaguje z łańcuchem bocznym histydyny. Użyteczny jest także bromek parabromofenyloacylowy, reakcję korzystnie prowadzi się w 0,1 M roztworze kakodylanu sodowego w pH 6,0.

Reszty lizynylowe i reszty na końcu aminowym poddaje się reakcji z bezwodnikiem kwasu bursztynowego lub innych kwasów karboksylowych. Derywatyzacja tymi związkami odwraca ładunek reszt lizyny Iowy ch. Inne związki odpowiednie do derywatyzacji reszt zawierających grupy α-aminowe obejmują imidoestry, takie jak ester metylowy kwasu pikohnimidowego, fosforan pirydoksalu, pirydoksal, chloroborowodór, kwas trójnitrobenzenosulfonowy, O-metyloizomocznik, 2,4-pentanodion i reakcja z glioksylanem katalizowana przez transaminazę.

180 773

Reszty arginylowe modyfikuje się w reakcji z jednym iub kilkoma tradycyjnymi związkami, włączając fenyloglioksal, 2,3-butanodion, 1,2-cykloheksanodion i ninhydryna. Derywatyzacja reszt arginylowych wymaga, żeby reakcje były prowadzone w środowisku alkalicznym ze względu na wysoką wartość pK_a guanidynylowej grupy funkcyjnej. Ponadto, związki te mogą reagować z grupami lizyny, a także grupą epsylon-aminową argininy.

Boczne grupy karboksylowe (aspartyl, glutamyl) selektywnie modyfikuje się w reakcji karbodiimidów (R-N=C=N-R'), w których R i R' oznaczają różne grupy alkilowe, takie jak 1 -cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-4-etylo)karbodiimid lub 1 -etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)karbodiimid. Ponadto, reszty aspartylową i glutamylową można zmienić w reszty aspangmylową i glutaminylową w reakcji z solami amonowymi.

Reakcję kowalencyjnego sprzęgania reszt ghkozydowych z resztami aminokwasowymi można wykorzystać do modyfikowania lub zwiększenia liczby lub różnorodności podstawników węglowodowanych, szczególnie w miejscu lub pobliżu reszt aminokwasowych, które biorą udział w wiązaniu aktyny. W zależności od sposobu sprzęgania reszty lub resztę cukrową można przyłączyć do (a) argininy lub histydyny, (b) wolnych grup karboksylowych, (c) wolnych grup siarkowodorowych, takich jak grupa cysteiny, (d) wolnych grup hydroksylowych, takich jak grupy seryny, treoniny czy hydroksyproliny, (e) reszt aromatycznych, takich jak grupy fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofany i (f) grupy amidowej glutaminy. Odpowiednie sposoby są opisane na przykład w Publikacji Patentowej PCT nr WO 87/05330 (opublikowanej 11 września, 1987) i w Aplin i wsp., CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259-306 (1981).

Kowalencyjne wiązanie takich związków jak glikol polietylenowy (PEG) lub albumina surowicy ludzkiej do wariantów ludzkiej DNazy I i może zmniejszyć immunogenność i/lub toksyczność wariantu i/lub wydłużyć jego okres półtrwania, tak jak to obserwowano dla innych białek. Abuchowski i wsp., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Poznansky i wsp., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson i wsp., Biotechnology 8:343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992). Ponadto modyfikacje przez te związki reszty aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I lub jej wariantu w miejscu lub pobliżu reszt aminokwasowych (to znaczy w obrębie około 5 reszt aminokwasowych), które biorąudział w wiązaniu aktyny może spowodować powstanie wariantu opornego na aktynę.

W następnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wariant ludzkiej DNazy I zawiera mutację reszty Asn w pozycji 74 sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy 1 (na przykład, mutacje N74D, N74K lub N74S) w celu zmniejszenia lub uniemożliwienia deaminacji wariantu DNazy I. Frenz i wsp., publikacja opisu patentowego nr WO 93/25670, opublikowana 23 grudnia, 1993). W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy I zawiera mutację sekwencji aminokwasowej lub inną modyfikację kowalencyjną, która zmniejsza podatność tego wariantu na degradację przez proteazy (na przykład, elastazę neutrofili), które mogąbyć obecne w plwocinie i innych materiałach biologicznych.

Aktywność hydrolityczna DNA i zdolność wiązania aktyny wariantów ludzkiej DNazy I wytworzonych sposobem według wynalazku łatwo zmierzyć za pomocą testów i metod znanych w sztuce i tu opisanych. Każdy wariant mający aktywność hydrolityczną DNA i zredukowaną zdolność wiązania aktyny (tak jak zdefiniowano powyżej) jest wariantem opornym na aktynę i wchodzi w zakres wynalazku.

