DE69736129T2 - Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von neoplastichen Krankheiten - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von wirksamen Verbindungen zur Erhöhung der Menge an Angiostatin, einem Inhibitor der Angiogenese zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Man nimmt an, dass Angiostatin, ein proteolytisches Fragment von Plasminogen aus Kringel 1 bis 3 und dem gesamten oder Teil von Kringel 4 besteht, und es ist ein potenter Inhibitor der Angiogenese und dem Wachstum von Tumorzell-Metastasen. O'Reilly et al., Cell, 79, 315–328 (1994); PCT-Anmeldung WO 95/29242. Angiostatin findet sich in vivo in Tumor-tragenden Mäusen. O'Reilly et al., Cell, 79, 315–328 (1994); O'Reilly et al., Nature Med. 2, 689–692 (1996). Der enzymatische Mechanismus, durch den Angiostatin in vivo erzeugt wird, bleibt unbekannt.
  • Die Angiostatin-Aktivität kann in vitro erzeugt werden durch eingeschränkte Elastase-Proteolyse von Plasminogen. Sottrup-Jensen et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, 3, 191–209 (Davidson et al., Hrsg. 1978). Eine kürzliche Zusammenfassung schlägt vor, dass Angiostatin durch Makrophagen erzeugt wird, die primäre Tumoren infiltrieren und Elastase-Aktivität freisetzen, welche dann Plasminogen unter Bildung eines Proteins mit Angiostatin-Aktivität spaltet. Dong et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 37 58 (1996). Während jedoch eingeschränkte Elastase-Spaltung von Plasminogen ein Fragment oder Fragmente mit Angiostatin-Aktivität ergibt, verdaut die Elastase das oder die Fragment(e) und inaktiviert Peptide und ist daher wahrscheinlich nicht das Enzym, das Angiostatin in vivo erzeugt.
  • Wie vorstehend bemerkt, kann Angiostatin in vitro durch eingeschränkte Elastase-Proteolyse von Plasminogen erzeugt werden. Dieses Verfahren hat verschiedene Nachteile. Während Elastase-Plasminogen unter Erzeugung eines die Kringel 1–3 enthaltenden Fragmentes spaltet, ist es zunächst nicht bekannt, ob diese Spaltung an den normalen Stellen stattfindet, an denen Spaltung unter Herstellung von Angiostatin in vivo auftritt. Daher kann das Elastase-abgeleitete Angiostatin die in vivo-Verarbeitung geändert haben und geänderte Aktivität in Menschen besitzen. Es kann auch immunogen sein, wenn die Stellen der Peptidspaltung sich von normalem Angiostatin unterscheiden.
  • Eine zweite Art zur Herstellung von Angiostatin ist durch Exprimierung der gewünschten Kringel-Domänen der Plasminogen-cDNA oder seines Gens in einem Expressionsvektor in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen. Siehe PCT-Anmeldung WO 95/29242. Dieser Ansatz ist auch beschränkt, da die geeigneten Domänen zur Exprimierung nicht bekannt sind. Das Produkt kann auch immunogen sein und könnte im Menschen nicht prozessiert werden, wie beim Produkt, das durch Spaltung von Plasminogen durch die normalen in vivo-Enzyme erzeugt wird.
  • Schließlich kann Angiostatin aus Körperflüssigkeiten von Tieren isoliert werden, in denen es hergestellt wird. Siehe PCT-Anmeldung WO 95/29242. Jedoch kann Angiostatin auf diese Weise nicht in ausreichenden Mengen zur Behandlung von Krankheiten hergestellt werden und das Angiostatin kann mit infektiösen Mitteln kontaminiert sein, wenn es aus derartigen Quellen isoliert wird.
  • Es besteht klarerweise ein Bedarf an einem Verfahren zur Herstellung von nativem Angiostatin in großen Mengen. "Natives Angiostatin" wird hier als Angiostatin definiert, das in vivo hergestellt wird oder Angiostatin, unabhängig von seiner Herstellungsweise, welches das gleiche wie das in vivo hergestellte Angiostatin ist.
  • A. D. Purushotham et al., Journal of Surgical Oncology 57: 3–7 (1994) offenbart die Verwendung von Streptokinase, wirksam zur Inhibierung von Lungentumor, der in ein Nagermodell eingepflanzt wurde. Streptokinase war im Rattenmodell fähig, Fibrinolyse zu verursachen und erzeugt die Umwandlung von Plasminogen in das fibrinolytische Enzym Plasmin.
  • K. R. Meehan et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, Vol. 6, No. 2, 1995, 105–112 offenbart die Wirkungen eines Plasminogenaktivators vom Urokinase-Typ, der Patienten mit kleinzelligem Karzinom der Lunge verabreicht wurde und die Lysis von Fibrin induziert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Verwendungen von wirksamen Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten bereit. Diese Verwendungen begründen sich auf die Entdeckung, dass ein konditioniertes Kulturmedium (CCM), hergestellt durch Kultivierung von Krebszellen, primären Endothelialzellen, glatten Muskelzellen oder Fibroblasten Angiostatin produziert, wenn es mit Plasminogen oder Plasmin kontaktiert wird. Die aktiven Faktoren in dem CCM wurden als Plasminogenaktivator und ein Sulfhydryldonor identifiziert. So ist das durch die Verwendung eines Plasminogenaktivators und eines Sulfhydryldonors erzeugte Angiostatin das gleiche, wie in vivo produziertes Angiostatin, d.h. es ist natives Angiostatin.
  • Die Erfindung stellt die Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung von Angiostatin bereit. Das Medikament umfasst einen Sulfhydryldonor und einen Plasminogenaktivator. Zwei Ausführungsformen der Zusammensetzung sind CCM, hergestellt durch Kultivierung von Zellen, die Plasminogenaktivator und ein Lysat derartiger Zellen herstellen können.
  • Die Erfindung stellt auch die Verwendung des vorstehend definierten Medikaments zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer neoplastischen Krankheit bereit, und umfasst die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines Sulfhydryldonors in Kombination mit einem Plasminogenaktivator an ein unter einer derartigen Krankheit leidendes Tier, welche effektiv ist zur Umwandlung von Plasmin in Angiostatin. Das Plasmin kann ein solches sein, hergestellt durch endogenen Plasminogenaktivator/-aktivatoren aus endogenem Plasminogen. Alternativ kann das Verfahren ferner die Verabreichung einer effektiven Menge von Plasmin umfassen. In weiteren Ausführungsformen kann ein Plasminogenaktivator dem Tier verabreicht werden, um das Plasmin aus endogenem Plasminogen oder aus einer effektiven Menge von verabreichtem Plasminogen zu erzeugen.
  • Gemäß der Erfindung kann ferner ein Behälter verwendet werden, der einen Plasminogenaktivator allein oder in Kombination mit Sulfhydryldonor beinhaltet. Der Behälter besitzt darauf ein Etikett, das die Verabreichung der Kombination von Plasminogenaktivator und Sulfhydryldonor an ein unter einer angiogenetischen Krankheit leidendes Tier instruiert. Die Erfindung stellt auch einen Behälter bereit, der einen Sulfhydryldonor beinhaltet mit einem Etikett darauf, das die Verabreichung des Sulfhydryldonors in einer für die Konversion von Plasmin in Angiostatin effektiven Menge instruiert.
  • Gemäß der Erfindung kann auch ein Protein verwendet werden, das die folgenden Eigenschaften aufweist: (a) es ist ein Fragment von Plasminogen; (b) dessen N-terminale Aminosäure ist die gleiche wie die N-terminale Aminosäure von Plasmin; (c) dessen C-terminale Aminosäure liegt in Kringel 5; und (d) es inhibiert die Angiogenese. Gemäß einer Ausführungsform ist das Protein natives Angiostatin. Gemäß der Erfindung kann ferner ein DNA-Molekül verwendet werden, das für das Protein kodiert, wobei das DNA-Molekül operativ mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, eine Wirtszelle, die das operativ mit Expressionskontrollsequenzen verbundene DNA-Molekül umfasst und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, welches die Kultivierung der Wirtszelle umfasst.
  • Das Protein kann verwendet werden, um angiogenetische Krankheiten durch Verabreichung einer effektiven Menge des Proteins an ein unter einer derartigen Krankheit leidendes Tier zu behandeln. Ein unter einer derartigen Krankheit leidendes Tier kann auch behandelt werden durch Verabreichung eines Transgens, das für das Protein kodiert. Vorzugsweise ist das Protein, das durch das Transgen kodiert wird, natives Angiostatin.
  • Schließlich kann erfindungsgemäß ein Antikörper verwendet werden, der selektiv an das Protein bindet. Ein derartiger Antikörper kann verwendet werden, um das Protein von Materialien zu reinigen, die es enthalten. Ein derartiger Antikörper, der selektiv an natives Angiostatin bindet, kann auch verwendet werden in Verfahren und Kits zur Detektion oder Quantifizierung von nativem Angiostatin.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A: Ein Western-Blot, der die Umwandlung von Plasminogen und Plasmin in Angiostatin durch serumfreies konditioniertes Medium (SFCM), hergestellt von PC-3-Zellen, zeigt. Spur 1, Molekulargewichtstandard; Spur 2, humanes Plasminogen; Spur 3, humanes Plasminogen, über Nacht bei 37°C in nicht-konditioniertem RPMI inkubiert; Spur 4, humanes Plasminogen, über Nacht bei 37°C in SFCM aus PC-3-Zellen inkubiert; Spur 5, humanes Plasmin, in nicht-konditioniertem RPMI inkubiert; Spur 6, humanes Plasmin, in SFCM, hergestellt von PC-3-Zellen inkubiert.
  • 1B: Western-Blot, der zeigt, dass die Erzeugung von Angiostatin aus Plasminogen zeitabhängig war. PC-3 SFCM wurde mit Plasminogen inkubiert und zu den angezeigten Zeitpunkten wurden Aliquots entfernt und vor der Western-Blot-Analyse schockgefroren. Die Erzeugung von Spuren an Angiostatin wurde zuerst nach 3 Stunden beobachtet und vollständige Umwandlung wurde nach 24 Stunden festgestellt.
  • 1C: Western-Blots, die zeigen, dass die Erzeugung von Angiostatin durch PC-3 SFCM konzentrationsabhängig war. SFCM wurde mit verschiedenen Mengen an frischem RPMI verdünnt, wie angezeigt und mit Plasminogen 24 Stunden lang inkubiert.
  • 1D: Ein Graph, der die Beziehung von Angiostatinerzeugung zur Menge an SFCM erläutert. Das relative Angiostatinsignal wurde durch Abtastdichtemessung und Hintergrundsubtraktion quantifiziert. Nach 18stündiger Inkubation gab es eine lineare Beziehung zwischen der erzeugten Angiostatinmenge und der in der Reaktionsmischung vorhandenen Menge an PC-3 SFCM.
  • 2: Western-Blots nach Affinitätsreinigung von Angiostatin, das durch Inkubation von Plasminogen mit SFCM, hergestellt von PC-3-Zellen erzeugt wurde. Spur 1, Molekulargewichtsstandards; Spur 2, humanes Plasminogen, inkubiert über Nacht bei 37°C in nicht-konditioniertem RPMI; Spur 3, Angiostatin, erzeugt durch Inkubation von Plasminogen mit PC-3 SCFM und dann affinitätsgereinigt auf Lysin-Sepharose und detektiert auf Western-Blot durch Färbung mit Coomassie-Blau; Spur 4, Angiostatin, erzeugt durch Inkubation von Plasminogen mit PC-3 SCFM und dann affinitätsgereinigt auf Lysin-Sepharose und detektiert auf Western-Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers K1–3 an Kringel 1–3.
  • 3A–B: Graphen, die zeigen, dass Angiostatin, hergestellt durch Inkubation von Plasminogen mit PC-3 SCFM, die für die Angiogenese kritischen in vitro-Schritte inhibiert. 3A: Proliferation von Endothelialzellen. Die Daten sind die mittlere ± Standardabweichung. 3B: Durch basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) induzierte Wanderung. Hintergrundwanderung ohne den Induktor und in Gegenwart von stimulierendem bFGF sind gezeigt. Die Toxizität wurde parallel durch Trypan-Blau-Ausschluss gemessen und betrug < 10% bei allen Konzentrationen.
  • 4A–B: Fotografien, die zeigen, dass Angiostatin, hergestellt durch Inkubation von Plasminogen mit PC-3 SCFM die in vitro-Bildung von humanen Endothelialzellen-Röhrchen inhibiert. Humane Endothelialzellen aus der Nabelvene (HUVEC) wurden auf Gelen von Matrigel in Schalen mit 24 Vertiefungen plattiert und dann mit 15 μg/ml Angiostatin, hergestellt unter Verwendung von PC-3 SFCM in nicht-konditioniertem RPMI behandelt. 4A: Kontroll-HUVEC bildet verzweigende, miteinander verbundene Netzwerke. 4B: Im Gegensatz dazu verursacht Angiostatin, hergestellt unter Verwendung von PC-3 SFCM eine signifikante Unterbrechung des Rohrnetzwerks.
  • 5A–B: Fotografien, die die Inhibierung der Angiogenese in vivo durch Angiostatin, hergestellt unter Verwendung von PC-3 SCFM zeigen. 5A: Ein Hydron-Pellet (gezeigt durch den Pfeil), das bFGF enthielt, induzierte eine positive neovaskuläre Antwort 7 Tage nach Implantation. 5B: Im Gegensatz dazu wurden keine Gefäße beobachtet, die sich einem Hydron-Pellet näherten, welches bFGF und 10 μg/ml Angiostatin, hergestellt unter Verwendung von PC-3 SFCM enthielt (angezeigt durch den Pfeil).
