ES2267151T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades neoplasicas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA METODOS PARA PRODUCIR ANGIOSTATINA IN VIVO, QUE CONSISTEN EN PONER EN CONTACTO PLASMINOGENO CON UN ACTIVADOR DE PLASMINOGENO Y UN DONADOR DE SULFHIDRILO, O PONER EN CONTACTO PLASMINA CON UN DONADOR DE SULFHIDRILO. LA INVENCION PROPORCIONA ASIMISMO UN METODO PARA TRATAR ENFERMEDADES ANGIOGENICAS, MEDIANTE LA ADMINISTRACION A UN ANIMAL QUE SUFRE DICHA ENFERMEDAD, DE UN DONADOR DE SULFHIDRILO Y, OPCIONALMENTE, DE UN ACTIVADOR DE PLASMINOGENO, PLASMINOGENO O PLASMINA. LA INVENCION COMPRENDE ADEMAS UNA COMPOSICION PARA PRODUCIR ANGIOSTATINA QUE COMPRENDE UN DONADOR DE SULFHIDRILO Y UN ACTIVADOR DE PLASMINOGENO. LA INVENCION COMPRENDE ASIMISMO UN RECIPIENTE QUE CONTIENE UN DONADOR DE SULFHIDRILO Y/O UN ACTIVADOR DE PLASMINOGENO, TENIENDO DICHO RECIPIENTE UNA ETIQUETA SOBRE EL MISMO QUE CONTIENE LAS INSTRUCCIONES REFERENTES A LA ADMINISTRACION DEL DONADOR DE SULFHIDRILO Y/O DEL ACTIVADOR DE PLASMINOGENO A UN ANIMAL QUE SUFRE DICHA ENFERMEDAD ANGIOGENICA. DICHA INVENCION PROPORCIONA ADEMAS FRAGMENTOS DE PLASMINOGENO CUYO AMINOACIDO N-TERMINAL ES EL MISMO QUE EL DE LA PLASMINA, Y CUYO AMINOACIDO C-TERMINAL ESTA SITUADO EN EL KRINGLE 5 Y QUE INHIBE LA ANGIOGENESIS; ANTICUERPOS QUE SE UNEN SELECTIVAMENTE A DICHOS FRAGMENTOS; METODOS Y EQUIPAMIENTOS PARA LA UTILIZACION DE DICHOS ANTICUERPOS; METODOS Y MATERIALES PARA FABRICAR DICHOS FRAGMENTOS MEDIANTE TECNICAS DE RECOMBINACION DE ADN; Y UN METODO DE TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD ANGIOGENICA QUE CONSISTE EN ADMINISTRAR UNA CANTIDAD EFECTIVA DE UNO DE LOS FRAGMENTOS. FINALMENTE, LA INVENCION PROPORCIONA UN METODO DE TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD ANGIOGENICA QUE CONSISTE EN ADMINISTRAR UN TRANSGEN QUE CODIFICA PARA UNO DE LOS FRAGMENTOS.

Description

Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con el uso de compuestos efectivos para incrementar la cantidad de angiostatina, un inhibidor de angiogénesis en el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

Antecedentes de la invención

La angiostatina, un fragmento proteolítico de plasminógeno que se cree que consiste de los kringles 1 a 3 y todo o parte del kringle 4, es un potente inhibidor de angiogénesis y del crecimiento de metástasis en células tumorales. O'Reilly y colaboradores, Cell, 79, 315-328 (1994); la solicitud PCT WO 95/29242. La angiostatina se encuentra in vivo en ratones que tienen tumores. O'Reilly y colaboradores, Cell, 79, 315-328 (1994). O'Reilly y colaboradores, Nature Med., 2, 689-692 (1996). El mecanismo enzimático por medio del cual se genera la angiostatina in vivo es aún desconocido.

La actividad de la angiostatina puede ser generada in vitro por medio de proteólisis limitada del plasminógeno con la elastasa. Sottrup-Jensen y colaboradores, en Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, 3, 191-209 (Davidson y colaboradores eds. 1978). Un resumen reciente propone que la angiostatina se genera por medio de macrófagos que infiltran los tumores primarios y liberan la actividad de la elastasa, que escinde luego al plasminógeno para formar una proteína que tiene actividad de angiostatina. Dong y colaboradores, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 37, 58 (1996). Sin embargo, mientras que una escisión limitada por medio de la elastasa del plasminógeno producirá un fragmento o fragmentos que tienen actividad de angiostatina, la elastasa digerirá además al fragmento(s) para inactivar péptidos, y por lo tanto, es probable que no sea la enzima la que genere angiostatina in vivo.

Como se observó anteriormente, la angiostatina puede ser generada in vitro por medio de proteólisis limitada del plasminógeno con la elastasa. Este método tiene varias desventajas. Primero, mientras que la elastasa escinde al plasminógeno para generar un fragmento que contiene los kringles 1-3, no se sabe si esta escisión es en los sitios normales en donde ocurre la escisión para producir angiostatina in vivo. Por lo tanto, la angiostatina derivada de la elastasa puede tener un procesamiento alterado in vivo con actividad alterada en humanos. También puede ser inmunogénica si los sitios de escisión del péptido son diferentes de los de la angiostatina normal.

Un segundo medio para producir angiostatina es por medio de la expresión de los dominios kringle deseados del ADNc del plasminógeno o del gen en un vector de expresión en células procariotas o eucariota. Verla solicitud PCT WO 95/29242. Esta aproximación también está limitada ya que los dominios apropiados para la expresión no son conocidos. El producto puede también ser inmunogénico y puede no ser procesado en humanos como lo sería el producto generado por medio de escisión del plasminógeno a través de las enzimas normales in vivo.

Finalmente, la angiostatina puede ser aislada de los fluidos corporales de animales en los cuales se produce. Ver la solicitud PCT WO 95/29242. Sin embargo, la angiostatina no puede ser producida de esta forma en cantidades suficientes, y la angiostatina puede ser contaminada con agentes infecciosos cuando se la aisla a partir de tales
fuentes.

Claramente existe la necesidad de un método para producir angiostatina nativa en grandes cantidades. Se define aquí a la "angiostatina nativa" por ser la angiostatina producida in vivo o angiostatina, no importa cómo se la produzca, que sea la misma que la angiostatina producida in vivo.

A.D. Purushotham y colaboradores, Journal of Surgical Oncology 57:3-7 (1994) revelan el uso de estreptoquinasa efectiva en la inhibición del tumor pulmonar sembrado en un modelo de roedor. La estreptoquinasa fue capaz de causar fibrinólisis en el modelo de rata y de dar origen a la conversión del plasminógeno en la enzima fibrinolítica,
plasmina.

K.R. Meehan y colaboradores, Blood Coagulation and Fibrinolysis, Vol. 6, No. 2, 1995, 105-112 revelan los efectos de un activador plasminógeno del tipo de la uroquinasa administrado a pacientes con un pequeño carcinoma celular del pulmón induciendo la lisis de la fibrina.

Resumen de la invención

La presente invención provee nuevos usos de los compuestos efectivos en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades neoplásicas. Estos usos se basan en el descubrimiento de que el medio de cultivo acondicionado (CCM) producido por medio de células de cáncer cultivadas, células primarias endoteliales, células musculares lisas o fibroblastos, produce angiostatina cuando se pone en contacto con plasminógeno o plasmina. Los factores activos en el CCM han sido identificados por ser activadores plasminógenos y un donante sulfhidrilo. Así, la angiostatina producida por medio del uso de un activador plasminógeno y de un donante sulfhidrilo es la misma que la angiostatina producida in vivo, esto es, es angiostatina nativa.

La invención provee la fabricación de un medicamento para generar angiostatina. El medicamento comprende un donante sulfhidrilo y un activador plasminógeno. Dos modalidades de la invención se producen en CCM por medio del cultivo de células capaces de producir un activador plasminógeno y un lisado de tales células.

La invención también provee el uso del medicamento que se definió previamente en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neoplásica que comprende la administración a un animal que sufre de tal enfermedad de una cantidad terapéuticamente efectiva de un donante sulfhidrilo en combinación con un activador efectivo del plasminógeno para causar la conversión de plasmina en angiostatina. La plasmina puede ser aquella producida por medio del activador(es) endógeno(s) de plasminógeno a partir del plasminógeno endógeno. Alternativamente, el método pude comprender además la administración de una cantidad efectiva de plasmina. En aún otras modalidades, un activador del plasminógeno puede ser administrado al animal para producir la plasmina a partir de plasminógeno endógeno o a partir de la administración de una cantidad efectiva de plasminógeno.

De acuerdo a la invención, además de un contenedor puede utilizarse como contenedor un activador plasminógeno, solo o en combinación con el donante sulfhidrilo a un animal que sufre de una enfermedad angiogénica. La invención también proporciona un contenedor que soporta a un donante sulfhidrilo con una marca sobre él que instruye la administración del donante sulfhidrilo en una cantidad efectiva para causar la conversión de plasmina a angiostatina.

De acuerdo a la invención, también puede utilizarse una proteína que tiene las siguientes características: (a) es un fragmento de plasminógeno; (b) su aminoácido N-terminal es el mismo que el aminoácido N-terminal de la plasmina; (c) su aminoácido C-terminal está en kringle 5; y (d) inhibe la angiogénesis. En una modalidad, la proteína es angiostatina nativa. De acuerdo a la invención, además de una molécula de ADN puede utilizarse la codificación para la proteína, la molécula de ADN operativamente enlazada a las secuencias de control de expresión, una célula huésped que comprende a la molécula de ADN operativamente enlazada a las secuencias de control de expresión, y un método para producir la proteína que comprende el cultivo de la célula huésped.

La proteína puede ser utilizada para tratar enfermedades angiogénicas por medio de la administración de una cantidad efectiva de la proteína a un animal que sufre de tal enfermedad. Un animal que sufre de tal enfermedad puede ser tratado también administrándole un transgén que codifica a la proteína. Preferiblemente, la proteína codificada por el transgén es angiostatina nativa.

Finalmente, de acuerdo a la invención, puede utilizarse un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína. Tal anticuerpo puede ser utilizado para purificar a la proteína a partir de materiales que lo contienen. También, tal anticuerpo que se une selectivamente a la angiostatina nativa, puede ser utilizado en métodos y en kits para detectar o cuantificar una angiostatina nativa.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A: Transferencias de Western que muestran la conversión de plasminógeno y plasmina a angiostatina por medio de medio acondicionado libre de suero (SFCM) producido por células PC-3. Senda 1, peso molecular estándar; senda 2, plasminógeno humano; senda 3, plasminógeno humano incubado durante la noche a 37ºC en RPMI no acondicionado; senda 4, plasminógeno humano incubado durante la noche a 37ºC en SFCM a partir de células PC-3; senda 5, plasmina humana incubada en RPMI no acondicionado; senda 6, plasmina humana incubada en SFCM producida por células PC-3.

Figura 1B: Transferencias de Western que muestran que la generación de angiostatina a partir de plasminógeno fue dependiente del tiempo. El SFCM con PC-3 fue incubado con plasminógeno y, en los períodos de tiempo indicados, se removieron alícuotas y se congelaron sobre una plancha enfriada con nieve carbónica antes del análisis de las transferencias de Western. La generación de trazas de angiostatina se observó primero a las 3 horas, y la conversión completa fue marcada a las 24 horas.

Figura 1C: Transferencias de Western que muestran que la generación de angiostatina por el SFCM con PC-3 fue dependiente de la concentración. El SFCM se diluyó con diferentes cantidades de RPMI fresco como se indicó, y se incubó con plasminógeno durante 24 horas.

Figura 1D: Gráfica que ilustra la relación de la generación de angiostatina con la cantidad de SFCM. La señal relativa de la angiostatina fue cuantificada por medio de un densitómetro de barrido con sustracción de la señal de fondo. A las 18 horas de incubación, existía una relación lineal entre la cantidad de angiostatina generada y la cantidad de SFCM con PC-3 presente en la mezcla de reacción.

Figura 2: Transferencias de Western después de purificación por afinidad de la angiostatina generada por incubación del plasminógeno con SFCM producido por las células PC-3. La senda 1, estándares de peso molecular; senda 2, plasminógeno humano incubado durante la noche a 37ºC en RPMI no acondicionado; senda 3, angiostatina producida por medio de la incubación de plasminógeno con SFCM con PC-3 y luego afinidad purificada sobre Sefarosa con lisina y detectada sobre transferencias de Western por medio de coloración con azul de Coomassie; senda 4, angiostatina producida por medio de incubación de plasminógeno con SFCM con PC-3 y luego afinidad purificada sobre Sefarosa con lisina y detectada sobre transferencias de Western utilizando el anticuerpo monoclonal K1-3 para los kringles 1-3.