Opornych na aktynę wariantów ludzkiej DNazy I wytworzonych sposobem według wynalazku używa się do zmniejszenia lepkoelastyczności zawierającego DNA materiału, takiego jak plwocina, śluz i inne wydzieliny dróg oddechowych. Takie warianty są szczególnie użyteczne w leczeniu pacjentów chorych na choroby płuc i którzy mająnienormalnie lepkie lub zagęszczone wydzieliny, w przebiegu ostrych lub chronicznych chorób oskrzelowo-płucnych, włączając zakaźne zapalenie płuc, zapalenie oskrzeli, zapalenie tchawicy i oskrzeli, rozstrzeń oskrzelowy, mukowiscydozę, astmę, gruźlicę i infekcje grzybowe. W takich przypadkach roztwory lub bardzo rozdrobnione suche preparaty opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I podaje się

180 773 tradycyjnymi sposobami do dróg oddechowych (na przykład, oskrzeli) lub płuc pacjenta, na przykład, przez wytwarzanie aerozolu.

Oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy I jest także użyteczny jako leczenie wspomagające w leczeniu ropnia lub ostrych infekcji zamkniętych przestrzeni w przebiegu ropniaka, zapalenia opon, ropnia, zapalenia otrzewnej, zapalenia zatok, zapalenia ucha, zapalenia ozębnej, zapalenia osierdzia, zapalenia trzustki, kamicy żółciowej, zapalenia wsierdzia, posocznicowego zapalenia stawów, a także w leczeniu miejscowym różnych stanów zapalnych i zakażeń, takich jak zakażone rany skóry i/lub błon śluzowych, rany pooperacyjne, rany powrzodowe i oparzenia. Oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy I może poprawić skuteczność antybiotyków używanych w leczeniu takich infekcji (na przykład, aktywność gentamy cyny jest znacząco zmniejszona przez odwracalne wiązanie z natywnym DNA).

Natywna ludzka DNaza I i oporne na aktynę warianty ludzkiej DNazy I są też użyteczne w leczeniu tocznia rumieniowatego systemowego (SLE), przerażającej choroby autoimmunologicznej, która charakteryzuje się wytwarzaniem różnorodnych przeciwciał przeciw własnemu organizmowi. DNA jest głównym składnikiem antygenowym kompleksu immunologicznego. W tym przypadku ludzką DNazę I (natywna lub wariant) podaje się pacjentom systematycznie, na przykład, dożylnie, podskórnie, dooponowo lub domięśniowo.

Natywna ludzka DNaza I oporne na aktynę warianty ludzkiej DNazy I są tez użyteczne w zapobieganiu rozwojowi i zaostrzeniu infekcji dróg oddechowych, jakie mogą wystąpić u pacjentów chorych na mukowiscydozę, chroniczne zapalenie oskrzeli, astmę, zapalenie płuc i mne choroby płuc, pacjentów których oddychanie jest podtrzymywane przez wentylator lub mne urządzenie mechaniczne lub pacjentów zagrożonych rozwojem infekcji dróg oddechowych, na przykład, pacjentów pooperacyjnych.

Oporne na aktynę warianty ludzkiej DNazy I można wytworzyć znanymi sposobami, w celu otrzymania kompozycji terapeutycznych. Korzystna kompozycja terapeutyczna jest roztworem opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I w zbuforowanym lub niezbuforowanym roztworze wodnym, i korzystnie jest izotonicznym roztworem soli, takim jak 150 mM roztwór chlorku sodowego zawierający 1,0 mM chlorku wapniowego o pH 7,0. Te roztwory sąszczególnie dobrze przystosowane do użycia w dostępnych w handlu rozpylaczach, włączając rozpylacze strumieniowe i ultradźwiękowe przydatne do podawania leku bezpośredniego do dróg oddechowych lub płuc chorego pacjenta.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kompozycja terapeutyczna zawiera suchy proszek opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I, korzystnie wytworzoną metodą suszenia rozpryskowego roztworu opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy 1, dokładnie tak jak opisano w będącym jednocześnie przedmiotem postępowania zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr 08/206020 (złożonym 4 marca 1994).

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kompozycja terapeutyczna zawiera komórki aktywnie wytwarzające oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy I. Takie komórki można wprowadzić bezpośrednio do tkanek pacjenta, lub mogą być zamknięte w porowatej błonie, którą wszczepia się pacjentowi. W obu przypadkach powoduje to dostarczanie opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I w te miejsca ciała pacjenta, które potrzebują zwiększonej aktywności hydrolitycznej DNA. Na przykład, własne komórki pacjenta transformuje się in vivo lub in vitro DNA kodującym oporny na aktynę wariant ludzkiej DNazy 11 używa ich do wytwarzania DNazy I w ciele pacjenta.

