CZ267797A3 - Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a izolovaná nukleová kyselina ji kodující a způsob léčby pacienta majícího plicní nemoc nebo chorobu obsahující podávání terapeuticky účinného množství na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I a farmaceutický prostředek obsahující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA - Google Patents

Description

Na akt i n rezistentní varianta lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a izolovaná nukleová kyselina ji kódující a způsob léčby pacienta majícího plicní nemoc nebo chorobu obsahující podávání terapeuticky účinného množství na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I a farmaceutický prostředek obsahující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA

Oblast techniky ' Předložený vynález se týká výsledků získaných výzkumem lidské deoxyribonukleázy (DNázy 1), fosfodiesterázy, která je schopná hydrolýzy polydeoxyribonukleové kyseliny. Všeobecné se týká modifikovaných (variantních) forem lidské DNázy I a jejich přípravy metodami rekombinantní

DNA do formy farmaceutického prostředku ták aby byla jejich funkčnost využívána klinicky a týká se také metod, které používají tyto varianty DNázy 1 a prostředky z nich vyrobené.

Dosavadní stav techni ky

DNáza I je fosfodiesteráza schopná hydrolýzy polydeoxyribonukleové kyseliny. DNáza 1 byla purifikována z různých druhů do různého stupně. Hovězí DNáza 1 byla rozsáhle studována biochemicky. Viz např. Moore, in The Enzymes (Boyer, P.D., ed.), pp 281-296, Academie press, New York (1981). Úplná aminokyselinová sekvence hovězí DNázy I je známa (Liao, et. al., J. Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefner, et. al., J. Mol. Biol.

192:605-632 (1986); Lahm, et. al., J- Mol Biol. 221:645-667 (1991)) a DNA kódující hovězí DNázu I byla klonována a exprimována (Worrall, et. al , J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Struktura hovězí DNázy I byla určena rentgenokrystalografií (Suck, et.al., EMBO J. 3:2423-2430 (1984); Suck, et.al., Nátuře 321:620-625 (1986); Oefner, et. al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986)).

DNA kódující hovězí DNázu 1 byla izolována a sekvencována a tato DNA byla exprimována v rekombinantních hostitelských buňkách a tím byla umožněna výroba lidské DNázy Iv komerčně užitečných množstvích (Shak, et.al., Proč. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990)).

DNáza 1 má řadu známých užitečných vlastností a byla použita na terapeutické účely. Její základní terapeutické uplatnění je ve snížení viskoelasticity plicních sekrecí (hlenu) při takových nemocech jako zápal plic ,« a cystická fibróza (CF) a tím pomáhá při vyčištění dýchacích cest. Viz např.

fy Lourenco, et. al., Arch. Intern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak, et. al.,

Proč. Nát Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Hubbard, et. al., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Bryson, et. al., Drugs 48:894-906 (1994). Hlen také přispívá k úmrtnosti při chronické bronchitidě, astmatické bronchitidě, bronchiectasitidě, rozedmě plic, akutní a chronické sinusítidě, a rovněž k rýmě.

Plicní sekrece osob majících takovéto nemoci jsou komplexní látky, které zahrnují hlenové glykoproteiny, mucopolysacharidy, proteázy, aktin a

DNA. Některé z těchto látek v plicních sekrecích jsou uvolňovány z leukocytů (neutrofilů), které infiltrují plicní tkáň jako odpověď na přítomnost mikrobů (např. kmenů Pseudomonas, Pneuniococcus nebo Staphylokokových bakterií) '4 • ·· ' · β · ·· ···· ···· ·· · nebo jiných dráždidel (např. cigaretového kouře a pylu). Leukocyty mohou degenerovat a uvolňovat svůj obsah v průběhu reagování s takovýmito mikroby nebo dráždidly, což přispívá k viskoelaslicitě plicních sekrecí.

Schopnost DNázy I redukovat viskoelasťitidu plicních sekrecí je přičítána její enzymové degradaci velkého množství DNA uvolněného neutrophily. Shak, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Aitken, et. al., J. Am.

Med. Assoc. 267:1943-1951 (1992).

Nedávno byl navržen jiný mechanismus pro mukolytický efekt DNázy I zahrnující disagregaci aktiriu. Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994). Aktin je jedním z nejvíce obsažených bílkovin v eukaryotních buňkách (například aktin zahrnuje přibližně 10% všech bílkovin v leukocytech) a byl rozsáhle studován. Kabsch, et. al., Ann. Rev. Biophys,

Biomol. Struct. 21:49-76 (1992); Sheterline, et. al., Prot. Profile 1:1-121 (1994). Aktin existuje ve dvou formách, mono měrní formě (G-aktin) a filamentní formě (F-aktin), který je složen z monomerů G-aktínu Polymerní filamenty aktinu jsou vysoce viskoelastické a významně přispívají k viskozitě plicních sekrecí. Mornet, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 81:3680-3684 (1984); Newman, et. al., Biochemistry 24:1 538-1544 (1985); Jamney, et. al.,

Biochemistry 27:8218-8226 (1988); Vasconcellos, et. al., Science 263:969971 (1994).

Protože je známo, že se DNáza I váže na aktin ( Lazarides, et. al,, Proč.

Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Kabsch, et. al,, Nátuře 347:37-44 (1990)) a depolymeruje aktinové filamenty (stejně tak inhibuje polymeraci Gaktinu do filamentů) (Mannherz, et. al., FEBS Lett. 60:34-38 (1975);

Hitchcock, et. al., Gel! 7:531-542 (1976); Pinder, et. al., Biochemistry 21:4886-4890 (1982); Weber, et. al., Biochemistry 33:.,4780-4786 (1994)), předpokládá se, že mukolytický efekt Dnázy I na sputum a jiné plicní sekrece je způsoben disagregaci aktinu (depoiymerací) spíše než hydrolýzou DNA. Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994). V souladu s tímto pohledem je známo, zeje DNA-hydrolytická aktivita Dnázy I v přítomnosti aktinu inhibována. Lazarides, et. al.. Proč. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Mannherz, et. al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Také v souladu s tímto pohleděni bylo oznámeno, že bílkoviny inhibující aktin (např. gelsolin) jsou účinné při snižování viskoelasticity sputa při cystické fibróze. Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994), Stossel, et. al.,_______

PCT Patent Puhlication No. WO 94/22465 (publikováno 13.říjen 1994).

Předložený vynález je založen z části na výzkumu vynálezců, který měl určit biochemický základ mukolytické aktivity DNázy I. Tento výzkum zahrnoval navržení a syntézu různých variant lids DNázy I a testování těchto variant na stanovení jejich schopnosti hydrolyzovat DNA, vázat aktin a redukovat viskoelasticitu sputa in vitro.

Vynálezci vytvořili několik tříd variant lidské DNázy I, Jedna třída variant (varianty rezistentní k aktinu) měly sníženou schopnost vázat aktin, ale stále měly mukolytickou aktivitu a v některých případech měly tuto mukolytickou aktivitu zvýšenou ve srovnání s přirozenou DNázou I . Tyto varianty rezistentní k aktinu mají přibližně stejnou hydrolytickou aktivitu štěpení DN A jako přirozená DNáza I, ale tato aktivita je méně citlivá na inhibici aktinem. Druhá třída variant váže aktin s afinitou podobnou té .nalezeně u přirozené DNázy I, ale má sníženou mukolytickou aktivitu a

···· ···· · · · sníženou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA ve srovnání s přirozenou DNázou I.

Tyto výsledky ukazují, že terapeutická působivost lidské DNázy při redukování viskoelastieity plicních sekrecí je způsobena její katalytickou, hydrolytickou aktivitou štěpeni DNA spíše než její schopností depolymerovat filamentní aktin. Varianty lidké DNázy I, které vážou aktin s nižší afinitou než přirozená lidská DNáza I, ale které mají stále hydrolytickou aktivitu štěpení DNA, by podle přechozího měly být prospěšným terapeutickým prostředkem, zvláště při léčení pacientů majících plicní sekrece, které obsahují relativně vysoké množství akt inu. Protože takové varianty mají sníženou afinitu k aktinu, jejich hydrolytická aktivita štěpení DNA je méně inhibována v přítomnosti aktinu a tak mají tyto varianty v přítomnosti aktinu větší mukolytickou aktivitu ve srovnání s přirozenou lidskou DNázou I.

Po d stát a vynálezu

Předmětem předloženého vynalezu je poskytnout variantu lidské DNázy 1, která má stále hydrolytickou aktivitu štěpení DNA, ale váže aktin s menší afinitou než přirozená lidská DNáza I.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout nukleové kyseliny kódující takovéto na aktin rezistentní varianty lidské DNázy Ϊ, rekombinantní vektory obsahující takovéto nukleové kyseliny, rekombinantní hostitelské buňky transformované těmito nukleovými kyselinami nebo vektory a postupy na výrobu variant lidské DNázy I pomocí technologie rekombinantní DNA,

Tento vynález také vede k farmaceutickým prostředkům obsahujícím na b' aktin rezistentní varianty lidské DNázy I.

Tento vynález také vede k metodě umožňující snížení viskoelastieity nebo viskózní hustoty látky obsahující DNA u pacienta, což zahrnuje podávání terapeuticky účinné dávky na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I pacientovi.

Tento vynález zvláště vede k metodě léčení pacientů majících nemoci jako jsou cystická fíbróza, chronická bronchitida, zápal plic, bronchiectasitida, rozedma plic, astma a nebo systemický lupus erythematosus, což zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství na aktin rezistentní varianty lidské DNázy 1 pacientovi.

Tento vynález také vede k používání na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I při diagnostických zkouškách vizózní látky (např, sputa) získané od pacienta in vitro, k měření množství přítomného aktinu a k stanovení, zda je pacient vhodný kandidát na léčení na akt in rezistentní variantou lidské DNázy 1

Tyto a jiné předměty vynálezu budou zřejmé běžnému odborníkovi se zřetelem na specifikace jako celek.