Figuras 3A-B: Gráficas que muestran que la angiostatina producida por medio de incubación del plasminógeno con SFCM con PC-3 se inhibe en las etapas in vitro críticas para la angiogénesis.

Figuras 3A: Proliferación endotelial celular. Los datos son la media \pm la desviación estándar.

Figura 3B: Migración inducida por el factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF). Se indican la migración de fondo sin el inductor y en presencia del bFGF estimulador. Se midió paralelamente la toxicidad por medio de exclusión con azul de tripán y fue < 10% a todas las concentraciones.

Figuras 4A-B: Fotografías que muestran que la angiostatina producida por medio de la incubación del plasminógeno con SFCM con PC-3 inhibe la formación in vitro del tubo de células endoteliales humanas. Se sembraron en placa las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), sobre geles de Matrigel en placas de 24 pozos y luego fueron tratadas con 15 \mug/ml de angiostatina producida utilizando SFCM con PC-3 en RPMI no acondicionado. Figura 4A: Las HUVEC de control forman ramificaciones, redes de interconexión. Figura 4B: Por contraste, la angiostatina producida utilizando SFCM con PC-3 causó una rotura significativa de la red del tubo.

Figuras 5A-B: Fotografías que muestran la inhibición de angiogénesis in vivo por medio de la angiostatina producida utilizando SFCM con PC-3. Figura 5A: La pastilla de hidrón (indicada por medio de la flecha) que contiene bFGF indujo una respuesta neovascular positiva 7 días después de la implantación. Figura 5B: Por contraste, no se observan vasos próximos a una pastilla de hidrón que contenga bFGF y 10 \mug/ml de angiostatina producida utilizando SFCM con PC-3 (indicado por medio de la flecha).

Figura 6: Transferencia de Western que muestra que la tanda que eluye desde el Reactivo Rojo 120-Agarosa, genera angiostatina cuando se combina con lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa, RPMI o aminoácidos de RPMI. Senda 1 - SFCM + plasminógeno; Senda 2 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa + plasminógeno; Senda 3 - eluato de la tanda del Reactivo Rojo 120-Agarosa después de diálisis hacia TBS + plasminógeno; Senda 4 - eluato de la tanda dializada + lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa + plasminógeno; Senda 5 - eluato de la tanda dializada + RPMI + plasminógeno; Senda 6 - eluato de la tanda dializada + mezcla de vitamina de RPMI + plasminógeno; Senda 7 - eluato de la tanda dializada + mezcla de aminoácidos de RPMI + plasminógeno; Senda 8 - eluato de la tanda dializada + mezcla de vitamina de RPMI y mezcla de aminoácidos + plasminógeno; Senda 9 - plasminógeno + RPMI no acondicionado.

Figura 7: Gráfica que muestra que la actividad del activador tipo uroquinasa del plasminógeno (u-PA) y la actividad de conversión de la angiostatina a plasminógeno (PACA) coeluyen sobre un gradiente de elución a partir de una columna de intercambio aniónico Hi-Q. Las lecturas de densidad óptica a 280 nm demostraron diferentes picos de proteína. La actividad de la u-Pa se determinó por medio de la medición de la escisión de un sustrato de péptido cromogénico para plasmina (p-NA de Val-Leu-Lys) a 405 nm. Las fracciones de pico fueron evaluadas para PACA por medio de transferencias de Western.

Figura 8: Transferencia de Western que muestra que la adición de u-PA y plasminógeno de lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa cocido o al medio fresco de RPMI, generó angiostatina. Senda 1 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa + plasminógeno; Senda 2 - lo que fluyó a través del de Reactivo Rojo 120-Agarosa + plasminógeno + u-PA; Senda 3 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa cocido + plasminógeno; Senda 4 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa cocido + plasminógeno + u-PA; Senda 5 - RPMI no acondicionado + plasminógeno; Senda 6 - RPMI no acondicionado + plasminógeno + u-PA.

Figura 9: Transferencia de Western que muestra que lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa produce angiostatina en presencia de los activadores de plasminógeno. Senda 1 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa + plasminógeno; Senda 2 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa + plasminógeno + u-PA; Senda 3 - lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa cocido + plasminógeno + t-PA.

Figura 10: Transferencia de Western que muestra la producción de angiostatina por medio de u-PA y glutationa. Senda 1 - plasminógeno + u-PA; Senda 2 - plasminógeno + u-PA + glutationa 5 \muM; Senda 3 - plasminógeno + u-PA + glutationa 50 \muM; Senda 4 - plasminógeno + u-PA + glutationa 100 \muM; Senda 5 - plasminógeno + u-PA + glutationa cocida 5 \muM; Senda 6 - plasminógeno + u-PA + glutationa cocida 50 \muM; Senda 7 - plasminógeno + u-PA + glutationa cocida 100 \muM.

Figura 11: Transferencia de Western que muestra que la combinación de u-PA y D-penicilamina produce angiostatina. Senda 1 - plasminógeno + D-penicilamina 100 \muM; Senda 2 - plasminógeno + u-PA + D-penicilamina 100 \muM; Senda 3 - plasminógeno + u-PA + D-penicilamina 1,0 \muM.

Figura 12: Transferencia de Western que muestra la producción de angiostatina por medio de u-PA, t-PA y estreptoquinasa. Las abreviaturas utilizadas en la figura tienen el siguiente significado:

PLG =

plasminógeno humano;

uPA =

activador de plasminógeno tipo uroquinasa;

tPA =

activador de plasminógeno tipo tejido:

SK =

estreptoquinasa;

+ =

con N-acetil-L-cisteína; y

- =

sin N-acetil-L-cisteína.

Figura 13: Transferencia de Western que muestra la producción de plasmina a partir de plasminógeno y la producción de angiostatina a partir de la plasmina purificada, preformada. Senda 1 - plasminógeno + u-PA-Sefarosa; Senda 2 - plasmina purificada + N-acetil-L-cisteína 100 \muM.

Figura 14: Gráfica del tamaño medio del tumor primario (mm^{3}) para los días 0-21 para ratones de control y ratones tratados con N-acetil-L-cisteína (NAC) o NAC + inhibidor de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA).

Figura 15: Transferencia de Western que muestra la producción de angiostatina por medio de N-acetil-L-cisteína (NAC) in vivo. Senda 1 - plasma (diluido 1:20) del ratón de control # 2; Senda 2 - plasma (diluido 1:20) del ratón de control # 3; Senda 3 - plasma (diluido 1:20) del primer ratón que recibió angiostatina libre de células, purificada por afinidad; Senda 4 - plasma (diluido 1:20) del segundo ratón que recibió angiostatina libre de células, purificada por afinidad; Senda 5 - plasma (diluido 1:20) del ratón # 1 tratado con NAC; Senda 6 - plasma (diluido 1:20) del ratón # 2 tratado con NAC; Senda 7 - plasma (diluido 1:20) del ratón # 3 tratado con NAC; y Senda 8 - angiostatina libre de células, purificada por afinidad.

Figura 16: Diagrama de plasminógeno humano que muestra la secuencia de aminoácidos de la molécula completa después de la escisión del péptido señal (no mostrado) (tomado de Molecular Basis of Thombosis and Hemostasis (High y Roberts, eds. 1995)). Se indican los kringles 1-5 (K1-K5). Los sitios de escisión entre los residuos 77 y 78 y los residuos 561 y 562 necesarios para la activación de plasminógeno a plasmina, se indican por medio de flechas rellenas. Las flechas no rellenas representan las posiciones de los intrones en el gen. Se indican también las ubicaciones del oligosacárido N-enlazado en la posición 289 y del glicano O-enlazado en la posición 346. El * indica a los miembros de la triada catalítica de la plasmina (His603, Asp646 y Ser741).

Descripción detallada de las modalidades actualmente preferidas

La invención provee el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de activador del plasminógeno en combinación con el donador de sulfhidrilo efectivo para incrementar la cantidad de angiostatina presente en un humano en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neoplásica en un humano que sufra de dicha enfermedad.

También se revelan, pero no forman parte de la invención, los métodos in vitro para la generación de angiostatina nativa. Uno de tales métodos comprende poner en contacto al plasminógeno con un activador del plasminógeno y un donante sulfhidrilo. Los tres reactivos pueden combinarse simultáneamente. Alternativamente, el plasminógeno puede ponerse en contacto con un activador del plasminógeno para producir plasmina, y la plasmina ponerse en contacto luego con un donante sulfhidrilo para producir la angiostatina. La plasmina puede estar al menos parcialmente purificada antes de ponerla en contacto con el donante sulfhidrilo. En realidad, la angiostatina puede ser producida directamente a partir de plasmina, elaborada sin embargo, poniendo en contacto la plasmina con un donante sulfhidrilo.

El plasminógeno puede ser de cualquier especie animal. Preferiblemente, sin embargo, el plasminógeno de la especie animal que va a ser tratada con la angiostatina es utilizado para evitar reacciones inmunológicas por la administración de la angiostatina. Así, si un humano va a ser tratado con la angiostatina, se prefiere el uso de plasminógeno humano.

Los métodos para la elaboración de plasminógeno son bien conocidos en el estado del arte. El plasminógeno puede ser adquirido también comercialmente. Preferiblemente, el plasminógeno se prepara por medio de ADN recombinante o de otras técnicas que evitan la inclusión de agentes infecciosos en la preparación del plasminógeno.

Pueden utilizarse todos los tipos de activadores del plasminógeno, incluidos los activadores del plasminógeno del tipo de la uroquinasa, activadores del plasminógeno de tipo tejido y estreptoquinasa. El activador del plasminógeno puede ser de cualquier especie animal. Los métodos para la elaboración del plasminógeno son bien conocidos en el estado del arte, y muchos activadores de plasminógeno están disponibles comercialmente. Preferiblemente, el activador del plasminógeno se prepara por medio de ADN recombinante o de otras técnicas que evitan la inclusión de agentes infecciosos en la preparación del activador del plasminógeno.

El plasminógeno se pone en contacto con el activador del plasminógeno en cantidades y bajo condiciones efectivas para causar la conversión del plasminógeno en plasmina. Estas cantidades y condiciones son conocidas o se pueden determinar empíricamente como es bien conocido en el estado del arte. En particular, aproximadamente desde 1 ng/ml aproximadamente hasta 1 \mug/ml del activador uroquinasa del plasminógeno por cada microgramo del plasminógeno en una reacción de 1 ml, se ha encontrado que produce la conversión completa de plasminógeno en plasmina aproximadamente después de 24 horas de incubación a 37ºC.

Puede utilizarse cualquier donante sulfhidrilo. Los donantes de sulfhidrilo son bien conocidos y están disponibles comercialmente. Los donantes de sulfhidrilo adecuados incluyen L-cisteína, D-cisteína, DL-cisteína, N-acetil-L-cisteína, glutationa reducida, D-penicilamina y captopril. El donante sulfhidrilo se cree que reduce o altera la formación del enlace disulfuro en el plasminógeno, y/o en la plasmina, y/o en la angiostatina, y/o en un producto intermedio.

El donante sulfhidrilo se pone en contacto con la plasmina, solo o en presencia del plasminógeno y del activador del plasminógeno, en cantidades y bajo condiciones efectivas para causar la conversión de la plasmina en angiostatina. Estas cantidades y condiciones pueden determinarse empíricamente como se conoce en el estado del arte. En particular, aproximadamente desde 10 \muM hasta aproximadamente 1 mM de donante sulfhidrilo por cada microgramo de plasmina en 1 ml de reacción, se ha encontrado que produce la conversión completa de plasmina en angiostatina aproximadamente después de 24 horas de incubación a 37ºC.

La plasmina puede ser generada a partir de plasminógeno por medio de un activador de plasminógeno como se describió anteriormente. La plasmina puede ser purificada a partir de los reactivos antes de ponerla en contacto con el donante sulfhidrilo. Los métodos de purificación de la plasmina son bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Ejemplo 4). La plasmina adquirida comercialmente o preparada de otras formas puede ser utilizada también para producir angiostatina poniendo en contacto a la plasmina con el donante sulfhidrilo como se describió anteriormente.

De acuerdo a la invención, puede utilizarse una composición para generar angiostatina. La composición comprende un activador del plasminógeno y un donante sulfhidrilo como se describió anteriormente. El activador del plasminógeno y el donante sulfhidrilo pueden estar contenidos en cualquier solución fisiológicamente aceptable (por ejemplo, suero fisiológico, amortiguadores, medio de cultivo) o pueden estar presentes en forma cristalina o liofilizada. Las composiciones adecuadas para uso terapéutico se describen más adelante.

