SK283850B6 - Aktín-rezistentné varianty humánnej DNázy I, ich príprava, použitie a farmaceutický prostriedok s ich obsahom - Google Patents

Abstract

Sú uvedené aminokyselinové sekvencie variantov humánnej DNázy I, ktoré majú zníženú viazaciu afinitu proti aktínu. Taktiež sú uvedené nukleotidové sekvencie, kódujúce takéto aktín-rezistentné varianty, čím sa umožňuje produkcia týchto variantov v množstvách dostatočných na klinické použitie. Ďalej sú poskytnuté farmaceutické zmesi a terapeutické použitie aktín-rezistentných variantov humánnej DNázy I.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka výsledkov získaných z výskumu humánnej deoxyribonukleázy I (DNáza I), fosfodiesterázy, ktorá je schopná hydrolyzovať kyselinu polydeoxyribonukleovú. Vo všeobecnosti sa týka modifikovaných foriem (variantov) humánnej DNázy 1 a ich prípravy metódami rekombinantnej DNA, farmaceutických kompozícií, prostredníctvom ktorých môžu byť klinicky využité, a spôsobov použitia týchto variantov DNázy I a ich zmesí.

Doterajší stav techniky

DNáza 1 je fosfodiesteráza, schopná hydrolyzovať kyselinu polydeoxyribonukleovú. DNáza 1 bola purifikovaná z rozličných druhov rozličnými stupňami.

Bovinná DNáza I bola biochemický intenzívne študovaná. Pozri napr. Moore, in The Enzymes (Boyer, P.D., ed), str. 281 - 296, Academic press, New York (1981). Kompletná aminokyselinová sekvencia bovinnej DNázy I je známa (Liao, et al., J. Biol. Chem. 248:1498-1495 (1973); Oefner, et al., J. Mol. Biol. 192:605-632 (1986); Lahm, et al., J. Mol. Biol. 221:645-667 (1991) a DNA kódujúca bovinnú DNázu I bola klonovaná a vytvorená (Worrall, et al., J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Štruktúra bovinnej DNázy I bola stanovená roentgenovou kryštalografiou. Suck, et al., EMBO J. 3:2423-2430 (1984); Suck, et al., Náture 321:620-625 (1986); Oefner, et al., J. Mol. Biol. 192:605 -632 (1986).

DNA kódujúca humánnu DNázu I bola izolovaná a sekvenovaná a táto DNA bola vytvorená v rekombinantných hostiteľských bunkách, aby sa umožnila produkcia humánnej DNázy I v komerčne použiteľných množstvách. Shak, etal., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990).

DNáza I má množstvo známych užitočných vlastností a bola použitá na terapeutické účely. Jej zásadným terapeutickým použitím bola redukcia viskoelasticity pľúcnych sekrétov (mucus) v takých ochoreniach, ako je zápal pľúc a cystická fibróza (CF), aby sa pomohlo pri uvoľnení respiračných ciest. Pozri napríklad Lourenco, et al., Árch. lutern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Hubbard, et al., New Engl. J. Med. 326:812-815 (1992); Fuchs, et al., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Bryson, et al., Drugs 48: 894-906 (1994). Hlien taktiež prispieva k morbidite pri chronickej bronchitíde, astmatickej bronchitíde, bronchoektázii. emfyzéme, akútnej a chronickej sínusitíde, ako aj pri bežných prechladnutiach.

Pľúcne sekréty osôb, ktoré majú takéto choroby, sú komplexnými materiálmi, ktoré obsahujú glykoproteínové hlieny, mukopolysacharidy, proteázy, aktín a DNA. Niektoré z týchto materiálov v pľúcnych sekrétoch sú uvoľnené z leukocytov (neutrofily), ktoré infiltrujú pľúcne tkanivo ako odpoveď na prítomnosť mikróbov (napr. kmene baktérií Pseudomonas, Pneumococcus alebo Staphylococcus) alebo ďalšie dráždivé látky (napríklad cigaretový dym, peľ). V priebehu reakcie s takýmito mikróbami alebo dráždivými látkami leukocyty môžu degenerovať a môže sa uvoľňovať ich obsah, ktorý prispieva k viskoelasticite pľúcnych sekrétov.

Schopnosť DNázy I redukovať (znižovať) viskoelasticitu pľúcnych sekrétov bola pripisovaná jej enzymatickej degradácii širokého množstva DNA, uvoľneného neutrofilmi. Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci 87:9188-9192 (1990); Aitken, et al., J. Am. Med. Assoc. 267:1947-1951 (1992).

Neskoršie sa pripisoval mukolytickému účinku DNázy I iný mechanizmus, zahrnujúci disagregáciu aktínu. Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994). Aktín je jedným z proteínov v eukaryotických bunkách (napríklad, aktín zahrnuje okolo 10 % totálneho leukocytového proteínu) a bol intenzívne študovaný. Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992); Sheterline, et al., Prot. Profile X: 1-121 (1994). Aktín existuje v dvoch formách: v monomérnej forme (G-aktín) a vláknitej forme (F-aktín), ktorá je zostavená z monomérov G-aktínu. Polymérne vlákna (filamenty) aktínu majú vysokú viskoelasticitu a jednoznačne prispievajú k viskozite pľúcnych sekrétov. Momet, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 8):3680-3684 (1984); Newman, et al., Biochemistry 24:1538-1544 (1985); Janmey, et al., Biochemistry 27:8218-8226 (1988); Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994).

Pretože DNáza I je známa na viazanie aktínu (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Kabsch, ct al., Náture 347:37-44 (1990) a depolymerizáciu vlákien aktínu (takisto aj na inhibiciu polymerizácie G-aktínu vo vláknach) (Mannherz, et al., PEBS Lett. 60:3438 (1975); Hitchock, et al., Celí 7:531-542 (1976); Pinder, et al., Biochemistry 21:4886-4890 (1982); Weber, et al., Biochemistry 33:4780-4786 (1994)), boli predstavy, že mukolytický účinok DNázy I na spútum alebo na iné pľúcne výlučky viac spočíva v disagregácii (depolymerizácii) aktínu ako v hydrolýze DNA. Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994). Zlúčiteľný s týmto názorom je poznatok, že v prítomnosti aktínu je DNA-hydrolytická aktivita DNázy I inhibovaná. Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Mannherz, et al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Tomuto názoru taktiež zodpovedá to, že bolo referované o tom, že niektoré proteíny aktínu (napr. gélsolin) sú účinné pri potláčaní viskoelasticity cystického fibrózneho spúta. Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994); Stossel, et al., PCT Patent Publication No. WO 94/22465 (zverejnená 13. októbra 1994).

Predložený vynález je založený na časti výskumu vynálezcov - určiť biochemický základ mukolytickej aktivity DNázy I. Tento výskum zahrnuje vzor a syntézu rôznych variantov humánnej DNázy 1, testovanie týchto variantov na posúdenie ich schopnosti hydrolyzovať DNA, viazať aktín a znižovať viskoelasticitu spúta in vitro. Vynálezcovia vytvorili niekoľko tried variantov humánnej DNázy I. Jedna trieda variantov (varianty aktín-rezistentné) znížila schopnosť viazať aktín, ale ešte má mukolytickú aktivitu a v niektorých prípadoch mukolytická aktivita vzrástla pri porovnaní s natívnou humánnou DNázou 1. Tieto aktínrezistentné varianty majú približne rovnakú DNA-hydrolytickú účinnosť ako natívna (prírodná) humánna DNáza I, ale táto účinnosť je menej náchylná na inhibovanie aktínom. Druhá trieda variantov viaže aktín s afinitou podobnou tej, ktorá bola zistená pre natívnu humánnu DNázu I, ale má zníženú mukolytickú účinnosť a zníženú DNA-hydrolytickú účinnosť pri porovnaní s natívnou humánnou DNázou I.

Tieto výsledky indikujú, že terapeutická efektívnosť humánnej DNázy 1 pri znižovaní viskoelasticity pľúcnych sekrétov je daná viac jej katalytickou, DNA-hydrolytickou aktivitou ako jej schopnosťou depolymerizovať vláknitý aktín. Preto varianty humánnej DNázy, ktoré viažu aktín s nižšou afinitou ako prírodná humánna DNáza, ale ešte majú DNA-hydrolytickú aktivitu, by mali byť použiteľné ako terapeutické činidlá, najmä pri liečení pacientov, ktorí majú pľúcne výlučky obsahujúce relatívne vysoké množstvo aktínu. Pretože takéto varianty znížili afinitu proti aktínu, ich DNA-hydrolytická aktivita je menej inhibovaná v prítom nosti aktínu a tak tieto varianty majú vyššiu mukolytickú účinnosť v prítomnosti aktínu pri porovnaní s prírodnou humánnou DNázou I.

Podstata vynálezu

Podstatou predloženého vynálezu je teda poskytnúť varianty humánnej DNázy I, ktoré majú DNA-hydrolytickú aktivitu, ale viažu aktín s nižšou afinitou ako natívna humánna DNáza I.

Ďalšia podstata predloženého vynálezu spočíva v poskytnutí nukleových kyselín, kódujúcich takéto aktínrezistentné (odolne) varianty humánnej DNázy I, rekombinantné vektory zahrnujúce takéto nukleové kyseliny, rekombinantné hostiteľské bunky transformované takýmito nukleovými kyselinami alebo vektormi a v poskytnutí spôsobov na produkciu variantov humánnej DNázy I prostriedkami technológie rekombinantnej DNA.

Vynález taktiež vedie k farmaceutickým zmesiam, obsahujúcim aktín-rezistentné varianty humánnej DNázy I, ľubovoľne spolu s farmaceutický akceptovateľným excipicntom.

Vynález ďalej smeruje k spôsobu znižovania viskoelasticity alebo viskozitnej konzistencie materiálu, obsahujúceho DNA, pri pacientoch, spočívajúcemu v podávaní terapeuticky účinnej dávky aktín-rezistentného variantu DNázy I pacientovi.

Vynález smeruje najmä k spôsobu liečenia pacientov majúcich také ochorenia, ako je cystická fíbróza, chronická bronchitída, pneumónia (zápal pľúc), bronchocktázia, emfyzéma (rozodma), astma alebo systémový lupus erythematosus, ktorý zahrnuje podávanie terapeuticky účinného množstva aktín-rezistentného variantu DNázy I pacientovi.

