JP2002517436A - アデノシン二リン酸リボシルトランスフェラーゼの阻害を介する創傷処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物において創傷を治癒するための方法に関し、以下の工程（Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量のインヒビターを含有する治療学的な創傷治癒組成物を提供する工程；および（Ｂ）治療学的な創傷治癒組成物と、哺乳動物における創傷とを接触する工程を包含する。本発明はまた、創傷治癒組成物に関し、ならびに創傷治癒組成物および治療学的組成物が使用され得る薬学的産物を調製および使用するための方法に関する。本発明はさらに、おむつ皮膚炎を最小にするためにおよび処置するために有用な治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物に関し、ならびに治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物を調製および使用するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、哺乳動物において創傷を治癒するための方法に関し、以下の工程（
Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、モノ
アデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量のイン
ヒビターを含有する治療学的な創傷治癒組成物を提供する工程；および（Ｂ）治
療学的な創傷治癒組成物と、哺乳動物における創傷とを接触する工程を包含する
。本発明はまた、創傷治癒組成物に関し、ならびに創傷治癒組成物および治療学
的組成物が使用され得る薬学的産物を、調製および使用するための方法に関する
。本発明はさらに、おむつ皮膚炎を最小にするためにおよび処置するために有用
な治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物に関し、ならびに治療学的な皮膚科学的
創傷治癒組成物を調製および使用するための方法に関する。

【０００２】 背景の説明 本発明の開示の背景を説明するために、およびその実施に関してさらなる詳細
を提供するために本明細書中に言及される開示は、本明細書中に参考として援用
され、そして簡便のために以下の本文において参照され、および添付の著書目録
においてそれぞれ分類される。

【０００３】 創傷は、機械的手段、化学的手段、ウイルス手段、細菌手段、または熱手段の
ような物理的手段によって引き起こされる内部または外部の身体の損傷または病
変である。このような身体の損傷としては、挫傷、皮膚が破壊されない創傷、切
開、切断機器によって皮膚が破壊される創傷、切れ味の悪いあるいは鈍い機器に
よって皮膚が破壊される創傷が挙げられる。創傷は、偶発的な事故によって、お
よび外科手術的手順によって引き起こされ得る。重度のまたは慢性の創傷を被る
患者は、創傷治癒プロセスにおける増強から利益を受け得る。創傷治癒は、組織
が修復され、分化された組織が再生され、そして新しい組織が再構成される一連
のプロセスからなる。創傷治癒は３つの主要な相からなる：ａ）炎症相（０〜３
日間）、ｂ）細胞増殖相（３〜１２日間）、および（ｃ）再構築相（３日〜６ヶ
月間）。炎症相の間、血小板の凝集および凝固化は、、種々のタイプの細胞の流
入を誘導するために、血漿タンパク質および血球を捕獲する基質を形成する。細
胞増殖相の間、新しい結合組織または肉芽組織が、コラーゲンおよびエラスチン
線維の網によって置き換えられれ、瘢痕組織の形成を導く。

【０００４】 マクロファージは、創傷修復、慢性関節リウマチ、および固形腫瘍発生を含む
線維増殖状態において、新脈管形成を誘導するのに重要な役割を果たす（１〜５
）。マクロファージによる脈管形成活性の生成は、ポジティブな脈管形成調節因
子および新脈管形成のインヒビターの産生のバランスに依存する（６、７、８）
。単球およびマクロファージによって産生されることが以前に示されているポジ
ティブな脈管形成調節因子としては、サイトカインのＴＮＦαおよびＩｌ８（９
、１０、１１）が挙げられ；ネガティブな調節因子としては、トロンボスポンジ
ン−１、Ｉｆｎγ誘導性タンパク質−１０（γＩＰ−１０）、および未だ特徴付
けられていないタンパク質のインヒビターのような他のものが挙げられる（１２
、１３、１４）。ポジティブな脈管形成調節因子およびネガティブな脈管形成調
節因子のバランスを制御する機構は十分には理解されていない。非活性化単球お
よびマクロファージは、非脈管形成性の表現型を示す（１、４）。インターフェ
ロン−γおよび／またはエンドトキシン（ＬＰＳ）のような薬剤での活性化後、
マクロファージは脈管形成活性を表し、脈管形成性のサイトカインの発現、およ
び新脈管形成のインヒビターの発現によって特徴付けられる（１５、１６、１７
、１８）。活性化細胞はまた、酸素ラジカル、一酸化窒素（ＮＯ）、およびそれ
らの誘導体を産生および放出する（１７、１９）。これらのラジカルは、活性化
マクロファージの脈管形成性の表現型を調節するにおいて重要な役割を果たすこ
とが示されている（２０、２１）。ＩｆｎγおよびＬＰＳのような因子、ならび
に減少された酸素圧（低酸素）および上昇された乳酸レベルは、脈管形成活性を
発現するようにマクロファージを誘導する（１〜３、９、２２）。近年、インビ
トロでマクロファージは、脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、強力に脈管形成性で
ある内皮特異的マイトジェンを発現することが示されている（１８、２３〜３０
）。

【０００５】 米国特許第５,５１０,３９１号（Ｅｌｓｏｎ）は：皮膚の血管異常および光老
化によって引き起こされる皮膚異常を処置する方法を開示し、ａ）薬学的組成物
を同時処方する工程であって、ここで組成物は０．０１％〜５０％のビタミンＫ
を含有する、工程；およびｂ）皮膚の血管異常および光老化によって引き起こさ
れる皮膚異常を局所的に処置するために薬学的組成物を適用する工程を包含する
。皮膚の血管異常および光老化によって引き起こされる皮膚異常としては、化学
作用性および医原性の紫斑病、ほくろ、顔の毛細管拡張症、クモ状血管腫、顔お
よび肺のクモ状静脈が挙げられる。

【０００６】 発明の要旨 本発明は、哺乳動物において創傷を治癒するための方法に関し、以下の工程： （Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
インヒビターを含有する治療学的な創傷治癒組成物を提供する工程；および （Ｂ）治療学的な創傷治癒組成物と哺乳動物における創傷とを接触する工程、
を包含する。

【０００７】 好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。別の好ましい実施態様に
おいて、モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビター
は、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４、ビタミンＫ５
、ビタミンＫ６、ノボビオシン（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）、ｍ−ヨードベンジル
グアニジン、ニコチンアミド、クメルマイシン、ジクマロール、およびシリビン
（ｓｉｌｙｂｉｎ）からなる群より選択される。モノアデノシン二リン酸−リボ
シルトランスフェラーゼのより好ましいインヒビターは、ビタミンＫ１、ビタミ
ンＫ３、ノボビオシン、およびシリビンである。モノアデノシン二リン酸−リボ
シルトランスフェラーゼのインヒビターは、治療学的な創傷治癒組成物の約０．
１重量％〜約１０重量％の量において、治療学的な創傷治癒組成物に存在する。
創傷は、圧力性潰瘍、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および熱傷損傷からなる群よ
り選択され得る。治療学的な創傷治癒組成物はさらに、薬学的に受容されるキャ
リアを含有する。

【０００８】 本発明はまた、創傷治癒組成物に関し： （Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
インヒビター、および （Ｂ）薬学的に受容されるキャリア、を含有する。

【０００９】 本発明はさらに、ヒトにおいておむつ皮膚炎を処置するための方法に関し、以
下の工程： （Ａ）治療学的なおむつ皮膚炎創傷治癒組成物を提供する工程であって、当該
組成物は： （ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
インヒビター、 （ｂ）約５〜約８の範囲において皮膚炎のｐＨを維持するための緩衝化剤；お
よび （ｃ）抗炎症剤を含有する、工程；ならびに （Ｂ）治療学的なおむつ皮膚炎創傷治癒組成物と、ヒトにおけるおむつ皮膚炎
とを接触する工程、を包含する。

【００１０】 本発明はさらに、おむつ皮膚炎を最小にするためにおよび処置するために有用
な、治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物に関し、治療学的に有効な量の： （１）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターを含有す
る治療学的な創傷治癒組成物； （２）約５〜約８の範囲において皮膚炎のｐＨを維持するための緩衝化剤；お
よび （３）抗炎症剤、を含有する。

【００１１】 発明の詳細な説明 マクロファージ依存性の脈管形成活性（ＭＤＡＡ）の生成は、インターフェロ
ン−γおよび／またはエンドトキシンのような因子、低酸素、または高濃度の乳
酸による活性化を必要とする（Ｊｅｎｓｅｎら Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５４、
５７４、１９８６）。以前の研究は、マクロファージにおける誘導性一酸化窒素
合成酵素（ｉＮＯＳ）がＭＤＡＡを調節し、ｉＮＯＳの阻害は、ＭＤＡＡの発現
をダウンレギュレートすることを実証した（Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈら、ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ９１、４１９０、１９９４）。非活性化マクロファージは非脈管形成性
であるが、それにもかかわらずこれらは脈管形成増殖因子ＶＥＧＦの有意なレベ
ルを発現することが今や見出された。ＶＥＧＦのこの構成的な発現は、低酸素も
乳酸依存性でもない。正常酸素状態の、非活性化マクロファージによって構成的
に産生されるＶＥＧＦは、アルギニン特異的ＡＤＰリボシル化のプロセスによる
転写後修飾に起因して、非脈管形成性の形態にあることが見出される。対照的に
、ＬＰＳ活性化マクロファージ、低酸素処理されたマクロファージ、または乳酸
処理されたマクロファージによって産生されるＶＥＧＦは、非ＡＤＰリボシル化
形態にあり、および脈管形成性である。ＬＰＳ活性化マクロファージにおけるｉ
ＮＯＳ経路の阻害は、２部分からなる機構によってＭＤＡＡの発現を廃止する。
先ず、ＶＥＧＦはＡＤＰ−リボシル化された、非脈管形成性の状態に戻り；次に
、ｉＮＯＳ阻害されたマクロファージは、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、およびｂＦＧＦ
を含むいくつかの脈管形成因子の脈管形成活性を阻害する抗脈管形成因子を発現
する。ｉＮＯＳ遺伝子が特異的に欠失されたマウス（ｉＮＯＳノックアウトマウ
ス、ｉＮＯＳ‐／‐）において、創傷治癒は顕著に阻害された（Ｙａｍａｓａｋ
ｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１、９６７、１９９８）。この阻害は
、遅延された創傷閉鎖に、および肉芽組織の形成における遅延に現れる。ｉＮＯ
Ｓ‐／‐マウスからのマクロファージは、ｉＮＯＳ＋／＋マウスに比較して、減
少されたレベルのＭＤＡＡを発現するが、全体のＶＥＧＦの産生は顕著に変化さ
れない。創傷修復において新脈管形成を調節するｉＮＯＳ経路およびＶＥＧＦの
ＡＤＰ−リボシル化の役割、ならびにｉＮＯＳ経路およびＡＤＰ−リボシル化経
路を標的化することによりマクロファージ依存性の脈管形成活性および創傷修復
を薬理学的に調節するための様相は、現在調査中である。

【００１２】 マウスチオグリコール酸誘導性の腹膜マクロファージ（ＭＰＭ）およびマウス
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞株（ＲＡＷ細胞）は、脈管内皮増殖因子
（ＶＥＧＦ）を構成的に産生する。ＶＥＧＦ産生は、低酸素条件下で、またはイ
ンターフェロン−γ（Ｉｆｎγ）およびエンドトキシン（ＬＰＳ）での細胞の活
性化後に、増加される。対照的に、ＴＮＦαは、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化細胞に
よってのみ産生される。乳酸（２０ｍＭ）はこれらの細胞によるＶＥＧＦ産生を
増加しない。しかし、低酸素、乳酸、およびＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭは、
脈管形成活性を表すが、正常酸素状態の、非活性化ＭＰＭは脈管形成活性を表さ
ない。脈管形成活性の欠損は、これらの細胞の培地中の抗脈管形成因子に起因し
ない。低酸素処理および乳酸処理されたＭＰＭによって生成される脈管形成活性
は、抗ＶＥＧＦ抗体によって中和され、これはまた、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化Ｍ
ＰＭによって生成される大部分の脈管形成活性を中和する。誘導性一酸化窒素合
成酵素（ｉＮＯＳ）インヒビターのＮｇニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステ
ル（Ｌ−ＮＡＭＥ）（１．５ｍＭ）およびアミノグアニジン（ＡＧ）（１ｍＭ）
は、ＭＰＭおよびＲＡＷ細胞による脈管形成活性の生成をブロックする。ＲＡＷ
細胞において、Ｌ−ＮＡＭＥおよびＡＧは、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化をブロック
するが、構成的なＶＥＧＦ産生をブロックせず、一方ＭＰＭにおいて、構成的な
ＶＥＧＦ合成もＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＶＥＧＦ合成も影響されない。ＴＮＦα
の合成はまた、影響されない。正常酸素状態の、非活性化ＭＰＭとは対照的に、
ｉＮＯＳ阻害された、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭは、抗脈管形成因子を産生
する。従って、ＶＥＧＦは、マクロファージ由来の脈管形成活性の主要な寄与因
子であり、そして低酸素、乳酸、またはＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化によるその活性
化は、マクロファージ由来のＶＥＧＦを、非脈管形成性の状態から脈管形成の状
態に切り替える。この切り替えは、恐らくＡＤＰ−リボシル化のプロセスによる
ＶＥＧＦの翻訳後修飾を含み得る。ＭＰＭ細胞質ゾル抽出物による、またはコレ
ラトキシンによるＡＤＰ−リボシル化は、ｒＶＥＧＦ_１６５を、脈管形成性の状
態から非脈管形成性の状態に切り替える。Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭにおい
て、ｉＮＯＳ依存性の経路はまた、ＶＥＧＦの生体活性を拮抗する抗脈管形成因
子の発言を調節し、そしてマクロファージの脈管形成性の表現型を制御するさら
なる調節経路を提供する。

【００１３】 本発明によれば、ＭＰＭおよびＲＡＷ細胞による脈管形成増殖因子のＶＥＧＦ
の発現が試験され、そしてＴＮＦαの発現に比較される。これらの細胞によるＶ
ＥＧＦおよびＴＮＦα産生に対する、低酸素、乳酸、およびＬ−アルギニン−依
存性の誘導性ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）経路の効果がまた試験された。ＶＥＧＦ
産生は、低酸素およびｉＮＯＳ経路によって転写および翻訳の両方により調節さ
れ、そして転写後修飾は、脈管形成因子としてＶＥＧＦの生体活性を調節するに
おいて重要な役割を果たし得ることが見出された。さらに、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活
性化マクロファージにおけるｉＮＯＳ経路は、ＶＥＧＦの脈管形成効果を拮抗す
る抗脈管形成因子の発現を調節し、マクロファージの脈管形成性の表現型を制御
するためのさらなる調節経路を提供する。