La composición puede estar en un medio de cultivo acondicionado (CCM) preparado por medio de cultivo de células capaces de producir activador del plasminógeno. Las células animales malignas, humanas y no humanas que expresan a un activador del plasminógeno pueden producir CCM capaz de convertir plasminógeno y plasmina en angiostatina. Las células malignas adecuadas incluyen a las líneas celulares de carcinoma de próstata PC-3, DU-145, LN-CaP, las líneas celulares de carcinoma humano de seno MDA-MB-231 y MCF-7, a las líneas celulares de glioma humano U-373, U-118, A-172, y U-87, y la línea celular de melanoma de ratón B16F10. Se conocen muchas células animales no malignas para producir al activador del plasminógeno. Las células adecuadas no malignas incluyen a las células endoteliales primarias (por ejemplo, células endoteliales aórticas de bovino), a las células de músculo liso (por ejemplo, células de músculo liso de bovino), y fibroblastos. Además, se conocen células bacteriales que producen al activador del plasminógeno (por ejemplo, estreptoquinasa), y células de cualquier tipo pueden ser transformadas por medio de técnicas de ADN recombinante para producir al activador del plasminógeno. Las células y las líneas celulares adecuadas son bien conocidas en el estado del arte, y pueden obtenerse comercialmente, a partir de depósitos celulares, y por medio de métodos bien conocidos en el estado del arte.

Las condiciones apropiadas de cultivo para estas células son también bien conocidas en el estado del arte. El medio de cultivo utilizado debe contener un donante sulfhidrilo, o puede añadirse un donante sulfhidrilo al CCM después de producirlo. El medio de cultivo adecuado incluye a aquellos comercialmente disponibles, tales como RPMI, DMEM, etc. El CCM puede ser producido cultivando simplemente las células bajo condiciones normales de cultivo durante un tiempo suficiente para producir al CCM capaz de convertir plasminógeno o plasmina en angiostatina. Este tiempo puede ser determinado empíricamente. En particular, se ha encontrado que el cultivo de células de mamífero durante 24-72 horas después de que se ha formado una monocapa a 37ºC, es suficiente.

Alternativamente, o adicionalmente, las células pueden ser lisadas después de cultivarlas durante un tiempo suficiente para permitir la síntesis del activador del plasminógeno. Este tiempo puede ser determinado empíricamente, pero el cultivo de las células hasta que se forme una monocapa debe ser suficiente. El lisado puede ser utilizado para convertir plasminógeno y plasmina en angiostatina.

La angiostatina producida por medio de estos métodos puede ser purificada a partir de la mezcla de reacción. Los métodos para la purificación de la proteína son bien conocidos en el estado del arte. En particular, la angiostatina puede ser purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando Sefarosa con lisina. La actividad de la plasmina residual debe ser removida con, por ejemplo, Sefarosa con inhibidor de tripsina de la semilla de soya, Sefarosa con aprotinina, u otros procedimientos de cromatografía de afinidad que remuevan a las serina proteasas o al dominio catalítico de la plasmina. La angiostatina puede ser purificada también a partir de la mezcla de reacción utilizando un anticuerpo que se enlace selectivamente a ella (ver más adelante).

La angiostatina producida a través de estos métodos (angiostatina nativa) ha sido caracterizada. Ella reacciona con un anticuerpo monoclonal específico para los kringles 1-3 del plasminógeno, y se ha encontrado que inhibe la angiogénesis como se determinó a través de una variedad de análisis in vitro e in vivo.

Se ha encontrado también que tiene la secuencia N-terminal de la plasmina. Para la angiostatina producida a partir de plasminógeno humano, se ha encontrado que la secuencia N-terminal es Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly [SEQ ID NO: 1]. Se conocen las secuencias de la plasmina de otros animales. Así, la angiostatina nativa de un animal particular tendría la misma secuencia N-terminal que la plasmina de ese animal.

Muy sorprendentemente, se ha encontrado que la angiostatina nativa tiene su aminoácido C-terminal ubicado en kringle 5. En particular, se ha encontrado que la angiostatina producida a partir de plasminógeno humano tiene la secuencia C-terminal Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg [SEQ ID NO: 4] o Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys [SEQ ID NO: 5] (ver Ejemplo 6). Estas secuencias C-terminales resultarían de una escisión después del amino ácido 529 o del 530 del plasminógeno (ver Figura 16), que son sitios bien conocidos de escisión de la plasmina. Así, la angiostatina humana nativa comprende a la mayor parte del kringle 5 (ver Figura 16), lo cual es consistente con su peso molecular de 50-60 kD en electroforesis sobre gel de poliacrilamida bajo condiciones no reductoras.

Estos hallazgos fueron sorprendentes ya que se pensaba que la angiostatina contenida en los kringles 1-3 y en parte o en todo el kringle 4 (ver la sección de Antecedentes). También, se ha mostrado que una molécula que consiste de los kringles 1-4, aunque activa, fue menos activa que una molécula que consiste de los kringles 1-3 (ver la solicitud PCT WO 96/35774). Así, no se anticipo que la angiostatina nativa incluiría alguna porción del kringle 5. No se anticipo particularmente que la angiostatina nativa incluiría a la mayor parte del kringle 5.

Se espera ahora que fragmentos de plasminógeno, diferentes a los de la angiostatina nativa, incluyan al menos una porción del kringle 5 poseerán actividad de angiostatina (esto es, inhibirán la angiogénesis). Preferiblemente, el fragmento de plasminógeno comprende a la mayor parte del kringle 5. Más preferiblemente, el fragmento de plasminógeno comprende a la mayor parte del kringle 5. Como se lo utiliza aquí, "la mayoría del kringle 5" significa que al menos el 50% del kringle 5 (por ejemplo, al menos 40 de los aminoácidos para el kringle 5 humano), y "la mayor parte del kringle 5" significa que al menos 75% del kringle 5 (por ejemplo, al menos 60 de los aminoácidos para el kringle 5 humano). Por supuesto, el fragmento del plasminógeno es más preferiblemente de angiostatina nativa por las razones dadas más arriba.

Se conocen las secuencias de los plasminógenos de otros animales (disponibles a partir, por ejemplo del, GenBank). Las secuencias de plasminógeno humano [SEQ ID NO: 6], bovino [SEQ ID NO: 7], canino [SEQ ID NO: 8], de erizo del oeste europeo [SEQ ID NO: 9], de caballo [SEQ ID NO: 10], de mono rhesus [SEQ ID NO: 11], de ratón [SEQ ID NO: 12], y de cerdo [SEQ ID NO: 13] se dan más adelante en Listado de Secuencias (descargado de La Base de Datos de Secuencias de Proteína SWISS-PROT). La angiostatina nativa para un animal particular incluiría a la mayor parte del kringle 5 del plasminógeno de ese animal y tendría una secuencia C-terminal que corresponde a las secuencias C-terminales de la angiostatina nativa humana dadas anteriormente. En realidad, una revisión de estas secuencias mostró que la secuencia inmediatamente después de los sitios de escisión en el plasminógeno humano que produce a la angiostatina nativa (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; ver Ejemplo 6 más adelante) se conserva en todas estas secuencias de plasminógenos (ver los aminoácidos resaltados con negrilla en el Listado de Secuencias).

Como puede observarse en el Listado de Secuencias, las secuencias de plasminógenos de canino [SEQ ID NO: 8] y de caballo [SEQ ID NO: 10] contienen únicamente un dominio sencillo de kringle. Este dominio sencillo de kringle se considera como un dominio de kringle 5 por homología con otros dominios de kringle 5, y contiene la secuencia conservada (ver los aminoácidos resaltados en el Listado de Secuencias) encontrada en los dominios del kringle 5 de otros plasminógenos. Así, la invención incluye fragmentos de plasminógeno de plasminógenos de canino y de caballo y de cualquier otro plasminógeno que contiene un dominio de kringle 5.

Los fragmentos de plasminógeno utilizados en la invención (aquellos que tienen la secuencia N-terminal de la plasmina y que tienen sus aminoácidos C-terminales localizados en el kringle 5) pueden ser producidos a través de métodos de ADN recombinante. Preferiblemente, el fragmento de plasminógeno es angiostatina nativa. Más preferiblemente, el fragmento de plasminógeno es angiostatina humana nativa. Los métodos de ADN recombinante y las células huésped adecuadas, los vectores y otros reactivos para ser utilizados aquí son bien conocidos en el estado del arte.

La selección de una célula huésped particular para la producción de un fragmento de plasminógeno de la invención depende de varios factores reconocidos en el estado del arte. Estos incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión escogido, la toxicidad del fragmento de plasminógeno para la célula, la velocidad de transformación, las características de expresión, la bioseguridad, y los costos. Un balance de estos factores debe llamar la atención en el entendido de que no todos los huéspedes pueden ser igualmente efectivos para la expresión de un fragmento particular de plasminógeno.

Se prefieren las células huésped eucariotas para elaborar los fragmentos de plasminógeno utilizados en la invención. Dentro de los lineamientos anteriores, las células huésped eucariotas útiles incluyen levaduras y otros hongos, líneas celulares animales células animales en un animal intacto, células de insectos, y otras células huésped eucariotas conocidas en el estado del arte.

Las células huésped pueden ser transformadas con un vector que contiene ADN que codifica a un fragmento de plasminógeno utilizado en la invención. Sobre el vector, la secuencia de codificación debe estar operativamente enlazada a las secuencias de control de expresión.

Como se la utiliza aquí, "operativamente enlazada" se refiere al enlazamiento de las secuencias de ADN de tal forma que el fragmento de plasminógeno se expresará. Preferiblemente, el enlazamiento incluye al orden de las secuencias, la orientación de las secuencias, y el espaciamiento relativo de las diferentes secuencias, se realiza de tal manera que se obtiene la expresión óptima.

Las secuencias de control de expresión deben incluir a un promotor. El promotor utilizado en el vector puede ser cualquier secuencia que muestre actividad transcripcional en la célula huésped y puede derivarse de los genes que codifican a las proteínas homologas o heterólogas y a las proteínas extracelulares o intracelulares. Sin embargo, el promotor no necesita ser idéntico a ningún promotor de ocurrencia natural. Puede estar compuesto de porciones de diferentes promotores o puede ser parcialmente o totalmente sintético. La guía para el diseño de los promotores la suministran los estudios de la estructura del promotor tal como aquel de Harley y Reynolds, Nucleic Acids Res., 15, 2343-61 (1987). También, la ubicación del promotor con relación al inicio de la transcripción, puede ser optimizada. Ver, Roberts y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 760-4 (1979). El promotor puede ser inducible o constitutivo, y es preferiblemente un promotor fuerte. Por "fuerte", se entiende que el promotor provee una alta velocidad de transcripción en la célula huésped.

En el vector, las secuencias de codificación deben estar operativamente enlazadas a las secuencias de terminación de la transcripción, así como al promotor. La secuencia de codificación puede estar también operativamente enlazada a las secuencias de control de expresión diferentes a las de los promotores y a las secuencias de terminación de la transcripción. Estas secuencias adicionales de control de la expresión incluyen activadores, reforzadores, operadores, señales de detención, señales de caperuza, señales de poliadenilación, secuencias 5' no traducidas, y otras secuencias y señales involucradas con el control de transcripción o de traducción.

La secuencia de consenso para la secuencia de inicio de la traducción de eucariotas ha sido definida por Kozak (Cell, 44, 283-292 (1986)) como: C(A/G)CCAUGG. Las desviaciones de esta secuencia, particularmente en la posición 3 (A o G), tienen un gran efecto sobre la traducción de un ARNm particular. Virtualmente todos los genes altamente expresados de mamífero utilizan esta secuencia. Los ARNm de levadura altamente expresados, por otro lado, difieren de esta secuencia, y en vez de eso utilizan la secuencia (A/Y)A(A/U)AAUGUCU (Cigan y Donahue, Gene, 59, 1-18 (1987)) estas secuencias pueden ser empíricamente alteradas para determinar la secuencia óptima que va a ser utilizada en una célula huésped particular.