Přehled obrázků na výkrese

Obr. 1 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci přirozené lidské DNázy 1 (SEKV. ID. Č: 1). Čísla ukazují pořadí aminokyselinových zbytků Uvnitř sekvence.

Obr. 2 znázorňuje relativní specifickou aktivitu přirozené lidské DNázy a variant. Poloúsečka chyby vyznačuje standardní odchylku (n-zatíženou).

• · · • · ·

Relativní specifická aktivita Pulmozyme® lidská DNáza I (Genentech, lne., South San Francisco, California US A) je definována jako 1,0. Relativní specifická aktivita přirozené lidské DNázy I je větší než u Pulmozyme® vlivem přítomnosti deami no váné formy lidské DNázy Iv Pulmozyme®, která má sníženou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA (Frenz, et. al., PCT Patent Publication No. WO93/25670, publikováno 23. prosince 1993).

Obr. 3 znázorňuje hydrolytickou aktivitu štěpení DNA přirozené lidské DNázy I a variant lidské DNázy I š jednotlivými záměnami zbytků v přítomnosti aktinu jak byla stanovena ve zkoušce hyperchromacity.

“Procenta aktivity” jsou procenta hydrolytické aktivity štěpení DNA DNázy I (přirozená nebo variantní) vypočítaná jak je popsáno v Příkladu 3; hydrolytická aktivita štěpení DNA DNázou I v nepřítomnosti aktinu je definována jako 100 procent aktivity. Poloúsečka chyby vyznačuje standardní Odchylku.

Obr. 4 znázorňuje hydrolytickou aktivitu štěpení DNA přirozené lidské DNázy I a variant lidské DNázy 1 s několika záměnami zbytků v přítomnosti aktinu, jak bylo stanoveno ve zkoušce hyperchromacity nebo zkoušce na methylovou zeleň. “Procenta aktivity” jsou procenta hydrolytické aktivity štěpení DNA DNázy 1 (přirozené nebo variantní) vypočítaná jak je popsáno v Příkladu 3; hydrolytická aktivita štěpení DNA DNázou I v nepřítomnosti aktinu je definována jako 100 procent aktivity. Poloúsečka chyby vyznačuje standardní odchylku.

Obr. 5 znázorňuje relativní vazebnou afinitu variant lidské DNázy I k aktinu jak bylo stanoveno ve zkoušce ELIS A na vázání aktinu (jak je popsáno v Příkladu 3). Hodnota ECso je koncentrace DNázy I (přirozené nebo variantní), které je zapotřebí k získání polovičního signálu proti maximu ve zkoušce. Poloúsečka chyby vyznačuje standardní odchylku. Hodnoty EC$o pro Pulmozyme® a přirozenou lidskou DNázu jsou 72 + 21 pM (n - 21) a 85 ± 14 pM (n = 14). Relativní vazebná afinita znázorněná na obrázku je hodnota ECso stanovená pro variantu lidské DNázy I vydělená hodnotou ECso stanovenou pro přirozenou lidskou DNázu. Varianty, u kterých bylá hodnota EG50 větší něž bylo možno měřit ve zkoušce, jsou uvedeny jako >35, >350, >1750, >3500, >35000.

Obr 6. Znázorňuje mukolytickou aktivitu přirozené lidské DNázy I a -váriaútJjjd^k4é-Ďííázy~I--ve-vzor-cích-spufaro4-pacicntů-s-cys44ckeu-fíbrožóU5-j-afc bylo stanoveno zkouškou kompaktnosti. Poloúsečka chyby vyznačuje Standardní průměrnou chybu.

Obr. 7 znázorňuje schematickou ukázku zkoušky ELIS A na vázání aktinu popsanou v Příkladu 3. ' ’

Jak je zde uváděno, pojmy “lidská DNáza I”, “přirozená lidská DNáza I” a “divoký typ lidské DNázy I” se vztahuji na polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci lidské přirozené DNázy I uvedené dále na Obr. 1.

“Varianta” nebo “varianta aminokyselinové Sekvence” lidské DNázy I je polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence přirozené lidské DNázy I. Obecně bude mít varianta nejméně z 80% totožnou sekvenci (homologii), spíše však nejméně z 95% totožnou sekvenci a nejspíše nejméně z 95% totožnou sekvenci s přirozenou lidskou DNázou I. Procento sekvenční identity je určeno např. v Flinch, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 80:1 382-1 386 (1983), verze algoritmu je popsána v Needleman, et. al., 3.

• · ·· ·

Mol. Biol. 48:443-453 (1970), po seřazení sekvencí k poskytnutí maximální homologie.

Pojmy “na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I”, “na aktin rezistentní varianta” se vztahují na variantu přirozené lidské DNázy 1, která má (1) hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a (2) sníženou vazebnou afinitu k akt i nu.

“ Hydrolytická aktivita štěpení DNA” se vztahuje na enzymovou aktivitu přirozené lidské DNázy I nebo varianty lidské DNázy 1 při hydrolýze (štěpení) substrátové DNA 5-fosforylovanými oligonukleotidy jako konečnými produkty. Hydrolytická aktivita štěpení DNA je přímo stanovena některou z různých metod známou ve světě, včetně analytické elektroforézy v akrylamidovém nebo agarózovém gelu , zkoušky hyperehromicity (Kunitz,

J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)) nebo zkouškou na methylovou zelen (Kurnick, Arch. Biochem. 29:4153 (1950); Sinicropi, et. al., Anal. Biochem. 222:351-3 58 (1994)).

“Vazebná afinita” na aktin přirozené lidské DNázy 1 nebo na aktin rezistentní varianty lidské DNázy 1 se vztahuje na schopnost DNázy I nekovalentně vázat aktin. Vazebná afinita může být stanovena některou z různých metod známou ve světě, například, jak je to popsáno v Mannherz, et. al., Rur. J. Biochem. 104:367-379 (1980); Jinak jsou relativní vazebné afinity různých DNáz (např. přirozené lidské DNázy I a jejích variant) stanoveny měřením vazby DNáz k imobilizo vánému aktinu ve zkoušce ELIS A (popsáno ve zkoušce 3) nebo porovnáním hydrolytické aktivity štěpeni DNA DNáz v přítomnosti a nepřítomnosti aktinu (popsáno také ve zkoušce 3). Metody popsané v Příkladech jsou zvláště vhodné pro testování variant lidské DNázy 1 za účelem rychle identifikovat takové varianty, které mají sníženou vazebnou afinitu k aktinu.

Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I mající “sníženou vazebnou afinitu k aktinu” je ta, která má vazebnou afinitu k aktinu relativně menší než je afinita, kterou se přirozená lidská DNáza I váže k aktinu, stanoveno za srovnatelných podmínek. Jestliže je zkouška ELIS A na vazbu k aktinu použita ke stanovení vazebné afinity lidské DNázy (přirozené nebo variantní) k aktinu jak je popsáno v Příkladu 3, pak bude na aktin rezistentní varianta mající “sníženou vazebnou afinitu k aktinu” tou, která má hodnotu ECjo větší než má přirozená lidská DNáza 1. Při této zkoušce bude mít na aktin rezistentní varianta hodnotu EC50 typicky pětkrát až 100-krát větší než má přirozená lidská DNáza I; ale na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I mající hodnotu EC50 více nž 500-krát větší větší než má přirozená lidská DNáza 1 jsou také přímo produkovány, zvláště změnou několika aminokyselinových zbytků v aminokyselinové sekvenci přirozené lidské DNázy I (viz např. Obr.

“Mukolytická aktivita” se vztahuje na redukci viskoelasticity (viskozity) sputa nebo jiného biologického materiálů, například jak bylo pozorováno při působení přirozenou lidskou DNázou I nebo variantou lidské

DNázy I na tento materiál. Mukolytická aktivita je přímo stanovena některou z různých metod známých ve světě, včetně zkoušky kompaktnosti sputa (PCT

Patent Publication No. WO 94/10567, publikováno 11. května 1994), zkoušky používající torzní kyvadlo (Jamney, J. Biochem. Biophys. Methods 22:41-53 (1991) nebo jiných rheologických metodologií.

·· · ·· ·

X ··········· o ······ · ··· ·· ··· ·· ·· “Polymerázová řetězová reakce” neboli “PCR” se obecně vztahuje na metody určené k pomnožení žádané nukleotidové sekvence in vitro, jak je to popsáno např. v U.S. Pat. No. 4683195. Obecně metoda PCR zahrnuje opakované cykly extenze příměrové syntézy s použitím oligonukleotidových primerů schopných hybridizovat přednostně s templátovou nukleovou kyselinou.

“Buňka”, “hostitelská buňka”, “buněčná linie” a “buněčná kultura” jsou používány zaměnitelně všude a všechny tyto pojmy by měly být chápány s tím, že obsahují genetickou výbavu, jejíž výsledkem je růst a kultivace buňky. “Transformace’’ a “transfekce” jsou používány zaměnitelně aby se vztahovaly na proces vnesení DNA do buňky.

“Funkčně spojeno” se vztahuje na kovalentní spojování dvou nebo více sekvencí DNA prostřednictvím enzymové ligace nebo jinak v konfiguraci navzájem takové, že normální funkce sekvencí může být zachována. Například je DNA pro presekvěnci nebo sekreční vedoucí úsek funkčně spojena k DNA pro póly peptid, jestliže je exprimována jako preprotein který participuje na sekreci póly peptidu; promotor nebo zesilovač je funkčně spojen ke kódující sekvenci, jestliže ovlivňuje transkripci této sekvence, nebo ribozomální vazebné místo je funkčně spojeno s kódující sekvencí, jestliže je umístěno tak, že usnadňuje translaci. Obecně “funkčně spojeno” zmanená, že sekvence DNA, které jsou spojovány, jsou nepřerušené a v případě sekreěníhp vedoucího úseku nepřerušené ve čtecí fázi Spojování je prováděno ligací ve vhodném restrikčním miste. Jestliže taková místa neexistují, pak jsou používány syntetické oligonukleotidové adaptory nebo linkery ve shodě se standardními metodami rekombinantní DNA.