【００１４】 脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、強力に脈管形成性であるポリペプチド増殖因
子（新しい血管の増殖を誘導する）は、創傷治癒においてマクロファージ（新脈
管形成を調節するにおいて重要な役割を果たす細胞）によって化学的に修飾され
る。この化学的修飾は、マクロファージにおける酵素（ＡＤＰ−リボシルトラン
スフェラーゼ）によるＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化を含む。特に、細胞質のモ
ノ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼは、ＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化に
関与し、そしてこの修飾は、脈管形成性から非脈管形成性へのＶＥＧＦの特性の
変化を生じる。マクロファージは、ＶＥＧＦを構成的に作製し、そしてマクロフ
ァージは、このＡＤＰ−リボシル化反応によってＶＥＧＦの脈管形成活性を調節
するようである。ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ビタミンＫ３、ノボビオシン、
ｍ−ヨードベンジルグアニジン、およびニコチンアミドのようなモノ−ＡＤＰ−
リボシル化のインヒビターは、ＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化を阻害することに
よって、マクロファージの表現型を、非脈管形成性の表現型から脈管形成性の表
現型に変化する。脈管形成誘導は、正常な創傷修復において重要な事象であるの
で、マクロファージ（脈管形成因子を産生することによって新脈管形成を制御す
る重要な細胞）によるＶＥＧＦ産生は、非脈管形成性の表現型から脈管形成性の
表現型への、すなわち、ＡＤＰ−リボシル化の形態から非修飾化形態への、切り
替えを必要としなければならない。

【００１５】 モノ−ＡＤＰ−リボシル化のインヒビターは、ＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化
をブロックし得るので、これらのインヒビター、ならびにそれらの誘導体および
アナログは、慢性の、治癒されない創傷（ここで、新脈管形成は欠損される）の
処置において価値があり得る。圧力性潰瘍、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および
ある熱傷損傷を含むがこれらに制限されない多くの慢性の創傷において、創傷は
、新脈管形成における欠損に少なくとも一部起因して、治癒できない。これらの
創傷におけるマクロファージの表現型は、非脈管形成性であり、ＶＥＧＦは非脈
管形成性の、ＡＤＰ−リボシル化形態において産生される。この場合において、
ＡＤＰ−リボシル化のインヒビターでのこれらの創傷の処置は、ＶＥＧＦのＡＤ
Ｐ−リボシル化をブロックし、従って修飾されない、脈管形成性のＶＥＧＦの産
生を生じる。次いで、このＶＥＧＦは創傷において新脈管形成を刺激するのに関
与するべきであり、そして修復を促進するのを補助する。従って、本発明は、創
傷に対する局所的な適用に適する、適切なベヒクル中のＡＤＰ−リボシル化トラ
ンスフェラーゼインヒビターの処方物に関する。

【００１６】 慢性の創傷の処置のための現在の技術は一般に、集中的な創傷手当て、挫滅組
織切除、殺菌剤、抗生物質の使用、および閉塞包帯の使用を包含する。開発中の
技術は、増殖因子の使用を包含し、通常、組換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子操
作することによって調製される。増殖因子は非常に効果であり、およびそれらの
効力は今だ疑問である。慢性の創傷の処置のためのＡＤＰ−リボシル化インヒビ
ターの使用の利点は：ａ）化合物が、低分子量の、十分に特徴づけされた、およ
び比較的安価であること；ｂ）外因性増殖因子の活性を導入することを試みるの
ではなく、化合物が創傷自身の生物学的媒介因子の生体活性を調節し、これらを
非脈管形成性から脈管形成性に移行すること；ｃ）創傷への送達のための低分子
量のインヒビターの処方物が、確かに増殖因子の処方に比較して、比較的単純な
行使であるべきであること；ならびにｄ）モノ−ＡＤＰ−リボシル化インヒビタ
ーの主要な群のうちの１つを構成するビタミン−Ｋ化合物は、何年もの間他の目
的のために利用可能であり、およびＦＤＡの承認を有することである。

【００１７】 上記のように、本発明は、哺乳動物において創傷を治癒するための方法に関し
、以下の工程（Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害す
るための、モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に
有効な量のインヒビターを含有する治療学的な創傷治癒組成物を提供する工程；
および（Ｂ）治療学的な創傷治癒組成物と、哺乳動物における創傷とを接触する
工程を包含する。

【００１８】 モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターは、任
意のインヒビターであり得、活性な誘導体およびアナログを包含し、これは、脈
管内皮増殖因子のＡＤＰ−リボシル化を阻害し、それによって脈管内皮増殖因子
を、非脈管形成性の表現型から脈管形成性の表現型に、すなわち、ＡＤＰ−リボ
シル化の形態から非ＡＤＰ−リボシル化の形態に切り替える。好ましくは、モノ
アデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターは、ビタミン
Ｋ１、ビタミンＫ２、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４、ビタミンＫ５、ビタミンＫ
６、ノボビオシン、ｍ−ヨードベンジルグアニジン、ニコチンアミド、クメルマ
イシン、ジクマロール、およびシリビンからなる群より選択される。より好まし
くは、モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターは
、ビタミンＫ１、ビタミンＫ３、ノボビオシン、およびシリビンからなる群より
選択される。

【００１９】 本発明の治療学的な創傷治癒組成物に存在するモノアデノシン二リン酸−リボ
シルトランスフェラーゼのインヒビターの量は、治療学的に有効な量である。モ
ノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターの治療学的
に有効な量は、脈管内皮増殖因子を、非脈管形成性の形態から脈管形成性の表現
型に、すなわち、ＡＤＰ−リボシル化の形態から非ＡＤＰ−リボシル化の形態に
切り替え、それによって創傷治癒を促進するために本発明の組成物に必要な、モ
ノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターの量である
。モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターの正確
な量は、処置される状態のタイプ、および組成物中の他の成分のような因子に供
される選択の問題である。好ましい実施態様において、モノアデノシン二リン酸
−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターは、治療学的な創傷治癒組成物の
約０．１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．２重量％〜約８重量％、およ
びより好ましくは約０．３重量％〜約５重量％の量において、治療学的な創傷治
癒組成物中に存在する。

【００２０】 本発明の創傷治癒組成物を使用して治癒され得る創傷のタイプは、切開、切断
機器によって皮膚が破壊される創傷、裂傷、切れ味の悪いあるいは鈍い機器によ
って皮膚が破壊される創傷のような表皮障害を引き起こす損傷から生じる創傷で
ある。治療学的組成物は、圧力性潰瘍、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および熱傷
損傷を処置するために使用され得る。治療学的組成物はまた、角質増殖、熱傷、
皮膚移植からのドナー側の創傷、潰瘍（皮膚性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈うっ滞、
および糖尿病性潰瘍）、乾癬、皮膚発疹、および日焼けの光反応性のプロセスの
ような種々の皮膚科学的異常を処置するために使用され得る。創傷治癒組成物は
、以下の表示について使用され得る：ａ）切り傷および擦り傷を治癒すること；
ｂ）熱傷（ほとんど瘢痕およびかさぶたを生じることなく熱傷を治癒する）；ｃ
）褥瘡性潰瘍；ｄ）床ずれ、圧力性潰瘍；ｅ）裂、痔；ｆ）免疫刺激因子と組合
せた使用（治癒不全の患者を刺激する）；ｇ）外科手術後の創傷；ｈ）包帯；ｉ
）糖尿病性潰瘍；ｊ）静脈潰瘍化；ならびにｋ）創傷を清潔にする薬剤と組合せ
た使用。好ましくは、治療学的組成物は、圧力性潰瘍、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰
瘍、および熱傷損傷を処置するために使用され得る。

【００２１】 別の実施態様において、本発明は、創傷治癒組成物に関し、（Ａ）脈管内皮増
殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、モノアデノシン二リ
ン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量のインヒビター、およ
び（Ｂ）薬学的に受容されるキャリアを含有し、ここで脈管内皮増殖因子のアデ
ノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、モノアデノシン二リン酸−リボシ
ルトランスフェラーゼのインヒビターの量およびタイプは、上記される。

【００２２】 特定の実施態様において、本発明はおむつ皮膚炎に関する。おむつ皮膚炎、あ
るいはおむつまけは、乳児においておむつと接触する皮膚領域に局在化される刺
激性の接触皮膚炎である。おむつ皮膚炎は、１〜２０ヶ月齢の範囲の乳児のうち
の約６５％において生じる。おむつ皮膚炎の現れ方は、拡散性紅斑から小節性病
変に変化する。皮膚と、尿で浸されたおむつとの長期間の接触は、表皮のふやけ
を生じる。閉塞ガーゼまたはプラスチックのパンツはさらに、損傷を悪化させる
。おむつ皮膚炎は、尿からのアンモニアによって引き起こされ、皮膚のｐＨを上
昇し、および皮膚油の成分と化合して刺激原を形成する。細菌または酵母の感染
はさらに、継続的なおよび重篤な炎症を引き起こすことによっておむつ皮膚炎を
複雑にし得る。おむつ皮膚炎は一般に、おむつを頻繁に交換し、および刺激され
た領域に滑石粉を適用することにより、皮膚を乾燥に保つことによって処置され
る。重篤な場合において、ゴムパンツおよびプラスチックの使い捨てのおむつカ
バーは避けられるべきである。

【００２３】 本発明によれば、ヒトにおいておむつ皮膚炎を処置するための方法が提供され
、当該方法は以下の工程、（Ａ）治療学的なおむつ皮膚炎創傷治癒組成物を提供
する工程であって、当該組成物は： （ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
インヒビター；（ｂ）約５〜約８の範囲において皮膚炎のｐＨを維持するための
緩衝化剤；および（ｃ）抗炎症剤を含有する、工程；ならびに（Ｂ）治療学的な
おむつ皮膚炎創傷治癒組成物と、ヒトにおけるおむつ皮膚炎とを接触する工程、
を包含する。緩衝化剤は、アンモニアを中和することによっておむつ皮膚炎を防
止することを補助し得るが、損傷された哺乳動物細胞を治癒しない。抗炎症剤は
、患者における炎症（紅斑）を低減し得るが、創傷治癒プロセスを促進しない。
創傷治癒組成物は、損傷された哺乳動物細胞の蘇生速度、および死細胞を置き換
えるための新しい哺乳動物細胞の増殖速度を増加し得る。出願人は、緩衝化剤、
抗炎症剤、および創傷治癒組成物の組合せがおむつ皮膚炎を最小にするためにお
よび処置するために有用な、治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物を生じること
を見出した。皮膚科学的創傷治癒組成物は必要に応じて、おむつ皮膚炎の持続お
よび重篤度をさらに低減するために、治療学的に有効な量の局所的な殺菌剤を含
む。

【００２４】 緩衝化剤は、溶液のｐＨ値の大きな変化を引き起こすことなく強酸または強塩
基の適度の量が添加され得る溶液を形成する、溶質性化合物である。Ｂｒｏｎｓ
ｔｅｄの用語術において、緩衝化剤は、弱酸およびその共役した弱塩基の両方を
含む。緩衝化溶液は通常、（ａ）弱酸および弱酸の塩、（ｂ）酸塩と、通常の塩
との混合物、または（ｃ）２つの酸（例えば、ＮａＨ_２ＰＯ_４およびＮａ_２ＨＰ
Ｏ_４）の混合物を含む。弱酸は、アルカリが添加される場合、緩衝化剤になり、
および弱塩基は、酸が添加される場合、緩衝化剤になる。本発明の皮膚科学的創
傷治癒組成物中の緩衝化剤は、広範囲の治療学的薬剤および治療学的薬剤の混合
物から選択され得る。天然に存在する緩衝化剤としては、リン酸、炭酸、アンモ
ニウム塩、植物および動物の組織のタンパク質、ならびに血液中の炭酸−重炭酸
系が挙げられる。緩衝化剤の制限されない説明的な特定の例としては、クエン酸
−クエン酸ナトリウム溶液、リン酸−リン酸ナトリウム溶液、および酢酸−酢酸
ナトリウム溶液が挙げられる。好ましくは、緩衝化剤は、リン酸−リン酸ナトリ
ウムである。

【００２５】 本発明において使用される緩衝化剤の量は、有効な量であり、および特定の緩
衝化剤について推奨されるまたは許容される投薬量に依存して変化し得る。一般
に、存在する緩衝化剤の量は、所望の結果を得るために必要とされる通常の投薬
量である。このような投薬量は、医学の分野の当業者に公知であり、および本発
明の一部ではない。好ましい実施態様において、皮膚科学的な創傷治癒組成物中
の緩衝化剤は、約５〜約８、好ましくは約５．５〜約７．５、およびより好まし
くは約６〜約７の範囲に、皮膚炎のｐＨを維持するための量で存在する。

【００２６】 抗炎症剤は、炎症プロセスを中和するまたは抑制する化合物である。本発明の
皮膚科学的な創傷治癒組成物中の抗炎症剤は、広範に多様なステロイド性、非ス
テロイド性、およびサリチル酸の水溶性および水不溶性の薬物、ならびにそれら
の酸付加塩または金属塩から選択され得る。有機塩および無機塩の両方が、使用
され得るが、但し抗炎症剤はその薬物価値を維持する。抗炎症剤は、広範囲の治
療学的薬剤および治療学的薬剤の混合物から選択され得、これは持続性放出また
は長期間の作用形態において投与され得る。非ステロイド性抗炎症剤の制限され
ない説明的な特定の例としては、以下の薬物が挙げられる：イブプロフェン、ナ
プロキセン、サリンダク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）、ジフルニサル、ピロキシカム、
インドメタシン、エトドラク（ｅｔｏｄｏｌａｃ）、メクロフェナム酸ナトリウ
ム、フェノプロベンカルシウム、ケトプロフェン、メフェナム酸、ナブメトン、
ケトロラクトロメタミン、ジクロフェナク、およびマツヨイグサ油（約７２％の
リノレン酸および約９％のγ−リノレイン酸を含有する）。サリチル酸抗炎症剤
の制限されない説明的な特定の例としては、以下の薬物が挙げられる：アセチル
サリチル酸、メサラミン、サルサレート、ジフルニサル、サリチルサリチル酸、
およびコリンマグネシウムトリサリチル酸。ステロイド性の抗炎症剤の制限され
ない説明的な特定の例としては、以下の薬物が挙げられる：フルニソリド、トリ
アムシノリン、トリアムシノリンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、
ジプロピオン酸βメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、
プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロン。

【００２７】 用いられるべき好ましい抗炎症剤は、イブプロフェン、ナプロキセン、サリン
ダク、ジフルニサル、ピロキシカム、インドメタシン、エトドラク、メクロフェ
ナム酸ナトリウム、フェノプロベンカルシウム、ケトプロフェン、メフェナム酸
、ナブメトン、ケトロラクトロメタミン、ジクロフェナク、マツヨイグサ油、ア
セチルサリチル酸、メサラミン、サルサレート、ジフルニサル、サリチルサリチ
ル酸、およびコリンマグネシウムトリサリチル酸、フルニソリド、トリアムシノ
リン、トリアムシノリンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピ
オン酸βメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニ
ゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンからなる群より選択され得
る。好ましい実施態様において、抗炎症剤は、イブプロフェン、ナプロキセン、
サリンダク、ジフルニサル、ピロキシカム、インドメタシン、エトドラク、メク
ロフェナム酸ナトリウム、フェノプロベンカルシウム、ケトプロフェン、メフェ
ナム酸、ナブメトン、ケトロラクトロメタミン、ジクロフェナク、およびマツヨ
イグサ油からなる群より選択される。より好ましい実施態様において、抗炎症剤
は、マツヨイグサ油である。

【００２８】 本発明の抗炎症剤は、抗炎症剤の最初の投薬量を提供するために薬学の分野に
おいて周知の多くの異なる物理的形態、および／または抗炎症剤のさらなる時間
放出性の形態において使用され得る。それらに制限されないが、このような物理
的形態としては、遊離形態およびカプセルか形態、ならびにそれらの混合形態が
挙げられる。