  • 6: Western-Blot, der zeigt, dass das Haupteluat aus Reaktivrot 120-Agarose Angiostatin erzeugt, wenn es mit Raktivrot 120-Agarose-Durchfluss, RPMI oder RPMI-Aminosäuren kombiniert wird. Spur 1 – SFCM + Plasminogen; Spur 2 – Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen; Spur 3 – Reaktivrot 120-Agarose-Haupteluat nach Dialyse gegen TBS + Plasminogen; Spur 4 – dialysiertes Haupteluat + Reaktivrot 120-Agarosedurchfluss + Plasminogen; Spur 5 – dialysiertes Haupteluat + RPMI + Plasminogen; Spur 6 – dialysiertes Haupteluat + RPMI-Vitaminmix + Plasminogen; Spur 7 – dialysiertes Haupteluat + RPMI-Aminosäuremix + Plasminogen; Spur 8 – dialysiertes Haupteluat + RPMI-Vitaminmix + Aminosäuremix + Plasminogen; Spur 9 – Plasminogen + unkonditioniertes RPMI.
  • 7: Graph, der zeigt, dass Aktivität des Plasminogenaktivators vom Urokinase-Typ (u-PA) und Plasminogen-Angiostatin konvertierende Aktivität (PACA) bei einer Gradientelution über eine Hi-Q-Anionenaustauschsäule coeluieren. Die Aufzeichnungen der optischen Dichte bei 280 nm zeigen verschiedene Proteinpeaks. u-PA-Aktivität wurde bestimmt durch Messung der Spaltung eines chromogenen Peptidsubstrats hinsichtlich Plasmin (Val-Leu- Lys p-NA) bei 405 nm. Die Peakfraktionen wurden auf PACA durch Western-Blot analysiert.
  • 8: Western-Blot, der zeigt, dass die Zugabe von u-PA und Plasminogen zu kochendem Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss oder frischem RPMI-Medium Angiostatin erzeugte. Spur 1 – Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen; Spur 2 – 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen + u-PA; Spur 3 – kochender Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen; Spur 4 – kochender Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen + u-PA; Spur 5 – unkonditioniertes RPMI + Plasminogen; Spur 6 – unkonditioniertes RPMI + Plasminogen + u-PA.
  • 9: Western-Blot, der zeigt, dass der Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss Angiostatin in Gegenwart von Plasminogenaktivatoren produziert. Spur 1 – Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen; Spur 2 – Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen + u-PA; Spur 3 – Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss + Plasminogen + t-PA.
  • 10: Western-Blot, der die Herstellung von Angiostatin durch u-PA und Glutathion zeigt. Spur 1 – Plasminogen + u-PA; Spur 2 – Plasminogen + u-PA + 5 μM Glutathion; Spur 3 – Plasminogen + u-PA + 50 μM Glutathion; Spur 4 – Plasminogen + u-PA + 100 μM Glutathion; Spur 5 – Plasminogen + u-PA + kochendes 5 μM Glutathion; Spur 6 – Plasminogen + u-PA + kochendes 50 μM Glutathion; Spur 7 – Plasminogen + u-PA + kochendes 100 μM Glutathion.
  • 11: Western-Blot, der zeigt, dass die Kombination von u-PA und D-Penicillamin Angiostatin erzeugt. Spur 1 – Plasminogen + 100 μM D-Penicillamin; Spur 2 – Plasminogen + u-PA + 100 μM D-Penicillamin; Spur 3 – Plasminogen + u-PA + 1,0 mM D-Penicillamin.
  • 12: Western-Blot, der die Herstellung von Angiostatin durch u-PA, t-PA und Streptokinase zeigt. Die in der Figur verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
    • PLG
    = humanes Plasminogen;
    uPA
    = Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ;
    tPA
    = Plasminogenaktivator vom Gewebe-Typ;
    SK
    = Streptokinase;
    +
    = mit N-Acetyl-L-cystein; und
    –
    = ohne N-Acetyl-L-cystein.
  • 13: Western-Blot, der die Herstellung von Plasmin aus Plasminogen und die Herstellung von Angiostatin aus dem vorher gebildeten, gereinigten Plasmin zeigt. Spur 1 – Plasminogen + u-PA-Sepharose; Spur 2 – gereinigtes Plasmin + 100 μM N-Acetyl-L-cystein.
  • 14: Graph der mittleren primären Tumorgröße (mm3) für die Tage 0–21 der Kontrollmäuse und der mit N-Acetyl-L-cystein (NAC) oder NAC + Plasminogeninhibitor vom Urokinase-Typ (uPA) behandelte Mäuse.
  • 15: Western-Blot, der die Herstellung von Angiostatin durch N-Acetyl-L-cystein (NAC) in vivo zeigt. Spur 1 – Plasma (1:20 verdünnt) aus Kontrollmaus #2; Spur 2 – Plasma (1:20 verdünnt) aus Kontrollmaus #3; Spur 3 – Plasma (1:20 verdünnt) aus einer ersten Maus, die affinitätsgereinigtes, zellfreies Angiostatin erhielt; Spur 4 – Plasma (1:20 verdünnt) aus einer zweiten Maus, die affinitätsgereinigt ist, zellfreies Angiostatin erzielt; Spur 5 – Plasma (1:20 verdünnt) aus NAC-behandelter Maus #1; Spur 6 – Plasma (1:20 verdünnt) aus NAC-behandelter Maus #2; Spur 7 – Plasma (1:20 verdünnt) aus NAC-behandelter Maus #3; und Spur 8 – affinitätsgereinigtes, zellfreies Angiostatin.
  • 16: Ein Diagramm von humanem Plasminogen, das die Aminosäuresequenz des kompletten Moleküls nach Spaltung des Signalpeptids (nicht gezeigt) zeigt (entnommen aus Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis (High and Roberts, Hrsg. 1995)). Kringel 1–5 (K1–K5) sind gezeigt. Die Spaltstellen zwischen den Resten 77 und 78 und den Resten 561 und 562, die für die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin benötigt werden, sind durch ausgefüllte Pfeile gezeigt. Die nicht ausgefüllten Pfeile stellen die Positionen von Introns in dem Gen dar. Die Stellen des N-verknüpften Oligosaccharids in Position 289 und des O-verknüpften Glycans in Position 346 sind auch gezeigt. Der Stern zeigt Teile der katalytischen Triade von Plasmin (His603, Asp646 und Ser741).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER DERZEIT BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Erfindung stellt die Verwendung einer therapeutisch effektiven Menge von Plasminogenaktivator in Kombination mit einem Sulfhydryldonor bereit, effektiv zur Erhöhung der Menge von in einem Menschen vorhandenem Angiostatin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neoplastischen Krankheit in einem unter dieser Krankheit leidenden Menschen. Es werden auch offenbart, ohne Teil der Erfindung zu bilden, in vitro-Verfahren zur Erzeugung von nativem Angiostatin. Ein derartiges Verfahren umfasst die Kontaktierung von Plasminogen mit einem Plasminogenaktivator und einem Sulfhydryldonor. Alle drei Reaktanten können gleichzeitig kombiniert werden. Alternativ kann das Plasminogen mit einem Plasminogenaktivator kontaktiert werden, um Plasmin zu erzeugen und das Plasmin wird dann mit einem Sulfhydryldonor zur Herstellung von Angiostatin kontaktiert. Das Plasminogen kann wenigstens teilweise gereinigt sein, bevor es mit dem Sulfhydryldonor kontaktiert wird. Tatsächlich kann Angiostatin direkt aus Plasmin hergestellt werden, wird jedoch durch Kontaktierung des Plasmins mit einem Sulfhydryldonor erzeugt.
  • Das Plasminogen kann aus jeder Tierspezies stammen. Vorzugsweise wird jedoch Plasminogen aus der Tierspezies verwendet, die mit dem Angiostatin behandelt werden soll, um Immunreaktionen bei Verabreichung des Angiostatins zu vermeiden. Wenn ein Mensch mit dem Angiostatin behandelt werden soll, wird daher vorzugsweise humanes Plasminogen verwendet.
  • Verfahren zur Herstellung von Plasminogen sind in der Technik gut bekannt. Plasminogen kann auch kommerziell gekauft werden. Vorzugsweise wird das Plasminogen hergestellt durch rekombinante DNA- oder andere Techniken, die den Einschluss von infektiösen Mitteln bei der Plasminogenherstellung vermeiden.
  • Alle Arten von Plasminogenaktivatoren können verwendet werden einschließlich von Plasminogenaktivatoren vom Urokinase-Typ, Plasminogenaktivatoren vom Gewebe-Typ und Streptokinase. Der Plasminogenaktivator kann von jeder Tierspezies stammen. Verfahren zur Herstellung von Plasminogenaktivatoren sind in der Technik gut bekannt und viele Plasminogenaktivatoren sind kommerziell verfügbar. Vorzugsweise wird der Plasminogenaktivator durch rekombinante DNA- oder andere Techniken hergestellt, die den Einschluss von infektiösen Mitteln bei der Herstellung des Plasminogenaktivators vermeiden.
  • Das Plasminogen wird mit dem Plasminogenaktivator in Mengen und bei Bedingungen kontaktiert, die zur Umwandlung des Plasminogens in Plasmin wirksam sind. Diese Mengen und Bedingungen sind bekannt oder können empirisch bestimmt werden, wie es in der Technik bekannt ist. Insbesondere wurde gefunden, dass von etwa 1 ng/ml bis etwa 1 μg/ml Urokinase-Plasminogenaktivator für jedes Mikrogramm an Plasminogen in einer 1 ml Reaktion vollständige Umwandlung von Plasminogen in Plasmin nach etwa 24 Stunden bei Inkubation bei 37°C ergibt.
  • Jeder Sulfhydryldonor kann verwendet werden. Sulfhydryldonoren sind gut bekannt und kommerziell verfügbar. Geeignete Sulfhydryldonoren beinhalten L-Cystein, D-Cystein, DL-Cystein, N-Acetyl-L-cystein, reduziertes Glutathion, D-Penicillamin und Captopril. Man nimmt an, dass der Sulfhydryldonor die Disulfidbindungsbildung im Plasminogen und/oder Plasmin und/oder Angiostatin und/oder einem intermediären Produkt reduziert oder ändert.
  • Der Sulfhydryldonor wird mit dem Plasmin allein oder in Gegenwart des Plasminogens und des Plasminogenaktivators kontaktiert in Mengen und unter Bedingungen, die zur Umwandlung des Plasmins in Angiostatin wirksam sind. Diese Mengen und Bedingungen können empirisch bestimmt werden, wie es in der Technik bekannt ist. Insbesondere wurde gefunden, dass von etwa 10 μM bis etwa 1 mM Sulfhydryldonor für jedes Mikrogramm Plasmin in einer 1 ml-Reaktion die vollständige Umwandlung von Plasmin in Angiostatin nach etwa 24 Stunden bei Inkubation bei 37°C ergibt.
  • Plasmin kann aus Plasminogen durch einen vorstehend beschriebenen Plasminogenaktivator erzeugt werden. Das Plasmin kann aus den Reaktanten gereinigt werden, bevor es mit dem Sulfhydryldonor kontaktiert wird. Verfahren zur Reinigung von Plasmin sind in der Technik bekannt (siehe z.B. Beispiel 4). Kommerziell erworbenes Plasmin oder auf andere Weise hergestelltes kann auch verwendet werden, um Angiostatin durch Kontaktierung des Plasmins mit einem Sulfhydryldonor zu erzeugen, wie vorstehend beschrieben.
  • Gemäß der Erfindung kann eine Zusammensetzung zur Erzeugung von Angiostatin verwendet werden. Die Zusammensetzung umfasst einen Plasminogenaktivator und einen Sulfhydryldonor, wie vorstehend beschrieben. Der Plasminogenaktivator und der Sulfhydryldonor können in jeder physiologisch annehmbaren Lösung enthalten sein (z.B. Saline, Puffer, Kulturmedium) oder können in kristalliner oder lyophilisierter Form vorhanden sein. Geeignete Zusammensetzungen für die therapeutischen Verwendungen werden nachstehend beschrieben.
  • Die Zusammensetzung kann ein konditioniertes Kulturmedium (CCM) sein, hergestellt durch Kultivierung von Zellen, die Plasminogenaktivator erzeugen können. Maligne Tierzellen, humane und nicht-humane, welche einen Plasminogenaktivator exprimieren, können CCM erzeugen, welches Plasminogen und Plasmin in Angiostatin umwandeln kann. Geeignete maligne Zellen beinhalten humane Prostatakarzinom-Zelllinien PC-3, DU-145, LN-CaP, humane Brustkarzinom-Zelllinien MDA-MB-231 und MCF-7, humane Gliom-Zelllinien U-373, U-118, A-172 und U-87 und Maus-Melanom-Zelllinie B16F10. Es ist bekannt, dass viele nicht-maligne Tierzellen Plasminogenaktivator erzeugen. Geeignete nicht-maligne Zellen beinhalten primäre Endothelialzellen (z.B. Endothelialzellen aus der Rinder-Aorta), glatte Muskelzellen (z.B. glatte Rindermuskelzellen) und Fibroblasten. Zusätzlich sind Bakterienzellen bekannt, die Plasminogenaktivator herstellen (z.B. Streptokinase) und Zellen jeden Typs können durch rekombinante DNA-Techniken transformiert werden, so dass sie Plasminogenaktivator erzeugen. Geeignete Zellen und Zelllinien sind in der Technik gut bekannt und können aus Zell-Hinterlegungsstellen und durch in der Technik gut bekannte Verfahren kommerziell erhalten werden.
