JP2935709B2 - リン脂質アンカードメインとの新規融合ポリペプチドの合成のための核酸および方法 - Google Patents
リン脂質アンカードメインとの新規融合ポリペプチドの合成のための核酸および方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、組換え細胞培養物中での崩壊促進因子（以
下、DAFと短縮して記す）の生産に関する。特に、医薬
または診断の用途に適したDAFの大スケールでの製造に
関する。
下、DAFと短縮して記す）の生産に関する。特に、医薬
または診断の用途に適したDAFの大スケールでの製造に
関する。
体液性免疫応答の標的となる抗原細胞は補体活性化と
呼ばれる過程によって溶解される。この過程は、抗体と
その抗原の結合によって開始される一連のまたはカスケ
ードとしてのタンパク質加水分解活性で構成される。補
体の活性化に関与する成分は多数かつ複雑であるが、本
発明の目的にとって最も重要なものはC4bおよびC3bであ
る。補体活性化における鍵となる過程において、これら
２つのタンパク質は標的細胞の表面に共有結合し、次い
でこのカスケードの増幅酵素であるC3およびC5コンバー
ターゼ（転換酵素）の集合のためのアンカーとして働
く。
呼ばれる過程によって溶解される。この過程は、抗体と
その抗原の結合によって開始される一連のまたはカスケ
ードとしてのタンパク質加水分解活性で構成される。補
体の活性化に関与する成分は多数かつ複雑であるが、本
発明の目的にとって最も重要なものはC4bおよびC3bであ
る。補体活性化における鍵となる過程において、これら
２つのタンパク質は標的細胞の表面に共有結合し、次い
でこのカスケードの増幅酵素であるC3およびC5コンバー
ターゼ（転換酵素）の集合のためのアンカーとして働
く。
補体の活性化は標的にだけ焦点が当てられるものでな
ければならず、宿主細胞上で起こってはならない。しか
し、補体活性化の過程において、多数の形成期C4bおよ
びC3bフラグメントが液相中に放出される。大部分は水
と反応するが、一部は偶然によってすぐ近くの宿主細胞
に結合することがあり、その損傷を導く。この理由およ
び可能性あるその他の理由により、結合ならびに遊離の
C3bおよびC4bフラグメントの活性は、血清および膜タン
パク質の複雑な系による厳格な制御下にある。
ければならず、宿主細胞上で起こってはならない。しか
し、補体活性化の過程において、多数の形成期C4bおよ
びC3bフラグメントが液相中に放出される。大部分は水
と反応するが、一部は偶然によってすぐ近くの宿主細胞
に結合することがあり、その損傷を導く。この理由およ
び可能性あるその他の理由により、結合ならびに遊離の
C3bおよびC4bフラグメントの活性は、血清および膜タン
パク質の複雑な系による厳格な制御下にある。
最近の報告（Medof,et al.,1982,J.Esp.Med. 156:173
9;Medof,et al.,1984,J.Exp.Med. 159:1669）によれば、
基質結合したC4bおよびC3bの活性の調節は液相フラグメ
ントの制御とは異なっていることが示唆される。前者の
機能は主として２種類の膜タンパク質、即ちC3b/C4b受
容体（CR1）およびDAFによって制御される。CR1はC3お
よびC5コンバーターゼ コンプレックス中のC4bおよびC
3bからC2および因子Ｂを解離させ、血清酵素C3b/C4bイ
ンアクチベーター（Ｉ）によるC3bの切断（Medof,et a
l.,1982,J.Exp.Med. 156:1739;Fearon,D.T.,1979,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 76:5867;Medicus,et al.,1983,Eur.J.
Immunol. 13:465;およびRoss,et al.,1982,J.Immunol. 12
9:2051）およびC4bの切断（Medof,et al.,1984,J.Exp.M
ed. 159:1669;Iida et al.,1981,J.Exp.Med. 153:1138）
を促進する。また、DAFもC3コンバーターゼからのC2お
よび因子Ｂの崩壊解離を増強することが示された（Nich
olson−Weller,et al.,1982,J.Immunol. 129:205およびP
angburn,M.K.et al.,1983,J.Exp.Med. 157:1971）。この
２種類の膜因子の調節活性における見かけ上の重複の理
由、およびこれらのコンバーターゼ制御におけるそれぞ
れの役割はわかっていない。CR1の異常は、欠損性の免
疫複合体の処理に関連した症状である全身性のエリテマ
トーデス（SLE）において見い出され（Miyakawa,Y.et a
l.,1981,Lancet ２:493:Iida,K.et al.,1982,J.Exp.Med.
155:1427;Wilson,J.G.et al.,1982,N.Engl.J.Med. 307:9
81:Taylor,R.P.et al.,1983,Arthritis Rheum. 26:73
6）、DAFの異常は、血球の溶解に対する高められた感受
性に関連した症状である発作性夜間血色素尿症（PNH）
において見い出された（Pangburn,M.K.et al.,1983,J.E
xp.Med. 157:1971;Pangburn,M.K.et al.,1983,Proc.Nat
l.Acad.Sci. 80:5430;Nicholson−Weller,A.et al.,198
3,Proc.Natl.Acad.Sci. 80:5066）。
9;Medof,et al.,1984,J.Exp.Med. 159:1669）によれば、
基質結合したC4bおよびC3bの活性の調節は液相フラグメ
ントの制御とは異なっていることが示唆される。前者の
機能は主として２種類の膜タンパク質、即ちC3b/C4b受
容体（CR1）およびDAFによって制御される。CR1はC3お
よびC5コンバーターゼ コンプレックス中のC4bおよびC
3bからC2および因子Ｂを解離させ、血清酵素C3b/C4bイ
ンアクチベーター（Ｉ）によるC3bの切断（Medof,et a
l.,1982,J.Exp.Med. 156:1739;Fearon,D.T.,1979,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 76:5867;Medicus,et al.,1983,Eur.J.
Immunol. 13:465;およびRoss,et al.,1982,J.Immunol. 12
9:2051）およびC4bの切断（Medof,et al.,1984,J.Exp.M
ed. 159:1669;Iida et al.,1981,J.Exp.Med. 153:1138）
を促進する。また、DAFもC3コンバーターゼからのC2お
よび因子Ｂの崩壊解離を増強することが示された（Nich
olson−Weller,et al.,1982,J.Immunol. 129:205およびP
angburn,M.K.et al.,1983,J.Exp.Med. 157:1971）。この
２種類の膜因子の調節活性における見かけ上の重複の理
由、およびこれらのコンバーターゼ制御におけるそれぞ
れの役割はわかっていない。CR1の異常は、欠損性の免
疫複合体の処理に関連した症状である全身性のエリテマ
トーデス（SLE）において見い出され（Miyakawa,Y.et a
l.,1981,Lancet ２:493:Iida,K.et al.,1982,J.Exp.Med.
155:1427;Wilson,J.G.et al.,1982,N.Engl.J.Med. 307:9
81:Taylor,R.P.et al.,1983,Arthritis Rheum. 26:73
6）、DAFの異常は、血球の溶解に対する高められた感受
性に関連した症状である発作性夜間血色素尿症（PNH）
において見い出された（Pangburn,M.K.et al.,1983,J.E
xp.Med. 157:1971;Pangburn,M.K.et al.,1983,Proc.Nat
l.Acad.Sci. 80:5430;Nicholson−Weller,A.et al.,198
3,Proc.Natl.Acad.Sci. 80:5066）。
DAFは、ヒト赤血球支質（ストロマ）のプール抽出物
から銀染色のSDS−PAGEによって単一の70Kdバンドまで
精製されたと報告されている（Medof et al.,1984,J.Ex
p.Med. 160:1558）。この分子は疎水性であり、分子ふる
いクロマトグラフィーによって測定すると、150Kdの
マルチマーを形成する傾向にある。精製したDAFは赤血
球と再結合することもある。少ない数のDAF分子（＜10
0）だけが、活性化された補体の溶血作用に有意の効果
を有していた。Medofらは、DAFは本質的に細胞膜内での
み機能することができると結論し、それがPNHの患者由
来の細胞膜における欠損をインビトロで除く可能性を与
えるものであることを示唆した。
から銀染色のSDS−PAGEによって単一の70Kdバンドまで
精製されたと報告されている（Medof et al.,1984,J.Ex
p.Med. 160:1558）。この分子は疎水性であり、分子ふる
いクロマトグラフィーによって測定すると、150Kdの
マルチマーを形成する傾向にある。精製したDAFは赤血
球と再結合することもある。少ない数のDAF分子（＜10
0）だけが、活性化された補体の溶血作用に有意の効果
を有していた。Medofらは、DAFは本質的に細胞膜内での
み機能することができると結論し、それがPNHの患者由
来の細胞膜における欠損をインビトロで除く可能性を与
えるものであることを示唆した。
DAFを得るための既存の方法は工業生産に対しては満
足できるものではない。赤血球は極めて少量のDAFしか
含んでいない。さらに、血液は、ウイルスやその他の生
物学的に活性な成分を含んでおり、これらは投与を受け
た者あるいは使用者に望ましくない反応の危険を与え
る。
足できるものではない。赤血球は極めて少量のDAFしか
含んでいない。さらに、血液は、ウイルスやその他の生
物学的に活性な成分を含んでおり、これらは投与を受け
た者あるいは使用者に望ましくない反応の危険を与え
る。
赤血球DAFは固有の膜結合した形態に限定され、存在
するであろうあらゆる天然アレルを含む。DAFアゴニス
トもしくはアンタゴニストとして機能することができる
か、または他の望ましい特徴（例えば、Ｃ−末端脂質が
存在しないこと、プロテアーゼに対する耐性、もしくは
標的細胞の膜にDAFを放出する能力など）を示すアミノ
酸およびグリコシル化変異体を合成するための方法が必
要とされている。
するであろうあらゆる天然アレルを含む。DAFアゴニス
トもしくはアンタゴニストとして機能することができる
か、または他の望ましい特徴（例えば、Ｃ−末端脂質が
存在しないこと、プロテアーゼに対する耐性、もしくは
標的細胞の膜にDAFを放出する能力など）を示すアミノ
酸およびグリコシル化変異体を合成するための方法が必
要とされている。
従って、本発明の目的は、治療学的に許容しうる供給
源から工業的な量でDAFを製造することにある。
源から工業的な量でDAFを製造することにある。
さらに、他のヒトタンパク質に全く汚染されない供給
源からヒトDAFを得ることも目的の１つである。
源からヒトDAFを得ることも目的の１つである。
また、別の目的はDAFのアミノ酸配列およびグリコシ
ル化変異体を作成することである。
ル化変異体を作成することである。
本発明のその他の目的は本明細書全体から明らかとな
るであろう。
るであろう。
要約 本発明の目的は、組換え細胞培養においてDAFを発現
させることによって、即ち基本的には、DAFをコードし
ている核酸を得、このDAFをコードしている核酸で宿主
細胞を形質転換し、そしてこの細胞を培養して宿主細胞
培養物中にDAFを発現させることからなる方法によって
達成される。
させることによって、即ち基本的には、DAFをコードし
ている核酸を得、このDAFをコードしている核酸で宿主
細胞を形質転換し、そしてこの細胞を培養して宿主細胞
培養物中にDAFを発現させることからなる方法によって
達成される。
本発明の方法は、アミノ酸配列変異体およびグリコシ
ル化変異体を含む新しい形態のDAFの製造を可能にす
る。アミノ酸配列変異体は、１またはそれ以上のDAFア
ミノ酸残基の削除、置換および挿入からなる。また、DA
Fは、異種の組換え細胞培養でのDAFの発現産物として得
られ、天然DAFに随伴するグリコシル化を伴わない形態
で発現される（グリコシル化を全く伴っていないものを
含む）。組換え細胞培養物の成分としてあらゆる形態に
あるDAFが新規である。
ル化変異体を含む新しい形態のDAFの製造を可能にす
る。アミノ酸配列変異体は、１またはそれ以上のDAFア
ミノ酸残基の削除、置換および挿入からなる。また、DA
Fは、異種の組換え細胞培養でのDAFの発現産物として得
られ、天然DAFに随伴するグリコシル化を伴わない形態
で発現される（グリコシル化を全く伴っていないものを
含む）。組換え細胞培養物の成分としてあらゆる形態に
あるDAFが新規である。
DAF mRNAの細胞プロセッシングを研究している際に、
膜結合型のDAF（mDAF）がインビボで発現される唯一の
形態ではないことを予想外に見い出した。事実、sDAFと
呼ぶ別の形態のDAFが存在する。この形態は、最後の
３′イントロンがスプライスされていないmRNA種によっ
てコードされており、mDAFとは全く異なるアミノ酸配列
Ｃ−末端〜残基327が得られることになる。この新規なs
DAFのＣ−末端はインビボでのタンパク質の血流中（こ
こで生物学的に活性であることもある）への分泌を導く
ものと仮定されているが、これは、イントロンの存在が
最後のエクソンのリーディング・フレーム（読み枠）を
変え、ホスファチジルイノシトール（mDAFの膜アンカ
ー）の結合を指令する「シグナル」を削除するためであ
る。この新規形態のDAFは、本発明の先駆的な研究が行
われるまでは正しく理解されていなかったものであり、
抗原的に別個のＣ−末端を含有している点においてmDAF
とは異なっている。ある個体における症状が、DAF遺伝
子のいずれかを発現することができないこと、あるいは
ホスファチジルイノシトールアンカーを結合させるため
の翻訳後プロセッシングができないことに由来するのか
否かを決定するのは現在可能であることから、sDAFはPN
Hの診断に有用である。
膜結合型のDAF（mDAF）がインビボで発現される唯一の
形態ではないことを予想外に見い出した。事実、sDAFと
呼ぶ別の形態のDAFが存在する。この形態は、最後の
３′イントロンがスプライスされていないmRNA種によっ
てコードされており、mDAFとは全く異なるアミノ酸配列
Ｃ−末端〜残基327が得られることになる。この新規なs
DAFのＣ−末端はインビボでのタンパク質の血流中（こ
こで生物学的に活性であることもある）への分泌を導く
ものと仮定されているが、これは、イントロンの存在が
最後のエクソンのリーディング・フレーム（読み枠）を
変え、ホスファチジルイノシトール（mDAFの膜アンカ
ー）の結合を指令する「シグナル」を削除するためであ
る。この新規形態のDAFは、本発明の先駆的な研究が行
われるまでは正しく理解されていなかったものであり、
抗原的に別個のＣ−末端を含有している点においてmDAF
とは異なっている。ある個体における症状が、DAF遺伝
子のいずれかを発現することができないこと、あるいは
ホスファチジルイノシトールアンカーを結合させるため
の翻訳後プロセッシングができないことに由来するのか
否かを決定するのは現在可能であることから、sDAFはPN
Hの診断に有用である。
また新規な核酸も提供されるが、これには次のものが
含まれる：（１）ゲノムDNA、cDNAまたはRNAを含む、DA
Fをコードしていると同定された細胞遊離型の核酸；
（２）非翻訳化介在配列（イントロン）または周辺のゲ
ノムDNAを含まない、DAFをコードしているDNA;および
（３）DAFをコードしている核酸の供給源にホモローガ
スな他のあらゆるタンパク質をコードしている核酸を含
まない、DAFをコードしている核酸。また、本発明の範
囲内に含まれるのは、DAFをコードしてはいないがDAFを
コードしている核酸とハイブリダイズすることができる
核酸である。
含まれる：（１）ゲノムDNA、cDNAまたはRNAを含む、DA
Fをコードしていると同定された細胞遊離型の核酸；
（２）非翻訳化介在配列（イントロン）または周辺のゲ
ノムDNAを含まない、DAFをコードしているDNA;および
（３）DAFをコードしている核酸の供給源にホモローガ
スな他のあらゆるタンパク質をコードしている核酸を含
まない、DAFをコードしている核酸。また、本発明の範
囲内に含まれるのは、DAFをコードしてはいないがDAFを
コードしている核酸とハイブリダイズすることができる
核酸である。
DAFをコードしている核酸は、組換え細胞培養におけ
るDAFの発現において、またはDAFをコードしている核酸
の存在について被験試料を検定するのに有用である。ラ
ベルしたDAFをコードしている核酸またはハイブリダイ
ズする核酸がそのような検定で用いるために供される。
るDAFの発現において、またはDAFをコードしている核酸
の存在について被験試料を検定するのに有用である。ラ
ベルしたDAFをコードしている核酸またはハイブリダイ
ズする核酸がそのような検定で用いるために供される。
組換えのDAFは治療学的に許容しうる担体中に配合さ
れ、PNHまたは炎症性もしくは細胞溶解性自己免疫疾患
の治療のために投与される。標的細胞の表面での補体活
性化を阻害するために標的細胞にDAFを放出するDAFコン
ジュゲートまたは融合体を調製する。このコンジュゲー
トまたは融合体は異型移植拒絶または自己免疫疾患を改
善するために有用である。
れ、PNHまたは炎症性もしくは細胞溶解性自己免疫疾患
の治療のために投与される。標的細胞の表面での補体活
性化を阻害するために標的細胞にDAFを放出するDAFコン
ジュゲートまたは融合体を調製する。このコンジュゲー
トまたは融合体は異型移植拒絶または自己免疫疾患を改
善するために有用である。
mDAFのグリコホスホ脂質膜アンカードメイン、または
グリコホスホ脂質によって同じようにアンカーされる他
のタンパク質由来の機能的に等価なドメインを、膜アン
カードメインの供給源とは異種のタンパク質またはその
ようなタンパク質のマルチマー、例えばホルモン、抗原
（特に、感染性生物由来の抗原）、アレルゲン、免疫グ
ロブリン、酵素、受容体などに融合させる。このアンカ
ー融合体を、それを発現する組換え細胞と組合わせ用い
るか、または回収して治療学的組成物に製剤化するか、
診断検定の成分として用いるか、またはアフィニティー
精製法において用いる。この融合体は異種ポリペプチド
のＣ−末端のところでアンカードメインに融合した異種
のポリペプチドを含有しており、それは後にそのＣ−末
端カルボキシルのところでグリコホスホ脂質によって共
有結合置換される。
グリコホスホ脂質によって同じようにアンカーされる他
のタンパク質由来の機能的に等価なドメインを、膜アン
カードメインの供給源とは異種のタンパク質またはその
ようなタンパク質のマルチマー、例えばホルモン、抗原
（特に、感染性生物由来の抗原）、アレルゲン、免疫グ
ロブリン、酵素、受容体などに融合させる。このアンカ
ー融合体を、それを発現する組換え細胞と組合わせ用い
るか、または回収して治療学的組成物に製剤化するか、
診断検定の成分として用いるか、またはアフィニティー
精製法において用いる。この融合体は異種ポリペプチド
のＣ−末端のところでアンカードメインに融合した異種
のポリペプチドを含有しており、それは後にそのＣ−末
端カルボキシルのところでグリコホスホ脂質によって共
有結合置換される。
図面の簡単な説明 第1a〜1f図は、クローンλ33（残基１のHind III部位
まで）、およびλ47（Hind IIIから３′末端まで）のcD
NA配列を示すものである。イントロンが除去された箇所
は星印で示す。可能性の高いホスファチジルイノシトー
ル誘導体化の部位はCys330であり、Ｃ−末端疎水性領域
は残基331−347から延びている。アミノ酸残基はAsp1の
成熟アミノ末端から数を付した。
まで）、およびλ47（Hind IIIから３′末端まで）のcD
NA配列を示すものである。イントロンが除去された箇所
は星印で示す。可能性の高いホスファチジルイノシトー
ル誘導体化の部位はCys330であり、Ｃ−末端疎水性領域
は残基331−347から延びている。アミノ酸残基はAsp1の
成熟アミノ末端から数を付した。
第2a〜2g図は、ヒトsDAFをコードしているクローンλ
33（残基＋１のHind III部位まで）、およびλ41（Hind
IIIから３′末端まで）のcDNA配列を示すものである。
sDAFをコードしているcDNA中のスプライスされていない
イントロンは囲んで示した。制限酵素部位は通常の短縮
形を用いて示した。DAFと予想される種のそれぞれにつ
いて予想アミノ酸配列を、それぞれの分泌リーダーおよ
び成熟Ｎ−末端（矢印で示す）とともに示す。
33（残基＋１のHind III部位まで）、およびλ41（Hind
IIIから３′末端まで）のcDNA配列を示すものである。
sDAFをコードしているcDNA中のスプライスされていない
イントロンは囲んで示した。制限酵素部位は通常の短縮
形を用いて示した。DAFと予想される種のそれぞれにつ
いて予想アミノ酸配列を、それぞれの分泌リーダーおよ
び成熟Ｎ−末端（矢印で示す）とともに示す。
第３図は、実施例３で調製したgD−1/DAF融合タンパ
ク質中に存在するHSV1糖タンパク質Ｄ（gD−１）および
DAFの領域を示す模式図である。断端を切り取った（分
泌型）gD−１を、天然（膜）gD−１（14）から作成し
た。これはアミノ酸１〜300からなり、疎水性のシグナ
ル配列（残基１〜25;斜線部分で示す）を含んでいる。
疎水性膜スパニング（spanning）ドメイン（残基340〜3
60;斜線部）およびＣ−末端疎水性ドメイン（残基361〜
393）は除去した。切り取りの位置（残基300）は破線で
示した。切り取ったgD−１を膜DAFの残基311に融合させ
た。このgD−1/DAF融合体は、cDNA配列から予想される
膜DAFの最後の37残基（残基311〜347）を含有してお
り、Ｃ−末端疎水性領域（残基331〜347;黒塗りで示
す）含んでいる。
ク質中に存在するHSV1糖タンパク質Ｄ（gD−１）および
DAFの領域を示す模式図である。断端を切り取った（分
泌型）gD−１を、天然（膜）gD−１（14）から作成し
た。これはアミノ酸１〜300からなり、疎水性のシグナ
ル配列（残基１〜25;斜線部分で示す）を含んでいる。
疎水性膜スパニング（spanning）ドメイン（残基340〜3
60;斜線部）およびＣ−末端疎水性ドメイン（残基361〜
393）は除去した。切り取りの位置（残基300）は破線で
示した。切り取ったgD−１を膜DAFの残基311に融合させ
た。このgD−1/DAF融合体は、cDNA配列から予想される
膜DAFの最後の37残基（残基311〜347）を含有してお
り、Ｃ−末端疎水性領域（残基331〜347;黒塗りで示
す）含んでいる。
詳細な説明 DAFとは、第１図または第２図に示されているプレま
たは成熟アミノ酸配列を有するあらゆる分子、並びに、
それらの第１図または第２図の天然DAFと共通の生物学
的活性を示すことができるアミノ酸配列またはグリコシ
ル化変異体（天然のアレルを含む）であると定義され
る。以下においては、特に記述がなければDAFなる用語
はこのいずれかの形態またはその両者を意味するものと
する。天然のDAFとは、血清、血球またはその他の動物
体液もしくは組織から得られるDAFである。DAFの生物学
的な活性は、１）天然DAFの少なくとも１つのエピトー
プとの免疫学的な交差反応性、または２）天然DAFと質
的に共通する少なくとも１つのホルモン、調節もしくは