【００２９】 本発明において使用される抗炎症剤の量は治療学的に有効な量であり、および
特定の抗炎症剤について推奨または許容される治療学的投薬量に依存して変化し
得る。一般に、存在する抗炎症剤の量は、所望の結果を得るために必要とされる
通常の量である。このような投薬量は、医学の分野において当業者に公知であり
、および本発明の一部ではない。好ましい実施態様において、皮膚科学的創傷治
癒組成物中の本発明の抗炎症剤は、約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましく
は約０．１重量％〜約５重量％、およびより好ましくは約１重量％〜約３重量％
の量で存在する。

【００３０】 別の特定の実施態様において、本発明は、おむつ皮膚炎を最小にするためにお
よび処置するために有用な治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物に関し、当該組
成物は、治療学的に有効な量の： （１）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターを含有す
る治療学的な創傷治癒組成物、 （２）約５〜約８の範囲において皮膚炎のｐＨを維持するための緩衝化剤；お
よび （３）抗炎症剤、を含有する。

【００３１】 一旦調製されると、本発明の治療学的な創傷治癒組成物は、将来の使用のため
に保存され得るか、または広範囲に多様な薬学的組成物を調製するために、薬学
的に受容されるキャリアとともに有効な量において処方され得る。薬学的に受容
されるキャリアの例は、薬学的器具および局所用ベヒクルである。薬学的器具の
例は、縫合、ステープル、ガーゼ、包帯、熱傷包帯、人口皮膚、リポソームまた
はミセル処方物、マイクロカプセル、ガーゼ包帯を浸すための水性ベヒクルなど
、ならびにそれらの混合物である。局所用組成物は、クリーム、ゲル処方物、泡
、軟膏およびスプレイ、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ならびにフィルムのような局所用
ベヒクルを用い、これらは皮膚または体腔に適用されることが意図され、および
口に入れられることは意図されない。経口局所用組成物は、うがい薬、リンス、
経口スプレイ、懸濁液、および歯科用ゲルのような経口ベヒクルを用い、これら
は、口に入れられることが意図されるが、摂取されることは意図されない。好ま
しい局所用ベヒクルは、水、ならびにエチルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、プロピレングリコール、グリセリンなど、およびこれらの溶媒の混合物のよ
うな薬学的に受容される水和性有機溶媒である。水−アルコール混合物が特に好
ましく、ならびに一般に、それぞれ、約１：１〜約２０：１、好ましくは約３：
１〜約２０：１、および最も好ましくは約３：１〜約１０：１の重量比率におい
て用いられる。

【００３２】 緩衝液、保存剤、張度調節剤、坑酸化剤、粘性を調節するための、または増量
剤として使用するためのポリマー、および腑形剤などのような多様な伝統的な成
分は必要に応じて、有効な量において薬学的組成物中に含まれ得る。他の従来の
添加物としては、湿潤剤、緩和剤、潤滑剤、安定化剤、色素、および香料が挙げ
られるが、但し、添加物は治療学的な創傷治癒組成物の治療学的な特性を妨げな
い。このような伝統的成分の特定の説明的な例としては、酢酸およびホウ酸緩衝
液；チメロゾール、ソルビン酸、メチルおよびプロピルパラベンおよびクロロブ
タノール保存剤；張度を調節するための塩化ナトリウムおよび糖；およびマンニ
トール、ラクトース、およびスクロースのような腑形剤が挙げられる。薬学の分
野における当業者に公知の他の従来の薬学的な添加物はまた、薬学的組成物中で
使用され得る。最終的な薬学的組成物は、薬学の分野において一般に公知の方法
を使用して、容易に調製される。

【００３３】 本発明によれば、本発明の治療学的な創傷治癒組成物の治療学的に有効な量が
、薬学的器具中で使用され得る。これらの量は、過度の実験を伴うことなく、当
業者によって容易に決定される。用いられる治療学的な創傷治癒組成物の正確な
量は、治療学的な創傷治癒組成物のタイプおよび濃度、ならびに用いられる薬学
的器具のタイプのような因子に供される。従って、治療学的な創傷治癒組成物の
量は、最終的な産物において所望される結果を得るために変化され得、そしてこ
のような変化は、過度の実験についての必要性を伴うことなく、当業者の能力の
範囲内である。好ましい実施態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物の約
０．１重量％〜約１０重量％において、治療学的な創傷治癒組成物を含有する。
より好ましい実施態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物の約０．２重量
％〜約８重量％において、治療学的な創傷治癒組成物を含有する。最も好ましい
実施態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物の約０．３重量％〜約５重量
％において、治療学的な創傷治癒組成物を含有する。

【００３４】 本発明は、薬学的組成物を作製するための方法に拡張する。一般に、薬学的組
成物は、治療学的に有効な量の治療学的な創傷治癒組成物と、薬学的に受容され
るキャリアおよび最終的に所望される薬学的組成物の他の成分とを接触すること
によって作製される。治療学的な創傷治癒組成物は、溶媒中にあり得、および薬
学的器具上に吸収され得る。

【００３５】 結果 ＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＰＭによる亜硝酸の産生 図１は、ＭＰＭによる亜硝酸の産生を示す。亜硝酸は、乳酸を伴っておよび伴
わないでのいずれでも、非活性化細胞によって産生されなかった。Ｉｆｎγ／Ｌ
ＰＳでの攻撃後、亜硝酸産生は強力に誘導され、亜硝酸は、４８時間のインキュ
ベーション期間にわたって蓄積した。Ｌ−ＮＡＭＥ（１．５ｍＭ）は、約７０〜
８０％まで亜硝酸の産生をブロックし；ＡＧ（１ｍＭ）は、９５％を超えてまで
亜硝酸産生をブロックした。ＲＡＷ２６４．７細胞は、類似の様式において亜硝
酸を産生し、そしてＬ−ＮＡＭＥおよびＡＧは、類似の程度にＲＡＷ２６４．７
細胞による亜硝酸合成をブロックした（データ示さず）。

【００３６】 ＲＡＷ２６４．７細胞およびマウス腹膜マクロファージによるＶＥＧＦの産生 ＲＡＷ細胞によるＶＥＧＦの産生は、図２Ａにおいて示される。刺激されない
ＲＡＷ細胞は、４８時間のインキュベーション期間にわたって、明らかに構成的
な様式においてＶＥＧＦを産生した。ＶＥＧＦのこの自発的な産生は、通常の培
養プレートにおいておよび気体透過性のＰｅｒｍａｎｏｘプレートにおいて類似
した。ＩｆｎγおよびＬＰＳでの細胞の刺激は、１８時間で、刺激されない細胞
によって産生される構成的なレベルよりも、約３〜４倍までＶＥＧＦの産生を増
加した。４８時間で、刺激されたＶＥＧＦレベルは、構成的なレベルよりも２倍
増加されたのみであった。ｉＮＯＳインヒビターのＡＧ（１．０ｍＭ）およびＬ
−ＮＡＭＥ（１．５ｍＭ）は、刺激されないＲＡＷ細胞によるＶＥＧＦの構成的
な産生をブロックしなかったが、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＲＡＷ細胞によるＶＥ
ＧＦの産生を、刺激されない細胞のレベルを顕著に下回るレベルに減少した。乳
酸ナトリウム（２５ｍＭ）は、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化を伴っても伴わなくても
、これらの細胞によるＶＥＧＦの産生を変化しなかった。低酸素条件下で培養さ
れたＲＡＷ細胞は、ＶＥＧＦの量を増加した。１８時間後、低酸素条件下で培養
された細胞の培地中のＶＥＧＦレベルは、コントロールの、正常酸素状態の細胞
の培地中のレベルよりも約３倍大きかった。この差異は、４８時間までにほとん
ど顕著でなくなった。採集直後の馴化培地中の溶解された酸素レベルの分析は、
正常酸素状態の条件下で、酸素レベルが一貫して高かった（ｐＯ_２＞１４５）こ
とを明らかに示した。低酸素条件下（９５％ Ｎ_２／５％ ＣＯ_２）での２４時間
および４８時間のインキュベーション後、ｐＯ_２は、それぞれ、７１ｍｍおよび
４６ｍｍであった。

【００３７】 ＭＰＭによるＶＥＧＦの産生は、ＲＡＷ細胞のＶＥＧＦの産生に類似し、構成
的な産生が４８時間にわたって生じた（図２Ｂ）。増加される産生が、Ｉｆｎγ
／ＬＰＳによって誘導された。しかし、ＲＡＷ細胞と対照的に、ｉＮＯＳインヒ
ビターは、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭによるＶＥＧＦの産生を有意には減少
しなかった。ＲＡＷ細胞について観察されたように、乳酸ナトリウムは、これら
の細胞によるＶＥＧＦの産生を調節しなかった。低酸素条件下でのＭＰＭの培養
は、最初の18時間においてＶＥＧＦ産生の増加を生じたが：４８時間後、ＶＥＧ
Ｆの構成的な産生は、低酸素細胞のＶＥＧＦの産生よりもわずかに高いのみであ
った。ＭＰＭの馴化培地において決定される酸素レベルは、ＲＡＷ細胞培地にお
いて見出されるレベルに類似した。

【００３８】 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの定量的なＲＴ−ＰＣＲ分析 内部標準としてＶＥＧＦ ＲＮＡミニ遺伝子を使用する、定量的なＲＴ−ＰＣ
Ｒ希釈系列の典型的な例は、図３において示される。ミニ遺伝子のＰＣＲ増幅産
物は、２９３ｂｐの大きさである。ネイティブなｍＲＮＡ ＰＣＲ増幅バンドは
３６２ｂｐの大きさである。増幅されたミニ遺伝子および増幅されたネイティブ
なｍＲＮＡについての等価の点は、希釈系列から容易に決定され得る。これらの
分析から決定された値は、平行なサンプルにおいて決定されるＧ３ＰＤＨ ｍＲ
ＮＡのレベルに正規化されたが、実際、サンプル間でＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡの変
化はほとんど観察されなかった。このことに基づいて、種々のマクロファージ調
製物におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの相対的な量が、表１において示される。低酸
素およびＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化の両方は、４および１０時間で、ＭＰＭにおけ
るＶＥＧＦ定常状態のｍＲＮＡレベルをアップレギュレートした。しかし、２４
時間までに、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルは、全ての群間において類似した。ＲＡ
Ｗ細胞において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルは、２４時間で上昇されたままであ
った。Ｉｆｎγ／ＬＰＳ処理されたＭＰＭのアミノグアニジン処理は、任意の時
点で、それらの定常状態のＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルを有意には減少しなかった
が；ＲＡＷ細胞において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルは、４、１０、および２４
時間で、７０〜８０％まで減少された。

【００３９】 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡイソ型のＲＴ−ＰＣＲ分析 ＶＥＧＦの３つのイソ型は、非活性化ＭＰＭおよびＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化Ｍ
ＰＭの両方によって産生されることが見出された。これらのイソ型は、ＶＥＧＦ
−１（６５２ｂｐ）、ＶＥＧＦ−２（５８０ｂｐ）、およびＶＥＧＦ−３（４４
８ｂｐ）（４５）に対応した。Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化後の各時点でＭＰＭによ
って発現されるＶＥＧＦイソ型の相対的な割合は、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化によ
っておよびＡＧでのｉＮＯＳの阻害によってわずかに調節されたのみであった（
図４）。ＲＡＷ細胞において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡイソ型は、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ
活性化によっておよびＡＧ処置によって、同様に影響されなかった。

【００４０】 ＭＰＭおよびＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦαの産生 ＴＮＦαは、４８時間の試験期間にわたって、刺激されないＭＰＭおよびＲＡ
Ｗ２６４．７細胞のいずれによっても産生されなかった。ＭＰＭによるＴＮＦα
の産生は、図５において示される。Ｉｆｎγ／ＬＰＳでの刺激後、ＴＮＦαの発
現が強力に誘導され、馴化培地における増加されたＴＮＦαは、攻撃後８時間ま
で明白であった。乳酸ナトリウムで処理された細胞および乳酸ナトリウムで処理
されなかった細胞において、ＴＮＦαの産生における有意な差異はなかった。同
様に、正常酸素状態または低酸素のいずれかの条件下での、Ｐｅｒｍａｎｏｘデ
ィッシュにおける細胞の培養物は、ＴＮＦα産生を調節しなかった。ｉＮＯＳイ
ンヒビターのＬ−ＮＡＭＥおよびＡＧは、ＭＰＭによるＴＮＦαの産生に対して
有意な効果を有しなかった。ＲＡＷ細胞によるＴＮＦαの産生は、ＭＰＭにおい
て観察されるＴＮＦαの産生に類似した（データ示さず）。

【００４１】 細菌トキシンおよびマクロファージ抽出物によるＡＤＰリボシル化 ^３２Ｐ-ＮＡＤでのｒＶＥＧＦの標識化が、コレラトキシンおよびマクロファ
ージ細胞質ゾル抽出物を使用して観察された（図６）。コレラトキシンでの標識
化は、ｒＶＥＧＦ_１６５標準の大きさに対応する単一の^３２Ｐ標識化バンドを生
じた（図６Ｃ）マクロファージ細胞質ゾル抽出物での標識化は、マクロファージ
細胞質ゾルタンパク質の内因性の標識化に起因して、多数のバンドの^３２Ｐ標識
化を生じた（図６Ａ）。この混合物におけるｒＶＥＧＦ_１６５の標識化を明らか
に実証するために、抗ＶＥＧＦ抗体でのマクロファージ細胞質ゾル標識化混合物
の免疫沈降が必要であった。免疫沈降後、ｒＶＥＧＦ_１６５に対応する顕著な標
識化バンドが明らかに可視可能であった（図６Ｂ）。このバンドは、ｒＶＥＧＦ _１６５ の不在下で行われたコントロール反応に存在しなかった。百日咳トキシン
を使用するＶＥＧＦの標識化は観察されなかった（図６Ｅ）。

【００４２】 ラット角膜における脈管形成応答および抗脈管形成応答 種々の条件下で培養されたＭＰＭからの濃縮された馴化培地によるラット角膜
において誘導される脈管形成応答は、表２において示される。正常酸素状態下で
培養された非活性化ＭＰＭからの培地は、新脈管形成を誘導しなかった。ＶＥＧ
Ｆ（２５ｎｇ）の脈管形成効果はこの培地によって影響されなかったので、この
培地は抗脈管形成活性を含まなかった。Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭからの培
地は強力に脈管形成性であったが、ｉＮＯＳ阻害されたＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化
ＭＰＭからの培地は、顕著に減少された脈管形成活性を示した。正常酸素状態の
、非活性化ＭＰＭからの培地と対照的に、この培地は、本発明者らが以前に報告
したように（３６）、抗脈管形成活性を含むことが見出された。正常酸素状態の
、乳酸処理された非活性化ＭＰＭからの培地は、有意な脈管形成活性を示した。
同様に、低酸素条件下で培養された非活性化ＭＰＭからの培地は、有意な脈管形
成活性を示した。これらの場合の両方において、ＶＥＧＦに対するポリクロー抗
体は、馴化培地における脈管形成活性を中和した。ｒＶＥＧＦ_１６５によって誘
導される脈管形成応答は、コントロール実験において抗ＶＥＧＦ抗体によって中
和され、一方、ｂＦＧＦ（２０ｍｇ／移植片）およびＴＮＦα（２０ｎｇ／移植
片）によって誘導された脈管形成応答は、影響されなかった。