  • Geeignete Kulturbedingungen für diese Zellen sind auch in der Technik gut bekannt. Das verwendete Kulturmedium muss einen Sulfhydryldonor enthalten oder ein Sulfhydryldonor kann dem CCM nach Herstellung zugegeben werden. Geeignete Kulturmedien beinhalten solche, die kommerziell erhältlich sind, wie RPMI, DMEM etc. Das CCM kann hergestellt werden, indem einfach die Zellen unter normalen Kulturbedingungen für eine ausreichende Zeit kultiviert werden, um CCM herzustellen, das Plasminogen oder Plasmin in Angiostatin umwandeln kann. Diese Zeit kann empirisch bestimmt werden. Insbesondere wurde gefunden, dass die Kultivierung der Säugerzellen für 24–72 Stunden nach Bildung einer Monoschicht bei 37°C ausreichend ist.
  • Alternativ oder zusätzlich können die Zellen nach Kultivierung für eine für die Synthese von Plasminogenaktivator ausreichenden Zeit lysiert werden. Diese Zeit kann empirisch bestimmt werden, aber die Kultivierung der Zellen bis zur Bildung einer Monolayer sollte ausreichend sein. Das Lysat kann verwendet werden, um Plasminogen und Plasmin in Angiostatin umzuwandeln.
  • Das mit diesen Verfahren hergestellte Angiostatin kann aus der Reaktionsmischung gereinigt werden. Verfahren zur Proteinreinigung sind in der Technik gut bekannt. Insbesondere kann Angiostatin durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Lysin-Sepharose gereinigt werden. Restliche Plasminaktivität sollte z.B. mit Sojabohnen-Trypsininhibitor-Sepharose, Aprotinin-Sepharose oder andere Affinitätschromatographie-Verfahren entfernt werden, welche Serinproteasen oder die katalytische Domäne von Plasmin entfernen. Das Angiostatin kann auch aus der Reaktionsmischung unter Verwendung eines Antikörpers gereinigt werden, der selektiv an dieses bindet (siehe Nachstehendes).
  • Das mit diesen Verfahren erzeugte Angiostatin (natives Angiostatin) wurde charakterisiert. Es reagiert mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für Kringel 1–3 von Plasminogen ist und es wurde gefunden, dass es die Angiogenese inhibiert, wie durch eine Vielzahl von Untersuchungen in vitro und in vivo festgestellt wurde.
  • Es wurde auch gefunden, dass es die N-terminale Sequenz von Plasmin besitzt. Für das aus humanem Plasminogen erzeugte Angiostatin wurde gefunden, dass die N-terminale Sequenz Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly [SEQ ID NO: 1] ist. Die Sequenzen von Plasmin oder anderen Tieren sind bekannt. So besitzt natives Angiostatin eines speziellen Tieres die gleiche N-terminale Sequenz wie das Plasmin dieses Tieres.
  • Ziemlich überraschend wurde gefunden, dass die C-terminale Aminosäure von nativem Angiostatin in Kringel 5 lokalisiert ist. Insbesondere wurde gefunden, dass Angiostatin, hergestellt aus humanem Plasminogen, die C-terminale Sequenz Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg [SEQ ID NO: 4] oder Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys [SEQ ID NO: 5] besitzt (siehe Beispiel 6). Diese C-terminalen Sequenzen resultieren aus einer Spaltung nach Aminosäure 529 oder 530 von Plasminogen (siehe 16), welche bekannte Plasmin-Spaltungsstellen sind. So umfasst natives humanes Angiostatin den Großteil von Kringel 5 (siehe 16), was konsistent ist mit dessen Molekulargewicht von 50–60 kD auf Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.
  • Diese Befunde waren überraschend, da man annahm, dass Angiostatin Kringel 1–3 und einen Teil von oder den gesamten Kringel 4 enthält (siehe Hintergrundsabschnitt). Auch wurde gezeigt, dass ein aus Kringeln 1–4 bestehendes Molekül, obwohl aktiv, weniger aktiv war, als ein aus Kringeln 1–3 bestehendes Molekül (siehe PCT-Anmeldung WO 96/35774). So war es unvorhergesehen, dass natives Angiostatin irgendeinen Teil von Kringel 5 beinhalten würde. Es war insbesondere unvorhergesehen, dass natives Angiostatin den Großteil von Kringel 5 beinhalten würde.
  • Es wird nun erwartet, dass Plasminogenfragmente im Unterschied von nativem Angiostatin, die wenigstens einen Teil von Kringel 5 beinhalten, Angiostatinaktivität besitzen (d.h. sie werden die Angiogenese inhibieren). Vorzugsweise umfasst das Plasminogenfragment die Majorität von Kringel 5. Insbesondere bevorzugt umfasst das Plasminogenfragment den größten Teil von Kringel 5. Der hierin verwendete Ausdruck "Majorität von Kringel 5" bedeutet wenigstens 50% von Kringel 5 (z.B. wenigstens 40 Aminosäuren des humanen Kringel 5) und "der größte Teil von Kringel 5" bedeutet wenigstens 75% von Kringel 5 (z.B. wenigstens 60 Aminosäuren des humanen Kringel 5). Natürlich ist das Plasminogenfragment am besten natives Angiostatin aus den vorstehend angegebenen Gründen.
  • Die Sequenzen von Plasminogen aus anderen Tieren sind bekannt (erhältlich aus z.B. GenBank). Die Sequenzen von Plasminogen aus dem Menschen [SEQ ID NO: 6], Rind [SEQ ID NO: 7], Hasen [SEQ ID NO: 8], westeuropäischen Igel [SEQ ID NO: 9], Pferd [SEQ ID NO: 10], Rhesusaffe [SEQ ID NO: 11], Maus [SEQ ID NO: 12] und Schwein [SEQ ID NO: 13] werden nachstehend in dem Sequenzprotokoll angegeben (download aus SWISS-PROT Proteinsequenzdatenbank). Natives Angiostatin für ein bestimmtes Tier beinhaltet den größten Teil von Kringel 5 von Plasminogen dieses Tieres und besitzt eine C-terminale Sequenz entsprechend den C-terminalen Sequenzen von humanem nativem Angiostatin, wie vorstehend angegeben. Tatsächlich zeigte eine Übersicht dieser Sequenzen, dass die Sequenz unmittelbar nach den Spaltungsstellen in humanem Plasminogen, welche natives Angiostatin produziert [SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3; siehe nachstehendes Beispiel 6] in all diesen Plasminogensequenzen konserviert ist (siehe die in dem Sequenzprotokoll in Fettdruck hervorgehobenen Aminosäuren).
  • Wie aus dem Sequenzprotokoll gesehen werden kann, enthalten die Plasminogensequenzen des Hasens [SEQ ID NO: 8] und des Pferds [SEQ ID NO: 10] nur eine einzige Kringeldomäne. Diese einzige Kringeldomäne wird als Domäne von Kringel 5 infolge von Homologie mit anderen Domänen von Kringel 5 betrachtet und sie enthält die konservierte Sequenz (siehe die in dem Sequenzprotokoll hervorgehobenen Aminosäuren), die in den Domänen von Kringel 5 der anderen Plasminogene gefunden wird. So beinhaltet die Erfindung Plasminogenfragmente von Hasen- und Pferde-Plasminogenen und von jedem anderen Plasminogen, das eine Domäne von Kringel 5 enthält.
  • Erfindungsgemäß verwendete Plasminogenfragmente (solche mit N-terminaler Sequenz von Plasmin und mit deren C-terminalen Aminosäuren, die in Kringel 5 lokalisiert sind) können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt ist das Plasminogenfragment natives Angiostatin. Am meisten bevorzugt ist das Plasminogenfragment natives humanes Angiostatin. Rekombinante DNA-Verfahren und geeignete Wirtszellen, Vektoren und andere Reagenzien für die Verwendung hierbei sind in der Technik gut bekannt.
  • Die Auswahl einer besonderen Wirtszelle für die Herstellung eines Plasminogenfragments gemäß der Erfindung ist abhängig von einer in der Technik bekannten Anzahl von Faktoren. Diese beinhalten z.B. Kompatibilität mit dem gewählten Expressionsvektor, Toxizität des Plasminogenfragments gegenüber der Zelle, Transformationsrate, Expressionseigenschaften, Biosicherheit und Kosten. Eine Balance dieser Faktoren muss mit dem Wissen getroffen werden, dass nicht alle Wirte gleich effektiv für die Expression eines speziellen Plasminogenfragments sind.
  • Eukaryotische Wirtszellen sind zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Plasminogenfragmente bevorzugt. Innerhalb der vorstehenden Richtlinien beinhalten verwendbare eukaryotische Wirtszellen Hefe und andere Pilze, tierische Zelllinien, tierische Zellen in einem intakten Tier, Insektenzellen und andere eukaryotische Wirtszellen, die in der Technik bekannt sind.
  • Die Wirtszellen können mit einem Vektor transformiert werden, der die für ein erfindungsgemäß verwendetes Plasminogenfragment codierende DNA umfasst. Auf dem Vektor muss die codierende Sequenz operativ mit den Expressionskontrollsequenzen verbunden sein.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "operativ verbunden" auf die Verbindung von DNA-Sequenzen derart, dass das Plasminogenfragment exprimiert wird. Vorzugsweise wird die Verbindung einschließlich der Reihenfolge der Sequenzen, der Orientierung der Sequenzen und des relativen Abstands der verschiedenen Sequenzen so durchgeführt, dass eine optimale Expression erhalten wird.
  • Die Expressionskontrollsequenzen müssen einen Promotor beinhalten. Der in dem Vektor verwendete Promotor kann irgendeine Sequenz sein, die Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle zeigt und kann von Genen abgeleitet sein, die homologe oder heterologe Proteine und entweder extrazelluläre oder intrazelluläre Proteine codieren. Jedoch muss der Promotor nicht mit einem natürlich auftretenden Promotor identisch sein. Er kann aus Teilen von verschiedenen Promotoren zusammengesetzt sein oder kann teilweise oder insgesamt synthetisch sein. Richtlinien für den Aufbau von Promotoren werden bereitgestellt durch Untersuchungen der Promotorstruktur wie von Harley and Reynolds, Nucleic Acids Res., 15, 2343–61 (1987). Auch die Lokalisierung des Promotors relativ zum Transkriptionsstart kann optimiert werden. Siehe Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 760–4 (1979). Der Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein und ist vorzugsweise ein starker Promotor. Mit "stark" ist gemeint, dass der Promotor eine hohe Transkriptionsrate in der Wirtszelle bereitstellt.
  • In den Vektor müssen die kodierenden Sequenzen operativ mit den Transkriptionsterminationssequenzen ebenso wie mit dem Promotor verbunden sein. Die kodierende Sequenz kann auch operativ mit Expressionskontrollsequenzen verbunden sein, die sich von denen des Promotors und den Transkriptionsterminationssequenzen unterscheiden. Diese zusätzlichen Expressionskontrollsequenzen beinhalten Aktivatoren, Verstärker, Operatoren, Stoppsignale, Verkappungssignale, Polyadenylierungssignale, 5'-nicht-translatierte Sequenzen und andere Sequenzen und Signale, die bei der Kontrolle von Transkription oder Translation involviert sind.
  • Die Konsensus-Sequenz für die Translationsstartsequenz von Eukaryonten ist von Kozak (Cell, 45, 283–292 (1986)) bestimmt worden und ist C(A/G)CCAUGG. Abweichungen von dieser Sequenz, insbesondere an der -3-Position (A oder G) haben eine große Wirkung auf die Translation einer bestimmten mRNA. Tatsächlich alle hoch exprimierten Säugergene verwenden diese Sequenz. Hoch exprimierte Hefe-mRNA unterscheiden sich andererseits von dieser Sequenz und verwenden statt dessen die Sequenz (A/Y)A(A/U)AAUGUCU (Cigan und Donahue, Gene, 59, 1–18 (1987)). Diese Sequenzen können empirisch geändert werden, um die optimale Sequenz zur Verwendung in einer bestimmten Wirtszelle zu bestimmen.
  • Die DNA-Kodierung für ein Plasminogenfragment, das erfindungsgemäß verwendet wird, kann unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden, wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben. Insbesondere sind Klone bekannt, die für Plasminogen kodieren. Siehe z.B. GenBank PCT-Anmeldung WO 95/29242; Browne et al., Fibrinolysis, 5, 257–260 (1991). Andere Klone können durch in der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden. Die Klone, ob bekannt oder neu identifiziert, können mit in der Technik bekannten Verfahren modifiziert werden, um für ein erfindungsgemäßes Plasminogenfragment zu kodieren.
  • Die kodierende Sequenz kann alternativ unter Verwendung von Standardtechniken, die in der Technik gut bekannt sind und unter Verwendung der bekannten Plasminogensequenzen synthetisiert werden. Beispielsweise können DNA-Sequenzen mit der Phosphoamidit-Chemie in einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert, gereinigt, verknüpft, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert werden. Die chemische Synthese ist aus verschiedenen Gründen bevorzugt.
  • Zunächst ist die chemische Synthese erwünscht, da die von dem Wirt, in dem die DNA-Sequenz exprimiert wird, bevorzugte Codons verwendet werden können, um die Expression zu optimieren. Nicht alle Codons müssen geändert werden, um verbesserte Expression zu erhalten, aber mehr als 50%, am besten wenigstens 80% der Codons sollten in wirtsbevorzugte Codons geändert werden. Die Codon-Präferenzen vieler Wirtszellen sind bekannt. Siehe Maximizing Gene Expression, Seiten 225–85 (Reznikoff & Gold, Hrsg., 1986). Die Codon-Präferenzen anderer Wirtszellen können durch in der Technik bekannte Verfahren abgeleitet werden.