エフェクター機能の保持、のいずれかとして定義され
る。アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するDAF
のアミノ酸配列変異体が含まれるので、アミノ酸配列変
異体はいずれかのDAFの免疫モジュレーター活性を示す
ことを必要とせずにDAFの定義の範囲内に入る。例え
ば、ある変異体はアンタゴニストとして作用し、天然DA
Fを競争的に阻害するが、それでも免疫モジュレーター
活性それ自体は有していないこともある。これとは異な
り、変異体がアンタゴニストではなく、また免疫モジュ
レーター活性を有していないときであっても、それが天
然のDAFに対して生成させた抗体と交差反応することが
できるなら、定義の範囲内に入る。今のところ知られて
いるDAFの免疫モジュレーター活性の例はC4b2a機能的活
性の阻害である（Medof et al.,1984;同上）。
たは成熟アミノ酸配列を有するあらゆる分子、並びに、
それらの第１図または第２図の天然DAFと共通の生物学
的活性を示すことができるアミノ酸配列またはグリコシ
ル化変異体（天然のアレルを含む）であると定義され
る。以下においては、特に記述がなければDAFなる用語
はこのいずれかの形態またはその両者を意味するものと
する。天然のDAFとは、血清、血球またはその他の動物
体液もしくは組織から得られるDAFである。DAFの生物学
的な活性は、１）天然DAFの少なくとも１つのエピトー
プとの免疫学的な交差反応性、または２）天然DAFと質
的に共通する少なくとも１つのホルモン、調節もしくは
エフェクター機能の保持、のいずれかとして定義され
る。アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するDAF
のアミノ酸配列変異体が含まれるので、アミノ酸配列変
異体はいずれかのDAFの免疫モジュレーター活性を示す
ことを必要とせずにDAFの定義の範囲内に入る。例え
ば、ある変異体はアンタゴニストとして作用し、天然DA
Fを競争的に阻害するが、それでも免疫モジュレーター
活性それ自体は有していないこともある。これとは異な
り、変異体がアンタゴニストではなく、また免疫モジュ
レーター活性を有していないときであっても、それが天
然のDAFに対して生成させた抗体と交差反応することが
できるなら、定義の範囲内に入る。今のところ知られて
いるDAFの免疫モジュレーター活性の例はC4b2a機能的活
性の阻害である（Medof et al.,1984;同上）。
DAFのアミノ酸反配列変異体には、第１図または第２
図に示したプレまたは成熟DAF配列中の残基の削除、挿
入または置換が含まれる。通常、アミノ酸配列の削除は
約１〜10残基の範囲内であり、普通は連続している。通
常、連続削除は偶数の残基で行われるが、１個のまたは
奇数の削除も本発明の範囲内に含まれる。代表的な削除
は、［デスCys330］成熟mDAF、［デスCys330−Thr347］
成熟mDAF、［デスThr2−Gly327］成熟sDAFである。特に
重要な削除はmDAFからのCys330−Thr347である。これ
は、膜アンカー部位およびトランスメンブラン領域を削
除するものであり、sDAFと同様に分泌されるが、sDAFの
特有の抗原決定基を全く有さない分子が得られることに
なる。
図に示したプレまたは成熟DAF配列中の残基の削除、挿
入または置換が含まれる。通常、アミノ酸配列の削除は
約１〜10残基の範囲内であり、普通は連続している。通
常、連続削除は偶数の残基で行われるが、１個のまたは
奇数の削除も本発明の範囲内に含まれる。代表的な削除
は、［デスCys330］成熟mDAF、［デスCys330−Thr347］
成熟mDAF、［デスThr2−Gly327］成熟sDAFである。特に
重要な削除はmDAFからのCys330−Thr347である。これ
は、膜アンカー部位およびトランスメンブラン領域を削
除するものであり、sDAFと同様に分泌されるが、sDAFの
特有の抗原決定基を全く有さない分子が得られることに
なる。
また、挿入は、変異が成熟DAF配列の範疇にあるとき
に偶数の残基で行うのが好ましく、通常、挿入は１〜５
残基の範囲内であろう。しかし、挿入には、DAFのアミ
ノもしくはカルボキシ末端への、または１残基から実質
的に制限されない長さのポリペプチドまでの融合が含ま
れる。１個の末端挿入の例は、Ｎ−末端のメチオニルを
有する成熟DAFである。この変異体は、組換え細胞の培
養におけるDAFの直接発現、即ち成熟DAFの細胞膜結合も
しくは分泌させるためのシグナル配列を伴わない発現の
ための人工物である。末端挿入の他の例には、１）組換
え宿主からの成熟DAFの分泌を容易にするための、成熟D
AFのＮ−末端への異種シグナル配列の融合、２）免疫原
性ポリペプチド、例えば細菌性ポリペプチド、例えば大
腸菌（E.coli）trp遺伝子座によってコードされている
酵素あるいはβ−ラクタマーゼなどの融合、および３）
細胞表面結合物質、例えばホルモン、成長因子あるいは
抗体などとの融合が含まれる。細胞表面結合物質との融
合体は組換え法によって製造されることを必要とせず、
ホスファチジルイノシノール基を含むDAFとの共有また
は非共有結合の産物であってもよい。例えば、抗体また
は可変領域を有するそのフラグメントを、DAFのＣ−末
端に共有結合させるか、またはそれとの融合体として組
換え細胞培養において発現させる。異型移植拒絶の改善
のためには、DAFを異型移植のHLA抗原に特異的な抗体に
結合させる。抗体とDAFは、例えばEP170,697Aの方法に
よって共有結合されるが、タンパク質を結合させるため
の他の方法が当業者には普通に知られている。免疫原の
融合は、抗−DAF抗体を得るためのワクチンとして適し
ている免疫原性のDAFを調製する際に有用である。これ
らは診断試薬の調製に有用である。代表的な挿入体に
は、［Thr329Leu Leu Cys330］成熟DAF、［Arg100His A
rg100］成熟DAF、［Lys125Gln Lys126Gln Lys127］成熟
DAF、［Pro193Leu Leu Ala194］成熟DAF、［Pro247Asp
Asp Glu248］成熟DAF、［Thr282Ser Ser Thr Thr283］
成熟DAF、および［Gly316Thr Thr317］成熟DAFが含まれ
る。
に偶数の残基で行うのが好ましく、通常、挿入は１〜５
残基の範囲内であろう。しかし、挿入には、DAFのアミ
ノもしくはカルボキシ末端への、または１残基から実質
的に制限されない長さのポリペプチドまでの融合が含ま
れる。１個の末端挿入の例は、Ｎ−末端のメチオニルを
有する成熟DAFである。この変異体は、組換え細胞の培
養におけるDAFの直接発現、即ち成熟DAFの細胞膜結合も
しくは分泌させるためのシグナル配列を伴わない発現の
ための人工物である。末端挿入の他の例には、１）組換
え宿主からの成熟DAFの分泌を容易にするための、成熟D
AFのＮ−末端への異種シグナル配列の融合、２）免疫原
性ポリペプチド、例えば細菌性ポリペプチド、例えば大
腸菌（E.coli）trp遺伝子座によってコードされている
酵素あるいはβ−ラクタマーゼなどの融合、および３）
細胞表面結合物質、例えばホルモン、成長因子あるいは
抗体などとの融合が含まれる。細胞表面結合物質との融
合体は組換え法によって製造されることを必要とせず、
ホスファチジルイノシノール基を含むDAFとの共有また
は非共有結合の産物であってもよい。例えば、抗体また
は可変領域を有するそのフラグメントを、DAFのＣ−末
端に共有結合させるか、またはそれとの融合体として組
換え細胞培養において発現させる。異型移植拒絶の改善
のためには、DAFを異型移植のHLA抗原に特異的な抗体に
結合させる。抗体とDAFは、例えばEP170,697Aの方法に
よって共有結合されるが、タンパク質を結合させるため
の他の方法が当業者には普通に知られている。免疫原の
融合は、抗−DAF抗体を得るためのワクチンとして適し
ている免疫原性のDAFを調製する際に有用である。これ
らは診断試薬の調製に有用である。代表的な挿入体に
は、［Thr329Leu Leu Cys330］成熟DAF、［Arg100His A
rg100］成熟DAF、［Lys125Gln Lys126Gln Lys127］成熟
DAF、［Pro193Leu Leu Ala194］成熟DAF、［Pro247Asp
Asp Glu248］成熟DAF、［Thr282Ser Ser Thr Thr283］
成熟DAF、および［Gly316Thr Thr317］成熟DAFが含まれ
る。
第３の群の変異体は、DAF分子中の少なくとも１つの
残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されている
ものである。通常、そのような置換は次の表に従って行
われる。
残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されている
ものである。通常、そのような置換は次の表に従って行
われる。
第１表のものより保存性が少ない置換を選択すること
によって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド
骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、
（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、また
は（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有
意に異なっている残基を選択することによって、機能ま
たは免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通
常、DAFの性質に最大の変化をもたらすと予想される置
換は、（ａ）親水性の残基（例えば、セリルまたはトレ
オニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、イソロ
イシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）に
代えて（または、によって）置換されているもの；
（ｂ）システインまたはプロリンが他のいずれかの残基
に代えて（または、によって）置換されているもの；
（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、
アルギニルまたはヒスチジル）が、電気陰性の残基（例
えば、グルタミルまたはアスパルチル）に代えて（また
は、によって）置換されているもの；または（ｄ）大き
な側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、
そのような側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）に
代えて（または、によって）置換されているものであろ
う。
によって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド
骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、
（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、また
は（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有
意に異なっている残基を選択することによって、機能ま
たは免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通
常、DAFの性質に最大の変化をもたらすと予想される置
換は、（ａ）親水性の残基（例えば、セリルまたはトレ
オニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、イソロ
イシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）に
代えて（または、によって）置換されているもの；
（ｂ）システインまたはプロリンが他のいずれかの残基
に代えて（または、によって）置換されているもの；
（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、
アルギニルまたはヒスチジル）が、電気陰性の残基（例
えば、グルタミルまたはアスパルチル）に代えて（また
は、によって）置換されているもの；または（ｄ）大き
な側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、
そのような側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）に
代えて（または、によって）置換されているものであろ
う。
代表的な置換DAFは、［Cys330→Met］成熟mDAF、［Cy
s330→Ser］成熟mDAF、［Lys2→Ser］成熟mDAF、［Lys
125Lys126→Gln］成熟DAF、［Gly144→Pro］成熟DAF、
［Ile146→Met］成熟DAF、［Phe169→Tyr］成熟DAF、
［Pro192→Gly］成熟DAF、［Ile201→Leu］成熟DAF、
［Asn236Asn237→Asp Asp］成熟DAF、［Glu239→Asp］
成熟DAF、［Ser256→Tyr］成熟DAF、［Val268→Phe］成
熟DAF、［Lys285→Gln］成熟DAF、［Thr294→Ser］成熟
DAF、および［Leu324→Ser］成熟DAFである。
s330→Ser］成熟mDAF、［Lys2→Ser］成熟mDAF、［Lys
125Lys126→Gln］成熟DAF、［Gly144→Pro］成熟DAF、
［Ile146→Met］成熟DAF、［Phe169→Tyr］成熟DAF、
［Pro192→Gly］成熟DAF、［Ile201→Leu］成熟DAF、
［Asn236Asn237→Asp Asp］成熟DAF、［Glu239→Asp］
成熟DAF、［Ser256→Tyr］成熟DAF、［Val268→Phe］成
熟DAF、［Lys285→Gln］成熟DAF、［Thr294→Ser］成熟
DAF、および［Leu324→Ser］成熟DAFである。
上記の変異体はsDAFまたはmDAFのどちらにおいても行
われる。以下に挙げる変異体は特有のsDAF C−末端にお
いて行われる：［Lys352→Gln］成熟sDAF、［Cys339−S
er］成熟sDAF、［Arg394→His］成熟sDAF、および［Leu
403Phe404Leu405→Ser Tyr Ser］成熟sDAF。
われる。以下に挙げる変異体は特有のsDAF C−末端にお
いて行われる：［Lys352→Gln］成熟sDAF、［Cys339−S
er］成熟sDAF、［Arg394→His］成熟sDAF、および［Leu
403Phe404Leu405→Ser Tyr Ser］成熟sDAF。
本明細書に記載した変異体は前もって決定したDAF変
異体であるので、本発明の目的のためには、あらゆる天
然のアレルはDAF変異体の範囲内に含まれない。
異体であるので、本発明の目的のためには、あらゆる天
然のアレルはDAF変異体の範囲内に含まれない。
mDAFのＣ−末端ドメインは、翻訳後プロセッシングの
間にリン脂質（通常はグリコホスホ脂質）が結合する部
位（「リン脂質アンカードメイン」と呼ぶ）を含んでい
る。このドメインは約20〜30の残基を含み、リン脂質は
Ｃ−末端残基のカルボキシルに共有結合する。このドメ
インまたはそれを含有するmDAFのあらゆるフラグメント
は、膜−結合の形態を作るのが望ましい他のあらゆるポ
リペプチドとの融合体として得られる。発現した融合体
について用いるときの「リン脂質アンカードメイン」
は、後記でさらに詳しく説明するように、翻訳後に修飾
された融合体についてであることは理解されよう。例え
ば、普通は分泌されるホルモンは、組換え細胞培養にお
いて、mDAFのリン脂質アンカードメインとのＣ−末端融
合のプレタンパク質として産生される。分泌される代わ
りに、この融合体は細胞膜まで運搬され、ホスファチジ
−コリンアンカーのためにそこに留どまったままにな
る。このような組換え細胞は、ホルモンまたは他の選択
したポリペプチドのための免疫原またはワクチンとして
有用である。また、膜においてポリペプチドをキレート
化すると、それが培養培地中に希釈されることから保護
される。最後に、Ｃ−末端脂質を有する融合ポリペプチ
ドは、その末端脂質が微量滴定管または試験管の表面な
どへの吸着のための都合の良い部位を与えるので、ポリ
ペプチドまたはその抗体の診断検定において有用であ
る。
間にリン脂質（通常はグリコホスホ脂質）が結合する部
位（「リン脂質アンカードメイン」と呼ぶ）を含んでい
る。このドメインは約20〜30の残基を含み、リン脂質は
Ｃ−末端残基のカルボキシルに共有結合する。このドメ
インまたはそれを含有するmDAFのあらゆるフラグメント
は、膜−結合の形態を作るのが望ましい他のあらゆるポ
リペプチドとの融合体として得られる。発現した融合体
について用いるときの「リン脂質アンカードメイン」
は、後記でさらに詳しく説明するように、翻訳後に修飾
された融合体についてであることは理解されよう。例え
ば、普通は分泌されるホルモンは、組換え細胞培養にお
いて、mDAFのリン脂質アンカードメインとのＣ−末端融
合のプレタンパク質として産生される。分泌される代わ
りに、この融合体は細胞膜まで運搬され、ホスファチジ
−コリンアンカーのためにそこに留どまったままにな
る。このような組換え細胞は、ホルモンまたは他の選択
したポリペプチドのための免疫原またはワクチンとして
有用である。また、膜においてポリペプチドをキレート
化すると、それが培養培地中に希釈されることから保護
される。最後に、Ｃ−末端脂質を有する融合ポリペプチ
ドは、その末端脂質が微量滴定管または試験管の表面な
どへの吸着のための都合の良い部位を与えるので、ポリ
ペプチドまたはその抗体の診断検定において有用であ
る。
リン脂質アンカーで置換されたＣ−末端ドメインを含
んでいる他のタンパク質が知られている。このようなタ
ンパク質には次のものが含まれる:Thy−１［Low et a
l.,Nature（London）318:62（1985）およびTse et al.,
Science 230:1003（1985）］、アフリカ・トリパノソー
マの変異表面糖タンパク質（VSG）［Ferguson et al.,
J.Biol.Chem. 260:14547（1985）］、アセチルコリンエ
ステラーゼ［Futerman et al.,Biochem.J. 226:369（198
5）］、５′ヌクレオチダーゼ［Low et al.,Biochim.Bi
ophys.Acta 508:565（1978）］、並びにDAF［Davitz et
al.,J.Exp.Med. 163:1150（1986）およびMed of et al.,
Biochemistry 25:6740（1986）］。グリコシル化ホスフ
ァチジルイノシトール（PI）およびエタノールアミンを
含有するDAFアンカーの結合は、mDAFからの17−31 C−
末端残基のタンパク質加水分解除去に続いて起こること
は明らかである［Low,M.G.,J.Biochem. 244:1−13（198
7）およびCross,G.A.M.,Cell 48:179−181（1987）］。
んでいる他のタンパク質が知られている。このようなタ
ンパク質には次のものが含まれる:Thy−１［Low et a
l.,Nature（London）318:62（1985）およびTse et al.,
Science 230:1003（1985）］、アフリカ・トリパノソー
マの変異表面糖タンパク質（VSG）［Ferguson et al.,
J.Biol.Chem. 260:14547（1985）］、アセチルコリンエ
ステラーゼ［Futerman et al.,Biochem.J. 226:369（198
5）］、５′ヌクレオチダーゼ［Low et al.,Biochim.Bi
ophys.Acta 508:565（1978）］、並びにDAF［Davitz et
al.,J.Exp.Med. 163:1150（1986）およびMed of et al.,
Biochemistry 25:6740（1986）］。グリコシル化ホスフ
ァチジルイノシトール（PI）およびエタノールアミンを
含有するDAFアンカーの結合は、mDAFからの17−31 C−
末端残基のタンパク質加水分解除去に続いて起こること
は明らかである［Low,M.G.,J.Biochem. 244:1−13（198
7）およびCross,G.A.M.,Cell 48:179−181（1987）］。
所望のポリペプチドとリン脂質アンカードメインの融
合体を作成するため、通常はそのようなアンカーを有す
るポリペプチドのＣ−末端の約30〜50残基をコードして
いるDNAを、所望のポリペプチドをコードしているDNA
に、またはその適当なフラグメントマルチマーもしくは
アミノ酸配列変異体に連結する。アンカー認識部位をコ
ードしているDNAを所望のタンパク質のＣ−末端に挿入
する。このアンカー認識部位は、アンカードメイン、並
びに融合体からプロセッシングされるアンカードメイン
のＣ−末端に位置する短い約10〜20残基の疎水性配列を
含んでいる。当業者には周知の常法によってこれを行
う。例えば、選択したリン脂質アンカー認識部位をコー
ドしているDNAは、インビトロでの方法によって、また
は天然のアンカーされるタンパク質をコードしているcD
NAもしくはゲノムDNAから適当なフラグメントを得るこ
とによって合成される。アンカードメインはＣ−末端疎
水性ドメインから上流の約20〜40残基中に見い出される
ので、疎水性ドメイン並びにその上流の約20〜40残基を
コードしているDNAを用いるべきである。
合体を作成するため、通常はそのようなアンカーを有す
るポリペプチドのＣ−末端の約30〜50残基をコードして
いるDNAを、所望のポリペプチドをコードしているDNA
に、またはその適当なフラグメントマルチマーもしくは
アミノ酸配列変異体に連結する。アンカー認識部位をコ
ードしているDNAを所望のタンパク質のＣ−末端に挿入
する。このアンカー認識部位は、アンカードメイン、並
びに融合体からプロセッシングされるアンカードメイン
のＣ−末端に位置する短い約10〜20残基の疎水性配列を
含んでいる。当業者には周知の常法によってこれを行
う。例えば、選択したリン脂質アンカー認識部位をコー
ドしているDNAは、インビトロでの方法によって、また
は天然のアンカーされるタンパク質をコードしているcD
NAもしくはゲノムDNAから適当なフラグメントを得るこ
とによって合成される。アンカードメインはＣ−末端疎
水性ドメインから上流の約20〜40残基中に見い出される
ので、疎水性ドメイン並びにその上流の約20〜40残基を
コードしているDNAを用いるべきである。
DAFに加えて多数のタンパク質がグリコホスホ脂質ア
ンカーを含んでいることが知られており、それらのアミ
ノ酸配列（異種の融合においてアンカーとして用いられ
るＣ−末端の約20〜50残基を含む）が知られている。そ
の例には次のものが含まれる：アセチルコリンエステラ
ーゼ［M.Schumacher et al.,Nature 319:407−409（198
6）］、Thy−１［T.Seki et al.,Nature 313:485−487
（1985）およびT.Moriuchi et al.,FEBS Lett. 178:105
−108（1985）］、VSG（T.Brucei）［Cross,Philos.Tra
ns.R.Soc.London Ser.B 307:3−12（1984）］、および
アルカリホスファターゼ［Weiss et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 83:7182−7186（1986）］。そのようなポリペ
プチドの全般的な概説については、M.G.Low,Biochem.J.
