JP2011021015A - ヘリコバクター属(Helicobacter)により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸菌の選択および使用 - Google Patents
ヘリコバクター属(Helicobacter)により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸菌の選択および使用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリによる胃腸の炎症を低下させる能力について、選択された乳酸桿菌属の株、およびヒトへの投与のため、若しくは関連する炎症の処置、予防のための剤を包含する。これらの株由来の生成物、ならびに、選択された株を増殖させた馴化培地および該馴化培地のタンパク質を含有する抽出物を包含する。
【選択図】なし
Description
れており、また、良好な乳酸産生ならびに抗真菌活性が報告されている。本明細書で使用されるコリニフォルミス菌(L.coryniformis)MM7単離物(ATCC PTA−4660)はヒト母乳中で見出された。
本発明は、本明細書に、ヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択されたある種の乳酸杆菌属(Lactobacillus)株、およびヒトへの投与のためのヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤を包含する前記株由来の生成物を含んでなり、かつ、前記株が増殖された馴化(またはならし)培地および該馴化培地のタンパク質を含有する抽出物を包含する。
PTA−4660およびロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)MM2−3、ATCC PTA−4659を包含する。これらの株由来の全細胞若しくは成分を含有する食物、栄養添加物および製剤、医薬若しくは医療用具のような製品を、当該技術分野で既知であるように処方することができ、かつ、一般に、既知のところの摂取可能な支持体および乳酸杆菌属(Lactobacillus)の株若しくはそれ由来の成分を包含する。L.ラムノスス(L.rhamnosus)GG ATCC 53103、ロイテリ菌(L.reuteri)ATCC 55730および他者のような良好なTNFαを低下させる能力を有することが今や同定された以前に既知の株もまた上の製剤中で使用し得る。これらの生成物は、哺乳動物への投与のためのヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤である。
乳酸杆菌属(Lactobacillus)の種(例えばL.ラムノスス(L.rhamnosus)GG ATCC 53103、L.ジョンソニイ(L.johnsonii)ATCC 33200、ロイテリ菌(L.reuteri)MM2−3 ATCC PTA−4659、コリニフォルミス菌(L.coryniformis)、MM7、ATCC PTA−4660を包含する)、および大腸菌(E.coli)Nissleをそれぞれde Man、Rogosa、Sharpe(MRS)およびLuria−Bertani(LB)培地(Difco、メリーランド州スパークス)中で増殖させた。乳酸杆菌の一夜培養物を1.0のOD600(およそ109細胞/mlを表す)まで希釈し、そしてさらに10倍希釈しかつ追加の4、8および24時間増殖させた。ヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)(Sydney株SS1)およびヘリコバクター ヘパティクス(Helicobacter hepaticus)3B1(ATCC 51449)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したBrucella培地(Difco)中で48時間培養した。培養物を10倍希釈しかつ別の24および48時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を4℃、8500rpmで10分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そしてその後0.22μm孔のフィルター装置(Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード)を通して濾過した。
LPSを添加することにより作成した。マクロファージは、細胞を含まない乳酸杆菌属(Lactobacillus)の馴化培地と前若しくは共インキュベートのいずれかをした。組換えmIL−10(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)を陽性対照として使用した。細胞の生存率をトリパンブルー(Invitrogen)排除により評価した。細胞培養上清中のTNF−αの存在はサンドウィッチエンザイムイムノアッセイ、Quantikine M(R)マウスTNF−αイムノアッセイ(R & D Systems)で測定した。
株、主として試験したロイテリ菌(L.reuteri)である。
上の方法を使用して、1種の効果的にTNFαを低下させる株からの馴化培地(本実験ではロイテリ菌(L.reuteri)ATCC PTA−4659からの培地)を選択した。本培地を、de Man、Rogosa、Sharpe(MRS)(Difco、メリーランド州スパークス)中で該株を増殖させることにより、より大きなスケールで製造した。乳酸杆菌の一夜培養物を1.0のOD600(およそ109細胞/mlを表す)まで希釈し、そしてさらに10倍希釈しかつ追加の24時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を4℃、8500rpmで10分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そしてその後0.22μm孔のフィルター装置(Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード)を通して濾過した。その後、標準的方法を使用して馴化培地を凍結乾燥かつ処方して錠剤を作成した。本錠剤を、H.ピロリ(H.pylori)により引き起こされる潰瘍を治療するためにヒトにより薬物として使用した。
Lupskiらの米国特許第5,523,217号および同第5,691,136号明細書の方法を使用して、ロイテリ菌(L.reuteri)株のゲノムフィンガープリント法を行った。本方法は、細菌サンプルに一対の外側に向けられたプライマーを添加することによる細菌DNAの増幅を利用する。増幅後、生じるハイブリダイゼーションの伸長産物を大きさにより分離し、そして、大きさ分類した(sized)伸長生成物のパターンを測定することにより細菌の株を特徴付けする。Bacterial BarCodes,Inc.(テキサス州ヒューストン)により、Uprime Eプライマー(1プライマー)を使用してロイテリ菌(L.reuteri)の82種の株について二重のゲル画像を得た。二重のデータ組は比較可能であった。合計で、相互に異なった11クラスター、および独特であるようであった8種のアウトライヤー(outlier)が存在した。