  • Die Verwendung von chemisch synthetisierter DNA erlaubt auch die Selektion von Codons hinsichtlich der Verleihung von einzigartigen oder fast einzigartigen Restriktionsstellen an zweckmäßigen Punkten in der Sequenz. Die Verwendung dieser Stellen stellt ein zweckmäßiges Mittel zum Aufbau der synthetischen kodierenden Sequenzen bereit. Wenn Sekundärstrukturen, gebildet durch das mRNA-Transkript oder andere destabilisierende Sequenzen zusätzlich die Transkription oder Translation beeinträchtigen, können sie durch Änderung der Codonauswahl eliminiert werden.
  • Chemische Synthese ermöglicht auch die Verwendung von optimierten Expressionskontrollsequenzen mit der DNA-Sequenzkodierung für ein Plasminogenfragment. Auf diese Weise kann eine optimale Expression der Plasminogenfragmente erhalten werden. Wie vorstehend erwähnt, können beispielsweise Promotoren chemisch synthetisiert werden und deren Lage relativ zum Transkriptionsstart optimiert werden.
  • Die DNA-Kodierung für eine Signal- oder eine Signalleitsequenz kann oberhalb der DNA-Sequenz lokalisiert sein, die für das Plasminogenfragment kodiert. Eine Signal- oder Signalleitsequenz ist eine Aminosäuresequenz am Aminoende eines Proteins, durch die das Protein, an die sie angeheftet ist, aus der Zelle, in der es produziert wird, ausgeschieden werden kann. Geeignete Signal- und Signalleitsequenzen sind gut bekannt. Obwohl sezernierte Proteine oft leichter zu reinigen sind, sind die Expressionsraten im Allgemeinen geringer als die derjenigen, die ohne Sekretion erhalten werden können.
  • Vektoren zur Exprimierung der Plasminogenfragmente können jeder Vektor sein, der zweckmäßigerweise rekombinanten DNA-Verfahrensweisen unterworfen werden kann und der ein Plasminogenfragment in der gewählten Wirtszelle exprimieren kann. Der zur Transformation der Wirtszellen verwendete Vektor kann eines oder mehrere Replikationssysteme haben, wodurch er sich in den Wirtszellen replizieren kann. Insbesondere wenn der Wirt eine Hefe ist, sollte der Vektor die zwei 2u-Replikationsgene REP 1–3 der Hefe und den Replikationsursprung enthalten.
  • Alternativ kann ein Integrationsvektor verwendet werden, der die Integration der für ein erfindungsgemäßes Plasminogenfragment kodierenden Sequenz in das Chromosom der Wirtszelle ermöglicht. Obwohl die Kopiezahl der kodierenden Sequenz in den Wirtszellen geringer ist, als wenn selbst replizierende Vektoren verwendet werden, sind Transformanten mit in deren Chromosome integrierten Sequenzen im Allgemeinen ziemlich stabil.
  • Wenn der Vektor ein selbst replizierender Vektor ist, ist er vorzugsweise ein Plasmid mit hoher Kopiezahl, so dass hohe Expressionsraten erhalten werden. Ein "Plasmid mit hoher Kopiezahl", wie es hier verwendet wird, ist mit etwa 100 Kopien oder mehr pro Zelle vorhanden. Viele geeignete Plasmide mit hoher Kopiezahl sind bekannt.
  • Der Vektor besitzt auch wünschenswerterweise einzigartige Restriktionsstellen für die Insertion von DNA-Sequenzen und einer Sequenz, die für ein selektierbares oder identifizierbares phenotypisches Merkmal kodiert, welches sich manifestiert, wenn der Vektor in der Wirtszelle vorhanden ist (ein "Selektionsmarker"). Wenn ein Vektor keine einzigartigen Restriktionsstellen besitzt, kann er modifiziert werden, um Restriktionsstellen einzuführen oder zu eliminieren und ihn für weitere Manipulationen geeigneter zu machen.
  • Nach Herstellung des Vektors, der eine für ein Plasminogenfragment der Erfindung kodierende DNA-Sequenz umfasst, wird er zur Transformation der Wirtszellen verwendet. Verfahren zur Transformation von Wirtszellen sind in der Technik gut bekannt und irgendeines dieser Verfahren kann verwendet werden.
  • Transformierte Wirtszellen werden auf bekannte Weisen selektiert und dann unter Bedingungen kultiviert, die zur Herstellung des Plasminogenfragments wirksam sind. Die Kulturverfahren sind solche, die für die gewählte Wirtszelle in der Technik bekannt sind.
  • Das exprimierte Plasminogenfragment kann unter Verwendung von Verfahren zur Wiedergewinnung und Reinigung von Proteinen aus rekombinanten Zellkulturen wiedergewonnen werden, welche in der Technik gut bekannt sind. Insbesondere können Antikörper verwendet werden, die selektiv an die Plasminogenfragmente der Erfindung binden, um die Fragmente zu reinigen (siehe Nachstehendes).
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Behandlung neoplastischer Krankheiten (z.B. Tumoren und Tumormetastasen) bereit.
  • Die neoplastische Krankheit kann behandelt werden durch Verabreichung einer Menge eines Sulfhydryldonors, die ausreicht, um die Überführung von Plasmin in Angiostatin zu verursachen und einer effektiven Menge eines Plasminogenaktivators. Das Plasminogen oder Plasmin kann ein endogen in dem Tier anzutreffendes sein oder effektive Mengen an Plasminogen oder Plasmin werden dem Tier ebenfalls verabreicht. Gemäß der Erfindung behandelbare Tiere beinhalten Säugetiere wie Hunde, Katzen, Pferde, andere Haustiere und Menschen.
  • Effektive Dosisformen, Verabreichungsarten und Dosismengen für die verschiedenen Verbindungen zur Behandlung von angiogenetischen Krankheiten können empirisch bestimmt werden und die Vornahme solcher Bestimmungen liegt innerhalb des Fachwissens. Es ist dem Fachmann klar, dass die Dosiermenge mit der Aktivität der bestimmten, verwendeten Verbindung, der Schwere der angiogenetischen Krankheit, dem Verabreichungsweg, der Exkretionsrate der Verbindung, der Dauer der Behandlung, der Identifizierung von weiteren, dem Tier verabreichten Medikamenten, dem Alter, der Größe und der Spezies des Tiers und derartigen, in der Medizin und der Veterinärmedizin bekannten Faktoren variiert. Im Allgemeinen wird eine geeignete tägliche Dosis einer erfindungsgemäßen Verbindung eine Menge der Verbindung sein, die die geringste effektive Dosis zur Herstellung eines therapeutischen Effekts ist. Jedoch wird die tägliche Dosis bestimmt von einem behandelnden Arzt oder Tierarzt innerhalb des Bereichs der vernünftigen medizinischen Beurteilung. Wenn gewünscht, kann die effektive tägliche Dosis als 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Teildosen verabreicht werden und getrennt in zweckmäßigen Intervallen über den Tag verteilt verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können einem tierischen Patienten zur Therapie auf jedem geeigneten Administrationsweg verabreicht werden, einschließlich oraler, nasaler, rektaler, vaginaler, parenteraler (z.B. intravenöser, intraspineller, intraperitoneller, subkutaner oder intramuskulärer) intracisterneller, transdermaler, intrakranialer, intracerebraler und topischer (einschließlicher bukaler und sublingualer Verabreichung.
  • Die bevorzugten Verabreichungswege sind subkutan, oral und intravenös. Die Verwendung von bioabbaubaren Polymeren ist auch ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung, ähnlich denen, beschrieben von Brehm et al., Lancet, 345, 1571 (1995) für die lokale Langzeitfreisetzung von pharmakologischen Mitteln, die auf die Einverleibung in die bioabbaubaren Polymere folgt. Implantation des mit dem Medikament imprägnierten Polymers, z.B. an einer Tumorstelle, ermöglicht die lang anhaltende lokale Exposition mit minimaler systemischer Exposition.
  • Während eine erfindungsgemäß verwendete Verbindung alleine verabreicht werden kann, ist es bevorzugt, sie als pharmazeutische Formulierung (Zusammensetzung) zu verabreichen. Die erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine erfindungsgemäße Verbindung als aktiven Inhaltsstoff in Mischung mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern und optional mit einer oder mehreren anderen Verbindungen, Medikamenten oder weiteren Materialien. Jeder Träger muss "annehmbar" in dem Sinne sein, dass er mit den weiteren Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist und nicht für den Patienten schädlich ist.
  • Erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Formulierungen beinhalten solche, die für orale, nasale, ophthalmische, topische, rektale, vaginale und/oder parenterale Verabreichung geeignet sind. Unabhängig von dem gewählten Verabreichungsweg werden die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen in pharmazeutisch annehmbare Dosierformen mit herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren formuliert.
  • Die Menge des aktiven Inhaltsstoffs, der mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer einzelnen Dosisform kombiniert wird, variiert abhängig von dem zu behandelnden Wirt, dem bestimmten Administrationsweg und allen weiteren oben beschriebenen Faktoren. Die Menge des aktiven Inhaltsstoffs, der mit einem Trägermaterial zur Herstellung einer einzelnen Dosisform kombiniert wird, ist im Allgemeinen eine Menge der Verbindung, die die geringste effektive Dosis zur Erzeugung eines therapeutischen Effekts ist oder die maximal tolerierte Dosis, die einen therapeutischen Zuwachs für lebensbedrohliche Krankheiten, wie Krebs, ergibt.
  • Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen oder Zusammensetzungen beinhalten den Schritt des Assoziierens einer erfindungsgemäß verwendeten Verbindung mit dem Träger und optional eines oder mehrerer Hilfs-Inhaltsstoffe. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt durch einheitliches und inniges Assoziieren einer erfindungsgemäßen Verbindung mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem und dann, falls nötig, Formen des Produkts.
  • Erfindungsgemäß verwendete Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können in Form von Kapseln, Säckchen, Pillen, Tabletten, Pulvern, Granulierung oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder als Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Flüssigemulsionen oder als Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum) und dergleichen vorliegen und enthalten jeweils eine vorbestimmte Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung als aktiven Inhaltsstoff. Eine erfindungsgemäß verwendete Verbindung kann als Bolus, Elektuarium oder Paste verabreicht werden.
  • In festen Dosierformen, die erfindungsgemäß für die orale Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulvern, Granulaten und dergleichen) verwendet werden, wird der aktive Inhaltsstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder einem der folgenden Stoffe vermischt: (1) Füllstoffe oder Streckmittel wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannitol und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel wie z.B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Gummi arabicum; (3) Netzmitteln wie Glycerin; (4) Disintegrationsmittel wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapioca-Stärke, Alginsäure, bestimmte Silicate und Natriumcarbonat; (5) Lösungs-retardierende Mittel wie Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger wie quaternäre Ammoniumverbindungen; (7) benetzende Mittel wie z.B. Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; (8) Absorbentien wie Kaolin und Bentonit-Ton; (9) Schmiermittel wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat und Mischungen von diesen; und (10) Färbemittel. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch Puffer umfassen. Es können feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs als Füllstoffe in weich- und hartgefüllten Gelatinekapseln unter Verwendung derartiger Arzneimittelträger verwendet werden, wie Laktose oder Milchzucker ebenso wie Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht und dergleichen.
  • Die Tabletten und andere feste Dosierformen, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granulaten verwendet werden, können optional eingekerbt werden oder mit Beschichtungen und Überzügen wie enterischen Überzügen und anderen Beschichtungen, die in der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannt sind, hergestellt werden. Sie können auch derart formuliert werden, dass sie langsame oder kontrollierte Freisetzung des darin verwendeten aktiven Inhaltsstoffs bereitstellen, z.B. Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen zur Bereitstellung des gewünschten Freisetzungsprofils, andere Polymermatrizes, Liposome und/oder Mikrosphären. Sie können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter sterilisiert werden. Diese Zusammensetzungen können auch optional opazifizierende Mittel enthalten und können von einer Zusammensetzung sein, dass sie den aktiven Inhaltsstoff lediglich oder vorzugsweise in einem bestimmten Bereich des gastrointestinalen Traktes, optional mit Retardeffekt, freisetzen. Beispiele von Einlagerungszusammensetzungen, die verwendet werden können, beinhalten polymere Substanzen und Wachse. Der aktive Inhaltsstoff kann auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
  • Flüssige Dosierformen für die orale Verabreichung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen beinhalten pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff können die flüssigen Dosierformen gewöhnlich in der Technik verwendete inerte Verdünnungsmittel wie z.B. Wasser oder andere Lösungsmittel, Löslichkeit vermittelnde Agenzien und Emulgatoren wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Kastor- und Sesamöle), Glycerol, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan und Mischungen von diesen enthalten.
  • Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsmittel wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel, Süßmittel, Geschmacksmittel, Färbemittel, Parfüme und Konservierungsmittel beinhalten.
  • Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspensionsmittel wie z.B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbitol und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Traganth und Mischungen von diesen enthalten.