244:1−13（1987）およびM.G.Low et al.,TIBS 11:212−
215（1986）を参照。
ンカーを含んでいることが知られており、それらのアミ
ノ酸配列（異種の融合においてアンカーとして用いられ
るＣ−末端の約20〜50残基を含む）が知られている。そ
の例には次のものが含まれる：アセチルコリンエステラ
ーゼ［M.Schumacher et al.,Nature 319:407−409（198
6）］、Thy−１［T.Seki et al.,Nature 313:485−487
（1985）およびT.Moriuchi et al.,FEBS Lett. 178:105
−108（1985）］、VSG（T.Brucei）［Cross,Philos.Tra
ns.R.Soc.London Ser.B 307:3−12（1984）］、および
アルカリホスファターゼ［Weiss et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 83:7182−7186（1986）］。そのようなポリペ
プチドの全般的な概説については、M.G.Low,Biochem.J.
244:1−13（1987）およびM.G.Low et al.,TIBS 11:212−
215（1986）を参照。
ある場合には、例えば異種ポリペプチドのＣ−末端が
立体的に自由であるべき免疫エピトープまたは活性部位
を含んでいるときには、異種ポリペプチドのＣ−末端と
リン脂質アンカードメインの間にスペーサーポリペプチ
ドを導入するのが望ましいであろう。最も望ましくは、
これはアンカードメイン供与ポリペプチド由来の別の配
列、例えばアンカードメインのＮ−末端の約10〜50残基
であるが、人工の配列であってもよい。
立体的に自由であるべき免疫エピトープまたは活性部位
を含んでいるときには、異種ポリペプチドのＣ−末端と
リン脂質アンカードメインの間にスペーサーポリペプチ
ドを導入するのが望ましいであろう。最も望ましくは、
これはアンカードメイン供与ポリペプチド由来の別の配
列、例えばアンカードメインのＮ−末端の約10〜50残基
であるが、人工の配列であってもよい。
リン脂質アンカードメインをコードしているDNAから
帰属させたアミノ酸配列は、荷電していない疎水性残基
（ロイシン、グリシン、トレオニン、バリン、メチオニ
ン、イソロイシンおよび／またはフェニルアラニン）を
含有する約10〜20残基のＣ−末端配列を除いて配列の相
同性をわずかしか示さないか、または全く示さない。し
かし、これにもかかわらず、リン脂質アンカードメイン
は疎水性配列のすぐＮ−末端の領域内に含まれ、これに
基づいて容易に同定することができる。当業者ならリン
脂質アンカードメインの任意の配列を精製することがで
きよう。
帰属させたアミノ酸配列は、荷電していない疎水性残基
（ロイシン、グリシン、トレオニン、バリン、メチオニ
ン、イソロイシンおよび／またはフェニルアラニン）を
含有する約10〜20残基のＣ−末端配列を除いて配列の相
同性をわずかしか示さないか、または全く示さない。し
かし、これにもかかわらず、リン脂質アンカードメイン
は疎水性配列のすぐＮ−末端の領域内に含まれ、これに
基づいて容易に同定することができる。当業者ならリン
脂質アンカードメインの任意の配列を精製することがで
きよう。
上記のように、リン脂質アンカードメインに結合させ
るべきポリペプチドの実体および性質は限定されない。
それらの選択は、意図している治療または診断目的に依
存するであろう。必要とされるのは、融合したポリペプ
チドが、リン脂質アンカードメインとのハイブリッドと
して発現される前の未融合のポリペプチドの所望の生物
学的な活性を示すことだけである。このポリペプチドは
約４残基から数千までのどんな長さのものであってもよ
く、酵素、ホルモン、抗原などが含まれる。
るべきポリペプチドの実体および性質は限定されない。
それらの選択は、意図している治療または診断目的に依
存するであろう。必要とされるのは、融合したポリペプ
チドが、リン脂質アンカードメインとのハイブリッドと
して発現される前の未融合のポリペプチドの所望の生物
学的な活性を示すことだけである。このポリペプチドは
約４残基から数千までのどんな長さのものであってもよ
く、酵素、ホルモン、抗原などが含まれる。
これら融合体のための発現宿主は、リン脂質認識部位
をプロセッシングすることができ、リン脂質をアンカー
ドメインに結合させることができる細胞である。そのよ
うな細胞は好ましくは本明細書の他の箇所に記載したよ
うな哺乳動物の継続セルラインであり、最も好ましくは
DHFR-CHO細胞である。
をプロセッシングすることができ、リン脂質をアンカー
ドメインに結合させることができる細胞である。そのよ
うな細胞は好ましくは本明細書の他の箇所に記載したよ
うな哺乳動物の継続セルラインであり、最も好ましくは
DHFR-CHO細胞である。
融合ポリペプチドは、上記の免疫原の用途には、それ
を産生する細胞とともに、即ち発現宿主から回収するこ
となく使用される。他の場合、例えば診断キットの製造
に関連して融合体を疎水性の親和マトリックスに吸着さ
せる際には、融合体をその使用の前に発現宿主から回収
する。これまでmDAFまたは他のアンカーされたポリペプ
チドが単離されてきた方法と実質的に同じ方法で細胞膜
抽出物を調製することによって、融合体を宿主の細胞膜
から回収する。また、受容体などの膜アンカーされたポ
リペプチドの調製物を得るための他の方法が知られてお
り、本明細書に記載した融合体の回収に用いるのに適し
ている。通常は、宿主細胞膜を細胞質から分離し、ノニ
オン系デタージェントで可溶化し、そして融合体を免疫
アフィニティー、基質または配位子アフィニティーカラ
ムによる吸着によって回収する。この融合体は、異種の
ポリペプチドとグリコホスホ脂質アンカードメインを、
Ｃ−末端結合したグリコホスホ脂質とともに含有するポ
リペプチドとして回収されるであろう。この融合タンパ
ク質は、融合体のプロセッシングおよびグリコホスホ脂
質による置換の前に存在するＣ−末端疎水性配列を含む
ない形態で回収されるであろうことに注意すべきであ
る。
を産生する細胞とともに、即ち発現宿主から回収するこ
となく使用される。他の場合、例えば診断キットの製造
に関連して融合体を疎水性の親和マトリックスに吸着さ
せる際には、融合体をその使用の前に発現宿主から回収
する。これまでmDAFまたは他のアンカーされたポリペプ
チドが単離されてきた方法と実質的に同じ方法で細胞膜
抽出物を調製することによって、融合体を宿主の細胞膜
から回収する。また、受容体などの膜アンカーされたポ
リペプチドの調製物を得るための他の方法が知られてお
り、本明細書に記載した融合体の回収に用いるのに適し
ている。通常は、宿主細胞膜を細胞質から分離し、ノニ
オン系デタージェントで可溶化し、そして融合体を免疫
アフィニティー、基質または配位子アフィニティーカラ
ムによる吸着によって回収する。この融合体は、異種の
ポリペプチドとグリコホスホ脂質アンカードメインを、
Ｃ−末端結合したグリコホスホ脂質とともに含有するポ
リペプチドとして回収されるであろう。この融合タンパ
ク質は、融合体のプロセッシングおよびグリコホスホ脂
質による置換の前に存在するＣ−末端疎水性配列を含む
ない形態で回収されるであろうことに注意すべきであ
る。
宿主の細胞膜を含まない精製された融合体は治療組成
物として有用である。例えば、ウロキナーゼまたは組織
プラスミノーゲン活性化因子などのプラスミノーゲン活
性化因子酵素を含む融合体をグリコホスホ脂質アンカー
ドメインに融合させ、治療組成物として、心筋梗塞また
は望ましくない血餅を伴う他の疾患を有する患者に投与
する。好ましくは、酵素はそのＣ−末端がグリコホスホ
脂質アンカードメインのＮ−末端に融合される。「グリ
コホスホ脂質アンカードメイン」がアミノ酸残基ならび
にＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシル基で置換された
グリコホスホ脂質の両者を含むことは理解されよう。こ
の融合させたプラスミノーゲン活性化因子は、プラスミ
ノーゲンの活性化に最も効果的である血球および血管系
に入れられ、分解過程、例えば肝臓または脾臓によって
為される分解などによる血流からの除去を受けず、従っ
て、酵素の半減期を長くし、一層直接的に所望の治療部
位を標的とさせることができる。
物として有用である。例えば、ウロキナーゼまたは組織
プラスミノーゲン活性化因子などのプラスミノーゲン活
性化因子酵素を含む融合体をグリコホスホ脂質アンカー
ドメインに融合させ、治療組成物として、心筋梗塞また
は望ましくない血餅を伴う他の疾患を有する患者に投与
する。好ましくは、酵素はそのＣ−末端がグリコホスホ
脂質アンカードメインのＮ−末端に融合される。「グリ
コホスホ脂質アンカードメイン」がアミノ酸残基ならび
にＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシル基で置換された
グリコホスホ脂質の両者を含むことは理解されよう。こ
の融合させたプラスミノーゲン活性化因子は、プラスミ
ノーゲンの活性化に最も効果的である血球および血管系
に入れられ、分解過程、例えば肝臓または脾臓によって
為される分解などによる血流からの除去を受けず、従っ
て、酵素の半減期を長くし、一層直接的に所望の治療部
位を標的とさせることができる。
これらの利点を、細胞膜表面、特に造血細胞または血
管上皮などの循環系に近い細胞で機能するのが望ましい
あらゆるポリペプチドに適用することができる。例え
ば、代謝の先天的な欠陥の場合のように、必須酵素活性
が存在しないことを特徴とする疾患に苦しんでいる患者
は、リン脂質アンカードメインに融合させた問題の酵素
の注入によって治療される。必要とされる代謝産物の細
胞への放出および合成の動力学は、単に代謝産物を注入
することよりも改善される。また、この方法は、代謝産
物を供給するための別の方法である体細胞形質転換より
も多くの利点を与える。この融合体を、例えば脳細胞の
代謝欠損に向けるために脳脊髄液に、または他の組織も
しくは器官系に特異的な疾患を標的とするのが最も望ま
しいときにはリンパ系もしくは血流に注入する。
管上皮などの循環系に近い細胞で機能するのが望ましい
あらゆるポリペプチドに適用することができる。例え
ば、代謝の先天的な欠陥の場合のように、必須酵素活性
が存在しないことを特徴とする疾患に苦しんでいる患者
は、リン脂質アンカードメインに融合させた問題の酵素
の注入によって治療される。必要とされる代謝産物の細
胞への放出および合成の動力学は、単に代謝産物を注入
することよりも改善される。また、この方法は、代謝産
物を供給するための別の方法である体細胞形質転換より
も多くの利点を与える。この融合体を、例えば脳細胞の
代謝欠損に向けるために脳脊髄液に、または他の組織も
しくは器官系に特異的な疾患を標的とするのが最も望ま
しいときにはリンパ系もしくは血流に注入する。
本新規融合体は、免疫系の欠陥または欠損（特に、抗
原提供の過程におけるもの）を克服するのに特に有用で
ある。免疫応答を調節することが望まれる抗原をリン脂
質アンカードメインとの融合体として合成し、この融合
体を所望の効果を得るために決定した条件および用量で
投与する。抗原の選択には制限はないが、融合体は抗原
の関連エピトープ（群）を保存していなければならな
い。これは、当業者には周知の方法に従い、天然抗原お
よびラベルした天然抗原に対して生成させた抗体を用い
る通常の競合型の免疫検定によって容易に決定される。
また、抗原融合体は、上記のようなインビトロでの診断
法に、あるいはアフィニティークロマトグラフィーにお
いても有用である。
原提供の過程におけるもの）を克服するのに特に有用で
ある。免疫応答を調節することが望まれる抗原をリン脂
質アンカードメインとの融合体として合成し、この融合
体を所望の効果を得るために決定した条件および用量で
投与する。抗原の選択には制限はないが、融合体は抗原
の関連エピトープ（群）を保存していなければならな
い。これは、当業者には周知の方法に従い、天然抗原お
よびラベルした天然抗原に対して生成させた抗体を用い
る通常の競合型の免疫検定によって容易に決定される。
また、抗原融合体は、上記のようなインビトロでの診断
法に、あるいはアフィニティークロマトグラフィーにお
いても有用である。
本発明の新規融合体は、所望により、リポソームまた
は他の脂質膜担体中で製剤化される。これは、融合体の
溶液と予め形成させたリポソーム懸濁液を混合し、リポ
ソーム２重層中に融合体が挿入されるまでインキュベー
トすることによって容易に行われる。別法によれば、融
合体をリポソームの調製に用いた水性溶液と混合する。
また、融合体はmDAFについて後記するように通常の薬理
学的に許容しうる担体中で製剤化される。融合体は疎水
性の置換部分を保持しているので、Tween20やPEGなどの
薬理学的に許容しうるデタージェントと、または血清ア
ルブミンとともに製剤化することができる。
は他の脂質膜担体中で製剤化される。これは、融合体の
溶液と予め形成させたリポソーム懸濁液を混合し、リポ
ソーム２重層中に融合体が挿入されるまでインキュベー
トすることによって容易に行われる。別法によれば、融
合体をリポソームの調製に用いた水性溶液と混合する。
また、融合体はmDAFについて後記するように通常の薬理
学的に許容しうる担体中で製剤化される。融合体は疎水
性の置換部分を保持しているので、Tween20やPEGなどの
薬理学的に許容しうるデタージェントと、または血清ア
ルブミンとともに製剤化することができる。
DAFに関する以下の記載は、融合体は高等真核生物中
で生産されるべきであると記したときを除き、すぐ後に
記載するグリコホスホ脂質融合体に対しても同様に適用
されるものとみなされるべきである。
で生産されるべきであると記したときを除き、すぐ後に
記載するグリコホスホ脂質融合体に対しても同様に適用
されるものとみなされるべきである。
ほとんどの削除および挿入、並びに特に置換は、DAF
分子の性質に激変はもたらさないであろう。しかし、置
換、削除または挿入の正確な効果をそれを行う前に予測
することが困難であるとき、例えばDAF受容体結合ドメ
インまたは免疫エピトープを修飾するときには、通常の
スクリーニング検定によってその効果を評価するのは当
業者の認識するところであろう。例えば、変異体は通
常、天然のDAFをコードしている核酸の部位特異的な突
然変異誘発、組換え細胞培養での変異核酸の発現、およ
び所望により、細胞培養物からの精製（例えば、少なく
とも１つの残存免疫エピトープによって変異体を吸着さ
せるためのウサギポリクローナル抗−DAFカラムへの免
疫アフィニティー吸着による）によって調製される。次
いで、細胞溶解液または精製されたDAF変異体の活性
を、目的の性質に対して適切なスクリーニング検定で調
べる。例えば、ある抗体に対する親和性などのDAFの免
疫学的性質の変化は競合型の免疫検定で測定する。免疫
モジュレーター活性の変化はC4b2a検定で測定するが、
インビボでのsDAFおよびmDAFの機能がさらにわかったと
きには、他の検定がそのようなスクリーニングに有用と
なるであろう。酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タ
ンパク質加水分解に対する感受性、または担体と、もし
くはマルチマーに集合する傾向などのタンパク質の性質
の修飾は当業者には周知の方法によって検定される。
分子の性質に激変はもたらさないであろう。しかし、置
換、削除または挿入の正確な効果をそれを行う前に予測
することが困難であるとき、例えばDAF受容体結合ドメ
インまたは免疫エピトープを修飾するときには、通常の
スクリーニング検定によってその効果を評価するのは当
業者の認識するところであろう。例えば、変異体は通
常、天然のDAFをコードしている核酸の部位特異的な突
然変異誘発、組換え細胞培養での変異核酸の発現、およ
び所望により、細胞培養物からの精製（例えば、少なく
とも１つの残存免疫エピトープによって変異体を吸着さ
せるためのウサギポリクローナル抗−DAFカラムへの免
疫アフィニティー吸着による）によって調製される。次
いで、細胞溶解液または精製されたDAF変異体の活性
を、目的の性質に対して適切なスクリーニング検定で調
べる。例えば、ある抗体に対する親和性などのDAFの免
疫学的性質の変化は競合型の免疫検定で測定する。免疫
モジュレーター活性の変化はC4b2a検定で測定するが、
インビボでのsDAFおよびmDAFの機能がさらにわかったと
きには、他の検定がそのようなスクリーニングに有用と
なるであろう。酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タ
ンパク質加水分解に対する感受性、または担体と、もし
くはマルチマーに集合する傾向などのタンパク質の性質
の修飾は当業者には周知の方法によって検定される。
ヒト以外の種、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど
由来のDAFも本発明の範囲内に含まれる。
由来のDAFも本発明の範囲内に含まれる。
DAFは組換え細胞培養物中での合成によって調製する
のが好ましい。そうするためには、第１にDAFをコード
している核酸を入手することが必要である。DAFをコー
ドしているすべての核酸を同定する際に相当な困難が存
在した。最終的に決定されたDAFをコードしているヒトm
DNAの配列を第１図に示す。上記のようにHela細胞由来
のcDNAを調べることによって第２図に示すsDAFをコード
しているcDNAを同定するに至った。このDNAが同定され
たときには、ヒトDNAのゲノムライブラリーへの核酸ハ
イブリダイゼーションによって、または、別の動物種の
DAFをコードしているDNAを得るのが所望であるときに
は、該種の細胞由来のDNAライブラリーのハイブリダイ
ゼーションによって、上記核酸を得るのは当業者には自
明のことである。標的DNAに対して完全に、またはほと
んど完全に対合する極めて長い合成プローブの調製を第
１図および第２図が可能にしているので、ここでのハイ
ブリダイゼーション分析は簡単なことである。
のが好ましい。そうするためには、第１にDAFをコード
している核酸を入手することが必要である。DAFをコー
ドしているすべての核酸を同定する際に相当な困難が存
在した。最終的に決定されたDAFをコードしているヒトm
DNAの配列を第１図に示す。上記のようにHela細胞由来
のcDNAを調べることによって第２図に示すsDAFをコード
しているcDNAを同定するに至った。このDNAが同定され
たときには、ヒトDNAのゲノムライブラリーへの核酸ハ
イブリダイゼーションによって、または、別の動物種の
DAFをコードしているDNAを得るのが所望であるときに
は、該種の細胞由来のDNAライブラリーのハイブリダイ
ゼーションによって、上記核酸を得るのは当業者には自
明のことである。標的DNAに対して完全に、またはほと
んど完全に対合する極めて長い合成プローブの調製を第
１図および第２図が可能にしているので、ここでのハイ
ブリダイゼーション分析は簡単なことである。
DAF核酸の供給源として選んだゲノムライブラリーま
たはcDNAが、完全長さのDAFをコードしている単一のク
ローンを含んでおらず、部分的なクローンだけを含んで
いることもありうる。これらの部分的なクローンおよび
フラグメントは、部分的なクローンを重なり部分中の選
択した制限部位で切断し、所望のフラグメントをそれぞ
れ回収し、そして適切な順序および配向でそれらを連結
することによって、完全長さのDNAに容易に組み立てら
れる。必要なら、あらゆる失われた配列を供給するため
のオリゴヌクレオチドを調製する。
たはcDNAが、完全長さのDAFをコードしている単一のク
ローンを含んでおらず、部分的なクローンだけを含んで
いることもありうる。これらの部分的なクローンおよび
フラグメントは、部分的なクローンを重なり部分中の選
択した制限部位で切断し、所望のフラグメントをそれぞ
れ回収し、そして適切な順序および配向でそれらを連結
することによって、完全長さのDNAに容易に組み立てら
れる。必要なら、あらゆる失われた配列を供給するため
のオリゴヌクレオチドを調製する。
次いで、DAFをコードしている核酸を、さらにクロー
ニングするための、または発現させるための複製可能な
ベクターに連結する。ベクターは適合宿主細胞と共同し
て２つの機能を発揮するのに有用である（宿主−ベクタ
ー系）。機能の１つは、DAFをコードしている核酸のク
ローニングを容易にすること、即ち使用可能な量の核酸
を生産させることである。他の機能はDAFを発現させる
ことである。これら機能の１つまたは両方はベクター−
宿主系によって行われる。ベクターはそれらに行わせる
機能、並びに、クローニングまたは発現用に選択した宿
主細胞に依存して異なった成分を含有しているであろ
う。
ニングするための、または発現させるための複製可能な
ベクターに連結する。ベクターは適合宿主細胞と共同し
て２つの機能を発揮するのに有用である（宿主−ベクタ
ー系）。機能の１つは、DAFをコードしている核酸のク
ローニングを容易にすること、即ち使用可能な量の核酸
を生産させることである。他の機能はDAFを発現させる
ことである。これら機能の１つまたは両方はベクター−