Aminokyseliny jsou zde uvedeny tří pí směnovým nebo

jednc	>písm	enovým označením, jak j(	ί uvedeno níže:
Asp Thr	D T	aspartic acid threonine	Ile I Leu L	isoleucine leucine
Ser Glu Pro Gly Ala	S E P G A	serine g 1 u ta m o v á k y se lina pro lín glycin alanin	Tyr T Phe F His H Lys K Arg R	tyrosine phenylalanin histidin lysin arginin
Cys Val	C V	cystein valin	Trp W Gin Q	tryptophan glutamin
Met	M	methionin	Asn A	asparagin

·> Selekce na aktin rezistentních variant: předložený vynález je založen na studii struktury, aktin vázajících vlastností, hydrolytické aktivitě štěpení DNA a mukolytické aktivitě variant aminokyselinové sekvence lidské DNázy

1. Na aktin rezistentní varianty v předloženém vynálezu hydrolytickou aktivitu štěpení DNA, ale vážou aktin s menší afinitou než přirozená lidská DNáza I Redukce vázání aktinu je přednostně dosaženo vytvořením mutací v místě anebo v okolí těch aminokyselinových zbytků uvnitř přirozené lidské DNázy I, které ovlivňují bázání aktinu, které zahrnují například zbytky přirozené lidské DNázy I Glu 13, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52 Asp53, Asn56, Tyr65, Val67, Glu69, a Alal 14 (čísla následující třípísmenové • ·· · 99 999999 ·· 9 · ···· ·· · • · ·· · · 9 9 9999

999 999 99

999 99 999 99 99 9 označení uvádějí specifické umístění aminokyselinových zbytků uvnitř sekvence na Obr. 1).

Existuje mnoho způsobů jak vytvořit na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I. V jednom provedení tohoto vynálezu je na aktin rezistentní varianta připravena zavedením jak jednotlivých tak několika aminokyselinovýeh substitucí, insercí anebo delecí v místě nebo v okolí místa (např. uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) těch aminokyselinových zbytků přirozené lidské DNázy 1, které mají vliv na vazbu k aktinu. Některé ilustrativní příklady takových mutací jsou uvedeny následovně: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, E69R, D53R:Y65A, D53R.E69R, II44A:D53R:Y65A, H44A:Y65A:E69R (viz Obr. 2-6).

V jiném provedení tohoto vynálezu je na aktin rezistentní varianta připravena zavedením mutace nebo mutací, které vytvářejí nové glykosilační místo v místě nebo v okolí místa (např. uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) aminokyselinových zbytků přirozeně lidské DNázy I, které mají vliv na vázání aktinu Například je cílená mutageneze použita k zavedení jedné ze tří peptidových sekvencí, asparagin-X-serin nebo asparagin-X-threonin (kde X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou průlinu), což jsou rozeznávací sekvence pro enzymové připojení karbohydrátové jednotky k asparaginovému postrannímu řetězci. Creighton, Proteins, pp. 7678 (W. H. Freeman, 1984). Sterická překážka vyskytující se mezi karbohydrátovou jednotkou výslední A-glykosilované varianty DNázy a aktinem může snížit nebo zabránit vázání aktinu a v důsledku toho způsobit inhibici hydrolytické aktivity štěpení DNA v porovnání s přirozenou lidskou DNázou I Některé ilustrativní příklady takových mutací zavádějících nové glykosilační místo jsou uvedeny následovně: H44N, D58S, D58T, H64NV66T, H64N:V66S, V67N:E69S, V67N:E69T.

Je také možné přirozeně se vyskytující glykosilační místo v pozici 18 anebo 106 uvnitř aminokyselinové sekvence přirozené lidské DNázy 1 deletovat v závislosti na rozsahu glykosilace, ke které dochází při vytvoření nového glykosilačního místa mutací.

V dalším provedení tohoto vynálezu je použita cílená mutageneze k zavedení zbytků v místě nebo v okolí místa (např, uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) těch aminokyselinových zbytků přirozené lidské DNázy 1, které mají vliv na vázání aktinu, které jsou vhodné k posttranslační modifikaci jak biologicky tak chemicky (viz níže). Means, et. al., Chemical , Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer, et. al., Chemical

Modification of Proteins: Seíected Methods and Analytical Procedures • (Elsevier, 1975); . Creighton, Proteins, pp. 70-87 (W. HFreeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Takové to posttranslační modifikace mohou zavést stérickou překážku nebo znčněné elektrostatické vlastnosti do DNázy I, což sníží nebo zabrání vázání aktinu aktinu a v důsledku toho způsobit inhibici hydrolytické aktivity Štěpení DNA v porovnání s přirozenou lidskou DNázou I. Například může být cysteinový zbytek zaveden v místě nebo v okolí místa nějakého zbytku přirozené lidské DNázy I, které má vliv na vázání aktinu. Volný thiol cysteinového zbytku může tvořit intermolekulární disulfidovou vazbu s jinou takovou variantou DNázy I a vytvořit tak DNázový dimer nebo může být modifikován, například al kal izačním činidlem specifickým na thiol. Některé ·· · • · · ilustrativní příklady takových mutací jsou uvedeny následovně: H44C, L45C,

V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E69C, Al 14C.

Je obyčejně výhodné vytvářet substituce, inserce anebo delece v aminokyselinové sekvenci přirozené lidské DNázy 1 zavedením mutací do příslušné nukleotidové sekvence DNA kódující přirozenou lidskou DNázou I, například cílenou mutagenezí. Exprese mutované DNA má pak za následek produkci varianty lidské DNázy I mající žádanou (nepřirozenou) aminokyselinovou sekvenci.

I když může být k provedení cílené mutageneze použita jakákoliv známá technika, např. jak je to uvedeno v Sambrook, et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Sprig Harbor Laboratory Press, New York (1989)), cílená mutageneze pomocí oligonukleotidů je preferovanou metodou na přípravu variant lidské DNázy I uvedenou v tomto vynálezu. Tato metoda, která je velmi dobře známa (Zoller, et. al., Meth. Enz. 100:4668-500 (1983); Zoller, et. al., Meth. Enz. 154:3293 50 (1987); Carter, Met. Enz. 154:382-403 (1987); Kunkel, et al , Meth. Enz.

54:367-382 (1987); Horwitz, et. al., Meth. Enz. 185:599-6] 1 (1990)), je zvláště vhodná pro vytváření substitučních variant, ačkoliv může být použita i pro snadnou přípravu delečních a inserčních variant.

Technika cílené mutageneze využívá typicky fágového vektoru, který existuje ve dvou formách, jak jednovláknové tak dvouvláknové. Typické vektory užitečné pro cílenou mutagenezi jsou vektory jako fág Μ13 a piazmidové vektory, které obsahují jednovláknový fágový počátek replikace (Messing, et. al., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1983); Veira et. al., Meth. Enzymol. 153:3-1 1 (1987); Short, et. al., Nucl. Acids. Res. 16:7583-7600 (1988)). Výsledkem replikace těchto vektorů ve vhodných hostitelských buňkách je syntéza jednovláknové DNA, která může být použita k cílené mutagenezi.

Krátce popsáno, při provádění cílené mutageneze DNA kódující přirozenou lidskou DNazu 1 (nebo její variantů) je DNA pozměněna nejprve hybridizací oligonukleotidů kódujícího žádanou mutaci k jednotlivému vláknu DNA. Po hybridizací je použita DNA polymeráza aby syntetizovala celé druhé vlákno s využitím hybridizovaného oligonukleotidů jako primerů a vlákna DNA jako templátu. Tímto způsobem je oligonukleotid kódující žádanou ____mutaci začleněn do výsledné dvouvláknové DNA. _______

Oligonukleotidy používané jako hybridizační próby nebo primery mohou být připraveny některou vhodnou metodou jako je purifikace přirozeně se vyskytující se DNA nebo syntéza in vitro. Například jsou Oligonukleotidy syntetizévány přímo s využitím různých technik organické chemie, jak je to „ •5 popsáno v Narang, et. al., Meth. Enzymol. 68:90-98 (1979); Brown, et. al.,

Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); Caruthers, et. al., Meth.

Enzymol. 1 54:.287-3 13 (1985). Obecný přístup k výběru vhodné hybridizační próby nebo primerů je dobře znám. Keller, et. al., DNA Probes, pp. 11-1 8 (Stockton Press (1989). Hybridizační próby nebo primery typicky obsahují 10-25 nebo více nukleotidů a zahrnují nejnénč 5 nukleotidů na každé straně sekvence kódující žádanou mutaci aby se tak zajistilo, že oligonukleotid bude hybridizovat preferenčně v žádaném místě k jednovláknové templátové molekule DNA.

Ovšem cílená mutageneze může být použita k zavedení několika substitučních, inserčních nebo delečních mutací do výchozí DNA. Jestliže • ·· · ·· ·· ···· ·· · · ·· · · · · · _ ··· ······ ········ ··· · ··· · · · ·· ··· ·· ··· ·· ·· · jsou místa, která mají být mutována, umístěna blízko sebe, mutace mohou být zavedeny současně použitím jediného oligonukleotidu, který kóduje všechny žádané mutace. Jestliže jsou však místa, která mají být mutována, umístěna od sebe v jisté vzdálenosti (odděleny více než přibližně 10 nukleotidy), je obtížnější vytvořit jediný oligonukleotid, který kóduje všechny požadované změny. Místo toho může být využita jedna ze dvou alternativních metod.

V první metodě je vytvořen oddělený oligonukleotid pro každou z požadovaných mutací. Oligonukleotidy jsou potom hybridizovány k j ed no vláknové templ átové DNA současně a druhé vlákno DNA, které je syntetizéváno podle templátu bude kódovat všechny požadované aminokyselinové substituce.