  • Formulierungen der erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen für rektale oder vaginale Verabreichung können als Zäpfchen dargereicht werden, welche hergestellt werden durch Vermischen einer oder mehrerer Verbindungen der Erfindung mit einem oder mehreren geeigneten nicht entzündlichen Arzneimittelträgern oder Trägern, welche umfassen z.B. Kokosbutter, Polyethylenglykol, ein Zäpfchenwachs oder Salicylat und welches bei Raumtemperatur fest ist aber bei Körpertemperatur flüssig ist und daher im Rektum oder der Vagina schmilzt und die aktive Verbindung freisetzt. Erfindungsgemäß verwendete Formulierungen, die für vaginale Verabreichung geeignet sind, beinhalten auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen, welche derartige Träger enthalten, die in der Technik bekannt sind und zweckmäßig sind.
  • Dosierformen für die topische oder transdermale Verabreichung einer erfindungsgemäß verwendeten Verbindung beinhalten Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalationsmittel. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und mit irgendeinem Puffer oder Treibmittel, das erforderlich sein mag, vermischt werden.
  • Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einer erfindungsgemäß verwendeten aktiven Verbindung Arzneimittelträger, wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärken, Traganth, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Mischungen von diesen enthalten.
  • Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer erfindungsgemäß verwendeten Verbindung Arzneimittelträger wie Laktose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Mischungen von diesen Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich gewöhnliche Treibmittel wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige, nicht-substituierte Kohlenwasserstoffe wie Butan und Propan enthalten.
  • Transdermale Pflaster haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie die gesteuerte Freisetzung einer erfindungsgemäßen Verbindung in den Körper bereitstellen. Derartige Dosierformen können hergestellt werden durch Lösen, Dispergieren oder andere Einverleibung einer erfindungsgemäßen Verbindung in einem geeigneten Medium wie einem elastomeren Matrixmaterial. Absorptionsverstärker können auch verwendet werden, um den Fluss der Verbindung durch die Haut zu erhöhen. Die Flussrate kann gesteuert werden durch entweder Bereitstellen einer geschwindigkeitskontrollierenden Membran oder Dispergieren der Verbindung in einer Polymermatrix oder Gel.
  • Erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen eine oder mehrere Verbindungen der Erfindung in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren sterilen, isotonen, wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterile Pulver, die in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen vor der Verwendung rekonstituiert werden können, welche Antioxidantien, Puffer, gelöste Stoffe, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen oder Suspendiermittel oder Verdickungsmittel enthalten können.
  • Beispiele geeigneter wässriger oder nicht-wässriger Träger, die in den erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können beinhalten Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerol, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Mischungen von diesen, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Eine geeignete Fluidität kann z.B. aufrechterhalten werden durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien wie Lecithin durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln.
  • Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel enthalten. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in den Zusammensetzungen einzuschließen. Zusätzlich kann verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form erzielt werden durch den Einschluss von Mitteln, welche die Absorption verzögern wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
  • In einigen Fällen ist es zur Verlängerung der Wirkung eines Medikaments wünschenswert, die Absorption des Medikaments aus der subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung einer flüssigen Suspension eines kristallinen oder amorphen Materials mit schlechter Wasserlöslichkeit. Die Absorptionsrate des Medikaments hängt dann von seiner Lösungsrate ab, welche wiederum von der Kristallgröße und Kristallform abhängen kann. Alternativ wird die verzögerte Absorption eines parenteral verabreichten Medikamentes erreicht durch Lösen oder Suspendieren des Medikaments in einem Öl-Bindungsmittel.
  • Injizierbare Depotformen werden hergestellt durch Bilden von mikroverkapselten Matrizes des Medikaments in bioabbaubaren Polymeren wie Polylactid-Polyglycolid. Abhängig von dem Verhältnis des Medikaments zum Polymer und der Beschaffenheit des bestimmten, verwendeten Polymers, kann die Freisetzungsrate des Medikaments gesteuert werden. Beispiele von anderen bioabbaubaren Polymeren beinhalten Polyorthoester und Polyanhydride. Injizierbare Depot-Formulierungen werden auch hergestellt durch Einschließen des Medikaments in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit dem Körpergewebe kompatibel sind. Die injizierbaren Materialien können z.B. durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter sterilisiert werden.
  • Die Formulierungen können in versiegelten Behältern für Einheitsdosis oder Mehrfachdosis vorliegen, z.B. Ampullen und Fläschchen und können in lyophilisierter Form gelagert werden, was lediglich die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers erfordert, z.B. Wasser für die Injektion, unmittelbar vor der Verwendung. Gebrauchsfertige Injektionslösungen und Suspensionen können hergestellt werden aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten des vorstehend beschriebenen Typs. Obwohl es nicht Teil der Erfindung bildet, kann eine angiogenetische Krankheit auch durch Gentherapie behandelt werden. Insbesondere wird ein Transgen einem unter einer derartigen Krankheit leidenden Tier verabreicht, wobei das Transgen eine DNA umfasst, die für ein Plasminogenfragment kodiert, welches die N-terminale Sequenz von Plasmin besitzt und wenigstens einen Teil von Kringel 5, operativ mit den Expressionskontrollsequenzen verbunden, enthält. Vorzugsweise ist das durch das Transgen kodierte Plasminogenfragment natives Angiostatin. Die Herstellung von DNA, die für die erfindungsgemäß verwendeten Plasminogenfragmente kodiert, einschließlich nativem Angiostatin, und die operativ mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, wurde vorstehend beschrieben. Die Expression des Transgens in dem Tier ergibt die Produktion des Plasminogenfragments, welches die Angiogenese in dem Tier inhibiert.
  • Verfahren und Materialien für die Gentherapie sind in der Technik gut bekannt. Siehe Culver, Gene Therapy: A Primer for Physicians (überarbeitete 2. Auflage, 1996), US-Patente Nr. 5,521,291, 5,460,831 und 5,559,099, PCT-Anmeldungen WO 95/29242, WO 96/14876 und WO 96/35774. Siehe auch Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest., 92, 381–387 (1993) und Drazner et al., J. Clin. Invest., 99, 288–296 (1997). Insbesondere geeignete Verfahren und Vehikel für die Bereitstellung von Transgenen sind bekannt und können verwendet werden, um die Transgene der Erfindung bereitzustellen.
  • Beispielsweise kann das Transgen in gewünschte Zellen in vitro transfiziert werden, um die transformierten Zellen in ein unter einer angiogenetischen Krankheit leidendes Tier injiziert werden, vorzugsweise nach Expansion der Anzahl von transformierten Zellen. Verfahren zur Transfektion eines Transgens in Zellen in vitro sind gut bekannt und beinhalten die Elektroporation, die direkte Injektion von nackter DNA in Zellen, Teilchenbombardierung, Bereitstellung durch Liposomen oder andere Lipid-basierende Träger, Bereitstellung durch virale Vektoren etc.
  • Alternativ kann das Transgen dem Tier derart verabreicht werden, dass es Zellen innerhalb des Tieres transformiert. Verfahren zur Bereitstellung von Transgenen in vivo sind auch gut bekannt und beinhalten die direkte Injektion von nackter DNA in gewünschtes Gewebe, Organe oder Tumoren, Verwendung von Liposomen oder anderen Lipid-basierenden Trägern zur Bereitstellung des Transgens, Verwendung eines nicht-infektiösen viralen Vektors (z.B. ein adenoviraler Vektor mit Replikationsdefekt) zur Bereitstellung des Transgens, Verwendung von Ziel-Vehikeln (ein Vehikel, das es dem Vehikel ermöglicht, an eine spezifische Zelle, Gewebe, Organ oder Tumor wie Liposomen mit einem tumorspezifischen Antikörper, der an diese gebunden ist, zu binden) und das Transgen an diese freizusetzen.
  • Erfindungsgemäß können Antikörper verwendet werden, die selektiv an ein erfindungsgemäß verwendetes Plasminogenfragment binden, einschließlich Antikörpern, die selektiv an natives Angiostatin binden. "Selektives Binden" bedeutet, dass der Antikörper an das Plasminogenfragment der Erfindung bindet, wie natives Angiostatin, vorzugsweise an Plasminogen oder Plasmin.
  • Antikörper beinhalten polyklonale Antikörper, affinitätsgereinigte Antiseren, monoklonale Antikörper, Fragmente von Antikörpern (wie Fab, F(ab') oder F(ab')2), die Antigene binden können, jeder bekannte Isotyp oder Subklasse von Antikörper und geschneiderte Antikörper (wie Einzelkettenantikörper, hergestellt durch rekombinante DNA-Techniken). Das einzige Erfordernis ist, dass die abschließende Antikörper-Präparation Spezifität für das Plasminogenfragment aufweist und selektiv an das Fragment binden kann.
  • Verfahren zur Herstellung von Antikörpern und Fragmenten von Antikörpern sind in der Technik gut bekannt. Beispielsweise können die Antikörper hergestellt werden durch Injektion eines Plasminogenfragments der Erfindung zusammen mit einem Hilfsstoff in ein geeignetes Wirtstier. Die Injektionen des Fragments werden fortgesetzt, bis ein Antiserum mit geeignetem Titer erhalten wird. Das Antiserum wird geerntet und kann unter Verwendung bekannter Techniken weiter gereinigt werden, falls nötig oder gewünscht. Beispielsweise können die Antikörper affinitätsgereinigt werden oder können fraktioniert werden, wie durch DE-52-Chromatographie.
  • Vorzugsweise werden die Antikörper jedoch hergestellt durch somatische Zellhybridisierung durch Verschmelzen von Zellen aus einem immunisierten Tier (wie Ratten, Hamster, Mäuse und anderes Säugetier) mit einer immortalen Zelllinie wie Myeloma-Zellen. Die verschmolzenen Zellen werden kloniert und monoklonale Antikörper mit zweckmäßiger Spezifität können isoliert werden durch Screenen der klonierten verschmolzenen Zellen. Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind gut bekannt.
  • Antikörper, die selektiv an ein erfindungsgemäß verwendetes Plasminogenfragment binden, können verwendet werden, um die Plasminogenfragmente von diese enthaltenden Flüssigkeiten zu reinigen. Derartige Flüssigkeiten beinhalten Kulturmedien wie solche, die aus der Praxis der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von nativem Angiostatin und den Plasminogenfragmenten der Erfindung resultieren (siehe Vorstehendes). Natives Angiostatin wird zusätzlich in Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Plasma, Serum, Speichel, Urin und durch Tumoren hergestellte Fluide) gefunden.
  • Zur Reinigung eines Plasminogenfragments wird das dieses enthaltende Fluid mit einem Antikörper kontaktiert, der für das spezielle Fragment spezifisch ist. Vorzugsweise wird der Antikörper an eine feste Oberfläche angeheftet, bevor er mit der das Fragment enthaltenden Flüssigkeit kontaktiert wird. Geeignete feste Oberflächen sind in der Technik gut bekannt und kommerziell erhältlich. Beispiele beinhalten Glas, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat, Polycarbonat, Polyacrylnitril, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Latexkugeln, Agarosekugeln und Nylon.
  • Der Antikörper wird vorzugsweise kovalent an die feste Oberfläche angeheftet. Verfahren und Mittel zur kovalenten Anheftung von Antikörpern an feste Oberflächen sind in der Technik gut bekannt. Geeignete Mittel beinhalten Carbodiimid, Cyanoborhydrid, Diimidoester, Periodat, Alkylhalogenide, Succinimide, Dimethylpimelimidat und Dimaleimide. Siehe Blair et al., J. Immunol. Methods, 59, 129 (1993); Blair et al., Cancer Res., 41, 2700 (1981)); Gautheier et al., J. Expr. Med., 156, 766 (1982).
  • Die spezifischen Konzentrationen der Reaktanten, die Temperatur und Zeit der Inkubation ebenso wie weitere Bedingungen zum Erhalt der Bindung des Antikörpers an das Plasminogenfragment können abhängig von derartigen Faktoren wie Konzentration des Plasminogenfragments in der Flüssigkeit, Beschaffenheit des Fluids und dergleichen variiert werden. Der Fachmann kann operative und optimale Bedingungen bestimmen unter Einsatz von Routine-Experimenten.
  • Nachdem der Antikörper an das Plasminogenfragment gebunden wurde, wird der Rest der Flüssigkeit von dem gebundenen Plasminogenfragment abgetrennt. Das Plasminogenfragment wird dann von dem Antikörper durch bekannte Verfahren freigesetzt.
  • Am besten wird eine feste Oberfläche mit dem daran gebundenen Antikörper in einer Säule lokalisiert. Beispielsweise eine mit Agarosekügelchen mit dem daran gebundenen Antikörper gefüllte Säule. Die Flüssigkeit, die die Plasminogenfragmente enthält, wird einfach über die Säule gegeben und die Plasminogenfragmente in der Flüssigkeit binden an den Antikörper in der Säule und werden in der Säule zurückgehalten, während der Rest der Flüssigkeit durch die Säule hindurchläuft. Nachdem die Säule gewaschen wurde, werden die Plasminogenfragmente von dem Antikörper freigesetzt.
  • Antikörper, die selektiv an natives Angiostatin binden, können auch verwendet werden, um natives Angiostatin zu detektieren oder quantifizieren für die Diagnose einer angiogenetischen Krankheit oder zur Überwachung des Wiederauftretens einer derartigen Krankheit. Derartige Antikörper können auch verwendet werden, um den Mechanismus der Wirkung von Angiostatin im Körper zu untersuchen.
  • Natives Angiostatin kann in Materialien wie Körperflüssigkeiten (siehe Vorstehendes), Zellen und Gewebe (Tumorgewebe, Plazenta, Uterus, Gehirn, Leber und Darm) detektiert werden. Natives Angiostatin kann aus den Zellen oder Geweben durch bekannte Extraktionstechniken freigesetzt werden oder intakte Zellen oder Gewebeabschnitte können verwendet werden.