宿主系によって行われる。ベクターはそれらに行わせる
機能、並びに、クローニングまたは発現用に選択した宿
主細胞に依存して異なった成分を含有しているであろ
う。
それぞれのベクターは上に記したようにDAFをコード
している核酸を含有しているであろう。通常、これはア
ミノ末端が分泌シグナルに結合している成熟形のDAFを
コードしているDNAであろう。この分泌シグナルは、通
常インビボでヒト細胞からDAFを分泌させるDAFプレ配列
であるのが好ましい。しかし、適当な分泌シグナルに
は、他の動物DAF由来のシグナル、ウイルス性シグナ
ル、または同一もしくは関連の種の分泌ポリペプチド由
来のシグナルも含まれる。
している核酸を含有しているであろう。通常、これはア
ミノ末端が分泌シグナルに結合している成熟形のDAFを
コードしているDNAであろう。この分泌シグナルは、通
常インビボでヒト細胞からDAFを分泌させるDAFプレ配列
であるのが好ましい。しかし、適当な分泌シグナルに
は、他の動物DAF由来のシグナル、ウイルス性シグナ
ル、または同一もしくは関連の種の分泌ポリペプチド由
来のシグナルも含まれる。
発現およびクローニングベクターは、１またはそれ以
上の選択した宿主細胞中でのベクターの複製を可能にす
る核酸配列を含んでいる。通常、クローニングベクター
においては、この配列は宿主染色体とは独立してベクタ
ーが複製することを可能にする配列であり、複製起源ま
たは自律的に複製する配列を含んでいる。このような配
列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知であ
る。よく知られているプラスミドpBR322由来の複製起源
がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、酵母に対し
ては２μプラスミド起源が、そして種々のウイルス性起
源（SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBP
V）は哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用で
ある。起源は哺乳動物発現ベクターには必要ではない
（SV40起源が実施例で用いられているが、これは初期プ
ロモーターを含んでいるからである）。ほとんどの発現
ベクターは「シャトル（往復）」ベクターである：即
ち、少なくとも一群の生物中で複製が可能であり、発現
のために別の生物中にトランスフェクションすることが
できる。例えば、ベクターを大腸菌中でクローンし、次
に同じベクターを、それが宿主細胞染色体とは独立して
複製することができないものであっても、発現用に酵母
または哺乳動物細胞中にトランスフェクションする。
上の選択した宿主細胞中でのベクターの複製を可能にす
る核酸配列を含んでいる。通常、クローニングベクター
においては、この配列は宿主染色体とは独立してベクタ
ーが複製することを可能にする配列であり、複製起源ま
たは自律的に複製する配列を含んでいる。このような配
列は種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知であ
る。よく知られているプラスミドpBR322由来の複製起源
がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、酵母に対し
ては２μプラスミド起源が、そして種々のウイルス性起
源（SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBP
V）は哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用で
ある。起源は哺乳動物発現ベクターには必要ではない
（SV40起源が実施例で用いられているが、これは初期プ
ロモーターを含んでいるからである）。ほとんどの発現
ベクターは「シャトル（往復）」ベクターである：即
ち、少なくとも一群の生物中で複製が可能であり、発現
のために別の生物中にトランスフェクションすることが
できる。例えば、ベクターを大腸菌中でクローンし、次
に同じベクターを、それが宿主細胞染色体とは独立して
複製することができないものであっても、発現用に酵母
または哺乳動物細胞中にトランスフェクションする。
また、DNAは宿主ゲノム中への挿入によってクローン
される。これは、バシラス種を用い、例えばバシラスの
ゲノムDNA中に見い出される配列に相補性であるDNA配列
をベクター中に含ませることによって容易に行われる。
このベクターを用いてバシラスをトランスフェクション
すると、ゲノムとDAF DNAの挿入体による相同組換えが
起こる。しかし、DAF DNAの切り出しには制限酵素消化
が必要であるので、DAFをコードしているゲノムDNAの回
収は外部で複製されたベクターのそれよりも複雑であ
る。
される。これは、バシラス種を用い、例えばバシラスの
ゲノムDNA中に見い出される配列に相補性であるDNA配列
をベクター中に含ませることによって容易に行われる。
このベクターを用いてバシラスをトランスフェクション
すると、ゲノムとDAF DNAの挿入体による相同組換えが
起こる。しかし、DAF DNAの切り出しには制限酵素消化
が必要であるので、DAFをコードしているゲノムDNAの回
収は外部で複製されたベクターのそれよりも複雑であ
る。
通常、DAF発現のための安定なセルラインまたは微生
物を調製する目的でDNAを宿主ゲノム中に挿入する。
物を調製する目的でDNAを宿主ゲノム中に挿入する。
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子（選択
マーカーとも呼ばれる）を含んでいるべきである。これ
は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増
殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。
この遺伝子の存在は、ベクターを欠いているすべての宿
主細胞が形質転換宿主を越える増殖または複製の利益を
受けないことを確実なものにする。通常の選択遺伝子
は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピ
シリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラ
サイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）
栄養要求欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）コン
プレックス培地から入手できない必須栄養物質を供給す
るタンパク質、例えばバシラスのためのＤ−アラニン
ラセマーゼをコードしている遺伝子、をコードしてい
る。
マーカーとも呼ばれる）を含んでいるべきである。これ
は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増
殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子である。
この遺伝子の存在は、ベクターを欠いているすべての宿
主細胞が形質転換宿主を越える増殖または複製の利益を
受けないことを確実なものにする。通常の選択遺伝子
は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピ
シリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラ
サイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）
栄養要求欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）コン
プレックス培地から入手できない必須栄養物質を供給す
るタンパク質、例えばバシラスのためのＤ−アラニン
ラセマーゼをコードしている遺伝子、をコードしてい
る。
酵母で用いるのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミ
ドYRp7中に存在しているtpr1遺伝子である（Stinchcomb
et al.,1979,Nature 282:39;Kingsman et al.,1979,Gen
e ７:141;またはTschemper et al.,1980,Gene 10:157）。
このtpr1遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を
欠く酵母の突然変異株、例えばATCC No.44076またはPEP
4−１（Jones,1977,Genetics 85:12）の選択マーカーを
与える。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp1欠損の存
在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転
換の検出に有効な環境を与える。同様に、Leu2欠損酵母
株（ATCC 20,622または38,626）は、Leu2遺伝子を有す
る既知のプラスミドによって補足される。
ドYRp7中に存在しているtpr1遺伝子である（Stinchcomb
et al.,1979,Nature 282:39;Kingsman et al.,1979,Gen
e ７:141;またはTschemper et al.,1980,Gene 10:157）。
このtpr1遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を
欠く酵母の突然変異株、例えばATCC No.44076またはPEP
4−１（Jones,1977,Genetics 85:12）の選択マーカーを
与える。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp1欠損の存
在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転
換の検出に有効な環境を与える。同様に、Leu2欠損酵母
株（ATCC 20,622または38,626）は、Leu2遺伝子を有す
る既知のプラスミドによって補足される。
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ
葉酸還元酵素（DHFR）またはチミジンキナーゼである。
これらのマーカーは、DAFの核酸の取込みに対してコン
ピテントである細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞
形質転換体を、マーカーを取込んだために形質転換体だ
けが唯一生存に適応する選択圧下に置く。選択圧は、培
地中の選択物質の濃度を連続的に変化させ、それによっ
て選択遺伝子とDAFをコードしているDNAの両方の増幅が
導かれる条件下で形質転換体を培養することによって課
される。増幅とは、増殖に必須であるタンパク質を産生
することが強く要求されている遺伝子が組換え細胞の代
々の世代の染色体内に直列して反復される過程である。
増加量のDAFが増幅されたDNAから合成される。
葉酸還元酵素（DHFR）またはチミジンキナーゼである。
これらのマーカーは、DAFの核酸の取込みに対してコン
ピテントである細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞
形質転換体を、マーカーを取込んだために形質転換体だ
けが唯一生存に適応する選択圧下に置く。選択圧は、培
地中の選択物質の濃度を連続的に変化させ、それによっ
て選択遺伝子とDAFをコードしているDNAの両方の増幅が
導かれる条件下で形質転換体を培養することによって課
される。増幅とは、増殖に必須であるタンパク質を産生
することが強く要求されている遺伝子が組換え細胞の代
々の世代の染色体内に直列して反復される過程である。
増加量のDAFが増幅されたDNAから合成される。
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞は、始
めにヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠く
培養培地ですべての形質転換体を培養することによって
同定する。この場合の適切な宿主細胞は、Urlaubおよび
Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216の記載の
ように調製し、増殖させた、DHFR活性を欠くチャイニー
ズ・ハムスター卵巣（CHO）セルラインである。特に有
用なDHFRは、MTXに対して耐性が高い突然変異DHFRであ
る（EP 117,060A）。この選択物質は、内生のDHFRの存
在にかかわらず、その他の点では適切なあらゆる宿主、
例えばATCC No.CCL61 CHO−K1で用いることができる。
次に、DHFRを不活性化する物質（メトトレキセートまた
はMTX）に暴露することによって、DHFRとDAFコード化DN
Aを増幅する。連続回の逐次増大するMTX濃度で増殖する
ことができる細胞だけを選択することによって、細胞が
さらにDHFRを必要とする（従って、すべての外来DNAを
増幅する）のを確実なものにする。
めにヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠く
培養培地ですべての形質転換体を培養することによって
同定する。この場合の適切な宿主細胞は、Urlaubおよび
Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216の記載の
ように調製し、増殖させた、DHFR活性を欠くチャイニー
ズ・ハムスター卵巣（CHO）セルラインである。特に有
用なDHFRは、MTXに対して耐性が高い突然変異DHFRであ
る（EP 117,060A）。この選択物質は、内生のDHFRの存
在にかかわらず、その他の点では適切なあらゆる宿主、
例えばATCC No.CCL61 CHO−K1で用いることができる。
次に、DHFRを不活性化する物質（メトトレキセートまた
はMTX）に暴露することによって、DHFRとDAFコード化DN
Aを増幅する。連続回の逐次増大するMTX濃度で増殖する
ことができる細胞だけを選択することによって、細胞が
さらにDHFRを必要とする（従って、すべての外来DNAを
増幅する）のを確実なものにする。
組換え脊椎動物細胞培養におけるハイブリッド受容体
の合成に適合させるのに適したその他の方法、ベクター
および宿主細胞は、M.J.Gething et al.,Nature 293:620
−625（1981）;N.Mantei et al.,Nature 281:40−46;お
よびA.Levinson et al.,EP 117,060Aおよび117,058Aが
記載している。DAFの哺乳動物細胞培養発現に特に有用
な出発プラスミドは、pE342.HBV E400.D22（pE348HBVE4
00D22とも呼ばれる;EP 117,058A）である。
の合成に適合させるのに適したその他の方法、ベクター
および宿主細胞は、M.J.Gething et al.,Nature 293:620
−625（1981）;N.Mantei et al.,Nature 281:40−46;お
よびA.Levinson et al.,EP 117,060Aおよび117,058Aが
記載している。DAFの哺乳動物細胞培養発現に特に有用
な出発プラスミドは、pE342.HBV E400.D22（pE348HBVE4
00D22とも呼ばれる;EP 117,058A）である。
クローニングベクターとは異なり、発現ベクターは、
宿主生物によって認識され、そしてDAFの核酸に機能的
に結合したプロモーターを含有しているべきである。プ
ロモーターは、その支配下にある核酸の転写および翻訳
をコントロールする、構造遺伝子の開始コドンの上流
（通常、約100〜1000bp以内）に位置している翻訳され
ない配列である。これらは普通２つの群、即ち誘導性お
よび構成性に分けられる。誘導性のプロモーターは、培
養条件のある変化、例えば栄養素の存在もしくは非存在
または温度の変化に応答してそれらの支配下のDNAから
増大レベルの転写を開始するプロモーターである。現時
点では、多種の可能性ある宿主細胞によって認識される
多数のプロモーターが周知である。これらのプロモータ
ーは、制限酵素消化によってこれらをこれらの元の遺伝
子から取り、次いでDAFの開始コドンの５′に挿入する
ことによって、DAFをコードしているDNAに機能的に結合
させる。これは、ゲノムDAFプロモーターが使用できな
いと言うものではない。しかし、一般に異種のプロモー
ターは、一層高い転写および一層高い発現DAF収量を与
えることになる。
宿主生物によって認識され、そしてDAFの核酸に機能的
に結合したプロモーターを含有しているべきである。プ
ロモーターは、その支配下にある核酸の転写および翻訳
をコントロールする、構造遺伝子の開始コドンの上流
（通常、約100〜1000bp以内）に位置している翻訳され
ない配列である。これらは普通２つの群、即ち誘導性お
よび構成性に分けられる。誘導性のプロモーターは、培
養条件のある変化、例えば栄養素の存在もしくは非存在
または温度の変化に応答してそれらの支配下のDNAから
増大レベルの転写を開始するプロモーターである。現時
点では、多種の可能性ある宿主細胞によって認識される
多数のプロモーターが周知である。これらのプロモータ
ーは、制限酵素消化によってこれらをこれらの元の遺伝
子から取り、次いでDAFの開始コドンの５′に挿入する
ことによって、DAFをコードしているDNAに機能的に結合
させる。これは、ゲノムDAFプロモーターが使用できな
いと言うものではない。しかし、一般に異種のプロモー
ターは、一層高い転写および一層高い発現DAF収量を与
えることになる。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれ
たときに機能的に結合される。例えば、プレ配列または
分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関
係するプレタンパク質として発現されるならばポリペプ
チドのDNAに機能的に結合しており；プロモーターまた
はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすな
らば暗号配列に機能的に結合しており；また、リボソー
ム結合部位は、それが翻訳を促進するように設置されて
いるならば暗号配列に機能的に結合している。通常、機
能的に結合するとは、結合されるDNA配列群が近接して
おり、分泌リーダーの場合には近接してリーディング相
内にあることを意味する。結合は都合のよい制限部位で
のライゲート（連結）によって行う。そのような部位が
存在しないときには、常法に従って合成オリゴヌクレオ
チド アダプターまたはリンカーを用いる。
たときに機能的に結合される。例えば、プレ配列または
分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関
係するプレタンパク質として発現されるならばポリペプ
チドのDNAに機能的に結合しており；プロモーターまた
はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすな
らば暗号配列に機能的に結合しており；また、リボソー
ム結合部位は、それが翻訳を促進するように設置されて
いるならば暗号配列に機能的に結合している。通常、機
能的に結合するとは、結合されるDNA配列群が近接して
おり、分泌リーダーの場合には近接してリーディング相
内にあることを意味する。結合は都合のよい制限部位で
のライゲート（連結）によって行う。そのような部位が
存在しないときには、常法に従って合成オリゴヌクレオ
チド アダプターまたはリンカーを用いる。
原核性宿主で用いるのに適したプロモーターには、β
−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Chan
g et al.,1978,Nature 275:615;およびGoeddel et a
l.,1979,Nature 281:544）、アルカリホスファターゼ、
トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddel,1980,
Nucleic Acids Res. ８:4057およびEPO出願公開No.36,77
6）、およびtacプロモーターなどのハイブリットプロモ
ーター（H.de Boar et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 80:21−25）が含まれる。しかし、その他の既知の細
菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオチド
配列は公表されており、従って当業者はこれらを、あら
ゆる必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはア
ダプターを用いて、DAFをコードしているDNAに機能的に
