HU223272B1 - Humán dezoxiribonukleáz I variánsok - Google Patents

Abstract

A találmány a humán DNáz I aminosavszekvencia-variánsaira vonatkozik,amelyek csökkentett aktinkötő affinitással rendelkeznek. A találmánytárgyát képezik továbbá az ilyen variánsokat kódolónukleinsavszekvenciák, melyek lehetővé teszik ezeknek a variánsoknaknagy mennyiségben történő előállítását klinikai célokra. A találmánytovábbá a humán DNáz I aktinrezisztens variánsait tartalmazógyógyászati készítményekre is vonatkozik. ŕ

Description

A találmány a humán dezoxiribonukleáz I-gyel (DNáz I), a polidezoxiribonukleinsav hidrolizálására képes foszfodiészterázzal végzett kutatásokból kapott eredményekre vonatkozik. Közelebbről a találmány a humán DNáz I módosított formáira (variáns), ezek rekombináns DNS módszerekkel történő előállítására, gyógyászati készítményekre, melyek által klinikailag hasznosíthatók, továbbá a DNáz-variánsokat alkalmazó eljárásokra és ezek kompozícióira vonatkozik.

A DNáz egy olyan foszfodiészteráz, amely hidrolizálni képes a polidezoxiribonukleinsavat. A DNáz I-et különböző fajokból különböző mértékig tisztították.

A szarvasmarhából származó DNáz I-et biokémiailag széleskörűen tanulmányozták [lásd például Moore, in The Enzymes (Boyer, P. D. kiadó), 281-296. o., Academic Press, New York (1981)]. A szarvasmarhaDNáz I teljes aminosavszekvenciája is ismert [Liao és munkatársai: J. Bioi. Chem. 248, 1489-1495 (1973)]; Oefner és munkatársai: J. Mól. Bioi. 192, 605-632 (1986); Lahm és munkatársai: J. Mól. Bioi. 221, 645-667 (1991)], és a szarvasmarha-DNáz-t kódoló DNS-szekvenciát klónozták és kifejezték [Worrall és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 21 889-21 895 (1990)]. A szarvasmarha-DNáz I szerkezetét röntgenkrisztallográfiával meghatározták [Suck és munkatársai: EMBO J. 3, 2423-2430 (1984); Suck és munkatársai: Natúré 321, 620-625 (1986); Oefner és munkatársai: J. Mól. Bioi. 192, 605-632 (1986)].

A humán DNáz-t kódoló DNS-t izolálták és szekvenálták, és ezt a DNS-t rekombináns gazdasejtekben expresszálták, ezáltal lehetővé vált a humán DNáz I termelése kereskedelmileg felhasználható mennyiségben [Shak és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9188-9192 (1990)].

A DNáz I számos ismert felhasználási területtel rendelkezik, és terápiás célokra is használatos. Fő terápiás alkalmazása abban áll, hogy csökkenti a tüdőváladékok (mucus) viszkozitását olyan megbetegedésekben, mint például a tüdőgyulladás és cisztikus fibrózis (CF), és ezáltal elősegíti a légutak tisztulását [lásd például Lourenco és munkatársai: Arch. Intem. Med. 142,2299-2308 (1982); Shak és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9188-9192 (1990); Hubbard és munkatársai: New Engl. J. Med. 326,812-815 (1992); Fuchs és munkatársai: New Engl. J. Med. 331, 637-642 (1994); Bryson és munkatársai: Drugs 48, 894-906 (1994)]. A nyálkás váladék (mucus) is hozzájárul a következő megbetegedések súlyosságához: krónikus bronchitis, asztmás bronchitis, bronchiectasis, emphysema, akut és krónikus arcüreggyulladás (sinusitis), sőt még a közönséges megfázáshoz is.

Az ilyen betegségekben szenvedő egyének tüdőváladékai komplex anyagok, amelyek nyálkaglikoproteineket, mukopoliszacharidokat, proteázokat, aktint és DNS-t tartalmaznak. A tüdőváladékokban lévő anyagok közül néhány leukocitákból származik (neutrofilek), amelyek infiltrálják a tüdőszövetet a mikrobák (például Pseudomonas, Pneumococcus törzsek vagy Staphylococcus baktériumok) vagy egyéb irritáló anyagok (például dohányfüst, pollen) jelenlétére adott válaszban. Az ilyen mikrobákkal vagy irritáló anyagokkal való reakció során a leukociták degenerálódhatnak, és felszabadítják tartalmukat, amely növeli a tüdőváladékok viszkozitását.

A DNáz I-nek az a képessége, hogy csökkenti a tüdőváladékok viszkoelaszticitását, a neutrofilek által felszabadított nagy mennyiségű DNS enzimes lebontásának tulajdonítható [Shak és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9188-9192 (1990); Aitken és munkatársai: J. Am. Med. Assoc. 267, 1947-1951 (1992)].

Egészen mostanáig eltérő mechanizmusokat javasoltak a DNáz I mukolitikus (nyákoldó) hatásának magyarázatára, amely magában foglalja az aktin dezintegrációját [Vasconcellos és munkatársai: Science 263, 969-971 (1994)]. Az aktin egyike az eukarióta sejtekben leggyakrabban előforduló fehérjéknek (például az aktin tartalmazza a teljes leukocitafehérje körülbelül 10%-át), melyet széleskörűen tanulmányoztak [Kabsch és munkatársai: Ann. Rév. Biophys. Biomol. Struct. 21, 49-76 (1992); Sheterline és munkatársai: Prot. Profilé 1, 1-121 (1994)]. Az aktin kétféle formában fordul elő, egy monomer formában (G-aktin) és egy rostos formában (F-aktin), amely G-aktin-monomerekből tevődik össze. Az aktinpolimer rostjai nagyon viszkoelasztikusak, és lényegesen hozzájárulnak a tüdőváladékok viszkozitásához [Momet és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 3680-3684 (1984); Newman és munkatársai: Biochemistry 24, 1538-1544 (1985); Janmey és munkatársai: Biochemistry 27, 8218-8226 (1988); Vasconcellos és munkatársai: Science 263, 969-971 (1994)].

Mivel a DNáz-ról ismert, hogy kötődik az aktinhoz [Lazarides és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. 71, 4742-4746 (1974); Kabsch és munkatársai: Natúré 347, 37-44 (1990)], és hogy depolimerizálja az aktinrostokat (valamint gátolja a G-aktin rostokká történő polimerizációját) [Mannherz és munkatársai: FEBS Lett. 60, 34-38 (1975); Hitchcock és munkatársai: Cell 7, 531-542 (1976); Pinder és munkatársai: Biochemistry 21, 4886-4890 (1982); Weber és munkatársai: Biochemistry 33, 4780-4786 (1994)], azt feltételezték, hogy a DNáz I mukolitikus hatása a köpeten (sputum) vagy más tüdőváladékokon inkább az aktinaggregátumok széteséséhez (depolimerizáció), mint DNS-hidrolízishez vezet [Vasconcellos és munkatársai: Science 263, 969-971 (1994)]. Ezzel az állásponttal megegyezően az is ismert, hogy az aktin jelenlétében a DNáz I DNS-hidrolitikus hatása gátolt [Lazarides és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. 71, 4742-4746 (1974); Mannherz és munkatársai: Eur. J. Biochem. 104, 367-379 (1980)]. Ezzel a feltételezéssel egyezésben azt is közölték, hogy az aktin-védőfehéijék (például gelsolin) aktívak a cisztikus fibrózisban keletkezett köpet (sputum) viszkoelaszticitásának csökkentésében [Vasconcellos és munkatársai: Science 263, 969-971 (1994); Stossel és munkatársai: WO 94/22465 számú PCT-beli közrebocsátási irat (publikálva 1994. 10. 13.)].

A találmány részben azon a feltalálók által végzett kutatáson alapul, hogy meghatározzák a DNáz I mukolitikus aktivitásának biokémiai alapját. Ez a kutatás ma2

HU 223 272 Bl gában foglalja különböző humán DNáz I-variánsok szintézisét és jelölését, továbbá ezeknek a variánsoknak a vizsgálatát, hogy milyen mértékben képesek a DNS-t hidrolizálni, az aktinhoz kötődni és a váladék viszkoelaszticitását in vitro csökkenteni. A feltalálók létrehozták a humán DNáz I-variánsok különböző osztályait. A variánsok egyik osztálya (aktinrezisztens variánsok) csökkenti az aktinkötő képességet, de megtartja a mukolitikus aktivitást, és néhány esetben növeli a mukolitikus aktivitást a natív humán DNáz I-hez viszonyítva. Ezek az aktinrezisztens variánsok körülbelül ugyanolyan DNS-hidrolitikus aktivitással rendelkeznek, mint a natív humán DNáz I, de az ilyen aktivitás kevésbé érzékeny az aktin általi gátlásra. A variánsok második osztálya ugyanolyan affinitással kötődik az aktinhoz, mint amilyent a natív humán DNáz I-nél kimutattak, de csökken a mukolitikus aktivitás és a DNS-hidrolitikus aktivitás a natív humán DNáz I-hez viszonyítva.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a humán DNáz I tüdőváladékok viszkoelaszticitásának csökkentésében mutatott terápiás hatékonysága inkább tulajdonítható a katalitikus, DNS-hidrolitikus aktivitásának, mint annak a képességének, hogy depolimerizálja a rostos aktint. Ennek megfelelően azok a humán DNáz I-variánsok, melyek alacsonyabb affinitással kötik meg az aktint, mint a natív humán DNáz I, de még DNS-hidrolitikus aktivitással rendelkeznek, felhasználhatók lehetnek terápiás szerekként, különösen olyan betegek kezelésében, akik tüdőváladéka viszonylag nagy mennyiségű aktint tartalmaz. Mivel az ilyen variánsok csökkentett affinitást mutatnak az aktin irányába, DNS-hidrolitikus aktivitásuk is kevésbé gátolt aktin jelenlétében, és így ezek a variánsok nagyobb mukolitikus aktivitással bírnak aktin jelenlétében, mint a natív humán DNáz I.

A fentiek alapján a találmány egyik tárgyát humán DNáz I-variánsok képezik, melyek DNS-hidrolitikus aktivitással rendelkeznek, de az aktint alacsonyabb affinitással kötik meg, mint a natív humán DNáz I.

A találmány másik tárgyát az ilyen aktinrezisztens humán DNáz I-variánsokat kódoló nukleinsavak, ezeket a nukleinsavakat tartalmazó vektorok, az ilyen nukleinsavakkal vagy vektorokkal transzformált rekombináns gazdasejtek és a humán DNáz I-variánsok előállítására szolgáló rekombináns DNS-technológia segítségével végzett eljárások képezik.