【００４３】 コレラトキシンまたはＭＰＭ細胞質ゾル抽出物を使用してＡＤＰ-リボシル化
されたｒＶＥＧＦ_１６５によって誘導される脈管形成応答は、表３において示さ
れる。コントロールＶＥＧＦ（コレラトキシンおよびＭＰＭ細胞質抽出物の不在
下で模擬標識化手順を介して行われた）は、強力に新脈管形成を誘導したが、コ
レラトキシン媒介性のおよびＭＰＭ細胞質抽出物媒介性のＡＤＰリボシル化ＶＥ
ＧＦは、脈管形成応答を大きく減少し、このことはＡＤＰ−リボシル化がＶＥＧ
Ｆの脈管形成活性を廃止したことを示す。ＶＥＧＦは、へパリン−セファロース
結合および溶出を使用して反応混合物から精製されたので、本発明者らはまた、
第１に、これらの溶出物がそれら自身で脈管形成活性を含むのか否か、および第
２に、任意の抗脈管形成活性がこの手順を介して溶出物中に富化され得、そして
ＶＥＧＦの脈管形成活性を妨げ得るのか否かを決定するために、コレラトキシン
またはマクロファージ細胞質ゾル抽出物を用いで調製したコントロールＶＥＧＦ
非含有反応物からの溶出物を試験した。それゆえ、溶出物は単独で試験され、次
いでｒＶＥＧＦ_１６５の反応後の添加を伴った。模擬溶出物は、直接的な脈管形
成活性を示さず、ＶＥＧＦと組合わされた場合、抗脈管形成活性を示さなかった
。

【００４４】 考察 本研究において、マウスマクロファージ（ＭＰＭ）は、ＶＥＧＦ、強力な内皮
細胞特異的、脈管形成増殖因子（２３、２４）を産生することが示された。ＭＰ
ＭによるＶＥＧＦ産生は活性化を必要とせず、有意なＶＥＧＦレベルが、外部刺
激の添加を伴うことなく、１８〜４８時間にわたって、馴化倍地中に放出された
。しかし、ＶＥＧＦ産生のこの構成的なレベルは、Ｉｆｎγ／ＬＰＳでの細胞の
刺激によって顕著に増加された（図２）。対照的に、ＴＮＦαの産生は、多くの
以前の研究において示されたように、ＩｎｆγおよびＬＰＳでのマクロファージ
の活性化に厳密に依存した（図４）（３７〜３９）。

【００４５】 ＶＲＧＦ発現は、インビボおよびインビトロの両方で酸素圧によって調節され
（４０〜４４）、低レベルの酸素（低酸素）はＶＥＧＦ発現のアップレギュレー
ションを生じることが見出されている。この増加された発現は、転写レベルおよ
びｍＲＮＡ安定性のレベルの両方で調節されることが示されており、細胞タイプ
に依存する。本発明者らの研究において、酸素濃度が、通常の培養ディッシュお
よびＰｅｒｍａｎｏｘ培養ディッシュの両方において培養されたマクロファージ
の馴化倍地において測定された。これらの測定は、これらの条件下で、ＭＰＭお
よびＲＡＷ細胞上の培地は正常酸素状態であり、観察された構成的なＶＥＧＦ産
生は、低酸素圧によるＶＥＧＦ遺伝子の発現の誘導に起因しなかったことを示唆
する。しかし、細胞が低酸素条件下で特異的にインキュベートされた場合、両方
の細胞タイプにおいて、ＶＥＧＦの有意なアップレギュレーションが観察された
が、ＴＮＦαおよび亜硝酸産生の有意なアップレギュレーションは観察されなか
った。ＶＥＧＦ発現のこのアップレギュレーションは、ｍＲＮＡおよびタンパク
質レベルの両方で明白であった。これらの観察は、他の細胞タイプにおいて観察
されるように、ＶＥＧＦ遺伝子の発現が、マクロファージにおける酸素圧によっ
て調製されることを示唆する。しかし、この調節が転写のレベルで生じるのか否
か、またはｍＲＮＡ安定性のレベルで生じるのか否かは未だ明らかではない。

【００４６】 Ｋｎｉｇｈｔｏｎおよび共同研究者は、ウサギ骨髄由来のマクロファージによ
る脈管形成活性の発現が低酸素によって調節されること、および低酸素マクロフ
ァージの馴化培地中に蓄積する高レベルの乳酸が、マクロファージ由来の脈管形
成活性の発現を調節するにおいて重要であることを以前に示した（５）。ＭＰＭ
およびＲＡＷ細胞において、正常酸素条件下の高乳酸濃度（２５ｍＭ）の存在下
での培養は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現のレベルを調節しなか
った。しかし、刺激されないＭＰＭは有意なレベルのＶＥＧＦを発現するが、こ
れらの細胞からの馴化培地は非脈管形成性である（４、８、２２）ことに注目す
ることは重要である。乳酸または低酸素処理後、培地は、脈管形成活性を示す（
表１）。これは、ＶＥＧＦの脈管形成活性がどのように調節されるかという重要
な疑問を生じさせる。先ず、ＶＥＧＦはＴＮＦαとの相乗作用において操作され
得、Ｉｆｎγ/ＬＰＳ活性化マクロファージからの馴化倍地中の微小脈管構造を
刺激する。しかし、乳酸処理されたまたは低酸素処理された非活性化マクロファ
ージからの培地は、ＴＮＦαを含まず、強力な脈管形成活性を表すという事実は
、適切な条件下で、ＶＥＧＦがＴＮＦαの不在下で脈管形成性であり得るという
ことを示唆する。このことは、これらの培地における脈管形成活性が、抗ＶＥＧ
Ｆ抗体によって中和されるという事実によって支持される（表１）。試験された
第２の可能性は、正常酸素状態の、非活性化ＭＰＭからの培地が、ＶＥＧＦの脈
管形成効果をブロックする抗脈管形成因子を含み得るということであった。この
仮説は、ＶＥＧＦの脈管形成効果が阻害されたか否かを決定するために、これら
の細胞からの濃縮された馴化培地とｒＶＥＧＦ_１６５とを合わせることによって
、ラットの角膜のバイオアッセイを使用して試験された。実際、ＶＥＧＦの効果
の阻害は、この系において観察されず、抗脈管形成因子がこの馴化倍地中に存在
しなかったことを明らかに示す。以下にさらに考察されるように、ｉＮＯＳ阻害
された、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化マクロファージ培地からの馴化培地に対照的で
あった。

【００４７】 次いで、刺激されないＭＰＭによって産生されるＶＥＧＦは、刺激されたＭＰ
Ｍによって産生されるＶＥＧＦとは構造的に異なり得るということが仮説された
。この構造的差異は、異なる脈管形成活性を有するＶＥＧＦのオルタナティブに
スプライスされたイソ型に、または例えば、ＡＤＰリボシル化依存性機構による
ＶＥＧＦの転写後修飾（３２、４５、４６）に関連し得た。ＲＴ−ＰＣＲを使用
する本発明者らの結果は、ＶＥＧＦのイソ型が、乳酸によって、またはｉＮＯＳ
の阻害によって、マクロファージの活性化の間に顕著には変化されないことを示
す。ＶＥＧＦ１、２、および３ ｍＲＮＡイソ型は、試験された全ての条件下で
同様の割合に産生される。従って、ＶＥＧＦ脈管形成活性の調節についての最も
ありそうな機構は、Ｈｕｓｓａｉｎら（３２、４７）によって近年示唆されたよ
うに、転写後機構を含み得るようである。この仮説の支持において、ｒＶＥＧＦ
は、ＡＤＰ−リボシル化についての基質であることが示され、そしてＡＤＰ−リ
ボシル化は、ｒＶＥＧＦの脈管形成活性を廃止することが示された。マクロファ
ージはＮＡＤ^＋に不透過性であるので、^３２Ｐ−標識化ＮＡＤ＋を使用する、マ
クロファージにより内因的に合成されたＶＥＧＦの代謝性標識化は可能ではない
（３２、３３）。しかし、本発明者らは、マクロファージの細胞質ゾル抽出物を
使用して、および細菌のアルギニン特異的ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ
、コレラトキシンサブユニットＡによって、インビトロでｒＶＥＧＦ_１６５の標
識化を実証した（図６）（３４、３５）。他方、百日咳トキシンは、システイン
特異的ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼであり、ｒＶＥＧＦ_１６５を修飾し
なかった（４８）。さらに、本発明者らは、ＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化は、
その脈管形成活性を廃止することを示した。未修飾のｒＶＥＧＦ_１６５と対照的
に、コレラトキシンまたはマクロファージ細胞質ゾル抽出物を使用して誘導体化
されたｒＶＥＧＦ_１６５は、非脈管形成性であることが見出された（表３）。

【００４８】 ヒト単球による、およびマウスマクロファージによる脈管形成活性の生成は、
Ｉｆｎγ／ＬＰＳでの細胞の活性化によって誘導される（１〜３、２０、２１、
４９）。さらに、Ｌ−アルギニン依存性の誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ
）依存性の経路は、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化マクロファージによる脈管形成活性
の発現を調節するにおいて重要な役割を示す（２１）。Ｌ−ＮＡＭＥ、Ｎｇ−モ
ノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰ
Ｉ）、およびＡＧのようなｉＮＯＳのインヒビターは、脈管形成サイトカインの
ＴＮＦαおよびＩｌ−８の産生を阻害することなく、活性化マクロファージによ
る脈管形成活性の産生をブロックする（２１、４９、５０）。この研究において
、本発明者らは、ｉＮＯＳインヒビターのＬ−ＮＡＭＥおよびＡＧは、Ｉｆｎγ
／ＬＰＳ活性化ＰＡＷ細胞によるＶＥＧＦの産生を顕著に阻害する（＞７０％阻
害）が、これらの細胞によるＶＥＧＦの構成的な（刺激されない）産生に対して
ほとんど効果を有しないことを示す。興味深いことに、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化
ＲＡＷ細胞において、Ｌ−ＮＡＭＥおよびＡＧは、ＶＥＧＦの産生を、刺激され
ない細胞のレベルを有意に下回るレベルに阻害する。このことは、非活性化ＲＡ
Ｗ細胞および活性化ＲＡＷ細胞において、ＶＥＧＦ産生の調節に関与する経路が
異なり、活性化経路のみがｉＮＯＳ産物に感受性であることを示唆する。このこ
とは、構成的条件および活性化条件下でのＶＥＧＦ遺伝子の発現に関与する転写
プロモーターの性質に関連し得る。他方、ＭＰＭにおいて、ｉＮＯＳインヒビタ
ーは、構成的なＶＥＧＦおよびＩｎｆγ／ＬＰＳ刺激されたＶＥＧＦのいずれの
産生に対しても有意な効果を有しなかった。しかし、ＭＰＭ馴化培地の脈管形成
活性が、ｉＮＯＳインヒビターによって顕著にダウンレギュレートされたことに
注目することは重要である。本発明者らの結果は、２つの機構が、ｉＮＯＳ阻害
された、Ｉｎｆγ／ＬＰＳ活性化されたＭＰＭによる脈管形成活性の発現の調節
に関与することを示唆する。第１は、低酸素および乳酸によるマクロファージの
活性化において観察されること；すなわち、ＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化の調
節に、従って、その脈管形成活性の調節に類似する。Ｉｎｆγ／ＬＰＳ活性化は
、ＶＥＧＦの産生をＡＤＰリボシル化された、非脈管形成性の形態から未修飾の
、脈管形成性の形態に切り替える。第２に、ｉＮＯＳ依存性の経路は、新脈管形
成のインヒビターの発現を調節する。ｉＮＯＳ経路が活性であり、およびＮＯが
産生される場合、インヒビターは不活性であるかまたは存在せず；ｉＮＯＳ経路
がＡＧまたはＬ−ＮＡＭＥでブロックされる場合、インヒビターは活性である。
本発明者らは以前に、この抗脈管形成活性が、ｉＮＯＳ阻害された、Ｉｎｆγ／
ＬＰＳ活性化されたＭＰＭの馴化培地に存在することを報告した（３６）。この
インヒビターの性質はいまだ明らかでないが；これは、トロンボスポンジン−１
またはγＩＰ−１０（この両方は、マクロファージによって産生され得る強力な
抗脈管形成因子である）に対する特異的な抗体によって中和されない（５１、５
２）。ＴＮＦαおよびＴＧＦβに対する特異的な抗体はまた、抗脈管形成活性を
中和しなかった。インヒビターは、へパリン−セファロースに弱く結合し、そし
て１００ｋＤａを超える見かけの分子量を有する（３６）。

【００４９】 Ｈｕｓｓａｉｎおよび共同研究者（３２、４７）は、ＡＤＰ−リボシル化依存
性の機構が、脈管形成因子の転写後修飾に関与し得、非脈管形成性の形態を生じ
ることを示唆した。本発明者らの結果は、これが、マクロファージによる脈管形
成活性の産生を調節する機構のうちの１つでまさにあり得ることを示唆する。本
発明者らは、構成的な経路によって産生されるＶＥＧＦが、通常ＡＤＰ−リボシ
ル化された、非脈管形成性の形態にあり、一方Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭに
よって産生されるＶＥＧＦは、リボシル化されない、脈管形成性の形態にあるこ
とを示唆する。従って、活性化は、ＶＥＧＦの転写後修飾を、ＡＤＰリボシル化
された、非脈管形成性の形態から、未修飾の、脈管形成性の形態に調節し得る。
さらに、活性化されたＭＰＭにおけるｉＮＯＳ経路は、抗脈管形成因子の産生（
生体活性）を調節するようであり、これは、Ｉｎｆγ／ＬＰＳ活性化された、ｉ
ＮＯＳ阻害されたＭＰＭ培地においてのみ明白である。

【００５０】 これらの結果は明らかに,ＶＥＧＦがＡＤＰ−リボシル化についての基質であ
ること、およびＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化は、その脈管形成活性を廃止する
ことを示す。予備的な結果（作成中の原稿）はまた、ビタミンＫ３およびノボビ
オシンは、両方ともにモノ−ＡＤＰリボシル化反応のインヒビターであり（３４
、３５）、ＶＥＧＦ産生のレベルまたはＴＮＦαの産生を影響することなく、非
活性化の、正常酸素状態のマクロファージによる脈管形成的に活性なＶＥＧＦの
産生を生じることを示し、マクロファージにおける脈管形成活性の調節における
モノ−ＡＤＰリボシル化の関与を示唆する。しかし、マクロファージによるＶＥ
ＧＦ生体活性の調節におけるモノ−ＡＤＰリボシル化の役割の最終的な証明は、
ＶＥＧＦが、酸素圧またはＩｆｎγ／ＬＰＳ誘導性のマクロファージ活性化およ
びｉＮＯＳ依存性の経路を改変する条件下で、マクロファージにおいて異なって
ＡＤＰリボシル化されるという直接的な実証を必要とする。