連結することができる（Siebenlist et al.,1980,Cell 2
0:269）。また、細菌性の系で用いるためのプロモータ
ーは、DAFをコードしているDNAに機能的に結合させたシ
ャイン−ダルガルノ（S.D.）配列を含有している。
−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Chan
g et al.,1978,Nature 275:615;およびGoeddel et a
l.,1979,Nature 281:544）、アルカリホスファターゼ、
トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddel,1980,
Nucleic Acids Res. ８:4057およびEPO出願公開No.36,77
6）、およびtacプロモーターなどのハイブリットプロモ
ーター（H.de Boar et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 80:21−25）が含まれる。しかし、その他の既知の細
菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオチド
配列は公表されており、従って当業者はこれらを、あら
ゆる必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはア
ダプターを用いて、DAFをコードしているDNAに機能的に
連結することができる（Siebenlist et al.,1980,Cell 2
0:269）。また、細菌性の系で用いるためのプロモータ
ーは、DAFをコードしているDNAに機能的に結合させたシ
ャイン−ダルガルノ（S.D.）配列を含有している。
酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、３−ホス
ホグリセレート キナーゼ（Hitzeman et al.,1980,J.B
iol.Chem. 255:2073）、またはその他のグルコース分解
酵素（Hess et al.,1968,J.Adv.Enzyme Reg. ７:149;お
よびHolland,1978,Biochemistry 17:4900）、例えばエノ
ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコース−６
−ホスフェート イソメラーゼ、３−ホスホグリセレー
ト ムターゼ、ピルベート キナーゼ、トリオセホスフ
ェート イソメラーゼ、ホスホグルコース イソメラー
ゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれ
る。
ホグリセレート キナーゼ（Hitzeman et al.,1980,J.B
iol.Chem. 255:2073）、またはその他のグルコース分解
酵素（Hess et al.,1968,J.Adv.Enzyme Reg. ７:149;お
よびHolland,1978,Biochemistry 17:4900）、例えばエノ
ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコース−６
−ホスフェート イソメラーゼ、３−ホスホグリセレー
ト ムターゼ、ピルベート キナーゼ、トリオセホスフ
ェート イソメラーゼ、ホスホグルコース イソメラー
ゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーターが含まれ
る。
増殖条件によってコントロールされる転写の別の利点
を有している誘導性プロモーターであるその他の酵母プ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する
分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース
およびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモータ
ー領域である。酵母発現において用いるのに適したベク
ターおよびプロモーターはHitzeman et al.（EP 73,657
A）がさらに開示している。また、酵母エンハンサーを
酵母プロモーターとともに用いるのが有利である。
を有している誘導性プロモーターであるその他の酵母プ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する
分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース
およびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモータ
ー領域である。酵母発現において用いるのに適したベク
ターおよびプロモーターはHitzeman et al.（EP 73,657
A）がさらに開示している。また、酵母エンハンサーを
酵母プロモーターとともに用いるのが有利である。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからのDAFの転写は、
ポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、
レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましく
はサルウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノムか
ら、または、例えばアクチンプロモーターなどのヘテロ
ローガスな哺乳動物プロモーターから得られるプロモー
ターによってコントロールされる。SV40ウイルスの初期
および後期プロモーターは、SV40のウイルス性複製起源
をも含有するSV40制限フラグメントとして好都合に得ら
れる（Fiers et al.,1978,Nature 273:113）。また、宿
主細胞またはその関連種由来のプロモーターが本発明に
おいて有用であるのは勿論である。
ポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、
レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましく
はサルウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノムか
ら、または、例えばアクチンプロモーターなどのヘテロ
ローガスな哺乳動物プロモーターから得られるプロモー
ターによってコントロールされる。SV40ウイルスの初期
および後期プロモーターは、SV40のウイルス性複製起源
をも含有するSV40制限フラグメントとして好都合に得ら
れる（Fiers et al.,1978,Nature 273:113）。また、宿
主細胞またはその関連種由来のプロモーターが本発明に
おいて有用であるのは勿論である。
高等真核生物によるDAFをコードしているDNAの転写
は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによ
って増大する。エンハンサーは、通常約10〜300bpのヌ
クレオチド配列であり、プロモーターに作用してその転
写を増強するが、その配向および位置には比較的無関係
に作用する。現在では多数のエンハンサー配列が哺乳動
物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−
フェトプロテインおよびインスリン）から既知となって
いる。しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを
用いるのが普通である。その例には、SV40の複製起源の
後期側のエンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマの
複製起源の後期側のエンハンサー、およびアデノウイル
スのエンハンサーが含まれる。エンハンサーはベクター
のDAFをコードしている配列の５′または３′の位置に
継ぎ合わせてよいが、プロモーターの５′の位置に設置
するのが好ましい。
は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによ
って増大する。エンハンサーは、通常約10〜300bpのヌ
クレオチド配列であり、プロモーターに作用してその転
写を増強するが、その配向および位置には比較的無関係
に作用する。現在では多数のエンハンサー配列が哺乳動
物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−
フェトプロテインおよびインスリン）から既知となって
いる。しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを
用いるのが普通である。その例には、SV40の複製起源の
後期側のエンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマの
複製起源の後期側のエンハンサー、およびアデノウイル
スのエンハンサーが含まれる。エンハンサーはベクター
のDAFをコードしている配列の５′または３′の位置に
継ぎ合わせてよいが、プロモーターの５′の位置に設置
するのが好ましい。
また、真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動
物、ヒト、またはその他の多細胞生物由来の有核細胞）
で用いる発現ベクターは、転写の終止およびmRNAの安定
化に必要な配列をも含んでいるであろう。通常、このよ
うな配列は真核性またはウイルス性のDNAまたはcDNAの
５′および時には３′非翻訳化領域から得ることができ
る。これらの領域は、DAFをコードしているmRNAの非翻
訳化部分にポリアデニル化されたセグメントとして転写
される領域を含んでいる。また、３′非翻訳化領域は転
写終止部位をも含んでいる。
物、ヒト、またはその他の多細胞生物由来の有核細胞）
で用いる発現ベクターは、転写の終止およびmRNAの安定
化に必要な配列をも含んでいるであろう。通常、このよ
うな配列は真核性またはウイルス性のDNAまたはcDNAの
５′および時には３′非翻訳化領域から得ることができ
る。これらの領域は、DAFをコードしているmRNAの非翻
訳化部分にポリアデニル化されたセグメントとして転写
される領域を含んでいる。また、３′非翻訳化領域は転
写終止部位をも含んでいる。
本発明のベクターのクローニングまたは発現に適した
宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核細胞であ
る。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物、例
えば大腸菌またはバシラスが含まれる。好ましいクロー
ニング宿主は大腸菌294（ATCC 31,446）であるが、その
他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば大腸
菌Ｂ、大腸菌X1776（ATCC 31,537）、大腸菌W3110（ATC
C 27,325）、シュードモナス種、またはセラッチア・マ
ルセサンス（Serratia Marcesans）も適している。
宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核細胞であ
る。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物、例
えば大腸菌またはバシラスが含まれる。好ましいクロー
ニング宿主は大腸菌294（ATCC 31,446）であるが、その
他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば大腸
菌Ｂ、大腸菌X1776（ATCC 31,537）、大腸菌W3110（ATC
C 27,325）、シュードモナス種、またはセラッチア・マ
ルセサンス（Serratia Marcesans）も適している。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核性微
生物もDAFをコードしているベクターに適した宿主であ
る。サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces ce
revisiae）または普通のパン酵母が、低級真核宿主微生
物の中で最も普通に用いられる。しかし、その他多数の
属、種、および株が普通に用いられ、本発明にとって有
用である。
生物もDAFをコードしているベクターに適した宿主であ
る。サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces ce
revisiae）または普通のパン酵母が、低級真核宿主微生
物の中で最も普通に用いられる。しかし、その他多数の
属、種、および株が普通に用いられ、本発明にとって有
用である。
DAFの発現用に好ましい宿主細胞は多細胞生物由来の
細胞である。もし天然DAFに対しても最も忠実な立体配
座を示すことを組換えタンパク質に期待するときには、
DAFが大きいことおよびその分子内ジスルフィド結合
（群）により、宿主細胞は最適には微生物よりさらに高
等な系統発生オーダーのものであることが示唆される。
さらに、それはDAFをグリコシル化するのにも望まし
い。これら機能のすべては高等真核細胞によって最もう
まく行うことができる。原則的には、あらゆる高等真核
細胞培養物が脊椎動物あるいは非脊椎動物培養物由来を
問わず使用可能であるが、ヒトなどの哺乳動物由来の細
胞が好ましい。これら細胞の培養物中での増幅は自体周
知である［Tissue Culture,Academic Press,Kruseおよ
びPatterson編（1973）を参照］。有用な哺乳動物宿主
セルラインの例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣セルライン、WI38、BHK、COS−７、MDCK
セルライン、およびヒト胚腎セルライン293である。
細胞である。もし天然DAFに対しても最も忠実な立体配
座を示すことを組換えタンパク質に期待するときには、
DAFが大きいことおよびその分子内ジスルフィド結合
（群）により、宿主細胞は最適には微生物よりさらに高
等な系統発生オーダーのものであることが示唆される。
さらに、それはDAFをグリコシル化するのにも望まし
い。これら機能のすべては高等真核細胞によって最もう
まく行うことができる。原則的には、あらゆる高等真核
細胞培養物が脊椎動物あるいは非脊椎動物培養物由来を
問わず使用可能であるが、ヒトなどの哺乳動物由来の細
胞が好ましい。これら細胞の培養物中での増幅は自体周
知である［Tissue Culture,Academic Press,Kruseおよ
びPatterson編（1973）を参照］。有用な哺乳動物宿主
セルラインの例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣セルライン、WI38、BHK、COS−７、MDCK
セルライン、およびヒト胚腎セルライン293である。
宿主細胞を上記の発現またはクローニングベクターで
形質転換し、プロモーターの誘導または増幅遺伝子を含
む形質転換体の選択に適するように修飾された通常の栄
養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は、クロー
ニングまたは発現のために選択した宿主細胞でこれまで
用いられている条件が適当であり（それぞれの場合に応
じて）、当業者には明らかであろう。
形質転換し、プロモーターの誘導または増幅遺伝子を含
む形質転換体の選択に適するように修飾された通常の栄
養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は、クロー
ニングまたは発現のために選択した宿主細胞でこれまで
用いられている条件が適当であり（それぞれの場合に応
じて）、当業者には明らかであろう。
sDAFは分泌タンパク質として培養培地から回収するの
が好ましいが、分泌シグナルなしで直接発現させるとき
には宿主細胞溶菌液から回収することもできる。第１段
階として、培養培地または溶菌液を遠心して個々の細胞
残骸を除去する。また、DAFは不純な可溶性タンパク質
から、例えば選別カラム（例えば、ConA）による吸着、
溶離、抗−sDAFもしくは抗−mDAF免疫アフィニティーカ
ラムによる吸着およびそれからの溶離によって精製され
る。これとは別に、他の方法、例えばアルキル・セファ
ロース、シリカまたはアニオンもしくはカチオン交換樹
脂によるクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動を用い
てsDAFを不純物から分離する。sDAFは、Medof et al.,
（1984;同上）の方法を用いて形質転換体細胞膜から回
収する。疎水性トランスメンブラン領域および／または
mDAFホスファチジルイノシトール結合残基が削除されて
いるか、または置換されているmDAF変異体はsDAFと同じ
方法で回収されるが、トランスメンブラン領域が無傷の
ままである変異体は形質転換体細胞膜から回収される。
が好ましいが、分泌シグナルなしで直接発現させるとき
には宿主細胞溶菌液から回収することもできる。第１段
階として、培養培地または溶菌液を遠心して個々の細胞
残骸を除去する。また、DAFは不純な可溶性タンパク質
から、例えば選別カラム（例えば、ConA）による吸着、
溶離、抗−sDAFもしくは抗−mDAF免疫アフィニティーカ
ラムによる吸着およびそれからの溶離によって精製され
る。これとは別に、他の方法、例えばアルキル・セファ
ロース、シリカまたはアニオンもしくはカチオン交換樹
脂によるクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動を用い
てsDAFを不純物から分離する。sDAFは、Medof et al.,
（1984;同上）の方法を用いて形質転換体細胞膜から回
収する。疎水性トランスメンブラン領域および／または
mDAFホスファチジルイノシトール結合残基が削除されて
いるか、または置換されているmDAF変異体はsDAFと同じ
方法で回収されるが、トランスメンブラン領域が無傷の
ままである変異体は形質転換体細胞膜から回収される。
天然のDAFはある条件のもとで集合する傾向を有して
いるので、少量のノニオン系界面活性剤［例えば、ツイ
ーン（Tween）またはポリエチレングリコール］を分離
中に加えることによってマルチマーの集合状態を安定化
させるのが有用であろう。また、PMSFなどのプロテアー
ゼ阻害物質は精製中のタンパク質加水分解を阻害するの
に有用であり、抗生物質を含有させて外来不純物の増殖
を防止してもよい。
いるので、少量のノニオン系界面活性剤［例えば、ツイ
ーン（Tween）またはポリエチレングリコール］を分離
中に加えることによってマルチマーの集合状態を安定化
させるのが有用であろう。また、PMSFなどのプロテアー
ゼ阻害物質は精製中のタンパク質加水分解を阻害するの
に有用であり、抗生物質を含有させて外来不純物の増殖
を防止してもよい。
天然のDAFに適した精製方法が、組換え細胞培養物中
で発現させたDAFまたはその変異体の性質の変化に鑑み
て、修飾を必要とすることもあることは当業者の認める
ところであろう。例えば、原核細胞の培養中に産生され
たDAFポリペプチドはグリコシル化されていないので、C
on−Ａセファロースに吸着しないであろう。この場合に
は、他の方法、例えばゲル電気泳動、イオン交換または
免疫アフィニティー精製などを用いるべきである。同様
に、sDAF脂質不含のＣ−末端mDAF変異体は、mDAFのよう
には容易に疎水性吸着剤に吸着しないであろう。適切な
精製法は特定の組換えDAFの性質に依存しており、当業
者には明らかであろう。
で発現させたDAFまたはその変異体の性質の変化に鑑み
て、修飾を必要とすることもあることは当業者の認める
ところであろう。例えば、原核細胞の培養中に産生され
たDAFポリペプチドはグリコシル化されていないので、C
on−Ａセファロースに吸着しないであろう。この場合に
は、他の方法、例えばゲル電気泳動、イオン交換または
免疫アフィニティー精製などを用いるべきである。同様
に、sDAF脂質不含のＣ−末端mDAF変異体は、mDAFのよう
には容易に疎水性吸着剤に吸着しないであろう。適切な
精製法は特定の組換えDAFの性質に依存しており、当業
者には明らかであろう。
DAFはナトリウム、カリウム、リン酸、塩酸などのイ
オンとの非毒性塩として調製される。通常、DAFはリン
酸緩衝食塩水中で保存されるか、または糖アルコール類
（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、モノサ
ッカリド類（例えば、グルコース、マンノース、ガラク
トースまたはフルクトース）、オリゴサッカリド類（例
えば、マルトース、ラクトースまたはスクロース）、お
よびタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む
賦形剤の存在下に凍結乾燥してもよい。
オンとの非毒性塩として調製される。通常、DAFはリン
酸緩衝食塩水中で保存されるか、または糖アルコール類