Vynález je taktiež zameraný na použitie aktín-rezistentných variantov humánnej DNázy v in vitro diagnostických rozboroch viskóznych materiálov (napríklad spútum) od pacientov, na meranie množstva prítomného aktínu a na stanovenie, či pacient je vhodným kandidátom na liečbu s aktín-rezistentným variantom DNázy I.

Tieto a ďalšie objekty vynálezu budú zrejmé odborníkom v odbore s prihliadnutím na opis ako celok.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu humánnej zrelej DNázy I (SEQ. ID. NO:1). Čísla označujú sekvenčné polohy aminokyselinových zvyškov v sekvencii.

Obr. 2 zobrazuje relatívnu špecifickú aktivitu natívnej humánnej DNázy I a variantov. Chybové čiary znamenajú štandardnú odchýlku (n-zaťaženie). Relatívna špecifická účinnosť humánnej DNázy I Pulmozyme® (Genentech, Inc., South San Francisco, California, USA) je definovaná ako 1. Relatívna špecifická účinnosť humánnej DNázy I je vyššia ako Pulmozyme®, kvôli prítomnosti deamidovanej formy humánnej DNázy I v Pulmozyme®, ktorá znížila DNA-hydrolytickú aktivitu (Frenz, et al., PCT Patent Publication WO 93/25670, zverejnená 23. decembra 1993).

Obr. 3 zobrazuje DNA-hydrolytickú aktivitu natívnej humánnej DNázy I ajednozvyškových variantov humánnej DNázy I v prítomnosti aktínu, ako bolo stanovené hyperchrómovom teste (test hyperchromicity). „Percento aktivity“ je percento DNA-hydrolytickej aktivity humánnej DNázy I (natívnej alebo variantu) vypočítané spôsobom, ako je opísané v príklade 3; DNA-hydrolytická aktivita humánnej DNázy I za neprítomnosti aktínu je definovaná ako

100 % účinnosť. Nepresné stĺpce (pruhy) reprezentujú štandardnú odchýlku.

Obr. 4 ukazuje DNA-hydrolytickú aktivitu natívnej humánne DNázy I a viaczvyškové varianty humánnej DNázy I v prítomnosti aktínu, ako bolo stanovené v hyperchrómovom teste alebo v teste s metylovou zeleňou. „Percento účinnosti“ je percento DNA-hydrolytickej aktivity humánnej DNázy I (natívnej alebo variantu) vypočítané spôsobom, ako je opísané v príklade 3; DNA-hydrolytická aktivita humánnej DNázy I za neprítomnosti aktínu je definovaná ako 100 % účinnosť. Nepresné stĺpce reprezentujú štandardnú odchýlku.

Obr. 5 ukazuje relatívnu viazaciu afinitu variantov humánnej DNázy I proti aktínu, ako bola stanovená aktínviazacím EL1SA testom (ako je opísané v príklade 3). Hodnota EC₅₀ je koncentrácia DNázy I (natívnej alebo variantu), ktorá je nutná na to, aby poskytla polovicu maximálneho signálu v teste. Nepresné stĺpce reprezentujú štandardnú odchýlku. Hodnoty EC₅₀ pre Pulmozyme® a natívnu humánnu DNázu I sú 72 ± 21 pM (n=21) prípadne 85 ± 14 pM (n=l 4). Relatívna viazacia afinita, znázornená na obrázku, je hodnota EC₅₀ určená pre variant humánnej DNázy I, delená hodnotou EC₅₀ určenou pre natívnu humánnu DNázu I. Varianty, kde hodnota EC₅₀ bola väčšia, ako mohlo byť odmerané v pokuse, sú označené ako >35, >350, >1750, >3500 alebo >35000.

Obr. 6 predstavuje mukolytickú účinnosť natívnej humánne DNázy I a variantov humánnej DNázy I vo vzorkách spúta od pacientov s cystickou fibrózou, ako bola stanovená v teste kompaktnosti. Nepresné stĺpce reprezentujú štandardnú chybu spôsobu.

Obr. 7 ukazuje schematické znázornenie aktín viazacieho ELISA testu, opísaného v príklade 3.

Detailný opis vynálezu

I. Definície

Ako je tu použité, pojmy „humánna DNáza I“, „natívna humánna DNáza ľ‘ a „DNáza I štandardného typu“ sa týkajú polypeptidu, majúceho aminokyselinovú sekvenciu dospelej humánnej DNázy I, ako je uvedená na obr. 3.

„Variant“ alebo „aminokyselinová sekvencia variantu“ humánnej DNázy I je polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu odlišnú od natívnej humánnej DNázy I. Vo všeobecnosti variant bude mať minimálne 80 % sekvenčnú identitu (homológiu), výhodne minimálne 90 % sekvenčnú identitu, ešte výhodnejšie aspoň 95 % sekvenčnú identitu a najvýhodnejšie aspoň 98 % sekvenčnú identitu s natívnou humánnou DNázou I. Percento sekvenčnej identity je stanovené, napríklad, Fitch-om, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:1382-1386 (1983), verziu algoritmu opísal Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), po zoradení sekvencii na poskytnutie maximálnej homológie.

Pojmy „humánna DNáza I aktín-rezistentný variant“, „aktín-rezistentný variant“ a „aktín-rezistentný variant humánnej DNázy I“ sa týkajú variantu natívnej humánnej DNázy I, ktorá má (1) DNA-hydrolytickú aktivitu a (2) redukovanú viazaciu afinitu proti aktínu.

„DNA-hydrolytická aktivita“ súvisí s enzymatickou aktivitou natívnej humánnej DNázy I v hydrolyzujúcom (štiepiacom) substráte DNA za získania 5'-fosforylovaných oligonukleotidových konečných produktov. DNA-hydrolytická účinnosť je rýchlo stanovená niektorou z rôznych metód, známych v odbore, zahrnujúcich polyakrylamidovú a agarózovú gélovú elektroforézu, hyperchrómový test (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)) alebo testom s metylo vou zeleňou (Kumick, Árch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, e\a\.,Anal. Biochem. 222:351 -358 (1994)).

„Viazacia afinita“ natívnej humánnej DNázy 1 alebo aktín-rezistentného variantu humánnej DNázy 1 proti aktínu sa týka schopnosti (kapacity) DNázy I nekovalentne sa naviazať na aktín. Viazacia afinita sa dá stanoviť ktoroukoľvek z rozličných metód, známych v odbore, napríklad, ako opisuje Mannherz, et al,, Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Alternatívne, relatívne viazacie afinity rozličných DNáz (napríklad natívnej humánnej DNázy I a jej variantov) sú stanovené meraním naviazania DNáz na imobilizovaný aktín v ELISA teste (opísaný v príklade 3), alebo porovnaním DNA-hydrolytickej aktivity DNáz v prítomnosti a bez aktinu (tiež opísané v príklade 3). Metódy opísané v príkladoch sú špeciálne vyhovujúce pre skríning variantov humánnej DNázy I na rýchle identifikovanie takýchto variantov, ktoré majú zníženú viazaciu afinitu proti aktínu.

„Humánna DNáza 1 aktín-rezistentný variant“, majúci „zníženú viazaciu afinitu proti aktínu“, jc variant, majúci viazaciu aktivitu proti aktínu, ktorá je relatívne nižšia ako afinita, s ktorou natívna humánna DNáza I viaže aktín, stanovené v porovnateľných podmienkach. Ak sa aktín-viažuci ELISA test, ako je opísaný v príklade 3, použije na stanovenie viazacej afinity humánnej DNázy 1 (natívnej alebo variantu) proti aktinu, potom aktín-rezistentný variant majúci „zníženú viazaciu afinitu proti aktínu“ bude ten, ktorý má hodnotu EC₅₀ vyššiu, ako je hodnota natívnej humánnej DNázy I. V tomto pokuse aktín rezistentný variant bude mať typicky EC₅₀ hodnotu päťkrát až 1 OO-krát vyššiu ako hodnota natívnej humánnej DNázy; ale aktin-rezistentné varianty, majúce EC₅₀ hodnotu viac ako 500-krát vyššiu ako hodnota natívnej humánnej DNázy I, sa tiež dajú rýchlo pripraviť, najmä viacnásobnou modifikáciou aminokyselinových zvyškov aminokyselinovej sekvencie natívnej humánnej DNázy I (pozri, napríklad, obr. 5).

„Mukolytická účinnosť (aktivita)“ súvisí s redukciou (znížením) viskoelasticity (viskozity) spúta alebo iného biologického materiálu, napríklad ako sa pozorovalo pri spracovaní materiálu s natívnou humánnou DNázou I alebo variantom humánnej DNázy I. Mukolytická účinnosť sa rýchlo stanoví ktoroukoľvek z niektorých rôznych metód, známych v odbore, zahrnujúcich test spúta (PCT Patent Publication WO 94/10567. zverejnená 11. mája 1994), testy využívajúce torzné kyvadlo (Janmey, J Biochem. Biophys. Methods 22:41-53 (1991), alebo ďalšie reologické postupy.

„Polymerázová reťazová reakcia“ alebo „PCR“ vo všeobecnosti sa týka spôsobu amplifikácie (rozmnoženia) želanej nukleotidovej sekvencie in vitro, ako opisuje, napríklad, US pat. 4,683,195. Všeobecne, PCR spôsob zahrnuje opakované cykly syntézy predlžovania priméru. s použitím oligonukleotidových primárov schopných hybridizácie prednostne na matricovú nukleovú kyselinu.

„Bunka“, „hostiteľská bunka“, „bunková línia“ a „bunková kultúra sú tu používané navzájom zameniteľné a všetky takéto pojmy by mali byť chápané ako obsahujúce progén majúci pôvod v raste alebo kultivácii bunky. „Transformácia“ a „transefekcia“ sú zameniteľné používané a súvisia s procesom introdukcie (zavedenia) DNA do bunky.

