CZ288633B6 - Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I a izolovaná nukleová kyselina ji kódující - Google Patents

Abstract

P°edlo en² vyn lez se t²k variant aminokyselinov sekvence lidsk DN zy I, kter m sn enou vazebnou afinitu k aktinu. Vyn lez poskytuje sekvence nukleov kyseliny k duj c takov na aktin rezistentn varianty a t m umo uj c produkci t chto variant v mno stv ch dostate n²ch ke klinick mu pou it . Vyn lez se tak vztahuje na farmaceutick prost°edky a terapeutick pou it na aktin rezistentn ch variant lidsk DN zy I.\

Description

Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I a izolovaná nukleová kyselina ji kódující

Oblast techniky

Předložený vynález se týká výsledků získaných výzkumem lidské deoxyribonukleázy (DNázy I), fosfodiesterázy, která je schopná hydrolýzy polydeoxyribonukleové kyseliny. Všeobecně se týká modifikovaných (variantních) forem lidské DNázy I a jejich přípravy metodami rekombinantní DNA do formy farmaceutického prostředku tak, aby byla jejich funkčnost využívána klinicky a týká se také metod, které používají tyto varianty DNázy I a prostředky z nich vyrobené.

Dosavadní stav techniky

DNáza I je fosfodiesteráza schopná hydrolýzy polydeoxyribonukleové kyseliny. DNáza I byla purifikována z různých druhů do různého stupně.

Hovězí DNáza I byla rozsáhle studována biochemicky. Viz např. Moore, in The Enzymes (Boyer, P. D., ed.), pp 281-296, Academie press, New York (1981). Úplná aminokyselinová sekvence hovězí DNázy I je známa (Liao, et. al., J. Biol. Chem. 248: 1 489-1 495 (1973); Oefner, et. al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986); Lahm, et. al., J. Mol. Biol. 221:645-667 (1991)) a DNA kódující hovězí DNázu I byla klonována a exprimována (Worrall, et. al., J. Biol. Chem. 265:21 889-21 895 (1990)). Struktura hovězí DNázy I byla určena rentgenokrystalografií (Suck, et. al., EMBO J. 3:2 423-2 430 (1984); Suck, et. al., Nátuře 321:620-624 (1986); Oefner, et. al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986)).

DNA kódující hovězí DNázu I byla izolována a sekvencována a tato DNA byla exprimována v rekombinantních hostitelských buňkách a tím byla umožněna výroba lidské DNázy I v komerčně užitečných množstvích (Shak, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 87:9 188-9 192 (1990)).

DNáza I má řadu známých užitečných vlastností a byla použita na terapeutické účely. Její základní terapeutické uplatnění je ve snížení viskoelasticity plicních sekrecí (hlenu) při takových nemocech jako zápal plic a cystická fibróza (CF) a tím pomáhá při vyčištění dýchacích cest. Viz např. Lourenco, et. al., Arch. Intem. Med. 142:2 299-2 308 (1982); Shak, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 87:9 188-9 192 (1990); Hubbard, et. al., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Biyson, et. al., Drugs 48:894-906 (1994). Hlen také přispívá k úmrtnosti při chronické bronchitidě, astmatické bronchitidě, bronchiestasitidě, rozedmě plic, akutní a chronické sinusitidě, a rovněž k rýmě.

Plicní sekrece osob majících takovéto nemoci jsou komplexní látky, které zahrnují hlenové glykoproteiny, mukopolysacharidy, proteázy, aktin a DNA. Některé z těchto látek v plicních sekrecích jsou uvolňovány z leukocytů (neutrofilů), které infiltrují plicní tkáň jako odpověď na přítomnost mikrobů (např. kmenů Pseudomonas, Pneumococcus nebo Staphylokokových bakterií) nebo jiných dráždidel (např. cigaretového kouře a pylu). Leukocyty mohou degenerovat a uvolňovat svůj obsah v průběhu reagování s takovýmito mikroby nebo dráždidly, což přispívá k viskoelasticitě plicních sekrecí.

Schopnost DNázy I redukovat viskoelastitidu plicních sekrecí je přičítána její enzymové degradaci velkého množství DNA uvolněného neutrophily. Shak, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Aitken, et. al., J. Am. Med. Assoc. 267:1943-1951 (1992).

Nedávno byl navržen jiný mechanismus pro mukolytický efekt DNázy I zahrnující disagregaci aktinu. Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994). Aktin je jedním z nejvíce obsažených bílkovin v eukaryotních buňkách (například aktin zahrnuje přibližně 10 % všech bílkovin v leukocytech) a byl rozsáhle studován. Kabsch, et. al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.

- 1 CZ 288633 B6

21:49-76 (1992); Sheterline, et. al., Prot. Profile 1:1-121 (1994). Aktin existuje ve dvou formách, monomemí formě (G-aktin) a fílamentní formě (F-aktin), který je složen z monomerů G-aktinu. Polymemí filamenty aktinu jsou vysoce viskoelastické a významně přispívají kviskozitě plicních sekrecí. Momet, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 81:3680-3684 (1984); Newman, et. al., Biochemistry 24:1538-1544 (1985); Jamney, et. al., Biochemistry 27:8218— 8226 (1988); Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994).

Protože je známo, že se DNáza I váže na aktin (Lazarides, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 71:47424746 (1974); Kabsch, et. al., Nátuře 347:37-44 (1990)) a depolymeruje aktinové filamenty (stejně tak inhibuje polymerací G-aktinu do fílamentů) (Mannherz, et. al., FEBS Lett. 60:34-38 (1975); Hitchcock, et. al., Cell 7:531-542 (1976); Pinder, et. al., Biochemistry 21:4886-4890 (1982); Weber, et. al., Biochemistry 33:..4780-4786 (1994)), předpokládá se, mukolytický efekt Dnázy I na sputum a jiné plicní sekrece je způsoben disagregací aktinu (depolymerací) spíše než hydrolýzou DNA. Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994). V souladu s tímto pohledem je známo, že je DNA-hydrolytická aktivita Dnázy I v přítomnosti aktinu inhibována Lazarides, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Mannherz, et. al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Také v souladu s tímto pohledem bylo oznámeno, že bílkoviny inhibující aktin (např. gelsolin) jsou účinné při snižování viskoelasticity sput a při cystické fíbróze. Vasconcellos, et. al., Science 263:969-971 (1994). Stossel, et. al., PCT Patent Publication No. WO 94/22465 (publikováno 13. října 1994).

Předložený vynález je založen z části na výzkumu vynálezců, který měl určit biochemický základ mukolytické aktivity DNázy I. Tento výzkum zahrnoval navržení a syntézu různých variant lidské DNázy I a testování těchto variant na stanovení jejich schopnosti hydrolyzovat DNA, vázat aktin a redukovat viskoelasticitu sputa in vitro.

Vynálezci vytvořili několik tříd variant lidské DNázy I. Jedna třída variant (varianty rezistentní k aktinu) měly sníženou schopnost vázat aktin, ale stále měly mukolytickou aktivitu a v některých případech měly tuto mukolytickou aktivitu zvýšenou ve srovnání s přirozenou DNázou I. Tyto varianty rezistentní k aktinu mají přibližně stejnou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA jako přirozená DNáza I, ale tato aktivita je méně citlivá na inhibici aktinem. Druhá třída variant váže aktin s afinitou podobnou té nalezené u přirozené DNázy I, ale má sníženou mukolytickou aktivitu a sníženou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA ve srovnání s přirozenou DNázou I.

Tyto výsledky ukazují, že terapeutická působivost lidské DNázy při redukování viskoelasticity plicních sekrecí je způsobena její katalytickou, hydrolytickou aktivitou štěpení DNA spíše než její schopností depolymerovat fílamentní aktin. Varianty lidské DNázy I, které vážou aktin s nižší afinitou než přirozená lidská DNáza I, ale které mají stále hydrolytickou aktivitu štěpení DNA, by podle předchozího mělo být prospěšným terapeutickým prostředkem, zvláště při léčení pacientů majících plicní sekrece, které obsahují relativně vysoké množství aktinu. Protože takové varianty mají sníženou afinitu k aktinu, jejich hydrolytická aktivita štěpení DNA je méně inhibována v přítomnosti aktinu a tak mají tyto varianty v přítomnosti aktinu větší mukolytickou aktivitu ve srovnání s přirozenou lidskou DNázou I.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je poskytnout variantu lidské DNázy I, která má stále hydrolytickou aktivitu štěpení DNA, ale váže aktin s menší afinitou než přirozená lidská DNáza I.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout nukleové kyseliny kódující takovéto na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I, rekombinantní vektory obsahující takovéto nukleové

-2CZ 288633 B6 kyseliny, rekombinantní hostitelské buňky transformované těmito nukleovými kyselinami nebo vektory a postupy na výrobu variant lidské DNázy I pomocí technologie rekombinantní DNA.

Tento vynález také vede k farmaceutickým prostředkům obsahujícím na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I.

Tento vynález zvláště vede k použití variant k léčení pacientů majících nemoci jako jsou cystická fibróza, chronická bronchitida, zápal plic, bronchiectasitida, rozedma plic, astma a nebo systemický lupus erythematosus.