Skuteczna terapeutycznie ilość opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I zależy, na przykład, od ilości DNA ilości aktyny w traktowanym materiale, od celów leczenia, sposobu podania i stanu pacjenta. W celu uzyskania optymalnego efektu terapeutycznego lekarz musi więc dobrać dawkę i zmodyfikować sposób podania. Biorąc pod uwagę zmniejszoną zdolność wiązania aktyny i w konsekwencji zwiększoną zdolność hydrolizy DNA w obecności aktyny, opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I, w stosunku do natywnej ludzkiej DNazy I, ilość opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I, niezbędną do osiągnięcia działania terapeutycznego jest mniejsza niż ilość natywnej ludzkiej DNazy I, konieczna do osiągnięcia takiego samego

180 773 działania tarapeutycznego, w takich samych warunkach. Ogólnie, efektywną terapeutycznie ilością opornego na aktynę wariantu ludzkiej DNazy I jest dawka od około 0,1 pg do około 5 mg wariantu na kg wagi ciała pacjenta, podany jako kompozycja farmaceutyczna tu opisana.

Oporny na aktynę wariant DNazy I można połączyć z lub wspólnie podawać z jednym lub więcej innych środków farmakologicznych używanych do leczenia wyżej opisach przypadków, takich jak antybiotyki, środki rozszerzające oskrzela, środki przeciwzapalne, mukolityczne (na przykład, N-acetylo-cySteina), białka wiążące aktynę lub białka rozkładające aktynę (na przykład, gelsolin; Matsudaira i wsp., Celi 54:139-140 (1988); Stossel i wsp., publikacja opisu patentowego PCT nr WO 94/22465 (opublikowana 13 października, 1994), inhibitory proteaz lub produkty do terapii genowej (na przykład, włączając gen regulatora przewodnictwa przezbłonowego stosowany w leczeniu mukowiscydozy (CFTR), Riordan i wsp., Ściance 245:1066-1073 (1989)).

Poniższe przykłady zamieszczono w celu zilustrowania sposobu według wynalazku, a nie w celu ograniczenia zakresu wynalazku. Wszystkie tu cytowane patenty i odnośniki literaturowe są włączone przez referencje.

Przykład 1

Mutageneza ludzkiej DNazy I

Szczep E. coli CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, Califomia USA) transformuje się plazmidem pRK.DNase.3 metodą opisaną przez Chung i wsp. (Nuc.Acids. Res. 16:3580 (1988). Plazmid pRK.DNase.3 użyty w tym wynalazku jest identyczny z plazmidem opisanym w publikacji opisu patentowego PCT nr WO 90/07572 (opublikowanej 12 lipca, 1990), z wyjątkiem sekwencji kodującej ludzką DNazę I pokazanej na figurze 1. Transformowane komórki wysiewa się na podłoże agarowe LB, zawierające 50 pg/ml carbenicyliny i hoduje się przez noc w temperaturze 37°C. Indywidualnymi koloniami z podłoża agarowego zaszczepiono podłoże 2YT (5 ml) zawierające 50 pg/ml carbenicyliny i 10 μΐ faga pomocniczego VCSM13 (Stratagene, La Jolla, Califomia USA) i hoduje się przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem. Z takiej hodowli izoluje się jednoniciowy DNA i używa jako matrycy do mutagenezy.

Ukierunkowaną miejscowo mutagenezę prowadzi się przy użyciu syntetycznych ohgonukleotydów według metody opisanej przez Kunkel i wsp., (Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987)). Ohgonukleotydy używane jako mutageny były 21-merami lub 24-merami, mającymi 9 lub 12 dokładnie sparowanych zasad w kierunku 5' od mutowanej zasady i 9 dokładnie sparowanych zasad w kierunku 3'. Po mutagenezie jednoniciowy DNA z indywidualnych hodowli poddaje się sekwencjonowaniu metodą terminacji łańcucha za pomocą dwudeoksynukleotydów (Sanger i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)). DNA kodujące sekwencję wariantu transformuje się następnie opisaną powyżej metodą szczep E. coli XL1 Blue MRF ((Stratagene). Po wysianiu i wyizolowaniu pojedynczych kolonii, tak jak opisano powyżej, indywidualnych kolonii używa się do zaszczepienia 0,5 litra podłoża LB zawierającego 50 pg/ml carbenicyliny. Po całonocnym wzroście z wytrząsaniem w temperaturze 37°C, komórki zbiera się przez wirowanie i DNA kodujący sekwencję wariantu (z wektorem ekspresyjnym) oczyszcza się przy użyciu kolumn Oiagen tip-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, Califomia USA).