„Operatívne spojený“, resp, „použiteľné spojený“ sa vzťahuje na kovaientné spojenie dvoch alebo viacerých DNA sekvencií prostriedkami cnzymatickej ligácie alebo inakšie, v konfigurácii v pomere k jednému ďalšiemu, takže môže byť splnená normálna funkcia sekvencií. Napríklad, DNA na presekvenciu alebo sekrečný úsek (secretory leader) je operatívne spojený s DNA pre polypeptid, ak je vytvorený ako preproteín, ktorý sa podieľa na sekrécii polypeptidu; promótor alebo zosilňovač transkripcie (enhancer) je operatívne spojený s kódujúcou sekvenciou ak ovplyvňuje transkripciu sekvencie; alebo miesto viažuce ribozóm je operatívne spo jený s kódujúcou sekvenciou, ak je umiestnená tak, aby uľahčovala transláciu. Všeobecne, ,,operatívne spojený“ znamená, že DNA sekvencie, ktoré sa majú spojiť sú priľahlé a, v prípade sekrečného úseku, priľahlé a v čítacej fáze. Pripojenie sa dosiahne ligáciou na vhodných reštrikčných miestach. Ak takéto miesta neexistujú, potom sa použijú syntetické oligonukleotidové adaptory alebo linkery (spojovníky), v spojení so štandardnými metódami rekombinantnej DNA.

Aminokyseliny sú tu identifikované tromi písmenami alebo jednopísmenovým označením, ako je uvedené neskôr.

Asp D kyselina asparágová	Íle I izoleucín
Thr T treonin	Leu L leucín
Ser S serín	Tyr Y tyrozín
Glu E kyselina glutamová	Phe F fenylalanín
Pro P prolín	His H histidín
Gly G glycín	Lys K lyzín
Ala A alanín	Arg R arginín
Cys C cysteín	Trp W tryptofán
Val V valín	Gin Q glutamín
Met M metionín	Asn N asparagín

H. Selekcia aktín-rezistentných variantov

Predložený vynález je založený na štúdiu štruktúry, aktín viažucich vlastností, DNA-hydrolytickej aktivity a mukolytickej aktivity aminokyselinovej sekvencie variantov humánnej DNázy I, Aktín-rezistentné varianty predloženého vynálezu majú DNA-hydrolytickú aktivitu, ale viazanie (pripájanie) aktínu s nižšou afinitou ako natívna humánna DNáza I, Zníženie viazania aktínu sa výhodne dosiahne vytvorením mutácií na a/alebo okolo takýchto aminokyselinových zvyškov v natívnej humánnej DNáze I, ktoré sa javia ako ovplyvňujúce viazanie aktínu, zahrnujúc, napríklad, Glul3, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val67. Glu69 a Alal 14 zvyšky natívnej humánnej DNázy I (číslo nasledujúce po trojpísmenovom aminokyselinovom označení indikuje špecifickú polohu aminokyselinového zvyšku v sekvencií na obr. 1).

Existuje množstvo spôsobov, ktorými sa môžu vyrobiť aktin-rezistentné varianty humánnej DNázy I. V jednom príklade tohto vynálezu sa aktín-rezistentný variant pripraví introdukciou (zavedením) buď jednou alebo viacnásobnými aminokyselinovými substitúciami, inzerciami (vsunutie) a/alebo deléciami (strata) na. alebo priľahlých k (tzn. v približne piatich aminokyselinových zvyškoch od) takým aminokyselinovým zvyškom natívnej humánnej DNázy 1, ktoré ovplyvňujú viazanie aktínu. Niektoré ilustrativne príklady takýchto mutácií sú nasledujúce: D53R, D53K. D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, H44A:Y65A:E69R (pozri obr. 2 až 6).

V ďalšom príklade tohto vynálezu sa aktín-rezistentný variant pripraví introdukčnou mutáciou(-iami). ktorá vytvorí nové miesto glykozyiácie na (alebo na priľahlých) (t. j. v asi piatich aminokyselinových zvyškoch) aminokysclinových zvyškoch natívnej humánnej DNázy I, ktoré ovplyvňujú viazanie aktinu. Napríklad, cielená mutagenéza je použitá na introdukciu jednej z tripeptidovych sekvencií, asparagín-X-serín alebo asparagin-X-treonín (kde X je akákoľvek aminokyselina s výnimkou prolínu), ktoré sú rozpoznávacími sekvenciami na enzymatické naviazanie uhľovodíkovej skupiny na asparagínovú stranu reťazca. Cre ighton, Proteins, str. 76 - 78 (W.H. Freeman, 1984). Sférická zábrana, vyskytujúca sa medzi uhľovodíkovou skupinou výsledného N-glykozylovaného variantu DNázy I a aktínom môže znížiť alebo zamedziť viazanie aktínu a následne inhibíciu DNázy I DNA-hydrolytickej aktivity, pri porovnaní s natívnou humánnou DNázou I. Niektoré ilustratívne príklady takýchto mutácií na introdukciu nového glykozylačného miesta sú nasledujúce: H44N, D58S, D58T, H64N:V66T, H64N:V66S, V67N:E69S, V67N:E69T.

Voliteľne, v spojení s takýmito mutáciami na vytvorenie nového miesta glykozylácie, prirodzene sa vyskytujúce miesto glykozylácie v polohách 18 a/alebo 106 v aminokyselinovej sekvencií natívnej humánnej DNáza I môže byť „vymazané“, v závislosti od rozsahu glykozylácie želanej v aktín-rezistentom variante.

V ďalšom riešení tohto vynálezu cielená mutagenéza sa použije na introdukciu zvyškov na, (alebo na priľahlých) (t. j. v asi piatich aminokyselinových zvyškoch od) aminokyselinových zvyškoch natívnej humánnej DNázy I, ktoré sú obsiahnuté pri viazaní aktínu a ktoré sú vhodné na posttranslačnú modifikáciu biologicky alebo chemicky (pozri nižšie). Means, et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer, et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analvtical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins. str. 70 - 87 (W.H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modifícation (CRC Press, 1991). Takéto posttranslačné modifikácie môžu predstavovať stérickú zábranu alebo zmenené elektrostatické vlastnosti v DNáze I, ktoré budú znižovať alebo zabraňovať viazaniu aktínu a následnej inhibícii DNA-hydrolytickej aktivity, pri porovnaní s natívnou humánnou DNázou L Napríklad, cysteínový zvyšok môže byť zavedený na (alebo na priľahlý) zvyšok natívnej humánnej DNázy I, ktorý je obsiahnutý pri viazaní aktínu. Voľný tiol cysteínového zvyšku môže tvoriť intermolekulový disulfidieký spoj (mostík) a s ďalším takým variantom DNázy I vytvoriť dimér DNázy I, alebo môžu byť modifikované, napríklad, so špecifickým tiolovým alkylačným činidlom. Niektorými ilustratívnymi príkladmi takýchto mutácií sú: II44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E69C, A114C.

Kvôli jednoduchosti sú substitúcie, inzercie a/alebo delécie v aminokyselinovej sekvencií natívnej humánnej DNázy I zvyčajne vykonané introdukčnými mutáciami v príslušnej nukleotidovej sekvencií DNA kódujúcej natívnu humánnu DNázu I, napríklad cielenou mutagenézou. Expresia zmenenej DNA potom vedie k produkcii variantu humánnej DNázy I, majúceho požadovanú (nenatívnu) aminokyselinovú sekvenciu.

Zatiaľ čo akákoľvek technika, známa v odbore, môže byť použitá na vytvorenie cielenej mutagenézy, napríklad ako opisuje Sambrook, et al., Molecular Clonine: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), oligonukleotidom-riadená mutagenéza je preferovaným spôsobom prípravy variantov humánnej DNázy I tohto vynálezu. Tento spôsob, ktorý je dobre známy v odbore (Zoller, et al., Meth. Enz. 100:4668-500 (1983); Zoller, et al., Meth. Enz. 154:329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154:382-403 (1987); Kunkel, et al., Meth. Enzymol 154:367-382 (1987); Horwitz, et al., Meth. Enz. 185:599-611 (1990)), je vhodný najmä na vyrobenie substitučných variantov, hoci môže byť taktiež výhodne použitý na prípravu variantov deléciou (vyštiepením, vynechaním) a inzerciou (vsunutím).

Technika cielenej mutagenézy typicky využíva fágový vektor, ktorý' existuje v dvoch formách - jednovláknovej a dvojvláknovej. Typické vektory, užitočné na cielenú muta genézu, zahrnujú vektory, ako je Ml3 fág a plazmidové vektory, ktoré obsahujú jednovláknového fága replikačného pôvodu (Messing, et al., Meth. Enzymol. 101:20-78 (1983); Veira, et al., Meth. Enzymol. 153:3-11 (1987); Short, et al., Nuc. Acids. Res. 16:7583-7600 (1988)). Replikácia týchto vektorov vo vhodných hostiteľských bunkách vedie k syntéze jednovláknovej DNA, ktorá môže byť použitá na cielenú mutagenézu.

V skratke, pri uskutočňovaní cielenej mutagenézy DNA kódujúcej natívnu humánnu DNázu I (alebo jej variant), DNA je modifikovaná prvou hybridizáciou oligonukleotidu kódujúceho želanú mutáciu jedného vlákna DNA. Po hybridizácii je použitá DNA polymcráza na syntetizovanie celého druhého vlákna, využijúc hybridizovaný oligonukleotid ako primér a využijúc jedno vlákno DNA ako templát. Teda, oligonukleotid kódujúci želanú mutáciu je zabudovaný vo výslednej dvojvláknovej DNA.

Oligonukleotidy na použitie ako hybridizačné sondy alebo primery môžu byť pripravené akoukoľvek vhodnou metódou, ako je purifikácia prirodzene sa vyskytujúcej DNA alebo in vitro syntézou. Napríklad, oligonukleotidy sa dajú rýchlo syntetizovať s využitím rôznych techník v organickej chémii, ako sú opísané v Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-98 (1979); Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); Caruthers, et al., Meth. Enzymol. 154:287-313 (1985). Všeobecný prístup k selekcii vhodnej hybridizačnej sondy alebo priméru je veľmi dobre známy. Keller, et al., DNA Probes. str. 11 - 18 (Stockton Press, 1989). Typicky bude hybridizačná sonda alebo primér obsahovať 10-25 alebo viac nukleotidov a bude zahrnovať aspoň 5 nukleotidov na obidvoch stranách sekvencie kódujúcej želanú mutáciu tak, aby sa zaistilo, že oligonukleotid bude prednostne hybridizovať na želanom mieste molekuly matrice jednovláknovej DNA.