【００５１】 まとめると、これらの観察に基づいて、ＶＥＧＦはマクロファージ依存性の脈
管形成活性に対する重要な寄与因子であるようである。マクロファージにおける
ＶＥＧＦ産生は、いくつかのレベルで調節される。構成的に発現されるＶＥＧＦ
は通常、脈管形成的に不活性である。低酸素およびＩｆｎγ／ＬＰＳ活性は、産
生されるＶＥＧＦの絶対量を増加するが、脈管形成性ＶＥＧＦの発現をまた生じ
る。高い乳酸用量は、産生されるＶＥＧＦの量を増加しないが、脈管形成性のＶ
ＥＧＦの産生をまた生じる。ＶＥＧＦの脈管形成性の表現型における変化は、恐
らくＶＥＧＦ生態活性を調節するＡＤＰ−リボシル化のプロセスによる、翻訳後
修飾に起因し得る。ｒＶＥＧＦ_１６５は、コレラトキシンによる、およびＭＰＭ
細胞質ゾル抽出物によるＡＤＰ−リボシル化についての基質であり、ならびにｒ
ＶＥＧＦ_１６５のＡＤＰ−リボシル化は、その脈管形成活性を廃止することが示
された。低酸素およびＩｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭにおいて、活性化は、ＶＥ
ＧＦ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートし、そしてまた、ＶＥＧＦの翻訳後修
飾のバランスを、非脈管形成性の形態から脈管形成性の形態にシフトした。ＲＡ
Ｗ２６４．７細胞において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルのＩｆｎγ／ＬＰＳ活性
化依存性の修飾は、ｉＮＯＳ経路によって一部調節されるが、非活性化細胞にお
けるＶＥＧＦの構成的な産生は調節されない。他方、ＭＰＭにおいて、Ｉｆｎγ
/ＬＰＳ活性化によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの調節は、ｉＮＯＳ経路に有意に
は依存しない。これらの細胞におけるＶＥＧＦ脈管形成活性は、翻訳後修飾のレ
ベルで調節されるようである。最後に、ｉＮＯＳ経路が、Ｉｆｒγ／ＬＰＳ活性
化ＭＰＭにおいて阻害される場合、ＶＥＧＦの脈管形成活性を阻害する抗脈管形
成因子が発現される。ならびに、翻訳後修飾によるＶＥＧＦ生体活性の調節、お
よび抗脈管形成因子の発現のｉＮＯＳ依存性の調節は、マクロファージの脈管形
成性の表現型を制御するための新規な機構を提供し、ならびにインビボで、創傷
修復、線維増殖において、およびおそらく固形腫瘍の発生において、マクロファ
ージ依存性の脈管形成活性を調節するのに重要な役割を果たし得る。

【００５２】 本発明は、有効な請求の範囲を制限することが意図されない以下の実施例によ
ってさらに説明される。実施例において、ならびに明細書および請求の範囲を通
じて、全ての要素およびパーセントは、他で特定されない限り最終濃度の重量基
準である。

【００５３】 実施例 材料および方法 マウス腹膜マクロファージ（ＭＰＭ）およびＲＡＷ２６４．７細胞 Ｂａｌｂ−ｃマウス（雄性、６〜８週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏ
ｗｎ、ＮＹ）を、２．５ｍｌの滅菌Ｂｒｅｗｅｒチオグリオール酸ブロス（３％
ｗ／ｖ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ．、Ｄｅｔｒｉｏｔ、ＭＩ）で腹腔内に注射し
た。５日後、マウスを屠殺し、そしてＭＰＭを１００Ｕ/ｍｌのへパリンを含有
するＰＢＳを使用して採集した。細胞を、３００ｇにて５分間、４℃で遠心分離
し、血清非含有ＤＭＥＭで２回洗浄し、そして１０％ ＦＣＳおよび５０μｇ／
ｍｌゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ）中に再懸濁
した。細胞を、３７℃にて、９５％空気／５％ ＣＯ２において４時間、加湿し
たインキュベーター中でインキュベートして、細胞を接着させた。いくつかの実
施態様において、細胞を、通常の組織培養ディッシュではなくＣｏｕｎｔｅｒ
Ｐｅｒｍａｎｏｘ気体透過性ディッシュ（Ｍｉｌｅｓ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、
ＩＬ）において播種して、ディッシの底面における細胞に対する周囲のガーゼの
利用可能性を増加した。非接着性の細胞を、血清非含有ＤＭＥＭで洗浄すること
によって除去し、そして細胞を、ＤＭＥＭ／１％ ＦＣＳで再栄養補給した。Ｍ
ＰＭを、ｉＮＯＳインヒビターのＬ−ＮＡＭＥ（１．５ｍＭ）またはＡＧ（１ｍ
Ｍ）の存在下または不在下のいずれかにおいて、１００Ｕ／ｍｌマウスＩｆｎγ
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１０
０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ血清型０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）を使用
して活性化した。ＭＰＭに対する乳酸の効果を試験するために、インキュベーシ
ョン期間の開始時に、培養物に乳酸ナトリウム（２５ｍＭ）を添加した。低酸素
の効果を試験するために、ＭＰＭを、正常酸素状態（９５％空気、５％ ＣＯ_２
）下または低酸素条件下（９５％ Ｎ_２、５％ ＣＯ_２）のいずれかで、Ｐｅｒｍ
ａｎｏｘディッシュ中でインキュベートした。培地および細胞を、Ｉｆｎ‐γ／
ＬＰＳおよび／または乳酸の添加後、示された時点で採集した。培地のアリコー
トを、インキュベーション後に迅速にサンプリングし、そしてＢｌｏｏｄ Ｇａ
ｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂ.、Ｌｅｘｉｎ
ｇｔｏｎ、ＭＡ）において分析した。残りの培地を４℃で５分間、１５,０００
ｇで遠心分離して、細胞残渣を除去し、そして分析するまで−８０℃で保存した
。

【００５４】 ＲＡＷ２６４．７細胞をＡＴＣＣから得、そしてＤＭＥＭ−１０％ ＦＣＳ中
に日常的に維持した。細胞を掻爬することによって継代し、そして上記のように
、Ｉｆｎγ／ＬＰＳを伴ってまたは伴わないで、乳酸ナトリウムを伴ってまたは
伴わないで、および低酸素条件下で、通常のディッシュまたはＰｅｒｍａｎｏｘ
ディッシュのいずれかにプレートした。ＶＥＧＦおよびＴＮＦαの産生に対する
Ｌ−ＮＡＭＥおよびＡＧの効果をまた試験した。培地および細胞を、上記のよう
に採集し、そして処理した。

【００５５】 全細胞性ＲＮＡの単離 全細胞性ＲＮＡを、ＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を使用して、マ
クロファージ細胞培養物から単離した。培地を細胞から除去し、ＴＲＩ ＲＥＡ
ＧＥＮＴを培養ディッシュに直接的に添加し、そして細胞溶解物を２１ゲージの
注射針に数回通した。サンプルを、室温で５分間保存し、次いで、溶解試薬の１
ミリリットルあたり０．２ｍｌクロロホルムを添加し、混合物を１５秒間、ボル
テックスし、次いで室温で１０分間インキュベートした。得られた混合物を１２
，０００ｇにて１５分間４℃で遠心分離した。水性の（上部の）相を、新鮮なマ
イクロ遠心チューブに移し、そして元来の抽出について使用した１ｍｌのＴＲＩ
ＴＥＡＧＥＮＴ当たり０．５ｍｌのイソプロパノールを添加することによって
、ＲＮＡを沈殿した。サンプルを、室温で５分間インキュベートし、次いで１２
，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ＲＮＡペレットを７５％エタノー
ルで洗浄し、５分間風乾し、そしてＲＮＡアーゼ非含有水中に溶解した。

【００５６】 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの定量的なＲＴ−ＰＣＲ分析 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ段階およびＰＣＲ段階の両方を通じて存在
する内部ミニ遺伝子ＲＮＡ標準を使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。２
９３ｂｐのＶＥＧＦミニ遺伝子ＲＮＡ標準は、６９ｂｐの遺伝子欠失を含み、以
下のように調製した：以下のプライマーを使用して、ＭＰＭからの全ＲＮＡをＲ
Ｔおよび３５サイクルを介するＰＣＲに供した。

【００５７】 センスミニ遺伝子プライマー：（１８マー）エキソン１における（４１〜５８
位）：５’ ＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣ ３’ アンチセンスミニ遺伝子プライマー（３９マー）、エキソン５において開始し
、イントロンに及び、そして３８７位までエキソン４に続き、３１８位までの６
９ｂｐの遺伝子を欠失し、そして３００位まで続く。従って、プライマーはイン
トロンに及び、および６９ｂｐの欠失を含む。５’ ＴＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴ
ＣＡＣＡＴＣＧＧＣ−ＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＣ ３’。ＰＣＲバ
ンドをエタノール沈殿によってプライマーから精製し、そして平滑末端をｐＣＲ
−Ｓｃｒｉｐｔ ＡｍｐＳＫ（+）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ、ＣＡ）にライゲーションした。ベクターにおけるミニ遺伝子の方向を、
ジデオキシ配列解析によって決定した。アンチセンス方向においてミニ遺伝子挿
入物を含有するクローンを、ＲＮＡミニ遺伝子の調製のためのその後のインビト
ロ転写に使用した。ベクターをＮｏｔ１で線状化し、プロテイナーゼ−Ｋ（４μ
ｇ／ｍｌ）で１時間、３７℃で処理し、そしてフェノール抽出およびエタノール
沈殿によって精製した。次いで、線状化したプラスミドを、ＶＴＲＡＮ−７転写
キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い、インビト
ロで転写して、センスＲＮＡを得た。反応産物を、ＲＮＡアーゼ非含有ＤＮＡア
ーゼ１（転写反応中の１０μ／ｍｇ ＤＮＡ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ、ＷＩ）で２時間、３７℃で処理した。次いで、反応混合物を９０℃に５分間
加熱し、冷却し、そして１０×転写停止溶液（５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍ
ＥＤＴＡ）を添加した後、フェノール抽出し、そしてイソプロパノール沈殿し
た。ＲＮＡ濃度を分光光度計で決定した。次いで、ＶＥＧＦ ＲＮＡミニ遺伝子
（反応当たり２．５ｐｇ）をＲＴ−ＰＣＲ反応物に取込ませた。種々の条件下で
処理されたマクロファージからの全ＲＮＡを、１〜２００ｎｇ／反応の範囲の量
において、ＲＴ−ＰＣＲ反応に添加した。拮抗的なＲＴ−ＰＣＲ反応に使用され
るオリゴヌクレオチドプライマーは、ミニ遺伝子を調製するために使用された最
初のプライマーにネストした１８マーであった： エキソン１におけるセンスプライマー：５’ ＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴ
ＧＣＴＧ ３’ アンチセンスプライマー（イントロンに及ぶ）：５’ ＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴ
ＣＡＣＡＴＣＧＧ ３’。

【００５８】 アンチセンスプライマーを最初のＲＴ反応に使用し；逆転写酵素を９９℃で５
分間不活性化し、そして等量のセンスプライマーを含有するＰＣＲミックスに添
加した。次いで、ＰＣＲを２５サイクル行った。反応物をＴＡＥ緩衝液中で１．
５％アガロースゲルにおける電気泳動によって分析し、エチジウムブロミドで染
色し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅ Ａ
ｎａｌｙｚｅｒを使用してスキャニングした。次いで、内部ＶＥＧＦ ＲＮＡミ
ニ遺伝子の強度に等しい強度のバンドを与える投入量ＲＮＡの濃度を決定した。
イントロンに及ぶプライマーを始めから最後まで使用したが、、全ＲＮＡ調製物
のゲノムＤＮＡ混入についてのコントロールを日常的に行った。これらのコント
ロールは、逆転写酵素の不在下の平行反応の実施を含んだ。

【００５９】 使用される種々の培養条件によって顕著に調節されないハウスキーピング遺伝
子についてのコントロールとして、酵素グリセルアルデヒド−３‐リン酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）についてのＲＴ−ＰＣＲ手順をまた開発した（詳細は
示さず）。Ｇ３ＰＤＨ ｍＲＮＡレベルについての平行反応を、種々のマクロフ
ァージＲＮＡサンプルに対して行い、そしてＲＴ-ＰＣＲによって決定されるＶ
ＥＧＦ ｍＲＮＡレベルをＧ３ＰＤＨレベルに正規化した。

【００６０】 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡイソ型のＲＴ−ＰＣＲ分析 逆転写について、１．０μｇの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、
ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃ
Ａ）とともに５０Ｕ ＭｕＬｖ逆転写酵素を用いて、以下に示される１００ｎｇ
の逆ＶＥＧＦ特異的プライマーを使用して転写した。最初のＲＴ反応工程後、２
０μｌの反応容量を５分間煮沸して、逆転写酵素を不活性化した。１００ｎｇの
正方向プライマー（以下を参照のこと）を、８０μｌのＰＣＲマスターミックス
とともに添加して、反応当たり１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、お
よび２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の最終濃度を
与えた。ＰＣＲプライマーを、ＶＥＧＦ遺伝子から形成されるＶＥＧＦ ｍＲＮ
Ａの３つの異なってスプライシングされるマウスイソ型の増幅を可能にするよう
に選択した。これらのＶＥＧＦ ｍＲＮＡイソ型は、８つのエキソンを含有する
遺伝子に由来した（４５）。最も大きな、ＶＥＧＦ−１は、全ての８つのエキソ
ンを使用して形成される。ＶＥＧＦ−２はエキソン７を欠損し、およびＶＥＧＦ
−３はエキソン６および７を欠損する。エキソン３および８におけるＰＣＲプラ
イマーを使用することによって、ＶＥＧＦの３つの異なるイソ型が、異なった大
きさのＰＣＲ増幅産物を生成し、ならびにこれらが同じプライマーから増幅され
るので，３つのバンドの強度の比率は、３つの異なってスプライスされるｍＲＮ
Ａイソ型の相対的な量の見積もりを与える。ＰＣＲ増幅のために選択されたプラ
イマーは： 正方向プライマー（エキソン３に位置される）：５’ ＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣ
ＴＧＧＡＧＴＧＣ ３’ 逆方向プライマー（エキソン８に位置される）；５’ ＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣ
ＡＡＣＣＣＴＡＡ ３’であった。

【００６１】 ＰＣＲについて以下のサイクリングプログラムを使用した：２５サイクルにつ
いて、９４℃で１分間の変性、５４℃で１分間のアニーリング、および２分間、
７２℃での伸長、そして７２℃で１５分間の最終的な伸長を伴う。次いで、ＰＣ
Ｒ反応物を、ＴＡＥ緩衝液を使用する１．５％アガロースゲルにおける電気泳動
によって分析し、そしてエチジウムブロミドで染色した。ゲルを、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅ分析器を使用してスキャンし、
そしてＰＣＲ増幅されたＶＥＧＦイソ型バンドの染色強度を、ＩｍａｇｅＱｕａ
ｎｔ画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ
）を使用して分析した。

【００６２】 ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦタンパク質レベルのアッセイ 馴化培地中のＶＥＧＦを、製造業者のプロトコルに従って、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用してアッセイした。このアッセイは、３〜５００
ｐｇ/ｍｌの範囲における感度で、マウスＶＥＧＦを検出する。この範囲を超え
るＶＥＧＦ濃度を有するサンプルを、ＲＰＭＩで溶出し、そして再アッセイした
。全てのサンプルを三連においてアッセイした。結果は、平均＋／−平均の標準
偏差（Ｓ．Ｄ．）として示される。

【００６３】 ＥＬＩＳＡによるＴＮＦαのアッセイ マウスＴＮＦαを、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＴＮＦ-Ａ Ｍｉｎｉｋｉ
ｔ、Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用してアッセイし、製造業者の
手順に従った。全てのサンプルを三連においてアッセイした。結果は、平均＋／
−Ｓ．Ｄ．として示される。