El ADN que codifica a un fragmento de plasminógeno utilizado en la invención, puede prepararse utilizando métodos estándar tales como aquellos descritos en Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989). En particular, se conocen los clones que codifican al plasminógeno. Ver, por ejemplo, el GenBank de la solicitud PCT WO 95/29242; Browne y colaboradores, Fibrinolysis, 5, 257-260 (1991). Pueden identificarse otros clones a través de métodos conocidos en el estado del arte. Los clones, ya sea conocidos o recientemente identificados, pueden ser modificados para codificar un fragmento de plasminógeno de la invención a través de métodos conocidos en el estado del arte.

Las secuencias de codificación pueden, alternativamente, ser sintetizadas utilizando técnicas estándar que son bien conocidas en el estado del arte, usando las secuencias conocidas de plasminógeno. Por ejemplo, pueden ser sintetizadas las secuencias de ADN por medio de la química de la fosfoamidita en un sintetizador automatizado de ADN, purificadas, templadas, ligadas y clonadas dentro de vectores adecuados. Se prefiere la síntesis química por diferentes razones.

Primero, es deseable la síntesis química ya que los codones preferidos por el huésped en el cual se expresará la secuencia de ADN, pueden ser utilizados para optimizar la expresión. No se necesita alterar todos los codones para obtener una expresión mejorada pero por encima del 50%, más preferiblemente aproximadamente al menos el 80%, de los codones deben ser cambiados por los codones preferidos por el huésped. Se conocen las preferencias de los codones de muchas de las células huésped. Ver, Maximizing Gene Expresión, páginas 225-85 (Reznikoff & Gold, eds., 1986). Las preferencias de los codones de otras células huésped pueden ser deducidas por medio de métodos conocidos en el estado del arte.

El uso del ADN sintetizado químicamente permite también la selección de los codones con una visión para proveer sitios de restricción únicos o casi únicos en posiciones convenientes en la secuencia. El uso de estos sitios provee un medio conveniente para construir las secuencias sintéticas de codificación. Además, si las estructuras secundarias formadas a través de la transcripción del ARN mensajero o de otras secuencias desestabilizadoras, interfiere con la transcripción o con la traducción, ellas pueden ser eliminadas por medio de la alteración de las selecciones de
codón.

La síntesis química también permite el uso de secuencias optimizadas de control de expresión con la secuencia de ADN que codifica al fragmento de plasminógeno. De esta forma, puede obtenerse la expresión óptima de los fragmentos de plasminógeno. Por ejemplo, como se observo anteriormente, los promotores pueden sintetizarse químicamente y optimizarse sus ubicaciones con relación al inicio de la transcripción.

La codificación del ADN para una señal o una secuencia líder de señal pueden localizarse secuencia arriba de la secuencia de ADN que codifica al fragmento de plasminógeno. Una señal o una secuencia líder de señal es una secuencia de aminoácidos en el amino terminal de una proteína que permite que la proteína a la cual está unida, sea secretada a partir de la célula en la cual se produce. La señal apropiada y las secuencias líderes de señal son bien conocidas. Aunque las proteínas secretadas son a menudo más fáciles de purificar, los niveles de expresión son generalmente menores que aquellos que pueden obtenerse en ausencia de la secreción.

Los vectores para la expresión de los fragmentos de plasminógeno pueden ser cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que sea capaz de expresar a un fragmento de plasminógeno en la célula huésped seleccionada. El vector utilizado para transformar a las células huésped puede tener uno o más sistemas de replicación que le permitan replicarse en la célula huésped. En particular, cuando el huésped es una levadura, el vector debe contener a los genes REP 1-3 de replicación de la levadura 2u y al origen de la
replicación.

Alternativamente, puede utilizarse un vector de integración que permita la integración dentro del cromosoma de la célula huésped de la secuencia de codificación para un fragmento de plasminógeno de la invención. Aunque el número de copias de la secuencia de codificación en las células huésped sería menor que cuando se utilizan los vectores de autorreplicación, los transformantes que tienen secuencias integradas dentro de sus cromosomas, son generalmente bastante estables.

Cuando el vector es un vector de autorreplicación, es preferible es un plásmido de alto número de copias para que se obtengan altos niveles de expresión. Como se lo utiliza aquí, un "plásmido de alto número de copias" es uno que esta presente aproximadamente con 100 copias o más, por célula. Se conocen un gran número de plásmidos adecuados de alto número de copias.

El vector deseable tiene también sitios de restricción únicos para la inserción de secuencias de ADN y una secuencia de codificación para un rasgo fenotípico seleccionable o identificable que se manifiesta cuando el vector está presente en la célula huésped ("un marcador de selección"). Si un vector no tiene sitios de restricción únicos, puede ser modificado para introducir o eliminar sitios de restricción para hacerlo más adecuado para manipulaciones adicionales.

Después de que se prepara al vector que contiene una secuencia de ADN que codifica a un fragmento de plasminógeno de la invención, se lo utiliza para transformar a las células huésped. Los métodos para transformar a las células huésped son bien conocidos en el estado del arte, y se pueden utilizar cualquiera de estos métodos.

Las células huésped transformadas se seleccionan en formas conocidas y luego se cultivan bajo condiciones efectivas para producir al fragmento del plasminógeno. Los métodos de cultivo son aquellos que son bien conocidos en el estado del arte para la escogencia de la célula huésped.

El fragmento de plasminógeno expresado puede ser recuperado utilizando métodos de recuperación y purificación de proteínas a partir de cultivos celulares recombinantes que son bien conocidos en el estado del arte. En particular, los anticuerpos que se enlazan selectivamente a los fragmentos de plasminógeno de la invención, pueden ser utilizados para purificar los fragmentos (ver más adelante).

La invención también provee métodos para el tratamiento de enfermedades neoplásicas (por ejemplo, tumores y metástasis de tumores).

La enfermedad neoplásica puede ser tratada por medio de la administración de una cantidad de un donante sulfhidrilo suficiente para causar la conversión de la plasmina en angiostatina, y una cantidad efectiva de un activador del plasminógeno. El plasminógeno o la plasmina pueden ser aquellos encontrados en forma endógena en el animal, o también se administran cantidades efectivas de plasminógeno o de plasmina al animal. Los animales tratables de acuerdo a la invención incluyen mamíferos, tales como perros, gatos, caballos, u otros animales domésticos, y humanos.

Las formas efectivas de dosificación, modos de administración y cantidades de las dosis de los diferentes compuestos para tratar enfermedades angiogénicas, pueden determinarse empíricamente, y hacer tales determinaciones está dentro las habilidades del estado de la técnica. Se entiende por aquellos experimentados en el estado del arte, que las cantidades de las dosis variarán con la actividad del compuesto particular empleado, con la severidad de la enfermedad angiogénica, con la ruta de administración, con la velocidad de excreción del compuesto, con la duración del tratamiento, con la identificación de otras drogas que sean administradas al animal, la edad, el tamaño y la especie del animal, y con factores parecidos conocidos en las artes médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la presente invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis efectiva más baja para producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosis diaria será determinada por el médico o el veterinario que presta la atención, dentro del alcance de un buen juicio médico. Si se desea la dosis diaria efectiva puede ser administrada como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas separadamente a intervalos apropiados durante el transcurso del día.

Los compuestos utilizados en la presente invención pueden ser administrados a un paciente animal para terapia por medio de cualquier ruta adecuada de administración, incluida la forma oral, nasal, rectal, vaginal, parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, intraperitoneal, subcutánea, o intramuscular), intracisternal, transdérmica, intracraneal, intracerebral, y tópica (incluyendo la forma bucal y sublingual). Las rutas preferidas de administración son la subcutánea, la oral y la intravenosa. El uso de polímeros biodegradables similares a aquellos descritos por Brem y colaboradores, Lancet, 345, 1571 (1995) para la liberación local sostenida de agentes farmacológicos después de la incorporación dentro de los polímeros biodegradables, es también un método preferido de administración. La implantación del polímero impregnado con la droga en, por ejemplo, un sitio tumoral, permite una exposición local prolongada con una exposición sistémica mínima.

Aun cuando es posible administrar sólo a un compuesto utilizado en la presente invención, se prefiere administrar al compuesto como una formulación farmacéutica (composición). Las composiciones farmacéuticas utilizadas en la invención contienen un compuesto de la invención como ingrediente activo en mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con uno o más de otros compuestos, drogas u otros materiales. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, y no nocivos para el paciente.

Las formulaciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención incluyen a aquellas adecuadas para administración oral, nasal, oftálmica, tópica, rectal, vaginal y/o parenteral. Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos utilizados en la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por medio de métodos convencionales conocidos por aquellos entrenados en la técnica.

La cantidad de ingrediente activo que se combinará con un material portador para producir una forma de dosificación sencilla variará dependiendo del huésped que está siendo tratado, del modo particular de administración y de todos los otros factores descritos anteriormente. La cantidad de ingrediente activo que se combinará con un material portador para producir una forma de dosificación sencilla, generalmente será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis efectiva más baja para producir un efecto terapéutico o la dosis máxima tolerada que produzca un incremento terapéutico sobre las enfermedades que pongan en peligro la vida, tales como el cáncer.

Los métodos para preparar formulaciones farmacéuticas o composiciones, incluyen la etapa de asociar un compuesto utilizado en la presente invención con el portador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando en forma íntima y uniforme a un compuesto de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, dándole forma al producto.

Las formulaciones adecuadas utilizadas en la invención para administración oral pueden estar en la forma de cápsulas, bolsitas, píldoras, tabletas, polvos, gránulos o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o en emulsiones líquidas acuosas en aceite o aceitosas en agua, o como un tónico o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia), y similares, conteniendo cada una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como ingrediente activo. También se puede administrar un compuesto utilizado en la presente invención como un bolo, electuario o pasta.

En las formas de dosificación sólida utilizadas en la invención para administración oral (cápsulas, tabletas, píldoras, dulces medicados recubiertos de azúcar, polvos, gránulos y similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como el citrato de sodio o el fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: (1) rellenos o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; (2) aglomerantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes de desintegración, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes en solución, tales como parafina; (6) aceleradores de absorción, tales como compuestos cuaternarios de amonio; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilén glicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de las cápsulas, las tabletas y las píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden contener agentes amortiguadores. Las composiciones sólidas de tipo similar pueden emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina blandas y duras, utilizando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilén glicoles de alto peso molecular y
similares.

Una tableta puede elaborarse por medio de compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas utilizando un aglomerante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil celulosa), lubricante, diluyente inerte, preservativo, desintegrante (por ejemplo, glicolato sódico de almidón o carboximetilcelulosa de sodio entrelazada), un agente tensoactivo o dispersante. Las tabletas moldeadas pueden elaborarse por moldeo en una máquina apropiada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Las tabletas, y otras formas de dosificación sólida utilizadas en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tales como dulces medicados recubiertos de azúcar, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden ser opcionalmente marcados o preparados con recubrimientos o cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en el arte de la formulación farmacéutica. Ellos también pueden ser formulados para proveer una liberación lenta o controlada del ingrediente activo utilizando en ellos, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en diferentes proporciones para permitir el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Ellos pueden ser esterilizados por medio, por ejemplo, de filtración a través de un filtro para retención de bacterias. Estas composiciones pueden contener también opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición en la que ellos liberan únicamente al ingrediente activo, o preferencialmente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, en forma retardada. Ejemplos de las composiciones de inclusión que pueden ser utilizadas incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo puede estar también en forma microencapsulada.

Las formas de dosificación líquida para administración oral de los compuestos utilizados en la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en el arte, tales como, por ejemplo, agua y otros solventes, agentes de solubilización y emulsificantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilén glicol, 1,3-butilén glicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de maní, de maíz, de germen, de oliva, de castor, y de sésamo), glicerol, tetrahidrofuril alcohol, polietilén glicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán, y mezclas de los mismos.

Junto a los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir también adyuvantes tales como agentes de humectación, emulsificantes y agentes de suspensión, agentes endulzantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y preservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearil etoxilados, polioxietilén sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas utilizadas en la invención para administración rectal o vaginal pueden ser presentadas como supositorios, que pueden ser preparados por medio de la mezcla de uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes no irritantes adecuados o portadores que contienen, por ejemplo, manteca de cacao, polietilén glicol, una cera o salicilato para supositorios, la cual es sólida a temperatura ambiente, pero líquida a temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirá en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo. Las formulaciones utilizadas en la presente invención que son adecuadas para administración vaginal incluyen también supositorios vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en nebulizador que contienen portadores que son conocidos en el estado del arte por ser apropiados.

Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de un compuesto utilizado en esta invención incluyen polvos, nebulizadores, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier amortiguador, o propelentes que puedan ser requeridos.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo utilizado en esta invención, excipientes, tales como grasas vegetales o animales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilén glicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los
mismos.