A találmány tehát aktinrezisztens humán DNáz I-re vonatkozik, amely DNS-hidrolitikus aktivitású és csökkent aktinkötő affinitású, továbbá legalább 90%-ban azonos a natív humán DNáz I, az 1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciájával, és amelyben legalább egy aminosav helyettesítve van egy másik aminosavval az alábbi helyek egyikénél vagy többjénél: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Valóó, Val67, Glu69 és Alall4.

A találmány továbbá olyan variánsra is kiterjed, amelynek az 1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciája van, kivéve, hogy legalább egy aminosav helyettesítve van az alábbi helyek egyikénél vagy többjénél: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 és Alall4.

Olyan variáns is a találmány tárgya, amelynek legalább egy aminosavhelyettesítése van a következők közül: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K. és E69R, vagy amelynek legalább egy aminosavhelyettesítése van a következők közül: D53R, Y65A, H44A, E69R, H44A:D53R: Y65A, H44A: Y65A:E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R és V67K.

A találmány szerinti variánsok közé tartozik az is, amelynek legalább 95%-os azonossága van a natív humán DNáz I 1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciájához.

A találmány kiterjed azon izolált nukleinsavakra, amelyek valamely felsorolt humán DNáz I aktinrezisztens változatát kódolják.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény a felsoroltaknak megfelelő humán DNáz I aktinrezisztens variánst és kívánt esetben valamely gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, és a készítmény lehet folyadék formájú vagy por formájú.

A találmány segítségével egy betegben a DNS-tartalmú anyag viszkoelaszticitásának vagy viszkózus konzisztenciájának csökkentésére szolgáló eljárás is végrehajtható, amelynek lényege egy DNáz I aktinrezisztens variáns terápiásán hatékony mennyiségének beadása a betegnek.

A találmány különösen olyan betegségben szenvedő beteg kezelésénél alkalmazható, mint a cisztikus fibrózis, krónikus hörghurut (bronchitis), tüdőgyulladás (pneumonia), hörgőtágulat (bronchiectasis), tüdőtágulat (emphysema), asztma vagy szisztémás lupus erythematosus, és magában foglalja egy DNáz I aktinrezisztens variáns terápiásán hatékony mennyiségének beadását a betegnek.

A találmány továbbá humán DNáz I aktinrezisztens variánsok felhasználására is vonatkozik egy betegből nyert viszkózus anyag (például köpet) in vitro diagnosztikai vizsgálataiban abból a célból, hogy megméijük a jelen lévő aktin mennyiségét, és meghatározzuk, vajon a beteg alkalmas jelölt-e az aktinrezisztens DNáz I-variánssal történő kezelésre.

A találmány fent megadott és egyéb tárgyai nyilvánvalóak lesznek a területen jártas szakember számára a teljes leírás figyelembevételével.

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra a humán érett DNáz I aminosavszekvenciáját mutatja be (SEQ. ID. NO: 1). A számok a szekvencián belül az aminosavmaradékok helyzetét jelzik.

A 2. ábrán a natív humán DNáz I és variánsok relatív specifikus aktivitása látható. A hibahatárok a standard deviációt jelentik (nátlag), A Pulmozyme® humán DNáz I (Genentech, Inc., South San Francisco, Califomia USA) relatív specifikus aktivitását definiáltuk 1-nek. A natív humán DNáz I relatív specifikus aktivitása nagyobb, mint a Pulmozyme® aktivitása, ami arra vezethető vissza, hogy a Pulmozyme®-ban a DNáz I dezaminált for3

HU 223 272 Bl mája is előfordul, amely csökkentett DNS-hidrolitikus aktivitással rendelkezik [Frenz és munkatársai: WO 93/25670 számú PCT-beli közrebocsátást irat (publikálva: 1993.12.23.)].

A 3. ábra a natív humán DNáz I és a humán DNáz I olyan variánsainak DNS-hidrolitikus aktivitását ábrázolja aktin jelenlétében egy hiperkromicitásvizsgálatban meghatározva, melyekben egyetlen aminosavmaradékot helyettesítettünk. A „%-os aktivitás” a DNáz I (natív vagy variáns) DNS-hidrolitikus aktivitása %-ban kifejezve, melyet a 3. példában leírtak szerint számítottunk; a DNáz I aktin távollétében mért DNS-hidrolitikus aktivitását definiáltuk 100%-os aktivitásnak. A hibahatárok jelentik a standard deviációt.

A 4. ábra a natív humán DNáz I és a humán DNáz I olyan variánsainak DNS-hidrolitikus aktivitását mutatja be aktin jelenlétében egy hiperkromicitásvizsgálatban vagy egy metilzöld assay-ben meghatározva, melyekben egyszerre több aminosavmaradékot helyettesítettünk. A „%-os aktivitás” a DNáz I (natív vagy variáns) DNS-hidrolitikus aktivitása %-ban kifejezve, melyet a 3. példában leírtak szerint számítottunk; a DNáz I aktin távollétében mért DNS-hidrolitikus aktivitását definiáltuk 100%-os aktivitásként. A hibahatárok jelentik a standard deviációt.

Az 5. ábra humán DNáz I-variánsok relatív aktint kötő affinitását ábrázolja, melyet egy aktinkötő ELISA assay-vel határoztunk meg (lásd 3. példa). Az EC₅₀-érték az a DNáz I- (natív vagy variáns) koncentráció, amely szükséges ahhoz, hogy egy félmaximális jelet kapjunk a vizsgálatban. A hibahatárok jelentik a standard deviációt. A Pulmozyme®-ra és a natív humán DNáz I-re kapott EC₅₀-értékek 72±21 pM (n=21) illetőleg 85±14 pM (n=14). Az ábrán bemutatott relatív kötőaffinitás a humán DNáz I-variánsra meghatározott EC₅₀-érték osztva a natív humán DNáz I-re meghatározott EC₅₀értékkel. Azoknál a variánsoknál, ahol az EC₅₀-érték nagyobb, mint amit az assay-ben mérni lehetett, a következő jelölést alkalmaztuk: >35, >350, >1750, >3500 vagy >35 000.

A 6. ábra a natív humán DNáz I és a humán DNáz I-variánsok mukolitikus aktivitását mutatja be cisztikus fibrózisban szenvedő betegekből származó köpetmintákon tömörségi teszttel meghatározva. A hibahatárok az átlag standard hibáját jelentik.

A 7. ábra sematikusan ábrázolja a 3. példában leírt aktinkötő ELISA assay-t.

I. Definíciók

A „humán DNáz I”, „natív humán DNáz I” és „vad típusú DNáz I” kifejezések - amint a leírásban használjuk - olyan polipeptidre vonatkoznak, amely az 1. ábrán található humán érett DNáz I aminosavszekvenciájával rendelkezik.

A humán DNáz I „variánsa” vagy „aminosavszekvencia-variánsa” egy olyan polipeptid, amely a natív humán DNáz I-től eltérő aminosavszekvenciát tartalmaz. Általában egy variáns szekvenciája legalább 80%-ban azonos (homológ), előnyösen legalább 90%-ban, még előnyösebben legalább 95%-ban és legelőnyösebben legalább 98%-ban azonos a natív humán DNáz I-gyel. A százalékban kifejezett szekvenciaazonosságot például Fitch és munkatársai módszerével határozzuk meg [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 1382-1386 (1983)], Needleman és munkatársai által leírt algoritmusverzióval [J. Mól. Bioi. 48, 443-453 (1970)], sorba állítva a szekvenciákat, hogy a maximális homológiát megkapjuk.

A „humán DNáz I aktinrezisztens variáns”, „aktinrezisztens variáns” és a „humán DNáz I aktinrezisztens variánsa” kifejezések a natív humán DNáz egy olyan variánsára vonatkoznak, amely (1) DNS-hidrolitikus aktivitással és (2) az aktinra nézve csökkentett kötőaffinitással rendelkezik.

A „DNS-hidrolitikus aktivitás” a natív humán DNáz I vagy egy humán DNáz I-variáns enzimes aktivitását jelenti a szubsztrát DNS hidrolízisében (hasításában) 5’-foszforilezett oligonukleotid végtermékeket eredményezve. A DNS-hidrolitikus aktivitás könnyen meghatározható a technika állásából ismert különféle módszerek bármelyikével, beleértve az analitikai poliakrilamid- és agarózgél-elektroforézist, hiperkromicitásvizsgálatot [Kunitz: J. Gén. Physiol. 33, 349-362 (1950); Kunitz: J. Gén. Physiol. 33, 363-377 (1950)] vagy a metilzöld assay-t [Kumick: Arch. Biochem. 29, 41-53 (1950); Sinicropi és munkatársai: Anal. Biochem. 222, 3561-358 (1994)].

A natív humán DNáz I vagy a humán DNáz I egy aktinrezisztens variánsának „kötőaffinitása” a DNáz I azon képességére vonatkozik, hogy nemkovalensen kötődik az aktinhoz. A kötőaffinitást bármely ismert módszerrel meghatározhatjuk, így például Mannherz és munkatársai által leírtak szerint [Eur. J. Biochem. 104, 367-379 (1980)]. Alternatív módon a különböző DNáz-ok (például natív humán DNáz I és ennek variánsai) relatív kötőaffinitását annak mérésével határozhatjuk meg, hogy a DNáz-ok hogyan kötődnek az immobilizált aktinhoz ELISA assay-ben (lásd 3. példa), vagy a DNáz-ok DNS-hidrolitikus hatásának összehasonlításával aktin jelenlétében és távollétében (szintén a 3. példában ismertettük). A példákban leírt módszerek különösen alkalmasak humán DNáz I-variánsok screenelésére, hogy gyorsan azonosítani tudjuk azokat a variánsokat, amelyek csökkentett kötőaffinitást mutatnak az aktinnal szemben.

Az „aktinra nézve csökkentett kötőaffmitás”-sal bíró humán DNáz I aktinrezisztens variáns egy olyan variáns, melynek kötőaffinitása relatíve kisebb, mint az az affinitás, amellyel a natív humán DNáz kötődik az

HU 223 272 Bl aktinhoz, amikor összehasonlítható körülmények között határozzuk meg. Ha a 3. példában leírt aktinkötő ELISA assay-t alkalmazzuk a humán DNáz I (natív vagy variáns) aktint kötő affinitásának meghatározására, akkor egy „csökkentett aktinkötő affinitású” aktinrezisztens variáns egy olyan variáns lesz, melynek EC₅₀értéke nagyobb, mint a natív humán DNáz I-é. Ebben a vizsgálatban egy aktinrezisztens variáns EC₅₀-értéke tipikusan 5-100-szor nagyobb lesz, mint a natív humán DNáz-é; de olyan aktinrezisztens variánsokat is előállítottunk, melyek EC_S0-értéke >500-szor nagyobb a natív humán DNáz-énál, különösen ha a natív humán DNáz aminosavszekvenciájában több aminosavmaradékot kicseréltünk (lásd például 5. ábra).