Figury 2-6 określają różne warianty ludzkiej DNazy I jakie wytworzono. Na figurach i w specyfikacji, opis substytucji aminokwasowych tworzących mutacje obecne w wariantach ludzkiej DNazy I skrócono do pierwszej litery, liczby i drugiej litery. Pierwsza litera oznacza jednoliterowy skrót reszty aminokwasowej w natywnej (typu dzikiego) dojrzałej ludzkiej DNazy I, liczba oznacza pozycję tej reszty w sekwencji w natywnej dojrzałej ludzkiej DNazie I (według numeracji pokazanej na figurze 1) i druga litera oznacza jednoliterowy skrót reszty aminokwasowej w wariancie ludzkiej DNazie I. Na przykład, w wariancie ludzkiej DNazy I mającym mutację D53R, reszta kwasu asparaginowego (D) w pozycji 53 natywnej ludzkiej dojrzałej DNazy I została zamieniona na resztę argimny (R). Wielokrotnie mutacje w pojedynczym wariancie oznaczono podobnie, do odróżnienia oddzielnych mutacji występujących w jednym wariancie użyto

180 773 dwukropka (:). Na przykład, oznaczenia D53R: Y65A oznacza, że ten wariant ma mutację D53R i Y65A.

Przykład 2

Ekspresja wariantów ludzkiej DNazy I

Ludzkie embrionalne komórki nerki 239 (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) hoduje się na podłożu zawierającym surowicę w plastykowych płytkach Petn'ego o średnicy 150 mm. Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu przejściowego kotransfekuje się 22,5 pg oczyszczonego DNA wariantu (wytworzonego tak jak opisano powyżej) i 17 pg DNA adenowirusa za pomocą metody precypitacji DNA fosforanem wapnia (Gorman i wsp., DNA and Protein Eng. Techn. 2:3-10 (1990)). Około 16 godzin po transfekcji komórki przemywa się 15 ml roztworu soli buforowanego fosforanami i zmienia się podłoże na podłoże pozbawione surowicy. Z każdej płytki dwukrotnie zbiera się podłoże, pierwszy raz po 24 lub 72 godzinach, a drugi raz po 96 godzinach zmieniając podłoże na podłoże pozbawione surowicy. W ten sposób otrzymuje się około 50 ml hodowlanego zawierającego wariant DNazy I. Takie podłoże hodowlane zebrane z każdej płytki zatęża się 5 do 50 razy za pomocąkoncentratorów Centriprep 10, a zatężone podłoża testuje się w celu określenia różnych biochemicznych i biologicznych aktywności wariantów DNazy I. W ten sam opisany powyżej sposób wytwarza się zatężone podłoże zawierające natywną ludzkąDNazę I, jednakże komórki 239 przejściowo transfekuje się plazmidem pRK.DNase.3.

Przykład 3

Biochemiczne i biologiczne aktywności wariantów DNazy I

I. Względna aktywność właściwa

Względną aktywność właściwą wariantów DNazy I, określa się porównując dwoma testami aktywność wariantów i aktywność natywnej ludzkiej DNazy I. Względną aktywność właściwą definiuje się jako stężenie wariantu (w mg/ml) określone testem aktywności zieleni metylowej (Sinicropi i wsp., AnaL Biochem. 222:351-358 (1994; Kumick, Arch. Biochem. 29'41-53 (1950)) podzielone przez stężenie wariantu (w mg/ml) określone testem ELISA dla DNazy I (opisanym poniżej). W obu testach krzywe standardowe wyznacza się używając ludzkiej DNazy I Pulmozyme ®. Na figurze 2 pokazano względną aktywność właściwą natywnej ludzkiej DNazy 1 i wariantów DNazy I.

W teście aktywności zieleni metylowej (Sinicropi i wsp., Anal. Biochem. 222:351-358 (1194); Kumick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)) wykorzystuje się barwnik zieleń metylową który interkaluje mniej więcej co dziesięć zasad z DNA dając zielony substrat. Ponieważ DNA jest degradowane przez DNazę I zieleń metylowa jest uwalniana i utleniana do formy bezbarwnej. Utrata barwy jest proporcjonalna do ilości DNazy I obecnej w badanej próbce. Ilość DNazy I obecnej w teście jest wyliczana z porównania z krzywą standardową otrzymaną przy użyciu znanych stężeń DNazy I.

Test ELISA dla DNazy I obejmuje opłaszczenie płytek ze studzienkami poliklonalnym przciwciałem kozy przeciw DNazy I, dodanie testowanej próbki i wykrycie związanej DNazy I za pomocą studzienkami pohklonalnego przeciwciała królika przeciw DNazie I sprzężonego z peroksydazą korzenia chrzanu (HRP). Po dodaniu substratu dla HRP i substancji wyzwalającej powstanie barwy, pojawia się barwa której natężenie jest proporcjonalne do ilości DNazy obecnej w badanej próbce. Ilość DNazy I obecnej w teście jest wyliczana z porównania z krzywą standardową otrzymaną przy użyciu znanych stężeń DNazy I.