Samozrejme, cielená mutagenéza môže byť použitá na introdukciu viacnásobných mutácií substitúciou, inzerciou alebo deléciou vo východiskovej DNA. Ak miesta, na ktorých sa majú mutácie uskutočniť, sú lokalizované blízko seba, mutácie môžu byť zavedené súčasne s použitím jedného oligonukleotidu, ktorý kóduje všetky želané mutácie. Ale ak miesta, ktoré majú byť mutované, sú rozmiestnené od seba v určitej vzdialenosti (oddelené viac ako desiatimi nukleotidmi), je ťažšie generovať jeden oligonukleotid, ktorý kóduje všetky želané zmeny. Miesto toho môže byť využitá jedna z dvoch alternatívnych metód.

V prvej metóde je generovaný separátny oligonukleotid pre každú žiaducu mutáciu. Oligonukleotidy sú potom naraz teplotnc hybridizované na jednovláknovú matricovú (templátovú) DNA a druhé vlákno DNA, ktoré je syntetizované z matrice, bude kódovať všetky zo žiaducich aminokyselinových substitúcií.

Alternatívna metóda obsahuje dva alebo viac cyklov mutagenézy na produkciu želaného variantu. Prvý cyklus je taký, ako je opísané pri vykonávaní jednej mutácie. Druhý cyklus mutagenézy využíva zmenenú DNA, produkovanú v prvom cykle mutagenézy, ako templát. Teda, tento templát už obsahuje jednu alebo viac mutácií. Oligonukleotid kódujúci ďalšiu(e) želanú(é) aminokyselinovú(é) substitúciu(e) je potom teplotné hybridizovaný na tento templát a výsledné vlákno DNA teraz kóduje mutácie obidvoch cyklov - prvého aj druhého - mutagenézy. Výsledná DNA môže byť použitá ako matrica v treťom cykle mutagenézy, atď.

PCR mutagenéza (Higuchi, in PCR Protocols. str. 177 - 183 (Academic Press, 1990); Vallette, et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989); je tiež vhodná na vyrobenie variantov humánnej DNázy I. Stručne, keď sa použijú malé množstvá matricovej DNA ako východiskové materiály v PCR, priméry, ktoré sa nepatrne odlišujú v sekvencii od príslušného regiónu v matricovej DNA, môžu byť použité na generovanie relatívne veľkých množstiev špecifického fragmentu DNA, ktorý sa líši od sekvencie matrice len na miestach, kde sa priméry líšia od matrice. Na zavedenie mutácie do plazmidovej DNA sekvencia jedného z primárov obsahuje, napríklad, želanú mutáciu a je označená na hybridizovanie jedného vlákna plazmidovej DNA na mieste mutácie; sekvencia druhého priméru musí byť identická s nukleotidovou sekvenciou protiľahlého vlákna plazmidovej DNA, ale táto sekvencia môže byť lokalizovaná kdekoľvek pozdĺž plazmidovej DNA. Ale je výhodné, keď sekvencia druhého priméru je umiestnená v 200 nukleotidoch z prvého priméru tak, že na konci celej amplifikovanej oblasti DNA viazanej primármi môže byť ľahko sekvenovaná. PCR amplifikácia využívajúca pár primárov ako jeden, už práve opísaný, sa prejavuje v populácii DNA fragmentov, ktoré sa líšia na mieste mutácie špecifikovanom primárom, a možno na iných miestach, pretože kopírujúca matrica je trocha náchylná na chyby. Wagner, et al., in PCR Topics, str. 69 - 71 (Springer-Verlag, 1991).

Ak pomer matrice k amplifikovanej DNA produktu je extrémne nízky, väčšina DNA fragmentov produktu zabuduje želanú(é) mutáciu(e). Táto DNA produktu sa použije na premiestnenie príslušnej oblasti v plazmide, ktorý slúžil ako PCR matrica, využijúc metódy štandardnej rekombinantnej DNA. Mutácie na oddelených miestach môžu byť zavedené súčasne buď využitím mutantu druhého priméru alebo vykonaním druhej PCR s rôznymi primérmi mutantu a ligáciou dvoch výsledných PCR fragmentov súčasne na plazmidový fragmet v troj- (alebo viac-jstupňovej ligácii.

Ďalší spôsob prípravy variantov, kazetová mutagenéza, je založený na technológii opísanej vo Wels, et al., Gene 34:315-323 (1985). Východiskovým materiálom je plazmid (alebo iný vektor), zahrnujúci DNA sekvenciu, ktorá má byť zmenená. Kodón(y) vo východiskovej DNA, ktorá má byť zmenená, sú identifikované. Tu musí byť typické miesto pre reštrikčnú endonukleázu na každej strane identifikovaného(ých) miesta(miest) mutácie. Ak žiadne takéto reštrikčné miesta neexistujú, môžu byť vytvorené s použitím opísanej metódy oligonukleotidom sprostredkovanej mutagenézy na ich vytvorenie na patričných miestach v DNA. Plazmidová DNA je vyrezaná na týchto miestach kvôli linearizácii. Dvojvláknový oligonukleotid kódujúci sekvenciu DNA medzi reštrikčnými miestami, ale obsahujúci želanú mutáciu(e) je syntetizovaný s využitím štandardných postupov, v ktorých dve vlákna oligonukleotidu sú syntetizované oddelene a potom spolu hybridizované s využitím štandardných technológií. Tomuto dvojvláknovému oligonukleotidu sa hovorí kazeta. Táto kazeta je konštruovaná tak, že má 5 a 3 konce, ktoré sú kompatibilné s koncami linearizovaného plazmidu, takže tento sa môže priamo ligovať na plazmid. Výsledný plazmid obsahuje zmenenú ĎNA sekvenciu.

Prítomnosť mutácie(ií) v DNA sa stanoví spôsobmi, ktoré sú v odbore známe a zahrnujú reštrikčné mapovanie a/alebo DNA sekvenovanie. Výhodnou metódou na sekvenovanie DNA je metóda dideoxy reťazovej terminácie podľa Sangera, et ah, Proc Nat. Acad. Sci. USA 72:3918-392+ (1979).

DNA kódujúca variant humánnej DNázy I je vložená do replikovateľného vektora na ďalšie klonovanie a exprcsiu. „Vektory“ sú plazmidy a iné DNA, ktoré sú schopné replikácie v hostiteľskej bunke a samy osebe sú užitočné na uskutočnenie dvoch funkcií v spojení s kompatibilnými hostiteľskými bunkami (vektor-hostiteľský systém). Jednou funkciou je uľahčiť klonovanie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje variant humánnej DNázy 1, tzn. produkovať užitočné množstvá nukleovej kyseliny. Druhou funkciou je viesť expresiu variantu humánnej DNázy 1. Jedna alebo obidve tieto funkcie sú uskutočnené vektorom v zvláštnej hostiteľskej bunke, použitej na klonovanie alebo expresiu. Vektory budú obsahovať rozličné zložky, v závislosti od funkcie, ktorú majú vykonať.

Aby sa produkoval variant humánnej DNázy I bude expresný vektor obsahovať DNA kódujúcu variant, ako už bolo uvedené, operatívne pripojenú na promótor a ribozóm viažuce miesto. Variant je potom vytvorený priamo v rekombinantnej bunkovej kultúre, alebo ako fúzia s heterologickými polypeptidmi, výhodne signálnou sekvenciou alebo iným polvpeptidom, ktorý má špecifické štiepiace miesto na spojení medzi heterologickým polypeptidom a variantom humánnej DNázy í.

Preferovanými hostiteľskými bunkami iniciálnych klonovacích krokov podľa tohto vynálezu sú prokaryoty (napríklad E. coli a ďalšie baktérie). Sú použiteľné najmä na rýchlu produkciu veľkých množstiev DNA, na produkciu templátov jednovláknovej DNA používaných na cielenú mutagenézu a na sekvenovanie DNA generovaných variantov. Prokaryotické hostiteľské bunky môžu byť taktiež použité na expresiu DNA kódujúcej variant humánnej DNázy 1. Polypeptidy, ktoré sú produkované v prokaryotických bunkách, typicky budú neglykozylované.

Okrem toho varianty humánnej DNázy I podľa tohto vynálezu môžu byť vytvorené v eukaryotických hostiteľských bunkách, zahrnujúc eukaryotické mikróby (napríklad kvasinky) alebo bunky derivované zo živočíšneho alebo incho mnohobunkového organizmu (napríklad ovariálne bunky čínskeho škrečka a iné cicavčie bunky) alebo v živých zvieratách (napríklad dobytok, kozy, ovca).

Klonovacie a expresívne metodológie sú v odbore veľmi dobre známe. Príkladmi prokaryotických a eukaryotických hostiteľských buniek a expresívnych vektorov, vhodných na použitie pri produkcii variantov humánnej DNázy 1 podľa predloženého vynálezu, sú, napríklad tie, ktoré sú opísané v Shak, PCT Patent Publication WO 90/07572 (zverejnená 12. júla 1990).

Ak sú prokaryotické bunky alebo bunky, ktoré obsahujú podstatné konštrukcie bunkovej steny, použité ako hostitelia, preferovanými spôsobmi transfekcie buniek DNA je spôsob spracovania vápnikom, ktorý opísali Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110-2114 (1972) alebo polyetylénglykolový spôsob, ktorý opísali Chung, et al., Nuc. Acids. Res. 16:3580 (1988). Ak sú ako hostiteľ použité kvasinky, transľekcia sa vo všeobecnosti vykoná s použitím polyetylénglykolu, ako uvádza Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933 (1978). Ak sa ako hostiteľské bunky použijú cicavčie bunky, transfekcia sa vo všeobecnosti uskutočňuje zrážacou metódou fosforečnanom vápenatým, Graham, et al., Pirology 52:546 (1978), Gorman, et al., DNA and Prolein Eng. Tech. 2:3-10 (1990). Ale aj ďalšie známe spôsoby na zavedenie DNA do prokaryotických a eukaryotických buniek, ako napríklad jadrová injekcia, elektroporácia alebo fúzia protoplastov, sú tiež vhodné na použitie v tomto vynáleze.