Tento vynález zvláště vede k používání na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I při diagnostických zkouškách viskózní látky (např. sputa) získané od pacienta in vitro, k měření množství přítomného aktinu a k stanovení, zda je pacient vhodný kandidát na léčení na aktin rezistentní variantou lidské DNázy I.

Tyto a jiné předměty vynálezu budou zřejmé běžnému odborníkovi se zřetelem na specifikace jako celek.

Přehled obrázků na výkrese

Obr. 1 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci přirozené lidské DNázy I (SEKV. ID. C: 1). Čísla ukazují pořadí aminokyselinových zbytků uvnitř sekvence.

Obr. 2 znázorňuje relativní specifickou aktivitu přirozené lidské DNázy I a variant. Poloůsečka chyby vyznačuje standardní odchylku (n-zatíženou). Relativní specifická aktivita Pulmozyne® lidská DNáza I (Genentech, lne., South San Francisco, Califomia USA) je definována jako 1,0. Relativní specifická aktivita přirozené lidské DNázy I je větší než u Pulmozyme® vlivem přítomnosti deaminované formy lidské DNázy I v Pulmozyme®, která má sníženou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA (Frenz, et. al., PCT Patent Publication No. WO93/25670, publikováno 23. prosince 1993).

Obr. 3 znázorňuje hydrolytickou aktivitu štěpení DNA přirozené lidské DNázy I a variant lidské DNázy I s jednotlivými záměnami zbytků v přítomnosti aktinu jak byla stanovena ve zkoušce hyperchromacity. „Procenta aktivity“ jsou procenta hydrolytické aktivity štěpení DNA DNázy I (přirozená nebo variantní) vypočítaná jak je popsáno v příkladu 3; hydrolytická aktivita štěpení DNA DNázou I v nepřítomnosti aktinu je definována jako 100 procent aktivity. Poloůsečka chyby vyznačuje standardní odchylka.

Obr. 4 znázorňuje hydrolytickou aktivitu štěpení DNA přirozené lidské DNázy I a variant lidské DNázy I s několika záměnami zbytků v přítomnosti aktinu, jak bylo stanoveno ve zkoušce hyperchromacity nebo zkoušce na methylovou zeleň. „Procenta aktivity“ jsou procenta hydrolytické aktivity štěpení DNA DNázy I (přirozené nebo variantní) vypočítaná jak je popsáno v příkladu 3; hydrolytická aktivita štěpení DNA DNázou I v nepřítomnosti aktinu je definována jako 100 procent aktivity. Poloůsečka chyby vyznačuje standardní odchylku.

Obr. 5 znázorňuje relativní vazebnou afinitu variant lidské DNázy I k aktinu jak bylo stanoveno ve zkoušce ELISA na vázání aktinu (jak je popsáno v příkladu 3). Hodnota EC50 je koncentrace DNázy I (přirozené nebo variantní), které je zapotřebí k získání polovičního signálu proti maximu ve zkoušce. Poloůsečka chyby vyznačuje standardní odchylku. Hodnoty EC50 pro Pulmozyme® a přirozenou lidskou DNázu jsou 72 ±21 pM (n = 21) a 85 ± 14 pM (n = 14). Relativní vazebná afinita znázorněná na obrázku je hodnota EC₅₀ stanovená pro variantu lidské DNázy I vydělená hodnotou EC50 stanovenou pro přirozenou lidskou DNázu. Varianty, u kterých byla hodnota EC50 větší než bylo možno měřit ve zkoušce, jsou uvedeny jako >35, >350, >1750, >3500, >35000.

-3CZ 288633 B6

Obr. 6 znázorňuje mukolytickou aktivitu přirozené lidské DNázy I a variant lidské DNázy I ve vzorcích sputa od pacientů s cystickou fibrózou, jak bylo stanoveno zkouškou kompaktnosti.

Poloúsečka chyby vyznačuje standardní průměrnou chybu.

Obr. 7 znázorňuje schematickou ukázku zkoušky ELISA na vázání aktinu popsanou v příkladu 3.

Jak je zde uváděno, pojmy „lidská DNáza I“, „přirozená lidská DNáza I“ a „divoký typ lidské DNázy I“ se vztahují na polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci lidské přirozené DNázy I uvedené dále na obr. 1.

„Varianta“ nebo „varianta aminokyselinové sekvence“ lidské DNázy I je polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence přirozené lidské DNázy I. Obecně bude mít varianta nejméně z 80 % totožnou sekvenci (homologii), spíše však nejméně z 95 % totožnou sekvenci a nejspíše nejméně z 95 % totožnou sekvenci s přirozenou lidskou DNázou I. Procento sekvenční identity je určeno např. v Flinch, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. 80:1382-1386 (1983), verze algoritmu je popsána vNeedleman, et. al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), po seřazení sekvencí k poskytnutí maximální homologie.

Pojmy „na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I“, „na aktin rezistentní varianta“ se vztahují na variantu přirozené lidské DNázy I, která má (1) hydrolytickou aktivitu štěpení DNA a (2) sníženou vazebnou afinitu k aktinu.

„Hydrolytická aktivita štěpení DNA“ se vztahuje na enzymovou aktivitu přirozené lidské DNázy I nebo varianty lidské DNázy I při hydrolýze (štěpení) substrátové DNA 5-fosforylovanými oligonukleotidy jako konečnými produkty. Hydrolytická aktivita štěpení DNA je přímo stanovena některou z různých metod známou ve světě, včetně analytické elektroforézy v akrylamidovém nebo agarózovém gelu, zkoušky hyperchromicity (Kunta, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunta, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)) nebo zkouškou na methylovou zeleň (Kumick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et. al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)).

„Vazebná afinita“ na aktin přirozené lidské DNázy I nebo na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I se vztahuje na schopnost DNázy I nekovalentně vázat aktin. Vazebná afinita může být stanovena některou z různých metod známou ve světě, například, jak je to popsáno v Mannherz, et. al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Jinak jsou relativní vazebné afinity různých DNáz (např. přirozené lidské DNázy I a jejích variant) stanoveny měřením vazby DNáz k imobilizovanému aktinu ve zkoušce ELISA (popsáno ve zkoušce 3) nebo porovnáním hydrolytické aktivity štěpení DNA DNáz v přítomnosti a nepřítomnosti aktinu (popsáno také ve zkoušce 3). Metody popsané v příkladech jsou zvláště vhodné pro testování variant lidské DNázy I za účelem rychle identifikovat takové varianty, které mají sníženou vazebnou afinitu k aktinu.

Na katin rezistentní varianty lidské DNázy I mající „sníženou vazebnou afinitu k aktinu“ je ta, která má vazebnou afinitu k aktinu relativně menší než je afinita, kterou se přirozená lidská DNáza I váže k aktinu, stanoveno za srovnatelných podmínek. Jestliže je zkouška ELISA na vazbu k aktinu použita ke stanovení vazebné afinity lidské DNázy (přirozené nebo variantní) kaktinu jak je popsáno v příkladu 3, pak bude na aktin rezistentní varianta mající „sníženou vazebnou afinitu k aktinu“ tou, která má hodnotu EC₅₀ větší než má přirozená lidská DNáza I. Při této zkoušce bude mít na aktin rezistentní varianta hodnotu EC50 typicky pětkrát až lOOkrát větší než má přirozená lidská DNáza I; ale na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I mající hodnotu EC50 více než 500krát větší než má přirozená lidská DNáza I jsou také přímo produkovány, zvláště změnou několika aminokyselinových zbytků v aminokyselinové sekci přirozené lidské DNázy I (viz např. obr. 5).

-4CZ 288633 B6 „Mukolytická aktivita“ se vztahuje na redukci viskoelasticity (viskozity) sputa nebo jiného biologického materiálu, například jak bylo pozorováno při působení přirozenou lidskou DNázou I nebo variantou lidské DNázy I na tento materiál. Mukolytická aktivita je přímo stanovena některou z různých metod známých ve světě, včetně zkoušky kompaktnosti sputa (PCT Patent Publication No. WO 94/10567, publikováno 11. května 1994), zkoušky používající torzní kyvadlo (Jamney, J. Biochem. Biophys. Methods 22:41-53 (1991) nebo jiných Teologických metodologií.

„Polymerázová řetězová reakce“ neboli „PCR“ se obecně vztahuje na metody určené k pomnožení žádané nukleotidové sekvence in vitro, jak je to popsáno např. v US 4683195. Obecně metoda PCR zahrnuje opakované cykly extenze příměrové syntézy s použitím oligonukleotidových primerů schopných hybridizovat přednostně stemplátovou nukleovou kyselinou.

„Buňka“, „hostitelská buňka“, „buněčná linie“ a „buněčná kultura“ jsou používány zaměnitelně všude a všechny tyto pojmy by měly být chápány stím, že obsahují genetickou výbavu, jejíž výsledkem je růst a kultivace buňky. „Transformace“ a „transfekce“ jsou používány zaměnitelně aby se vztahovaly na proces vnesení DNA do buňky.