Los polvos y nebulizadores pueden contener, además del compuesto utilizado en esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo o mezclas de estas sustancias. Los nebulizadores pueden contener adicionalmente propelentes usuales tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como el butano y el propano.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proveer un suministro controlado de un compuesto de la invención al organismo. Tales formas de dosificación pueden elaborarse por medio de disolución, dispersión, o bien incorporando un compuesto de la invención en un medio apropiado, tal como un material de matriz elastomérica. Los reforzadores de absorción pueden ser utilizados también para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de tal flujo puede ser controlada ya sea proveyendo una membrana para el control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o en un gel.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención, adecuada para administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones isotónicas acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden ser reconstituidos en soluciones o en dispersiones estériles inyectables justo antes de usarlas, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, solutos que suministran la formulación isotónica con la sangre del receptor al cual se destina o agentes de suspensión o espesantes.

Los ejemplos de portadores adecuados acuosos y no acuosos que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas utilizadas en la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilén glicol, polietilén glicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y por medio del uso de tensoactivos.

Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como agentes de humectación, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéuticamente inyectable puede ser realizada por medio de la inclusión de agentes que retrasen la absorción tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.

En algunos casos, con el propósito de prolongar el efecto de una droga, es deseable hacer más lenta la absorción de la droga a partir de inyecciones subcutáneas o intramusculares. Esto puede lograrse por medio del uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en agua. La velocidad de absorción de la droga depende entonces de su velocidad de disolución, que a su vez puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción dilatada de una droga administrada de forma parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la droga en un vehículo aceitoso.

Las formas de depósito inyectables se elaboran por medio de la formación de matrices microencapsuladas de la droga en polímeros biodegradables tales como un poliglicólido-poliláctido. Dependiendo de la relación de la droga con el polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación de la droga. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectable se preparan también entrapando la droga en liposomas o en microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables se pueden esterilizar por ejemplo, por medio de filtración a través de un filtro retenedor de bacterias.

Las formulaciones se pueden presentar en contenedores sellados para dosis unitarias o dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y viales, y se pueden almacenar en condición liofilizada requiriendo solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para la inyección, inmediatamente antes de usarlas. Las soluciones y las suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito anteriormente. Aunque no forma parte de la invención, una enfermedad angiogénica puede ser tratada también por medio de terapia génica. En particular, se administra un transgén que contiene ADN que codifica a un fragmento de plasminógeno que tiene la secuencia N-terminal de plasmina y que contiene al menos una porción del kringle 5 operativamente enlazada a las secuencias de control de expresión a un animal que sufre de tal enfermedad. Preferiblemente, el fragmento de plasminógeno codificado por medio del transgén es angiostatina nativa. La preparación del ADN que codifica los fragmentos de plasminógeno utilizados en la invención, que incluyen angiostatina nativa, operativamente enlazada a las secuencias de control de expresión, se describió más arriba. La expresión del transgén en el animal, resulta en la producción del fragmento de plasminógeno que inhibe la angiogénesis en el animal.

Los métodos y los materiales para la terapia génica son bien conocidos en el estado del arte. Ver, Culver, Gene Therapy: A Primer for Physicians (Segunda edición revisada, 1996), las patentes estadounidenses Nos. 5.521.291, 5.460.831 y 5.559.099, las solicitudes PCT WO 95/29242, WO 96/14876, y WO 96/35774. Ver también, Kirshenbaum y colaboradores, J. Clin. Invest., 92, 381-387 (1993) y Drazner y colaboradores, J. Clin. Invest., 99, 288-296 (1997). En particular, se conocen los métodos y los vehículos adecuados para el suministro de los transgenes y se pueden utilizar para suministrar los transgenes de la invención.

Por ejemplo, el transgén puede ser transfectado in vitro dentro de células deseadas, y las células transformadas inyectadas dentro de un animal que sufre de una enfermedad angiogénica, preferiblemente después de la expansión del número de células transformadas. Los métodos de transfección in vitro de un transgén dentro de células, son bien conocidos e incluyen electroporación, inyección directa de ADN desnudo dentro de las células, bombardeo de partículas, suministro a través de liposomas o de otros portadores con base en lípidos, el suministro a través de vectores virales, etc.

Alternativamente, el transgén puede ser administrado al animal de tal forma que transforma a las células dentro del animal. Los métodos de suministro de los transgenes in vivo también son bien conocidos e incluyen inyección directa de ADN desnudo en los tejidos, órganos o tumores deseados, el uso de liposomas y de otros portadores basados en lípidos para el suministro del transgén, el uso de un vector viral no infeccioso (por ejemplo, un vector adenoviral deficiente en replicación) para el suministro del transgén, el uso de vehículos dirigidos (un vehículo que le permite al vehículo enlazarse a, y suministrar el transgén a, una célula específica, tejido, órgano o tumor tal como los liposomas que tienen un anticuerpo específico para el tumor unido a ellos) para el suministro del transgén, etc.

De acuerdo con la invención, pueden utilizarse anticuerpos que se enlacen selectivamente a un fragmento de plasminógeno utilizado en la invención, incluidos los anticuerpos que se enlazan selectivamente a la angiostatina nativa. Que se "enlaza selectivamente" significa que el anticuerpo se enlaza a un fragmento del plasminógeno de la invención, tal como la angiostatina nativa, de preferencia al plasminógeno o a la plasmina.

El uso de anticuerpos incluye anticuerpos policlonales, antisuero purificado por afinidad, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, F(ab') o F(ab')_{2}) que son capaces de enlazar al antígeno, cualquier isotipo conocido o subclase de anticuerpo, y anticuerpos modificados por ingeniería genética (tal como un anticuerpo de cadena sencilla preparado por medio de técnicas de ADN recombinante). Los únicos requisitos son que la preparación final del anticuerpo tenga especificidad por el fragmento de plasminógeno, y sea capaz de enlazarse selectivamente al fragmento.

Los métodos para elaborar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en el estado del arte. Por ejemplo, los anticuerpos utilizados pueden prepararse inyectando a un animal huésped adecuado (tal como un conejo, una cabra, un caballo u otros mamíferos) con un fragmento de plasminógeno de la invención en mezcla con un adyuvante. Las inyecciones del fragmento se continúan hasta que se obtiene un antisuero de titulo adecuado. El antisuero se cosecha y se puede purificar además utilizando técnicas conocidas, si se lo necesita o se lo desea. Por ejemplo,
los anticuerpos pueden ser purificados por afinidad o pueden ser fraccionados a través de cromatografía DE-52.

Preferiblemente, sin embargo, los anticuerpos utilizados se preparan por medio de hibridación de células somáticas a través de células de fusión de un animal inmunizado (tal como ratas, hámsteres, ratones u otros mamíferos) con una línea celular inmortal tal como las células de mieloma. Las células fusionadas se clonan, y se pueden aislar los anticuerpos monoclonales de especificidad apropiada por medio de la selección de células fusionadas clonadas. Las técnicas de preparación de anticuerpos monoclonales son bien conocidas.

Los anticuerpos que se enlazan selectivamente a un fragmento de plasminógeno utilizado, pueden ser usados para purificar los fragmentos de plasminógeno de los fluidos que los contienen. Tales fluidos incluyen medio de cultivo, tal como aquellos resultantes de la práctica de los métodos de la invención para producir angiostatina nativa y los fragmentos de plasminógeno de la invención (ver más arriba). La angiostatina nativa se encontraría, además, en fluidos corporales (por ejemplo, sangre, plasma, suero, saliva, orina y en los fluidos producidos por los tumores).

Para purificar un fragmento de plasminógeno, se pone en contacto el fluido que lo contiene con un anticuerpo específico para el fragmento particular. Preferiblemente, el anticuerpo se une a una superficie sólida antes de ser contactado con el fluido que hace contacto con el fragmento. Las superficies sólidas apropiadas son bien conocidas en el estado del arte y están comercialmente disponibles. Los ejemplos de las mismas incluyen vidrio, poliacrilamida, polimetilmetacrilato, policarbonato, poliacrilonitrilo, polietileno, polipropileno, poliestireno, lechos de látex, lechos de agarosa, y nylon.

El anticuerpo se une preferiblemente en forma covalente a la superficie sólida. Los métodos y los agentes para unir a los anticuerpos covalentemente a las superficies sólidas son bien conocidos en el estado del arte. Los agentes adecuados incluyen carbodiimida, cianoborohidruro, diimidoésteres, periodato, alquilhaluros, succinimidas, dimetilpimelimidiato y dimaleimidas. Ver, Blair y colaboradores, J. Immunol. Methods, 59, 129 (1993); Blair y colaboradores, Cancer Res., 41, 2700 (1981); Gautheier y colaboradores, J. Expr. Med., 156, 766 (1982).

Las concentraciones específicas de los reactivos, la temperatura y el tiempo de incubación, así como otras condiciones para obtener el enlazamiento del anticuerpo al fragmento de plasminógeno, puede variarse dependiendo de factores tales como la concentración del fragmento de plasminógeno en el fluido, de la naturaleza del fluido y similares. Aquellos entrenados en el arte serán capaces de determinar las condiciones óptimas y operativas mientras se emplea experimentación de rutina.

Después de que el anticuerpo se ha enlazado al fragmento de plasminógeno se separa el resto de fluido del fragmento enlazado del plasminógeno. El fragmento de plasminógeno es luego liberado del anticuerpo por medio de métodos conocidos.

Más preferiblemente, se ubica en una columna una superficie sólida con el anticuerpo unido a la misma. Por ejemplo, una columna rellena con lechos de agarosa que tienen anticuerpo unido a ellos. El fluido que contiene los fragmentos de plasminógeno se pasa simplemente a través de la columna, y los fragmentos de plasminógeno en el fluido se enlazan al anticuerpo en la columna y se retienen en la misma, mientras que el resto del fluido pasa a través de ella. Después de lavar la columna, los fragmentos de plasminógeno se liberan del anticuerpo.

Puede utilizarse también los anticuerpos usados que se enlazan selectivamente a la angiostatina nativa, para detectar o cuantificar a la angiostatina nativa para el diagnóstico de una enfermedad angiogénica o para hacer seguimiento a la recurrencia de tal enfermedad. Tales anticuerpos pueden utilizarse también para estudiar el mecanismo de acción de la angiostatina en el organismo.

La angiostatina nativa puede detectarse en materiales tales como los fluidos corporales (ver más arriba), en células y tejidos (tejido tumoral, placenta, útero, cerebro, hígado e intestinos). La angiostatina nativa puede ser liberada de las células o de los tejidos por medio de técnicas de extracción conocidas, o pueden utilizarse células intactas o secciones de tejido.

La angiostatina nativa en fluidos o en extractos puede ser detectada o cuantificada utilizando técnicas convencionales de inmunoensayo. Tales técnicas incluyen aglutinación, radioinmunoensayo, inmunoensayos con enzimas, ensayos de fluorescencia, ensayos colorimétricos, etc. El inmunoensayo puede realizarse en el formato de enlazamiento competitivo, o puede ser un ensayo inmunométrico. Puede ser un ensayo homogéneo o heterogéneo. Técnicas homogéneas apropiadas son la extinción y el acrecentamiento de la fluorescencia, el inmunoensayo de transferencia de energía, el inmunoensayo de impedimento estérico de doble anticuerpo, el inmunoensayo de sustrato marcado, el inmunoensayo del grupo prostético marcado y el inmunoensayo modulador de enzima marcada.

La angiostatina nativa sobre células o tejidos puede ser detectada por medio de técnicas inmunohistoquímicas estándar bien conocidas en el estado del arte. Por ejemplo, se recolectan o se toman biopsias de los tumores, y se cortan secciones de tejidos con un micrótomo para examinar los sitios de producción de la angiostatina nativa. Tal información es útil para propósitos de diagnóstico y posiblemente terapéuticos en la detección y el tratamiento de cáncer y es útil para propósitos de investigación, para estudiar el modo de acción de la angiostatina.