Obzvlášť užitočné v tomto vynáleze sú expresné vektory, ktoré sa starajú o dočasnú expresiu v cicavčích bunkách DNA. kódujúcej varianty humánnej DNázy 1. Všeobecne, dočasná expresia zahrnuje použitie expresného vektora, ktorý je schopný účinnej replikácie v hostiteľskej bunke, takže hostiteľská bunka nahromadí veľa kópii expresného vektora a v dôsledku toho syntetizuje vysoké hladiny želaného polypeptidu kódovaného expresným vektorom. Sys témy dočasnej expresie, pozostávajúce z vhodného expresného vektora a hostiteľskej bunky, berú do úvahy praktickú pozitívnu identifikáciu polypeptidov, kódovaných DNA, ako aj rýchly skríning takýchto polypeptidov na požadované biologické alebo fyziologické vlastnosti. Wong, et al., Science 228:810-815 (1985); Lee, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985); Yang, et al., Celí 47:3-10 (1986). Teda, dočasné expresné systémy sú vhodné na použitie na expresiu DNA, kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu variantov natívnej humánnej DNázy I, v spojení s testmi na identifikovanie týchto variantov, ktoré viažu aktín s nižšou afinitou tak natívna DNáza I, ako aj s testmi na vyhodnotenie týchto variantov s DNA-hydrolytickou aktivitou.

Variant humánnej DNázy I je výhodne vylučovaný z buniek, v ktorých je vytvorený, a v tomto prípade sa získa späť z kultivačného média, v ktorom hostiteľské bunky rastú. V tom prípade môže byť žiaduce, aby bunky rástli v kultivačnom médiu bez séra, pretože neprítomnosť sérových proteínov a iných zložiek séra v médiu môže uľahčiť purifikáciu variantu. Ak sa nevylučuje, potom sa variant humánnej DNázy I získa naspäť z lyzátov hostiteľských buniek. Keď je variant vytvorený v hostiteľskej bunke iného ako ľudského pôvodu, variant bude kompletne bez proteínov ľudského pôvodu. V každom prípade bude potrebné purifikovať variant od rekombinantných bunkových proteínov, aby sa získali podstatne homogénne preparáty variantu humánnej DNázy I. Na terapeutické použitie budú mať purifikované varianty výhodne vyššiu čistotu ako 99 % (napríklad, akékoľvek ďalšie proteíny budú pozostávať z menej ako 1 % totálneho proteínu v purifikovanej zmesi).

Všeobecne, puriflkácia variantu humánnej DNázy I je uskutočnená s využitím diferenciálnych fyzikálnochemických vlastností variantov pri porovnaní s kontaminantmi, s ktorými môže byť spojená. Napríklad, ako prvý krok sa centriťuguje kultivačné médium alebo lyzát hostiteľských buniek, aby sa odstránili pozostatky buniek. Variant humánnej DNázy I sa potom zbavuje znečistenín rozpustných proteínov a polypeptidov, napríklad zrážaním síranom amónnym alebo etanolom, gélovou filtráciou (molekulová vytesňovacia chromatografia), ionexovou chromatografiou, hydrofóbnou chromatografiou, imunoafinitnou chromatografiou (napríklad s použitím kolóny, pozostávajúcej z protilátok proti humánnej DNáze I naviazaných na Sepharose), zachytávacou kationexovou chromatografiou (Frenz, et al., PCT Patent Publication WO 93/25670, zverejnená 23. decembra 1993), reverznou fázovou HPLC a/alebo gélovou elektroforézou.

Je samozrejmé, že odborník v odbore pochopí, že metódy čistenia, ktoré sú použité pre natívnu humánnu DNázu I, si môžu vyžadovať nejakú modifikáciu, aby boli použiteľné na purifikáciu variantu humánnej DNázy I, zdôvodnenú štrukturálnymi alebo inými rozdielmi medzi natívnymi proteínmi a proteínmi variantu. Tak napríklad v niektorých hostiteľských bunkách (najmä v bakteriálnych hostiteľských bunkách) môže byť variant humánnej DNázy I vytvorený na začiatku v nerozpustnej, agregovanej forme (spomenuté v stave techniky ako „refraktilné telieska“ alebo „inklúzne telieska“), v prípade ktorej bude nevyhnutná solubilizácia a renaturácia variantu humánnej DNázy I v priebehu jeho čistenia. Spôsoby solubilizácie a renaturácie rcfraktilných teliesok rekombinantného proteínu sú v odbore známe (pozri, napríklad, Builder, et al., US patent 4,511,502).

V ďalšom príklade tohto vynálezu sa varianty humánnej DNázy I pripravia uskutočnením kovalentných modifikácií priamo v proteíne natívnej alebo variantu humánnej

DNázy I. Takéto modifikácie sa robia kvôli aktín-viažucej účinnosti alebo kvôli inej vlastnosti proteínu (napríklad stabilite, biologickému polčasu rozpadu, imunogenicite) a môžu byť urobené namiesto, alebo okrem, mutácií aminokyselinovej sekvenčnej substitúcie, inzercie a delécie, opísaných skôr.

Kovalentné modifikácie môžu byť zavedené reakciou cieľových aminokyselinových zvyškov natívnej DNázy I alebo variantu DNázy I s organickým derivatizačným činidlom, ktoré je schopné reakcie s vybranými aminokyselinovými postrannými reťazcami alebo N- alebo C-koncovými zvyškami. Vhodné derivatizačné činidlá a spôsoby sú v odbore dobre známe.

Tak napríklad cysteinylové zvyšky najčastejšie reagujú s α-halogénacetátmi (a príslušnými aminmi), ako je kyselina chlóroctová alebo chlóracetamid, za vzniku karboxymetyl alebo karboxyamidometyl derivátov. Cysteinylové zvyšky sú derivatizované reakciou s brómtrifluóracetónom, a-bróm-P-(5-imidazoyl)propiónovou kyselinou, chlóracetylfosfátom, N-alkylmaleínimidom, 3-nitro-2-pyridyldisulfidom, metyl-2-pyridyldisulfidom, p-chlórmerkuribenzoátom, 2-chlórmerkuri-4-nitrofenolom alebo chlór-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolom.

Histidylové zvyšky sú derivatizované reakciou s dietylpyrokarbonátom pri pH 5,5-7,0, pretože toto činidlo je relatívne špecifické pre histidylový bočný reťazec. Použiteľný je aj para-brómfenacylbromid; reakcia sa výhodne uskutočňuje v 0,1 M kakodylane sodnom pri pH 6,0.

Lyzinylové a aminokoncové zvyšky reagujú so sukcínanhydridom alebo s anhydridom inej karboxylovej kyseliny. Derivatizácia týchto činidiel má účinok na reverziu náboja lyzinylových zvyškov. Iné vhodné činidlá na derivatizáciu zvyškov, obsahujúcich α-amino, zahrnujú imidoestery, ako je metylpikolínimidát; pyridoxalfosfát; pyridoxal; chlórbórhydrid; kyselina trinitrobenzénsulfónová; O-dimetylizomočovina; 2,4-pentándión a katalyzovanú transaminázovú reakciu s glyoxalátom.

Arginylové zvyšky sú modifikované reakciou s jedným alebo niekoľkými konvečnými činidlami, medzi iným ťenylglyoxalom, 2,3-butándiónom, 1,2-cyklohexándiónom a ninhydrínom. Derivatizácia arginínových zvyškov vyžaduje, aby sa reakcia uskutočnila v alkalických podmienkach kvôli vysokej pK_a guanidínovej funkčnej skupiny. Okrem toho tieto činidlá môžu reagovať so skupinami lyzínu ako aj s epsilon-aminoskupinou argininu.

Bočné karboxylové skupiny (aspartyl alebo glutamyl) sú selektívne modifikované rekaciou s karbodiimidmi (R-N=C=N-R'), kde R a R sú rozličné alkylskupiny, ako je l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-etyl)karbodiimid alebo 1-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Aspartylové a glutamylové zvyšky sú ďalej konvertované na asparaginylové a glutaminylové zvyšky reakciou s amóniovými iónmi.

Kovalentné pripájanie glykozidov na aminokyselinové zvyšky proteínu môže byť použité na modifikáciu alebo na zvyšovanie počtu alebo profilu uhľovodíkových zvyškov, najmä na, alebo pri, spojoch týchto zvyškov, ktoré sú zahrnuté pri viazaní aktínu. V závislosti od použitia kopulačného spôsobu sa môže(u) pridať cukor(kry) k (a) argininu a histidínu. (b) voľnej karboxylovej skupine, (c) voľnej sulfohydrylovej skupine, ako je skupina cysteínu, (d) voľnej hydroxylovej skupine, ako je skupina serínu, treonínu alebo hydroxyprolínu, (e) aromatickým zvyškom, ako sú zvyšky fenylalanínu, tvrozínu alebo tryptofánu alebo (f) amidovej skupine glutamínu. Vhodné spôsoby sú opísané, napríklad, v PCTpatentovej publikácii WO 87/05330 (zverejnená 11.

septembra 1987) a v Aplin, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. str. 259 -306 )1981).

Kovalentná väzba činidiel, ako je polyetylénglykol (PEG) alebo humánny sérumalbumín, na varianty humánnej DNázy I môže znížiť imunogenicitu a/alebo toxicitu variantu a/alebo predĺžiť jeho polčas rozpadu, ako sa zistilo pri iných proteínoch. Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Poznansky, et al., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson, et al., Biotechnology 8:343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Polvetvlene Glycol Chemistry (Plénum Press, 1992). Okrem toho modifikácia natívnej humánnej DNázy 1 alebo jej variantu týmito činidlami na, alebo v susedstve s (tzn. asi v piatich z aminokyselinových zvyškov) aminokyselinovým zvyškom, ktorý pôsobí aktín-viažuco, môže viesť k aktin-rezistentným variantom.

V ďalšom riešení aktin-rezistentný variant humánnej DNázy I môže obsahovať mutáciu na Asn zvyšku, ktorý sa vyskytuje na pozícii 74 aminokyselinovej sekvencie natívnej humánnej DNázy I (napríklad N74D, N74K alebo N74S mutácia), na zníženie alebo zabránenie deamidácii variantu DNázy I. Frenz, et al., PCT Patent Publication WO 93/25670, zverejnená 23. decembra 1993. Ako ďalší príklad môže aktin-rezistentný variant humánnej DNázy 1 obsahovať mutáciu aminokyselinovej sekvencie alebo inú kovalentnú modifikáciu, ktorá zníži náchylnosť variantu na degradáciu proteázami (napríklad neutrofilnou elastázou), ktoré môžu byť prítomné v spútu alebo v iných biologických materiáloch.