„Funkčně spojeno“ se vztahuje na kovalentní spojování dvou nebo více sekvencí DNA prostřednictvím enzymové ligace nebo jinak v konfiguraci navzájem takové, že normální funkce sekvencí může být zachováno. Například je DNA pro presekvenci nebo sekreční vedoucí úsek funkčně spojena k DNA pro polypeptid, jestliže je exprimována jako preprotein který participuje na sekreci polypeptidu; promotor nebo zesilovač je funkčně spojen ke kódující sekvenci, jestliže ovlivňuje transkripci této sekvence; nebo ribozomální vazebné místo je funkčně spojeno škodující sekvencí, jestliže je umístěno tak, že usnadňuje translaci. Obecně „funkčně spojeno“ znamená, že sekvence DNA, které jsou spojovány, jsou nepřerušené a v případě sekrečního vedoucího úseku nepřerušené ve čtecí fázi. Spojování je prováděno ligací ve vhodném restrikčním místě. Jestliže taková místa neexistují, pak jsou používány syntetické oligonukleotidové adaptory nebo linkery ve shodě se standardními metodami rekombinantní DNA.

Aminokyseliny jsou zde uvedeny třípísmenovým nebo jednopísmenovým označením, jak je uvedeno níže:

Asp	D	aspartic acid	Ile	I	isoleucine
Thr	T	threonine	Leu	L	leucine
Ser	S	serine	Tyr	T	tyrosine
Glu	E	glutamová kyselina	Phe	F	phenylalanin
Pro	P	prolin	His	H	histidin
Gly	G	glycin	Lys	K	lysin
Ala	A	alanin	Arg	R	arginin
Cys	C	cystein	Trp	W	tryptophan
Val	V	valin	Gin	Q	glutamin
Met	M	methionin	Asn	A	asparagin

Selekce na aktin rezistentních variant: předložený vynález je založen na studii struktury, aktin vázajících vlastností, hydrolytické aktivitě štěpení DNA a mukolytické aktivitě variant aminokyselinové sekvence lidské DNázy I. Na aktin rezistentní varianty v předloženém vynálezu mají hydrolytickou aktivitu štěpení DNA, ale vážou aktin s menší afinitou než přirozená lidská DNáza I. Redukce vázání aktinu je přednostně dosaženo vytvořením mutací v místě a nebo v okolí těch aminokyselinových zbytků uvnitř přirozené lidské DNázy I, které ovlivňují vázání aktinu, které zahrnují například zbytky přirozené lidské DNázy I Glu 13, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52 Asp53, Asn56, Tyr65, Val67, Glu69, a Alall4 (čísla následující třípísmenové označení uvádějí specifické umístění aminokyselinových zbytků uvnitř sekvence na obr. 1).

-5CZ 288633 B6

Existuje mnoho způsobů jak vytvořit na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I. V jednom provedení tohoto vynálezu je na aktin rezistentní varianta připravena zavedením jak jednotlivých tak několika aminokyselinových substitucí, inzercí anebo delecí v místě nebo v okolí místa (např. uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) těch aminokyselinových zbytků přirozené lidské DNázy I, které mají vliv na vazbu k aktinu. Některé ilustrativní příklady takových mutací jsou uvedeny následovně: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, E69R, D53R.Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, H44A:Y65A:E69R(viz obr. 2-6).

V jiném provedení tohoto vynálezu je na aktin rezistentní varianta připravena zavedením mutace nebo mutací, které vytvářejí nové glykosylační místo v místě nebo v okolí místa (např. uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) aminokyselinových zbytků přirozené lidské DNázy I, které mají vliv na vázání aktinu. Například je cílená mutageneze použita k zavedení jedné ze tří peptidových sekvencí, asparagin-X-serin nebo asparagin-X-threonin (kde X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu), což jsou rozeznávací sekvence pro enzymové připojení karbohydrátové jednotky k asparaginovému postrannímu řetězci. Creighton, Proteins, pp 76-78 (W. H. Freeman, 1984). Sterická překážka vyskytující se mezi karbohydrátovou jednotkou výsledné A-glykosylované varianty DNázy a aktinem může snížit nebo zabránit vázání aktinu a v důsledku toho způsobit inhibici hydrolytické aktivity štěpení DNA v porovnání s přirozenou lidskou DNázou I. Některé ilustrativní příklady takových mutací zavádějících nové glykosylační místo jsou uvedeny následovně: H44N, D58S, D58T, H64N:V66T, H64N:V66S, V67N:E69S, V67N:E69T.

Je také možné přirozeně se vyskytující glykosylační místo v pozici 18 anebo 106 uvnitř aminokyselinové sekvence přirozené lidské DNázy I deletovat v závislosti na rozsahu glykosylace, ke které dochází při vytvoření nového glykosylačního místa mutací.

V dalším provedení tohoto vynálezu je použita cílená mutageneze k zavedení zbytků v místě nebo v okolí místa (např. uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) těch aminokyselinových zbytků přirozené lidské DNázy I, které mají vliv na vázání aktinu, které jsou vhodné k posttranslační modifikaci jak biologicky tak chemicky (viz níže). Means, et. al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazet, et. al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pp. 70-87 (W. H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Takové posttranslační modifikace mohou zavést stérickou překážku nebo změněné elektrostatické vlastnosti do DNázy I, což sníží nebo zabrání vázání aktinu a v důsledku toho způsobit inhibici hydrolytické aktivity štěpení DNA v porovnání s přirozenou lidskou DNázou I. Například může být cysteinový zbytek zaveden v místě nebo v okolí místa nějakého zbytku přirozené lidské DNázy I, které má vliv na vázání aktinu. Volný thiol cysteinového zbytku může tvořit intermolekulámí disulfidovou vazbu s jinou takovou variantou DNázy I a vytvořit tak DNázový dimer nebo může být modifikován, například alkalizačním činidlem specifickým na thiol. Některé ilustrativní příklady takových mutací jsou uvedeny následovně: H44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E69C, Al 14C.

Je obyčejně výhodné vytvářet substituce, inzerce anebo delece v aminokyselinové sekvenci přirozené lidské DNázy I zavedením mutací do příslušné nukleotidové sekvence DNA kódující přirozenou lidskou DNázou I, například cílenou mutagenezí. Exprese mutované DNA má pak za následek produkci varianty lidské DNázy' I mající žádanou (nepřirozenou) aminokyselinovou sekvenci.

I když může být k provedení cílené mutageneze použita jakákoliv známá technika, např. jak je to uvedeno v Sambrook, et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Sprig Harbor Laboratory Press, New York (1989)), cílená mutageneze pomocí oligonukleotidu je preferovanou metodou na přípravu variant lidské DNázy I uvedenou v tomto vynálezu. Tato metoda, která je velmi dobře známa (Zoller, et. al., Meth. Enz. 100:4668-500 (1983); Zoller, et.

-6CZ 288633 B6 al., Meth. Enz. 154:329-350 (1987); Carter, Met. Enz. 154:382^403 (1987); Kunkel, et. al.,

Meth. Enz. 154:367-382 (1987); Horwitz, et. al., Meth. Enz. 185:599-611 (1990)), je zvláště vhodná pro vytváření substitučních variant, ačkoliv může být použita i pro snadnou přípravu delečních a inzerčních variant.

Technika cílené mutageneze využívá typicky fágového vektoru, který existuje ve dvou formách, jak jednovláknové tak dvouvláknové. Typické vektory užitečné pro cílenou mutagenezi jsou vektory jako fág M13 a plazmidové vektory, které obsahují jednovláknový fágový počátek replikace (Messing, et. al., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1983); Veira et. al., Meth. Enzymol. 153:3-11 (1987); Short, et. al., Nucl. Acids. Res. 16:7583-7600 (1988)). Výsledkem replikace těchto vektorů ve vhodných hostitelských buňkách je syntéza jednovláknové DNA, která může být použita k cílené mutagenezi.

Krátce popsáno, při provádění cílené mutageneze DNA kódující přirozenou lidskou DNázu I (nebo její variantu) je DNA pozměněna nejprve hybridizací oligonukleotidu kódujícího žádanou mutaci kjednotlivému vláknu DNA. Po hybridizací je použita DNA polymeráza, aby syntetizovala celé druhé vlákno s využitím hybridizovaného oligonukleotidu jako prímeru a vlákna DNA jako templátu. Tímto způsobem je oligonukleotid kódující žádanou mutaci začleněn do výsledné dvouvláknové DNA.

Oligonukleotidy používané jako hybridizační próby nebo příměry mohou být připraveny některou vhodnou metodou jako je purifikace přirozeně se vyskytující DNA nebo syntéza in vitro. Například jsou oligonukleotidy syntetizovány přímo s využitím různých technik organické chemie, jak je to popsáno vNarang, et. al., Meth. Enzymol. 68:90—98 (1979); Brown, et. al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); Caruthers, et. al., Meth. Enzymol. 154:287-313 (1985). Obecný přístup k výběru vhodné hybridizační próby nebo primeru je dobře znám. Keller, et. al., DNA Probes, pp. 11-18 (Stockton Press (1989). Hybridizační próby nebo primery typicky obsahují 10-25 nebo více nukleotidů a zahrnují nejméně 5 nukleotidů na každé straně sekvence kódující žádanou mutaci, aby se tak zajistilo, že oligonukleotid bude hybridizovat preferenčně v žádaném místě k jednovláknové templátové molekule DNA.

Ovšem cílená mutageneze může být použita k zavedení několika substitučních, inzerčních nebo delečních mutací do výchozí DNA. Jestliže jsou místa, která mají být mutována, umístěna blízko sebe, mutace mohou být zavedeny současně použitím jediného oligonukleotidu, který kóduje všechny žádané mutace. Jestliže jsou však místa, která mají být mutována, umístěna od sebe v jisté vzdálenosti (odděleny více než přibližně 10 nukleotidy), je obtížnější vytvořit jediný oligonukleotid, který kóduje všechny požadované změny. Místo toho může být využita jedna ze dvou alternativních metod.