La angiostatina nativa puede ser detectada o cuantificada utilizando un anticuerpo marcado que se enlaza selectivamente a la angiostatina nativa (anticuerpo primario) o a un componente marcado que se enlaza a la inmunoglobulina, tal como otro anticuerpo (anticuerpo secundario) o proteína A. Los marcadores adecuados ya sea para el anticuerpo primario o para el componente que se enlaza al anticuerpo primario, son bien conocidos en el estado del arte. Ellos incluyen: 1) enzimas (por ejemplo, rábano peroxidasa, malato deshidrogenada, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, deshidrogenada del alcohol producido por levaduras, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta galactosidasa, ribonuclesa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetil colinesterasa); 2) fluoróforos (tales como el isocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina), 3) radionucleótidos (tales como ^{125}I); 4) marcadores bioluminiscentes (tales como luciferina, luciferasa y aequorina); 5) marcadores quimioluminiscentes (tales como luminol, isoluminol, éster acridinio aromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato); 6) marcadores en forma de partículas (tales como las nanopartículas de oro); y 7) biotina/avidina o biotina/estreptavidina. El enlazamiento y al detección de estos marcadores puede llevarse a cabo utilizando técnicas estándar conocidas por aquellos capacitados en la técnica.

Las concentraciones específicas de los reactivos, la temperatura y el tiempo de incubación, así como otras condiciones, pueden ser variadas en cualquier inmunoensayo o técnica inmunohistoquímica que se emplee, dependiendo de factores tales como la concentración de la angiostatina nativa en la muestra, la naturaleza de la muestra y similares. Aquellos capacitados en el arte serán capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas para cada determinación mientras emplea experimentación de rutina. También se revela el uso de un kit de prueba para detectar o cuantificar a la angiostatina nativa. El kit es una combinación empacada de uno o más contenedores que contienen reactivos útiles para llevar a cabo los inmunoensayos o las técnicas inmunohistoquímicas de la invención. Los contenedores adecuados para los reactivos del kit incluyen botellas, viales, tubos de ensayo, placas de microtitulación, varillas indicadores de inmersión, tirillas, y otras superficies sólidas.

El kit incluirá un contenedor de un anticuerpo que se enlaza selectivamente a la angiostatina nativa. Estos anticuerpos son aquellos que se describieron anteriormente. El anticuerpo puede estar en solución, puede estar liofilizado, o unido a una superficie sólida, y puede estar marcado o no. Las superficies sólidas son de los tipos descritos anteriormente, y el anticuerpo está unido como se describió anteriormente.

El kit puede incluir además un contenedor con el componente marcado descrito anteriormente que se enlaza al anticuerpo primario. Los marcadores son aquellos descritos anteriormente.

Finalmente, el kit puede contener también otros materiales que son conocidos en el estado del arte y que pueden ser deseables desde el punto de vista comercial y del usuario. Tales materiales pueden incluir una muestra de angiostatina nativa (para inmunoensayos de estandarización o para enlazamiento a células o a tejidos en técnicas inmunohistoquímicas), amortiguadores, sustratos enzimáticos, diluyentes, y equipo para llevar a cabo el inmunoensayo o la técnica inmunohistoquímica.

Ejemplos

Ejemplo Comparativo 1

Preparación de Medio Acondicionado que Contiene Actividad Convertidora de Plasminógeno en Angiostatina (PACA)

Este ejemplo demuestra que una variedad de células expresan actividad enzimática que puede generar angiostatina bioactiva a partir de plasminógeno o de plasmina humana purificada. La angiostatina purificada por afinidad generada por medio de incubación del plasminógeno o de la plasmina con medio acondicionado libre de suero (SFCM), inhibió la proliferación celular endotelial humana, la migración inducida por el factor de crecimiento de fibroblastos básico para el factor angiogénico (bFGF), la formación de tubo celular endotelial, y angiogénesis de la córnea inducida por el bFGF. Los inhibidores de la serina proteinasa, pero no inhibidores de las metalo, cisteína o aspártico proteinasas, bloquearon la generación de angiostatina. El elastatinal, un inhibidor específico de la elastasa, falló en bloquear la generación de angiostatina, indicando que una elastasa no es responsable por la conversión de plasminógeno en angiostatina. En vez de eso, los datos muestran que la actividad de la serina proteinasa es necesaria para la generación de angiostatina.

A. Métodos

1. Cultivo Celular. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), fueron cultivadas en RPMI suplementado con 20% de suero bovino de ternera (Hyclone Laboratories Inc., Logan Utah #A-2151-L), 100 U/ml de penicilina G, 100 mg/ml de estreptomicina, L-glutamina, (Gibco BRL), 2500 U de heparina sódica (Fisher Scientific, Itasca, I1), y 50 mg/ml de suplemento para crecimiento de células endoteliales (Collaborative Biomedical Research, Bedford, MA). Las otras células enlistadas en la Tabla 1 fueron cultivadas en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina G, 100 mg/ml de estreptomicina (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Las células fueron mantenidas a 37ºC en una incubadora humificada en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Para generar SFCM, se lavaron dos veces las monocapas de células confluentes con suero fisiológico amortiguado con fosfato, y luego se le añadió RPMI libre de suero. Al siguiente día se recolectó el SFCM y se lo centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos para remover los restos celulares insolubles.

2. Generación de Angiostatina. Se añadieron dos microgramos de plasminógeno humano, obtenido por medio de cromatográfica de afinidad sobre Sefarosa con lisina de plasma humano (Castellino & Powell, Methods Enzymol, 80, 365-78 (1981)), o plasmina humana (#527624, Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA) a alícuotas de 100 \mul de SFCM y se incubó la mezcla a 37ºC durante la noche. Las alícuotas fueron analizadas por la generación de angiostatina por medio de transferencias de Western (ver más adelante). El plasminógeno escindido por SFCM fue evaluado también en presencia de inhibidores de proteinasa (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN).

3. Transferencias de Western. Las muestras se sometieron a electroforesis bajo condiciones no reductoras sobre geles de poliacrilamida al 12% (NOVEX, San Diego, CA) en amortiguador Tris-Glicina para corrimiento (Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970)), y fueron electrotransferidas a una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0.45 \muM (PVDF) (Immobilon, Millipore, Bedford, M.A.). La membrana fue bloqueada durante 30 minutos en amortiguador de bloqueo (albúmina de suero bovino al 1% en suero fisiológico amortiguado con Tris) y probada con una dilución 1:1000 de un anticuerpo monoclonal en los fragmentos de kringles 1-3 (K1-3) de plasminógeno humano (VAP 230L, Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). Después del lavado, se incubó la membrana durante 30 minutos con un anticuerpo secundario IgG antiratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Kirkegaard & Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD) y desarrollada utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato/nitroazul de tetrazolio (KPL).

4. Análisis Zimográfico. Se llevaron a cabo los Zimogramas para detectar la actividad de la matriz de metaloproteinasa como se describió previamente. Heussen & Dowdle, Anal. Biochem., 102, 196-202 (1980).

5. Sustratos de Péptido Cromogénico. Para determinar si estaba presente una elastasa, se incubaron 50 \mul de SFCM con 0,3 mM de sustratos de péptido cromogénico específicos para la elastasa (sustrato I, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA; sustrato II, Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA); sustrato III, pGlu-Pro-Val-p NA; sustrato IV, Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-pNA) (Calbiochem-Novabiochem Corp.), a 37ºC durante 2-18 horas. Se determine la escisión del sustrato hacienda seguimiento a la absorbancia a 405 nm (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

6. Purificación de Angiostatina sobre Sefarosa con Lisina. Para generar angiostatina purificada para análisis de bioactividad, se incubó plasminógeno humano con SFCM con PC-3 a 20 \mug/ml durante la noche a 37ºC. Se aplicó el producto de reacción a una columna de Sefarosa con lisina (Pharmacia Biotech), preequilibrada con TBS (Tris 50 mM, pH 7,5, y NaCl 150 mM). Después de los lavados con TBS para remover a la proteína no específicamente enlazada, se eluyó la angiostatina en ácido epsilon aminocapróico 0.2 M (EACA) en TBS. La fracción eluida fue dializada (corte de peso molecular 12.000-14.000) en suero fisiológico amortiguado con fosfato. Para remover la plasmina residual, se aplicó la angiostatina a una columna de agarosa inhibidora de la tripsina de la semilla de soya (Sigma Chemical Co., San Luis, MO), y se recolectó el fluido que la atravesó, se lo esterilizó a través de un filtro y se lo almacenó a -80ºC hasta su uso. Se cuantificó la angiostatina por medio de la medición de la absorbancia a 280 nm, utilizando una A^{1%}/_{1cm} de 8,0. Sottrup-Jensen y colaboradores, en Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, vol. 3, páginas 191-209 (Davidson y colaboradores, eds. 1978). Se examinó también a la angiostatina purificada por medio de coloración con azul brillante de Coomassie de geles de poliacrilamida, e inmunodetección por medio de transferencias de Western. La angiostatina generada por la elastasa, purificada a partir de plasma humano como se describe en O'Reilly, y colaboradores, Nature Med., 2, 689-692 (1996), fue un generoso obsequio de M.S. O'Reilly, Children's Hospital, Harvard University, Boston, MA.

7. Análisis de Microsecuencia de la Angiostatina. Para determinar el terminal NH_{2} de las bandas de la angiostatina, se sometieron a electroforesis 10 \mug/ml de la angiostatina purificada por afinidad preparada por medio de incubación del plasminógeno con SFCM con PC-3, sobre un gel de poliacrilamida en SDS al 12%, se hizo una electrotransferencia a una membrana de PVDF, y se la coloreó con azul de Coomassie. Se cortaron las bandas, se las colocó sobre discos Porton para soporte de la muestra, y se las secuenció utilizando un secuenciador de pulsos en fase líquida con análisis de feniltiohidantoina.

8. Ensayo de Proliferación de Células Endoteliales. Se determinó la proliferación de células utilizando el Ensayo de Proliferación Celular No Radioactivo con el CellTiter 96™ AQ (Promega Corp., Madison, WI). Las células endoteliales humanas fueron sembradas en placas para cultivo de tejidos de 96 pozos (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) a una concentración de 5.0 x 10^{3} células/pozo. Al siguiente día se añadieron, 1, 5, 8, o 10 \mug/ml de angiostatina en medio fresco a los pozos por triplicado. Los pozos sin angiostatina sirvieron como control. Las células fueron incubadas durante 72 horas, y la absorbancia leída a 490 nm, que refleja el número de las células que proliferaron, fue medida utilizando un lector automatizado de microplacas (Molecular Devices). Los resultados se reportan como el porcentaje del número de células de control no tratadas.

9. Ensayo de Migración de Células Endoteliales. Para determinar la capacidad de la angiostatina preparada por medio de incubación del plasminógeno con SFCM con PC-3 para bloquear la migración de células endoteliales hacia un factor angiogénico, bFGF, los ensayos de migración fueron realizados en una cámara modificada Borden, utilizando células capilares endoteliales de bovino (un gentil obsequio del Dr. Folkman, Harvard Medical School, Boston, MA) como se describió previamente. Dameron y colaboradores, Science, 265, 1582-84 (1994). Las células fueron cultivadas en medio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM) con suero de ternera donante al 10% y 100 mg/ml de mitógeno celular endotelial y utilizado en la pasada 15. Para evaluar la migración, a las células se las dejó morir de hambre en suero durante la noche en DMEM suplementado con albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA), se las cosechó, se las suspendió en DMEM/BSA, se las sembró en placa de a 106/ml sobre la superficie inferior de una membrana gelatinizada (Nucleopore Corp., Plesanton, CA) en una cámara invertida de Boyden, y se las incubó durante 1,5-2 horas para permitir la unión celular. Se invirtieron nuevamente las cámaras, se añadió material para ensayo en la superficie del pozo, y se incubó la cámara durante 3-4 horas adicionales. Se fijaron entonces las membranas y se colorearon, y se determinó el número de células que migró a la parte superior del filtro en 10 campos de alta potencia. Se utilizó DMEM con BSA al 0,1% como control negativo, y se utilizó bFGF (proveído por el Dr. Noel Bouck y preparado como se describe en Dameron y colaboradores, Science, 265, 1582-1584 (1994)) a 10 ng/ml como control positivo.

10. Formación del Tubo Celular Endotelial. Las HUVEC fueron sembradas en placas sobre geles de Matrigel (gentilmente suministrados por Hynda Kleinman, National Institute of Dental Research) en placas para cultivo de tejidos de 24 pozos como se describió previamente. Schnaper y colaboradores, J. Cell. Physiol, 156, 235-246 (1993). La angiostatina, preparada por medio de incubación con SFCM con PC-3, se añadió en RPMI no acondicionado a los pozos, seguido por las células con una concentración final de 4,0 x 10^{4} células en 1 ml de medio de cultivo con 50% de HUVEC y 50% de RPMI. Cada angiostatina o condición de control fue evaluada por triplicado. Los cultivos fueron incubados durante 16-18 horas a 37ºC, en una atmósfera húmeda con 5% de CO_{2}, luego fijados con Diff-Quick Solution II (Baxter, McGraw Park, IL). Un área representativa de la red tubular fue fotografiada utilizando una cámara Polaroid MicroCam con una magnificación final de 35X. Las fotografías fueron cuantificadas luego por medio de un observador blindado que midió la longitud de cada tubo, corrigiendo las porciones de los que estaban incompletos. Se determinó la longitud total de los tubos para cada fotografía y se determinó la longitud media del tubo. Los resultados fueron expresados como la media \pm del error estándar de la media.