A „mukolitikus aktivitás” a köpet vagy más biológiai anyag viszkoelaszticitásának (viszkozitásának) csökkentésére vonatkozik, amint azt például az anyag natív humán DNáz I-gyel vagy egy humán DNáz I-variánssal történő kezelése során megfigyeljük. A mukolitikus aktivitást könnyen meghatározhatjuk bármely ismert módszerrel, beleértve a köpettömörségi vizsgálatot (WO 94/10567 PCT-beli közrebocsátási irat, publikálva: 1994. 05. 11-én), torziós ingát alkalmazó assay-ket [Janmey: J. Biochem. Biophys. Methods 22, 41-53 (1991)] vagy egyéb Teológiai metodikákat.

A „polimeráz-láncreakció” vagy „PCR” általánosságban a kívánt nukleotidszekvencia in vitro sokszorozásának módszerére vonatkozik, mint azt például a 4,683,195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik. Általában a PCR-módszer magában foglalja a prímért meghosszabító szintézis ismétlődő ciklusait, felhasználva ehhez olyan oligonukleotid printereket, amelyek képesek előnyösen egy templát nukleinsavhoz hibridizálni.

A „sejt”, „gazdasejt”, „sejtvonal” és „sejttenyészet” kifejezéseket itt felcserélhetően használjuk, és mindegyik magától értetődően egy sejt növekedéséből vagy tenyésztéséből kapott utódokra vonatkozik. A „transzformációt” és „transzfekciót” is felcserélhetően használjuk, és ezek olyan eljárásokat jelentenek, melyekkel a DNS-t egy sejtbe bejuttatjuk.

A „működőképesen kapcsolt” két vagy több DNSszekvencia kovalens kapcsolatát jelenti enzimes ligálás vagy egyéb módszerek segítségével, ahol olyan konfigurációban viszonyul egyik a másikhoz, hogy a szekvenciák normális funkciója fennmaradjon. Például, egy preszekvencia vagy kiválasztó vezetőszekvencia működőképesen kapcsolódik a polipeptidet kódoló DNShez, ha a polipeptid preprotein formájában fejeződik ki, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában; egy promoter vagy enhancer működőképesen kapcsolódik a kódolószekvenciához, ha irányítja a szekvencia transzkripcióját; vagy egy riboszóma-kötőhely működőképesen kapcsolódik a kódolószekvenciához, ha úgy van elhelyezve, hogy megkönnyíti a transzlációt. Általában véve, a „működőképesen kapcsolt” azt jelenti, hogy a kapcsolódó DNS-szekvenciák szomszédosak, és egy kiválasztó vezetőszekvencia esetében szomszédosak és leolvasási fázisban vannak. Ha ilyen helyek nem léteznek, akkor szintetikus oligonukleotid adapterokat vagy linkereket alkalmazunk, standard rekombináns DNS módszerekkel összekapcsolva.

Az aminosavak jelölésére az alábbiakban a hárombetűs vagy egybetűs kódokat alkalmazzuk:

Asp	D	aszparaginsav	Ile	I	izoleucin
Thr	T	treonin	Leu	L	leucin
Ser	S	szerin	Tyr	Y	tirozin
Glu	E	glutaminsav	Phe	F	fenil-alanin
Pro	P	prolin	His	H	hisztidin
Gly	G	glicin	Lys	K	lizin
Alá	A	alanin	Arg	R	arginin
Cys	C	cisztein	Trp	W	triptofán
Val	V	valin	Gin	Q	glutamin
Met	M	metionin	Asn	N	aszparagin

II. Aktinrezisztens variánsok kiválasztása

A jelen találmány a humán DNáz I szerkezetének, aktinkötő tulajdonságainak, DNS-hidrolitikus aktivitásának és mukolitikus aktivitásának, valamint aminosavszekvencia-variánsainak tanulmányozásán alapul. A találmány szerinti aktinrezisztens variánsok DNS-hidrolitikus hatásúak, de az aktint kisebb affinitással kötik, mint a natív humán DNáz I. Az aktin megkötésének csökkentését célszerűen olyan mutációk létrehozásával érhetjük el, melyeket azoknál az aminosavmaradékoknál és/vagy azok körül hozunk létre a natív humán DNáz I-en belül, melyek úgy tűnik, hogy felelősek az aktin megkötéséért, többek között például a Glul3, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val67, Glu69 és Alal 14 maradékoknál a natív humán DNáz I-ben (az aminosavakat jelölő hárombetűs kódokat követő számok az aminosavmaradékok specifikus pozícióját mutatják az 1. ábra szerinti szekvencián belül).

Különböző módszerek vannak, melyekkel humán DNáz I aktinrezisztens variánsokat létrehozhatunk. A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint egy aktinrezisztens variánst úgy állítunk elő, hogy egyetlen vagy többszörös aminosavszubsztitúciót, inszerciót és/vagy deléciót vezetünk be a natív humán DNáz I azon aminosavmaradékainál vagy azokkal szomszédos helye(ke)n (azaz kb. 5 aminosavrészen belül), amelyek befolyásolják az aktin kötését. Ilyen mutációk illusztrálására példaként megadjuk a következőket: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, H44A: Y65A: E69R (lásd 2-6. ábrák).

A találmány egy másik előnyös kiviteli módja szerint egy aktinrezisztens variánst úgy hozunk létre, hogy olyan mutáció(ka)t vezetünk be, mellyel egy új glikozilációs helyet hozunk létre a natív humán DNáz I aktinkötő helyén lévő vagy azzal szomszédos aminosavmaradékoknál (azaz kb. 5 aminosavrészen belül). így például helyre irányított mutagenezist alkalmazunk, hogy bevezessük az aszparagin-X-szerin vagy aszparagin-Xtreonin tripeptidszekvencia egyikét (ahol X bármely aminosav, kivéve a prolint), amelyek az aszparaginoldallánchoz a szénhidrogéncsoport enzimatikus kapcsolódásának felismerőszekvenciái (Creighton: Proteins, 76-78. o., kiadó: W. H. Freeman, 1984). Az így kapott N-glikozilált DNáz I-variáns szénhidrogéncso5

HU 223 272 Bl portja és az aktin között előforduló szterikus gátlás csökkenthető, vagy az aktin megkötése és ennek következtében a DNáz I DNS-hidrolitikus aktivitásának gátlása megelőzhető a natív humán DNáz I-gyel összehasonlítva. Az ilyen mutációk szemléltetésére, melyek egy új glikozilációs hely bevezetésére szolgálnak, példaként megemlítjük a következőket: H44N, D58S, D58T, H64N:V66T, H64N:V66S, V67N:E69S, V67N:E69T.

Adott esetben az ilyen, egy új glikozilációs helyet létesítő mutációk bevezetésével egyidejűleg a natív humán DNáz I aminosavszekvenciáján belül a 18. és/vagy 106. pozíciókban lévő természetes glikozilációs helyek törölhetők, attól függően, hogy kívánjuk-e a glikolizáció kiterjesztését az aktinrezisztens variánsban.

A találmány egy további előnyös kiviteli módja szerint a helyre irányított mutagenezist alkalmazzuk aminosavmaradékok bevezetésére a natív humán DNáz I azon aminosavmaradékainál vagy azokkal szomszédosán (azaz 5 aminosavrészen belül), amelyek az aktinkötésben részt vesznek, és amelyek alkalmasak akár biológiai, akár kémiai poszttranszlációs átalakításokra (lásd alább) [Means és munkatársai: Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer és munkatársai : Chemical Modifícation of Proteins: Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton: Proteins, 70-87. o. (W. H. Freeman, 1984); Lundblab: Chemical Reagents fór Protein Modification (CRC Press, 1991)]. Ilyen poszttranszlációs módosításokkal szterikus gátlást vagy megváltoztatott elektrosztatikus tulajdonságokat vezethetünk be a DNáz Ibe, melyek megakadályozni vagy csökkenteni fogják az aktin megkötését és ennek következtében a DNS-hidrolitikus aktivitás gátlását a natív humán DNáz I-hez viszonyítva. így például beépíthetünk egy ciszteinmaradékot a natív humán DNáz I aktinkötő helyén vagy a mellette lévő maradékhoz. A ciszteinmaradék szabad tiolcsoportja egy intermolekuláris diszulfidkötést alkothat egy másik ilyen DNáz I-variánssal egy DNáz I-dimert képezve, vagy módosíthatjuk például egy tiolspecifikus alkilezőszerrel. Ilyen mutációk illusztrálására szolgálnak a következő példák: H44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, A65C, V67C, E69C, A114C.

A natív humán DNáz I aminosavszekvenciájában helyettesítéseket, inszerciókat és/vagy deléciókat általában a natív humán DNáz I-et kódoló megfelelő nukleotidszekvenciába mutációk bevezetésével hozunk létre, például helyspecifikus mutagenezissel. A mutált DNS expressziója ezután a kívánt aminosavszekvenciájú (nem natív) humán DNáz I-variáns termelését eredményezi.

Mivel bármely, a technika állásából ismert technikát alkalmazhatjuk a helyre irányított mutagenezis kivitelezésére, például Sambrook és munkatársai által leírtakat [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)], a találmány szerinti humán DNáz I-variánsok előállítására előnyben részesítjük az oliogonukleotidirányított mutagenezist. Ez a módszer, amely a szakember számára jól ismert [Zoller és munkatársai: Meth. Enz. 100, 4668-500 (1983); Zoller és munkatársai: Meth. Enz. 154, 329-350 (1987); Carter: Meth. Enz. 154, 382-403 (1987); Kunkel és munkatársai: Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987); Horwitz és munkatársai: Meth. Enz. 185, 599-611 (1990)], különösen alkalmas szubsztitúciós variánsok létrehozására, ámbár felhasználható szokásosan deléciós és inszerciós variánsok előállítására is.

A helyre irányított mutagenezistechnika általában egy fágvektort alkalmaz, amely mind az egyszálú, mind a kettős szálú formában létezik. A helyspecifikus mutagenezisben alkalmazható tipikus vektorok közé tartoznak a fágvektorok, mint például az Ml3 fág, és a plazmidvektorok, amelyek egyszálú fág replikációs origót tartalmaznak [Messing és munkatársai: Meth. Enzymol. 101, 20-78 (1983); Veira és munkatársai: Meth. Enzymol. 153, 3-11 (1987); Short és munkatársai: Nuc. Acids. Rés. 16, 7583-7600 (1988)]. Ezeknek a vektoroknak egy alkalmas gazdasejtben végbemenő replikációja egyszálú DNS szintézisét eredményezi, amelyet felhasználhatunk a helyre irányított mutagenezishez.

Részletesebben, a natív humán DNáz I-et (vagy variánsát) kódoló DNS helyspecifikus mutagenezisének megvalósítása során a DNS-t módosítjuk úgy, hogy először a kívánt mutációt kódoló oligonukleotidot hibridizáljuk az egyszálú DNS-hez. Hibridizáció után egy DNS-polimerázt használunk a belső második szál megszintetizálására, melynek során printerként a hibridizált oligonukleotidot és templátként az egyszálú DNS-t alkalmazzuk. Ezáltal a kívánt mutációt kódoló oligonukleotid beépül a kapott kettős szálú DNS-be.