Tato alternativní metoda zahrnuje dvě nebo více kol mutageneze aby vyprodukovala požadovanou variantu. První kolo je Stejné, jak bylo popsáno pro zavedeni jediné mutace. Druhé kolo mutageneze využívá mutovanou DNA vytvořenou v prvním kole mutageneze jako templátu. Tento templát už obsahuje jednu nebo více mutací. Oligonukleotid kódující další požadovanou aminokyselinovou substituci (substituce) je hybridizován k tomuto templátu a výsledné vlákno DNA nyní kóduje mutace jak z prvního kola tak ze druhého kola mutageneze. Tato výsledná DNA může být použita jako templát ve třetím kole mutageneze a tak dále.

PCR mutageneze (Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academie Press, 1990); Vallete, et. al., Nucl. Acids. Res. 17: 723-733 (1989) je také vhodná pro vytvoření variant lidské DNázy I. Krátce popsáno, když jsou malá množství templátové DNA použitá jako výchozí materiál v PCR, primery, které se liší málo v sekvenci odpovídající oblasti v templátové DNA, mohou být použity k vytvoření relativně velkých množství specifických fragmentů DNA, které se liší od templátové sekvence pouze v místech, kde se primery liší od templátu. K zavedení mutace do plazmidové DNA obsahuje například jedna ze sekvencí primeru požadovanou mutaci a je navržena tak aby hybridizovala k jednomu vláknu plazmidové DNA v místě mutace; sekvence druhého primeru musí být shodná s nukleotidovou sekvencí uvnitř opačného vlákna plazmidové DNA, ale tato sekvence může být umístěna kdekoliv podél plazmidové DNA. Je však výhodné aby sekvence druhého primeru byla umístěna ne více než 200 nukleotidů od té první tak, že celá amplifikovaná oblast DNA Vázaná primery může být nakonec snadno sekveneována.

Výsledkem PCR amplifikace využívající pár primerů podobný tomu, který byl právě popsán, je populace fragmentů DNA, která se liší v místě mutace specifikované primerem a eventuálně v jiných místech, protože kopírování — „ t empl átu je poněkud náchylné na tvorbu chyb. Wagner, et. al., PCR Topics, pp. 69-71 (Springer-Verlag, 1991).

Jestliže je poměr templátu k vyprodukované amplifikované DNA extrémně nizký, většina vyprodukovaných fragmentů DNA do sebe začlení požadovanou mutaci. Tato vyprodukovaná DNA je použita k náhradě odpovídající oblasti v plazmidu, který slouží jako templát PCR pomoci standardních metod rekombinantní DNA. Mutace na odlišných místech mohou být zavedeny současně jak pomocí mutantního druhého primeru nebo provedením druhé PCR s jiným mutantním primerem a pomoci ligace těchto dvou výsledných fragmentů PCR současně k plazmidovému fragmentu ve tří (nebo více) členné ligaci.

• ·· · ·· • ♦ · · ···* · · · ··· ··· · · · ·· ····

Jiná metoda sloužící k přípravě variant, kazetová mutageneze, je založena na technice popsané v Wells, et. al., Gene, 34:315-323 (1985). Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor) obsahující sekvenci DNA, která má být mutována. Kodon ve výchozí DNA, který má být mutován, je identifikovám. Na obou stranách identifikovaného místa mutace musí být unikátní místo pro štěpení restrikční endonukleázou. Jestliže žádná taková restrikční místa neexistují, mohou být vytvořena pomocí výše popsané metody mutageneze prostřednictvím oligonukleotidu a zavedeny v příslušných místech v DNA. Plazmidová DNA je v těchto místech štěpena a linearizuje se. Dvouvláknový oligonukleotid kódující Sekvenci DNA mezi restrikční mi místy, ale obsahující požadovanou mutaci, je syntetizován pomocí standardních postupů, v kterých jsou tyto dvě vlákna oligonukleotidu syntetizována odděleně a potom hybridizována společně pomocí standardních technik. Tento dvouvláknový oligonukleotid se označuje jako kazeta. Táto kazeta je navržena tak aby měla 5'a 3' konce kompatibilní s konci linearizovaneho plazmidu tak, že tato může být přímo ligována do plazmidu. Výsledný plazmid obsahuje mutovanou sekvenci DNA.

Přítomnost mutace (mutací) v DNA je stanovena metodami dobře známými ve světě, jako jsou restrikční mapování a nebo sek věncování DNA. Preferovaná metoda sek věncování DNA je dideoxy řetězová terminační -metoda podle Sángera, Sanger, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 72:39183921 (1979).

DNA kódující variantu lidské DNázy 1 je vnesena do vektoru schopného replikace za účelem pozdějšího klonování nebo exprese. “Vektory“ jsou plazmidy a jiné molekuly DNA, které jsou schopné replikace uvnitř hostitelské buňky a jako takové jsou užitečné k výkonu dvou funkcí ve spojení s kompatibilními hostitelskými buňkami (vektor-hostitelský systém). Jednou funkcí je usnadnit klonování nukleové kyseliny, která kóduje variantu lidské DNázy I, tj. vyprodukovat využitelná množství nukleové kyseliny. Druhou funkcí je vést expresi varianty lidské DNázy 1. Jedna nebo obě tyto funkce vykonávány prostřednictvím vektoru v příslušné hostitelské buňce používané pro klonování nebo expresi. Vektory budou obsahovat různé . komponenty v závislosti na funkci, kterou mají vykonávat.

Za účelem produkce varianty lidské DNázy Ϊ bude expresní vektor obsahovat DNA kódující tuto variantu, jak bylo popsáno výše, funkčně _ spojenou s promotorem a ribozomálním vazebným místem. Vatianta je potom přímo ex přímo vána v rekombinantní buněčné kultuře, nebo jako fůze s heterologním póly peptidem, přednostně se signální sekvencí nebo jiným polypeptidem maj ící m specifické místo štěpení v mí stě spojení mezi heterologním polypeptidem a variantou lidské DNázy I.

Prokaryonti (např. E. coli a jiné bakterie) jsou preferované hostitelské buňky pro počátční klonovací kroky tohoto vynálezu. Jsou zvláště užiteční na rychlou produkci velkých množství DNA na produkci jednovláknových templátů DNA používaných k cílené mutagenezi a na sekvencování DNA vytvořených variant. Prokaryontní hostitelské buňky mohou být také používány k expresi DNA kódující variantu lidské DNázy I. Polypeptidy, které jsou produkovány v prokaryontníchbuňkách budou vždy neglykosilované.

Dále mohou být varianty lidské DNázy I tohoto vynálezu exprimovány v eukaryontních hostitelských buňkách zahrnujících eukaryontní mikroby • ·· · ·· ·· ··«· ·· · · ·· · · · · · ··· · · · ·*· ·· · · · · ·· ···· • · · ··· · · • · · · · ··· · · ·· · (např. kvasinky) nebo buňkách odvozených od zvířat nebo jiných mnohobuněčných organizmů (např. křeččích ovariálních buněk a jiných savčích buňek) nebo v živých zvířatech (např. krávy, kozy, ovce).

Metodologie klonování a exprese jsou ve světě dobře známy. Příklady prokaryontních a eukaryontních hostitelských buňek, expresních vektorů vhodných k vyprodukování variant lidské DNázy I předloženého vynálezu jsou například ty, popsané v Shak, PCT Patent Publication No. WO 90/07572 (publikováno 12. července 1990).

Jestliže jsou používány jako hostitelé prokaryontní buňky nebo buňky, které obsahují silnější buněčnou stěnu, preferovanou metodou transfekce buňek s DNA je metoda působící kalciem, jak bylo popsáno v Cohen, et. al.,

Proč. Nat. Acad Sci. USA 69:2110-2114 (1972) nebo polyethylenglykolová metoda, Chung, et. al., Nue. Acids. Res. 16:3 580 (1988). Jestliže jsou jako hostitelské buňky použity kvasinky, transfekce je obecně prováděna pomocí polyethylenglykolu, jak bylo popsáno v Hinnen, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929-1933 (1978). Jestliže jsou jako hostitelské buňky použity savčí buňky, transfekce je obecně prováděna precipitační metodou pomocí kalcium fosfátu, Graham, et. al., Virology 52:546 (1978), Gorman, et. al., DNA and Protein. Eng. Tech 2:3-10 (1990). Avšak jiné známé metody sloužící k vnesení DNA do prokaraontních nebo eukaryontních buňek, jako jsou injekce do jádra, elektroporace nebo protoplastová fuze, jsou také vhodné k použiti v tomto vynálezu.

Zvláště užitečné v tomto vynálezu jsou expresní vektory, které zajišťují krátkodobou (tranzientní) expresi DNA kódující variantu lidské DNázy 1 v savčích buňkách. Tranzientní exprese obecně zahrnuje použití expresního vektoru, který je schopen účinpé replikace v hostitelské buňce tak, že hostitelská buňka hromadí mnoho kopií expresního vektoru a tak syntetizuje vysoká množství žádeného polypeptidu, který je kodován tímto expresním vektorem. Tranzientní expresní systémy obsahující vhodný expresní vektor a hostitelskéu buňku umožňují vyhovující pozitivní identifikace polypeptidů kódovaných klonovanými DNA, stejně tak umožňují rychlé testování těchto polypeptidů na žádané biologické nebo fyziologické vlastnosti. Wong, et. al., science 228:810-81 5 (1985), Lee, et. al., Proč Nat. Acad. Sci. USA 82:43604364 (1985); Yang, et. al., cell 47:3-10 (1986). Tranzientní expresní systémy jsou tak výhodně používány k exprimování DNA kódující varianty amimokyselinové sekvence přirozené lidské DNázy I ve spojení se zkouškou, která identifikuje tyto varianty, které váží aktin s nižší afinitou než přirozená varianta lidské DNázy 1, stejně jako zkoušky k měření těchto variant na hydrolytiekou aktivitu štěpení DNA. Varianta lidské DNázy I je přednostně sekretována z hostitelských buňek, v kterých je exprimována. V tomto případě je varianta získána z kultivačního media, v kterém jsou hostitelské buňky pěstovány. V tomto případě může být výhodné pěstovat buňky v kultivačním mediu bez séra, protože nepřítomnost sérových proteinů a jiných sérových komponent v mediu muže usnadnit purifikaci varianty. Jestliže nedochází k sekreci, potom je varianta lidské DNázy I získána z lyzátu hostitelských buňek. Když je varianta exprimována v hostitelské buňce jiné než lidského původu, varianta bude zcela bez proteinů lidského původu. V každém případě bude nezbytně vyčistit variantu od rekombinantních buňečných bílkovin aby se získaly velmi homogenní preparace varianty lidské DNázy I. Pro farmaceutická použití bude mít purifikovaná varianta přednostně více než

Φ· ··>· ·· ·

99% čistá (tj. jakákoliv jiná bílkovina bude obsahovat méně než 1% celkové bílkoviny v purifikovaném preparátu).