（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、モノサ
ッカリド類（例えば、グルコース、マンノース、ガラク
トースまたはフルクトース）、オリゴサッカリド類（例
えば、マルトース、ラクトースまたはスクロース）、お
よびタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む
賦形剤の存在下に凍結乾燥してもよい。
また、上記の賦形剤は水溶液保存したときの不活性化
または沈澱に対するDAFの安定性に寄与することもあ
り、通常の他の安定化剤とともに用いられることもあ
る。そのような安定化剤には、キレート化剤（例えば、
EDTA）、抗酸化剤（例えば、アスコルベートまたはジチ
オトレイトール）、アミノ酸、およびノニオン系界面活
性剤（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールとポリプロピレングリコールのブロック
コポリマー）が含まれる。
または沈澱に対するDAFの安定性に寄与することもあ
り、通常の他の安定化剤とともに用いられることもあ
る。そのような安定化剤には、キレート化剤（例えば、
EDTA）、抗酸化剤（例えば、アスコルベートまたはジチ
オトレイトール）、アミノ酸、およびノニオン系界面活
性剤（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールとポリプロピレングリコールのブロック
コポリマー）が含まれる。
DAFは、免疫機能障害または誤指向性、特に体液免疫
応答における欠損から派生する種々の障害を改善するた
めにヒトまたは動物に投与される。その例には、PNH、
炎症、例えば炎症性腸障害（大腸炎）、リウマチ性関節
炎、異型移植拒絶などが含まれる。DAFによる治療は、
そのような障害の発生の初期に始められるべきである。
応答における欠損から派生する種々の障害を改善するた
めにヒトまたは動物に投与される。その例には、PNH、
炎症、例えば炎症性腸障害（大腸炎）、リウマチ性関節
炎、異型移植拒絶などが含まれる。DAFによる治療は、
そのような障害の発生の初期に始められるべきである。
治療用DAF組成物は、薬理学的に許容しうる担体中に
治療学的有効量をDAFを含んでいる。選択される容量、
担体および投与経路は、各種因子の中で、特に治療され
るべき障害または異常、患者の状態、望ましい投与経
路、および選択したDAF変異体の活性に依存するであろ
う。これは、治療過程の中で医師によって容易に決定お
よびモニターされる。
治療学的有効量をDAFを含んでいる。選択される容量、
担体および投与経路は、各種因子の中で、特に治療され
るべき障害または異常、患者の状態、望ましい投与経
路、および選択したDAF変異体の活性に依存するであろ
う。これは、治療過程の中で医師によって容易に決定お
よびモニターされる。
DAFの注入または注射のための担体は、滅菌等張水溶
液、例えば注射用食塩水または５％デキストロースであ
る。これらの調製物は、鼻内、皮下、静脈内、腹腔内、
またはその他の通常の投与経路で注射または注入され
る。また、調製物は関節の滑液にも注射される。
液、例えば注射用食塩水または５％デキストロースであ
る。これらの調製物は、鼻内、皮下、静脈内、腹腔内、
またはその他の通常の投与経路で注射または注入され
る。また、調製物は関節の滑液にも注射される。
また、DAFは持続放出担体中に加えられる。適当な例
には、一定の形状を有する半透過性の高分子マトリック
ス（例えば、座剤またはマイクロカプセル）が含まれ
る。移植可能な、またはマイクロカプセル持続放出マト
リックスには、ポリラクチド（米国特許3,773,919;EP 5
8,481）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グリタメ
ートのコポリマー（U.Sidman et al.,1983,Biopolymers
22（１）:547−556）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメ
タクリレート）（R.Langer et al.,1981,J.Biomed.Mate
r.Res. 15:167−277およびR.Langer,1982,Chem.Tech. 12:
98−105）、エチレンビニルアセネート（R.Langer et a
l.;同上）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドキシ酪
酸（EP 133,988A）が含まれる。また、持続放出DAF組成
物にはリポソームによって捕捉されたDAFが含まれる。D
AFを含有するリポソームは自体既知の方法によって調製
される（DE 3,218,121A;Epstein et al.,1985,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 82:3688−3692;Hwang et al.,1980,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030−4034;EP 52322A;EP 3667
6A;EP 88046A;EP 143949A;EP 142641A;日本特許出願83
−118008;米国特許4.485,045および4,544,545;およびEP
102,324A）。通常、リポソームは小さい（約200〜800
Å）単一膜型のものであり、脂質含量は約30モル％コレ
ステロール以上であり、この選択した割合はDAF漏出の
最適速度に調節されている。
には、一定の形状を有する半透過性の高分子マトリック
ス（例えば、座剤またはマイクロカプセル）が含まれ
る。移植可能な、またはマイクロカプセル持続放出マト
リックスには、ポリラクチド（米国特許3,773,919;EP 5
8,481）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グリタメ
ートのコポリマー（U.Sidman et al.,1983,Biopolymers
22（１）:547−556）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメ
タクリレート）（R.Langer et al.,1981,J.Biomed.Mate
r.Res. 15:167−277およびR.Langer,1982,Chem.Tech. 12:
98−105）、エチレンビニルアセネート（R.Langer et a
l.;同上）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドキシ酪
酸（EP 133,988A）が含まれる。また、持続放出DAF組成
物にはリポソームによって捕捉されたDAFが含まれる。D
AFを含有するリポソームは自体既知の方法によって調製
される（DE 3,218,121A;Epstein et al.,1985,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 82:3688−3692;Hwang et al.,1980,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030−4034;EP 52322A;EP 3667
6A;EP 88046A;EP 143949A;EP 142641A;日本特許出願83
−118008;米国特許4.485,045および4,544,545;およびEP
102,324A）。通常、リポソームは小さい（約200〜800
Å）単一膜型のものであり、脂質含量は約30モル％コレ
ステロール以上であり、この選択した割合はDAF漏出の
最適速度に調節されている。
持続放出のDAF調製物は、炎症または治療部位の近接
部、例えば関節の近く、炎症腸組織に移植または注射さ
れる。
部、例えば関節の近く、炎症腸組織に移植または注射さ
れる。
DAFに対して生成させたポリクローナルのウサギまた
はネズミ抗血清がMedof et al.（1984;同上）によって
記載されている。抗血清は、DAFの免疫アフィニティー
精製またはDAFのELISA検定において用いられる。sDAFの
特有のＣ−末端に特異的な抗体は次のように調製され
る：即ち、動物を免疫原のsDAFコンジュゲート（例え
ば、本明細書の他の箇所に記載したような組換え細胞培
養物中で調製された免疫原融合体）に対して免疫し、次
いで、mDAFエピトープに指向性の抗体を吸着させるため
に抗血清を固定化mDAFのカラムに通し、吸着されなかっ
た抗血清を125I−sDAF［125I−mDAFと実質的に同じ方法
で調製;Medof et al.,1984（同上）］の存在下でインキ
ュベートして特有のsDAFエピトープを未吸着抗血清中の
抗−sDAF抗体に結合させ、そして未結合の125I−sDAFの
量を測定することにより（例えば、プロテインＡセファ
ロースへの吸着によって）、抗−sDAF力価の存在につい
てスクリーニングすることによって調製される。
はネズミ抗血清がMedof et al.（1984;同上）によって
記載されている。抗血清は、DAFの免疫アフィニティー
精製またはDAFのELISA検定において用いられる。sDAFの
特有のＣ−末端に特異的な抗体は次のように調製され
る：即ち、動物を免疫原のsDAFコンジュゲート（例え
ば、本明細書の他の箇所に記載したような組換え細胞培
養物中で調製された免疫原融合体）に対して免疫し、次
いで、mDAFエピトープに指向性の抗体を吸着させるため
に抗血清を固定化mDAFのカラムに通し、吸着されなかっ
た抗血清を125I−sDAF［125I−mDAFと実質的に同じ方法
で調製;Medof et al.,1984（同上）］の存在下でインキ
ュベートして特有のsDAFエピトープを未吸着抗血清中の
抗−sDAF抗体に結合させ、そして未結合の125I−sDAFの
量を測定することにより（例えば、プロテインＡセファ
ロースへの吸着によって）、抗−sDAF力価の存在につい
てスクリーニングすることによって調製される。
そのような抗血清中のsDAF特異的な抗体は、固定化mD
AFによる吸着、未吸着分画の回収、固定化sDAFによる吸
着およびpH4〜６緩衝液による溶離によって、mDAF抗体
を実質的に含まないsDAF特異的な抗体を回収することに
よって調製する。別法では、抗−sDAF中和力価を示す免
疫された動物からの脾細胞を回収し、ミエローマ細胞と
融合させるか、または既知の方法によりEBウイルスで形
質転換し、モノクローナルなsDAF特異的な抗体を調製す
る。
AFによる吸着、未吸着分画の回収、固定化sDAFによる吸
着およびpH4〜６緩衝液による溶離によって、mDAF抗体
を実質的に含まないsDAF特異的な抗体を回収することに
よって調製する。別法では、抗−sDAF中和力価を示す免
疫された動物からの脾細胞を回収し、ミエローマ細胞と
融合させるか、または既知の方法によりEBウイルスで形
質転換し、モノクローナルなsDAF特異的な抗体を調製す
る。
DAFの中和抗体は、DAF活性を有する抗イディオタイプ
抗体を生成させるための抗原として免疫原性ポリペプチ
ドにコンジュゲートさせるときに有用である。そのよう
な抗イディオタイプ抗体はDAFと同じ診断および治療目
的に有用である。
抗体を生成させるための抗原として免疫原性ポリペプチ
ドにコンジュゲートさせるときに有用である。そのよう
な抗イディオタイプ抗体はDAFと同じ診断および治療目
的に有用である。
実施例を簡単にするため、頻繁に出てくる方法の一部
は簡略して表現されている。
は簡略して表現されている。
「プラスミド」は、小文字ｐ、それに先立つおよび／
またはそれに続く大文字、および／または数字を表す。
本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能である
か、制限のない状態でだれでも入手可能であるか、また
はそのような入手可能なプラスミドから公知の方法に従
って構築することができる。さらに、その他の等価なプ
ラスミドが当分野で知られているが、これらは当業者に
は明らかであろう。
またはそれに続く大文字、および／または数字を表す。
本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能である
か、制限のない状態でだれでも入手可能であるか、また
はそのような入手可能なプラスミドから公知の方法に従
って構築することができる。さらに、その他の等価なプ
ラスミドが当分野で知られているが、これらは当業者に
は明らかであろう。
DNAの「消化」とは、DNA中のある位置にだけ作用する
酵素によるDNAの触媒的切断を意味する。そのような酵
素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞれが特異的である部
位は制限部位と呼ばれている。本発明で用いられる多種
の制限酵素は市販品から入手可能であり、酵素供給元に
よって確立された反応条件、補助因子、およびその他の
必要条件を用いた。通常、制限酵素は、それぞれの制限
酵素が最初に得られた微生物を示す大文字とそれに続く
他の文字、およびそれに続く特定の酵素を示す数字から
なる短縮形で表される。通常、約１μｇのプラスミドま
たはDNAフラグメントを約20μの緩衝液中、約２単位
の酵素とともに用いる。特定の制限酵素のための適切な
緩衝液および基質量は製造元によって指定されている。
通常は37℃で約１時間のインキュベート時間を用いた
が、供給元の指示に従って変えることもある。インキュ
ベートの後、タンパク質をフェノールおよびクロロホル
ムによる抽出によって除去し、消化した核酸をエタノー
ルによる沈澱によって水性分画から回収する。時には、
制限酵素による消化に続いて末端５′ホスフェートの細
菌性アルカリホスファターゼ加水分解を行って、DNAフ
ラグメントの２つの制限切断末端が「環状化」または閉
じた環を形成すること（別のDNAフラグメントのこの制
限部位への挿入を妨げる）を防止する。特に記載がなけ
れば、プラスミドの消化に続いて５′末端の脱ホスホリ
ル化を行うことはない。脱ホスホリル化の方法および試
薬は通常のものである（T.Maniatis et al.,1982,Molec
ular Cloning,pp.133−134）。
酵素によるDNAの触媒的切断を意味する。そのような酵
素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞれが特異的である部
位は制限部位と呼ばれている。本発明で用いられる多種
の制限酵素は市販品から入手可能であり、酵素供給元に
よって確立された反応条件、補助因子、およびその他の
必要条件を用いた。通常、制限酵素は、それぞれの制限
酵素が最初に得られた微生物を示す大文字とそれに続く
他の文字、およびそれに続く特定の酵素を示す数字から
なる短縮形で表される。通常、約１μｇのプラスミドま
たはDNAフラグメントを約20μの緩衝液中、約２単位
の酵素とともに用いる。特定の制限酵素のための適切な
緩衝液および基質量は製造元によって指定されている。
通常は37℃で約１時間のインキュベート時間を用いた
が、供給元の指示に従って変えることもある。インキュ
ベートの後、タンパク質をフェノールおよびクロロホル
ムによる抽出によって除去し、消化した核酸をエタノー
ルによる沈澱によって水性分画から回収する。時には、
制限酵素による消化に続いて末端５′ホスフェートの細
菌性アルカリホスファターゼ加水分解を行って、DNAフ
ラグメントの２つの制限切断末端が「環状化」または閉
じた環を形成すること（別のDNAフラグメントのこの制
限部位への挿入を妨げる）を防止する。特に記載がなけ
れば、プラスミドの消化に続いて５′末端の脱ホスホリ
ル化を行うことはない。脱ホスホリル化の方法および試
薬は通常のものである（T.Maniatis et al.,1982,Molec
ular Cloning,pp.133−134）。
「充填」または「平滑化」は、制限酵素切断した核酸
の付着末端の１本鎖末端が２本鎖に変換される過程を意
味する。これにより付着末端が削除され、平滑末端が形
成される。この方法は、１つだけまたはいくつかの別の
制限酵素によって創製される末端に付着するかもしれな
い制限切断末端を、いずれかの平滑切断する制限エンド
ヌクレアーゼの末端または他の充填された付着末端と適
合する末端に変換するための多用途の方法である。通
常、平滑化は、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、5
0mM NaCl、10mMトリス（pH7.5）緩衝液中、DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウ・フラグメント（８単位）および４種
のデオキシヌクレオシド三リン酸（それぞれ250μＭ）
の存在下、約37℃で標的DNA（２〜15μｇ）をインキュ
ベートすることによって行う。通常、このインキュベー
トはフェノールおよびクロロホルム抽出ならびにエタノ
ール沈澱によって30分後に停止させる。
の付着末端の１本鎖末端が２本鎖に変換される過程を意
味する。これにより付着末端が削除され、平滑末端が形
成される。この方法は、１つだけまたはいくつかの別の
制限酵素によって創製される末端に付着するかもしれな
い制限切断末端を、いずれかの平滑切断する制限エンド
ヌクレアーゼの末端または他の充填された付着末端と適
合する末端に変換するための多用途の方法である。通
常、平滑化は、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、5
0mM NaCl、10mMトリス（pH7.5）緩衝液中、DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウ・フラグメント（８単位）および４種
のデオキシヌクレオシド三リン酸（それぞれ250μＭ）
の存在下、約37℃で標的DNA（２〜15μｇ）をインキュ
ベートすることによって行う。通常、このインキュベー
トはフェノールおよびクロロホルム抽出ならびにエタノ
ール沈澱によって30分後に停止させる。
制限消化物からのあるDNAフラグメントの「回収」ま
たは「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミド
またはアガロースゲルでの消化物の分離、その移動度と
既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度の比較
による目的フラグメントの同定、目的のフラグメントを
含有しているゲル切片の取り出し、およびゲルからのDN
Aの分離を意味する。この方法は広く知られている。例
えば、R.Lawn et al.,1981,Nucleic Acids Res. ９:6103
−6114およびゲデルらD.Goeddel et al.,1980,Nucleic
Acids Res. ８:4057を参照。
たは「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミド
またはアガロースゲルでの消化物の分離、その移動度と
既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度の比較
による目的フラグメントの同定、目的のフラグメントを
含有しているゲル切片の取り出し、およびゲルからのDN
Aの分離を意味する。この方法は広く知られている。例
えば、R.Lawn et al.,1981,Nucleic Acids Res. ９:6103
−6114およびゲデルらD.Goeddel et al.,1980,Nucleic
Acids Res. ８:4057を参照。
「ノーザン」ブロットは、既知のラベルされたオリゴ
ヌクレオチドまたはDNAフラグメントへのハイブリダイ
ゼーションによって細胞mRNAの存在を確認する方法であ
る。本発明のためには、他に記載がなければ、ノーザン
分析はT.Maniatis et al.,p.202（同上）が記載してい
るような、変性原（ホルムアルデヒド-7％）の存在下の
１％アガロースでのmRNAの電気泳動分離、ニトロセルロ
ースへの移動、ラベルしたフラグメントとのハイブリダ
イゼーションを意味するものとする。
ヌクレオチドまたはDNAフラグメントへのハイブリダイ
ゼーションによって細胞mRNAの存在を確認する方法であ
る。本発明のためには、他に記載がなければ、ノーザン
分析はT.Maniatis et al.,p.202（同上）が記載してい
るような、変性原（ホルムアルデヒド-7％）の存在下の
１％アガロースでのmRNAの電気泳動分離、ニトロセルロ
ースへの移動、ラベルしたフラグメントとのハイブリダ
イゼーションを意味するものとする。
「形質転換」とは、DNAが染色体外要素または染色体
組込み体として複製可能なように生物中にDNAを導入す
ることを意味する。特に記さなければ、本発明で大腸菌
の形質転換に用いた方法はMand el et al.,1970,J.Mol.
Biol. 53:154］のCaCl2法である。
組込み体として複製可能なように生物中にDNAを導入す
ることを意味する。特に記さなければ、本発明で大腸菌
の形質転換に用いた方法はMand el et al.,1970,J.Mol.