【００６４】 亜硝酸のアッセイ 試験した種々の条件下の細胞による一酸化酸素（ＮＯ）の産生を決定するため
に、以前に記載されるように培地をＧｒｉｅｓｓ反応を使用して、亜硝酸につい
て分析した。簡潔には、５０μｌ培養培地を、９６ウェルプレート中に置き、続
いて５０μＬの冷却３５０ｍＭ塩化アンモニウム、ｐＨ９．６を置いた。１００
μｌの１の割合の５ｍＭスルファニル酸、１の割合の５ｍＭ Ｎ−(１−ナフチル
)エチレンジアミン、および３の割合の氷酢酸を添加した。室温での暗所におけ
る１０分間のインキュベーション後、５７０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレー
トスキャナ（Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ．
ＶＴ）を使用して決定した。系を、新鮮に調製した標準亜硝酸溶液を使用して更
正した。一次回帰線が標準から決定され、そして実験的な亜硝酸濃度を算定した
。結果は、平均±Ｓ．Ｄ．である。

【００６５】 脈管形成活性および抗脈管形成活性のアッセイ ＭＰＭ培養物からの馴化培地を２０倍に濃縮し、そしてＡｍｉｃｏｎ遠心分離
スピンフィルター（３ＫＤａカットオフ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して
、透析した。５μｌの濃縮された培地を、等容量の緩慢放出性のＨｙｄｒｏｎ（
９５％エタノール中の１２％ ｗ/ｖ）（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）中に取込ませ、そして乾燥させた。Ｈ
ｙｄｒｏｎペレットを、以前に記載されるように（１、２、４、９）、ラットの
角膜支質内の嚢の、肢脈管構造から２ｍｍに無菌的に移植した。角膜を、立体顕
微鏡を使用して７日間毎日試験し、そして観察期間の終わりにコロイド性の炭素
で灌流して、脈管形成応答の永続的な記録を提供した。角膜を、非特異的な炎症
の任意の証拠について組織学的に試験した。脈管形成応答を、以下のような等級
付けに対してアッセイした：応答なし、または迅速に復帰される肢脈管構造のわ
ずかな発芽＝０；肢から０．２ｍｍ未満に進行し、および復帰を開始する、いく
つかの毛状芽および新芽の形成＝１；移植片に対して少なくとも１ｍｍで増殖す
るが、移植片に達しずおよびこれを侵襲しない毛状芽および新芽の網の持続性の
増殖＝２；移植片に達しおよびこれを取り囲む、毛状芽および新芽の高密度の網
の強力な増殖＝３。試験あたり４つの角膜移植片を調製し、そして応答をまとめ
た。従って、最大の応答は、１２のスコアを有し、一方最小の応答は、０のスコ
アを有する。抗脈管形成活性のアッセイについて、試験馴化培地（２０倍に濃縮
される）を、２０ｎｇの組換えヒトＶＥＧＦ_１６５（Ｎａｐｏｌｅｏｎｅ Ｆｅ
ｒｒａｒａ博士、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ、ＣＡの贈与物）と合わせた。次いで、ｒＶＥＧＦの脈管形成活性に対する試
験培地の効果を、角膜バイオアッセイを使用して決定した。

【００６６】 マクロファージ脈管形成活性に対する抗ＶＥＧＦ抗体の効果 ＭＰＭ馴化培地の脈管形成活性に対するＶＥＧＦの寄与を決定するために、Ｖ
ＥＧＦに対するアフィニティー精製した中和化ポリクローナル抗体（Ｎａｐｏｌ
ｅｏｎｅ Ｆｅｒｒａｒａ博士の贈与物）を使用した。上記のように調製した濃
縮された馴化培地を、３７℃で２時間、１０μｇ／ｍｌの最終濃度の抗−ＶＥＧ
Ｆ抗体とともにインキュベートした。コントロールを、同じ濃度の免疫前のＩｇ
Ｇと共にインキュベートした。次いで、これらの処理された培地を、ラット角膜
バイオアッセイにおいて脈管形成活性についてアッセイした。

【００６７】 ｒＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化 ^３２Ｐ−ＮＡＤ^＋を使用する、ＭＰＭにおいて内因的に合成されたＶＥＧＦを
代謝的に標識する最初の試みは、マクロファージがＮＡＤ^＋に不透過性であり、
これが細胞に入れ得ず、および細胞質ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼを提
供し得ないので、首尾良くいかなかった（３２、３３）。それゆえ、本発明者ら
は、透過化されたＭＰＭ（データ示さず）またはマクロファージ細胞質抽出物の
いずれかを使用して、内因性ｒＶＥＧＦがマクロファージのＡＤＰ−リボシルト
ランスフェラーゼについての基質であるか否かを決定した。同様に、ｒＶＥＧＦ
を、コレラトキシン（アルギニン−特異的ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ
）についての、および百日咳トキシン（システイン−特異的ＡＤＰ−リボシルト
ランスフェラーゼ）についての基質として試験した（３４、３５）。

【００６８】 ｉ）ＭＰＭの細胞質ゾル抽出物を、以下のように調製した：ＭＰＭを、１０％
胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中に、１００ｍｍ培養ディッシュにお
いてプレートし（１０ｍｌ培地中、ディッシュ当たり１０×１０^６細胞）、そし
て３７℃で一晩、インキュベートした。次いで、培地を除去し、そして冷却ＰＢ
Ｓで細胞を洗浄した（×２）。次いで、細胞を冷却ＰＢＳ（１ｍｌ／ディッシュ
）に掻爬することによって採集した。細胞を、３００ｇにて落とし、そして氷上
で、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ メルカプトエタノール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μ
ｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、および０．２５Ｍ スク
ロース（１ｍｌ／５０×１０^６細胞）中に再懸濁し、そして短く超音波処理した
。抽出物を、１５分間、１１００ｇで冷却して遠心分離して、核および不溶性の
残渣を除去した。抽出物のタンパク質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢｉｏＲａ
ｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を使用して決定し、そして抽出物を−８０℃で使
用するまで保存した。これらの抽出物が、ｒＶＥＧＦ_１６５をＡＤＰ−リボシル
化し得るか否かを決定するために、以下を含む標識化反応物を設定した：５００
ｎｇ ＶＥＧＦ_１６５、１０μｇ マクロファージタンパク質抽出物、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、２０ｍＭ イソニアジド、１２０ｍＭ ＭｇＣｌ
_２、１０ｍＭ ＮａＦ、０．０２％ ロイペプチン、０．５４ｍＭ ＮＡＤＰ、０
．４ｍＭ イソブチル−メチルキサンチン、０．１％ ルブロール、２ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１０ｍＭ チミジン、および７μＣｉ ^３２Ｐ標識化ＮＡＤ^＋（８００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ）（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）。３０℃で
２時間のインキュベーション後、反応混合物を氷上に置き、そして３０分間、１
０μｌのプロテイン−Ａ/Ｇ−アガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）で予めきれいにした。１０μｇのマウス抗Ｖ
ＥＧＦモノクローナル抗体（Ｔｅｘａｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．
Ｄａｌｌａｓ、ＴＸの贈与物）を上清に添加し、そして混合物を氷上で２時間、
インキュベートした。次いで、１０μｌのプロテイン−Ａ／Ｇ−アガロースビー
ズを添加し，そして混合物をさらに２時間、４℃で、穏やかにゆすりながらイン
キュベートした。ビーズを遠心分離によって採集し、そして細胞溶解緩衝液で洗
浄した（×３）。次いで、ビーズを等容量の２×電気泳動サンプル緩衝液（１０
０ｍＭ ＤＴＴの最終濃度）中でインキュベートし、そして９５℃で１０分間加
熱して、ビーズから結合されたＶＥＧＦを溶出した。次いで、サンプルを０．１
％ ＳＤＳ−１５％ ＰＡＧＥを使用して分離し、そして分画されたタンパク質を
、セミドライ電気泳動トランスファーによってニトロセルロースメンブレンに移
した。次いで、フィルターを、抗ＶＥＧＦ抗体を使用して免疫染色し、そしてＶ
ＥＧＦバンドを、増強された蛍光検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｖｉｓｔｒａ試
薬）およびＦｌｕｏｒｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙ
ｎａｍｉｃｓ）を使用して検出した。次いで、ニトロセルロースブロットを、Ｐ
ｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ分析器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓ
ｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して分析して、^３２Ｐ標識化バンドの局在化を
決定した。

【００６９】 ｉｉ）ｒＶＥＧＦ_１６５を、上記の反応緩衝液中で、以下のようにコレラトキ
シンとともに２時間まで、３０℃にてインキュベートした：５００ｎｇ ｒＶＥ
ＧＦ、２５０μｇ コレラトトキシン（Ａ−サブユニット、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。反応を、等容量の冷却１０％ Ｔ
ＣＡの添加によって終結した。沈殿されたタンパク質を、水飽和されたクロロホ
ルムで洗浄し（×３）、そして上述のように、最終的に、等容量の２×ＰＡＧＥ
サンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、
そして上記のようにニトロセルロースメンブレンに移した。

【００７０】 ｉｉｉ）５００ｎｇ ｒＶＥＧＦ_１６５を、上記の反応混合液中、２５μｇの
百日咳トキシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−０３１７）とともに２時間まで
、３０℃にてインキュベートした。百日咳トキシンを、１０ｍＭ ＡＴＰおよび
２０ｍＭ ＤＴＴとの３０分間のインキュベーションによって、ＶＥＧＦ反応混
合物への添加の前に予め活性化した。反応を、上記のように終結し、そして分析
した。

【００７１】 ＶＥＧＦの脈管形成活性に対するＡＤＰ−リボシル化の効果 脈管形成因子としてＶＥＧＦのＡＤＰ−リボシル化がその生体活性を調節する
か否かを決定するために、ｒＶＥＧＦ_１６５を、コレラトキシン、またはマクロ
ファージ細胞質ゾル抽出物のいずれかであるが、未標識のＮＡＤ^＋の存在下で、
以前に記載されるように処理した。反応混合物からのｒＶＥＧＦの回収を容易に
するために、プロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズからのＶＥＧＦの回収に苛酷
な、変性条件を必要とする免疫沈降をＶＥＧＦの回収のために使用するのではな
く、へパリン−セファロース結合を使用してＶＥＧＦを回収した。標識化反応後
、１０μｌの洗浄されたヘパリン−セファロースビーズを添加し、そして混合物
を４℃で４時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。次いで、ビーズ
を０．４Ｍ ＮａＣｌを含有する１００μｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７
．８で洗浄した（×３）。ＶＥＧＦを、１．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌとのインキュベーションによってビーズから溶出した。ＶＥＧ
Ｆの回収を、特異的なＥＬＩＳＡによって決定した。コントロール反応を、細菌
トキシンおよびマクロファージ抽出物の不在下で行った。抗脈管形成活性がマク
ロファージ抽出物およびコレラトキシン調製物に存在しないことを確実にするた
めに、類似の標識化反応を、ＶＥＧＦの不在下で行い、そしてこれらの反応物か
らのヘパリン−セファロース溶出物を、抗脈管形成アッセイにおいて試験した。

【００７２】 図１は、ＭＰＭによる亜硝酸産生を説明する。細胞を、示されるように、乳酸
ナトリウム（２５ｍＭ）、Ｉｆｎγ（１００ｕ/ｍｌ）およびＬＰＳ（１００ｎ
ｇ／ｍｌ）、Ｌ−ＮＡＭＥ（１．５ｍＭ）、もしくはＡＧ（１ｍＭ）を伴ってま
たは伴わないで、ＤＭＥＭ／１％ ＦＣＳ中でインキュベートした。培地を、Ｉ
ｆｎγ／ＬＰＳでの攻撃の８、２４、および４８時間後に採集した。結果は、典
型的な実験における三連の決定の平均＋／−Ｓ．Ｄ．である。類似の結果が、少
なくとも３つの別個の実験において見出された。

【００７３】 図２は、Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞、およびＢ）ＭＰＭによるＶＥＧＦの産生
を説明する。細胞を、示されるように、乳酸ナトリウム（２５ｍＭ）、Ｉｆｎγ
（１００ｕ/ｍｌ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ−ＮＡＭＥ（１．５
ｍＭ）、もしくはＡＧ（１ｍＭ）を伴ってまたは伴わないで、ＤＭＥＭ／１％
ＦＣＳ中でインキュベートした。培地を、Ｉｆｎγ／ＬＰＳでの攻撃の１８およ
び４８時間後に採集した。結果は、典型的な実験における三連の決定の平均＋／
−Ｓ．Ｄ．である。類似の結果が、少なくとも３つの別個の実験において見出さ
れた。

【００７４】 図３は、プレート化の２４時間後のコントロール（刺激されない）ＭＰＭにお
けるＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの拮抗的なＲＴ−ＰＣＲ分析を説明する。方法に
おいて詳細に記載されるように、ＭＰＭから単離された種々の量の全ＲＮＡ（１
〜２００ｎｇ）を、ネイティブなＶＥＧＦ ｍＲＮＡと同じプライマーを使用し
て増幅するＶＥＧＦ ＲＮＡミニ遺伝子（２．５ｐｇ）の存在下で、逆転写し、
そして２５サイクルを介するＰＣＲによって増幅した。ＲＮＡ ミニ遺伝子は、
２９３ｂｐの増幅されたＰＣＲ産物を生じ、ネイティブなＶＥＧＦ ｍＲＮＡは
、３６２ｂｐフラグメントを生じる。ミニ遺伝子と同じ強度の増幅バンドを生じ
る全ＲＮＡの量が、これらの分析から決定される。

【００７５】 図４は、ＡＧ処理を伴うかまたは伴わないで、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭ
によって産生されるＶＥＧＦのイソ型のＲＴ−ＰＣＲの分析を説明する。方法に
おいて記載されるように、ＭＰＭから単離された全ＲＮＡを逆転写し、そしてＰ
ＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーは、エキソン３および８に位置され、６
５２、５８０、および４４８ｂｐに対応する３つのＰＣＲ産物の増幅を生じた。

【００７６】 図５は、ＭＰＭによるＴＮＦαの産生を説明する。細胞を、示されるように、
乳酸ナトリウム（２５ｍＭ）、Ｉｆｎγ（１００ｕ/ｍｌ）およびＬＰＳ（１０
０ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ−ＮＡＭＥ（１．５ｍＭ）、もしくはＡＧ（１ｍＭ）を伴っ
てまたは伴わないで、ＤＭＥＭ／１％ ＦＣＳ中でインキュベートした。培地を
、Ｉｆｎγ／ＬＰＳでの攻撃の８、２４および４８時間後に採集した。結果は、
典型的な実験における三連の決定の平均＋／−Ｓ．Ｄ．である。類似の結果が、
少なくとも３つの別個の実験において見出された。

【００７７】 図６は、細菌トキシンによるおよびマクロファージ細胞質ゾル抽出物による、
ｒＶＥＧＦ_１６５のＡＤＰ−リボシル化を説明する。Ａ．ｒＶＥＧＦ（５００ｎ
ｇ）を、３２Ｐ−ＮＡＤ^＋の存在下、マクロファージ細胞質ゾル抽出物（方法を
参照のこと）とともにインキュベートした。全ての標識化反応を、０．１％ Ｓ
ＤＳ−１５％ ＰＡＧＥゲルにおいて分析した。Ｂ．ｒＶＥＧＦ_１６５マクロフ
ァージ細胞質ゾル抽出物標識化混合物を、抗ＶＥＧＦ抗体で免疫沈降し、そして
免疫沈降されたＶＥＧＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ｒＶＥＧＦ_{１６ ５} と同じ位置に移動する優勢な^３２Ｐ標識されたバンド（同じブロットのウェス
タン分析によって決定される）が示される。Ｃ．ｒＶＥＧＦ_１６５を、方法にお
いて記載されるように、コレラトキシンサブユニットＡおよび^３２Ｐ−ＮＡＤ^＋ とともにインキュベートした。Ｄ．コレラトキシンを、ｒＶＥＧＦ_１６５の不在
下、^３２Ｐ−ＮＡＤ^＋とともにインキュベートした。Ｅ．ｒＶＥＧＦ_１６５を、
方法において記載されるように、百日咳トキシンおよび^３２Ｐ−ＮＡＤ^＋ととも
にインキュベートした。