Obecně je purifikace varianty lidské DNázy I prováděna pomocí využití různých fyzikálněchemických vlastností varianty v porovnání s kontaminantami, s nimiž může být asociována. Například jako první krok je kultivační medium nebo lyzát hostitelské buňky centrifugován aby byly odstraněny hrubě buněčné zbytky. Varianta lidské DNázy I je posléze vyčištěna od kontaminujících rozpustných bílkovin a polypeptidů například amonium sulfátem nebo ethanolovým vysrážením, gelovou filtrací (molekulární vylučovací chromatografií), iontovou chromatografií, hydrofní chromatografií, imunoafinitní chromatografií (např. pomocí kolony obsahující protilátky proti variantě lidské DNázy I, kterě jsou připoutány k Sepharóze), kationtovou chromatografií (Frenz, et. al., PCT Patent Publication No. WO 93/25670, publikováno 23. prosince 1993), reverzní fázovou HPLC anebo gelovou elektroforézou.

Ovšem odborník uvítá, když budou purifikační metody, které slouží k purifikování přirozené lidské DNázy 1, vyžadovat některé modifikace, které jsou užitečné k purifikování varianty lidské DNázy I, jež jsou důsledkem strukturálních a jiných rozdílů mezi přirozenými a variantními bílkovinami. Například může být v některých hostitelských buňkách (zvláště bakteriálních hostitelských buňkách) varianta lidské DNázy I exprimována zpočátku v nerozpustné, agregované formě (odborně označované jako “refrakční těliska“ nebo “inkluzní tělíska“). V tomto případě bude nezbytné variantu lidské DNázy I rozpustit a renaturovat v průběhu její purifikace. Metody sloužící k rozpuštění a renaturování rekombinantních bílkovinných refrakčních tělísek jsou známy (viz např. Builder, et. al., U. S. Patent No. 451 1502).

V jiném provedení tohoto vynalezu jsou varianty lidské DNázy I připraveny vytvořením kpvalentnich modifikací přímo v přirozené nebo variantní bílkovině lidské DNázy i. Tyto modifikace jsou vytvořeny aby ovlivnily vázání aktinu nebo jinou vlastnost bílkoviny (např. stabilitu, biologický poločas rozpadu, imunogenicitu) a nohou být vytvořeny místo nebo ve spojení se substitučními, inserčními a delečními mutacemi v aminokyselinové sekvenci popsaných výše.

Kovalentní modifikace mohou být zavedeny reagováním cílených ^ajninokyselřno^výcli.zkyLků.purozenéneho-varjajitrLÍJidské„DNázy.l-s-_;-organickým derivatizačním činidlem, které je schopno reakce s vybranými aminokyselinovými postranními řetězci nebo N- nebo C-terminálními zbytky. Vhodná derivatizační činidla a metody jsou dobře známa.

Například cysteinýtové zbytky nejběžněji reagují s alfa-haloacetáty (a příslušnými aminy) jako je chloroacetova kyselina nebo chloroacetamid, které dávají karboxy methylové nebo karboxyamidomethylové deriváty.

Cysteinylové zbytky jsou také derivovány reakccí s bromotrifluoracetonem, alfa-bromo- beta-(5-imidozoyl)propionovou kyselinou, chloroacetylfosfátem, N-alkylmaleimidy, 3-nitro-2-pyridyldisulfidem, methyl 2- pyridyldisulfidem, p-chloromerkuribenzoátem, 2-chloromerkuri-4-nitrophenolem nebo chloro-7nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolem.

Histidylové zbytky jsou derivovány reakcí s diethylpropylkarbonátem při pH 5,5-7, protože toto činidlo je poměrně specifické na histidylový postranní řetězec. Para-bromophenylacyl bromid je také použitelný; reakce je přednostně prováděna v 0,1 M sodium kakodylátu při pH 6,0.

···· » · · » · »

999 · • · ·· · . .v·..?

Lysinylové a aminoterminální zbytky jsou zreagovány succinovou nebojinou karboxylovou kyselými anhydridy. Derivace těmito činidly má vliv na změnu náboje lysinylových zbytků. Jiná vhodná činidla na derivaci zbytků obsahujících alfa-amino-skupinu zahrnují imidoestery jako jsou methyl picolinimidát, pyridoxal ffosfát, pyrrridoxal, chloroborohydrid, trinitrobenzenfulfonová kyselina, O-methylisourea,, 2,4-pentandion a transaminázou kat alyzo váné reakce s gly oxy lat em.

Arginylové zbytky jsou modifikovány reakcí s jedním nebo několika konvenčními činidly mezi jinými phenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2cyklohexandion a ninhydrin. Derivace argininových zbytků vyžaduje aby _; byla reakce prováděna v alkalickém prostředí kvůli vysokému pil guanidinové funkční skupiny. Dále pak mohou táto činidla reagovat se skupinami lysinu stejně jako s argininovou epsilon-aminoskupinou.

Karboxylové postranní skupiny (aspartyl nebo glutamyl) jsou selektivně modifikovány reakcí s karbodiimidy (R'-N--C-N-R'), kde R a R'jsou různé alkylové skupiny jako jsou l-cyklohexyl-3-(2-morpholinyl-4ethyl)karbodiimid nebo 1 -ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl) karbodiimid. Dále jsou aspartylové a glutamylové zbytky převedeny na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amonnými ionty.

Kovalentní připojeni glykosidů k aminokyselinovým zbytkům bílkoviny může být použito na modifikaci nebo zvýšení počtu nebo profilu karbohydrátových substituentů, y vláště v místě nebo okolí místa těch zbytků, které se účastní vázání aktinu. V závislosti na použitém módu připojení může být připojen cukr (cukry) k (a) argininua histidinu, (b) volným karboxylovým skupinám, (c) volným sulfhydrylovým skupinám jako je cystein (d) volným hydroxylovým skupinám jako jsou serin, threonin nebo hydroxyprolin, (e) aromatickým skupinám jako jsou phenylalanin, tyrosin nebo tryptophan, nebo (f) amidové skupině gíutaminu. Vhodné metody jsou popsány např. v PCT Patent Publication No. WO 87/05330 (publikováno 11. září 1987) a v Aplin, et. al., CRC Crit Rev. Biochem., pp.259-306 (1981).

Kovalentní navázání činidel jako jsou polyethylenglykol (PEG) nebo lidský sérový albumin k variantám lidské ĎNázy I snižuje imunogenicitu anebo toxicitu varianty anebo prodlužuje její poločas rozpadu, jaj bylo pozorováno u jiných bílkovin. Abuchowski, et. al., J. Biol. Chem. 252:35823586 (1977); Poznaňský, et. al., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson, et. al., Biotechnology 8:343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenům Press, 1992). Dále pak může modifikace přirozené lidské DNázy I nebo její varianty těmito činidly v místě nebo v okolí mí sta (např. uvnitř přibližně pěti aminoky selinových zbytků) aminokyselinových zbytků, které ovlivňují vázání aktinu, vést k na aktin rezistentní variantě.

V dalším provedení může na aktin rezistentní varianta lidské DNázy 1 obsahovat mutaci ve zbytku Asn, který se vyskytuje v pozici 74 aminokyselinové sekvence přirozené lidské DNázy I (např. mutace N74D, N74K nebo N74S) aby snížila nebo zabránila deaminaci varianty DNázy I. Frenz, et. al., PCT Patent Publication No. WO 93/25670, publikováno 23. prosince 1993. V jiném příkladu může může na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I obsahovat mutaci v aminokyselinové sekvenci nebo jinou kovalentní modifikaci, která snižuje citlivost této varianty na na degradaci • · ·· · proteázami (např. neutrofilní elastázou), které mohou být přítomny ve sputu a jiných biologických látkách.

Hydrolytická aktivita štěpení DNA a vazebná afinita k aktinu vatiant lidské DNázy I připravených jak bylo popsáno výše jsou přímo stanovovány pomocí zkoušek a metod , které jsou známy a byly zde popsány. Jakákoliv tato varianta mající hydrolytickou aktivitu štěpeni DNA a sníženou vazebnou afinitu k aktinu (jak je definováno výše) je na aktin rezistentní varianta v rozsahu tohoto vynálezu.

Na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I tohoto vynálezu jsou používány ke snížení viskoelasticity materiálu obsahujícího DNA jako je sputum, hlen nebo jiné plicní sekrece. Tyto varianty jsou zvláště užitečné k léčení pacientů s plicními nemocemi, kteří mají abnormální viskózní nebo zahuštěné sekrece a stavy jako akutní nebo chronická průdušková plicní onemocnění zahrnující infekční zápal plic, bronchitidu nebo tracheobronchitidu, bronchiektázitidu, cystickou fibróžu, astma, tuberkulózu a plísnové infekce. Roztok nebo konečný rozdělený suchý přípravek na aktin rezistentní varianty je podáván obvyklým způsobem do dýchacích cest (např. průdušnic) nebo plic pacienta například v podobě aerosolu.