DNA-hydrolytická aktivita a aktín-viazacia afinita variantov humánnej DNázy I, pripravených, ako je opísané skôr, sa rýchlo stanoví s využitím testov a spôsobov známych v odbore a tu opísaných. Akýkoľvek takýto variant, ktorý má DNA-hydrolytickú aktivitu a zníženú viazaciu aktivitu pre aktín (ako je definované skôr), je aktín-rezistentným variantom, patriacim do rozsahu tohto vynálezu.

Aktín-rezistentné varianty humánnej DNázy 1 tohto vynálezu sa použijú na zníženie viskoelasticity materiálu, obsahujúceho DNA, ako je spútum, hlien alebo iné pľúcne sekréty (výlučky). Takéto varianty sú užitočné predovšetkým na liečenie pacientov s pľúcnymi ochoreniami, ktorí majú abnormálnu viskóznu (lepkavú) alebo zhustenú sekréciu a v podmienkach, ako sú akútne alebo chronické bronchiálno-pľúcne choroby, zahrnujúce infekčné zápaly pľúc, bronchitídu alebo tracheobronchitídu, bronchoektáziu, cystickú ftbrózu, astmu, tuberkulózu a hubovité infekcie. Na takúto liečbu sa roztok alebo jemne rozdrobený suchý preparát aktín-rezistentného variantu dodá bežným spôsobom do vzduchových ciest (napríklad do priedušiek) alebo pľúc pacienta, napríklad aerosolizáciou. Aktín-rezistentné varianty sú taktiež užitočné na doplnkovú liečbu abscesov alebo ťažkých opuzdrených zápalov v podmienkach ohraničeného priestoru, ako sú empyema, meningitída, absces, peritonitida, sinusitída, otitída, periodontitída, perikarditída, pankreatitída, cholelitiáza, endokarditída a septická artritída, ako aj na topickú liečbu v rôznych druhoch zápalových a infikovaných lézií, ako sú infikované lézie pokožky a/alebo slizníc, chirurgických rán, ulccratívnych lézií a popálenín. Aktin-rezistentný variant môže zlepšiť účinnosť antibiotík, použitých pri liečení takýchto infekcií (napríklad účinnosť gentamycinu je rapídne znížená reverzibilným viazaním na intaktnú DNA).

Natívna humánna DNáza a jej aktín-rezistentné varianty môžu byť užitočné aj na liečenie systémového lupus erythematosus (SLE), život ohrozujúceho autoimunitného ochorenia, charakterizovaného produkciou rozmanitých autoprotilátok. DNA je hlavnou antigénnou zložkou imu nitných súborov. V tomto prípade môže byť humánna DNáza 1 (natívna alebo variant) podávaná systémovo, napríklad intravenóznou, subkutánnou, intratekálnou alebo intramuskulárnou cestou postihnutému pacientovi.

Natívna humánna DNáza a jej aktín-rezistentné varianty môžu byť taktiež užitočné na prevenciu nového rozvinutia a/alebo zhoršenia dýchacích infekcií, ktoré sa môžu odohrať u pacientov s cystickou ftbrózou, chronickou bronchitídou, astmou, zápalom pľúc alebo inými pľúcnymi ochoreniami alebo u pacientov, u ktorých sa pri dýchaní napomáha s ventilátorom alebo iných mechanickým zariadením alebo u iných pacientov pri riziku vyvinutia respiračných infekcií, napríklad u pacientov po chirurgickom zákroku.

Aktín-rezistentné varianty môžu byť spracované do aplikačných foriem spôsobmi, známymi na prípravu farmaceutický použiteľných kompozícií. Výhodnou terapeutickou kompozíciou je roztok aktín-rezistentného variantu v tlmívom alebo netlmivom vodnom roztoku, výhodne v izotonickom fyziologickom roztoku, ako je 150 mM chloridu sodného obsahujúceho 1,0 mM chloridu vápenatého pri pH

7. Tieto roztoky sú obzvlášť prispôsobiteľné na použitie v komerčne dostupných nebulizátoroch, zahrnujúcich dýzové (hubicové) a ultrazvukové nebulizátory, použiteľné na podanie priamo do vzduchových ciest alebo pľúc postihnutého pacienta.

V inom príklade terapeutická zmes pozostáva zo suchého prášku aktín-rezistentného variantu, výhodne pripraveného rozprašovacím sušením roztoku aktín-rezistentného variantu, v podstate opísaného v US patentovej prihláške 08/206,020 (podaná 4. marca 1994), ktorá je v konaní.

V ďalšom príklade terapeutická zmes pozostáva z buniek, aktívne produkujúcich aktin-rezistentný variant humánnej DNázy 1. Takéto bunky môžu byť priamo zavedené do tkaniva pacienta alebo môžu byť enkapsulované v pórovitých membránach, ktoré sa potom pacientovi implantujú, v obidvoch prípadoch zaisťujúc dodanie aktín-rezistentného variantu do oblasti v tele pacienta, kde je potrebný nárast koncentrácie DNA-hydrolytickej aktivity. Napríklad, pacientove vlastné bunky by mohli byť transformované, buď in vivo alebo ex vivo, DNA kódujúcou aktinrezistentný variant humánnej DNázy 1, a potom použité na produkciu DNázy 1 priamo v pacientovi.

Terapeuticky účinné množstvo aktín-rezistentného variantu humánnej DNázy I bude závisieť, napríklad, od obsahu DNA a aktínu v materiáli, ktorý má byť ošetrený, od cieľov liečby, aplikačnej cesty a od stavu pacienta. Pre terapeuta bude preto nevyhnutné titrovať dávku a modifikovať spôsob aplikácie tak, ako si to vyžaduje dosiahnutie optimálneho terapeutického efektu. Vzhľadom na zníženú viazaciu afinitu pre aktín a následný nárast DNA-hydrolytickej aktivity v prítomnosti aktínu v pomere k natívnej humánnej DNáze 1, množstvo aktín-rezistentného variantu požadovaného na dosiahnutie terapeutického účinku môže byť menšie ako množstvo natívnej humánnej DNázy I potrebné na dosiahnutie rovnakého účinku za rovnakých podmienok. Vo všeobecnosti terapeuticky účinné množstvo aktín-rezistentného variantu bude dávkou približne od 0,1 pg do 5 mg variantu na kilogram telesnej hmotnosti pacienta, podanou vo farmaceutickej zmesi, ako už bolo opísané.

Variant aktín-rezistentnej DNázy 1 sa dá ľubovoľne kombinovať s, alebo podať v súlade s jedným alebo viacerými ďalšími farmakologickými činidlami, použiteľnými na liečenie stavov, uvedených skôr, ako sú antibiotiká, bronchodilatátory, protizápalové prostriedky, mukolytiká (napríklad n-acetyl-cysteín), aktín-viažuce alebo aktín-odde8 ľujúce proteíny (napríklad gélsolin; Matsudaira, et al., Celí 54:139-140 (1988); Stossel, et al., PCTPatent Publication WO 94/22465 (zverejnená 13. októbra 1994)), inhibítory proteázy alebo produkty génovej terapie (napríklad zahrnujúce gén CFTR („the cystic fibrosis transmembrane conductance regulátor gene“), Riordan, et al., Science 245:1066-1073 (1989).

Nasledujúce príklady sú ponúkané len ako spôsob ilustrácie a v žiadnom prípade sa nemajú chápať ako akýmkoľvek spôsobom obmedzujúce vynález. Všetky patenty a literárne odkazy, tu citované, sú výslovne začlenené.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Mutagenéza humánnej DNázy I

E. coli, kmeň CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, Califomia USA) sa transformuje plazmidom pRK. DNáza.3, s použitím spôsobu podľa Chung, et al. (Nuc. Acids. Res. J_6:3580 (1988)). Plazmid pRK.DNáza.3, použitý pri uskutočnení predloženého vynálezu, je ten, ako je opísaný v PCT patentovej publikácii WO 90/07572 (zverejnená 12. júla 1990) s výnimkou toho, že nukleotidová sekvencia kódujúca humánnu DNázu I je taká, ako je ukázaná na obr. 1. Transformované bunky sa naočkovali na LB agarové platne, obsahujúce 50 pg/'l karbenicilínu a nechali rásť cez noc pri 37 °C. Bujón 2YT (5 ml), obsahujúci 50 pg/ml karbenicilínu a 10 μΐ VCSM13 pomocného fága (Stratagene, La Jolla, Califomia USA) sa naočkoval individuálnou kolóniou z agarovej platne a nechal sa, za pretrepávania, rásť cez noc pri 37 °C. Z tejto kultúry sa izolovala jednovláknová DNA a použila sa ako templát (matrica) pre následnú mutagenézu.

Cielená mutagenéza sa uskutočnila s použitím syntetických oligonukleotidov, podľa metódy Kunkel, et al. {Meth Enzymol. 154:367-382 (1987)). Oligonukleotidmi pre mutagenézu boli 21-mers alebo 24-mers, majúce buď 9 alebo 12 presných bázových spárení 5 k nezhodujúcemu sa genetickému kódu a 9 presných bázových spárení 3 k nezhodujúcemu sa genetickému kódu. Nasledujúcou mutagenézou sa jednovláknová DNA z individuálnych klonov podrobila dideoxysekvenovaniu (Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)). DNA majúca variant nukleotidových sekvencií sa potom transformovala, ako je opísané, do E. coli kmeň XL1 Blue MRF (Stratagene). Po naočkovaní a izolovaní jednej kolónie, ako už bolo uvedené, sa individuálne kolónie použili na inokuláciu 0,5 1 LB bujónu, obsahujúceho 50 pg /ml karbenicilínu. Po raste za pretrepávania cez noc pri 37 °C sa bunky odobrali centrifugáciou, variant DNA (v expresnom vektore) sa purifikoval s použitím kolón Qiagen typ-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, Califomia USA).