  • Das native Angiostatin in den Flüssigkeiten oder Extrakten kann unter Verwendung herkömmlicher Immunonachweis-Techniken detektiert oder quantifiziert werden. Derartige Techniken beinhalten Agglutination, Radioimmunonachweis, Enzym-Immunonachweis, Fluoreszenz-Nachweis, kolorimetrische Nachweise etc. Der Immunonachweis kann im kompetitiven Bindungsformat durchgeführt werden oder kann ein immunometrischer Nachweis sein. Er kann ein homogener oder heterogener Nachweis sein. Geeignete homogene Techniken sind Fluoreszenzunterdrückung und -verstärkung, Energietransfer-Immunonachweis, doppelter Antikörper-Immunonachweis mit sterischer Hinderung, Immunnachweis mit Substratkennzeichnung, Immunnachweis mit Kennzeichnung durch prosthetische Gruppe und Immunnachweis mit Kennzeichnung durch Enzymmodulator.
  • Das native Angiostatin auf den Zellen oder Geweben kann durch immunohistochemische Standard-Techniken, die in der Technik gut bekannt sind, detektiert werden. Beispielsweise werden Tumoren durch Biopsie gewonnen oder gesammelt und Gewebeabschnitte mit einem Mikrotom geschnitten, um die Stellen der nativen Angiostatinproduktion zu untersuchen. Derartige Information ist verwendbar für diagnostische und möglicherweise therapeutische Zwecke zur Detektion und Behandlung von Krebs und ist verwendbar für Forschungszwecke zur Untersuchung des Wirkungsmechanismus von Angiostatin.
  • Das native Angiostatin kann unter Verwendung eines markierten Antikörpers detektiert oder quantifiziert werden, welcher selektiv an natives Angiostatin bindet (primäre Antikörper) oder eine markierte Komponente, die an Immunglobulin bindet sowie ein weiterer Antikörper (sekundärer Antikörper) oder Protein A. Geeignete Marker, entweder für den primären Antikörper oder für die Komponente, die an den primären Antikörper bindet, sind in der Technik gut bekannt. Sie beinhalten: 1) Enzyme (z.B. Meerrettich-Peroxidase, Malatdehydrogenase, Nuklease aus Staphylococcus, delta-5-Steroidisomerase, Alkoholdehydrogenase aus Hefe, alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Glucoamylase und Acetincholinesterase); 2) Fluorophore (wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin), 3) Radionukleotide (wie 125I); 4) Biolumineszenz-Marker (wie Luciferin, Luciferase und Aequorin); 5) chemilumineszente Marker (wie Luminol, Isoluminol, aromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester); 6) spezielle Marker (wie Gold-Nanopartikel); und 7) Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin. Die Bindung und Detektion dieser Marker kann unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Die spezifischen Konzentrationen der Reaktanten, die Temperatur und Zeit der Inkubation ebenso wie weitere Bedingungen können in jedem Immunnachweis variiert werden oder es wird eine immunohistochemische Technik verwendet, abhängig von derartigen Faktoren wie Konzentration des nativen Angiostatins in der Probe, Beschaffenheit der Probe und dergleichen. Der Fachmann kann operative und optimale Bedingungen für jede Bestimmung unter Verwendung von Routine-Untersuchungen bestimmen.
  • Die Verwendung eines Test-Kits zur Detektion oder Quantifizierung von nativem Angiostatin wird auch offenbart. Das Kit ist eine verpackte Kombination eines oder mehrerer Behälter, die zur Ausführung des Immunnachweis oder von immunohistochemischen Techniken der Erfindung verwendbare Reagenzien beinhalten. Geeignete Behälter für die Reagenzien des Kits beinhalten Kolben, Fläschchen, Teströhrchen, Mikrotiter-Platten, Eintauchstäbchen, Streifen und andere feste Oberflächen.
  • Das Kit umfasst einen Behälter eines Antikörpers, der selektiv an natives Angiostatin bindet. Diese Antikörper sind diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden. Der Antikörper kann in Lösung sein, kann lyophilisiert sein oder an eine feste Oberfläche angeheftet sein und kann markiert oder unmarkiert sein. Die festen Oberflächen sind die Typen, die vorstehend beschrieben wurden und der Antikörper wird angeheftet, wie vorstehend beschrieben.
  • Das Kit kann ferner einen Behälter umfassen, der die vorstehend beschriebene markierte Komponente beinhaltet, welche an den primären Antikörper bindet. Die Marker sind diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden.
  • Schließlich kann das Kit auch andere Materialien enthalten, die in der Technik gut bekannt sind und welche vom kommerziellen Standpunkt oder vom Standpunkt des Anwender aus wünschenswert sind. Derartige Materialien können eine Probe von nativem Angiostatin (für die Standardisierung von Immunnachweisen oder zur Bindung an Zellen oder Gewebe in immunohistochemischen Techniken), Puffer, Enzymsubstrate, Verdünnungsmittel und Ausrüstung zur Durchführung des Immunnachweis oder der immunohistochemischen Technik beinhalten.
  • BEISPIELE
  • Vergleichsbeispiel 1:
  • Herstellung von konditioniertem Medium, enthaltend Plasminogen-Angiostatin-Umwandlungsaktivität (PACA)
  • Dieses Beispiel zeigt, dass eine Vielzahl von Zellen enzymatische Aktivität exprimieren, die bioaktives Angiostatin aus gereinigtem humanem Plasminogen oder Plasmin erzeugen können. Affinitätsgereinigtes Angiostatin, erzeugt durch Inkubieren von Plaminogen oder Plasmin mit serumfreiem, konditioniertem Medium (SFCM) inhibierte das Wachstum von humanen Endothelialzellen, induzierte die Migration von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) durch angiogenetischen Faktor, Schlauchbildung von Endothelialzellen, und bFGF-induzierte corneale Angiogenese. Serin-Proteinaseinhibitoren, aber nicht Inhibitoren von Metallo-, Cystein- oder Asparagin-Proteinase, blockierten die Erzeugung von Angiostatin. Elastatinal, ein spezifischer Inhibitor von Elastase, konnte die Angiostatin-Erzeugung nicht blockieren, was zeigt, dass eine Elastase nicht für die Umwandlung von Plasminogen in Angiostatin verantwortlich ist. Statt dessen zeigen die Daten, dass Serin-Proteinase-Aktivität für die Angiostatinerzeugung notwendig ist.
  • A: Verfahren
  • 1. Zellkultur.
  • Endothelialzellen der humanen Nabelvene (HUVEC) ließ man in RPMI, supplementiert mit 20% Rinderkalbserum (Hyclone Laboratories Inc., Logan Utah #A-2151-L), 100 U/ml Penicillin G, 100 mg/ml Streptomycin, L-Glutamin, (Gibco BRL), 2500 U Natriumheparin (Fisher Scientific, Itasca, Il) und 50 mg/ml Endothelialzell-Wachstumssupplement (Collaborative Biomedical Research, Bedford, MA) wachsen. Die anderen, in Tabelle 1 gelisteten Zellen ließ man in RPMI-1640, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin G, 100 mg/ml Streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) wachsen. Die Zellen wurden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO2 gehalten. Zur Erzeugung von SFCM wurden konfluente Zell-Monoschichten zweimal mit phosphatgepufferter Saline gewaschen, dann wurde serumfreies RPMI zugegeben. SFCM wurde am nächsten Tag gesammelt und bei 3000 U/min 15 Minuten lang zentrifugiert, um unlösliche Zellreste zu entfernen.
  • 2. Angiostatin-Erzeugung.
  • Zwei Mikrogramm humanes Plasminogen, erhalten durch Lysin-Sepharose-Affinitätschromatographie von humanem Plasma (Castellino & Powell, Methods Enzymol, 80, 365–78 (1981)) oder humanes Plasmin (#527624, Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA) wurden zu 100 μl Aliquots von SFCM zugegeben und die Mischung wurde bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Aliquots wurden auf Angiostatinerzeugung mittels Western-Blot analysiert (siehe Nachstehendes). Plasminogenspaltung durch SFCM wurde auch in Gegenwart von Proteinaseinhibitoren (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) untersucht.
  • 3. Western-Blot.
  • Die Proben wurden bei nicht-reduzierenden Bedingungen auf 12%igen Polyacrylamidgelen (NOVEX, San Diego, CA) in Tris-Glycin-Laufpuffer (Laemmli, Nature, 227, 680–685 (1970)) mit Elektrophorese behandelt und auf eine 0,45 μM Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) (Immobilon, Millipore, Bedford, M. A.) elektrotransferiert. Die Membran wurde dann 30 Minuten lang in Blockierpuffer (1%iges Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Saline) blockiert und mit einer 1:1000-Verdünnung eines monoklonalen Antikörpers gegen das Fragment der Kringel 1–3 (K1–3) von humanem Plasminogen (VAP 230L, Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN) sondiert. Nach Waschen wurde die Membran 30 Minuten lang mit analkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-anti-Maus IgG sekundärem Antikörper (Kirkegaard & Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD) inkubiert und unter Verwendung von 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphat/Nitroblautetrazolium (KPL) entwickelt.
  • 4. Zymographische Analyse.
  • Zymogramme zur Detektion von Matrix-Metallproteinase-Aktivität wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Heussen & Dowdle, Anal. Biochem., 102, 196–202 (1980).
  • 5. Chromogene Peptidsubstrate.
  • Zur Bestimmung, ob eine Elastase vorhanden war, wurden 50 μl von SFCM mit 0,3 mM chromogenen Peptidsubstraten, die spezifisch für Elastase sind (Substrat I, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA; Substrat II, Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA); Substrat III, pGlu-Pro-Val-pNA; Substrat IV, Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-pNA) (Calbiochem-Novabiochem Corp.) bei 37°C für 2–18 Stunden inkubiert. Die Substratspaltung wurde bestimmt durch Überwachung der Absorption bei 405 nm (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
  • 6. Lysin-Sepharose-Reinigung von Angiostatin.
  • Zur Erzeugung von gereinigtem Angiostatin für Bioaktivitätsanalysen wurde humanes Plasminogen mit PC-3 SFCM bei 20 μg/ml über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde auf eine Lysin-Sepharose-Säule (Pharmacia Biotech) aufgebracht, voräquilibriert mit TBS (50 mM Tris, pH 7,5 und 150 mM NaCl). Nach Waschen mit TBS zur Entfernung von nicht spezifisch gebundenem Protein wurde Angiostatin in 0,2 M epsilon-Aminocapronsäure (EACA) in TBS eluiert. Die eluierte Fraktion wurde gegen phosphatgepufferte Saline dialysiert (Molekulargewichtgrenze 12.000–14.000). Zur Entfernung von restlichem Plasmin wurde das Angiostatin auf eine Säule mit Sojabohnen-Trypsininhibitor-Agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) aufgebracht und der Durchfluss gesammelt, über Filter sterilisiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Angiostatin wurde quantifiziert durch Messen der Absorption bei 280 nm unter Verwendung von A1%/1cm von 8.0. Sottrup-Jensen et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Seiten 191–209 (Davidson et al. Hrsg. 1978). Das gereinigte Angiostatin wurde auch mit Färbung durch Coomassie-Brilliantblau auf Polyacrylamidgelen und durch Immunodetektion mittels Western-Blot untersucht. Elastase erzeugtes Angiostatin, gereinigt aus humanem Plasma, wie beschrieben in O'Reilly, et al., Nature Med., 2, 689–692 (1996) war ein großzügiges Geschenk von M. S. O'Reilly, Children's Hospital, Harvard University, Boston, MA.
  • 7. Mikrosequenzanalyse von Angiostatin.
  • Zur Bestimmung des NH2-Terminus der Angiostatinbanden wurden 10 μg/ml des affinitätsgereinigten Angiostatin, hergestellt durch Inkubieren von Plasminogen mit PC-3 SFCM auf einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel durch Elektrophorese behandelt, auf eine PVDF-Membran elektroübertragen und mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Banden wurden ausgeschnitten, auf Porton-Proben-Trägerscheiben platziert und unter Verwendung eines gepulsten Flüssigphasen-Sequenzgeräts mit Phenylthiohydantoin-Analyse sequenziert.
  • 8. Endothelialzell-Proliferationsnachweis.
  • Die Zellproliferation wurde bestimmt unter Verwendung von CellTiter 96TM AQ nicht-radioaktiver Zellproliferationsnachweis (Promega Corp., Madison, WI). Die humanen Endothelialzellen wurden auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) mit einer Konzentration von 5,0 × 103 Zellen/Vertiefung plattiert. Am darauffolgenden Tag wurden 1, 5, 8 oder 10 μg/ml Angiostatin in frischem Medium in dreifachen Vertiefungen zugegeben. Vertiefungen ohne Angiostatin dienten als Kontrolle. Die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert und eine Absorption bei 490 nm ergab die Anzahl von proliferierenden Zellen und wurde gemessen unter Verwendung eines automatisierten Mikroplatten-Lesegeräts (Molecular Devices). Die Ergebnisse werden als Prozentsatz von nicht behandelter Kontrollzellzahl dargestellt.
  • 9. Endothelialzell-Migrationsnachweis.