Oboma testami bada się wielokrotne rozcieńczenia próbek i te stężenia, których wartości w testach wypadają w środkowym zakresie krzywej standardowej uśrednia się i oblicza odchylenie standardowe.

Stężenia DNazy I wyliczonego na podstawie testu ELISA dla DNazy I używa się do standaryzacji stężenia DNazy I w innych testach służących do dalszego charakteryzowania wariantów DNazy I (na przykład, opisanych poniżej testów hamowania przez aktynę).

180 773

II. Hamowanie przez aktynę aktywności hydrolitycznej DNazy I

G-aktynę (Kabsch i wsp., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992)) otrzymuje się przez całonocną dializę roztworu 1 mg/ml aktyny (kupionej (Sigma, StLouis, Missouri USA) lub wytworzonej metodą Pardee i wsp., Meth. Enzymol. 85:164-181 (1982)) wobec 5 mM roztworu HEPES pH 7,2, 0,2 mM CaCl₂, 0,5 mM ATP, 0,5 mM β-merkaptoetanol w temperaturze 4°C. Po odwirowaniu 13000xg przez 5 minut, ilość G-aktyny określa się mierząc absorbancję przy długości fali 290 nm. 1 mg/ml roztworu ma absorbancję 0,66. Ilość preparatu G-aktyny konieczną do osiągnięcia istotnego (>50% hamowania), ale nie całkowitego zahamowania aktywności hydrolitycznej natywnej ludzkiej DNazy I, określa się we wstępnych testach w takich samych warunkach badania.

Wrażliwość na hamowanie przez aktynę określa się mierząc aktywność hydrohtyczną wariantów w obecność i przy braku aktyny dwoma różnymi testami, opisanym wcześniej testem zieleni metylowej i testem nadbarwliwości, który jest oparty na pomiarze wzrostu absorbancji przy długości fali 260 nm po denaturacji i depolimeryzacji DNA (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)). Figury 3 i 4 pokazują oznaczony tymi testami procent hamowania wybranych wariantów.

W teście nadbarwliwości, zatężone supematanty hodowli (wytworzone jak opisano powyżej i zawierające warianty DNazy I) inkubuje się bez aktyny lub dodając 2- lub 3-krotny nadmiar w stosunku molamym aktyny w buforze A (25 mM HEPES pH 7,5,4 mM CaCl₂,4 mM MgCl₂, 0,1% BSA) przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę dodaje się do kuwety zawierającej 40 pg DNA w całkowitej objętości 1,0 ml. Końcowe stężenie wariantu DNazy I w teście wynosi około 26 nM, jak określono za pomocą testu ELISA. Mierzy się stopień hydrolizy DNA przez warianty DNazy I w obecności i przy braku aktyny. Procent aktywności pokazany na figurach 3 i 4 obliczono określając stosunek aktywności hydrolitycznej DNazy I (natywnej lub wariantu) w obecności i przy braku aktyny i mnożąc przez 100.

W teście zieleni metylowej, zatężone supematanty hodowli (wytworzone jak opisano powyżej i zawierające warianty DNazy I) inkubuje się bez aktyny lub dodając 1000-krotny nadmiar w stosunku molamym aktyny w buforze B (25 mM HEPES pH 7,5,4 mM CaCl₂ 4 mM MgCl₂, 0,1% BSA, 0,01% thimerosal, 0,05% Tween 20) przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Dla każdej próbki określa się stężenie aktywnego enzymu porównując z krzywą standardową otrzymaną dla Pulmozyme ®. „Procent aktywności” pozostałej wariantu oznacza stosunek aktywności w obecności aktyny do aktywności przy braku aktyny pomnożony przez 100.

Jak pokazano na figurach 3 i 4 aktywność hydrolityczna DNA natywnej ludzkiej DNazy I jest w znacznym stopniu hamowana przez obecność aktyny. Dla porównania, różne jedno- i wielopodstawione warianty DNA natywnej ludzkiej DNazy I są stosunkowo oporne na hamowanie przez aktynę, ponieważ mająw jej obecności większą aktywność hydrolityczną DNA niż natywna ludzka DNaza I.