Obr. 2 až 6 identifikujú rôzne varianty humánnej DNázy I, ktoré boli pripravené. Na obrázkoch a v celom texte opis aminokyselinovej(ých) substitučnej(ých) mutácie(ií), prítomnej vo variante DNázy I, je skrátený prvým písmenom abecedy, číslom a druhým písmenom abecedy. Prvé písmeno abecedy je jednopísmenová skratka aminokyselinového zvyšku v natívnej (divý typ) humánnej dospelej DNáze I, číslo indikuje polohu tohto zvyšku v natívnej humánnej dospelej DNáze I (číslovanie ako na obr. 1) a druhé abecedné písmeno je jednopísmenová skratka aminokyselinového zvyšku pri tejto polohe vo variante DNázy I. Napríklad, vo variante DNázy I, ktorá má D53R mutáciu, zvyšok kyseliny asparágovej (D) na polohe 53 v natívnej humánnej dospelej DNáze I bol nahradený arginínovým (R) zvyškom. Viacnásobné mutácie v jednom variante sú označené podobne, so stĺpcom (:) oddeľujúcim každú z rôznych mutácií, ktoré sú prítomné vo variante. Napríklad, označenie D53R:Y65A určuje, že variant má D53R mutáciu a

Y65A mutáciu.

Príklad 2

Expresia variantov humánnej DNázy I

293 buniek zárodočných humánnych obličkových buniek (ATCC CRL 1573, Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) sa kultivovalo v sérum obsahujúcej pôde (médium) v 150 mm plastických Petriho miskách. Bunky v log fáze sa dočasne kotransfektovali s 22,5 pg purifikovaného variantu DNA (pripraveného, ako je opísané) a 17 pg adenovírusu DNA s použitím kalciumfosfátovej zrážacej metódy (Gorman, et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). Približne 16 hodín po transfekcii sa bunky premyli 15 ml fosforečnanového tlmivého roztoku a pôda sa vymenila za pôdu bez séra. Dve úrody bunkovej pôdy (kultúry) sa zobrali z každej platne; prvá buď po 24 alebo 72 hodinách a posledná po 96 hodinách po zmene za pôdu bez séra. Týmto spôsobom sa získalo spolu približne 50 ml supematantu bunkovej kultúry, obsahujúceho variant DNázy I. Fond supematantu kultúry, pozberanej z každej platne, sa zakoncentroval 5 až 50 preloženiami s využitím zahusťovača Centriprep 10 a koncentráty sa testovali, aby sa stanovili rozličné biochemické a biologické aktivity variantov DNázy I.

Koncentrát obsahujúci natívnu humánnu DNázu I bol pripravený rovnakým postupom, ako je uvedené skôr, okrem toho, že 293 buniek sa dočasne transfektovalo plazmidom pRK.DNáza.3.

Príklad 3

Biochemické a biologické účinky variantov humánnej DNázy I

I. Relatívna špecifická aktivita

Relatívny špecifický účinok variantov DNázy I sa testoval porovnávaním účinku variantu s takým z natívnej humánnej DNázy 1 v dvoch rozdielnych testoch. Relatívna špecifická aktivita variantov je definovaná ako koncentrácia variantu (v pg/ml), stanovená testom účinnosti metylovej zelene (Sinicropi, et al., Anál. Biochem. 222:(351-358 (1994); Kumick, Árch. Biochem. 29:41-53 (1950)), delená koncentráciou variantu (v pg/ml) stanovená v DNáze I ELISA testom (opísaný neskôr). V obidvoch testoch, v teste účinnosti metylovej zelene a ELISA teste DNázy I, sa štandardné krivky stanovili s použitím Pulmozyme® humánnej DNázy I. Relatívna špecifická účinnosť natívnej humánnej DNázy I a variantov je znázornená na obr. 2.

Test aktivity metylovej zelene (Sinicropi, et al., Anál. Biochem. 222:1351-358 (1994); Kumick, Árch. Biochem. 29:41-53 (1950)) využíva farbivo metylovú zeleň, ktoré sa včleňuje po každých približne 10 bázach do DNA, výsledkom čoho je zelený substrát. Pretože DNA je štiepená DNázou I, metylzeleň sa uvoľňuje a oxiduje na bezfarebnú formu. Teda, strata zelenej farby je proporcionálna k množstvu DNázy I, pridaného do testovanej vzorky. Množstvo DNázy I, prítomné v teste, sa potom kvantifikuje porovnaním s krivkou štandardu, ktorá je pripravená testovaním známych množstiev DNázy I.

ELISA test DNázy I zahrnuje potiahnutie mikrotitračných platničiek s kozacou anti-DNáza I polyklonálnou protilátkou, pridanie vzorky, ktorá má byť testovaná a detegovanie akéhokoľvek výsledného pásma (hranice) DNázy I s králičou anti-DNáza I polyklonálnou protilátkou, ktorá je konjugovaná na chrenovú peroxidázu (HRP). Keď sa pridajú HRP substrát a činidlo na vyvolanie farby, rozvinutie farby je proporcionálne množstvu DNázy I, prítomnej vo vzorke. Množstvo DNázy I, prítomné v pokuse, sa potom kvantifikuje porovnaním so štandardnou krivkou, ktorá je pripravená testovaním známych množstiev DNázy 1.

V obidvoch testoch sa testovali viacnásobné riedenia vzoriek a tie hodnoty, ktoré spadli do stredu rozsahu štandardnej krivky sa spriemerovali a vypočítali sa štandardné odchýlky.

Takisto koncentrácia DNázy I, stanovená DNáza I ELISA testom, bola použitá na štandardizovanie koncentrácií DNázy I v ďalších testoch, v ktorých boli charakterizované varianty DNázy I (napríklad v testoch inhibície aktínom, opísaných neskôr).

Π. Inhibícia hydrolytickej aktivity DNázy I aktinom

G-aktín (Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Strúci. 21.:49-76 (1992) sa pripravil kratšie ako 10 dní pred použitím dialýzou cez noc 1 mg/ml roztoku komerčne dostupného aktínového preparátu (Sigma, St. Louis, Missouri USA) proti 5 mM HEPES, pH 7,2, 0,2 mM CaCl₂, 0,5 mM ATP, 0,5 mM β-merkaptoetanolu pri 4 °C. Po centrifugácii pri 13 000 x g počas 5 minút sa množstvo G-aktinu kvantifikovalo meraním absorbancie pri 290 nm; 1 mg/ml roztoku má absorbanciu 0,66 OD, Množstvo G-aktinového preparátu požadované na podstatnú (> 50 % inhibíciu), ale nie totálnu, inhibíciu DNA-hydrolytickej aktivity natívnej humánnej DNázy I bolo stanovené v orientačných experimentoch s použitím rovnakých podmienok pre každý test.

Citlivosť na aktínovú inhibíciu bola vyhodnotená meraním DNA-hydrolytickej aktivity variantov v prítomnosti a bez aktínu v obidvoch rozličných testoch, v už opísanom teste s metylzeleňou a v teste hyperchromicity, ktorý jc založený na náraste absorbancie pri 260 nm po denaturácii a depolymerizácii DNA (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)). Percentá inhibície vybraných variantov v týchto testoch sú uvedené na obr. 3 a 4.

V teste hyperchromicity zahustené supernatanty kultúr (pripravené opísaným spôsobom, obsahujúce varianty DNázy I) sa inkubovali buď bez pridania alebo s 2- až 3-násobným molovým prebytkom aktínu v tlmivom roztoku A (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCl₂, 4 mM MgCl_z, 0,1 % BSA) počas jednej hodiny pri teplote miestnosti a potom sa pridali do kyvety obsahujúcej 40 pg DNA v celkovom stanovovanom objeme 1,0 ml. Konečná koncentrácia variantu DNázy I v pokuse bola približne 26 nM, ako bolo stanovené DNáza I ELISA testom. Vyhodnotil sa stupeň DNA hydrolýzy variantmi DNázy I v prítomnosti aktínu a bez aktínu. Percento aktivity, uvedené na obr. 3 a 4, sa vypočítalo určením pomeru DNA hydrolytickej aktivity humánnej DNázy I (natívnej alebo variantu) v prítomnosti aktínu k jej DNA hydrolytickej aktivite bez aktínu násobením 100.

V teste s metylovou zeleňou zahustené supernatanty kultúr (pripravené opísaným spôsobom, obsahujúce varianty DNázy 1) sa inkubovali buď bez pridania alebo s 1000-násobným molovým prebytkom aktínu v tlmivom roztoku B (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCL, 4 mM MgCl₂, 0,1 % BSA, 0,01 % tiomersal a 0,05 % Tween 20) pri 37 °C 16 hodín. Koncentrácia aktívneho enzýmu v každom prípade bola odhadnutá porovnaním so štandardnou krivkou Pulmozyme®. Zostávajúce „percento aktivity“ variantu sa vzťahuje na lOOx pomer aktivity v prítomnosti aktínu k aktivite bez aktínu.

Ako je zobrazené na obr. 3 a 4 DNA-hydrolytická aktivita natívnej humánnej DNázy je podstatne znížená v prítomností aktínu. Pri porovnaní rôzne jedno- a viaczvyškové varianty natívnej humánnej DNázy 1 sú relatívne odolné proti inhibícii aktinom, ako naznačuje ich vyššia DNA-hydrolytická aktivita v prítomnosti aktínu ako natívnej humánnej DNázy I.