V první metodě je vytvořen oddělený oligonukleotid pro každou z požadovaných mutací. Oligonukleotidy jsou potom hybridizovány k jednovláknové templátové DNA současně a druhé vlákno DNA, které je syntetizováno podle templátu bude kódovat všechny požadované aminokyselinové substituce.

Tato alternativní metoda zahrnuje dvě nebo více kol mutageneze, aby vyprodukovala požadovanou variantu. První kolo je stejné, jak bylo popsáno pro zavedení jediné mutace. Druhé kolo mutageneze využívá mutovanou DNA vytvořenou v prvním kole mutageneze jako templátu. Tento templát už obsahuje jednu nebo více mutací. Oligonukleotid kódující další požadovanou aminokyselinovou substituci (substituce) je hybridizován k tomuto templátu a výsledné vlákno DNA nyní kóduje mutace jak z prvního kola tak z druhého kola mutageneze. Tato výsledná DNA může být použita jako templát ve třetím kole mutageneze a tak dále.

PCR mutageneze (Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academie Press, 1990); Vallete, et. al., Nucl. Acids. Res. 17: 723-733 (1989) je také vhodná pro vytvoření variant lidské DNázy I. Kráče popsáno, když jsou malá množství templátové DNA použita jako výchozí materiál v PCR,

-7CZ 288633 B6 primery, které se liší málo v sekvenci odpovídající oblasti v templátové DNA, mohou být použity k vytvoření relativně velkých množství specifických fragmentů DNA, které se liší od templátové sekvence pouze v místech, kde se primery liší od templátu. K zavedení mutace do plazmidové DNA obsahuje například jedna ze sekvencí primeru požadovanou mutaci a je navržena tak, aby hybridizovala kjednomu vláknu plazmidové DNA vmiste mutace; sekvence druhého primeru musí být shodná s nukleotidovou sekvencí uvnitř opačného vlákna plazmidové DNA, ale tato sekvence může být umístěna kdekoliv podél plazmidové DNA. Je však výhodné aby sekvence druhého primeru byla umístěna ne více než 200 nukleotidů od té první tak, že celá amplifikovaná oblast DNA vázaná primery může být nakonec snadno sekvencována. Výsledkem PCR amplifikace využívající pár primerů podobný tomu, který byl právě popsán, je populace fragmentů DNA, která se liší v místě mutace specifikované primerem a eventuálně v jiných místech, protože kopírování templátu je poněkud náchylné na tvorbu chyb. Wagner, et. al., PCR Topics, pp. 69-71 (Springer-Verlag, 1991).

Jestliže je poměr templátu k vyprodukované amplifikované DNA extrémně nízký, většina vyprodukovaných fragmentů DNA do sebe začlení požadovanou mutaci. Tato vyprodukovaná DNA je použita k náhradě odpovídající oblasti v plazmidu, kteiý slouží jako templát PCR pomocí standardních metod rekombinantní DNA. Mutace na odlišných místech mohou být zavedeny současně jak pomocí mutantního druhého primeru nebo provedením druhé PCR s jiným mutantním primerem a pomocí ligace těchto dvou výsledných fragmentů PCR současně k plazmidovému fragmentu ve tří- (nebo více) členěné ligaci.

Jiná metoda sloužící k přípravě variant, kazetová mutageneze, je založena na technice popsané v Wells, et. al., Gene, 34:315-323 (1985). Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor) obsahující sekvenci DNA, která má být mutována. Kodon ve výchozí DNA, který má být mutován, je indetifikován. Na obou stranách identifikovaného místa mutace musí být unikátní místo pro štěpení restrikční endonukleázou. Jestliže žádná taková restrikční místa neexistují, mohou být vytvořena pomocí výše popsané metody mutageneze prostřednictvím oligonukleotidů a zavedeny v příslušných místech v DNA. Plazmidová DNA je v těchto místech štěpena alinearizuje se. Dvouvláknový oligonukleotid kódující sekvenci DNA mezi restrikčními místy, ale obsahující požadovanou mutaci, je syntetizován pomocí standardních postupů, v kterých jsou tyto dvě vlákna oligonukleotidů syntetizována odděleně a potom hybridizována společně pomocí standardních technik. Tento dvouvláknový oligonukleotid se označuje jako kazeta. Tato kazeta je navržena tak, aby měla 5' a 3' konce kompatibilní s konci linearizovaného plazmidu tak, že tato může být přímo ligována do plazmidu. Výsledný plazmid obsahuje mutovanou sekvenci DNA.

Přítomnost mutace (mutací) v DNA je stanovena metodami dobře známými ve světě, jako jsou restrikční mapování a nebo sekvencování DNA. Preferovaná metoda sekvencování DNA je dideoxy řetězová terminační metoda podle Sangera, Sanger, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 72:3918-3921 (1979).

DNA kódující variantu lidské DNázy I je vnesena do vektoru schopného replikace za účelem pozdějšího kolonování nebo exprese. „Vektory“ jsou plazmidy a jiné molekuly DNA, které jsou schopné replikace uvnitř hostitelské buňky a jako takové jsou užitečné k výkonu dvou funkcí ve spojení s kompatibilními hostitelskými buňkami (vektor-hostitelský systém). Jednou funkcí je usnadnit klonování nukleové kyseliny, která kóduje variantu lidské DNázy I, tj. vyprodukovat využitelná množství nukleové kyseliny. Druhou funkcí je vést expresi varianty lidské DNázy I. Jedna nebo obě tyto funkce jsou vykonávány prostřednictvím vektoru v příslušné hostitelské buňce používané pro klonování nebo expresi. Vektory budou obsahovat různé komponenty v závislosti na funkci, kterou mají vykonávat.

Za účelem produkce varianty lidské DNázy I bude expresní vektor obsahovat DNA kódující tuto variantu, jak bylo popsáno výše, funkčně spojenou s promotorem a ribozomálním vazebným místem. Varianta je potom přímo exprimována v rekombinantní buněčné kultuře, nebo jako fuze s heterologním polypeptidem, přednostně se signální sekvencí nebo jiným polypeptidem majícím

-8CZ 288633 B6 specifické místo štěpení v místě spojení mezi heterologním polypeptidem a variantou lidské

DNázy I.

Prokaryonti (např. E. coli a jiné bakterie) jsou preferované hostitelské buňky pro počáteční 5 klonovací kroky tohoto vynálezu. Jsou zvláště užiteční na rychlou produkci velkých množství

DNA na produkci jednovláknových templátů DNA používaných k cílené mutagenezi a na sekvencování DNA vytvořených variant. Prokaryontní hostitelské buňky mohou být také používány k expresi DNA kódující variantu lidské DNázy I. Polypeptidy, které jsou produkovány v prokaryontních buňkách budou vždy neglykosylované.

Dále mohou být varianty lidské DNázy I tohoto vynálezu exprimovány v eukaryontních hostitelských buňkách zahrnujících eukaryontní mikroby (např. kvasinky) nebo buňkách odvozených od zvířat nebo jiných mnohobuněčných organizmů (např. křeččích ovariálních buněk a jiných savčích buněk) nebo v živých zvířatech (např. krávy, kozy, ovce).

Metodologie klonování a exprese jsou ve světě dobře známy. Příklady prokaryontních a eukaryontních hostitelských buněk, expresních vektorů vhodných k vyprodukování variant lidské DNázy I předloženého vynálezu jsou například ty, popsané v Shak, PCT Patent Publication No. WO 90/07572 (publikováno 12. července 1990).

Jestliže jsou používány jako hostitelé prokaryontní buňky nebo buňky, které obsahují silnější buněčnou stěnu, preferovanou metodou transfekce buněk s DNA je metoda působící kalciem, jak bylo popsáno vCohen, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 69:2110—2114 (1972) nebo polyethylenglykolová metoda, Chung, et. al., Nuc. Acids. Res. 16:3580 (1988). Jestliže jsou jako 25 hostitelské buňky použity kvasinky, transfekce je obecně prováděna pomocí polyethylenglykolu, jak bylo popsáno v Hinnen, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929-1933 (1978). Jestliže jsou jako hostitelské buňky použity savčí buňky, transfekce je obecně prováděna precipitační metodou pomocí kaličům fosfátu, Graham, et. al., Virology 52:546 (1978), Gorman, et. al., DNA and Protein. Eng. Těch. 2:3-10 (1990). Avšak jiné známé metody sloužící k vnesení DNA do 30 prokaraontních nebo eukaryontních buněk, jako jsou injekce do jádra, elektroporace nebo protoplastová fuze, jsou také vhodné k použití v tomto vynálezu.