【００７８】

【表１】 ^＊ 各群についてのＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルが、同じＲＮＡサンプルにおけ
るＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡと比較される。

【００７９】

【表２】 ^１ マクロファージを、示された条件下で４８時間インキュベートし、濃縮し（
×２０）、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３（３０００分子量カットオフ）フィルタ
ー（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して透析した。次いで、サンプルを等容量のＨｙｄｒ
ｏｎ（Ｉｎｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）（９５%エタノール中の１
２％ ｗ/ｖ）と合わせた。次いで、１０μｌの小滴を、２ｍｍの直径のＲｅｆｌ
ｏｎ棒の切断先端上で乾燥させ、ラットの角膜中に無菌的に移植した。^２ 脈管形成応答を、移植の７日後に評価した。脈管形成価は、各試験サンプル
について４つの個々の角膜からの等級付けされた脈管形成応答の和を示す。最大
の応答は１２のスコアであり；最小の応答は０のスコアである（方法を参照のこ
と）。

【００８０】

【表３】 ^＃ ｒＶＥＧＦ_１６５を、方法の節において記載されるように、コレラトキシン
またはマクロファージ細胞質ゾル抽出物のいずれかとともに、反応混合物中で処
理した。コレラトキシンまたはマクロファージ細胞質ゾル抽出物の不在下で処理
したＶＥＧＦのコントロールを予め形成して、ＶＥＧＦに対する緩衝液の効果を
決定した。ＶＥＧＦを伴わないでインキュベートしたコレラトキシンおよびマク
ロファージ細胞質ゾル抽出物のコントロールをまた予め形成して、外因性脈管形
成因子または抗脈管形成因子がコレラの試薬に存在するか否かを決定した。全て
の反応を方法において記載されるようにヘパリン−セファロースで処理して、反
応混合物からＶＥＧＦを回収した。

【００８１】 本出願を通じて、種々の刊行物が参照された。これらの刊行物における開示は
、技術水準をより十分に記載するために、本明細書中に参考として援用される。

【００８２】 参考文献 １．Ｐｏｌｖｅｒｎｉ ＰＪ、Ｃｏｔｒａｎ ＲＳ、Ｇｉｍｂｒｏｎｅ ＭＡ Ｊ
ｒ．、Ｕｎａｎｕｅ、ＥＲ：活性化されたマクロファージは、脈管増殖を誘導す
る。Ｎａｔｕｒｅ １９７７。２６９：８０４−８０６ ２．Ｋｏｃｈ、ＡＥ；Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ：
活性化されたヒト単球による新生脈管形成の誘導。Ｊ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉ
ｏｌ １９８５、３７：２７９−２８８ ３．Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ：マクロファージ誘導清の新脈管形成：概説。
Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ。１９８９、１：５４−７３ ４．Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ：マクロファージ細
胞株による新生脈管形成および非リンパ様間葉細胞の誘導。Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓ
ｔ １９８５、５１：６３５−６４２ ５．Ｓｕｎｄｅｒｋｏｔｔｅｒ Ｃ、Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ Ｋ、Ｇｏｅｂｅｌ
ｅｒ Ｍ、Ｂｈａｒｄｗａｊ Ｒ、Ｓｏｒｇ Ｃ：マクロファージおよび新脈管形
成。Ｊ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ １９９４、５５：４１０−４２２ ６．ＤｉＰｉｅｔｒｏ ＬＡ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ：脈管形成マクロファ
ージは、脈管形成インヒビターのトロンボスポンジン−１を産生する。Ａｍ Ｊ
Ｐａｔｈｏｌ １９９３、１４３：６７８−６８４ ７．Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ：新脈管形成の病態生理学。Ｃｒｉｔ Ｒｅｖｓ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９５、６：２３０−２４７ ８．Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ：ガン、脈管、関節炎、および他の疾患における新脈
管形成。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９５、１：２７−３１ ９．Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ、Ｓｈｅｐａｒｄ
ＨＭ、Ｗｉｓｅｍａｎ ＤＭ、Ｓｈｉｖｅｌｙ Ｖ、Ｎｕｓｅｉｒ Ｎ．：ヒト単
球による脈管形成活性の産生は、アルギニン／一酸化窒素合成酵素依存性のエフ
ェクター機構を必要とする。Ｎａｔｕｒｅ １９８７、３２９：６３０−６３２ １０．Ｋｏｃｈ Ａ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ、Ｋｕｎｋｅｌ ＳＬ、Ｈａｒ
ｌｏｗ ＬＡ、Ｄｉｐｉｅｔｒｏ ＬＡ、Ｅｌｎｅｒ ＶＭ、Ｅｌｎｅｒ ＳＧ、Ｓ
ｔｒｉｅｔｅｒ ＲＭ：新脈管形成のマクロファージ由来の媒介因子としてのイ
ンターロイキン−８。Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２、２５８：１７９８−１８０１ １１．Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｍ、Ｒｉｓａｕ Ｗ、Ｈａｌｌｍａｎ
ｎ Ｐ、Ｇａｕｔｓｃｈｉ Ｒ、Ｂｏｈｌｅｎ Ｐ：腫瘍壊死因子α型、インビト
ロでの内皮細胞増殖の強力なインヒビターは、インビボで脈管形成性である。Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８７、８４：５２７７−５２８
１ １２．Ｄｉｐｉｅｔｒｏ ＬＡ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ：脈管形成性マクロ
ファージは、脈管形成インヒビタートロンボスポンジン−１を産生する。Ａｍ
Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９３、１４３：６７８−６８４ １３．Ｘｉｏｎｇ Ｍ、Ｌａｎａｈａｎ Ｍ、Ｅｌｓｏｎ Ｅ、Ｌｅｉｂｏｖｉ
ｃｈ ＳＪ。マウス腹膜マクロファージにおけるＰ５３タンパク質レベルは、誘
導性一酸化酸素合成酵素（ｉＮＯＳ）経路によって調製される。Ｍｏｌ Ｂｉｏ
ｌ Ｃｅｌｌ １９９６、７（増刊）：２３ａ １４．Ｂｅｓｎｅｒ ＥＢ、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ Ｍ：マクロファージは、内皮
細胞増殖のヘパリン結合インヒビターを分泌する Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ
１９９１、４２：１８７−１９７ １５．Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ １９８９、１：５４−
７３ １６．Ｓｕｎｄｅｒｋｏｔｔｅｒ Ｃ、Ｇｏｅｂｅｌｅｒ Ｍ Ｓｃｈｕｌｚｅ
−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ、Ｂｈａｒｄｗａｊ Ｒ、Ｓｏｒｇ Ｃ：マクロファージ由
来の新脈管形成因子 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ １９９１、５１
：１９５−２１６ １７．Ｎａｔｈａｎ ＣＦ：酸素媒介因子の分泌：活性化マクロファージのエ
フェクター機能における役割、Ｆｅｄ Ｐｒｏｃ １９８２、４１：２２０６−２
２１１ １８．Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｍ、Ｙｏｓｈｉｒｏ Ｓ、Ｉｓｈｉｗａｔａ Ｔ、
Ａｓａｎｏ Ｇ：慢性リウマチ関節炎の新脈管形成における脈管内皮増殖因子の
役割。Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９８５、２２：１６２４−１６３０ １９．Ｈｉｂｂｓ ＪＢ Ｊｒ、Ｖａｖｒｉｎ Ｚ、Ｔａｉｎｔｏｒ ＲＲ：Ｌ−
アルギニンは、標的細胞において選択的な代謝阻害を引き起こす活性化されたマ
クロファージエフェクター機構の発現のために必要とされる。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ １９８７、１３８：５５０−５６５ ２０．Ｋｏｃｈ ＡＥ、Ｃｈｏ Ｍ、Ｂｕｒｒｏｗｓ ＪＳ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎ
ｉ ＰＪ、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ：酸素フリーラジカルスカベンジャーによる
単球／マクロファージ由来の脈管形成活性の産生の阻害。Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉ
ｎｔ Ｒｅｐｓ １９９２、１６：４１５−４１１ ２１．Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ、Ｆｏｎｇ ＴＷ
、Ｈａｒｌｏｗ ＬＡ、Ｋｏｃｈ ＡＥ：ヒト単球による脈管形成活性の生成は、
Ｌ−アルギニン／一酸化窒素合成酵素依存性のエフェクター機構を必要とする。
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ １９９４、９１：４１９０−４１９４ ２２．Ｋｎｉｇｈｔｏｎ ＤＲ、Ｈｕｎｔ ＴＫ、Ｓｃｈｅｕｅｎｓｔａｈｌ
Ｈ、Ｈａｌｌｉｄａｙ ＢＪ、Ｗｅｒｂ Ｚ、Ｂａｎｄａ ＭＪ：酸素圧は、マク
ロファージによる脈管形成因子の発現を調節する。Ｓｃｉｒｎｃｅ １９８４、
２２１：１２８３−１２８５ ２３．Ｌｅｕｎｇ ＤＷ、Ｃａｃｈｉａｎｅｓ Ｇ、Ｋｕａｎｇ ＷＪ、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ ＤＶ、Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ：脈管内皮増殖因子は分泌された脈管形成マ
イトジェンである。Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９、２４４：１３０６−１３０９ ２４．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ＤＴ、Ｏｌａｎｄｅｒ ＪＶ、Ｈｅｕｖｅｌｍａｎ
Ｄ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｒ、Ｍｏｎｓｅｌｌ Ｒ、Ｓｉｅｇｅｌ Ｎ、Ｈａｙｍｏｒｅ
ＢＬ、Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ Ｒ、Ｆｅｄｅｒ Ｊ：ヒト脈管透過性因子。Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９、２６４：２００１７−２００２４ ２５．Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ Ｄ、Ａｂｒａｈａｍ ＪＡ、Ｓｃｈｉｌｌ
ｉｎｇ Ｊ：下垂体由来の小胞星状細胞によって産生される脈管内皮細胞マイト
ジェンの単離および特徴づけ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９
８９、８６：７３１１−７３１５ ２６．Ｂｅｒｓｅ Ｂ、Ｂｒｏｗｎ ＬＦ、Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒ Ｌ、Ｄｖ
ｏｒａｋ ＨＦ、Ｓｅｎｇｅｒ ＤＲ：脈管透過性因子（脈管内皮増殖因子）遺伝
子は、正常な組織、マクロファージ、および腫瘍において異なって発現される。
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １９９２、３：２１１−２２０ ２７．Ｓｈａｒｋｅｙ ＡＭ、Ｃｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓ ＤＳ、Ｂｏｏｃ
ｏｃｋ ＣＡ、Ｂｒｏｗｎ、ＫＤ、Ｓｍｉｔｈ ＳＫ：ヒト胎盤における脈管内皮
増殖因子についてのｍｒｎａの発現。Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ １９９３
、９９：６０９−６１５ ２８．Ｆａｖａ ＲＡ、Ｏｌｓｅｎ ＮＪ、Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｇｒｅｅｎ Ｇ、
Ｙｅｏ ＴＫ、Ｂｅｒｓｅ Ｂ、Ｊａｃｋｍａｎ ＲＷ、Ｓｅｎｇｅｒ ＤＫ、Ｄｖ
ｏｒａｋ ＨＦ、Ｂｒｏｗｎ ＬＦ：脈管透過性因子／内皮増殖因子（ＶＰＦ/Ｖ
ＥＧＦ）：ヒト髄液およびリウマチ髄組織における蓄積および発現。Ｊ Ｅｘｐ
Ｍｅｄ． １９９４、１８０：３４１−３４６ ２９．Ｔｏｒｒｙ ＲＪ、Ｌａｂａｒｒｅｒｅ ＣＡ、Ｔｏｒｒｙ ＤＳ、Ｈｏ
ｌｔ ＶＪ、Ｆａｕｌｋ ＷＰ：移植されたヒト心臓における脈管内皮増殖因子の
発現。Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９５，６０：１４５１−１４５７ ３０．ＭｃＬａｒｅｎ Ｊ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ａ、Ｃｈａｒｎｏｃｋ-Ｊｏｎ
ｅｓ ＤＳ、Ｍｉｌｌｉｃａｎ ＳＡ、Ｍｕｌｌｅｒ ＫＨ、Ｓｈａｒｋｅｙ ＡＭ
、Ｓｍｉｔｈ ＳＫ：脈管内皮増殖因子は、子宮内膜症において腹膜液マクロフ
ァージによって産生され、および卵巣ステロイドによって調節される。Ｊ Ｃｌ
ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６、９８：４８２−４８９ ３１．Ｓｈｉｍａ ＤＴ、Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｕ、Ｎｇ ＹＳ、
Ａｄａｍｉｓ ＡＰ、Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ：脈管内皮増殖因子のマウス遺伝子。
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６、２７１：３８７７−３８８７ ３２．Ｚａｂｅｌ、ＤＯ、Ｆｅｎｇ ＪＪ、Ｓｃｈｅｕｅｎｓｔａｈｌ Ｈ、Ｈ
ｕｎｔ ＴＫ、Ｈｕｓｓａｉｎ ＭＺ、マクロファージ由来の脈管形成活性の乳酸
刺激は、ポリ(ＡＤＰ−リボース)合成の阻害と関連する。Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ
１９９６、７４：６４４−６４９ ３３．Ａｋｔｏｒｉｅｓ Ｋ、Ｊｕｓｔ Ｉ：細菌ＡＤＰ−リボシルトランスフ
ェラーゼによるＲｈｏのインビトロＡＤＰ−リボシル化。Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ。１９９５、２５６：１８４−１９５ ３４．Ｏｋａｚａｋｉ ＩＪ、Ｍｏｓｓ Ｊ：モノ−ＡＤＰ−リボシル化：タン
パク質の可逆的な翻訳後修飾。Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９６、３５：２
４７−２８０ ３５．Ｍｏｓｓ Ｊ、Ｖａｕｇｈａｍ Ｍ：コラーゲンの作用の機構。アクセプ
ターとしてアルギニンを伴う、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性につい
ての証拠。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７、２５２：２４５５−２４５７ ３６．Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ、Ｘｉｏｎｇ Ｍ、Ｅｌｓｏｎ Ｅ、Ｓｈａｒ
ａ Ｓ、Ｓｅｏ Ｃ、Ｌａｎａｈａｎ Ｍ：創傷治癒における新脈管形成の制御に
おけるマクロファージの役割：一酸化窒素（ＮＯ）、新脈管形成インヒビターお
よび腫瘍抑制遺伝子。骨形成および修復。Ｒａｂｉｅ ＡＭ編、Ｕｒｉｓｔ ＭＲ
１９９７、１０１−１１１ ３７．Ｂｅｕｔｌｅｒ Ｂ、Ｃｅｒａｍｉ Ａ：同じ生物学的通貨の２つの側と
してのカケクチンおよび腫瘍壊死因子。Ｎａｔｕｒｅ １９８６、３２０：５８
４−５８８ ３８．Ｂｕｒｃｈｅｔｔ ＳＫ、Ｗｅａｖｅｒ ＷＭ、Ｗｅｓｔａｌｌ ＪＡ、
Ｌａｒｓｅｎ Ａ、Ｋｒｏｎｈｅｉｍ Ｓ、Ｗｉｌｓｏｎ ＣＢ：ヒト単核食細胞
における腫瘍壊死因子／カケクチンおよびＩｌ−１分泌の調節。Ｊ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ １９８８、１４０：３４７３−３４８１ ３９．Ｍｕｋａｉｄａ Ｎ、Ｈａｒａｄａ Ａ、Ｙａｓｕｍｏｔｏ Ｋ、Ｍａｔ
ｓｕｓｈｉｍａ Ｋ：炎症後細胞特異的白血球化学走性サイトカイン、インター
ロイキン−８（ＩＬ−８）ならびに単球化学走性および活性化因子（ＭＣＡＦ）
の特性。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２、３６：７７３−７８９ ４０．Ｓｈｗｅｉｋｉ Ｄ、Ｉｔｉｎ Ａ、Ｓｏｆｆｅｒ Ｄ、Ｋｅｓｈｅｔ Ｅ
：マウスにおける脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＶＥＧＦレセプターの発
現のパターンは、ホルモンによって調節される新脈管形成における役割を示唆す
る。Ｎａｔｕｒｅ １９９２、３５９：８４３−８４５ ４１．Ｌａｄｏｕｘ Ａ、Ｆｒｅｌｉｎ Ｃ：低酸素は、心臓における脈管内皮
増殖因子メッセンジャーＲＮＡ発現の強力なインヒビターである。Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｓ １９９３、１９５：１００５−１０１０ ４２．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＭＡ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＴＪ：脈管内皮増殖因子
およびエリトロポイエチンの発現を調節する酸素感知機構間の類似性。Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４、２６９：４３５５−４３５９ ４３．Ｓｈｉｍａ ＤＴ、Ａｄａｍｉｓ ＡＰ、Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ、Ｙｅｏ Ｋ
Ｔ、Ａｌｌｅｎｄｅ Ｒ、Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ、Ｄ’Ａｍｏｒｅ Ｐ：網膜細胞に
おける内皮細胞増殖因子の低酸素誘導：マイトジェンとしての脈管内皮増殖因子
（ＶＥＧＦ）の同定および特徴づけ。Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９５、１：１８２−１
９３ ４４．Ｌｅｖｙ ＡＰ、Ｌｅｖｙ ＮＳ、Ｗｅｇｎｅｒ Ｓ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ
ＭＡ：低酸素によるラット脈管内皮増殖因子遺伝子の転写調節。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ １９９５、２７０：１３３３３−１３３４０ ４５．Ｂｒｕｎｅ Ｂ、Ｌａｐｅｔｉｎｅ ＥＧ：一酸化窒素生成剤による細胞
質ゾルＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼの活性化。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
１９８９、２６４：８４５５−８４５８ ４６．Ｍｏｌｉｎａ−Ｖｅｄｉａ Ｌ、ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｂ、Ｒｅｅｐ Ｂ、
Ｂｒｕｎｅ Ｂ、Ｄｉｓｉｌｖｉｏ Ｍ、Ｂｉｌｌｉａｒ ＴＲ、Ｌａｐｅｔｉｎ
ａ ＥＧ グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいっ産か窒素誘
導性のＳ−ニトロシル化は、酵素活性を阻害し、そして内因性ＡＤＰ−リボシル
化を増加する。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２、２６７：２４９２９−２４９
３２ ４７．Ｆｅｎｇ ＪＪ、Ｈｕｎｔ ＴＫ、Ｇｈａｎｉ Ｐ、Ｈｕｓｓａｉｎ ＭＺ
：マクロファージ由来の脈管形成活性能は、ＡＤＰ−リボシル化によって可逆的
に阻害され得る。Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １９９
７、５：Ａ１１１ ４８．Ｗｅｓｔ ＲＥ、Ｍｏｓｓ Ｊ、Ｖａｕｇｈａｎ Ｍ、Ｌｉｕ Ｔ−Ｙ：ト
ランスデューシンの百日咳トキシン触媒性のＡＤＰ−リボシル化。システイン３
４７はＡＤＰ−リボースアクセプター部位である。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９
８５、２６０：１４４２８−１４４３０ ４９．Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ、Ｇｏｌｃｚｅｗｓｋｉ Ｊ：誘導性一酸化酸
素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現は、マウスマクロファージおよびＩＣ−２１細胞
による脈管形成活性の生成のために必要とされる。Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ（
増刊）：３７３ａ ５０．Ｕｐｐｅｒｍａｎ ＪＳ、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ、Ｘｉｏｎｇ Ｍ、
Ｇｏｌｃｚｅｗｓｋｉ Ｊ、Ｄｅｉｔｃｈ ＥＡ ジフェニレンヨードニウム（Ｄ
ＰＩ）、ヌクレオチドを必要とするフラボタンパク質のインヒビターは、マクロ
ファージに由来する脈管形成活性の生成を阻害する。Ｓｕｒｇ Ｆｏｒｕｍ １９
９６、４７：７０８−７１０ ５１．Ｇｏｏｄ ＤＪ、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ、Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ Ｆ
、ＬｅＢｅａｕ ＭＮ、Ｌｅｍｏｎｓ ＲＳ、Ｆｒａｚｉｅｒ ＷＡ、Ｂｏｕｃｋ
ＮＰ：新脈管形成の腫瘍抑制因子依存性のインヒビターはトロンボスポンジンの
フラグメントと、免疫学的に区別できない。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ １９９０、８７：６６２４−６６２８ ５２．Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏ ＡＬ、Ｓｇａｄａｒｉ Ｃ、Ｔａｕｂ ＤＤ、Ｌ
ｉａｏ Ｆ、Ｆａｒｂｅｒ ＪＭ、Ｍａｈｅｓｈａｗａｒｉ Ｓ、Ｋｌｅｉｎｍａ
ｎ ＨＫ、ｒｅａｍａｎ ＧＨ、Ｔｏｓａｔｏ Ｇ：ヒトインターフェロン誘導性
のタンパク質１０は、インビボで新脈管形成の強力なインヒビターである。Ｊ
Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９５、１８２：１５５−１５９ ５３．Ｂａｎａｓｉｋ Ｍ、Ｕｅｄａ Ｋ：ＡＤＰ−リボシル化反応のインヒビ
ターおよびアクチベーター。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９４、１３
８：１８５−１９７