11. Ensayo de Angiogénesis de la Cornea. El ensayo de la cornea se llevó a cabo como se describió previamente. Polverini y colaboradores, Methods Enzymol, 198, 440-450 (1991). En resumen, se implantaron 5 \mul de pastillas de hidrón (Hydron Laboratories, New Brunswick, NJ) que contienen 10 \mug/ml de bFGF o bFGF más 1 ó 10 \mug/ml de angiostatina dentro de la cornea de ratas anestesiadas. Después de 7 días, se sacrificaron los animales y se colorearon los vasos de la cornea con carbón coloidal y se examinaron las corneas para la actividad angiogénica.

B. Resultados

1. Generación de Angiostatina a través del Medio de Cultivo Acondicionado. La incubación de plasminógeno humano con el SFCM producido por las células PC-3 dio como resultado la generación de múltiples bandas inmunoreactivas aproximadamente de 50 kD (Figura 1A), similares a aquellas observadas por O'Reilly y colaboradores, Cell, 79, 315-328 (1994). El examen de SFCM de las líneas celulares adicionales también reveló la generación de las bandas múltiples, similares a las de SFCM con PC-3 (no se muestran los datos). Estas líneas celulares están enlistadas en la Tabla 1 más adelante.

La indicación inicial de que el producto era angiostatina se basó en la inmunoreactividad con el anticuerpo monoclonal específico para los kringles 1-3 (K1-3) del plasminógeno y en el tamaño del producto de escisión. La confirmación posterior de que el producto de escisión del plasminógeno era angiostatina bioactiva se describe más adelante.

La generación de angiostatina por el SFCM con PC-3 fue dependiente del tiempo. Hubo una significativa disminución en el sustrato del plasminógeno y el correspondiente incremento en angiostatina comenzando a las 3 horas, con conversión completa a angiostatina a las 24 horas (Figura 1B). La dilución del SFCM con PC-3 resultó en la disminución proporcional en la generación de angiostatina (Figuras 1C y 1D).

Para determinar si la plasmina, la forma activada del plasminógeno zimógeno, podría ser convertida también en angiostatina, se evaluó la plasmina como un sustrato potencial. La incubación de la plasmina con SFCM con PC-3 rindió un producto indistinguible de la angiostatina derivada del plasminógeno (Figura 1A). En estudios cinéticos, la plasmina fue convertida en angiostatina a una velocidad comparable a la del plasminógeno; 50% de conversión a las 8 horas, con conversión completa a las 24 horas (no se muestran los datos). Estos datos sugieren que in vitro, tanto el plasminógeno como la plasmina son sustratos a partir de los cuales se puede generar la angiostatina.

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TABLA 1

Líneas Celulares Analizadas por la Actividad Generadora de Angiostatina
Carcinoma de Próstata Humana	Actividad
PC-3	+++
DU-145	++
Ln-CaP	+
Carcinoma de Seno Humano
MDA-MB-231	++
MCF-7	+/-

TABLA 1 (continuación)

Glioma Humano	Actividad
U-373	+
U-118	+
A-172	++
U-87	+
Melanoma de Ratón
B16F10	++
Músculo Liso de Bovino
Línea Celular Primaria	++
Células Endoteliales Aórticas de Bovino
BAEC	++

2. Clase Enzimática de la Actividad para Convertir Plasminógeno en Angiostatina. Para determinar la clase proteolítica de la actividad generadora de angiostatina, se incubó SFCM con PC-3 en presencia de diferentes inhibidores de proteinasa. Se añadieron los inhibidores de proteinasa a la mezcla SFCM/plasminógeno antes de incubación durante la noche. Las muestras fueron analizadas por medio de transferencias de Western para la evidencia de la inhibición de la generación de angiostatina.

Solamente los inhibidores de la serina proteinasa bloquearon la generación de angiostatina (ver la Tabla 2 más adelante). En contraste, ninguna de las otras clases de inhibidores de proteinasa fue efectiva.

La angiostatina puede ser generada in vitro por medio de una proteólisis limitada del plasminógeno por la elastasa. Sottrup-Jensen y colaboradores, en Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, 3, 191-209 (Davidson y colaboradores eds. 1978). O'Reilly y colaboradores, Nature Med., 2, 689-692 (1996). Dong y colaboradores, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 37, 58 (1996). En el presente estudio, la generación de angiostatina no fue inhibida por elastatinal, un inhibidor específico de la elastasa (ver la Tabla 2 más adelante). Adicionalmente, no se detectó actividad de la elastasa en SFCM con PC-3 con base en la coincubación de SFCM con cuatro sustratos cromogénicos sensibles a la elastasa durante 24 horas (no se muestran los datos). Estos datos indican que la actividad de conversión de plasminógeno a angiostatina, es improbable que dependa de la acción de una elastasa. Además, los zimogramas sobre gelatina
no revelaron evidencia de metaloproteinasas activas o latentes en el SFCM con PC-3 (no se muestran los datos).

TABLA 2

Inhibidor de Proteinasa	Concentración	Clase	Actividad Inhibitoria*
Pefabloc	4,0 mM	Serina Proteinasas	Completa
Aprotinina	0,3 \muM	Serina Proteinasas	Completa
Inhibidor de la Tripsina de la	2,0 mM	Serina Proteinasas	Completa
Semilla de Soya
Benzamidina	1-10 mM	Serina Proteinasas	Débil
Elastatinal	50-100 \muM	Elastasa	Ninguna
Diclorohidrato de Antipaina	100 \muM	Serina Proteinasas	Ninguna
		Limitadas
Leupeptina	100 \muM	Serina y Tiol	Ninguna
		Proteinasas
Quimostatina	100 \muM	Quimotripsina	Ninguna
Bestatina	10 \muM	Aminopeptidasas	Débil
E-64	10 \muM	Cisteína Proteinasas	Ninguna
Pepstatina	1,0 \muM	Aspártico Proteinasas	Ninguna
EDTA	1-10 mM	Metaloproteinasas	Ninguna
1-10 Fenantrolina	10 \muM	Metaloproteinasas	Ninguna
Fosforamidón	100 \muM	Metaloproteinasas	Ninguna
* \begin{minipage}[t]{155mm} La inhibición completa se define como las bandas de angiostatina no inmunoreactivas; la inhibición débil resulta en el desarrollo de bandas inmunoreactivas débiles de angiostatina, y ninguna se refiere a la generación completa angiostatina.\end{minipage}

3. Purification de Angiostatina. La angiostatina generada por medio de SFCM con PC-3 fue purificada por afinidad sobre Sefarosa con lisina (O'Reilly y colaboradores, Nature Med., 2, 689-692 (1996)), y el producto resultante fue examinado por medio de transferencias de Western y coloración con azul de Coomassie (Figura 2). La secuencia amino terminal de las tres bandas era KVYLSECKTG [SEQ ID NO: 1] que corresponde a los residuos 78-87 de la molécula de plasminógeno, confirmando que el producto era un fragmento interno del plasminógeno.

4. La Angiostatina Generada por medio de SCFM con PC-3 Inhibe la Angiogénesis. Ya que la angiogénesis representa una cascada de procesos celulares que incluyen la proliferación celular endotelial, migración, y formación tubular, (Follanan & Shing, J. Biol. Chem, 267, 10931-10934 (1992)), se utilizaron múltiples ensayos in vitro e in vivo relacionados con la angiogénesis para confirmar que el producto generado por la incubación del plasminógeno con SFCM con PC-3 era angiostatina bioactiva.

La angiostatina purificada por afinidad, generada por medio del SFCM con PC-3, inhibió la proliferación celular endotelial humana en una forma dependiente de la concentración, con una significativa inhibición observada en 10 \mug/ml (P<0.05) en comparación con la proliferación celular del control no tratado (Figura 3A).

La angiostatina generada por medio de la SFCM con PC-3 también inhibió la migración inducida por bFGF de las células capilares endoteliales de bovino (Figura 3B) con una ED_{50} de 0,35 \mug/ml. La curva de dosis/respuesta de la angiostatina generada por medio de la SFCM con PC-3 fue indistinguible de aquella angiostatina generada por la elastasa. La inhibición de la migración ocurrió a una concentración 10 veces menor que la requerida para inhibir la proliferación, un hallazgo que había sido reportado para los otros inhibidores de angiogénesis. Takano y colaboradores, Cancer Res., 54, 2654-2660 (1994). Esto puede ser debido al hecho de que el ensayo de proliferación, en contraste con el ensayo de migración, fue conducido en RPMI suplementado con suplemento para crecimiento celular endotelial y suero de ternera al 20%, y por lo tanto contenía múltiples factores de estimulación.

La formación de tubos celulares endoteliales sobre Matrigel fue significativamente inhibida con 15 \mug/ml (Figuras 4A y B); la longitud media de los tubos en el control no tratado fue de 674,5\pm54 mm en comparición con la angiostatina producida por el SFCM con PC-3, 287,7\pm47 mm (P<0,005).

Para determinar el efecto de la angiostatina generada por medio del SFCM con PC-3 sobre la angiogénesis in vivo en la cornea, se analizó su habilidad para bloquear la angiogénesis inducida por bFGF en el ensayo de angiogénesis de la cornea. La píldora de bFGF indujo angiogénesis en 100% de las corneas implantadas (Figura 5A). En contraste, la angiostatina inhibió completamente con 10 \mug/ml la respuesta angiogénica inducida por bFGF en 3 de 3 animales (Figura 5B). Con una dosis más baja de 1,0 \mug/ml, la angiogénesis bloqueó completamente a la angiostatina en 2 de 3 animales, con una inhibición parcial el tercer animal.

Tomados juntos, estos datos indican que la angiostatina generada por medio del SFCM con PC-3, es un potente inhibidor de angiogénesis tanto in vitro como in vivo.

Ejemplo Comparativo 2

Identificación de los Factores Responsables de la Conversión del Plasminógeno en Angiostatina

Se cultivó la línea celular PC-3 de carcinoma de próstata humana y se preparó SFCM con PC-3 como se describió en el Ejemplo 1. La angiostatina fue generada por incubación con el SFCM con PC-3 o con otros materiales identificados más adelante como se describió en el Ejemplo 1. Se llevaron a cabo transferencias de Western como se describió en el Ejemplo 1.

El SFCM con PC-e fue aplicado a una columna con Reactivo Rojo 120-Agarosa (Sigma Chemical Co.). Lo que fluyó a través suyo no tenía actividad residual generadora de angiostatina a partir de plasminógeno (PACA) como se demostró por medio del análisis de las transferencias de Western (Figura 6). El material enlazado se eluyó con KCl 1 M de acuerdo con el protocolo del fabricante, luego se lo dializó con suero fisiológico amortiguado con Tris (TBS, Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM), con un corte molecular de 6000-8000 Dalton. PACA no fue detectada en la fracción dializada (Figura 6). La observación de que PACA no fue detectada ni en lo que fluyo a través ni en el eluato condujo a la hipótesis de que son necesarios dos o más factores para generar angiostatina a partir del plasminógeno o de la plasmina, y que los factores fueron separados por medio de cromatografía sobre Reactivo Rojo 120-Agarosa, estando presente uno o más factores en el eluato y estando uno o más factores contenidos en lo que fluyó a través suyo.

Para probar esta hipótesis, el eluato dializado se recombinó con lo que fluyó a través suyo. Los materiales recombinados fueron capaces de convertir al plasminógeno en angiostatina. La suplementación del eluato con medio de cultivo fresco RPMI, así como de lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa, restableció la capacidad del eluato para generar angiostatina, sugiriendo que el factor necesario era un componente del RPMI, y no una proteína u otro factor único para el SFCM.

Para definir más al cofactor putativo, se evaluaron los componentes individuales del RPMI por la capacidad para complementar al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa. El cofactor estaba presente en la mezcla aminoácido del RPMI (Figura 6).

Para determinar que aminoácido era capaz de restablecer PACA al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa, se analizaron individualmente los 20 aminoácidos encontrados en RPMI. La L-cisteína fue el único aminoácido capaz de restablecer PACA al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa (no se muestran los datos).