Zvláště užitečné v tomto vynálezu jsou expresní vektory, které zajišťují krátkodobou (tranzientní) expresi DNA kódující variantu lidské DNázy I v savčích buňkách. Tranzientní exprese obecně 35 zahrnuje použití expresního vektoru, který je schopen účinné replikace v hostitelské buňce tak, že hostitelská buňka hromadí mnoho kopií expresního vektoru a tak syntetizuje vysoká množství žádaného polypeptidů, který je kódován tímto expresním vektorem. Tranientní expresní systémy obsahující vhodný expresní vektor a hostitelskou buňku umožňují vyhovující pozitivní identifikace polypeptidů kódovaných klonovanými DNA, stejně tak umožňují rychlé testování 40 těchto polypeptidů na žádané biologické nebo fyziologické vlastnosti. Wong, et. al., science 228:810-815 (1985); Lee, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985); Yang, et. al., cell 47:3-10 (1986). Tranzientní expresní systémy jsou tak výhodně používány kexprimování DNA kódující varianty aminokyselinové sekvence přirozené lidské DNázy I ve spojení se zkouškou, která identifikuje tyto varianty, které váží aktin s nižší afinitou než přirozená varianta 45 lidské DNázy I, stejně jako zkoušky k měření těchto variant na hydrolytickou aktivitu štěpení

DNA. Varianta lidské DNázy I je přednostně sekretována z hostitelských buněk, v kterých je exprimována. V tomto případě je varianta získána z kultivačního média, v kterém jsou hostitelské buňky pěstovány. V tomto případě může být výhodné pěstovat buňky v kultivačním médiu bez séra, protože nepřítomnost sérových proteinů a jiných sérových komponent v médiu může 50 usnadnit purifikaci varianty. Jestliže nedochází k sekreci, potom je varianta lidské DNázy I získána z lyzátu hostitelských buněk. Když je varianta exprimována v hostitelské buňce jiné než lidského původu, varianta bude zcela bez proteinů lidského původu. V každém případě bude nezbytné vyčistit variantu od rekombinantních buněčných bílkovin, aby se získaly velmi homogenní preparace varianty lidské DNázy I. Pro farmaceutická použití bude mít purifikovaná

-9CZ 288633 B6 varianta přednostně více než 99% čistotu (tj. jakákoliv jiná bílkovina bude obsahovat méně než % celkové bílkoviny v purifíkovaném preparátu).

Obecně je purifikace varianty lidské DNázy I prováděna pomocí využití různých fyzikálněchemických vlastností varianty v porovnání s kontaminantami, s nimiž může být asociována. Například jako první krok je kultivační médium nebo lyzát hostitelské buňky centrifugován, aby byly odstraněny hrubé buněčné zbytky. Varianta lidské DNázy I je posléze vyčištěna od kontaminujících rozpustných bílkovin a polypeptidů například amonium sulfátem nebo ethanolovým vysrážením, gelovou filtrací (molekulární vylučovací chromatografií), iontovou chromatografií, hydrofílní chromatografií, imunoafinitní chromatografií (např. pomocí kolony obsahující protilátky proti variantě lidské DNázy I, které jsou připoutány k Sepharóze), kationtovou chromatografií (Frenz, et. al., PCT Patent Publication No. WO 93/25670, publikováno 23. prosince 1993), reverzní fázovou HPLC anebo gelovou elektroforézou.

Ovšem odborník uvítá, když budou purifikační metody, které slouží k purifikování přirozené lidské DNázy I, vyžadovat některé modifikace, které jsou užitečné k purifikování varianty lidské DNázy I, jež jsou důsledkem strukturálních a jiných rozdílů mezi přirozenými a variantními bílkovinami. Například může být v některých hostitelských buňkách (zvláště bakteriálních hostitelských buňkách) varianta lidské DNázy I exprimována zpočátku v nerozpustné, agregované formě (odborně označované jako „refrakční tělíska“ nebo „inkluzní tělíska“).

V tomto případě bude nezbytné variantu lidské DNázy I rozpustit a renaturovat v průběhu její purifikace. Metody sloužící k rozpuštění a renaturování rekombinantních bílkovinných refrakčních tělísek jsou známy (viz např. Builder, et. al., U. S. Patent No. 4511502).

V jiném provedení tohoto vynálezu jsou varianty lidské DNázy I připraveny vytvořením kovalentních modifikací přímo v přirozené nebo variantní bílkovině lidské DNázy I. Tyto modifikace jsou vytvořeny, aby ovlivnily vázání aktinu nebo jinou vlastnost bílkoviny (např. stabilitu, biologický poločas rozpadu, imunogenicitu) a mohou být vytvořeny místo nebo ve spojení se substitučními, inzerčními a delečními mutacemi v aminokyselinové sekvenci popsanými výše.

Kovalentní modifikace mohou být zavedeny reagováním cílených aminokyselinových zbytků přirozené nebo variantní lidské DNázy I s organickým derivatizačním činidlem, které je schopno reakce s vybranými aminokyselinovými postranními řetězci nebo N- nebo C-terminálními zbytky. Vhodná derivatizační činidla a metody jsou dobře známa.

Například cysteinylové zbytky nejběžněji reagují s alfa-haloacetáty (a příslušnými aminy) jako je chloroacetová kyselina nebo chloroacetamid, které dávají karboxymethylové nebo karboxyamidomethylové deriváty. Cysteinylové zbytky jsou také derivovány reakcí s bromotrifluoracetonem, alfa-bromo-beta-(5-imidozoyl)propionovou kyselinou, chloroacetylfosfátem, N-alkylmaleimidy, 3-nitro-2-pyridyldisulfidem, methyl 2-pyridyldisulfidem, p-chloromerkuribenzoátem, 2-chloromerkuri-4-nitrophenolem nebo chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazolem.

Histidylové zbytky jsou derivovány reakcí s diethylpropylkabonátem při pH 5,5-7, protože toto činidlo je poměrně specifické na histidylový postranní řetězec. Para-bromofenylacyl bromid je také použitelný; reakce je přednostně prováděna v 0,1 M sodium kakodylátu při pH 6,0.

Lysinylové a aminoterminální zbytky jsou zreagovány s anhydridy kyseliny succinové nebo jiné karboxylové kyseliny. Derivace těmito činidly má vliv na změnu náboje lysinylových zbytků. Jiná vhodná činidla na derivaci zbytků obsahujících alfa-amino-skupinu zahrnují imidoestery jako jsou methyl picolinimidát, pyridoxal fosfát, pyridoxal, chloroborohydrid, trinitrobenzensulfonová kyselina, O-methylisourea, 2,4-pentandion a transaminázou katalyzované reakce s glyoxylátem.

-10CZ 288633 B6

Arginylové zbytky jsou modifikovány reakcí s jedním nebo několika konvenčními činidly mezi jinými fenylgíyoxal, 2,3-butandion, l,2cyklohexandion a ninhydrin. Derivace argininových zbytků vyžaduje, aby byla reakce prováděna v alkalickém prostředí kvůli vysokému pH guanidinové funkční skupiny. Dále pak mohou tato činidla reagovat se skupinami lysinu stejně jako s argininovou epsilon-aminoskupinou.

Karboxylové postranní skupiny (aspartyl nebo glutamyl) jsou selektivně modifikovány reakcí s karbodiimidy (R'-N=C=N-R'), kde R a R'jsou různé alkylové skupiny jako jsou 1-cyklohexyl3-(2-morpholinyl-4-ethyl)karbodiimid nebo l-ethyl-3-(4-aonia-4,4-dimethylpentyl) karbodiimid. Dále jsou aspartylové a glutamylové zbytky převedeny na sparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amonnými ionty.

Kovalentní připojení glykosidů k aminokyselinovým zbytkům bílkoviny může být použito na modifikaci nebo zvýšení počtu nebo profilu karbohydrátových substituentů, zvláště v místě nebo okolí místa těch zbytků, které se účastní vázání aktinu. V závislosti na použitém módu připojení může být připojen cukr (cukry) k (a) argininu a histidinu, (b) volným karboxylovým skupinám (c) volným sulfhydrylovým skupinám jako je cystein, (d) volným hydroxylovým skupinám jako jsou serin, threonin nebo hydroxyprolin, (e) aromatickým skupinám jako jsou fenylalanin, tyrosin nebo tryptofan, nebo (f) amidové skupině glutaminu. Vhodné metody jsou popsány např. v PCT Patent Publication No. WO 87/05330 (publikováno 11. září 1987) a v Aplin, et. al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Kovalentní navázání činidel jako jsou polyethylenglykol (PEG) nebo lidský sérový albumin k variantám lidské DNázy I snižuje imunogenicitu anebo toxicitu varianty anebo prodlužuje její poločas rozpadu, jak bylo pozorováno u jiných bílkovin. Abuchowski, et. al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Poznaňský, et. al., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson, et. al., Biotechnology 8:343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenům Press, 1992). Dále pak může modifikace přirozené lidské DNázy I nebo její varianty těmito činidly vmiste nebo v okolí místa (např. uvnitř přibližně pěti aminokyselinových zbytků) aminokyselinových zbytků, které ovlivňují vázání aktinu, vést kna aktin rezistentní variantě.

V dalším provedení může na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I obsahovat mutaci ve zbytku Asn, který se vyskytuje v pozici 74 aminokyselinové sekvence přirozené lidské DNázy I (např. mutace N74D, N74K nebo N74S), aby snížila nebo zabránila deaminaci varianty DNázy I. Frenz, et. al., PCT Patent Publication No. WO 93/25670, publikováno 23. prosince 1993. V jiném příkladu může na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I obsahovat mutaci v aminokyselinové sekvenci nebo jinou kovalentní modifikaci, která snižuje citlivost této varianty na degradaci proteázami (např. neutrofilní elastázou), které mohou být přítomny ve sputu a jiných biologických látkách.