III. Test ELISA wiązania aktyny

Do określenia zdolności natywnej ludzkiej DNazy I i jej wariantów wytworzonych sposobem według wynalazku opracowano test immunosorpcyjny ELISA wiązania aktyny. Studzienki płytki MaxiSorp (Nunc, Inc., Naperville, Illinois, USA) opłaszcza się w temperaturze 4°C przez 16-24 godziny roztworem 10pg/ml ludzkiej globuliny GC (Calbiochem, La Jolla, Califomia USA), białka wiążącego aktynę (Goldschmidt-Clermont i wsp., Blochem. J. 228:471-477 (1985), McLeod i wsp., J. Biol. Chem. 264:1260-1267 (1989), Houmeida i wsp., Eur. J. Biochem. 203:499-503 (1992)), w buforze 25 mM HEPES pH 7,2,4 mM CaCl₂,4 mM MgCl₂, dodając 100 μΐ na studzienkę. Po usunięciu glubuliny GC, nadmiar miejsc wiązania blokuje się dodając 200 μΐ na studzienkę bufom C (bufor C jest taki sam jak bufor B, ale zawiera jeszcze 0,5 mM trójfosforany adenozyny; bufor C jest używany do rozcieńczania we wszystkich następnych etapach testu, chyba że napisano inaczej) i inkubując płytki na wytrząsarce przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Każdy następny etap inkubacji prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Vineland, New Jersey, USA), pomiędzy każdym etapem płytkę opróżnia się i płucze 6 razy roztworem soli buforowanym fosforana

180 773 mi zawierającymi 0,05% Tween 20 w płukarce do płytek Microwash II (Skatron A/S, Norwegia). Następnie, G-aktynę przy gotowaną jak opisano powyżej, rozpuszcza się do stężenia 50 pg/ml w buforze C i do każdej studzienki dodaje się 100 μΐ, płytki inkubuje się i płucze, a następnie do studzienek dodaj e się różnych rozcieńczeń Pułmozyme ® i supematantu hodowli komórkowych zawierających natywną ludzką DNazę I lub jej warianty. Płytki inkubuje się i płucze, a następnie dodaje się 100 μΐ rozcieńczenia 1/25000 poliklonalnego przeciwciała królika przeciw ludzkiej DNazie I sprzężonego z peroksydaząkorzenia chrzanu (stężenie roztworu wyjściowego 465 pg/ml). Po inkubacji i przepłukaniu do każdej studzienki dodaje się 100 μΐ substancji wyzwalającej powstanie barwy (Sigma Fast o-fenylenodwuamina i tabletki mocznik/H₂O₂ rozpuszczone według zaleceń producenta). Reakcję barwnąhamuje się przez dodanie 100 μΐ 4,5 N H₂SO₄ na studzienkę. Zmierzone wartości absorbancji wykreśla się w zależności od stężenia DNazy I, które dodano do studzienek. W przypadku natywnej ludzkiej DNazy I i tych wariantów, które wiązą się z aktyną otrzymuje sigmoidalne krzywe. Krzywe te dopasowuje się do czteroparametrycznego równania metodą regresji nieliniowej (Marquardt, J.Soc.Indust.App.Math. 11:431 -441 (1963). Z każdej krzywej wylicza się stężenie DNazy I (natywnej lub wariantów) konieczne do uzyskania w teście sygnału o wartości równej połowie sygnału maksymalnego i to stężenie przyjmuje się jako wartość EC₅₀. Masa molowa natywnej ludzkiej DNazy 11 jej wariantów wynosi 37000 Daltonów.

Względną zdolność wiązania aktyny każdego wariantu ludzkiej DNazy I obliczono dzieląc wartość EC₅₀ otrzymaną dla wariantu ludzkiej DNazy I przez wartość EC₅₀ oznaczoną testem ELISA dla natywnej ludzkiej DNazy I, wyniki przedstawiono na figurze 5. Na przykład, jeżeli obliczona wartość względnej zdolności wiązania aktyny wariantu ludzkiej DNazy I wynosi 5 oznacza to, że wartość EC₅₀ wariantu ludzkiej DNazy I jest 5-krotnie większa niz wartość EC₅₀ natywnej ludzkiej DNazy I, innymi słowami, wariant ma powinowactwo do aktyny pięć razy mniejsze niż powinowactwo do aktyny natywnej ludzkiej DNazy I oznaczone testem ELISA.

IV Test zwartości plwociny

Test zwartości plwociny (publikacja opisu patentowego PCT nr WO 94/10567, opublikowana 11 maja 1994) został użyty do mierzenia względnej lepkoelastyczności plwociny pacjentów chorych na mukowiscydozę (plwocina CF) przed i po inkubacji z natywną ludzką DNaząl i jej różnymi wariantami. Po zmieszaniu plwociny CF z próbkąDNaząl i inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej, półstały roztwór ładuje się do kapilar i odwirowuje przez 20 minut przy 12000 obrotów na minutę. Po wirowaniu mierzy się wysokość osadu i porównuje do wysokości osadu i roztworu. Pomiarów używa się następnie do obliczenia procentowej zwartości plwociny, która jest skorelowana z lepkoelastycznością plwociny.

Procentową zwartość plwociny oznaczoną po traktowaniu plwociny CF natywną ludzką DNazą I i wariantami ludzkiej DNazy I, opornymi na aktynę pokazano na figurze 6. Wyniki te wskazują że warianty ludzkiej DNazy I oporne na aktynę, są bardziej efektywne niż natywna ludzka DNaza I w zmniejszaniu lepkoelastyczności plwociny CF, jak to określono testem zwartości plwociny.