ロイテリ菌(L.reuteri)株MM2−3の馴化培地を包含する多様な有効な乳
酸杆菌属(Lactobacillus)の馴化培地を多様な変性させる化合物で処理して、該細菌由来の推定のイムノモジュリン(immunomodulin)の性質を決定した。かように、馴化培地を反復性の凍結−融解、熱処理、DNAを消化する酵素、プロテアーゼおよび不活性化したプロテアーゼでの消化にかけた。推定のイムノモジュリンはこの方法で本来1種若しくはそれ以上のタンパク質若しくはペプチドであることが決定された。推定のタンパク質イムノモジュリンの大きさを決定するために、馴化培地を濾過により分画し、そして濾液を有効性について試験した。こうして、有効な乳酸杆菌属(Lactobacillus)株の馴化培地の有効成分は大きさがおよそ5kDa若しくはそれ未満であることが見出された。
Claims (18)
- 哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)感染に関連する胃腸の炎症を低下させる目的で哺乳動物に投与するための乳酸菌株の選択方法であって、
a.ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株を選択して培養する工程、
b.該菌株からの細胞を含まない培養上清を取得する工程、
c.該上清中でインキュベートされたレポーター細胞のTNFα産生能力について該上清の効果を評価する工程であって、対照試料と比較してレポーター細胞のTNFα産生の低下を乳酸菌株と同定する、上記の評価する工程、
d.該乳酸菌株を選択する工程
を含んでなる、上記の選択方法。 - 請求項1に記載の方法により選択されたロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株の生物学的に純粋な培養物に由来するヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に関連する炎症を低下させる成分であって、細胞を含まない上清から得られ、かつ、TNFαのレベルを低下する能力を有する、上記の成分。
- 請求項2に記載の成分であって、かつ、タンパク質またはタンパク質の部分である上記の成分。
- 請求項3に記載の成分であって、かつ、該タンパク質またはタンパク質の部分が5kDaより小さい、上記の成分。
- 摂取可能な支持体、ならびに、請求項1に記載の方法により選択されたロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株に由来するヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる食物組成物であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとTNFαのレベルを低下させる能力を有する、上記の食物組成物。
- 請求項5に記載の食物組成物であって、ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の食物組成物。
- 摂取可能な支持体、ならびに、請求項1に記載の方法により選択されたロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株に由来するヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる栄養補助食品であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとTNFαのレベルを低下させる能力を有する、上記の栄養補助食品。
- 請求項7に記載の栄養補助食品であって、ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の栄養補助食品。
- 製薬学的担体、ならびに、請求項1に記載の方法により選択されたロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株に由来するヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる栄養補助食品であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとTNFαのレベルを低下させる能力を有する、上記の製薬学的組成物
。 - 請求項9に記載の製薬学的組成物であって、ロイテリ菌(Lactobacillus
reuteri)株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の製薬学的組成物。 - 請求項1に記載の方法により選択された乳酸桿菌(Lactobacillus)株からの抗炎症成分を含んでなるヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に関連する炎症を治療または予防するための薬剤であって、該成分が該菌株の増殖後の細胞を含まない培養上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとTNFαのレベルを低下させる能力を有する、ことに特徴を有する上記の薬剤。
- 請求項1に記載の方法により選択された乳酸菌株の細胞を有効成分として含んでなるヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に関連する炎症を治療または予防するための製剤であって、該菌株が哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)感染に関連する胃腸の炎症を低下できることに特徴がある上記の製剤。
- 細胞が経口で投与されるものである、請求項12に記載の製剤。
- 細胞が直腸に投与されるものである、請求項12に記載の製剤。
- 請求項12に記載の製剤であって、該菌株が炎症性サイトカイン活性の低下に関連するタンパク質をならし培地で生産するものである、上記の製剤。
- タンパク質が5kDaより小さいことに特徴を有する請求項15に記載の製剤。
- a.ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株を選択して培養する工程、
b.該菌株からの細胞を含まない培養上清を取得する工程、
c.該上清中でインキュベートされたレポーター細胞のTNFα産生能力について該上清の効果を評価する工程であって、対照試料と比較してレポーター細胞のTNFα産生の低下を乳酸菌株と同定する、上記の評価する工程、
d.該乳酸菌株を選択する工程、および
e.工程d.で選択された乳酸菌株を含む組成物を製造する工程
を含んでなり、かつ、該組成物が哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)感染に関連する胃腸の炎症を低下させる目的で哺乳動物に投与されるためのものであることを特徴とする組成物の製造方法。 - 請求項17に記載の製造法で製造された乳酸菌株の細胞を含んでなる組成物。
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