Hydrolytická aktivita štěpení DNA a vazebná afinita k aktinu variant lidské DNázy I připravených jak bylo popsáno výše jsou přímo stanovovány pomocí zkoušek a metod, které jsou známy a byly zde popsány. Jakákoliv tato varianta mající hydrolitickou aktivitu štěpení DNA a sníženou vazebnou afinitu k aktinu (jak je definováno výše) je na aktin rezistentní varianta v rozsahu tohoto vynálezu.

Na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I tohoto vynálezu jsou používány ke snížení viskoelasticity materiálu obsahujícího DNA jako je sputum, hlen nebo jiné plicní sekrece. Tyto varianty jsou zvláště užitečné k léčení pacientů s plicními nemocemi, kteří mají abnormální viskózní nebo zahuštěné sekrece a stavy jako akutní nebo chronická průdušková plicní onemocnění zahrnující infekční zápal plic, bronchitidu nebo tracheobronchitidu, bronchiektázitidu, cystickou fibrózu, astma, tuberkulózu a plísňové infekce. Roztok nebo konečný rozdělený suchý přípravek na aktin rezistentní varianty je podáván obvyklým způsobem do dýchacích cest (např. průdušnic) nebo plic pacienta například v podobě aerosolu.

-11CZ 288633 B6

Na aktin rezistentní varianty jsou také užitečné pro přídatnou léčbu abscesů nebo závažných uzavřených infekcí při stavech jako empyém, meningitida, absces, peritonotida, sinusitida, otitida, periodontitida, perikarditida, pankreatitida, cholelithiatitida, andokraditida a septická 5 artritida, stejně jako při odborných léčbách u rozličných zánětlivých a infekčních poškozeních jako jsou infekční léze pokožky anebo mukózních membrán, chirurgických ran, vředových lézí a popáleninách. Na aktin rezistentní varianta může zlepšit účinnost antiobiotik používaných při léčbě takovýchto infekcí (např. gentamicinová aktivita je značně snížena reverzibilní vazbou k intaktní DNA).

Přirozená lidská DNáza I a na aktin rezistentní varianty mohou být také užitečné při léčbě systemické lupus erythematosis (SLE), život ohrožující autoimunní choroby charakterizované produkcí různorodých protilátek. DNA je hlavní antigenní složka imunitních komplexů. V tomto případě může být lidská DNáza (přirozená nebo variantní) podávána pacientovi systematicky, 15 například nitrožilně, podkožně, intrathekálně nebo intramuskulámě.

Přirozená lidská DNáza I a na aktin rezistentní varianty mohou být také užitečné při ochraně proti novému vývoji anebo aktivaci respiračních infekcí, které se mohou objevit u pacientů majících cystickou fibrózu, chronickou bronchitidu, astma, zápal plic nebo jiné plicní choroby nebo 20 u pacientů jejichž dýchání je usnadňováno ventilátorem nebo jiným mechanickým přístrojem anebo jiných pacientů, kteří jsou v nebezpečí vývinu dýchacích infekcí, například pacientů v poopeačním stavu.

Na aktin rezistentní varianty mohou být vyráběny podle známých metod k přípravě terapeuticky 25 účinných prostředků. Preferovaným terapeutickým prostředkem je roztok na aktin rezistentní varianty v pufrovaném nebo nepufrovaném vodném roztoku a nejlépe v izotonickém solném roztoku jako je 150 mM chlorid sodný obsahující 1,0 mM chlorid vápenatý při pH 7. Tyto roztoky jsou zvláště přizpůsobivé při použití v komerčně dostupných rozprašovačích účinných k dávkování přímo do dýchacích cest nebo plic poškozeného pacienta.

V dalším provedení obsahuje terapeutický prostředek suchý prášek na aktin rezistentní varianty přednostně připravený ve spreji vysušeného roztoku na aktin rezistentní varianty.

V dalším provedení obsahuje terapeutický prostředek buňky aktivně produkující na aktin 35 rezistentní varianty lidské DNázy I. Takové buňky mohou být přímo zaváděny do tkáně pacienta nebo mohou být uzavřeny do kapsulí s porézními membránami, které jsou implantovány pacientovi, ve všech případech za účelem dopravení na aktin rezistentní varianty do těch oblastí těla pacienta, které mají potřebu zvýšené koncentrace hydrolytické aktivity štěpení DNA. Například by mohly být transformovány pacientovy vlastní buňky, jak in vivo tak ex vivo, DNA 40 kódující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I, a tak použity k produkci DNázy přímo uvnitř pacienta.

Terapeuticky účinné množství na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I bude například záviset na množství DNA a aktinu v tkáni, která má být léčena, důvodech terapie, způsobu podávání 45 a stavu pacienta. Pro terapeuta bude podle toho nezbytné upravit dávku a zvolit způsob podávání, aby bylo dosaženo optimálního terapeutického efektu. Při pohledu na její sníženou vazebnou afinitu k aktinu a následovnou zvýšenou hydrolytickou aktivitu štěpení DNA v přítomnosti aktinu v poměru k přirozené lidské DNáze I bude množství na aktin rezistentní varianty potřebné k dosažení terapeutického efektu nižší než množství přirozené lidské DNázy I potřebné 50 k dosažení toho samého efektu při stejných podmínkách. Obecně bude terapeuticky účinné množství na aktin rezistentní varianty dávka od přibližně 0,1 ug do přibližně 5 mg varianty na kilogram tělesné váhy pacienta a toto množství bude podáváno jako farmaceutický prostředek tak, jak to zde bylo popsáno.

-12CZ 288633 B6

Na aktin rezistentní varianta DNázy I je příležitostně kombinována nebo podávána společně s jedním nebo více jiných farmaceutických prostředků používaných k léčbě stavů, které byly vyjmenovány výše, jako jsou antibiotika, bronchodilatátory, protizánětlivé prostředky, mukolytika (např. n-acetyl-cystein), aktin vázající nebo aktin degradující bílkoviny (např. gelsolin; Matsudaira, et. al., Cell 54:139-140 (1988); Stossel, et. al., PCT Patent Publication No. WO 94/22465 (publikováno 13. října 1994)), inhibitory proteázy nebo produkty genové terapie (např. obsahující gen pro transmembránový regulátor vodivosti u cystické fibrózy (CFTR), Riordan, et. al., Science 245:1066-1073 (1989)).

Následující příklady jsou podány pouze ilustrativně a nejsou míněny jako omezující tento vynález jakýmkoliv způsobem. Všechny patentové a literární odkazy, které jsou zde citovány, jsou důsledně začleněny.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kmen E. coli CJ236 (BioRad Laboiratories, Richmond, Califomia USA) byl transformován plazmidem pRK.DNase.3 použitím metody Chung, et. al., (Nucl. Acids. Res. 16:3580 (1988). Plazmid pRK.DNase.3 použitý v předloženém vynálezu je popsán v PCT Patent Publication No. WO 90/07572 (publikováno 12. července 1990) s výjimkou toho, že nukeotidová sekvence kódující lidskou DNázu I je taková jako na obr. 1. Transformované buňky byly vysety na agarové misky s LB obsahující 50 ug/ml karbenicilínu a 10 ul pomocného fágu VCSM13 (Stratagene, La Jola, Califomia USA) bylo inokulováno jednotlivou kolonií z agarové misky a pěstováno třepáním přes noc při 37 °C. Jednovláknová DNA byla izolována z této kultury a použita jako templát pro následnou mutagenezi.

Cílená mutageneze byla provedena pomocí syntetických oligonukleotidů podle metody popsané v Kunkel, et. al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987). Mutagenní oligonukleotidy byly 21-mery nebo 24-mery mající 9 nebo 12 přesných shod bází ve směru od 5' k neshodujícímu se kodónu a 9 přesných shod bází ve směru od 3' k neshodujícímu se kodónu. Po následné mutagenezi byla jednovláknová DNA z jednotlivých klonů sekvencována metodou dideoxy (Sanger, et. al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 72:3918-3921 (1979)). DNA mající variantní nukleotidové sekvence byly potom transformovány, jak to bylo popsáno výše, do kmene E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene). Po vysetí a izolaci jednotlivé kolonie stejně jako předešle byly jednotlivé kolonie použity kzaočkování 0,5 litru média LB obsahujícího 50 ug/ml karbenicilínu. Po následném pěstování třepáním přes noc při 37 °C byly buňky stočeny centrifugací a varianta DNA (v expresním vektoru) byla purifikována pomocí kolonek Qiagen tip—500 (Qiagen lne., Chatsworth, Califomia USA).

Obr. 2-6 identifikují různé varianty lidské DNázy I, které byly vytvořeny. Na těchto obrázcích a v příslušné specifikaci je popis aminokyselinových substitučních mutací přítomných ve variantě DNázy zkrácen do podoby prvního abecedního písmena, čísla a druhého abecedního písmena. První abecední písmeno je jednopísmenová zkratka aminokyselinového zbytku v přirozené (divoké) lidské DNáze I, číslo uvádí pozici tohoto zbytku v přirozené lidské DNáze I (číslování podle obr. 1) a druhé abecední písmeno je jednopísmenová zkratka aminokyselinového zbytku ve variantní DNáze I. Například, ve variantě DNázy I mající mutaci D53R je zbytek asparagové kyseliny (D) v pozici 53 v přirozené lidské DNáze I nahrazen argininovým zbytkem (R). Několikanásobné mutace v jednotlivé variantě jsou uvedeny podobně, navíc s dvojtečkou (:) oddělující každou z různých mutací, které se vyskytují ve variantě. Například D53R:Y65A uvádí, že varianta má mutaci D53R a mutaci Y65A.