Biol. 53:154］のCaCl2法である。
「ライゲート（連結）」とは、２つの２本鎖核酸フラ
グメントの間でホスホジエステル結合を形成させる過程
を指す（T.Maniatis et al.,p.146;同上）。特に記さな
ければライゲートは、ライゲートしようとするほぼ等し
い量のDNAフラグメント（0.5μｇ）に対してT4 DNAリガ
ーゼ（「リガーゼ」）（10単位）を用い、既知の緩衝液
および条件を用いて行う。
グメントの間でホスホジエステル結合を形成させる過程
を指す（T.Maniatis et al.,p.146;同上）。特に記さな
ければライゲートは、ライゲートしようとするほぼ等し
い量のDNAフラグメント（0.5μｇ）に対してT4 DNAリガ
ーゼ（「リガーゼ」）（10単位）を用い、既知の緩衝液
および条件を用いて行う。
形質転換体からのDNAの「調製」とは、微生物培養物
からのプラスミドDNAの単離を意味する。他に記載がな
ければ、Maniatis et al.,p.90（同上）のアルカリ/SDS
法を用いてよい。
からのプラスミドDNAの単離を意味する。他に記載がな
ければ、Maniatis et al.,p.90（同上）のアルカリ/SDS
法を用いてよい。
「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法によって化
学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲルで精製
された短い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオ
チドである。
学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲルで精製
された短い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオ
チドである。
以下に挙げる実施例は、今わかっている本発明実施の
最良の態様を単に説明するためのものであり、本発明は
これらに限定されるものではない。
最良の態様を単に説明するためのものであり、本発明は
これらに限定されるものではない。
実施例１ ヒトDAFのクローニング、DAFをコードしてい
るcDNAクローンの同定 ヒトDAFを均質になるまで精製し、Ｎ−末端配列の23
アミノ酸を決定した。これらの５つのアンビギュアスで
あった。
るcDNAクローンの同定 ヒトDAFを均質になるまで精製し、Ｎ−末端配列の23
アミノ酸を決定した。これらの５つのアンビギュアスで
あった。
このアミノ酸配列に基づく69merのオリゴヌクレオチ
ドプローブをインビトロで合成した。23Pラベルした
（キナーゼ処理した）プローブは次のヌクレオチド配列
を有していた： Hela細胞γcDNAライブラリー（約1x106組換え体）を、
この69merを用いて厳格性の低い条件下でスクリーニン
グした。唯１つのDAFクローン（γ21）が、６つの偽ポ
ジティブ（配列決定により、これらはプローブとの限定
された核酸の相同性を有しているが、全く異なるアミノ
酸配列を有していることがわかった）とともに同定され
た。γ21は次の配列をコードしている挿入体を含有して
いた： Asp.Cys.Gly.Leu.Pro.Pro.Asp.Val.Pro.Asn.Ala.Gln.Pr
o.Ala.Leu、Glu.Gly.Arg.Thr.Ser.Ple.Pro.Gly．［配列
中、下線を引いた残基はアミノ末端配列決定によって同
定された残基とは異なっていた］。
ドプローブをインビトロで合成した。23Pラベルした
（キナーゼ処理した）プローブは次のヌクレオチド配列
を有していた： Hela細胞γcDNAライブラリー（約1x106組換え体）を、
この69merを用いて厳格性の低い条件下でスクリーニン
グした。唯１つのDAFクローン（γ21）が、６つの偽ポ
ジティブ（配列決定により、これらはプローブとの限定
された核酸の相同性を有しているが、全く異なるアミノ
酸配列を有していることがわかった）とともに同定され
た。γ21は次の配列をコードしている挿入体を含有して
いた： Asp.Cys.Gly.Leu.Pro.Pro.Asp.Val.Pro.Asn.Ala.Gln.Pr
o.Ala.Leu、Glu.Gly.Arg.Thr.Ser.Ple.Pro.Gly．［配列
中、下線を引いた残基はアミノ末端配列決定によって同
定された残基とは異なっていた］。
最初のDAFクローン（クローンλ21）は1395bpの長さ
であり、ポリＡ尾部を含有していたが、イニシエーター
のメチオニンを欠いていた。
であり、ポリＡ尾部を含有していたが、イニシエーター
のメチオニンを欠いていた。
DAF mRNAの大きさを測定するため、Hela細胞ポリＡ＋
RNAを含むノーザンブロットを32PラベルしたDAFλ21で
スクリーニングした。このプローブは、大きさがおよそ
1500bpおよび2000bpの２つのメッセージとハイブリダイ
ズした。これらはほぼ等しい強度であった。
RNAを含むノーザンブロットを32PラベルしたDAFλ21で
スクリーニングした。このプローブは、大きさがおよそ
1500bpおよび2000bpの２つのメッセージとハイブリダイ
ズした。これらはほぼ等しい強度であった。
５′または３′末端のいずれかに延長を有する長い方
のDAFクローンを同定するため、以下のように、λ21の
５′および３′末端から２つの小さい制限フラグメント
を単離した： これらのプローブを32Pでラベルし、そしてこれを用い
て別のDAF−コード化クローンについてHela cDNAライブ
ラリーを再スクリーニングした。さらに２つのクローン
DAFγ41およびDAFγ47が同定された。これらは両プロ
ーブとハイブリダイズし、DAFγ21挿入体よりも長く、
それぞれ約2,000bpおよび2,200bpであった。これら両ク
ローンは、ポリＡ尾部の前に約780bpの付加的な３′非
翻訳化配列を含んでいた。このDAF遺伝子の３′非翻訳
化配列は多数のポリアデニル化シグナル（AATAAA）を含
んでおり、上流または下流のシグナルのいずれかを約1,
500bpまたは約2,000bpのmRNAのどちらかを生成させるた
めに用いることができるようである。
のDAFクローンを同定するため、以下のように、λ21の
５′および３′末端から２つの小さい制限フラグメント
を単離した： これらのプローブを32Pでラベルし、そしてこれを用い
て別のDAF−コード化クローンについてHela cDNAライブ
ラリーを再スクリーニングした。さらに２つのクローン
DAFγ41およびDAFγ47が同定された。これらは両プロ
ーブとハイブリダイズし、DAFγ21挿入体よりも長く、
それぞれ約2,000bpおよび2,200bpであった。これら両ク
ローンは、ポリＡ尾部の前に約780bpの付加的な３′非
翻訳化配列を含んでいた。このDAF遺伝子の３′非翻訳
化配列は多数のポリアデニル化シグナル（AATAAA）を含
んでおり、上流または下流のシグナルのいずれかを約1,
500bpまたは約2,000bpのmRNAのどちらかを生成させるた
めに用いることができるようである。
５′末端については、クローンDAFγ41はDAFγ21より
も55bp長く、翻訳開始のためのATGを含んでいた。クロ
ーンDAFγ47はその５′末端がDAFγ21よりも93bp短かっ
た。
も55bp長く、翻訳開始のためのATGを含んでいた。クロ
ーンDAFγ47はその５′末端がDAFγ21よりも93bp短かっ
た。
クローンDAF33も同定したが、これは５′プローブと
だけハイブリダイズした。このクローンはその５′末端
がDAFγ21よりも71bp長く、従って５′方向の最も長い
延長を示した。
だけハイブリダイズした。このクローンはその５′末端
がDAFγ21よりも71bp長く、従って５′方向の最も長い
延長を示した。
DAFγ21およびDAFγ41はタンパク質の暗号領域が完全
に重なっており、440アミノ酸のタンパク質をコードし
ていた。DAFγ47およびDAFγ33は、DAFγ21およびDAFγ
41と比較すると暗号領域の明らかな118bpの「欠失」を
含んでいた。さらに詳しく調べると、DAFγ21およびDAF
γ41はスプライスされていない（除去されていない）11
8bpのイントロンを含んでいるようであった。続いてさ
らに２つのクローンDAFγ35およびDAFγ37を同定した
が、その１つは同じイントロンを含んでおり、他方は含
んでいなかった。
に重なっており、440アミノ酸のタンパク質をコードし
ていた。DAFγ47およびDAFγ33は、DAFγ21およびDAFγ
41と比較すると暗号領域の明らかな118bpの「欠失」を
含んでいた。さらに詳しく調べると、DAFγ21およびDAF
γ41はスプライスされていない（除去されていない）11
8bpのイントロンを含んでいるようであった。続いてさ
らに２つのクローンDAFγ35およびDAFγ37を同定した
が、その１つは同じイントロンを含んでおり、他方は含
んでいなかった。
スプライスされていない形態がライブラリー中に存在
する頻度（６クローンのうち３クローン）は、スプライ
スされていないクローンが不適切にスプライスされたメ
ッセージであるとは考えにくいことを示唆する。むし
ろ、２つの形態のDAFタンパク質が存在するようであ
る。これら２つの形態はアミノ酸位置１〜327は同一で
あるが、異なるＣ−末端配列を有している。スプライス
されていない形態は付加的な79アミノ酸を含有してお
り、スプライスされた形態は付加的な20アミノ酸を含有
している。スプライスによってリーディング・フレーム
が変化するので、２つのタンパク質のＣ−末端の間には
相同性は存在しない。
する頻度（６クローンのうち３クローン）は、スプライ
スされていないクローンが不適切にスプライスされたメ
ッセージであるとは考えにくいことを示唆する。むし
ろ、２つの形態のDAFタンパク質が存在するようであ
る。これら２つの形態はアミノ酸位置１〜327は同一で
あるが、異なるＣ−末端配列を有している。スプライス
されていない形態は付加的な79アミノ酸を含有してお
り、スプライスされた形態は付加的な20アミノ酸を含有
している。スプライスによってリーディング・フレーム
が変化するので、２つのタンパク質のＣ−末端の間には
相同性は存在しない。
２つのDAFタンパク質のハイドロパシー（hydropath
y）プロットから、およびその特徴がよく調べられてい
るThy−１膜結合糖タンパク質との比較から、スプライ
スされたDAF cDNAは膜結合DAFの合成を指令し、一方、
スプライスされていない形態は可溶型をコードしている
ものと結論される。
y）プロットから、およびその特徴がよく調べられてい
るThy−１膜結合糖タンパク質との比較から、スプライ
スされたDAF cDNAは膜結合DAFの合成を指令し、一方、
スプライスされていない形態は可溶型をコードしている
ものと結論される。
実施例２ 組換え細胞培養におけるDAFの発現 実施例１のクローンDAFγ33、γ41およびγ47をそれ
ぞれpUC19（大腸菌用の容易に入手できるクローニング
ベクター）中にサブクローンした。これは、γクローン
のそれぞれをEcoR Iで消化し、それぞれからDAF挿入体
を回収し、pUC19をEcoR Iで消化し、開いたpUC19に挿入
体を連結（ライゲート）し、そしてそれぞれの連結混合
物で大腸菌294を形質転換することによって行った。pUC
1933、pUC1941およびpUC1947をアンピシリン耐性のコロ
ニーから回収した。
ぞれpUC19（大腸菌用の容易に入手できるクローニング
ベクター）中にサブクローンした。これは、γクローン
のそれぞれをEcoR Iで消化し、それぞれからDAF挿入体
を回収し、pUC19をEcoR Iで消化し、開いたpUC19に挿入
体を連結（ライゲート）し、そしてそれぞれの連結混合
物で大腸菌294を形質転換することによって行った。pUC
1933、pUC1941およびpUC1947をアンピシリン耐性のコロ
ニーから回収した。
pUC1933、pUC1941およびpUC1947をそれぞれEcoR Iお
よびHind IIIで消化し、DAF遺伝子の５′末端、並びにs
DAFおよびmDAF遺伝子の３′末端をそれぞれ含有するフ
ラグメント（それぞれ、Ｉ、IIおよびIII）を回収し
た。EcoR Iで消化したpUC19を３者（three way）連結で
フラグメントＩおよびIIに連結し、アンピシリン耐性の
大腸菌コロニーからpUC19sDAFを回収した。これは、第2
a〜2g図に示した完全なsDAF遺伝子のサブクローンであ
った。
よびHind IIIで消化し、DAF遺伝子の５′末端、並びにs
DAFおよびmDAF遺伝子の３′末端をそれぞれ含有するフ
ラグメント（それぞれ、Ｉ、IIおよびIII）を回収し
た。EcoR Iで消化したpUC19を３者（three way）連結で
フラグメントＩおよびIIに連結し、アンピシリン耐性の
大腸菌コロニーからpUC19sDAFを回収した。これは、第2
a〜2g図に示した完全なsDAF遺伝子のサブクローンであ
った。
フラグメントIIの代わりにフラグメントIIIを用いた
こと以外は、pUC19sDAFと同じ方法でpUC19mDAFを構築し
た。このサブクローンは第1a〜1f図の完全なmDAF遺伝子
を含有していた。
こと以外は、pUC19sDAFと同じ方法でpUC19mDAFを構築し
た。このサブクローンは第1a〜1f図の完全なmDAF遺伝子
を含有していた。
pE348HBVE400D22（また、pE342HBVE400D22;EP 117,05
8A）をHind IIIで消化し、DHFRを含有するフラグメント
を回収した。Hind III付着末端を充填し、このフラグメ
ントをCla Iで消化し、そして以下のフラグメントを単
離した： また、pE348MBV E400D22もCla IおよびSoc IIで消化
し、SV40起源およびHVsAgポリＡ配列を含有する990bpの
フラグメントを回収した（フラグメントｂ）。
8A）をHind IIIで消化し、DHFRを含有するフラグメント
を回収した。Hind III付着末端を充填し、このフラグメ
ントをCla Iで消化し、そして以下のフラグメントを単
離した： また、pE348MBV E400D22もCla IおよびSoc IIで消化
し、SV40起源およびHVsAgポリＡ配列を含有する990bpの
フラグメントを回収した（フラグメントｂ）。
pUCsDAFおよびpUCmDAFをEcoR Iで消化し、それぞれの
DAFをコードしているフラグメントを単離した（それぞ
れ、フラグメントC IIおよびC III）。
DAFをコードしているフラグメントを単離した（それぞ
れ、フラグメントC IIおよびC III）。
フラグメントC II、ａおよびｂを３者連結でライゲー
トし、大腸菌294にトランスフェクションした。pE348sD
AFをアンピシリン耐性のコロニーから回収した。これ
は、SV40sDAF初期プロモーターの３′に適切な配向でsD
AF遺伝子を含有する。このsDAF遺伝子は、哺乳動物宿主
細胞への導入ならびに該細胞中でのメトトレキセート選
択および増幅に適した発現ベクター中のSV40初期プロモ
ーターの支配下にある。
トし、大腸菌294にトランスフェクションした。pE348sD
AFをアンピシリン耐性のコロニーから回収した。これ
は、SV40sDAF初期プロモーターの３′に適切な配向でsD
AF遺伝子を含有する。このsDAF遺伝子は、哺乳動物宿主
細胞への導入ならびに該細胞中でのメトトレキセート選
択および増幅に適した発現ベクター中のSV40初期プロモ
ーターの支配下にある。
フラグメントC IIIを用いること以外は同じ方法でpE3
48mDAFを構築した。
48mDAFを構築した。
p342E（Crowley et al.,1983,Mol.Cell.Biol. ３:44−
55）をEcoR IおよびHpa Iで消化することによって別の
発現ベクターを構築し、ベクターフラグメントを回収
し、pUC19mDAFまたはpUC19sDAFをAcc I（mDAF用）また
は平滑Xho II（sDAF用）で消化し、充填し、EcoR Iで消
化し、そしてDAFをコードしているフラグメントを回収
した。このDAFフラグメントをベクターフラグメントに
連結し、発現ベクターを回収した。このベクターはDHFR
遺伝子を含有していないが、pFD11（Simonsen et al.,1
983,P.N.A.S.−USA 80:2495−99）との同時形質転換によ
って満足な結果が得られるであろう。
55）をEcoR IおよびHpa Iで消化することによって別の
発現ベクターを構築し、ベクターフラグメントを回収
し、pUC19mDAFまたはpUC19sDAFをAcc I（mDAF用）また
は平滑Xho II（sDAF用）で消化し、充填し、EcoR Iで消
化し、そしてDAFをコードしているフラグメントを回収
した。このDAFフラグメントをベクターフラグメントに
連結し、発現ベクターを回収した。このベクターはDHFR
遺伝子を含有していないが、pFD11（Simonsen et al.,1
983,P.N.A.S.−USA 80:2495−99）との同時形質転換によ
って満足な結果が得られるであろう。
pE348mDAFまたはpE348sDAFを常法によってDHFR-CHO細
胞中に同時トランスフェクションし、HAT培地に蒔き、
そして形質転換体を連続増加のメトトレキセート濃度を
有する培地での培養によって選択してDHFRおよびDAF遺
伝子を増幅した。安定にDAFを発現し、それを培養培地
中に分泌する形質転換体クローンを回収した。プロテイ
ンＡセファロース固定化のsDAFに対するウサギポリクロ
ーナル抗体を入れた免疫アフィニティーカラムへの吸着
およびpH5のグリシン緩衝液による溶離によって、培地
からsDAFを回収した。
胞中に同時トランスフェクションし、HAT培地に蒔き、
そして形質転換体を連続増加のメトトレキセート濃度を
有する培地での培養によって選択してDHFRおよびDAF遺
伝子を増幅した。安定にDAFを発現し、それを培養培地
中に分泌する形質転換体クローンを回収した。プロテイ
ンＡセファロース固定化のsDAFに対するウサギポリクロ
ーナル抗体を入れた免疫アフィニティーカラムへの吸着
およびpH5のグリシン緩衝液による溶離によって、培地
からsDAFを回収した。
同じ方法によってpE348mDAFをDHFR-CHO細胞に導入
し、そして増幅した。これまで赤血球ストロマ（海綿状
細胞膜）からmDAFを回収していた方法と実質的に同じ方
法による、宿主細胞膜のデタージェントリゼイトからの
単離によってmDAFを回収した。
し、そして増幅した。これまで赤血球ストロマ（海綿状
細胞膜）からmDAFを回収していた方法と実質的に同じ方
法による、宿主細胞膜のデタージェントリゼイトからの
単離によってmDAFを回収した。
実施例３ リン脂質アンカードメイン融合体の構築 本実施例では、スプライスされたcDNAによって予想さ
れる膜DAFの最後の37アミノ酸を、切り取りを行った形
態の単純疱疹ウイルス１型（HSV1）の糖タンパク質Ｄ
（gD−１）［Ｃ−末端の膜スパニングドメインを欠いて
いるので、通常、構成的に培養培地に分泌される;Lasky
et al.,Bio/Technology ２:527（1984）］のＣ−末端に
フレーム（枠）内で融合させた融合タンパク質を構築し
た。HSV gD−１の最初の300アミノ酸をコードしているH
ind III−Hinf Iフラグメントを、合成リンカーを介し
て、DAFのＣ−末端（残基316〜347）をコードしているX
mn I−EcoR Vフラグメントに連結した。合成Hinf IXmn
Iリンカー（５′−ATTCGCCAAATAAAGGAAGTGG−AACC）はg
D−１のアミノ酸301およびDAFのアミノ酸311〜317をコ
ードしており、フレーム内の融合を生じた。
れる膜DAFの最後の37アミノ酸を、切り取りを行った形
態の単純疱疹ウイルス１型（HSV1）の糖タンパク質Ｄ
（gD−１）［Ｃ−末端の膜スパニングドメインを欠いて
いるので、通常、構成的に培養培地に分泌される;Lasky
et al.,Bio/Technology ２:527（1984）］のＣ−末端に
フレーム（枠）内で融合させた融合タンパク質を構築し
た。HSV gD−１の最初の300アミノ酸をコードしているH
ind III−Hinf Iフラグメントを、合成リンカーを介し
て、DAFのＣ−末端（残基316〜347）をコードしているX
mn I−EcoR Vフラグメントに連結した。合成Hinf IXmn
Iリンカー（５′−ATTCGCCAAATAAAGGAAGTGG−AACC）はg
D−１のアミノ酸301およびDAFのアミノ酸311〜317をコ
ードしており、フレーム内の融合を生じた。
このgD−1/DAF融合タンパク質をコードしているDNA
を、CAT遺伝子の切除と融合DNAの挿入によって哺乳動物
発現ベクターのRSVプロモーターとSV40ポリアデニル化
配列の間に挿入し［Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 79:6777（1982）］、リン酸カルシウム同時沈澱法
によってCHO細胞中にトランスフェクションした［Wigle
r et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373（1979）、お
よびSimonsen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495
（1983）］。マウスのジヒドロ葉酸還元酵素cDNAは遺伝
子発現の選択マーカーを与えた［Simonsen et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495（1983）］。それぞれのコ
ロニーから得られた安定なセルラインを分析に用いた。
天然のgD−１または切り取りが為されたgD−１を発現し
ているセルラインを記載のようにして得た［Lasky et a
l.,Bio/Technology ２:527（1984）およびBerman et a
l.,Science 222:524（1983）］。得られた融合タンパク
質（第３図）は、シグナル配列を含むgD−１のＮ−末端
の75％（残基１〜300）、並びに２つの予想DAFタンパク
質の間で相違する20アミノ酸のセグメントおよび17アミ
ノ酸の隣接共通配列を含む膜DAFのＣ−末端の10％（37
アミノ酸）を含んでいる。gD−1/DAF融合タンパク質、
天然gD−１［Berman et al.,Science 222:524（198
3）］、および切り取りが為されたgD−１［Lasky et a
l.,Bio/Technology ２:527（1984）］をCHO細胞中で発現
させ、間接免疫蛍光法によって局在化させた。天然gD−
１またはgD−1/DAF融合体のどちらかを発現している透
過性にした細胞の内部ラベル化は、核周辺領域、おそら
くは小胞体における免疫蛍光の類似の局在を示した。切
り取りが為されたgD−１を発現している細胞は細胞質全
体に拡散した強い免疫蛍光を示した。完全長さの天然gD
−１を発現している無傷の（透過性にされていない）細
胞の免疫蛍光は、このタンパク質がそのトランスメンブ
ランドメインから予想されるように細胞表面に現れるこ
とを示す。対照的に、切り取り為された（分泌型）形態