A hibridizációs próbaként vagy printerként alkalmazott oligonukleotidokat bármely megfelelő módszerrel előállíthatjuk, így például egy természetesen előforduló DNS tisztításával vagy in vitro szintézissel. Oligonukleotidokat például könnyen szintetizálhatunk a szerves kémiában ismert különböző módszerekkel, ilyeneket ismertetnek például Narang és munkatársai [Meth. Enzymol. 68, 90-98 (1979)], Brown és munkatársai [Meth. Enzymol. 68, 109-151 (1979)] és Caruthers és munkatársai [Meth. Enzymol. 154, 287-313 (1985)]. Egy alkalmas hibridizációs próba vagy primer szelektálására szolgáló általános módszer is jól ismert [Keller és munkatársai: DNA Probes, 11-18. old. (Stockton Press, 1989)]. A hibridizációs próba vagy primer általában 10-25 vagy ennél több nukleotidot tartalmaz, és magában foglal legalább 5 nukleotidot a kívánt mutációt kódoló szekvencia egyik végén abból a célból, hogy biztosítsa, hogy az oligonukleotid elsősorban a kívánt lokációnál hibridizáljon az egyszálú DNS-templát-molekulához.

Természetesen, a helyre irányított mutagenezist felhasználhatjuk többszörös szubsztitúciós, inszerciós vagy deléciós mutációk bevezetésére a kiindulási DNSbe. Ha a mutációs helyek szorosan egymáshoz lokalizáltak, a mutációkat szimultán, egyetlen oligonukleotid segítségével bevezethetjük, amely az összes kívánt mutációt kódolja. Ha azonban a mutációs helyek bizonyos távolságban helyezkednek el egymástól (több mint

HU 223 272 Bl nukleotiddal vannak elválasztva), sokkal bonyolultabb egyetlen oligonukleotidot megszerkeszteni, amely az összes kívánt változtatást kódolja. Ehelyett két alternatív megoldás egyikét alkalmazhatjuk.

Az első módszerben külön oligonukleotidot állítunk elő minden egyes mutációhoz. Az oligonukleotidokat ezután egyidejűleg az egyszálú templát DNS-hez anneáljuk, és így a DNS második szála, amely a templátról szintetizálódik, kódolni fogja az összes kívánt aminosavszubsztitúciót.

A második módszer a mutagenezis két vagy több körét foglalja magában a kívánt variáns-előállításhoz. Az első kör, amint azt leírtuk, egyetlen mutáció bevezetésére szolgál. A mutagenezis második köre a mutagenezis első körében előállított mutált DNS-t templátként hasznosítja. Ezáltal ez a templát már egy vagy több mutációt tartalmaz. A további kívánt aminosavhelyettesítés(eke)t kódoló oligonukleotidot ezután ehhez a templáthoz anneáljuk, és így a DNS kapott szála már kódolja mind a mutagenezis első, mind a második körében bevezetett mutációkat, és így tovább.

A PCR-mutagenezis [Higuchi a PCR Protoco/s-ban, 177-183. old. (Academic Press, 1990); Vallette és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 17, 723-733 (1989)] szintén alkalmas humán DNáz I-variánsok létrehozására. Röviden ismertetve, amikor kis mennyiségű templát DNS-t alkalmazunk kiindulási anyagként a PCR-ben, olyan printereket, amelyek szekvenciában alig különböznek a templát DNS megfelelő régiójától, felhasználhatunk arra, hogy egy specifikus DNS-fragmenst viszonylag nagy mennyiségben állítsunk elő, amely csak azokban a pozíciókban különbözik a templátszekvenciától, ahol a primerek különböznek a templáttól. Például, ha egy mutációt kívánunk egy plazmidDNS-be bevezetni, akkor az egyik primer szekvenciája hordozza a kívánt mutációt és jelölve van, hogy hibridizáljon a plazmid-DNS egyik szálához a mutáció helyén; a másik primer szekvenciájának pedig azonosnak kell lennie a plazmid-DNS ellentétes szálán belül egy nukleotidszekvenciával, de ez a szekvencia bárhol elhelyezkedhet a plazmid-DNS mentén. Előnyös azonban, hogyha a második primer szekvenciája az elsőtől 200 nukleotidon belül helyezkedik el, úgyhogy végül a primerek által megkötött DNS teljes amplifikált régiója könnyen megszekvenálható. Az a PCR-amplifikáció (sokszorozás), amely éppen egy ilyen itt leírt primer párt használ fel, olyan DNS-fragmensek populációját eredményezi, amely különbözik a primer által meghatározott mutáció pozíciójában, és valószínűleg más pozíciókban, mivel a templátmásolás valamennyire hibára hajlamos [Wagner és munkatársai a PCR Topics-b&n 69-70. old. (Springer-Verlag, 1991)].

Ha a templát és az amplifikált DNS-termék aránya rendkívülien alacsony, a DNS-fragmens-termékek többsége beépíti a kívánt mutáció(ka)t. Ezt a DNS-terméket használjuk fel arra, hogy a plazmidban a megfelelő régiót helyettesítsük, amely PCR-templátként szolgál standard rekombináns módszerek alkalmazásakor. A szeparált pozíciókban lévő mutációkat bevezethetjük szimultán egy második mutáns primer felhasználásával, vagy egy második PCR kivitelezésével különböző mutáns primerekkel, és az így kapott két PCR-fragmens egyidejű ligálásával a plazmidfragmensbe három- (vagy több-) részes ligálással.

Egy másik módszer variánsok előállítására a kazettamutagenezis, amely Wells és munkatársai által leírt technikán alapul [Gene 34, 315-323 (1985)]. A kiindulási anyag egy plazmid (vagy egy vektor), amely a mutálni kívánt DNS-szekvenciát tartalmazza. A kiindulási DNS-ben a kodon(oka)t, melye(ke)t mutációnak vetünk alá, azonosítjuk. Egyetlen restrikciós endonukleáz helynek kell lenni az azonosított mutációs hely(ek) egyik végén. Ha nincsenek ilyen restrikciós helyek, létrehozunk ilyeneket a fent leírt oligonukleotidszabályozott mutagenezismódszerrel, hogy bevezessük azokat a DNS megfelelő helyeire. A plazmid-DNS-t ezeken a helyeken hasítjuk linearizálás céljából. A kettős szálú oligonukleotidot, amely kódolja a DNS szekvenciáját a restrikciós helyek között, de a kívánt mutáció(ka)t is tartalmazza, standard eljárások segítségével szintetizáljuk meg, amelyben az oligonukleotid két szálát egymástól elkülönítve szintetizáljuk, és ezután standard technikákat alkalmazva egymáshoz hibridizáljuk. Ezt a kettős szálú oligonukleotidot nevezzük kazettának. Ezt a kazettát az 5’- és 3’-végekkel jelöljük, amelyek kompatíbilisak a linearizált plazmid végeivel, ily módon közvetlenül ligálhatók a plazmidba. Az így kapott plazmid tartalmazza a mutált DNS-szekvenciát.

Egy DNS-ben a mutáció(k) meglétét a területen jól ismert módszerekkel határozzuk meg, beleértve a restrikciós térképezést és/vagy DNS-szekvenálást. A DNSszekvenálás egy előnyös módja a Sanger-féle didezoxilánc-terminációs módszer [Sanger és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3918-3921 (1979)].

A humán DNáz I-variánst kódoló DNS-t beépítjük egy replikálódó vektorba a további klónozáshoz vagy expresszióhoz. „Vektorok” lehetnek plazmidok vagy más DNS-ek, amelyek képesek replikálódni egy gazdasejten belül, és ezáltal felhasználhatók két funkció ellátására kompatibilis gazdasejtekkel összekapcsolva (egy vektor-gazda rendszer). Az egyik funkció megkönnyíteni annak a nukleinsavnak a klónozását, amely egy humán DNáz I-variánst kódol, azaz használható mennyiségű nukleinsavat termelni. A másik funkció a humán DNáz I-variáns expressziójának irányítását jelenti. Ezen funkciók egyike vagy mindkettő megvalósul a vektorral a klónozáshoz vagy expresszióhoz használt előnyös gazdasejtben. A vektorok a funkciótól függően azok megvalósításához különböző alkotóelemeket fognak tartalmazni.

Ahhoz, hogy egy humán DNáz I-variánst termeljünk, egy fent leírt expressziós vektort, amely a variánst kódoló DNS-t tartalmazza, működőképesen kapcsolunk egy promoterhez és egy riboszóma-kötőhelyhez. A variáns ezután kifejeződik közvetlenül a rekombináns sejttenyészetben, vagy fúziós fehérjeként egy heterológ polipeptiddel, előnyösen egy szignálszekvenciával vagy más polipeptiddel, amely egy specifikus hasítóhelyet tartalmaz a heterológ polipeptid és a humán DNáz I-variáns közötti kapcsolódásnál.

HU 223 272 Bl

Prokarióták (például E. coli és más baktériumok) az előnyös gazdasejtek a találmány szerinti kezdeti klónozó lépésben. Ezek különösen felhasználhatók nagy mennyiségű DNS gyors termelésére, a helyre irányított mutagenezishez használt egyszálú DNS-templátok előállítására és a kapott variánsok DNS-szekvenálására. Prokarióta gazdasejteket alkalmazhatunk a DNáz I-variánst kódoló DNS expresszálásához is. A prokarióta sejtekben termelődött polipeptidek tipikusan nem glükoziláltak lesznek.

Emellett a találmány szerinti humán DNáz I-variánsokat eukarióta gazdasejtekben is kifejezhetjük, melyek közé tartoznak az eukarióta mikrobák (például élesztő), vagy állatból vagy egyéb soksejtű élőlényből származó sejtek (például kínaihörcsög-petesejtek és más emlőssejtek), vagy élő állatokban (például tehén, kecske, bárány).

A klónozó és expressziós metodikák is jól ismertek a szakterületen. Azokat a prokarióta és eukarióta gazdasejteket és expressziós vektorokat, amelyek alkalmasak a találmány szerinti humán DNáz I-variánsok előállítására, például Shak ismertette a WO 90/07572 számú PCT-beli közrebocsátási iratban (publikálva: 1990. 07.12-én).