-13CZ 288633 B6

Příklad 2

Exprese variant lidské DNázy I: Lidské embryonální ledvinné buňky 293 (ATCC CRL 1573, Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) byly pěstovány v médiích obsahujících sérum v 150 mm plastových Petriho miskách. Buňky v logaritmické fázi růstu byly tranzientně kontransfekovány 22,5 ug purifikované variantní DNA (připravené jak je to uvedeno výše) a 17 ug adenovirové DNA pomocí kalcíum fosfátové precipitační metody (Gorman, et. al., DNA and Protein Eng. Těch. 2:3-10 (1990)). Přibližně 16 hodin po transfekci byly buňky promyty 15 ml fosfátového pufrovaného fyziologického roztoku a médium bylo vyměněno za médium bez séra. Dva výtěžky napěstovaných buněk byly vybrány z každé misky, první buď po 24 nebo 72 hodinách a druhý po 96 od výměny média bez séra. Celkově bylo tímto způsobem získáno přibližně 50 ml buněčného supematantu, který obsahoval variantu DNázy I. Výtěžek supematantu pocházejícího z každé misky byl zakoncentrován 5krát až 5krát pomocí koncentračních pomůcek Centripep 10 a koncentráty byly testovány na stanovení různých biochemických a biologických aktivit variant DNázy I.

Koncentrát obsahující přirozenou lidskou DNázu I byl připraven stejným postupem jak to bylo popsáno výše, s výjimkou toho, že buňky 293 byly tranzientně transfekovány plazmidem pRK.DNase.3.

Příklad 3

Biochemické a biologické aktivity variant lidské DNázy I: I. Relativní specifická aktivita: Relativní specifická aktivita variant lidské DNázy I byla stanovena porovnáním aktivity variantní a přirozené DNázy I ve dvou různých zkouškách. Relativní specifická aktivita variant je zvláště definována jako koncentrace varianty (v ug/ml) stanovená ve zkoušce aktivity methylovou zelení (Sinicropi, et. al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)), vydělená koncentrací varianty (v ug/ml) stanovené ve zkoušce ELISA DNázy I (popsáno výše). V obou zkouškách aktivity methylovou zelení a zkoušce ELISA DNázy I byly stanoveny standardní křivky pomocí Pulmozyme® lidské DNázy I. Relativní specifická aktivita přirozené lidské DNázy I a variant je znázorněna na obr. 2.

Zkouška aktivity methylovou zelení (Sinicropi, et. al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994); Kumick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)) využívá barvivo methylovou zeleň, která interkaluje do přibližně každých 10 bází v DNA, a výsledkem je zelený substrát. Protože DNA je štěpena DNázou I, barvivo methylová zeleň je uvolňováno a oxidováno na bezbarvou formu. Tak je ztráta zelené barvy přímo úměrná množství DNázy I přidané do testovaného vzorku. Množství DNázy I přítomné ve zkoušce je potom vypočítáno porovnáním se standardní křivkou, které odpovídá známým množstvím DNázy I.

Zkouška ELISA DNázy I zahrnuje pokrytí mikrotitračních misek kozími polyklonálními protilátkami proti DNáze I, přidání vzorku, který má být testován, a detekci jakékoliv výsledné navázané DNázy I na králičí polyklonální protilátky proti DNáze I, která je konjugována s křenovou peroxidázou (HRP). Když jsou substrát HPR a činidlo na barevné vyvolání přidány, vyvolaná barva je úměrná množství DNázy I přítomné ve vzorku. Množství DNázy I přítomné ve zkoušce je potom vypočítáno srovnáním se standardní křivkou, které odpovídá známým množství DNázy I.

V obou zkouškách bylo testováno mnoho naředěných vzorků a tyto hodnoty, které spadají do střední oblasti standardní křivky, byly způměrovány a byly vypočítány standardní odchylky.

Také koncentrace DNázy I tak, jak byla stanovena zkouškou ELISA DNázy I, byla použita ke standardizaci koncentrací DNázy I při jiných zkouškách, při kterých byly varianty DNázy I charakterizovány (např. ve zkoušce inhibice aktinem, popsané níže).

-14CZ 288633 B6

II. Inhibice hydrolytické aktivity štěpení DNA aktinem: G-aktin (Kabsch, et. al., Ann. Rev. Biophys. Biomol Struct. 21:49-76 (1992)) byl připraven méně než 10 dní před použitím dialyzací roztoku o koncentraci 1 mg/ml komerčně dostupného preparátu aktinu (Sigmě, St. Louis, Missouri USA) přes noc proti 5 mM HEPESu, pH 7,2, 0,2 mM CaCL₂, 0,5 mM ATP, 0,5 mM beta-merkaptoethenol při 4 °C. Po centrifugaci při 13 000 ^xg 5 min. bylo vypočítáno množství G-aktinu měřením absorbance při 290 nm; roztok o koncentraci l mg/ml má absorbanci 0,66 OD. Množství preparátu G-aktinu potřebné k značné (více než 50 %) nikoli však celkové inhibici hydrolytické aktivity štěpení DNA přirozené lidské DNázy I bylo stanoveno v předběžných pokusech za stejných podmínek použitých pro každou zkoušku.

Citlivost na inhibici aktinem byla stanovena měřením hydrolytické aktivity štěpení DNA variant v přítomnosti nebo nepřítomnosti aktinu v každé ze dvou různých zkoušek, předešle popsané zkoušce na methylenovou zeleň a ve zkoušce hyperchromicity, která je založena na zvýšení absorbance při 260 nm, když je DNA denaturována a depolymerována (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)). Procento inhibice vybrané varianty v těchto zkouškách je znázorněno na obr. 3 a 4.

Při zkoušce hyperchomicity byly koncentrované supematanty z kultur (připravených jak bylo popsáno výše, obsahující varianty DNázy I) inkubovány jak bezpřidání, tak s přidáním 2 až 3násobného molámího přebytku aktinu v pufru A (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 0,1% BSA) jednu hodinu při pokojové teplotě před přidáním do kyvety obsahující 40 ug DNA v celkovém objemu zkoušky 1,0 ml. Konečná koncentrace varianty DNázy I ve zkoušce byla přibližně 26 nM, jak bylo stanoveno zkouškou ELISA DNázy I. Poměry hydrolýzy DNA variantami DNázy I v přítomnosti nebo nepřítomnosti aktinu byly měřeny. Procento aktivity znázorněné na obr. 3 a 4 bylo vypočítáno stanovením poměru hydrolytické aktivity štěpení DNA lidské DNázy I (přirozené nebo variantní) v přítomnosti aktinu k její hydrolytické aktivitě v nepřítomnosti aktinu a vynásobením dosažené hodnoty 100.

Při zkoušce na methylenovou zeleň byly koncentrované supematanty z kultur (připravených jak bylo popsáno výše, obsahující varianty DNázy I) inkubovány jak bez přidání, tak s přidáním lOOOnásobného molámího přebytku aktinu v pufru B (25 mM HEPES, pH 7,5 4 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 0,1% BSA, 0,01% thiomerosal a 0,05% Tween 20) 16 hodin při 37 °C. Koncentrace aktivního enzymu byla v každém případě odhadnuta porovnáním se standardní křivkou Pulmozyme®. „Procento aktivity“ zůstávající variantě se vztahuje ke lOOnásobnému poměru aktivity v přítomnosti aktinu vzhledem k aktivitě v nepřítomnosti aktinu.

Jak je znázorněno na obr. 3 a 4, hydrolytická aktivita štěpení DNA přirozené lidské DNá2y I je podstatně snížena v přítomnosti aktinu. V porovnání s tímto byly různé jedno a více zbytkové varianty přirozené lidské DNázy I relativně rezistentní na inhibici aktinem, jak je vidět z toho, že mají větší hydrolytickou aktivitu štěpení DNA v přítomnosti aktinu než má přirozená lidská DNáza I.