のgD−１を発現している細胞においては表面のラベルは
検出されなかった。また、gD−1/DAF融合タンパク質を
発現している細胞も表面染色を示し、DAFのＣ−末端ド
メインの付加が分泌型（切り取り型）gD−１を再び原形
質膜に指向させることを示す。
を、CAT遺伝子の切除と融合DNAの挿入によって哺乳動物
発現ベクターのRSVプロモーターとSV40ポリアデニル化
配列の間に挿入し［Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 79:6777（1982）］、リン酸カルシウム同時沈澱法
によってCHO細胞中にトランスフェクションした［Wigle
r et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373（1979）、お
よびSimonsen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495
（1983）］。マウスのジヒドロ葉酸還元酵素cDNAは遺伝
子発現の選択マーカーを与えた［Simonsen et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495（1983）］。それぞれのコ
ロニーから得られた安定なセルラインを分析に用いた。
天然のgD−１または切り取りが為されたgD−１を発現し
ているセルラインを記載のようにして得た［Lasky et a
l.,Bio/Technology ２:527（1984）およびBerman et a
l.,Science 222:524（1983）］。得られた融合タンパク
質（第３図）は、シグナル配列を含むgD−１のＮ−末端
の75％（残基１〜300）、並びに２つの予想DAFタンパク
質の間で相違する20アミノ酸のセグメントおよび17アミ
ノ酸の隣接共通配列を含む膜DAFのＣ−末端の10％（37
アミノ酸）を含んでいる。gD−1/DAF融合タンパク質、
天然gD−１［Berman et al.,Science 222:524（198
3）］、および切り取りが為されたgD−１［Lasky et a
l.,Bio/Technology ２:527（1984）］をCHO細胞中で発現
させ、間接免疫蛍光法によって局在化させた。天然gD−
１またはgD−1/DAF融合体のどちらかを発現している透
過性にした細胞の内部ラベル化は、核周辺領域、おそら
くは小胞体における免疫蛍光の類似の局在を示した。切
り取りが為されたgD−１を発現している細胞は細胞質全
体に拡散した強い免疫蛍光を示した。完全長さの天然gD
−１を発現している無傷の（透過性にされていない）細
胞の免疫蛍光は、このタンパク質がそのトランスメンブ
ランドメインから予想されるように細胞表面に現れるこ
とを示す。対照的に、切り取り為された（分泌型）形態
のgD−１を発現している細胞においては表面のラベルは
検出されなかった。また、gD−1/DAF融合タンパク質を
発現している細胞も表面染色を示し、DAFのＣ−末端ド
メインの付加が分泌型（切り取り型）gD−１を再び原形
質膜に指向させることを示す。
gD−1/DAF融合体によってコードされているDAFのＣ−
末端セグメントはＣ−末端に17アミノ酸の疎水性領域を
含有しており、これは、翻訳後に除去され、PI−アンカ
ーで置換されると考えられている一時的な膜アンカーと
して作用するのかもしれない［Low,M.G.,J.Biochem. 24
4:1−13（1987）;Cross,G.A.M.,Cell 48:179−181（198
7）；およびCaras,I.W.et al.,Nature 325:545（198
7）］。上記の実験は、融合タンパク質がリン脂質アン
カーによってアンカーされているのか、または17アミノ
酸の疎水性領域によってアンカーされているのかを区別
しない。従って、結合の性質を調べるために、天然gD−
１またはgD−1/DAF融合体のどちらかを発現するCHO細胞
を、Staphylococcus aureus由来の精製したホスファチ
ジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（PI−PL
C）［Low,M.G.,Meth.Enzymol. 71:741（1981）］ととも
にインキュベートし、間接免疫蛍光および流れ血球計算
法（FACS）によって分析した。タンパク質加水分解不純
物を含まないPI−PLC［Low et al.,Nature 318:62（198
5）］で処理すると、対数で表した相対的な細胞蛍光の
顕著な減少によって示されるように、細胞表面のgD−1/
DAFの量がかなり減少した。通常、定量FACS分析によっ
て示されるように、70〜80％の細胞表面gD−1/DAFがPI
−PLCによって放出させられた。対照的に、細胞表面に
現れる完全長の天然gD−１はPI−PLCによる処理によっ
ては影響されなかった。この放出の特異性は、ホスファ
チジルイノシトールを加水分解しないClostridium perf
ringensまたはBacillus cereusのどちらか由来のホスホ
リパーゼＣ［Little,C.,Meth.Enzymol. 71:725（1981）
およびTakahashi,T.et al.,Meth.Enzymol. 71:710（198
1）］が原形質膜からgD−1/DAFを放出させなかったとい
う観察によってさらに確認された。
末端セグメントはＣ−末端に17アミノ酸の疎水性領域を
含有しており、これは、翻訳後に除去され、PI−アンカ
ーで置換されると考えられている一時的な膜アンカーと
して作用するのかもしれない［Low,M.G.,J.Biochem. 24
4:1−13（1987）;Cross,G.A.M.,Cell 48:179−181（198
7）；およびCaras,I.W.et al.,Nature 325:545（198
7）］。上記の実験は、融合タンパク質がリン脂質アン
カーによってアンカーされているのか、または17アミノ
酸の疎水性領域によってアンカーされているのかを区別
しない。従って、結合の性質を調べるために、天然gD−
１またはgD−1/DAF融合体のどちらかを発現するCHO細胞
を、Staphylococcus aureus由来の精製したホスファチ
ジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（PI−PL
C）［Low,M.G.,Meth.Enzymol. 71:741（1981）］ととも
にインキュベートし、間接免疫蛍光および流れ血球計算
法（FACS）によって分析した。タンパク質加水分解不純
物を含まないPI−PLC［Low et al.,Nature 318:62（198
5）］で処理すると、対数で表した相対的な細胞蛍光の
顕著な減少によって示されるように、細胞表面のgD−1/
DAFの量がかなり減少した。通常、定量FACS分析によっ
て示されるように、70〜80％の細胞表面gD−1/DAFがPI
−PLCによって放出させられた。対照的に、細胞表面に
現れる完全長の天然gD−１はPI−PLCによる処理によっ
ては影響されなかった。この放出の特異性は、ホスファ
チジルイノシトールを加水分解しないClostridium perf
ringensまたはBacillus cereusのどちらか由来のホスホ
リパーゼＣ［Little,C.,Meth.Enzymol. 71:725（1981）
およびTakahashi,T.et al.,Meth.Enzymol. 71:710（198
1）］が原形質膜からgD−1/DAFを放出させなかったとい
う観察によってさらに確認された。
DAFのグリコホスホ脂質アンカーは、ホスファチジル
イノシトールに加えてエタノールアミンおよびグルコサ
ミンを含有している［Medof et al.,Biochemistry 25:67
40（1986）］。グリコシル化されたリン脂質は、ポリペ
プチドの末端カルボキシル基とエタノールアミンのアミ
ン基の間のアミン結合によってタンパク質に結合される
ものと考えらえる［Low,M.G.,J.Biochem. 244:1−13（19
87）およびCross,G.A.M.,Cell 48:179−181（1987）］。
gD−1/DAF融合タンパク質がそのような構造によってア
ンカーされることを確認するため、細胞を［3H］エタノ
ールアミンまたは［35S］システインのどちらかで代謝
的にラベルし、タンパク質を免疫沈澱法で分析した。多
数の形態のgD−1/DAF、37kDの種、並びにそれぞれ約46k
Dおよび52kDの少なくとも２つの比較的大きい拡散度の
高い種が、gD−1/DAFを発現している細胞においての
み、HSV−１に対するポリクローナルおよびモノクロナ
ールの両抗体によって検出された。予備的なパルス−チ
ェース実験およびノイラミニダーゼによる実験は、37kD
の種が前駆体であり、一方、大きい方の種が成熟した高
度にグリコシル化された形態のタンパク質であることを
示唆した。46kDの種に対応する［3H］エタノールアミン
−ラベルされたバンドは前駆体であり、一方、大きい方
の種は成熟した高度にグリコシル化された形態のタンパ
ク質である。46kDおよび52kDの種に対応する［3H］エタ
ノールアミン−ラベルされたバンドは、37kDの種とは異
なり、gD−1/DAFを発現している細胞において特異的に
検出された。グリコホスホ脂質アンカーの結合は、脂質
アンカーされたタンパク質の生合成における初期の現象
であると考えられている［Medof et al.,Biochemistry 2
5:6740（1986）およびBerman et al.,Science 222:524
（1983）］。37kDのgD−1/DAF前駆体に対応する［3H］
エタノールアミン−ラベルされたバンドが存在しないの
は、本実験において細胞をラベルするのに用いた長いパ
ルス（16h）によるものであろう。天然のgD−１は
［3H］エタノールアミンでラベルされなかった。
イノシトールに加えてエタノールアミンおよびグルコサ
ミンを含有している［Medof et al.,Biochemistry 25:67
40（1986）］。グリコシル化されたリン脂質は、ポリペ
プチドの末端カルボキシル基とエタノールアミンのアミ
ン基の間のアミン結合によってタンパク質に結合される
ものと考えらえる［Low,M.G.,J.Biochem. 244:1−13（19
87）およびCross,G.A.M.,Cell 48:179−181（1987）］。
gD−1/DAF融合タンパク質がそのような構造によってア
ンカーされることを確認するため、細胞を［3H］エタノ
ールアミンまたは［35S］システインのどちらかで代謝
的にラベルし、タンパク質を免疫沈澱法で分析した。多
数の形態のgD−1/DAF、37kDの種、並びにそれぞれ約46k
Dおよび52kDの少なくとも２つの比較的大きい拡散度の
高い種が、gD−1/DAFを発現している細胞においての
み、HSV−１に対するポリクローナルおよびモノクロナ
ールの両抗体によって検出された。予備的なパルス−チ
ェース実験およびノイラミニダーゼによる実験は、37kD
の種が前駆体であり、一方、大きい方の種が成熟した高
度にグリコシル化された形態のタンパク質であることを
示唆した。46kDの種に対応する［3H］エタノールアミン
−ラベルされたバンドは前駆体であり、一方、大きい方
の種は成熟した高度にグリコシル化された形態のタンパ
ク質である。46kDおよび52kDの種に対応する［3H］エタ
ノールアミン−ラベルされたバンドは、37kDの種とは異
なり、gD−1/DAFを発現している細胞において特異的に
検出された。グリコホスホ脂質アンカーの結合は、脂質
アンカーされたタンパク質の生合成における初期の現象
であると考えられている［Medof et al.,Biochemistry 2
5:6740（1986）およびBerman et al.,Science 222:524
（1983）］。37kDのgD−1/DAF前駆体に対応する［3H］
エタノールアミン−ラベルされたバンドが存在しないの
は、本実験において細胞をラベルするのに用いた長いパ
ルス（16h）によるものであろう。天然のgD−１は
［3H］エタノールアミンでラベルされなかった。
gD−1/DAF融合タンパク質はホスファチジルイノシト
ールを介して原形質膜に結合されるものと結論された。
この結論は以下の証拠によって支持される。第１に、細
胞表面のgD−1/DAFは精製度の高いホスファチジルイノ
シトール特異的なホスホリパーゼＣによる消化に対して
感受性であったが、一方、天然のgD−１は影響を受けな
かった。第２に、特異性の広いホスホリパーゼがgD−1/
DAFの放出に有効ではなかった。第３に、gD−1/DAFはグ
リコホスホ脂質アンカーの成分である［3H］エタノール
アミンによって特異的にラベルされた。このように、リ
ン脂質膜アンカーの結合を指向させるために必要な情報
または「シグナル」は、DAFのＣ−末端の37アミノ酸内
に含まれている。Ｃ−末端配列が脂質を結合させる際に
ある役割を演じているというこの考えは、最近の、おそ
らくは別のmRNAスプライシングに由来するものと考えら
れる、多くの種類の神経細胞付着分子（Ｎ−CAM）mRNA
の同定によって支持される。これらのmRNAによってコー
ドされている別形態のＮ−CANは別のＣ−末端ドメイン
を有しており、疎水性の膜−スパニングドメインによっ
て、またはリン脂質によって膜結合することになること
は明らかである［Hemperly et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 83:9822（1986）］。PI−アンカーされるタンパク
質にとって利用可能なＣ−末端アミノ酸配列を調べる
と、明確な相同性はないことがわかり、唯一の共通の特
徴はcDNA配列によって予想されるＣ−末端の短い疎水性
ペプチド（15〜20残基）の存在であった。一時的な膜ア
ンカーとして働くこともあるこの疎水性ペプチドはプロ
セッシングの間に除去されるものと推定されている［Lo
w,M.G.,J.Biochem. 244:1−13（1987）およびCross,G.A.
M.,Cell 48:179−181（1987）］。PI−アンカーされるタ
ンパク質のＣ−末端領域における配列保存の欠如は、プ
ロセッシングシグナルがその性質において立体配座的な
ものであることを示唆する。上記の方法によりリン脂質
膜アンカーの付加は、可溶性または分泌型タンパク質を
細胞表面膜に向けるための新規機序を提供するものであ
る。
ールを介して原形質膜に結合されるものと結論された。
この結論は以下の証拠によって支持される。第１に、細
胞表面のgD−1/DAFは精製度の高いホスファチジルイノ
シトール特異的なホスホリパーゼＣによる消化に対して
感受性であったが、一方、天然のgD−１は影響を受けな
かった。第２に、特異性の広いホスホリパーゼがgD−1/
DAFの放出に有効ではなかった。第３に、gD−1/DAFはグ
リコホスホ脂質アンカーの成分である［3H］エタノール
アミンによって特異的にラベルされた。このように、リ
ン脂質膜アンカーの結合を指向させるために必要な情報
または「シグナル」は、DAFのＣ−末端の37アミノ酸内
に含まれている。Ｃ−末端配列が脂質を結合させる際に
ある役割を演じているというこの考えは、最近の、おそ
らくは別のmRNAスプライシングに由来するものと考えら
れる、多くの種類の神経細胞付着分子（Ｎ−CAM）mRNA
の同定によって支持される。これらのmRNAによってコー
ドされている別形態のＮ−CANは別のＣ−末端ドメイン
を有しており、疎水性の膜−スパニングドメインによっ
て、またはリン脂質によって膜結合することになること
は明らかである［Hemperly et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 83:9822（1986）］。PI−アンカーされるタンパク
質にとって利用可能なＣ−末端アミノ酸配列を調べる
と、明確な相同性はないことがわかり、唯一の共通の特
徴はcDNA配列によって予想されるＣ−末端の短い疎水性
ペプチド（15〜20残基）の存在であった。一時的な膜ア
ンカーとして働くこともあるこの疎水性ペプチドはプロ
セッシングの間に除去されるものと推定されている［Lo
w,M.G.,J.Biochem. 244:1−13（1987）およびCross,G.A.
M.,Cell 48:179−181（1987）］。PI−アンカーされるタ
ンパク質のＣ−末端領域における配列保存の欠如は、プ
ロセッシングシグナルがその性質において立体配座的な
ものであることを示唆する。上記の方法によりリン脂質
膜アンカーの付加は、可溶性または分泌型タンパク質を
細胞表面膜に向けるための新規機序を提供するものであ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 カラス，イングリッド・ダブリュ アメリカ合衆国カリフォルニア94122、 サン・フランシスコ、アパートメント 11、シックスティーンス・ストリート 1346番 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．319，ｐ．407 −409（1986) 11ＢＳ11，ｐ．212−215（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 19/00 C07K 14/47 C07K 14/08 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/06 C12N 1/21 C12N 9/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
Claims (19)
- 【請求項１】mDAF以外のタンパク質のリン脂質アンカー
ドメイン＿およびこれに融合した該リン脂質アンカード
メインに異種のタンパク質を含んでなるポリペプチド。 - 【請求項２】異種のポリペプチドが酵素、ホルモン、免
疫グロブリン、アレルゲン、受容体または抗原である請
求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 - 【請求項３】リン脂質アンカードメインが異種タンパク
質のＣ−末端に融合している請求の範囲第１項に記載の
ポリペプチド。 - 【請求項４】請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを
コードしている核酸。 - 【請求項５】５′から３′にかけて、異種ポリペプチド
およびリン脂質アンカー認識部位をコードしている請求
の範囲第４項に記載の核酸。 - 【請求項６】認識部位が約30〜70残基を含有するもので
ある請求の範囲第５項に記載の核酸。 - 【請求項７】請求の範囲第４項に記載の核酸で形質転換
した組換え宿主細胞。 - 【請求項８】mDAF以外のタンパク質のリン脂質アンカー
ドメイン、アンカードメインのＮ末端側の該タンパク質
の約10〜50残基、およびこれにＣ末端で融合した該リン
脂質アンカードメインに異種のタンパク質を含んでなる
ポリペプチド。 - 【請求項９】請求の範囲第８項に記載のポリペプチドを
コードしている核酸で形質転換された組換え宿主細胞。 - 【請求項１０】リン脂質アンカードメイン＿およびこれ
に融合した該リン脂質アンカードメインに異種のポリペ
プチドを含んでなるポリペプチドであって、該異種のポ
リペプチドはプラスミノーゲン活性化因子であるポリペ
プチド。 - 【請求項１１】請求の範囲第10項に記載のポリペプチド
をコードしている核酸で形質転換した組換え宿主細胞。 - 【請求項１２】リン脂質アンカードメイン＿およびこれ
に融合した該リン脂質アンカードメインに異種のポリペ
プチドを含んでなるポリペプチドであって、該異種のポ
リペプチドはウイルスのエンベロープタンパク質の免疫
エピトープを有する抗原であるポリペプチド。 - 【請求項１３】請求の範囲第12項に記載のポリペプチド
をコードしている核酸で形質転換した組換え宿主細胞。 - 【請求項１４】リン脂質アンカードメイン＿およびこれ
に融合した該リン脂質アンカードメインに異種のポリペ
プチドを含んでなるポリペプチドであって、該異種のポ
リペプチドは代謝の先天性異常に欠陥のある酵素である
ポリペプチド。 - 【請求項１５】請求の範囲第14項に記載のポリペプチド
をコードしている核酸で形質転換した組換え宿主細胞。 - 【請求項１６】mDAFのリン脂質アンカードメイン＿およ
びこれに融合した該リン脂質アンカードメインに異種の
ポリペプチドを含んでなるポリペプチドであって、該異
種のポリペプチドはアレルゲンまたは受容体であるポリ
ペプチド。 - 【請求項１７】請求の範囲第16項に記載のポリペプチド
をコードしている核酸で形質転換した組換え宿主細胞。 - 【請求項１８】（ａ）アミノ酸配列： を含むmDAF_のＣ末端30〜50残基、および （ｂ）mDAF以外のポリペプチド の融合であるポリペプチド。
- 【請求項１９】異種のポリペプチドがプレタンパク質で
ある請求の範囲第18項に記載のポリペプチド。
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|---|---|---|---|
| US07/083,757 US5109113A (en) | 1986-05-02 | 1987-08-06 | Membrane anchor fusion polypeptides |
| US083,757 | 1987-08-06 | ||
| PCT/US1988/002648 WO1989001041A1 (en) | 1987-08-06 | 1988-08-03 | Nucleic acid and methods for the synthesis of novel fusion polypeptides with a phospholipid anchor domain |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02504467A JPH02504467A (ja) | 1990-12-20 |
| JP2935709B2 true JP2935709B2 (ja) | 1999-08-16 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63507281A Expired - Lifetime JP2935709B2 (ja) | 1987-08-06 | 1988-08-03 | リン脂質アンカードメインとの新規融合ポリペプチドの合成のための核酸および方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0371999B1 (ja) |
| JP (1) | JP2935709B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1341485C (ja) |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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Also Published As
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