Ha prokarióta sejteket vagy olyan sejteket használunk gazdasejtként, amelyek lényegében sejtfalszerkezetet tartalmaznak, a sejtek DNS-sel történő transzfekciójának előnyös módszere a kalciumos kezelési módszer, melyet Cohen és munkatársai ismertettek [Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 2110-2114 (1972)], vagy a polietilénglikolos módszer [Chung és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 16, 3580 (1988)]. Ha élesztőt alkalmazunk gazdasejtként, a transzfekciót általában polietilénglikol alkalmazásával hajtjuk végre Hinnen kitanítása szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978)]. Ha gazdasejtként emlőssejteket alkalmazunk, a transzfekciót általában a kalcium-foszfát-kicsapásos módszerrel hajtjuk végre [Graham és munkatársai: Virology 52, 546 (1978); Gorman és munkatársai: DNA and Protein Eng. Tech. 2, 3-10 (1990)]. Azonban más ismert módszerek, melyek a DNS bevitelére szolgálnak a prokarióta és eukarióta sejtekbe, így például a nukleáris injekció, elektroporáció vagy a protoplasztfuzió, szintén alkalmasak a találmányban történő felhasználásra.

A találmányban előnyösen alkalmazható expressziós vektorok azok, amelyek biztosítják a humán DNáz I-variánst kódoló DNS tranziens expresszióját emlőssejtekben. Általánosságban a tranziens expresszió egy olyan expressziós vektor alkalmazását jelenti, amely képes hatékonyan replikálódni a gazdasejtben úgy, hogy a gazdasejt az expressziós vektor számos kópiáját akkumulálja, és az expressziós vektor által kódolt kívánt polipeptidet pedig magas szinten szintetizálja. A tranziens expressziós rendszerek tartalmaznak egy megfelelő expressziós vektort és egy gazdasejtet, amely lehetővé teszi a DNS-klónok által kódolt polipeptidek megfelelő pozitív azonosítását, valamint ezeknek a polipeptideknek gyors screenelését a kívánt biológiai és fiziológiai tulajdonságokra [Wong és munkatársai: Science 228, 810-815 (1985); Lee és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 4360-4364 (1985); Yang és munkatársai: Cell 47, 3-10 (1986)]. Ennélfogva a tranziens expressziós rendszerek kényelmesen használhatók a natív humán DNáz I-variánsok aminosavszekvenciáját kódoló DNS kifejezésére, összekapcsolva olyan vizsgálati módszerekkel, amelyek azokat a variánsokat azonosítják, melyek kisebb affinitással kötik az aktint, mint a natív humán DNáz I, valamint olyan vizsgálatokkal, melyek a DNS-hidrolitikus aktivitással rendelkező variánsokat mérik.

A humán DNáz I-variáns előnyösen kiválasztódik abból a gazdasejtből, amelyben expresszálódott, ez esetben a variáns kinyerhető abból a tenyészközegből, melyben a gazdasejt növekedett. Abban az esetben célszerű lenne, hogy a sejteket szérummentes tápközegben tenyésszük, mivel ha szérumfehétjék és egyéb szérumkomponensek nincsenek jelen a tápközegben, ez megkönnyítheti a variáns tisztítását. Ha a variáns nem szekretálódik, akkor a humán DNáz I-variánst a gazdasejtek lizátumából nyeljük ki. Amikor a variáns egy humán eredetű gazdasejttől eltérő sejtben fejeződik ki, teljesen mentes lesz humán eredetű fehérjéktől. Minden esetben szükséges, hogy a variánst a rekombináns sejtfehérjéktől megtisztítsuk abból a célból, hogy a humán DNáz I-variáns lényegében homogén készítményét kapjuk. Terápiás felhasználás céljára a tisztított variáns előnyösen nagyobb mint 99% tisztaságú (azaz bármi egyéb fehérjét az összfehérje kevesebb mint 1%-ában fog tartalmazni a tisztított készítmény).

Általában egy humán DNáz I-variáns tisztítását a variáns és a szennyezések, amelyekkel összekapcsolódhat, eltérő fizikokémiai tulajdonságainak kihasználásával valósítjuk meg. Például, első lépésként a tenyészközeget vagy gazdasejtlizátumot centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket. A humán DNáz I-variánst ezután az oldható fehérje- és polipeptidszennyezésektől tisztítjuk meg, például ammónium-szulfátos vagy etanolos kicsapással, gélszűréssel (molekulaméret-kizárásos kromatográfía), ioncserélő kromatográfiával, hidrofób kromatográfiával, immunaffinitás-kromatográfiával (például felhasználva egy Sepharose-hoz kapcsolt antihumán DNáz I antitesteket tartalmazó oszlopot), tapogató kationcserélő kromatográfiával (Frenz és munkatársai : WO 93/25670 számú PCT-beli közrebocsátási irat, publikálva: 1993. 12. 23.), reverz fázisú HPLCvel és/vagy gélelektroforézissel.

Természetesen a területen jártas szakember értékelni fogja, hogy azok a tisztítási módszerek, melyeket a natív humán DNáz I-hez használtunk, némi módosítással alkalmazhatók a humán DNáz I-variánsok tisztítására is, számolva a natív és variáns fehérjék közötti strukturális és egyéb különbségekkel. Például, bizonyos gazdasejtekben (különösen bakteriális gazdasejtek) a humán DNáz I-variáns kezdetben oldhatatlan, aggregálódott formában (ezekre az irodalomban „fénytörő testek”-ként vagy „zárványtestek”-ként hivatkoznak) fejeződhet ki, mely esetben szükséges a humán DNáz I-variánst szolubilizálni és renaturálni a tisztítás folyamán. A rekombináns fehérje fénytörő testecskék szolubilizálására és renaturálására szolgáló módszerek jól ismertek a szakterületen (lásd például Builder és munkatársai: 4,511,502 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

HU 223 272 Bl

A találmány egy másik előnyös kiviteli módja szerint a humán DNáz I-variánsokat közvetlenül a natív vagy variáns humán DNáz I-fehéijén végzett kovalens módosításokkal állítjuk elő. Ezek a módosítások befolyásolják az aktin kötését vagy a fehérje más tulajdonságát (például stabilitás, biológiai felezési idő, immunogenicitás), és elvégezhetjük ezeket az aminosavszekvencia fent leírt szubsztitúciós, inszerciós és deléciós mutációi helyett vagy mellett.

Kovalens módosításokat vezethetünk be úgy, hogy a natív vagy variáns humán DNáz I-ben a megcélzott aminosavmaradékot reagáltatjuk egy szerves derivatizálószerrel, amely képes reagálni a kiválasztott aminosav oldalláncaival, vagy N- vagy C-terminális maradékával.

így például, a ciszteinilmaradékokat leggyakrabban α-haloacetátokkal (és a megfelelő aminokkal) reagáltatjuk, mint például klór-ecetsav vagy klór-acetamid, hogy karboxi-metil- vagy karboxi-amido-metil-származékokat kapjunk. A ciszteinilcsoportokat derivatizálhatjuk úgy is, hogy a következő vegyületekkel reagáltatjuk: bróm-trifluor-aceton, a-bróm-p-(5-imidazoil)-propionsav, klór-acetil-foszfát, N-alkil-maleinimidek, 3nitro-2-piridil-diszulfid, metil-2-piridil-diszulfid, pklór-merkuri-benzoát, 2-klór-merkuri-4-nitro-fenol vagy klór-7-nitro-benzo-2-oxa-1,3-diazol.

A hisztidilmaradékokat dietil-pirokarbonáttal reagáltatva derivatizáljuk 5,5-7,0 pH-értéken, mivel ez a reagens viszonylag specifikus a hisztidiloldalláncra. Para-bróm-fenacil-bromidot is alkalmazhatunk; ezt a reakciót előnyösen 0,1 M nátrium-kakodilátban pH=6,0 értéken kivitelezzük.

A lizinilmaradékot és az aminoterminális részeket borostyánkősavanhidriddel vagy egyéb karbonsavanhidriddel reagáltatjuk. Ezekkel a reagensekkel történő derivatizálás megfordítja a lizinilmaradékok töltését. Az α-amino-tartalmú csoportok származékképzéséhez alkalmas egyéb reagensek közé tartoznak az imidoészterek, mint például metil-pikolinimidát; piridoxál-foszfát; piridoxál; klór-bór-hidrid; trinitro-benzolszulfonsav; O-metil-izokarbamid; 2,4-pentán-dion; és a transzaminázzal katalizált glioxilátos reakció.

Az arginilmaradékokat egy vagy néhány konvencionális reagenssel módosítjuk, többek között fenil-glioxállal, 2,3-bután-dionnal, 1,2-ciklohexán-dionnal és ninhidrinnel. Az argininrészek derivatizálása megkívánja, hogy a reakciót alkalikus körülmények között végezzük a guanidin funkciós csoport magas pK_a-ja miatt. Továbbá ezek a reagensek reagálhatnak a lizin csoportjaival, valamint az arginin epszilon-amino-csoportjával is.

Az oldallánc karboxilcsoportjait (aszpartil vagy glutamil) szelektíven módosíthatjuk karbodiimides (R-N=C=N-R’) reakcióval, ahol R és R’ különböző alkilcsoportok, mint például l-ciklohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)-karbodiimid vagy l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetil-pentil)-karbodiimid. Továbbá az aszpartil- és glutamilmaradékokat átalakíthatjuk aszparaginil- és glutaminilmaradékokká ammóniumionokkal reagáltatva azokat.

A glikozidok kovalens kapcsolását a fehérje aminosavmaradékaihoz felhasználhatjuk arra, hogy módosítsuk vagy növeljük a szénhidrát-szubsztituensek számát vagy profilját különösen azoknál a maradékoknál vagy azok szomszédságában, amelyek az aktinkötésben szerepet játszanak. Az alkalmazott kapcsolási módtól függően a cukor vagy cukrok kapcsolódhatnak (a) az argininhoz vagy hisztidinhez, (b) szabad karboxilcsoportokhoz, (c) szabad szulfhidrilcsoportokhoz, mint a cisztein, (d) szabad hidroxilcsoportokhoz, mint a szerin, treonin vagy hidroxi-prolin, (e) aromás részekhez, mint a fenil-alanin, tirozin vagy triptofán vagy (f) a glutamin amidcsoportjához. Alkalmas módszereket ismertetnek például a WO 87/05330 számú PCT-beli közrebocsátási iratban (publikálva: 1987. 09. 11.), és Aplin és munkatársai [CRC Crit. Rév. Biochem, 259-306. old. (1981)].

Olyan szerek kovalens kapcsolódása a humán DNáz I-variánsokhoz, mint például a polietilénglikol (PEG) vagy a humán szérumalbumin, csökkenthetik a variáns immunogenicitását és/vagy toxicitását, és/vagy meghosszabbíthatják a félélettartamot, amint azt más fehérjéknél megfigyelték [Abuchowski és munkatársai: J. Bioi. Chem. 252, 3582-3586 (1977); Poznansky és munkatársai: FEBS Letters 239, 18-22 (1988); Goodson és munkatársai: Biotechnology 8, 343-346 (1990); Katre: J. Immunoi. 144, 209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992)]. Ezenkívül a natív humán DNáz I vagy egy variánsának módosítása ezekkel a reagensekkel az aktinkötésért felelős aminosavrészeknél vagy azokkal szomszédosán (azaz kb. öt aminosavrészen belül) aktinrezisztens mutánst eredményezhet.