III. ELISA vázající aktin: Zkouška založená na mikrotitru byla vyvinuta za účelem měření vázání přirozené lidské DNázy I a variant DNázy I k imobilizovanému aktinu. Nejprve byly komůrky misky MaxiSorp (Nunc, lne., Naperville, Illinois USA) potaženy lidským globulinem GC (Calbiochem, La Jolla, Califomia USA) v objemu 100 ul na komůrku, bílkovinou vázající aktin (Goldschmidt-Clermont, et. al. Biochem J. 228:471-477 (1985), Mcleod, et. al., J. Biol. Chem. 264:1260-1267 (1989), Houmeida, et. al., Eur. J. Biochem. 203:499-503 (1992) v koncentraci lOug/ml v 25 mM HEPES, ph 7,23, 4 mM MgCl₂, 4 mM CaCl₂, 16-24 hodin při 4°C. Po odstranění globulinu GC byl přebytečné reaktivní místa blokována přidáním pufru C (pufr C je stejný jako pufr B, viz výše, s přídavkem 0,5 mM adenosintrifosfátu; pufr C byl použit jako ředící ve všech následujících krocích, pokud nebude jinak uvedeno) a inkubovány v misce na třepačce 1-2 hodiny při pokojové teplotě. Každý inkubační krok, který následoval, probíhal při pokojové teplotě jednu hodinu na třepačce Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Vineland,

-15CZ 288633 B6

New Yersey USA); mezi každým krokem byla miska vyprázdněna a 6krát promyta fosfátovým pilířovaným fyziologickým roztokem obsahujícím 0,05% Tween 20 s proplachovacím roztokem Microwash II (Skarton A/S, Norsko). Dále byl G-aktin připravený, jak je uvedeno výše, naředěn na koncentraci 50 ug/ml vpufru C a 100 ul bylo přidáno do každé komůrky; misky byly inkubovány a promyty a 100 ul různých naředění Pulmozyme® a buněčného média obsahujícího jak přirozenou lidskou DNázu I, tak jejích variant, byly přidány do komůrek a misky inkubovány a promyty. Nakonec bylo 100 ul naředění 1/25000 konjugátu králičí polyklonální protilátky proti lidské DNáze I a křenové peroxidázy (původní koncentrace zásobního roztoku byla 465 ug/ml) přidáno do každé komůrky. Po inkubaci a promytí byl vývoj zabarvení zahájen přidáním 100 ul činidla (Sigma Fast o-phenylendiamin a tablety močovina/H₂O₂ rozpuštěné podle doporučení výrobce) do každé komůrky a zastaven přidáním 100 ul 4,5 N H₂SO₄ na misku. Absorbance při 492 nm byla zaznamenána a nakreslena proti koncentraci DNázy na začátku přidané do komůrky. Sigmoidální křivky byly výsledkem pro přirozenou lidskou DNázu I a ty varianty, které se vázaly k aktinu; tyto křivky byly shodné s čtyř parametrovou rovnicí pro nelineární regresivní analýzu (Makquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:431-441 (1963); koncentrace každé DNázy (přirozené nebo variantní) potřebné k získání polovičního signálu proti maximu ve zkoušce byla vypočítána z křivek a je vztažena na hodnotu EC₅o- Molekulární hmotnosti přirozené lidské DNázy I a variant byly stanoveny na 37 000 Daltonů.

Relativní vazebná afinita každé varianty lidské DNázy I byla vypočítána vydělením hodnoty EC₅o varianty hodnotou EC50 přirozené lidské DNázy I stanovené zkouškou ELISA a výsledky jsou znázorněny na obr. 5. Jestliže byla relativní vazebná afinita varianty lidské DNázy I vypočítána jako hodnota 5, bude to znamenat, že hodnota EC₅₀ varianty je 5krá větší než hodnota EC50 přirozené lidské DNázy I, nebo jinými slovy, že varianta má afinitu k aktinu, která je 5krát menší než afinita přirozené lidské DNázy I k aktinu v této zkoušce ELISA.

IV. Zkouška kompaktnosti sputa: Zkouška kompaktnosti sputa (PCT Patent Publication No. WO 94/10567, publikováno 11. května 1994) byla použita k měření relativní viskoelasticity sputa od pacientů s cystickou fibrózou („sputum CF“) před a po inkubaci s přirozenou lidskou DNázou I a různými variantami DNázy I. Po smíchání sputa CF se vzorkem DNázy I a inkubaci 20 min. v pokojové teplotě byly polopevné roztoky naneseny do kapilárních trubiček, které byly potom centrifugovány 20 minut při 12000 ot./min. Po centrifugaci byla zjištěna hmotnost sedimentu a porovnána s hmotností roztoku a sedimentu. Tato měření byla potom použita k výpočtu procenta kompaktnosti sputa, což odpovídá viskoelasticitě sputa.

Procento kompaktnosti stanovené při působení přirozenou lidskou DNázou I a na aktin rezistentními variantami lidské DNázy I je znázorněno na obr. 6. Tyto výsledky ukazují, že na aktin rezistentní varianty lidské DNázy I jsou účinnější než přirozená lidská DNáza I při snižování viskoelasticity sputa CF, jak to bylo stanoveno zkouškou kompaktnosti.

-16CZ 288633 B6

INFORMACE PRO SEKV. ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: (A) DÉLKA: 260 aminokyselin (B) TYP: amonokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 1:

Leu 1

Lys

Ile

Ala

Ala 5

Phe

Asn

Ile

Gin

Thr 10

Phe

Gly

Glu

Thr

Lys 15

Met

Ser

Asn

Ala

Thr 20

Leu

Var

Ser

Tyr

Ile 25

Val

Gin

Ile

Leu

Ser 30

Arg

Lys

Asp

Ile

Ala 35

Leu

Val

Gin

Glu

Val 40

Arg

Asp

Ser

His

Leu 45

Thr

Ala

Val

Gly

Lys 50

Leu

Leu

Asp

Asn

Leu 55

Asn

Gin

Asp

Ala

Pro 60

Asp

Thr

Tyr

His

Tyr 65

Val

Val

Ser

Glu

Pro 70

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser 75

Tyr

Lys

Glu

Arg

Tyr 80

Leu

Phe

Val

Tyr

Arg 85

Pro

Asp

Gin

Val

Ser 90

Ala

Val

Asp

Ser

Tyr 95

Tyr

Tyr

Asp

Asp

Gly 100

Cys

Glu

Pro

Cys

Gly 105

Asn

Asp

Thr

Phe

Asn 110

Arg

Glu

Pro

Ala

Ile 115

Val

Arg

Phe

Phe

Ser 120

Arg

Phe

Thr

Glu

Val 125

Arg

Glu

Phe

Ala

Ile 130

Val

Pr©

Leu

His

Ala 135

Ala

Pro

Gly

Asp

Ala 140

Val

Ala

Glu

Ile

Asp 145

Ala

Leu

Tyr

Asp

Val 150

Tyr

Leu

Asp

Val

Gin 155

Glu

Lys

Trp

Gly

Leu 160

Glu

Asp

Val

Met

Leu 165

Met

Gly

Asp

Phe

Asn 170

Ala

Gly

Cys

Ser

Tyr 175

Val

Arg

Pro

Ser

Gin

Trp

Ser

Ser

Ile

Arg 185

Leu

Trp

Thr

Ser

Pro 190

Thr

Phe

Gin

Trp

Leu 195

Ile

Pro

Asp

Ser

Ala 200

Asp

Thr

Thr

Ala

Thr 205

Pro

Thr

His

Cys

Ala 210

tyr

Asp

Arg

Ile

Val 215

Val

Ala

Gly

Met

Leu 220

Leu

Arg

Gly

Ala

Val 225

Val

Pro

Asp

Ser

Ala 230

Leu

Pro

Phe

Asn

Phe 235

Gin

Ala

Ala

Tyr

Gly 240

Leu

Ser

Asp

Gin

Leu 245

Ala

Gin

Ala

Ile

Ser 250

Asp

His

Tyr

Pro

Val 255

Glu Val Met Leu Lys

260

-17CZ 288633 B6

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I, kde uvedená varianta má alespoň 90% identitu s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 a alespoň jednu aminokyselinovou substituci za jinou v jedné z následujících pozic: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 114.
2. 2. Varianta podle nároku 1, která má alespoň 95% identitu s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 a alespoň jednu aminokyselinovou substituci za jinou v jedné z následujících pozic: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 114.
3. 3. Varianta podle nároku 1, která má aminokyselinou sekvenci znázorněnou na obr. 1 a alespoň jednu aminokyselinovou substitucí za jinou v jedné z následujících pozic: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 114.
4. 4. Varianta podle nároku 3, která má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1 a aminokyselinovou substituci v pouze jedné z následujících pozic: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 114.
5. 5. Varianta podle nároku 3, která má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1 a aminokyselinovou substituci ve dvou nebo více z následujících pozic: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu 52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 nebo Ala 114.
6. 6. Varianta podle nároku 4, kde aminokyselinová substituce vytváří glykosylační místo uvnitř této varianty, které není přítomné v přirozené lidské DNáze I.
7. 7. Varianta podle nároku 5, kde aminokyselinová substituce vytváří glykosylační místo uvnitř této varianty, které není přítomné v přirozené lidské DNáze I.
8. 8. Varianta podle nároku 1, která má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1 a alespoň jednu z následujících aminokyselinových substitucí D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65E, Y65R, V67E, nebo E69R.
9. 9. Varianta podle nároku 1, která má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 1 a aminokyselinovou substituci vybranou ze skupiny zahrnující: D53R, Y65A, H44A, E69R, H44A : D53R : Y65A, H44A : Y65A : E69R, D53R : Y65A : E69R a V67K.
10. 10. Izolovaná nukleová kyselina kódující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
11. 11. Izolovaná nukleová kyselina kódující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I podle nároku 8.
12. 12. Izolovaná nukleová kyselina kódující na aktin rezistentní variantu lidské DNázy I podle nároku 9.
13. 13. Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro léčení pulmonámí nemoci.
14. 14. Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro léčení cystické fibrózy.

    -18CZ 288633 B6
15. 15. Na aktin rezistentní varianta lidské DNázy I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro léčení bronchitidy.