Debido a que la adición de L-cisteína al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa restableció la actividad generadora de angiostatina, se planteó la hipótesis de que el cofactor era un donante sulfhidrilo. Los agentes farmacológicos de reducción, D-penicilamina y captopril, fueron examinados por lo tanto por la capacidad para restablecer PACA al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa. La adición de 100 \muM de D-penicilamina al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa restableció la actividad generadora de angiostatina. El captopril también restableció la actividad generadora de angiostatina al eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa.

El SFCM con PC-3 fue eluido con Tris 50 mM, pH 10,0, NaCl 20 mM y aplicado a una resina de intercambio aniónico de Sefarosa Hi-Q (BioRad). No se detectó PACA en lo que fluyó a través suyo.

Los experimentos preliminares indicaron que PACA eluyó desde la columna de Sefarosa Hi-Q con NaCl 300 mM. Por lo tanto, el material enlazado fue eluido utilizando un gradiente lineal de NaCl desde 20 mM hasta 300 mM. La actividad de PACA y del activador del plasminógeno del tipo uroquinasa (u-PA), fue medida en las fracciones (después de dilución para restablecer las concentraciones fisiológicas de NaCl). La actividad de u-PA y de PACA copurificada (Figura 7). El examen del eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa reveló que también contenía u-PA.

Como se observó en el Ejemplo 1, La escisión del NH_{2} terminal de la angiostatina es en Lys^{77}, un sitio que resulta de la escisión del plasminógeno en Glu por la plasmina. Esto sugiere que la generación de plasmina puede ser una etapa intermedia necesaria en la generación de angiostatina a partir del plasminógeno.

Para determinar si el factor en el eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa era u-PA, se analizó u-PA como un sustituto para el eluato del Reactivo Rojo 120-Agarosa. Como se ilustra en la Figura 8, u-PA fue capaz de generar angiostatina en presencia de lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa cocido o de RPMI, ambos fuentes de donadores de sulfhidrilo. Esto indica que la única proteína necesaria para la conversión de plasminógeno en angiostatina es u-PA.

A continuación, u-PA, el activador del plasminógeno tipo tejido (t-PA), y la estreptoquinasa fueron analizados en combinación con lo que fluyó a través del Reactivo Rojo 120-Agarosa para PACA. Los activadores de plasminógeno solos fallaron al generar angiostatina a partir del plasminógeno pero, en presencia de lo que fluyó a través suyo, se produjo angiostatina (Figura 9). Estos datos sugieren que la generación de plasmina es un intermediario para la generación de angiostatina, y que la generación de angiostatina no depende de qué activador de plasminógeno está presente.

Ejemplo Comparativo 3

Generación de Angiostatina Utilizando Activadores de Plasminógeno y Donantes de Sulfhidrilo

Habiendo demostrado que la única proteína necesaria para la conversión de plasminógeno en angiostatina es un activador de plasminógeno, y que un donante sulfhidrilo es un cofactor necesario, se determinó a continuación si estos componentes son suficientes para la generación de angiostatina. Todas las incubaciones se realizaron a 37ºC durante 18 horas en TBS, y a las muestras resultantes se les analizó la angiostatina por medio de transferencias de Western (realizado como se describe en el Ejemplo 1).

La incubación de u-PA con plasminógeno y al menos 5 \mug redujo la angiostatina producida por la glutationa (Figura 10). No se produjo angiostatina en ausencia de la glutationa.

El uso de D-penicilamina 100 \muM o 1 mM en combinación con u-PA también fue capaz de generar angiostatina (Figura 11).

Finalmente, la incubación del plasminógeno (0,2 \muM) con u-PA (0,2 nM), t-PA (1,0 nM), o con estreptoquinasa (8,0 nM) con N-acetil-L-cisteína 100 \muM, resultó en la producción de angiostatina (Figura 12). El plasminógeno no fue convertido en angiostatina en ausencia de N-acetil-L-cisteína.

Estos datos muestran que el plasminógeno se convierte en angiostatina por cada uno de los activadores clásicos de plasminógeno en presencia de un donante sulfhidrilo, pero no en ausencia del donante sulfhidrilo. Además, estos datos y los datos en el Ejemplo 2 demuestran que la angiostatina se produce en presencia de agentes reductores fisiológicos (L-cisteína, glutationa reducida) y farmacológicos (captopril, D-penicilamina, N-acetil-L-cisteína).

Ejemplo Comparativo 4

Uso de Plasmina para la Generación de Angiostatina

Se incubaron dos microgramos de plasminógeno humano en 100 \mul de TBS con 10 \mul de uPA-Sefarosa (Calbiochem, La Jolla, CA) durante 2 horas a 37ºC. Después de esta incubación, se centrifugó la muestra para sedimentar la uPA-Sefarosa, y se recolectó el sobrenadante que contenía plasmina. La conversión completa de plasminógeno en plasmina fue confirmada por medio de análisis del sobrenadante sobre geles de poliacrilamida reducidos y coloreados con Coomassie. Se incubó entonces la plasmina purificada durante 18 horas a 37ºC con N-acetil-L-cisteína 100 \muM, y se analizaron las muestras por la generación de angiostatina por medio de transferencias de Western (llevado a cabo como se describe en el Ejemplo 1).

Los resultados se muestran en la Figura 13. Estos resultados demuestran que la plasmina es un intermediario necesario en la generación de angiostatina a partir del plasminógeno, y que la angiostatina puede ser producida por medio de incubación de la plasmina purificada con un donante sulfhidrilo.

Ejemplo 5 Tratamiento de Tumores in vivo Con Donantes de Sulfhidrilo, Con y Sin Activador de Plasminógeno

Once ratones desnudos hembra beige (Taconic Labs, Germantown, NY) de 6-8 semanas de edad fueron inyectados en forma subcutánea en el flanco derecho con 1,0 x 10^{6} células de hemangioendotelioma murino (EOMA) (generosamente suministradas por el Dr. Robert Auerbach, Madison, WI) en suero fisiológico amortiguado con 100 \mul de fosfato. Las células tumorales EOMA fueron cultivadas en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), con 100 unidades/ml de penicilina G, y con 100 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) y mantenido a 37ºC en una incubadora húmeda en una atmósfera al 10% de CO_{2}. El día de la inyección de las células tumorales fue designado como el día cero.

Empezando en el día 1, cada uno de los ratones fue inyectado en forma subcutánea dos veces al día con lo
siguiente:

Grupo y Número de Ratones	Tratamiento
Control (5)	Suero fisiológico
NAC (4)	N-acetil-L-cisteína en suero fisiológico (6 mg por inyección)
uPA + NAC (4)	Activador del plasminógeno de tipo uroquinasa en suero fisiológico
	(250 Unidades por inyección) + N-acetil-L-cisteína en suero fisiológico
	(6 mg por inyección)

El tamaño del tumo primario en cada ratón fue medido tres veces por semana utilizando calibradores para tejido, y se determinó el volumen del tumor utilizando la fórmula (ancho^{2} x longitud x 0,52) (O'Reilly y colaboradores, Nature Medicine, 2, 689-692 (1996)). Los resultados se presentan en la Figura 14. Como puede observarse, tanto el tratamiento con NAC como el tratamiento con uPA + NAC disminuyó en forma efectiva y significativa el tamaño medio del tumor en comparación con el grupo de control. Debe observarse que un ratón de control murió el día 10 y otro ratón de control murió el día 17. Ninguno de los ratones tratados con NAC o con uPA + NAC murió durante los 21 días de duración del tratamiento.

Las muestras de plasma tomadas de dos de los ratones de control y de tres de los ratones tratados con NAC el día del sacrificio, fueron evaluadas por angiostatina por medio de transferencias de Western (llevado a cabo como se describe en el Ejemplo 1). Como control, dos ratones fueron inyectados en forma subcutánea con 1,00 mg de angiostatina libre de células, purificada por afinidad dos veces al día comenzando el día 1, 24 horas antes del sacrificio. La angiostatina libre de células, purificada por afinidad fue generada como se describe en el Ejemplo 3, y la columna de Sefarosa con Lisina purificada por afinidad como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 15. Como puede observarse, la administración de NAC a los ratones causó la producción de angiostatina in vivo (Sendas 5, 6 y 7). No se detectó la producción de angiostatina en los ratones de control (Sendas 1 y 2).

Ejemplo Comparativo 6

Determinación de la Secuencia C-Terminal de la Angiostatina Nativa

La angiostatina nativa se generó por la incubación de plasminógeno humano (0,2 \muM) con u-PA humano (0,2 nM) (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) y N-acetil-L-cisteína 100 \muM a 37ºC durante la noche. El material se aplicó entonces a una columna de Sefarosa con lisina (ver Ejemplo 1), y se recolectó el material que fluyó a través suyo y se lo concentró. Se corrieron electroforesis de alícuotas del material concentrado que fluyó a través suyo bajo condiciones no reductoras sobre geles de poliacrilamida al 12% (NOVEX, San Diego, CA) en amortiguador para corrimiento sobre Tris-Glicina, y se lo electrotransfirió a una membrana de difluoruro de polivinileno (PVDF) de 0,45 \mum (Immobilon, Millipore, Bedford, MA), y las proteínas fueron coloreadas con azul de Coomassie.

La membrana coloreada mostró dos bandas muy prominentes de lo que fluyó a través de la columna aproximadamente de 30 kD. Aunque se observaron otras bandas, la coloración de estas bandas fue considerablemente menor que la coloración de las dos bandas de 30 kD, indicando que las dos bandas de 30 kD contenían a los constituyentes predominantes de lo que fluyó a través de la columna.

Se determinaron las secuencias N-terminales de las proteínas en las dos bandas de 30 kD por medio de análisis de microsecuencia como se describe en el Ejemplo 9. La secuencia N-terminal de la más prominente de las dos bandas fue de Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val [SEQ ID NO: 2], mientras que la secuencia de la otra banda era Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val [SEQ ID NO: 3]. La ubicación de estas secuencias en el kringle 5 del plasminógeno (ver Figura 16) y la prominencia de las dos bandas proveyó una evidencia extremadamente fuerte de que estos eran los fragmentos liberados como resultado de la escisión del plasminógeno para formar el C-terminal de la angiostatina nativa.

A partir de las secuencia N-terminales de los dos fragmentos de 30 kD, se dedujo que la secuencia C-terminal de la angiostatina nativa era Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg [SEQ ID NO: 4] o Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys [SEQ ID NO: 5]. Estas secuencias C-terminales se formarían por escisión después del aminoácido 529 (Arg) ó 530 (Lys) de plasminógeno humano, que es un kringle 5 (ver Figura 16), que son conocidos como sitios de escisión de la plasmina. La escisión en este punto daría un fragmento de plasminógeno aproximadamente del peso molecular observado para la angiostatina nativa en la electroforesis sobre el gel de poliacrilamida bajo condiciones no reductoras (50-60 kD).

La secuencia N-terminal de la angiostatina nativa humana [SEQ ID NO: 1] se da más arriba en el Ejemplo 1. Por lo tanto, se dedujo que la angiostatina nativa humana era un fragmento de plasminógeno que incluye la mayor parte del kringle 5 con la secuencia N-terminal.

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly

[SEQ ID NO: 1]

y la secuencia C-terminal

Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg [SEQ ID NO: 4]

o

Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys [SEQ ID NO: 5]

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\hskip3.9cm

Soff, Gerald

\hskip3.9cm

Gately, Stephen

\hskip3.9cm

Twardowski, Przemyslaw

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "Métodos y Composiciones para Generar Angiostatina"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Sheridan Ross P.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1700 Lincoln St., Suite 3500

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Denver

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: CO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CÓDIGO POSTAL: 80203

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Crook, Wannell

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.071

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ASUNTO: 3501-16-PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE MEDIOS DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (303) 863-9700

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (303) 863-0223

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly}

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Tyr Asp Tyr Cys Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 791 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 812 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 333 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

LONGITUD: 809 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 809 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 810 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 812 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 790 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

Claims (7)

1. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de activador de plasminógeno en combinación con un donante sulfhidrilo efectivo para incrementar la cantidad de angiostatina presente en un humano en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neoplásica en un humano que sufra de dicha enfermedad.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el donante sulfhidrilo se selecciona del grupo que consiste de cisteína, N-acetil-L-cisteína, captopril, D-penicilamina y glutationa reducida.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en donde el activador del plasminógeno se selecciona del grupo que consiste de uroquinasa, estreptoquinasa y el activador del plasminógeno del tejido.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la enfermedad neoplásica es un tumor maligno.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde el tumor ha hecho metástasis.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en combinación con plasminógeno.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en combinación con plasmina.