  • Zur Bestimmung der Fähigkeit von Angiostatin, hergestellt durch Inkubation von Plasminogen mit PC-3 SFCM zur Blockierung der Migration von Endothelialzellen gegen einen angiogenetischen Faktor, bFGF, wurden Migrationsnachweise in einer modifizierten Boyden-Kammer unter Verwendung von kapillaren Rinder-Endothelialzellen (freundliches Geschenk von Dr. Folkman, Harvard Medical School, Boston, MA), wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Dameron et al., Science, 265, 1582–84 (1994). Man ließ die Zellen in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Donor-Kalbserum und 100 mg/ml Endothelialzell-Mitogen wachsen und verwendete sie bei Passage 15. Zur Bestimmung der Migration wurden die Zellen über Nacht in DMEM, supplementiert mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) an Serum verarmt, geerntet, in DMEM/BSA suspendiert, mit 106/ml auf der unteren Oberfläche einer gelatinisierten Membran (Nucleopore Corp., Plesanton, CA) in einer inversen Boyden-Kammer plattiert und 1,5 bis 2 Stunden inkubiert, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Die Kammern wurden wieder umgedreht, das Testmaterial wurde in die obere Vertiefung gegeben und die Kammer wurde für zusätzliche 3–4 Stunden inkubiert. Die Membranen wurden dann fixiert und gefärbt und die Zellzahl, die zu der Oberseite des Filters in 10 Hochspannungsfeldern gewandert waren, wurde bestimmt. DMEM mit 0,1% BSA wurde als negative Kontrolle verwendet und bFGF (bereitgestellt von Dr. Noel Bouck und hergestellt wie in Dameron et al., Science, 265, 1582–1584 (1994)) beschrieben, mit 10 ng/ml wurde als positive Kontrolle verwendet.
  • 10. Endothelialzell-Schlauchbildung.
  • HUVEC wurde auf Gelen von Matrigel (freundlicherweise bereitgestellt von Hynda Kleinman, National Institute of Dental Research) in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen, wie vorstehend beschrieben, plattiert. Schnaper et al., J. Cell. Physiol, 156, 235–246 (1993). Angiostatin, hergestellt durch Inkubation mit PC-3 SFCM in nicht-konditioniertem RPMI wurde in die Vertiefungen gegeben, gefolgt von Zellen mit einer abschließenden Konzentration von 4,0 × 104 Zellen in 1 ml von 50%igem HUVEC-Kulturmedium, 50% RPMI. Jede Angiostatin- oder Kontrollbedingung wurde dreifach ausgewertet. Die Kulturen wurden 16 bis 18 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 in der Feuchte inkubiert, dann mit einer Diff-Quick-Lösung II (Baxter, McGraw Park, IL) fixiert. Eine repräsentative Fläche des Schlauchnetzwerks wurde unter Verwendung einer Polaroid MicroCam-Kamera mit einer Endvergrößerung von 35× fotografiert. Die Fotografien wurden dann durch einen Blind-Beobachter quantifiziert, der die Länge jedes Schlauchs maß, wobei Schlauchbereiche, die unvollständig waren, korrigiert wurden. Die Gesamtlänge der Schläuche wurde für jede Fotografie bestimmt und die mittlere Schlauchlänge wurde bestimmt. Die Ergebnisse wurden als mittlere ± Standardabweichung ausgedrückt.
  • 11. Cornealer Angiogenese-Nachweis.
  • Der corneale Nachweis wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Polverini et al., Methods Enzymol, 198, 440–450 (1991). Kurz gesagt wurden 5 μl Hydron-Pellets (Hydron Laboratories, New Brunswick, NJ), enthaltend 10 μg/ml bFGF oder bFGF plus 1 oder 10 μg/ml Angiostatin in die Cornea von anästhetisierten Ratten implantiert. Nach 7 Tagen wurden die Tiere geopfert und corneale Gefäße wurden mit kolloidalem Kohlenstoff gefärbt und die Cornea wurde auf angiogenetische Aktivität untersucht.
  • B. Ergebnisse
  • 1. Angiostatin-Erzeugung durch konditioniertes Kulturmedium.
  • Die Inkubation von humanem Plasminogen mit SFCM, hergestellt durch PC-3-Zellen, ergab die Erzeugung von multiplen immunoreaktiven Banden bei etwa 50 kD (1A), ähnlich denen, die von O'Reilly et al., Cell, 79, 315–328 (1994) beobachtet wurden. Die Überprüfung von SFCM aus zusätzlichen Zelllinien klärte auch die Erzeugung der multiplen Banden auf, ähnlich dem PC-3 SFCM (Daten nicht gezeigt). Diese Zelllinien sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
  • Die anfängliche Indikation, dass das Produkt Angiostatin war, basierte auf der Immunoreaktivität mit dem für Kringel 1–3 (K1–3) von Plasminogen spezifischen monoklonalen Antikörper und der Größe des Spaltprodukts. Anschließende Bestätigung, dass das Plasminogen-Spaltungsprodukt bioaktives Angiostatin war, wird nachstehend beschrieben.
  • Die Angiostatin-Erzeugung durch PC-3 SFCM war zeitabhängig. Es gab eine beträchtliche Abnahme des Plasminogensubstrats und einen entsprechenden Anstieg an Angiostatin, beginnend bei 3 Stunden mit vollständiger Umwandlung in Angiostatin in 24 Stunden (1B). Die Verdünnung der PC-3 SFCM ergab eine proportionale Abnahme an Angiostatin-Erzeugung (1C und 1D).
  • Zur Bestimmung, ob Plasmin, die aktivierte Form des Zymogens Plasminogen, auch in Angiostatin umgewandelt werden kann, wurde Plasmin als ein potenzielles Substrat ausgewertet. Die Inkubation von Plasmin mit PC-3 SFCM ergab ein Produkt, das von dem Plasminogen-abgeleiteten Angiostatin nicht unterscheidbar war (1A). In kinetischen Studien wurde Plasmin in Angiostatin mit vergleichbarer Rate zu der des Plasminogens umgewandelt; 50% Umwandlung in 8 Stunden mit vollständiger Umwandlung in 24 Stunden (Daten nicht gezeigt). Diese Daten legen nahe, dass sowohl Plasminogen als auch Plasmin in vitro-Substrate sind, aus denen Angiostatin erzeugt werden kann.
  • Tabelle 1
    Figure 00520001
  • 2. Enzymatische Klasse von Plasminogen-Angiostatin-Umwandlungsaktivität.
  • Zur Bestimmung der proteolytischen Klasse der Angiostatin-erzeugenden Aktivität wurde PC-3 SFCM mit Plasminogen in Gegenwart verschiedener Proteinaseinhibitoren inkubiert. Die Proteinaseinhibitoren wurden zu dem SFCM-Plasminogen-Mix vor der Über-Nacht-Inkubation zugegeben. Die Proben wurden durch Western-Blot auf den Nachweis der Inhibierung der Angiostatin-Erzeugung analysiert.
  • Lediglich Serin-Proteinaseinhibitoren blockierten die Angiostatin-Erzeugung (siehe nachstehende Tabelle 2). Im Gegensatz dazu war keiner der weiteren Klassen an Proteinaseinhibitoren effektiv.
  • Angiostatin kann in vitro durch limitierte Proteolyse von Plasminogen durch Elastase erzeugt werden. Sottrup-Jensen et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, 3, 191–209 (Davidson et al., Hrsg. 1978); O'Reilly et al., Nature Med., 2, 689–692 (1996); Dong et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 37, 58 (1996). In der vorliegenden Untersuchung wurde die Angiostatin-Erzeugung nicht durch Elastatinal, einen spezifischen Inhibitor der Elastase, inhibiert (siehe nachstehende Tabelle 2). Zusätzlich wurde keine Elastase-Aktivität in PC-3 SFCM detektiert, basierend auf der Co-Inkubation von SFCM mit 4 Elastase-empfindlichen chromogenen Substraten für 24 Stunden (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, dass die humane Plasminogen-Angiostatin-Umwandlungsaktivität wahrscheinlich nicht von der Wirkung einer Elastase abhängt. Ferner enthüllten Gelatin-Zymogramme keinen Nachweis an aktiven oder latenten Metalloproteinasen in dem PC-3 SFCM (nicht gezeigt). Tabelle 2
    Figure 00540001
    • * Vollständige Inhibierung ist definiert als keine immunoreaktiven Angiostatin-Banden; schwache Inhibierung ergibt die Entwicklung von schwachen immunoreaktiven Angiostatin-Banden; und "Keine" bezieht sich auf die vollständige Erzeugung von Angiostatin.
  • 3. Reinigung von Angiostatin.
  • Durch PC-3 SFCM erzeugtes Angiostatin wurde affinitätsgereinigt auf Lysin-Sepharose (O'Reilly et al., Nature Med., 2, 689–692 (1996)) und das resultierende Produkt wurde mit Western-Blot und Coomassie-Blaufärbung untersucht (2). Die aminoterminale Sequenz aller drei Banden war KVYLSECKTG [SEQ ID NO: 1], die den Resten 78–87 des Plasminogenmoleküls entspricht, was bestätigt, dass das Produkt ein internes Fragment von Plasminogen war.
  • 4. Durch PC-3 SFCM erzeugtes Angiostatin inhibiert die Angiogenese.
  • Da die Angiogenese eine Kaskade von zellulären Prozessen darstellt, die die Endothelialzell-Proliferation, Wanderung und Schlauchbildung beinhaltet (Folkman & Shing, J. Biol. Chem., 267, 10931–10934 (1992)), wurden vielfache in vitro- und in vivo-Nachweise in Bezug auf die Angiogenese verwendet, um zu bestätigen, dass das durch die Inkubation von Plasminogen mit PC-3 SFCM erzeugte Produkt bioaktives Angistation war.
  • Das affinitätsgereinigte Angiostatin, erzeugt durch PC-3 SFCM, inhibierte die humane Endothelialzell-Proliferation in einer konzentrationsabhängigen Weise mit beträchtlicher Inhibierung, die bei 10 μg/ml (P < 0,05) im Vergleich zu der nicht behandelten Kontrollzellproliferation beobachtet wurde (3A).
  • Das durch PC-3 SFCM erzeugte Angiostatin inhibierte auch die bFGF-induzierte Wanderung von kapillaren Rinder-Endothelialzellen (3B) mit einem ED50 von 0,35 μg/ml. Die Dosis/Antwort-Kurve von Angiostatin, erzeugt durch PC-3 SFCM war nicht unterscheidbar von der von Elastase erzeugtem Antiostatin. Die Inhibierung der Wanderung trat bei einer 10fach geringeren Konzentration auf, als zur Inhibierung der Proliferation erforderlich, eine Feststellung, die für andere Inhibitoren der Angiogenese berichtet wurde. Takano et al., Cancer Res., 54, 2654–2660 (1994). Dies kann an der Tatsache liegen, dass der Proliferationsnachweis im Gegensatz zu dem Wanderungsnachweis in RPMI, supplementiert mit 20 Rinderserum und Endothelialzell-Wachstumssupplement durchgeführt wurde und daher vielfache stimulatorische Faktoren enthielt.
  • Die Endothelialzell-Schlauchbildung auf Matrigel wurde beträchtlich bei 15 μg/ml inhibiert (4A und B); die mittlere Länge der Schläuche in der nicht behandelten Kontrolle war 674,5 ± 54 mm im Vergleich zum Angiostatin, produziert durch PC-3 SFCM, 287,7 ± 47 mm (P < 0,005).
  • Zur Bestimmung des Effekts von Angiostatin, erzeugt durch PC-3 SFCM auf die corneale Angiogenese in vivo wurde dessen Fähigkeit, bFGF-induzierte Angiogenese zu blockieren, in dem cornealen Angiogenese-Nachweis untersucht. Das bFGF-Pellet indizierte die Angiogenese in 100% der implantierten Cornea (5A). Im Gegensatz dazu inhibierte Angiostatin bei 10 μg/ml vollständig die bFGF-induzierte angiogenetische Antwort in 3 von 3 Tieren (5B). Bei einer geringeren Dosis von 1,0 μg/ml blockierte Angiostatin vollständig die Angiogenese in 2 von 3 Tieren mit teilweiser Inhibierung in dem dritten Tier.
  • Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Angiostatin, erzeugt durch PC-3 SFCM, ein potenter Inhibitor sowohl der in vitro- als auch der in vivo-Angiogenese ist.
  • Vergleichsbeispiel 2:
  • Identifizierung von Faktoren, verantwortlich für die Umwandlung von Plasminogen in Angiostatin
  • Man ließ die humane Prostatakarzinom-Zelllinie PC-3 wachsen und PC-3 SFCM wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Angiostatin wurde erzeugt durch Inkubation mit PC-3 SFCM oder anderen nachstehend identifizierten Materialien, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Western-Blots wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
  • PC-3 SFCM wurde auf eine Reaktivrot 120-Agarose-Säule (Sigma Chemical Co.) aufgegeben. Der Durchfluss besaß keine restliche Plasminogen-Angiostatin erzeugende Aktivität (PACA), wie durch Western-Blot-Analyse gezeigt (6). Das gebundene Material wurde mit 1 M KCl nach dem Protokoll des Herstellers eluiert, dann gegen Tris-gepufferte Saline (TBS, 20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 6000–8000 Dalton dialysiert. PACA wurde in der dialysierten Fraktion nicht detektiert (6). Die Beobachtung, dass PACA weder im Durchfluss noch dem Eluat detektiert wurde, führte zur Hypothese, dass zwei oder mehrere Faktoren notwendig sein, um Angiostatin aus Plasminogen oder Plasmin zu erzeugen und dass die Faktoren durch die Reaktivrot 120-Agarose-Chromatographe abgetrennt wurden, wobei einer oder mehrere Faktoren in dem Eluat und ein weiterer Faktor in dem Durchfluss enthalten waren.
  • Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde das dialysierte Eluat mit dem Durchfluss rekombiniert. Die rekombinierten Materialien konnten Plasminogen in Angiostatin überführen. Supplementierung des Eluats mit frischem RPMI-Kulturmedium ebenso wie der Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss stellten die Fähigkeit des Eluats wieder her, Angiostatin zu erzeugen, was nahe legte, dass der notwendige Faktor eine Komponente von RPMI war und nicht ein Protein oder ein anderer Faktor, der dem SFCM eigen ist.
  • Zur weiteren Definition des mutmaßlichen Cofaktors wurden die einzelnen Komponenten von RPMI hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewertet, das Reaktivrot 120-Agarose-Eluat zu komplementieren. Der Cofaktor war in der RPMI-Aminosäure-Mischung vorhanden (6).
  • Zur Bestimmung der Aminosäure, die PACA zu dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat wieder herstellen konnte, wurden die in RPMI gefundenen 20 Aminosäuren einzeln untersucht. L-Cystein war die einzige Aminosäure, die PACA zu dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat wieder herstellen konnte (Daten nicht gezeigt).
  • Da die Zugabe von L-Cystein zu dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat die Angiostatin-erzeugende Aktivität wieder herstellte, wurde hypothetisch angenommen, dass der Cofaktor ein Sulfhydryldonor war. Pharmakologisch reduzierende Mittel, D-Penicillamin und Captopril wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, PACA zu dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat wieder herzustellen. Die Zugabe von 100 μM D-Penicillamin zu dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat stellte die Angiostatin-erzeugende Aktivität wieder her. Captopril stellte auch die Angiostatin-erzeugende Aktivität zu dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat wieder her.
  • PC-3 SFCM wurde mit 50 mM Tris, pH 10,0, 20 mM NaCl verdünnt und auf eine Hi-Q Sepharose-Anionaustauschharz (Bio Rad) aufgegeben. Kein PACA wurde in dem Durchfluss detektiert.
  • Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass PACA von der Hi-Q Sepharose-Säule mit 300 mM NaCl eluiert wurde. Daher wurde das gebundene Material unter Verwendung eines linearen Gradienten von 20 mM bis 300 mM NaCl eluiert. PACA und Aktivität von Plasminogenaktivator des Urokinase-Typs (u-PA) wurden in den Fraktionen gemessen (nach Verdünnung zur Wiederherstellung von physiologischen NaCl-Konzentrationen). Die u-PA-Aktivität und PACA wurden co-gereinigt (7). Die Untersuchung des Reaktivrot 120-Agarose-Eluats enthüllte, dass es auch u-PA enthielt.
  • Wie in Beispiel 1 bemerkt, ist die NH2-terminale Spaltung von Angiostatin bei Lys77, einer Stelle, die sich aus der Spaltung von Glu-Plasminogen durch Plasmin ergibt. Dies legt nahe, dass die Plasminerzeugung ein notwendiger intermediärer Schritt in der Angiostatin-Erzeugung aus Plasminogen ist.
  • Zur Bestimmung, ob der Faktor in dem Reaktivrot 120-Agarose-Eluat u-PA war, wurde u-PA als Ersatz für das Reaktivrot 120-Agarose-Eluat untersucht. Wie in 8 erläutert, konnte u-PA Angiostatin in Gegenwart von kochendem Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss oder RPMI Angiostatin erzeugen, beides Quellen von Sulfhydryldonoren. Dies zeigt, dass das einzige Protein, das für die Umwandlung von Plasminogen in Angiostatin notwendig ist, u-PA ist.
  • Dann wurde u-PA, Plasminogenaktivator vom Gewebe-Typ (t-PA) und Streptokinase in Kombination mit dem Reaktivrot 120-Agarose-Durchfluss auf PACA untersucht. Die Plasminogenaktivatoren alleine konnten Angiostatin aus Plasminogen nicht erzeugen, aber in Gegenwart des Durchflusses wurde Angiostatin produziert (9). Diese Daten legen nahe, dass die Plasminerzeugung ein intermediärer Schritt zur Angiostatin-Erzeugung ist und dass die Angiostatin-Erzeugung nicht davon abhängig ist, welcher Plasminogenaktivator vorhanden ist.
  • Vergleichsbeispiel 3:
  • Erzeugung von Angiostatin unter Verwendung von Plasminogenaktivatoren und Sulfhydryldonoren
  • Nachdem demonstriert wurde, dass das einzige, für die Umwandlung von Plasminogen in Angiostatin notwendige Protein ein Plasminogenaktivator ist und dass ein Sulfhydryldonor ein notwendiger Cofaktor ist, wurde dann bestimmt, ob diese Komponenten zur Angiostatin-Erzeugung ausreichend sind. Alle Inkubationen wurden bei 37°C für 18 Stunden in TBS durchgeführt und die resultierenden Proben wurden auf Angiostatin durch Western-Blot analysiert (durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben).
  • Die Inkubation von u-PA mit Plasminogen und wenigstens 5 μm reduziertem Glutathion produzierte Angiostatin (10). Kein Angiostatin wurde in Abwesenheit von Glutathion produziert.
  • Die Verwendung von 100 μM oder 1 mM D-Penicillamin in Kombination mit u-PA konnte auch Angiostatin erzeugen (11).
  • Schließlich ergab die Inkubation von Plasminogen (0,2 μM) mit u-PA (0,2 nM), t-PA (1,0 nM) oder Streptokinase (8,0 nM) mit 100 μM N-Acetyl-L-cystein die Produktion von Angiostatin (12). Plasminogen wurde nicht in Angiostatin in Abwesenheit von N-Acetyl-L-cystein umgewandelt.
  • Diese Daten zeigen, dass Plasminogen in Angiostatin durch jeden der klassischen Plasminogenaktivatoren in Gegenwart eines Sulfhydryldonors, aber nicht in der Abwesenheit des Sulfhydryldonors umwandelt. Ferner zeigen diese Daten und die Daten von Beispiel 2, dass Angiostatin in Gegenwart von physiologischen (L-Cystein, reduziertes Glutation) und pharmakologischen (Captopril, D-Penicillamin, N-Acetyl-L-cystein) reduzierenden Mitteln produziert wird.
  • Vergleichsbeispiel 4:
  • Verwendung von Plasmin für die Angiostatin-Erzeugung
  • Zwei Mikrogramm humanes Plasminogen in 100 μl TBS wurden mit 10 μl an uPA-Sepharose (Calbiochem, La Jolla, CA) 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Probe zentrifugiert, um die uPA-Sepharose zu sedimentieren und der Überstand, enthaltend Plasmin, wurde gesammelt. Die vollständige Umwandlung von Plasminogen in Plasmin wurde durch Analyse des Überstands auf reduzierten Polyacrylamidgelen, die mit Coomassie gefärbt waren, bestätigt. Das gereinigte Plasmin wurde dann 18 Stunden lang bei 37°C mit 100 μM N-Acetyl-L-cystein inkubiert und die Proben wurden auf die Angiostatinerzeugung durch Western-Blot analysiert (durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben).
  • Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Plasmin ein notwendiges Intermediat in der Erzeugung von Angiostatin aus Plasminogen ist und dass Angiostatin durch Inkubation von gereinigtem Plasmin mit einem Sulfhydryldonor erzeugt werden kann.
  • Beispiel 5:
  • Behandlung von Tumoren in vivo mit Sulfhydryldonor mit und ohne Plasminogenaktivator
  • Elf weiblichen beigen nackten Mäusen (Taconic Labs, Germantown, NY), 6–8 Wochen alt, wurden 1,0 × 106 Maus-Hämangioendotheliom-Zellen (EOMA) (großzügigerweise bereitgestellt durch Dr. Robert Auerbach, Madison, WI) in 100 μl Phosphat-gepufferter Saline in die rechte Flanke subkutan injiziert. Die EOMA-Tumorzellen ließ man in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) wachsen und hielt sie bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 10% CO2. Der Tag der Injektion der Tumorzellen wurde als Tag 0 bezeichnet.
  • Beginnend mit Tag 1 wurde jeder Maus zweimal am Tag subkutan Folgendes injiziert:
  • Figure 00620001
  • Die Größe des Primärtumors in jeder Maus wurde dreimal wöchentlich unter Verwendung von Gewebeklammern gemessen und das Tumorvolumen wurde unter Verwendung der Formel (Breite2 × Länge × 0,52) (O'Reilly et al., Nature Medicine, 2, 689–692 (1996)) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 14 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass sowohl die Behandlung mit NAC als auch die Behandlung mit uPA + NAC effektiv und signifikant die mittlere Tumorgröße verringerte, verglichen mit der Kontrollgruppe. Es sollte bemerkt werden, dass eine Kontrollmaus am Tag 10 starb und eine weitere Kontrollmaus am Tag 17 starb. Keine der mit NAC oder uPA + NAC behandelte Maus starb während der 21tägigen Dauer des Experiments.
  • Plasmaproben, entnommen von zwei der Kontrollmäuse und drei der mit NAC behandelten Mäuse am Tag der Opferung, wurden auf Angiostatin durch Western-Blot untersucht (durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben). Als Kontrolle wurden zwei Kontrollmäusen subkutan 1,00 mg affinitätsgereinigtes, zellfreies Angiostatin zweimal täglich beginnen mit Tag 1 bis 24 Stunden vor der Opferung subkutan injiziert. Affinitätsgereinigtes, zellfreies Angiostatin wurde wie in Beispiel 3 beschrieben erzeugt und auf einer Lysin-Sepharose-Säule, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt. Wie ersichtlich ist, verursachte die Verabreichung von NAC an die Maus, die Produktion von Angiostatin in vivo (Spuren 5, 6 und 7). Keine Angiostatin-Produktion wurde in den Kontrollmäusen detektiert (Spuren 1 und 2).
  • Vergleichsbeispiel 6:
  • Bestimmung der C-terminalen Sequenz von nativem Angiostatin
  • Natives Angiostatin wurde erzeugt durch Inkubation von humanem Plasminogen (0,2 μM) mit rekombinantem humanem u-PA (0,2 nM) (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) und 100 μM N-Acetyl-L-cystein bei 37°C über Nacht. Das Material wurde dann auf eine Lysin-Sepharose-Säule (siehe Beispiel 1) aufgebracht und das Durchflussmaterial wurde gesammelt und konzentriert. Aliquots des konzentrierten Durchflussmaterials wurden bei nicht-reduzierenden Bedingungen auf 12% Polyacrylamidgelen (NOVEX, San Diego, CA) in Tris-Glycin-Laufpuffer elektrophoresiert, auf eine 0,45 μm Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) elektrotransferiert und die Proteine wurden mit Coomassie-Blau gefärbt.
  • Die gefärbte Membran zeigte zwei sehr deutliche Banden aus dem Durchfluss bei etwa 30 kD. Obwohl andere Banden beobachtet wurden, war die Färbung dieser Banden beträchtlich geringer als die Färbung der zwei 30 kD-Banden, was zeigte, dass die zwei 30 kD-Banden die vorherrschenden Bestandteile des Durchflusses enthielten.
  • Die N-terminalen Sequenzen der Proteine in den zwei 30 kD-Banden wurden durch Mikrosequenz-Analyse bestimmt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die N-terminale Sequenz der bedeutendsten der zwei Banden war Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val [SEQ ID NO: 2], während die Sequenz der anderen Bande Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val [SEQ ID NO: 3] war. Die Lage dieser Sequenzen in Kringel 5 von Plasminogen (siehe 16) und das Vorherrschen der zwei Banden stellte einen extrem starken Beweis dar, dass dies die Fragmente waren, die als Ergebnis der Spaltung von Plasminogen freigesetzt wurden und das C-terminale Ende des nativen Angiostatins bildeten.
  • Aus den N-terminalen Sequenzen der zwei 30 kD-Fragmente wurde abgeleitet, dass die C-terminale Sequenz von nativem Angiostatin Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg [SEQ ID NO: 4] oder Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys [SEQ ID NO: 5] ist. Diese C-terminalen Sequenzen werden gebildet durch Spaltung nach der Aminosäure 529 (Arg) oder 530 (Lys) von humanem Plasminogen, welche in Kringel 5 ist (siehe 16), welches bekannte Plasmin-Spaltungsstellen sind. Die Spaltung an diesem Punkt ergibt ein Plasminogenfragment von etwa dem Molekulargewicht, das für natives Angiostatin auf Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet wird (50–60 kD).
  • Die N-terminale Sequenz von humanem nativem Angiostatin [SEQ ID NO: 1] ist vorstehend in Beispiel 1 angegeben. So wurde abgeleitet, dass humanes natives Angiostatin ein Plasminogenfragment ist, das den Großteil von Kringel 5 einschließt mit der N-terminalen Sequenz
    Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly [SEQ ID NO: 1]
    und der C-terminale Sequenz
    Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg [SEQ ID NO: 4]
    oder
    Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys [SEQ ID NO: 5].
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001

Claims (7)

  1. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Plasminogenaktivators in Kombination mit einem Sulfhydryldonor wirksam zur Erhöhung der Menge von in einem Menschen vorhandenem Angiostatin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neoplastischen Krankheit in einem Menschen, der unter dieser Krankheit leidet.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Sulfhydryldonor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cystein, N-Acetylcystein, Captopril, D-Penicillamin und reduziertem Glutathion.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Plasminogenaktivator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Urokinase, Streptokinase und Gewebe-Plasminogenaktivator.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die neoplastische Krankheit ein maligner Tumor ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Tumor metastasiert hat.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit Plasminogen.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit Plasmin.
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