Egy további előnyös kiviteli módban a humán DNáz I aktinrezisztens variáns tartalmazhat egy mutációt az Asn-maradékban, amely a natív humán DNáz I aminosavszekvenciájának 74. pozíciójában fordul elő (például N74D, N74K vagy N74S mutáció), abból a célból, hogy csökkentsük vagy meggátoljuk a DNáz I-variáns dezaminációját (Frenz és munkatársai: WO 93/25670 számú PCT-beli közrebocsátási irat, publikálva: 1993. 12. 23.). Egy másik példa szerint a humán DNáz I aktinrezisztens variáns tartalmazhat egy aminosavmutációt vagy más kovalens módosítást, amely csökkenti a variáns érzékenységét a proteázok (például neutrofil elasztáz) általi degradációra, amely jelen lehet a köpetben és egyéb biológiai anyagokban.

A fent leírtak szerint előállított humán DNáz I-variánsok DNS-hidrolitikus aktivitását és aktinkötő affinitását könnyen meghatározhatjuk a szakterületen ismert és az itt ismertetett assay-k és módszerek alkalmazásával. Bármely ilyen variáns, amely DNS-hidrolitikus aktivitással és csökkentett aktinkötő affinitással (a fentiekben definiált) rendelkezik, a jelen találmány oltalmi körébe tartozó aktinrezisztens variáns.

A találmány szerinti humán DNáz I aktinrezisztens variánsok felhasználhatók DNS-tartalmú anyagok, mint például köpet, nyák vagy egyéb tüdőváladékok viszkoelaszticitásának csökkentésére. Ezeket a variánsokat előnyösen olyan pulmonális betegségben szenvedő bete9

HU 223 272 Bl gek kezelésére alkalmazzuk, akik váladéka abnormálisán viszkózus vagy besűrűsödött, ilyen betegségek például az akut vagy krónikus hörgő- és tüdőmegbetegedések, beleértve a fertőző tüdőgyulladást, hörghurutot vagy légcsőhurutot, hörgőtágulatot, cisztikus fibrózist, asztmát, tuberkulózist és gombás fertőzéseket. Ilyen célú terápiákhoz az aktinrezisztens variáns oldatát vagy végül megosztott száraz készítményét becseppentjük szokásos módon a légutakba (például bronchusokba), vagy bejuttatjuk a beteg tüdejébe, például aeroszolkészítmény formájában.

Az aktinrezisztens variánsokat felhasználhatjuk tályogok vagy súlyos, zárt térben lévő fertőzések kiegészítő kezelésére is olyan kórképekben, mint például empyema, meningitis, tályog, peritonitis, sinusitis, otitis, periodontitis, pericarditis, pancreatitis, cholelithiasis, endocarditis és szeptikus arthritis, valamint különféle gyulladások és fertőzött léziók helyi kezelésében, mint például a bőr és/vagy mukozális membránok fertőzött léziói, sebészeti sebek, gyomorléziók és égések. Az aktinrezisztens variáns javíthatja az ilyen infekciók kezelésében alkalmazott antibiotikumok hatékonyságát (például a gentamicinaktivitás erőteljesen redukált az intakt DNS-hez való reverzibilis kötődés által).

A natív humán DNáz I és aktinrezisztens variánsai továbbá felhasználhatók a szisztémás lupus erythematosus (SLE) kezelésére is, amely egy életveszélyes autoimmun betegség, melyet eltérő autoantitestek termelése jellemez. A DNS az immunkomplexek fő antigénkomponense. Ebben az esetben a humán DNáz I-et (natív vagy variáns) beadhatjuk szisztémásán, például intravénásán, szubkután, intratekálisan vagy intramuszkulárisan az érintett betegnek.

A natív humán DNáz I és aktinrezisztens variánsai szintén felhasználhatók a légúti fertőzések kiújulásának és/vagy fellobbanásának megelőzésére, amely előfordulhat olyan betegeknél, akik cisztikus fibrózisban, krónikus bronchitisben, asztmában, tüdőgyulladásban vagy egyéb pulmonális betegségben szenvednek, vagy olyan betegeknél, akiknek a lélegeztetése ventilátor vagy egy mechanikus eszköz segítségével történik, vagy azoknál a betegeknél, akiknél a légúti fertőzések kifejlődésének veszélye fennáll, például operáció után.

Az aktinrezisztens variánsokat terápiásán felhasználható készítmények előállításához ismert módokon formulázhatjuk. Egyik előnyös gyógyászati készítmény az aktinrezisztens variáns egy oldata pufferolt vagy nem pufferolt vizes oldatban, és előnyösen izotóniás sóoldat, mint például 1,0 mM kalcium-kloridot tartalmazó, 7-es pH-jú, 150 mM nátrium-klorid-oldat. Ezek az oldatok előnyösen adaptálhatók a szokásosan alkalmazott porlasztókban történő felhasználáshoz, így például jetporlasztókban és ultrahangporlasztókban, ahol közvetlenül a kezelendő beteg légutaiba vagy tüdejébe történik a beadás.

Egy másik előnyös kiviteli mód szerint a gyógyászati készítmény az aktinrezisztens variánst száraz por formájában tartalmazza, melyet előnyösen az aktinrezisztens variáns egy oldatának spray-szárításával állítunk elő, lényegében a függő 08/206,020 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírtak szerint (benyújtva: 1994. 03. 04.).

Egy további előnyös kiviteli módban a gyógyászati készítmény olyan sejteket tartalmaz, melyek aktívan termelnek egy humán DNáz I aktinrezisztens variánst. Ilyen sejteket közvetlenül bejuttathatunk a beteg szövetébe, vagy enkapszulázhatunk porózus membránba, amelyet implantálunk a betegbe, mindkét esetben az aktinrezisztens variáns azon a területen szabadul fel a beteg testében, ahol a DNS-hidrolitikus aktivitás megnövelt koncentrációjára szükség van. Például, ha a beteg saját sejtjeit lehetne transzformálni akár in vivő, akár ex vivő egy aktinrezisztens variánst kódoló DNSsel, akkor ezek használhatók a DNáz I közvetlen termelésére a betegen belül.

Egy aktinrezisztens humán DNáz I terápiásán hatékony mennyisége függ például a kezelendő anyag DNSés aktintartalmától, a terápiás körülményektől, a beadás módjától és a beteg állapotától. Ezzel összhangban szükséges, hogy a kezelőorvos beállítsa a dózist, és változtassa a beadási módot, hogy az optimális terápiás effektust megkapjuk. Tekintetbe véve a natív humán DNáz I-hez viszonyított redukált aktinkötő affinitást és ennek következtében a megnövekedett DNS-hidrolitikus aktivitást aktin jelenlétében, egy aktinrezisztens variánsnak a kívánt terápiás hatás eléréséhez szükséges mennyisége kevesebb lehet, mint az a natív humán DNáz I-mennyiség, amely azonos körülmények között ugyanolyan hatás eléréséhez szükséges. Általában, az aktinrezisztens variáns terápiásán hatékony mennyisége a beteg testtömegkilogrammjára vonatkoztatva mintegy 0,1 pg-mintegy 5 mg variáns, az említett gyógyászati készítményekben beadva.

Egy aktinrezisztens variánst adott esetben kombinálhatunk vagy együtt beadhatunk egy vagy több más farmakológiailag hatékony szerrel, melyeket a fentiekben felsorolt kórképek kezelésére használunk, mint például antibiotikumok, hörgőtágító szerek, gyulladáscsökkentő szerek, mukolitikumok (például n-acetil-cisztein), aktinkötő vagy aktinmegőrző fehéijék (például gelsolin) [Matsudaira és munkatársai: Cell 54, 139-140 (1988); Stossel és munkatársai: WO 94/22465 számú PCT-beli közrebocsátási irat (publikálva: 1994. 10. 13.)], proteázinhibitorok vagy génterápiás termékek [például melyek a cisztikus transzmembrán vezető regulátor (CFTR) gént tartalmazzák] [Riorda és munkatársai: Science 245, 1066-1073 (1989)].

Az alábbi példák csak az illusztrálásra szolgálnak, és semmiképp sem korlátozzák a találmány oltalmi körét. Az összes szabadalmat és irodalmi hivatkozást, melyet citáltunk, kifejezetten beépítjük a leírásba.

1. példa

A humán DNáz I mutagenezise

E. coli CJ236 törzset (BioRad Laboratories, Richmond, Califomia USA) pRK.DNase.3 plazmiddal transzformáltunk Chung és munkatársai módszere szerint [Nuc. Acids Rés. 16, 3580 (1988)]. A jelen találmányban alkalmazott pRK.DNase.3 plazmid azonos a WO 90/07572 számú PCT-beli közzétételi iratban leírt10

HU 223 272 Bl tál (publikálva: 1990. 07.12-én), azzal a különbséggel, hogy a humán DNáz I-et kódoló nukleotidszekvencia az 1. ábrán bemutatott szekvencia. A transzformált sejteket 50 pg/ml carbenicillint tartalmazó LB agarlemezekre vittük, és egy éjszakán át 37 °C-on növesztettük. 50 pg/ml carbenicillint tartalmazó 2YT táptalajt (5 ml) és 10 pl VCSM13 helper fágot (Stratagene, La Jolla, Califomia USA) inokuláltunk az agarlemezről származó egyes telepekkel, és egy éjszakán át 37 °C-on kevertetés közben hagytuk növekedni. Ebből a kultúrából izoláltuk az egyszálú DNS-t, melyet templátként használtunk az ezt követő mutagenezishez.

Helyspecifikus mutagenezist valósítottunk meg szintetikus oligonukleotidok felhasználásával Kunkel és munkatársai módszere szerint [Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987)]. A mutagén oligonukleotidok 21merek és 24-merek voltak, melyek 9. vagy 12. egzakt bázisa illeszkedik az 5’-végen a neki nem megfelelő kodonhoz, és a 9. egzakt bázis illeszkedik a 3’-végen a neki nem megfelelő kodonhoz. A mutagenezist követően az egyes kiónokból származó egyszálú DNS-eket didezoxiszekvenálásnak vetettük alá [Sanger és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)]. A különböző nukleotidszekvenciákat tartalmazó DNS-eket ezután a fent leírt módon az E. coli XL1 Blue MRF’ törzsbe (Stratagene) transzformáltuk. Szélesztés és egyetlen kolónia izolálása után, mint az előzőkben, az egyedül álló telepeket használtuk az 50 pg/ml carbenicillint tartalmazó 0,5 liter LB táptalaj inokulálására. Egy éjszakán át tartó inkubálást (37 °Con, kevertetés mellett) követően a sejteket centrifugával összegyűjtöttük, és a különböző DNS-eket (az expressziós vektorban) Qiagen-500 típusú oszlopon tisztítottuk (Qiagen Inc., Chatsworth, Califomia USA).