Na aktin rezistentní varianty jsou také užitečné pro přídatnou léčbu abscesů nebo závažných uzavřených infekcí při stavech jako empyém, meningitida, absces, peritonotida, sinusitida, otitida, periodontitida, perikarditida, pankreatitida, cholelithiatitida, andokarditida a septická arthritida, stejně jako při odborných léčbách u rozličných zánětlivých a infekčních poškozeních jako jsou infekční leze pokožky anebo mukózních membrán, chirurgických ran, vředových lézí a popáleninách. Na aktin rezistentní varianta může zlepšit účinnost antibiotik používaných při léčbě takovýchto infekcí (např. gentamicinová aktivita je značně snížena reverzibilní vazbou k intaktní DNA).

Přirozená lidská DNáza la na aktin rezistentní varianty mohou být také užitečné při léčbě systemické lupus erythematosis (SLE), život ohrožující autoimunní choroby charakterizované produkcí různorodých protilátek. DNA je hlavní antigenní složka imunitních kornplexů. V tomto případě může být lidská DNáza (přirozená nebo variantní) podávána pacientovi systematicky, například nitrožilně, podkožně, intratetikálně nebo intramuskulárnč.

__Přirozená lidská DNáza 1 a na aktin rezistentní varianty mohou být také užitečně při ochraně proti novému vývoji anebo aktivaci respiračních infekcí, které se mohou objevit u pacientů majících cystickou fibrózu, chronickou bronchitidu, astma, zápal plic nebo jiné plicní choroby nebo u pacientů = jej ichž dýchání j e u snad ňo váno ventilátorem -nebo jiným mechanickým přístrojem anebo jiných pacientů, kteří jsou v nebezpečí vývinu dýchacích infekcí, například pacientů v pooperačním stavu.

Na aktin rezistentní varianty mohou být vyráběny podle známých metod k přípravě terapeuticky účinných prostředků. Preferovaným terapeutickým prostředkem je roztok na aktin rezistentní varianty v pufrovanémnebo nepufrovaném vodném roztoku a nejlépe v izotonickém solném roztoku jako je 150 mM chlorid sodný obsahující 1,0 mM chlorid vápenatý při pH 7. Tyto roztoky jsou Zvláště přizpůsobivě při použití v komerčně dostupných rozprašovačích účinných k dávkování přímo do dýchacích cest nebo plic po šk o ze ne h o p a e i e n t a.

• ·

V dalším provedení obsahuje terapeutický prostředek suchý prášek na akt in rezistentní varianty přednostně připravený ve spreji vysušeného roztoku na aktin rezistentní varianty, jak to je popsáno v U. S: Patent Application Seriál No. 08/206020 (založeno 4. března 1994).

V dalším provedení obsahuje terapeutický prostředek buňky aktivně produkující na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I. Takové buňky mohou být přímo zaváděny do tkáně pacienta nebo mohou být uzavřeny do kapsulí s porézními membránami, které jsou implantovány pacientovi, ve všech případech za účelem dopravení na aktin rezistentní varianty do těch oblastí těla pacienta, které mají potřebu zvýšené koncentrace hydrolytické aktivity štěpení DNA. Například by mohly být transformovány pacientovy vlastní buňky, jak in vivo tak ex vivo, DNA kódující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I, a tak použity k produkci DNázy přímo uvnitř pacienta.

Terapeuticky účinné množství na aktin rezistentní varianty lidské DNázy 1 bude například záviset na množství DNA a aktinu v tkáni, která má být léčena, důvodech terapie, způsobu podávání a stavu pacienta. Pro terapeuta bude podle toho nezbytné upravit dávku a zvolit způsob podávání aby bylo dosaženo optimálního terapeutického efektu. Při pohledu na její sníženou vazebnou afinitu k aktinu a následovnou zvýšenou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA v přítomnosti aktinu v poměru k přirozené lidské DNáze I bude množství na aktin rezistentní varianty potřebné k dosažení terapeutického efektu nižší než množství přirozeně lidské DNázy I potřebné k dosažení toho samého efektu při stejných podmínkách. Obecně bude terapeuticky účinné množství na aktin rezistentní varianty dávka od přibližně 0,1 ug do přibližně 5 mg varianty na kilogram tělesné váhy pacienta a toto množství bude podáváno jako farmateutický prostředek tak, jak to zde bylo popsáno.

Na aktin rezistentní varianta DNázy I je příležitostně kombinována nebo podávána společně s jedním nebo více jiných farmaceutických prostředků používaných k léčbě stavů, které byly vyjmenovány výše, jako jsou antibiotika, bronchodilátory, protizánětlivé prostředky, mukolytika (např. n-acetyl-cystein), aktin vázající nebo aktin degradující bílkoviny (např. gelsolin; Matsudaira, et. al., Cell 54:139-140 (1988); Stossel, et. al., PCT Patent Publication No. WO 94/22465 (publikováno 13. října 1994)), inhibitory proteázy nebo produkty genové terapie (např. obsahující gen pro transmembránový regulátor vodivosti u cystické fibrózy (CFTR), Riordan, et. al., Science 245:1066-1073 (1989)).

Následující příklady jsou podány pouze ilustrativně a nejsou míněny jako omezující tento vynález jakýmkoliv způsobem. Všechny patentové a literární odkazy, které jsou zde citovány, jsou důsledně začleněny.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kmen E. coli CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, California USA) byl transformován plazmidem pRK.DNase.3 použitím metody Chung,et. al., (Nuel. Acids. Res 16:3 580 (1988). Plazmid pRK.DNase.3 použitý v • · ·

předloženém vynálezu je popsán v PCT Patent Publication No. WO 90/07572 (publikováno 12. července 1990) s výjimkou toho, že nukleotidová sekvence kódující lidskou DNázu 1 je taková jako na Obr. 1. Transformované buňky byly vysety na agarové misky s LB obsahující 50 ug/ml karbenicilínu a pěstovány přes noc při 37°C. Médium 5YT (5 ml) obsahující 50 ug/ml karbenicilínu a 10 ul pomocného fága VCSM13 (Stratagene, La Jola,

Cali fornia USA) bylo inokulováno jednotlivou kolonií z agarové misky a pěstováno třepáním přes noc při 37°C. Jednovláknová DNÁ byla izolována z této kultury a použita jeko templát pro následnou mutagenezi.

Cílená mutageneze byla provedena pomocí syntetických oligonukleotidů podle metody popsané v Kunkel, et. al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987). Mutagenní oligonukleotídy byly 21-mery nebo 24-mery mající 9 nebo 12 přesných shod baží ve směru od 5' k neshodujícímu se kodonu a 9 přesných shod baží ve směru od 3' k ne shoduj ící mu se kodonu. Po následné mutagenezi byla jedno vl ákno vá DNA z jednotlivých kl onu sek věncována metodou dideoxy (Sanger, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 72:3918-3921 (1979)). DNA mající variantní nukleotidové sekvence byly potom transformovány, jak to bylo popsáno výše, do kmene E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene). Po vysetí a izolaci jednotlivé kolonie stejně jako předešle byly jednotlivé kolonie použity k zaočkování 0,5 litru média LB obsahujícímu 50 ug/ml karbenicilínu. Po následném pěstováni třepáním přes noc při 37°C byly buňky stočeny centrifugací a varianta DNA (v expresním vektoru) byla purifikována pomocí kolonek Qiagen tip-500 (Qiagen lne., Chatsworth, California USA).

Obr. 2-6 identifikují různé varianty lidské DNázy I, které byly vytvořeny. Na těchto obrázcích a v příslušné specifikací je popis aminokyselinových substitučních mutací přítomných v variantě DNázy zkrácen do podoby prvního abecedního písmena, čísla a druhého abecedního písmena. První abecední písmeno je jednopísmenová zkratka aminokyselinového zbytku v přirozené (divoké) lidské DNáze I, číslo uvádí pozici tohoto zbytku v přirozené lidské DNáze I (číslování podle Obr. 1) a druhé abecední písmeno je jednopísmenová zkratka aminokyselinového zbytku ve variantní DNáze I. Například, ve variantě DNázy 1 mající mutaci D53R je zbytek asparagové kyseliny (D) v pozici 53 v přirozené lidské DNáze I nahrazen argininovým zbytkem (R). Několikanásobné mutace v jednotlivé různých mutací, které se vyskytují ve variantě. Například D53R Y65A uvádí, že varianta má mutaci D53R a mutaci Y65A.

Přikládá _

Exprese variant lidské DNázy 1: Lidské embryonální ledninné buňky 293 (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) byly pěstovány v médiích obsahujících sérum v 150 mm plastových Petriho miskách Buňky v logaritmické fázi růstu byly tranzientně kotransfekovány 22,5 ug purifikované variantní DNA (připravené jak je to uvedeno výše) a 17 ug adenovirové DNA pomocí kalcium fosfátové precipitační metody (Gorman, et. al., DNA and Protein Eng. Tech, 2:3-10 (1990)). Přibližně 16 hodin po transfekci byly buňky promyty 15 ml fosfátového pufrovaného fyziologického roztoku a médium bylo vyměněno za médium bez séra. Dva výtěžky napěstovaných buňek byly vybrány z každé '·

···· • · * · • · • · misky, první buď po 24 nebo 72 hodinách a druhý po 96 od výměny média bez séra. Celkově bylo tímto způsobem získáno přibližně 50 ml buněčného supernatantu, který obsahoval variantu DNázy I. Výtěžek supernatantu pocházejícího z každé misky byl zakoncentrován 5-krát až 50-krát pomocí koncentračních pomůcek Centripep 10 a koncentráty byly testovány na stanovení různých biochemických a biologických aktivit variant DNázy I.