【００８３】 本開示を通じて、出願人は、治療学的な創傷治癒組成物における成分が脈管内
皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するために機能すると考える
、種々の理論または機構を示唆する。出願人は、本発明を説明するための種々の
機構を提案し得るが、出願人は理論によって束縛されることを望まない。これら
の理論は、本発明をより良好に理解するために示唆されるが、本発明の有効な範
囲を制限することは意図されない。

【００８４】 本発明は、特異的な実施態様に関して詳細に記載されたが、当業者は、本発明
に対する多数の変化および改変が今や可能であり、この変化および改変は、本発
明の精神および範囲から逸脱するとみなされないことを、本開示を考慮して理解
する。従って、本発明は、広範囲に解釈されるべきであり、そして以下の請求の
範囲の範囲および精神によってのみ制限されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＭＰＭによる亜硝酸産生を説明する図である。

【図２】 Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞、およびＢ）ＭＰＭによるＶＥＧＦの産生を説明す
る図である。

【図３】 プレーティングの２４時間後のコントロール（刺激されない）ＭＰＭにおける
ＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの拮抗的なＲＴ−ＰＣＲ分析を説明する図である。

【図４】 ＡＧ処理を伴うかまたは伴わない、Ｉｆｎγ／ＬＰＳ活性化ＭＰＭによって産
生されるＶＥＧＦイソ型のＲＴ−ＰＣＲ分析を説明する図である。

【図５】 ＭＰＭによるＴＮＦα産生を説明する図である。

【図６】 細菌トキシンによるおよびマクロファージ細胞質ゾル抽出物による、ｒＶＥＧ
Ｆ_１６５のＡＤＰ−リボシル化を説明する図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 AA20 MA01 MA02 MA63 NA14 ZA891 ZB112 ZC202 ZC292 4C206 AA01 AA02 CB28 MA01 MA02 MA04 MA05 MA83 NA14 ZA89 ZB11 ZC20 ZC29

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物において創傷を治癒するための方法であって、以下
   の工程： （Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
   モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
   インヒビターを含有する治療学的な創傷治癒組成物を提供する工程；および （Ｂ）治療学的な創傷治癒組成物と、哺乳動物における創傷とを接触する工程
   を包含する方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで哺乳動物がヒトであ
   る方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここでモノアデノシン二リ
   ン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１、ビタミン
   Ｋ２、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４、ビタミンＫ５、ビタミンＫ６、ノボビオシ
   ン、ｍ−ヨードベンジルグアニジン、ニコチンアミド、クメルマイシン、ジクマ
   ロール、およびシリビンからなる群より選択される方法。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、ここでモノアデノシン二リ
   ン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１、ビタミン
   Ｋ３、ノボビオシン、およびシリビンからなる群より選択される方法。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここでモノアデノシン二リ
   ン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、治療学的な創傷治癒組成
   物の約０．１重量％〜約１０重量％の量において治療学的な創傷治癒組成物に存
   在する方法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで創傷が、圧力性潰瘍
   、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および熱傷損傷からなる群より選択される方法。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、ここで治療学的創傷治癒組
   成物が、薬学的に受容されるキャリアをさらに含有する方法。
8. 【請求項８】 創傷治癒組成物であって： （Ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
   モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
   インヒビター、および （Ｂ）薬学的に受容されるキャリア、を含有する創傷治癒組成物。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の創傷治癒組成物であって、ここでモノアデ
   ノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１
   、ビタミンＫ２、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４、ビタミンＫ５、ビタミンＫ６、
   ノボビオシン、ｍ−ヨードベンジルグアニジン、ニコチンアミド、クメルマイシ
   ン、ジクマロール、およびシリビンからなる群より選択される創傷治癒組成物。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の創傷治癒組成物であって、ここでモノア
    デノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ
    １、ビタミンＫ３、ノボビオシン、およびシリビンからなる群より選択される創
    傷治癒組成物。
11. 【請求項１１】 請求項８に記載の創傷治癒組成物であって、ここでモノア
    デノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、治療学的な
    創傷治癒組成物の約０．１重量％〜約１０重量％の量において治療学的な創傷治
    癒組成物に存在する創傷治癒組成物。
12. 【請求項１２】 ヒトにおいておむつ皮膚炎を処置するための方法であって
    、以下の工程： （Ａ）治療学的なおむつ皮膚炎創傷治癒組成物を提供する工程であって、当該
    組成物は： （ａ）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
    モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼの治療学的に有効な量の
    インヒビター、 （ｂ）約５〜約８の範囲において皮膚炎のｐＨを維持するための緩衝化剤；お
    よび （ｃ）抗炎症剤を含有する、工程；ならびに （Ｂ）治療学的なおむつ皮膚炎創傷治癒組成物と、ヒトにおけるおむつ皮膚炎
    とを接触する工程、を包含する方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、ここでモノアデノシン
    二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１、ビタ
    ミンＫ２、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４、ビタミンＫ５、ビタミンＫ６、ノボビ
    オシン、ｍ−ヨードベンジルグアニジン、ニコチンアミド、クメルマイシン、ジ
    クマロール、およびシリビンからなる群より選択される方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、ここでモノアデノシン
    二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１、ビタ
    ミンＫ３、ノボビオシン、およびシリビンからなる群より選択される方法。
15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の方法であって、ここでモノアデノシン
    二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、治療学的な創傷治癒
    組成物の約０．１重量％〜約１０重量％の量において治療学的な創傷治癒組成物
    に存在する方法。
16. 【請求項１６】 請求項１２に記載の方法であって、ここで緩衝化剤が、ク
    エン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム、および酢酸−酢酸ナ
    トリウムからなる群より選択される方法。
17. 【請求項１７】 請求項１２に記載の方法であって、ここで抗炎症剤が、イ
    ブプロフェン、ナプロキセン、サリンダク、ジフルニサル、ピロキシカム、イン
    ドメタシン、エトドラク、メクロフェナム酸ナトリウム、フェノプロベンカルシ
    ウム、ケトプロフェン、メフェナム酸、ナブメトン、ケトロラクトロメタミン、
    ジクロフェナク、マツヨイグサ油、アセチルサリチル酸、メサラミン、サルサレ
    ート、ジフルニサル、サリチルサリチル酸、およびコリンマグネシウムトリサリ
    チル酸、フルニソリド、トリアムシノリン、トリアムシノリンアセトニド、ジプ
    ロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸βメタゾン、ヒドロコルチゾン、コ
    ルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾ
    ロンからなる群より選択される方法。
18. 【請求項１８】 請求項１２に記載の方法であって、ここで治療学的な創傷
    治癒組成物がさらに、薬学的に受容されるキャリアを含有する方法。
19. 【請求項１９】 おむつ皮膚炎を最小にするためにおよび処置するために有
    用な治療学的な皮膚科学的創傷治癒組成物であって、該組成物は、治療学的に有
    効な量の： （１）脈管内皮増殖因子のアデノシン二リン酸リボシル化を阻害するための、
    モノアデノシン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターを含有す
    る治療学的な創傷治癒組成物、 （２）約５〜約８の範囲において皮膚炎のｐＨを維持するための緩衝化剤；お
    よび （３）抗炎症剤を含有する組成物。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の組成物であって、ここでモノアデノシ
    ン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１、ビ
    タミンＫ２、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４、ビタミンＫ５、ビタミンＫ６、ノボ
    ビオシン、ｍ−ヨードベンジルグアニジン、ニコチンアミド、クメルマイシン、
    ジクマロール、およびシリビンからなる群より選択される組成物。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の組成物であって、ここでモノアデノシ
    ン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、ビタミンＫ１、ビ
    タミンＫ３、ノボビオシン、およびシリビンからなる群より選択される組成物。
22. 【請求項２２】 請求項１９に記載の組成物であって、ここでモノアデノシ
    ン二リン酸−リボシルトランスフェラーゼのインヒビターが、治療学的な創傷治
    癒組成物の約０．１重量％〜約１０重量％の量において治療学的な創傷治癒組成
    物に存在する組成物。
23. 【請求項２３】 請求項１９に記載の組成物であって、ここで緩衝化剤が、
    クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム、および酢酸−酢酸
    ナトリウムからなる群より選択される組成物。
24. 【請求項２４】 請求項１９に記載の組成物であって、ここで抗炎症剤が、
    イブプロフェン、ナプロキセン、サリンダク、ジフルニサル、ピロキシカム、イ
    ンドメタシン、エトドラク、メクロフェナム酸ナトリウム、フェノプロベンカル
    シウム、ケトプロフェン、メフェナム酸、ナブメトン、ケトロラクトロメタミン
    、ジクロフェナク、マツヨイグサ油、アセチルサリチル酸、メサラミン、サルサ
    レート、ジフルニサル、サリチルサリチル酸、およびコリンマグネシウムトリサ
    リチル酸、フルニソリド、トリアムシノリン、トリアムシノリンアセトニド、ジ
    プロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸βメタゾン、ヒドロコルチゾン、
    コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニ
    ゾロンからなる群より選択される組成物。
25. 【請求項２５】 請求項１９に記載の組成物であって、ここで治療学的な創
    傷治癒組成物が、薬学的に受容されるキャリアをさらに含有する組成物。