A 2-6. ábrákon bemutatjuk azokat a különböző humán DNáz I-variánsokat, melyeket előállítottunk. Az ábrákon és az azokat körülvevő szövegben egy DNáz-variánsban lévő aminosavszubsztitúciós mutációt a következő rövidítéssel jelöltünk: első nagybetű, egy szám és második nagybetű. Az első nagybetű a natív (vad típusú) humán érett DNáz I-ben előforduló aminosav egybetűs kódja, a szám a maradék pozícióját mutatja a natív humán érett DNáz I-ben (az 1. ábra szerint számozva), és a második nagybetű a DNáz I-variánsban ugyanabban a pozícióban előforduló aminosav egybetűs rövidítése. így például, a D53R mutációt hordozó DNáz I-variánst úgy kaptuk, hogy a natív humán érett DNáz I 53as pozíciójában lévő aszparaginsavmaradékot (D) helyettesítettük egy argininrésszel (R). Egy variánsban előforduló többszörös mutációt hasonlóképpen jelöltünk, kettősponttal (:) elválasztva egyik mutációt a másiktól. A D53R:Y65A például azt jelenti, hogy a variáns egy D53R és egy Y65A mutációt hordoz.

2. példa

Humán DNáz I-variánsok expressziója

Humán embrionális 293 vesesejteket (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) szérumtartalmú tápközegben növesztettünk 150 mm-es plasztik Petri-csészékben. A növekedés lóg fázisában a sejteket 22,5 pg tisztított variáns DNS-sel (melyet a fenti módon állítottunk elő) és 17 pg adenovírus-DNS-sel átmenetileg kotranszfektáltuk kalcium-foszfát-kicsapásos módszert alkalmazva [Gorman és munkatársai: DNA and Protein Eng. Tech. 2, 3-10 (1990)]. Körülbelül 16 órás transzfektálás után a sejteket 15 ml foszfáttal pufferok sóoldattal mostuk, és a tápközeget szérummentes tápközegre kicseréltük. Az egyes lemezekről a sejttenyészetet kétszer learattuk, először a 24. vagy 72. órában, és másodszor a 96. órában, azután, hogy a tápközeget szérummentesre cseréltük. Ezen a módon kb. összesen 50 ml sejttenyészet-felülúszót kaptunk, mely a DNáz I-variánst tartalmazta. Az egyes lemezekről gyűjtött sejttenyészet-felülúszó poolokat 5-50-szeresére betöményítettük egy Centriprep 10 bepárlóban, és a koncentrátumokat vizsgáltuk, hogy meghatározzuk a DNáz I-variánsok különböző biokémiai és biológiai aktivitásait.

A natív humán DNáz I-et tartalmazó koncentrátumot a fentiekhez hasonló módon készítettük el, azzal az eltéréssel, hogy az átmeneti transzfektálást a pRK.DNase.3 plazmiddal végeztük.

3. példa

A humán DNáz I-variánsok biokémiai és biológiai aktivitásai

I. Relatív specifikus aktivitás

A DNáz I-variánsok relatív specifikus aktivitását összehasonlítva a natív humán DNáz I aktivitásával két különböző vizsgálati módszerrel határoztuk meg. Előnyösen a variánsok relatív specifikus aktivitását abban a variánskoncentrációban (pg/ml-ben) adjuk meg, melyet metilzöld aktivitási assay-ben határoztunk meg [Sinicropi és munkatársai: Anal. Biochem. 222, 351-358 (1994); Kumick: Arch. Bochem. 29,41-53 (1950)] osztva azzal a variánskoncentrációval (pg/ml-ben kifejezve), melyet egy DNáz I ELISA assay-ben határoztunk meg (lásd az alábbiakban). Mind a metilzöld, mind az ELISA assay-ben a standard görbe felvételéhez a Pulmozyme® humán DNáz I-et alkalmaztuk. A natív humán DNáz I és a variánsok relatív specifikus aktivitását a 2. ábrán mutatjuk be.

A metilzöld aktivitási vizsgálat [Sinicropi és munkatársai: Anal. Biochem. 222, 351-358 (1994); Kumick: Arch. Bochem. 29, 41-53 (1950)] a metilzöld festéket hasznosítja, amely beágyazódik megközelítőleg minden 10 bázisra a DNS-ben, ami egy zöld szubsztrátot eredményez. Amikor a DNS-t a DNáz I-gyel elhasítjuk, a metilzöld festék felszabadul, és színtelen formává oxidálódik. Ezáltal a zöld szín elvesztése arányos azzal a DNáz I-mennyiséggel, melyet a vizsgálati mintához hozzáadtunk. Az assay-ben jelen lévő DNáz I mennyiségét a standard görbével való összehasonlítással határoztuk meg, amelyet a DNáz I ismert mennyiségeivel vettünk fel.

A DNáz I ELISA vizsgálatban mikrotiterlemezeket vontunk be egy kecske-anti-DNáz I poliklonális antitesttel, majd hozzáadtuk a vizsgálandó mintát, és detektáltuk a DNáz I-gyel kapott kötést egy nyúl-antiDNáz I poliklonális antitesttel, melyet torma-peroxidáz11

HU 223 272 Bl hoz (HRP) konjugáltunk. Amikor a HRP-t és a színkifejlesztő reagenst hozzáadtuk, a kifejlődött szín arányos a mintában lévő DNáz I mennyiségével. Az assay-ben jelen lévő DNáz I mennyiségét a standard görbével való összehasonlítással határoztuk meg, amelyet a DNáz I ismert mennyiségeivel vettünk fel.

Mindkét assay-ben a mintákat többszörös hígításban vizsgáltuk, és azokat az értékeket, melyek a standard görbe középtartományába esnek, átlagoltuk, és standard deviációkat számítottunk.

A DNáz I ELISA assay-vel meghatározott DNáz Ikoncentrációkat használtuk tehát arra, hogy standardizáljuk a DNáz I-koncentrációkat más olyan vizsgálatokban is, amelyekben a DNáz I-variánsokat jellemeztük (például az aktingátlási vizsgálatokban, lásd alább).

II. A DNáz I hidrolitikus aktivitásának aktinnal történő gátlása

G-aktint [Kabsch és munkatársai: Ann. Rév. Biophys. Biomol. Struct. 21, 49-76 (1992)] állítottunk elő a felhasználás előtt 10 napon belül úgy, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható aktinkészítmény (Sigma, Si Louis, Missouri USA) 1 mg/ml koncentrációjú oldatát egy éjszakán át 4 °C-on a következő oldattal szemben dializáltuk: 5 mM HEPES, pH=7,2, 0,2 mM CaCl₂,0,5 mM ATP, 0,5 mM β-merkapto-etanol. Centrifúgálás után (13 000xg, 5 perc) a G-aktin mennyiségét 290 nm-en az abszorbancia mérésével határoztuk meg; 1 mg/ml oldat abszorbanciája 0,66 OD. Azt a Gaktin-mennyiséget, amely szükséges a natív humán DNáz I DNS-hidrolitikus aktivitásának lényeges (> 50%-os gátlás), de nem teljes gátlásához, előzetes kísérletekben határoztuk meg azonos körülmények között minden vizsgálatban.

Az aktingátlással szembeni érzékenységet a variánsok DNS-hidrolitikus aktivitásának aktin jelenlétében és távollétében végzett mérésével állapítottuk meg két különböző vizsgálatban, az előzőkben leírt metilzöld assay-ben és egy hiperkromicitási assay-ben, amely a denaturált és depolimerizált DNS 260 nm-en mért abszorbancianövekedésén alapul [Kunitz: J. Gén. Physiol. 33, 349-362 (1950); Kunitz: J. Gén. Physiol. 33, 363-377 (1950)]. A kiválasztott variánsok ezekben a vizsgálatokban mért százalékos gátlási értékét a 3. és

4. ábrán mutatjuk be.

A hiperkromicitásvizsgálatban a tenyészet betöményített felülúszóit, melyek a DNáz I-variánsokat tartalmazták (előállításuk a fent leírtak szerint), vagy aktin távollétében, vagy úgy, hogy 2-3-szoros moláris feleslegben aktint adtunk hozzá, A pufferben (25 mM HEPES, pH=7,5, 4 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 0,1% BSA) inkubáltuk egy órán keresztül szobahőmérsékleten, mielőtt hozzáadtuk a küvettához, amely 40 pg DNS-t tartalmazott 1,0 ml össztérfogatban. A DNáz I-variáns végkoncentrációja a vizsgálatban megközelítőleg 26 nM volt, DNáz I ELISA assay-vel meghatározva. A DNáz I-variánsok DNS-hidrolízisének mértékét aktin jelenlétében és távollétében mértük. A 3. és 4. ábrán bemutatott százalékos aktivitást egy aránynak a meghatározásával számítottuk ki: a humán DNáz I (natív vagy variáns) aktin jelenlétében mért DNS-hidrolitikus aktivitása viszonyítva az aktin távollétében mért DNS-hidrolitikus aktivitáshoz, és szorozva 100-zal.

A metilzöld assay-ben a tenyészet betöményített felülúszóit (előállítva a fentiek szerint), melyek a DNáz Ivariánsokat tartalmazták, aktin nélkül vagy 1000-szeres moláris feleslegben aktinnal együtt inkubáltuk 37 °C-on 16 órán keresztül, melyet B pufferben adtunk hozzá (25 mM HEPES, pH=7,5, 4 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 0,1% BSA, 0,01% thimerosal és 0,05% Tween 20). Az aktív enzim koncentrációját minden egyes esetben a Pulmozyme® standard görbéjével összehasonlítva értékeltük ki. A variáns „százalékos aktivitása” a következőt jelenti: aktin jelenlétében mért aktivitás osztva az aktin távollétében mért aktivitással, és szorozva 100-zal.

Amint a 3. és 4. ábrából látható, a natív humán DNáz I DNS-hidrolitikus aktivitása lényegesen lecsökkent aktin jelenlétében. Összehasonlítva a natív humán DNáz I egyszeres és többszörös mutációt hordozó variánsait a natív humán DNáz I-gyel, ezek viszonylag rezisztensek az aktin általi gátlásra, amit az aktin jelenlétében mutatott nagyobb DNS-hidrolitikus aktivitásuk bizonyít.