Koncentrát obsahující přirozenou lidskou DNázu 1 byl připraven stejným postupem jak to bylo popsáno výše, s výjimkou toho, že buňky 293 byly tranzientně transfekovány plazmidem pRK.DNase.3.

Příklad 3

Biochemické a biologické aktivity variant lidské DNázy L I. Relativní specifická aktivita: Relativní specifická aktivita variant lidské DNázy I byla stanovena porovnáním aktivity variantní a přirozené DNázy I ve dvou různých zkouškách. Relativní specifická aktivita variant je zvláště definována jako koncentrace varianty (v ug/ml) stanovená ve zkoušce aktivity methylovou zelení (Sinicropi, et. al., Anal. Biochem. 222:3 51-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29:41 -53 (1950)) vydělená koncentrací varianty (v ug/ml) stanovené ve zkoušce ELIS A DNázy 1 (popsáno výše). V obou zkouškách aktivity methylovou zelení a zkoušce ELIS A DNázy I byly stanoveny standardní křivky pomocí Pulmozyme® lidské DNázy 1. Relativní specifická aktivita přirozené lidské DNázy 1 a variant je znázorněna na Obr. 2.

Zkouška aktivity methylovou zelení (Sinicropi, et. al., Anal, Biochem. 222:351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)) využívá barvivo methylovou zelen, která interkaluje do přibližně každých 10 baží v DNA, a výsledkem je zelený substrát. Protože DNA je štěpena DNázou 1, barvivo methylová zeleň je uvolňováno a oxidováno na bezbarvou formu. Tak je ztáta zelené barvy přímo úměrná množství DNázy I přidané do testovaného vzorku. Množství DNázy 1 přítomné ve zkoušce je potom vypočítáno porovnáním se standardní křivkou, které odpovídá známým množství DNázy I.

Zkouška ELIS A DNázy I zahrnuje pokryti mikrotitračních misek kozími polyklonálními protilátkami proti DNáze I, přidání vzorku,který má být testonán, a detekci jakékoliv výsledné navázané DNázy I na králičí polyklonální protilátky proti DNáze 1, která je konjugována s křenovou peroxidázu (HRP). Když jsou substrát HPR a činidlo na barevné vyvolání přidány, vyvolaná barva je úměrná množství DNázy I přítomné ve vzorku. Množství DNázy I přítomné ve zkoušce je potom vypočítáno srovnáním se standardní křivkou, které odpovídá známým množství DNázy 1.

V obou zkouškách bylo testováno mnoho naředěných vzorků a tyto hodnoty, které spadají do střední oblasti standardní křivky, byly zprůměrovány a byly vypočítány standardní odchylky.

Také koncentrace DNázy I tak, ják byla stanovena zkouškou ELIS A DNázy 1, byla použita ke standardizací koncentrací DNázy I při jiných zkouškách, při kterých byly varianty DNázy I charakterizovány (např. v zkoušce inhibice aktinem, popsané níže).

II Inhibice hydrolitické aktivity štěpení DNA aktinem: G-aktin (Kabseh, et. al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992)) byl připraven méně než 10 dní před použitím dializací roztoku o koncentraci 1 mg/ml komerčně dostupného preparátu aktinu (Sigma, St. Louis, Missouri •· 9··· • ·

USA) přes noc proti 5 mM HEPESu, pil 7,2, 0,2 mM CaCU, 0,5 mM ATP, 0,5 mM beta-merkaptoethenol při 4°C. Po centrifugaci při 13000 x g 5 min. bylo vypočítáno množství G-aktinu měřením absorbance při 290 nm; roztok o koncentraci 1 mg/ml má absorbanci 0,66 OD. Množství preparátu G-aktinu potřebně k značné (více než 50%) nikoli vsak celkové inhibici hydrolitické aktivity štěpení DNA přirozené lidské DNázy I bylo stanoveno v předběžných pokusech za stejných podmínek použitých pro každou zkoušku.

Citlivost na inhibici aktinem byla stanovena měřením hydrolytické aktivity štěpení DNA variant v přítomnosti nebo nepřítomnosti aktinu v každé ze dvou různých zkoušek, předešle popsané zkoušce na methylenovou zeleň a ve zkošce hyperchromicity, která je založena na zvýšení absorbance při 260 nm, když je DNA denaturována a depolymerována (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)). Procento inhibice vybrané varianty v těchto zkouškách je znázorněno v Obr. 3 a 4.

Při zkošce hyperchromicity byly koncentrované supernatanty z kultur (připravených jak bylo popsáno výše, obsahuj íce varianty DNázy I) inkubovány jak bez přidáni, tak s přidáním 2- až 3-násobného molárního přebytku aktinu v pufru A (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCU, 4 mM MgCb, 0,1% BSA) jednu hodinu při pokojové teplotě před přidáním do kyvety obsahující 40 ug DNA v celkovém objemu zkoušky 1,0 ml. Konečná koncentrace varianty DNázy I ^ve zkoušce byla přibližně 26 nM, jak bylo stanoveno zkouškou ELIS A DNázy I. Poměry hydrolýzy DNA variantami DNázy I v přítomnosti nebo nepřítomnosti aktinu byly měřeny. Procento aktivity znázorněné na Obr. 3 a 4 bylo vypočítáno stanovením poměru hydrolitické aktivity štěpení DNA lidské DNázy 1 (přirozené nebo variantní) v přítomnosti aktinu k její hydrolitické aktivitě v nepřítomnosti aktinu a vynárobením dosažené hodnoty 100.

Při zkoušce na m ethy léno vou zeleň byly byly koncentrované supernatanty z kultur (připravených jak bylo popsáno výše, obsahujíce varianty DNázy I) inkubovány jak bez přidání, tak s přidáním 1000-násobného molárního přebytku aktinu v pufru B (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCU, 4 mM MgClž, 0,1% BSA, 0,01% thimerosal a 0,05% Tween 20) 16 hodin při 37°C. Koncentrace aktivního enzymu byla v každém případě odhadnuta porovnáním se standardní křivkou Pulmozyme®. Procento aktivity” zůstávající variantě se vztahuje ke 100 nássobnérnu_poměrii aktivity v__ přítomnosti aktinu vzhledem k aktivitě v nepřítomnosti aktinu.

Jak je znázorněno na Obr 3 a 4, hydrolitická aktivitá štěpení DNA přirozené lidské DNázy I je podstatně snížená v přítomnosti aktinu. V porovnání s tímto byly různé jedno a více zbytkové varianty přirozené lidské DNázy 1 relativně rezistentní na inhibici aktinem, jak je vidět z toho, že mají větší hydrolitickou aktivitu štěpení DNA v přítomnosti aktinu než má přirozená lidská DNáza I.

III ELIS A vázající aktin: Zkouška založená na mikrotitru byla vyvinuta za účelem měření vázání přirozeně lidské DNázy I a variant DNázy I k imobilizovanému aktinu. Nejprve byly komůrky misky MaxiSorp (Nunc, lne., Naperville, Illinois USA) potaženy lidským globulinem GC (Calbiochem, La Jolla, california USA) v objemu 100 ul na komůrku, bílkovinou vázající aktin (Goldschmidt-ClermonL et. al. Biochem J. 228:471-477 (1985), Mcleod, et. al., J. Biol. Chem. 264:1260-1267 (1989), Houmeida, et. al., Eur. J. Biochem. 203:499-503 (1992) v koncentraci 10 ug/ml v 25 mM HEPES, pH 7,2, 4 mM ·· · ·· · ·· ···· «_Λ ········ ··· ry ······ · ··· ·» ··· ·· ··

MgClj, 4mMCaCl2, 16-24 hodin při 4°C. Po odstranění globulinu GC byla přebytečné reaktivní místa blokována přidáním pufru C (pufr C je stejný jako pufr B, viz výše, s přídavkem 0,5 mM adenosintrifosfátu; pufr C byl použit jako ředící ve všech následujících krocích, pokud nebude jinak uvedeno) a inkubovány v misce na třepačce 1-2 hodiny při pokojové teplotě. Každý inkubační krok, který následoval, probíhal při pokojové teplotě jednu hodinu na třepačce Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Vineland, New Yersey USA); mezi každým krokem byla miska vyprázdněna a 6-krátpromyta fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokem obsahujícím 0,05% Tween 20 s proplachovacím roztokem Microwash II (Skarton A/S, Norsko). Dále byl G-aktin připravený, jak je uvedeno výše, naředčn na koncentraci 50 ug/ml v pufru C a 100 ul bylo přidáno do každé komůrky; misky byly inkubovány a promyty a 100 ul různých naředění Pulmozyme® a buněčného média obsahujícího jak přirozenou lidskou DNázu I, tak jejích variant, byly přidány do komůrek a misky inkubovány a promyty. Nakonec bylo 100 ul naředění 1/25000 konjugátu králičí polyklonální protilátky proti lidské DNáze I a křenové peroxidázy (původní koncentrace zásobního roztoku byla 465 ug/ml) přidáno do každé komůrky. Po inkubaci a promytí byl vývoj zabarvení zahájen přidáním 100 ul činidla (Sigma Fast o-phenylendiamin a tablety močovina/HzPz rozpuštěné podle doporučení výrobce) do každé komůrky a zastaven přidáním 100 ul 4,5 N H2SO4 na misku. Absorbance při 492 nm byla zaznamenána a nakreslena proti koncentraci DNázy ne začátku přidané do komůrky. Sigmoi dální křivky byly výsledkem pro přirozenou lidskou DNázu I a ty varianty, které se vázaly k aktinu; tyto křivky byly shodné s čtyř parametrovou rovnicí pro nelineární regresivní analýzu (Makquardt, J, Soc. Indust. Appl. Math. 1 1:431-441 (1963); koncentrace každé DNázy (přirozené nébo variantní) potřebné k získání polovičního signálu proti maximu ve zkoušce byla vypočítána z křivek a je vztažena na hodnotu EC50 Molekulární hmotnosti přirozené lidské DNázy I a variant byly stanoveny na 37 000 Daltonů.