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE' (i) APLIKANT: Genentech, Inc.

Lazarus, Robert A. Shak, Steven Uler, Jana S.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: WARIANTY LUDZKIEJ DNAZY I (iii) LICZBA SEKWENCJI: 1 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

180 773 (A) ADRESAT: Genentech, Inc.

(B) ULICA: 460 Point San Bruno Blvd (C) MIASTO: South San Francisco (D) STAN: Califomia (E) KRAJ: USA (F) KOD: 94080 (v) NOŚNIK KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka 5.25 cala, 360 Kb (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIA: patin (Genentech) (vi) DANE APLIKACJI:

(A) NUMER APLIKACJI:

(B) DATA ZłOŻENIA: 24 luty 1995 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE WCZEŚNIEJSZEJ APLIKACJI:

(A) NUMER APLIKACJI:

(B) DATA ZłOŻENIA:

(viii) RZECZNIK/ZASTĘPCA:

(A) NAZWISKO: Johnston, Sean A.

(B) NUMER REJESTRACJI: 35,910 (C) NUMER REJESTRU/SPRAWY: P0925PlPCTi (ix) INFORMACJE TELECOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFONE: 415/225-3562 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7166 (2) INFORMACJA O SEQ NO: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 260 aminokwasów (B) TYP: Aminokwas (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQIDNO: 1:

Leu 1

Lys

Ile

Ala

Ala 5

Phe

Asn

Ile

Gin

Thr 10

Phe

Gly

Glu

Thr

Lys 15

Met

Ser

Asn

Ala

Thr 20

Leu

Val

Ser

Tyr

Ile 25

Val

Gin

Ile

Leu

Ser 30

Arg

Tyr

Asp

Ile

Ala

Leu

Val

Gin

Glu

Val

Arg

Asp

Ser

His

Leu

180 773

Thr

Ala Val

Gly

Lys 50

Leu

Leu

Asp

Asn

Leu Asn Gin 55

Asp

Ala

Pro 60

Asp

Thr

Tyr

His

Tyr

Val

Val

Ser

Glu

Pro

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser

65

70

75

Tyr

Lys

Glu

Arg

Tyr

Leu

Phe

Val

Tyr

Arg

Pro

Asp

Gin

Val

Ser

80

85

90

Ala

Val

Asp

Ser

Tyr

Tyr

Tyr

Asp

Asp

Gly

Cys

Glu

Pro

Cys

Gly

95

100

105

Asn

Asp

Thr

Phe

Asn

Arg

Glu

Pro

Ala

Ile

Val

Arg

Phe

Phe

Ser

110

115

120

Arg

Phe

Thr

Glu

Val

Arg

Glu

Phe

Ala

Ile

Val

Pro

Leu

His

Ala

125

130

135

Ala

Pro

Gly

Asp

Ala

Val

Ala

Glu

Ile

Asp

Ala

Leu

Tyr

Asp

Val

140

145

150

Tyr

Leu

Asp

Val

Gin

Glu

Lys

Trp

Gly

Leu

Glu

Asp

Val

Met

Leu

155

160

165

Met

Gly

Asp

Phe

Asn

Ala

Gly

Cys

Ser

Tyr

Val

Arg

Pro

Ser

Gin

170

175

160

Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gin Trp Leu

180 773

185 190 195

Ile

Pro

Asp

Ser

Ala 200

Asp

Thr

Thr

Ala

Thr 205

Pro

Thr

His

Cys

Ala 210

Tyr

Asp

Arg

Ile

Val

Val

Ala

Gly

Met

Leu

Leu

Arg

Gly

Ala

Val

215

220

225

Val

Pro

Asp

Ser

Ala

Leu

Pro

Phe

Asn

Phe

Gin

Ala

Ala

Tyr

Gly

230

235

240

Leu

Ser

Asp

Gin

Leu

Ala

Gin

Ala

Ile

Ser

Asp

His

Tyr

Pro

Val

245

250

255

Glu

Val

Met

Leu

Lys

260

180 773

PMTOse^M εαρδχβζΜ

180 773

180 773 rśs.bÓO^'' '·/·<'

3,5OO<EZZZZ

3,500<[7T3^ ' 3,500^(%; 7 (

1,750<ΓΫ~~ ιπιι ι*

H44A:Y65A:E69R ~D53R:Y65A:H44A D53R:E69R 2_D53R:Y65A __D53R:H44A

35O< [

1,750<Q2

35<[

E69R ~E69K ' V67K ~V67E

V67A

Y65W ~Y65R

Y65E Y65A _ D53Y

D53R

D53K

D53A 2”H44W _IH44Y _ H44E ~H44D ”H44A ~E13Y E13W ' E13R

El 3H 1.E13A natywna

N (ϋ z c <0 <ΰ 5

IO

DNaza I

Ltut I 1 Łlltll > I ŁłUU i i futtu I Ł (I ,~~Pulmozyme _ nc _ OS eze^a euMZąeu)^uaQ3/i Azewa 33

180 773

O χη O C N O

Φ xn o o

-P ίΧ M Φ Φ -< ?