III. Aktín viažuca ELISA

Mikrotitračný test bol vyvinutý na vyhodnotenie viazania natívnej humánnej DNázy I a variantov DNázy I na imobilizovaný aktín. Po prvé, jamky MaxiSorp doštičky (Nunc, lnc., Naperville, Illinois USA) sa pokryli 100 μΐ/jamka humánneho DC globulínu (Calbiochem, La Jolla, California USA), aktín viažucim proteínom (GoldschmidtClermont, et al., Biochem. J. 228:471-477 (1985); McLeod, et al., J. Biol. Chem. 264:1260-1267 (1989); Houmeida, et al., Eur. J. Biochem. 203:499-503 (1992)) v koncentrácii 10 pg/ml v 25 ml HEPES, 4 mM MgCl₂, 4 mM CaCl₂, pH 7,2. pri 4 °C 16 až 24 hodín. Po odstránení GC globulínu prebytočné reakčné miesta boli blokované pridaním 200 μΐ/jamka tlmivého roztoku C (tlmivý roztok C je rovnaký, ako tlmivý roztok B, uvedený skôr, s prídavkom 0,5 mM adenozíntrifosfátu; tlmivý roztok C bol použitý ako testovacie riedidlo vo všetkých následných krokoch, ak nie je inak uvedené) a inkubáciou doštičky v trepačke 1 - 2 hodiny pri izbovej teplote. Každý inkubačný krok, ktorý nasleduje, sa uskutočňuje pri izbovej teplote 1 hodinu na trepačke Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Víneland, New Jersey USA); medzi každým z krokov platňa bola vyprázdnená a 6x premytá fosfátovým fyziologickým roztokom, obsahujúcim 0,05 % Tween 20 na premývačke platničiek Microwash 11 (Skatron A/S, Norway). Ďalej, G-aktín, pripravený ako bolo opísané, sa zriedil na 50 pg/ml v tlmivom roztoku C a 100 μΙ sa pridalo do každej jamky; doštičky sa inkubovali a premyli a 100 μΐ rôznych zriedení Pulmozyme® a bunkovej kultivačnej pôdy, obsahujúcej buď natívnu humánnu DNázu I alebo jej varianty, sa pridalo do jamiek a platničky sa inkubovali a premyli. Nakoniec, 100 μΙ 1/25000 zriedenia konjugátu králičej antihumánna DNáza 1 polyklonálnej protilátky s chrenovou peroxidázou (pôvodná koncentrácia východiskového materiálu bola 465 gg/ml) sa pridalo do každej jamky. Po inkubácii a premytí sa inicioval vývoj sfarbenia pridaním 100 μΙ/jamka činidla na vyvolanie farby (Sigma Fast ofenyléndiamín a močovina/H₂O₂ tabletky solubilizované podľa odporučenia výrobcu) a zastavil pridaním 100 μΙ/jamka 4,5N H₂SO₄. Zaznamenala sa absorbancia pri 492 nm a zakreslila proti koncentrácii DNázy I pôvodne pridanej do jamky. Sigmoidálne krivky sú výsledkom pre natívnu humánnu DNázu I a tie varianty, ktoré sa viazali na aktín; tieto krivky prechádzali štyrmi parametrami rovnice nelineárnej regresnej analýzy (Marquardt, J. Soc. Jndust. Appl. Math. 11:431 -444 (1963); koncentrácia každej DNázy I (natívnej alebo variantu), požadovaná na poskytnutie polovice maximálnej reakcie v pokuse, sa vypočítala z kriviek a je označená ako EC₅₀ hodnota. Molová hmotnosť natívnej humánnej DNázy I a variantov bola predpokladaná ako 37 000 Daltonov.

Relatívna viazacia afinita každého variantu humánnej DNázy 1 bola vypočítaná delením EC₅₀ hodnoty variantu EC₅o hodnotou natívnej humánnej DNázy I, stanovenej v ELISA teste a výsledky sú ukázané na obr. 5. Podľa príkladu, ak relatívna viazacia afinita variantu humánnej DNázy I bola vypočítaná ako 5. táto hodnota by mala indikovať, že ECso hodnota variantu je 5x vyššia ako EC₅₀ hodnota natívnej humánnej DNázy, alebo inými slovami, že variant má afinitu proti aktínu, ktorá je 5x nižšia ako afinita natívnej humánnej DNázy I proti aktínu v tomto ELISA teste. IV. Test hustoty spúta

Test hustoty spúta (PCT patentová publikácia WO 94/10567, zverejnená 11. mája 1994) sa použil na vyhodnotenie relatívnej viskoelasticity spúta od pacientov s cystickou fibrózou („CF spútum“) pred inkubáciou a po inkubácii s natívnou humánnou DNázou I a rozličnými variantmi DNázy I. Po zmiešaní CF spúta so vzorkou DNázy I a po 20-minú-tovej inkubácii pri teplote miestnosti sa polotuhé roztoky naplnili do kapilárnych trubičiek, ktoré sa potom centrifugovali pri 12 000 rpm 20 minút. Po centrifugácii sa zmerala výška peletky a porovnala s výškou roztoku + peletka. Tieto merania sa potom použili na vypočítanie percenta hustoty (kompaktnosti) spúta, ktorá je v korelácii s viskoelasticitou spúta.

Percento hustoty, stanovené po spracovaní CF spúta s natívnou humánnou DNázou I a aktín-rezistentnými variantmi humánnej DNázy I, je znázornené na obr. 6. Tieto výsledky značia, že aktín-rezistentné varianty humánnej DNázy I sú účinnejšie ako natívna humánna DNáza I pri znižovaní viskoelasticity CF spúta, ako sa stanovilo testom hustoty.

SEKVENČNÝ ZOZNAM (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ: Genentech, Inc.

Lazarus, Róbert A. Shak, Steven Ulmer, Jana S.

(ii) Názov vynálezu: Varianty humánnej DNázy I (iii) Počet sekvencii: 1 (iv) Korešpondenčná adresa:

(A) Adresa: Genentech, Inc.

(B) Ulica: 460 Point San Bruno Blvd (C) Mesto: South San Francisco (D) Štát: Califomia (E) Krajina: USA (F) ZIP: 94080 (v) Počítačová forma:

(A) Typ média: 5.25 palcov, 1,44 Mb floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: patín (Genentech) (vi) Súčasné údaje o prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania: 24. február 1995 (C) Zatriedenie:

(vii) Údaje o prioritnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(viii) Informácie o zástupcovi:

(A) Meno: Johnston, Sean A.

(B) Registračné číslo: 35,910 (C) Značka: P925 (ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón: 415/225-3562 (B) Telefax: 415/952-9881 (C) Telex: 910/371-7168 (2) Informácia pre SEQ ID NO: 1 (i) Sekvenčné charakteristiky:

(A) Dĺžka: 260 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1

Leu Lys	íle Ala	Ala Phe Asn íle	Gin	Thr Phe Gly	Glu	Thr	Lys
1		5		10			15
Met Ser	Asn Ala	Thr Leu Val Ser	Tyr	íle Val Gin	íle	Leu	Ser
		20		25			30
Arg Tyr	Asp íle	Ala Leu Val Glr.	Glu	Val Are Asp	Ser	His	Leu
		35		40			45
Thr Ala	Val Gly	Lys Leu Leu Asp	Asn	Leu Asn Glu	Asp	Ala	Pro
		SO		SS			60
Asp Thr	Tyr His	Tyr Val Val Ser	Glu	Pro Leu Gly	Arg	Asn	Ser
		63		70			75
Tyr Lys	Glu Arg	Tyr Leu Phe Val	Tyr	Arg Pro Asp	Gin	Val	Ser
		80		8S			so
Ala Val	Asp Ser	Tyr Tyr Tyr Asp	Asp	Gly Cys Glu	Pro	Cys	Gly
		55		100			105
Asn Asp	Thr Phe	Asn Ar; Glu Pro	Ala	íle Val Arg	Phe	Phe	Ser
		110		11S			120
Arg Phe	Thr Glu	Val Arg Glu Phe	Ala	íle Val Pro	Leu	Kis	Ala
		12$		130			135
Ala Pro	Gly Asp	Ala Val Ala Glu	íle	Asp Ala Leu	Tyr	Asp	Val
		140		14S			150
Tyr Leu	Asp Val	Gin Glu Lys Trp	Gly	Leu Glu Asp	Val	Met	Leu
		1S5		160			165
Met <51	y Asp Ph	e Asn Ala Gly Cys	í Sex	Tyr Val Arg	Pro	Ser	Gin
		170		17S			180

Trp Ser Ser íle Arg Leu Trp Thr Ser ?ro Thr The Gin Trp Leu íle Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ale

200 205 210

Tyr Asp Arg íle Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala Val

213

220

22S

Val Pro Asp

Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gin Ala Ala Tyr Gly

230

235

240

Leu Ser Asp Glu Leu Ala Gin* Ala íle Ser Asp His Tyr Pro Val

245

250

2S5

Glu Vsi Met Leu Lys

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Aktín-rezistentný variant humánnej Dnázy I s hydrolytickou aktivitou, vyznačujúci sa tým, že má nižšiu viazaciu aktivitu proti aktínu ako natívna humánna Dnáza I a aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 90 % identitou s aminokyselinovou sekvenciou natívnej humánnej Dnázy I z obr. 1.
2. 2. Aktín-rezistentný variant humánnej Dnázy I podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 95 % identitou s ami11 nokyselinovou sekvenciou natívnej humánnej Dnázy I z obr. 1.
3. 3. Aktin-rezistentný variant humánnej Dnázy 1 podľa nároku í alebo 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň 1 aminokyselinovú substitúciu za inú na jednej alebo viacerých z nasledovných pozícií: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 alebo Alal 14.
4. 4. Altín-rezistentný variant humánnej Dnázy I podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aminokyselinovú substitúciu za inú na jednej z uvedených pozícií.
5. 5. Aktin-rezistentný variant humánnej Dnázy I podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aminokyselinovú sekvenciu líšiacu sa od aminokyselinovej sekvencie z obr. 1 len jednou aminokyselinovou sekvenciou na jednej alebo viacerých z nasledujúcich pozícií: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val 66, Val67, Glu69 alebo Alal 14.
6. 6. Aktin-rezistentný variant humánnej Dnázy l podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5, vyznačujúci sa t ý m , že aminokyselinová substitúcia tvorí glykozylačné miesto v rámci uvedeného variantu, ktoré nie je prítomné v natívnej humánnej Dnáze I.
7. 7. Aktin-rezistentný vriant humánnej Dnázy 1 podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje jednu alebo viac z nasledovných aminokyselinových substitúcií: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65a, Y65E, Y65R, V67E, V67K alebo E69R.
8. 8. Aktin-rezistentný variant humánnej Dnázy I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m , že má aspoň jednu a nasledovných aminokyselinových substitúcii: H44A, H44A:D53R:Y65A,

   H44A:Y65A:E69R, D53R:Y65A a D53R:E69R.
9. 9. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca aktín-rezistentný variant humánnej Dnázy I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8.
10. 10. Použitie variantu humánnej Dnázy I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na výrobu lieku na liečenie cystickej fibrózy.
11. 11. Použitie variantu humánnej Dnázy 1 podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na výrobu lieku na liečenie chronickej bronchitídy.
12. 12. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje variant humánnej Dnázy I podľa ktoréhokoľvek z nárokov I až 8 a voliteľne farmaceutický prijateľný excipient.
13. 13. Prostriedok podľa nároku 12, vyznačuj úci sa t ý m , že je v tekutej forme.
14. 14. Prostriedok podľa nároku 12, v y z n a č u j úci sa t ý m , že je v práškovej forme.