Relativní vazebná afinita každé varianty lidské DNázy I byla vypočítána vydělením hodnoty EC50 varianty hodnotou EC50 přirozené lidské DNázy I stanovené zkouškou ELIS A a výsledky jsou znázorněny na Obr. 5. Jestliže byla relativní vazebná afinita varianty lidské DNázy 1 vypočítána jako hodnota 5, bude to znamenat, že hodnota EC50 varianty je 5-krát větší rtež hodnota EC50 přirozené lidské DNázy I, nebo jinými slovy, že varianta má afinitu k aktinu , která je 5-krát menší než afinita přirozené lidské DNázy I k aktinu v této zkoušce ELIS A.

IV. Zkouška kompaktnosti sputa: Zkouška kompaktnosti sputa (PCT Patent Publication No. WO 94/10567, publikováno 11. května 1994) byla použita k měření relativní viskoelasticity sputa od pacientů s cystickou fibrózou (“sputum CF ”) před a po inkubaci s přirozenou lidskou DNázou 1 a různými variantami DNázy I. Po smíchání sputa CF se vzorkem DNázy I a inkubaci 20 min v pokojově teplotě byly polopevné roztoky naneseny do kapilárních trubiček, které bylý potom centrifugovány 20 minut při 12000 ot./min. Po centrifugaci byla zjištěna hmotnost sedimentu a porovnána s hmotností roztoku a sedimentu. Tato měření byla potom použita k výpočtu procenta kompaktnosti sputa, což odpovídá viskoelasticitě sputa.

Procento kompaktnosti stanovené při působení přirozenou lidskou

DNázou 1 a na aktin rezistentní mi variantami l idské DNázy I je znázorněno na • · 4 9 4 4 ·

-)Λ ······ 49 ·4

Zv 999 999

4 4 44 994 44 4«

Obr. 6. Tyto výsledky ukazují, že na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I jsou účinnější než přirozená lidská DNáza I při snižování viskoelasticity sputa CF, jak to bylo stanoveno zkouškou kompaktnosti.

li

'* ♦ · 9999 ί ϊ .· • · · • · ·

INFORMACE PRO SEK V. ID. Č.l:

(i) CH AR AKTRI ŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 260 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární

(xi) Leu 1	POPIS SEKVENCE: Lys Ile Ala Ala 5	SEK V. ID.	Č. I: Ile Gin	Thr 10	Phe	Gly	Glu	Thr	Lys 15
Phe	Asp
Met	Ser Asn Ala Thr 2 0	Leu	Var	Ser Tyr	Ile 2 5	Val	Gin	Ile	Leu	Ser 3 0
Arg	Lys Asp Ile Ala 35	Leu	Val	Gin Glu	Val 40	Arg	Asp	Ser	His	Leu 45
Thr	Ala Val Gly Lys 5 0	Leu	Lea	Asp Asn	Leu 55	Asn	Gin	Asp	Ala	Pro 60
Asp	Thr Tyr His Tyr 65	Val	Val	Ser Glu	Pro 7 0	Leu	Gly	Arg	Asn	Ser 7 5
Tyr	Lys Glu Arg Tyr 8 0	Leu	Phe	Val Tyr	Arg 85	Pro	Asp	Gin	Val	Ser 90
Ala	Val Asp Ser Tyr 95	Tyr	Tyr	Asp Asp	Gly 100	Cys	Glu	Pro	Cys	Gly 10 5
Asn	Asp Thr Phe Asn 110	Arg	Glu	Pro Ala	Ile 115	Val	Arg	Phe	Phe	Sex 12 0
Arg	Phe Thr Glu Val 12 5	Arg	Glu	Phe Ala	Ile 130	Val	Pro	Leu	His	Ala 135
Ala	Pro Gly Asp Ala 14 0	Val	Ala	Glu Ile	Asp 145	Ala	Leu	Tyr	Asp	Val 150
Tyr	Leu Asp Val Gin 155	Glu	Lys	Trp Gly	Leu 160	Glu	Asp	Val	Met	Leu 165
Met	Gly Asp Phe Asn 170	Ala	Gly	Cýs Ser	Tyr 17 5	Val	Arg	Pro	Ser	Gin 180
Trp	Ser Ser Ile Arg 18 5	Leu	Trp	Thr Ser	Pro 190	Thr	Phe	Gin	Trp	Leu 195
Ile	Pro Asp Ser Ala 280	Asp	Thr	Thr Ala	Thr 205	Pro	Thr	His	Cys	Ala 210
tyr	Asp Arg Ile Val 215	Val	Ala	Gly Me t	Leu 220	Leu	Arg	Gly	Ala	Val 225
Val	Pro Asp Ser Ala 2 30	Leu	Pro	Phe Asn	Phe 235	Gin	Ala	Ala	Tyr	Gly 2 40
Leu	Sex Asp Gin Leu 245	Ala	Gin	Ala Ile	Ser 250	Asp	His	Tyr	•Pro	Val 255

Glu Va1 Met Leu Lys

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Varianta lidské DNázy I maj í cí hydrolytickou aktivitu Štěpení DNA a vazebnou afinitu k aktinu, která je menší než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy I.
2. 2. Varianta lidské DNázy I podle nároku 1, která má vazebnou afinitu k aktinu alespoň 5-krát menší než ji má přirozená lidská DNáza I.
3. 3. Varianta lidské DNázy 1 podle nároku 1, která má vazebnou afinitu k aktinu alespoň 100-krát menší než ji má přirozená lidská DNáza I.
4. 4. Varianta lidské DNázy j podle nároku 1 obsahující aminokyselinovou sekvenci mající alespoň 90% identitu s aminokyselinovou sekvencí přirozené lidské DNázy I znázorněné na Obr. 1.
5. 5. Varianta lidské DNázy I podle nároku 1 obsahující aminokyselinovou sekvenci mající alespoň 95% identitu s aminokyselinovou sekvencí přirozené lidské DNázy 1 znázorněné na Obr. 1.
6. 6. Varianta lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a vazebnou afinitu k aktinu, která je menší než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy I, mající aminokyselinovou sekvenci, která še liší od aminokyselinové sekvence znázorněné na Obr. 1 substitucí jedné aminokyseliny za jinou v pouze jediné pozici uvnitř sekvence znázorněné na Obr. 1.
7. 7. Varianta lidské DNázy 1 podle nároku 6, kde aminokyselinová substituce vytváří glykosilační místo uvnitř této varianty, které není přítomné v přirozené lidské DNáze I.
8. 8. Varianta lidské DNázy I podle nároku 6, kde je aminokyselinová substituce v jedné z následuj ících pozicí uvnitř sekvence na Obr. 1: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 114.
9. 9. Varianta lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a vazebnou afinitu k aktinu, která je menší než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy 1, mající aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence znázorněné na Obr. 1 substitucí jedné aminokyseliny za jinou ve dvou nebo více pozicích uvnitř sekvence znázorněné na Obr. 1.
10. 10. Varianta lidské DNázy 1 podle nároku 9, kde je alespoň jedna z aminokyselinových substitucí vytvořena v jedné z následujících pozic uvnitř sekvence znázorněné na Obr. 1: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 1 14.

    99 9999

    9 9 • 9

    99« 9 « 9 «9 9

    9 9

    2$3
11. 11. Varianta lidské DNázy I podle nároku 9, kde alespoň jedna z amonikyselinových substitucí vytváří glykosilační místo uvnitř této varianty, které není přítomné v přirozené lidské DNáze I.
12. 12. Izolovaná nukleová kyselina kódující variantu lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a vazebnou afinitu k aktinu, která je menší než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy I.
13. 13. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12 obsahující nukleotidovou ' sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci mající alespoň 90% identitu s aminokyselinovou sekvencí přirozené lidské DNázy I znázorněné na Obr. 1.

    ¢.
14. 14. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12 obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci mající alespoň 95% - identitu s aminokyselinovou sekvencí přirozené lidské DNázy I znázorněné na Obr. 1.

    Ěř íj,
15. 15. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12 obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyseliňové sekvence znázorněné na Obr. 1 substitucí jedné aminokyseliny za jinou v pouze jediné pozici uvnitř sekvence znázorněné na Obr. 1.
16. 16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12 obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence znázorněné na Obr. 1 substitucí jedné aminokyseliny za jinou v pouze dvou pozicích uvnitř sekvence znázorněné na Obr. 1.
17. 17. Způsob léčby pacienta majícího plicní nemoc nebo chorobu v y z n a č ují c í s e t i m, že obsahuje podávání terapeuticky účinného množství varianty lidské DNázy 1 mající hydrolytickou aktivitu štěpeni DNA a vazebnou afinitu k aktinu, která jě menší než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy I pacientovi.

    •i.
18. 18. Způsob léčby pacienta podle nároku 17, kde je nemocí nebo chorobou cystická fibróza.
19. 19. Způsob léčby pacienta podle nároku 17, kde je nemocí nebo chorobou chronická broncbitida.
20. 20. Farmaceutický prostředek v y z n a č u j í o i s e t í m, že obsahuje variantu lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DN A a vazebnou afinitu k aktinu, která je menši než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy I., a popřípadě farmaceuticky přijatelné vehikulum.
21. 21. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, kde prostředek je ve vodné formě.

    ·· zkyy Ζ'-ΖΖ ·· >···

    2¼
22. 22. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, kde prostředek je v práškové formě.
23. 23. Varianta lidské DNázy I mající hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a vazebnou afinitu k aktinu, která je menší než vazebná afinita k aktinu přirozené lidské DNázy I, a která je schopna snížit viskoelasticitu sputa pacientů s cystickou fibrózou.

    • ·· · ♦ · • • 99 99 9 9 99 9999 9 9 9 • · • 9 • · • · 999 · • · 9 • · • • 9 ··· 99 ··· 99 99 9