N c

E N

FIG. 6

0.01 0.1 1 10

Stężenie wariantu DNazy I (ug/ml) —Θ— natywna DNaza I — * - D53R

- «- V67K

- -Ξ - - D53R:Y65A • · ♦ · - D53R:E69R

- H44A:D53R:Y65A

- e H44A:Y65A:E69R

Poliklonalne przeciwciało królika przeciw DNazie sprzężone z HRP

FIG. 7

180 773

20 30 4050

LKIAAFNIQTFGETKMSNATLVSYIVQILSRYDIALVQEVRDSHLTAVGK

70 80 90100

LLDNLNQDAPDTYHYWSEPLGRNSYKERYLFVYRPDQVSAVDSYYYDDG

110 120 130 140150

CEPCGNDTFNREPArVRFFSRFTEVREFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDV

160 170 180 190200

YLDVQEKWGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIRLWTSPTFQWLIPDSA

210 220 230 240250

DTTATPTHCAYDRIWAGMLLRGAWPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAIS

260

DHYPVEVMLK

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wariant ludzkiej DNazy I o zdolności hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolności wiązania aktyny niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, znamienny tym, że posiada sekwencję amonokwasową identyczną w zakresie od 90% do 95% z sekwencjąnatywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig. 1, przy czym sekwencja ta różni się od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamianą jednego aminokwasu na inny tylko w jednej z pozycji sekwencji przedstawionej na fig. 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub Alall4.
2. 2. Wariant ludzkiej DNazy I o zdolności hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolności wiązania aktyny niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy 1, znamienny tym, że posiada sekwencję aminokwasową identyczną w zakresie od 90% do 95% z sekwencjąnatywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig. 1, przy czym sekwencja ta różni się od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamianąjednego aminokwasu na inny w dwóch lub więcej pozycjach sekwencji przedstawionej na fig. 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub Alall4.
3. 3. Izolowany kwas nukleinowy kodujący wariant ludzkiej DNazy I posiadający sekwencję nukleotydową kodującą wariant ludzkiej DNazy I o zdolności hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolności wiązania aktyny niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, znamienny tym, że posiada sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową identyczną w zakresie od 90% do 95% z sekwencjąnatywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig. 1, przy czym sekwencja ta różni się od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamianąjednego aminokwasu na inny tylko w jednej z pozycji sekwencji przedstawionej na fig. 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub Alall4.
4. 4. Izolowany kwas nukleinowy kodujący wariant ludzkiej DNazy I posiadający sekwencję nukleotydową kodującą wariant ludzkiej DNazy I o zdolności hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolności wiązania aktyny niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, znamienny tym, że posiada sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową identyczną w zakresie od 90% do 95% z sekwencjąnatywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig. 1, przy czym sekwencja ta różni się od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamianąjednego aminokwasu na inny w dwóch lub więcej pozycjach sekwencji przedstawionej na fig. 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub Alall4.
5. 5. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów chorych na choroby lub zaburzenia pracy płuc zawierająca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera wariant ludzkiej DNazy I o zdolności hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolności wiązania aktyny niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, charakteryzującą się tym, że posiada sekwencję aminokwasową identyczną w zakresie od 90% do 95% z sekwencją natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig. 1, przy czym sekwencja ta różni się od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamianąjednego aminokwasu na inny tylko w jednej z pozycji sekwencji przedstawionej na fig. 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub Alall4.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że jest w formie płynnej.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że jest w formie proszku.,

   180 773
8. 8. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów chorych na choroby lub zaburzenia pracy płuc zawierająca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, · znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera wariant ludzkiej DNazy I o zdolności hydrolizy DNA oraz o przynajmniej od 5 do 100 krotnie mniejszej zdolności wiązania aktyny niż zdolność wiązania aktyny natywnej ludzkiej DNazy I, charakteryzującą się tym, że posiada sekwencję aminokwasową identyczną w zakresie od 90% do 95% z sekwencją natywnej ludzkiej DNazy I przedstawionej na fig. 1, przy czym sekwencja ta różni się od sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej DNazy I zamianą jednego aminokwasu na inny w dwóch lub więcej pozycjach sekwencji przedstawionej na fig. 1 wybranych z grupy His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 lub Alall4.
9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jest w formie płynnej.
10. 10. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jest w formie proszku.

    * * *