III. Aktinkötő ELISA

Kifejlesztettünk egy mikrotiter assay-t a natív humán DNáz I és a DNáz I-variánsok kötésének mérésére. Először egy MaxiSorp lemez (Nunc, Inc., Naperville, Illinois, USA) mélyedéseit bevontuk mélyedésenként 100 pl GC-globulinnal (Calbiochem, La Jolla, California USA), egy aktinkötő fehérjével [Goldschmidt-Clermont és munkatársai: Biochem. J. 228, 471-477 (1958), McLeod és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 1260-1267 (1989), Houmeida és munkatársai: Eur. J. Biochem. 203,499-503 (1992)] 10 pg/ml koncentrációban a következő pufferben: 25 mM HEPES, 4 mM MgCl₂, 4 mM CaCl₂, pH=7,2; 4 °C-on 16-24 órán keresztül. A GC-globulin-felesleg eltávolítása után a reaktív helyeket mélyedésenként 200 pl C puffer hozzáadásával blokkoltuk (a C puffer ugyanaz, mint B puffer, kiegészítve 0,5 mM adenozin-trifoszfáttal; a C puffért használtuk a vizsgálat minden ezt követő lépésében hígítóként, hacsak másképp nem említjük), és a lemezt egy rázógépen 1-2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az egyes inkubációs lépéseket szobahőmérsékleten 1 órán keresztül egy Mini Orbital Shakeren (Bellco Biotechnology, Vineland, New Jersey USA) viteleztük ki; az egyes lépések között a lemezt kiürítettük, és egy Microwash II lemezmosóban (Skatron A/S, Norway) foszfáttal pufferolt sóoldattal hatszor mostuk, amely 0,05% Tween 20-at tartalmazott. Ezt követően a fentiek szerint előállított G-aktint C pufferrel 50 pg/ml-re hígítottuk, és 100 pl-t adtunk minden egyes mélyedéshez; a lemezeket inkubáltuk és mostuk, és 100 pl különböző mértékben hígított Pulmozyme® oldatot és a natív humán DNáz I-et vagy variánsait tartalmazó sejttenyészet-tápközeget adtuk a mélyedésekhez, majd a lemezeket inkubáltuk és mostuk. Végül 100 pl 1/25 000 hígítású antihumán DNáz I nyúl poliklonális antitest-torma-peroxidáz konjugátumot (az eredeti törzsoldat koncentrációja 465 pg/ml) adtunk minden egyes mélyedéshez. Inkubálás és mosás után a szín kifejlesztését 100 pl/mélyedés színkifejlesztő reagens hozzáadásával megindítottuk

HU 223 272 Bl (Sigma Fást o-fenilén-diamin és karbamid/H₂O₂ tabletták feloldva a gyártó utasítása szerint), és 100 μΐ/mélyedés 4,5 N H₂SO₄ hozzáadásával leállítottuk. A 492 nmen mért abszorbanciát feljegyeztük, és grafikusan ábrázoltuk a mélyedésekhez eredetileg hozzáadott DNáz Ikoncentráció függvényében. Szigmoidális görbét kaptunk a natív humán DNáz I-re és azokra a variánsokra, melyek kötődtek az aktinhoz; ezeket a görbéket illesztettük egy négyparaméteres egyenlethez nemlineáris regressziós analízissel [Marquardt: J. Soc. Indust. Appl. 10 Math. 11,431-441 (1963)]; az egyes DNáz I-koncentrációkat (natív vagy variáns), melyekkel szemben az volt a követelmény, hogy a maximális szignál felét adják az assay-ben, a görbékből számítottuk, és mint EC₅₀értéket adtuk meg. A natív humán DNáz I és a varián- 15 sok molekulatömegét 37 000 daltonnak találtuk.

Az egyes humán DNáz I-variánsok relatív kötőaffínitását úgy számítottuk ki, hogy a variáns EC₅₀-értékét elosztottuk a natív humán DNáz I EC₅₀-értékével, melyet ELISA assay-ben mértünk, és az eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be. Például, ha a humán DNáz I-variáns relatív kötőaffinitását 5-nek kalkuláljuk, ez az érték azt jelenti, hogy a variáns EC₅₀-értéke 5-ször nagyobb, mint a natív humán DNáz EC₅₀-értéke, vagy más szóval, hogy a variánsok affinitása az aktinhoz 5- 25 szőr kisebb, mint a natív humán DNáz I affinitása az aktin felé ebben az ELISA assay-ben.

IV. Köpettömörségi vizsgálatok

A köpettömörségi assay-t (WO 94/10567 számú 5 PCT-beli közrebocsátási irat, publikálva: 1994. 05. 11én) alkalmaztuk, hogy megméijük cisztikus fibrózisban szenvedő betegek köpetének („CF-köpet”) viszkoelaszticitását a natív humán DNáz I-gyel és a különböző DNáz I-variánsokkal történő inkubálás előtt és után. Miután a CF-köpetet összekevertük a DNáz I-mintával és 20 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, a félig szilárd oldatokat behelyeztük kapilláriscsövekbe, amelyeket ezután 12 000 ford./perccel 20 percig centrifugáltunk. A centrifúgálást követően megmértük a pellet magasságát, és összehasonlítottuk az oldat plusz pellet magasságával. Ezeket a méréseket használtuk ezután a köpet százalékos tömörségének kiszámítására, amely összhangban van a köpet viszkoelaszticitásával.

A százalékos tömörséget a CF-köpet natív humán 20 DNáz I-gyel és humán DNáz I aktinrezisztens variánsokkal való kezelése során határoztuk meg, és a 6. ábrán mutatjuk be. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a humán DNáz I-variánsok még hatékonyabban csökkentik a CF-köpet viszkoelaszticitását, mint a natív humán DNáz I, a tömörségi vizsgálatban meghatározva.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő: Genentech, Inc.

Lazarus, Róbert A.

Shak, Steven Ulmer, Jana S.

(ii) Bejelentés címe: Humán DNáz I-variánsok (iii) Szekvenciák száma: 1 (iv) Levelezési cím:

(A) Címzett: Genentech, Inc.

(B) Utca: 460 Point San Brúnó Blvd (C) Város: South San Francisco (D) Állam: Califomia (E) Ország: USA (F) Irányítószám: 94080 (v) Komputerrel olvasható forma:

(A) Hordozó típusa: 5.25 inch, 360 Kb floppy disk (B) Komputer: IBM PC kompatibilis (C) Operátorrendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: patin (Genentech) (vi) A bejelentés adatai:

(A) A bejelentés száma:

(B) A bejelentés napja: 1995.02. 24.

(C) Osztály:

(vii) Az elsőbbségi bejelentés adatai:

(A) A bejelentés száma:

(B) A bejelentés napja:

(viii) A képviselő adatai:

(A) Név: Johnston, Sean A.

(B) Regisztrálási szám: 35,910 (C) Aktaszám: P925 (ix) Telekommunikációs információk:

(A) Telefon: 415/225-3562 (B) Telefax: 415/952-9881

HU 223 272 Bl (C) Telex: 910/371-7168 (2) Információk a SEQ. ID. NO: 1 szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hossz: 260 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása: SEQ. ID. NO: 1 szekvencia:

Leu 1

Ly s

Ile

Al a

Al a 5

Phe

Asn

Ile

Gin

Thr 10

Phe

Gly

Glu

Thr

Lys 15

Me t

Ser

Asn

Alá

Thr 20

Leu

Val

Ser

Tyr

Ile 25

Val

Gin

Ile

Leu

Ser 30

Arg

Tyr

Asp

Ile

Al a 35

Leu

Val

Gin

Glu

Val 40

Arg

Asp

Ser

Hi s

Leu 45

Thr

Al a

Val

Gly

Lys 50

Leu

Leu

Asp

Asn

Leu 55

Asn

Gin

Asp

Al a

Pro 60

Asp

Thr

Tyr

Hi s

Tyr 65

Val

Va 1

Ser

Glu

Pro 70

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser 75

Tyr

Lys

Glu

Arg

Tyr 80

Leu

Phe

Val

Tyr

Arg 85

Pro

As p

Gin

Val

Ser 90

Al a

Val

Asp

Ser

Tyr 95

Tyr

Tyr

Asp

Asp

Gly 100

Cy s

Glu

Pro

Cy s

Gly 105

Asn

Asp

Thr

Phe

Asn 110

Arg

Glu

Pro

Al a

Ile 115

Va 1

Arg

Phe

Phe

Ser 120

Arg

Phe

Thr

Glu

Val 125

Arg

Glu

Phe

Al a

Ile 130

Val

Pro

Leu

Hi s

Al a 135

Al a

Pro

Gly

Asp

Al a 140

Val

Al a

Glu

Ile

Asp 145

Al a

Leu

Tyr

Asp

Val 150

Tyr

Leu

Asp

Val

Gin 155

Glu

Lys

Trp

Gly

Leu 160

G1 u

Asp

Val

Me t

Leu 165

Me t

Gly

Asp

Phe

Asn 170

Al a

Gly

Cy s

Ser

Tyr 175

Va 1

Arg

Pro

Ser

Gin 180

Trp

Ser

Ser

Ile

Arg 185

Leu

Trp

Thr

Ser

Pro 190

Thr

Phe

Gin

Trp

Leu 195

Ile

Pro

As p

Ser

Al a 200

As p

Thr

Thr

Alá

Thr 205

Pro

Thr

Hi s

Cys

Al a 210

Tyr

Asp

Arg

Ile

Va 1 215

Val

Al a

Gly

Me t

Leu 220

Leu

Arg

Gly

Al a

Val 225

Val

Pro

Asp

Ser

Al a 230

Leu

Pro

Phe

Asn

Phe 235

Gin

Al a

Al a

Tyr

Gly 240

Leu

Ser

Asp

Gin

Leu 245

Al a

Gin

Al a

Ile

Ser 250

As p

Hi s

Tyr

Pro

Val 255

Glu Val Me t Leu Lys

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Aktinrezisztens humán DNáz I-variáns, amely DNS-hidrolitikus aktivitású és csökkent aktinkötő affinitású, továbbá legalább 90%-ban azonos a natív humán DNáz 11. ábrában bemutatott aminosavszekvenciájával, és amelyben legalább egy aminosav helyettesítve van egy másik aminosavval az alábbi helyek egyikénél vagy többjénél: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 és Alall4.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti variáns, amelynek az 1. ábrában bemutatott aminosavszekvenciája van, kivéve, hogy legalább egy aminosav helyettesítve van az alábbi helyek egyikénél vagy többjénél: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 és Alall4.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti variáns, amelynek legalább egy aminosavhelyettesítése van az alábbiak közül: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K és E69R.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti variáns, amelynek legalább egy aminosavhelyettesítése van az alábbiak közül: D53R, Y65A, H44A, E69R, H44A:D53R: Y65A, H44A: Y65A:E69R, D53R: Y65A, D53R: E69R és V67K.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti variáns, amelynek legalább 95%-os azonossága van a natív humán DNáz 11. ábrában bemutatott aminosavszekvenciájához.
6. 6. Izolált nukleinsav, amely valamely, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti humán DNáz I aktinrezisztens variánst kódolja.
7. 7. Gyógyászati készítmény, amely tartalmaz egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti humán DNáz Ivariánst, és kívánt esetben valamely gyógyászatilag elfogadható hordozót.
8. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, ahol a készítmény folyadék formájú.
9. 9. A 7. igénypont szerinti készítmény, ahol a készítmény por formájú.