ES2217340T3 - Inhibidor de la proliferacion de celulas endoteliales y utilizacion de este. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA RELACIONADA CON UN INHIBIDOR ENDOTELIAL Y SU METODO DE USO. EL INHIBIDOR DE LA PROLIFERACION DE CELULAS ENDOTELIALES ES UNA PROTEINA QUE TIENE UN PESO MOLECULAR APROXIMADO DE 14 KD Y QUE TIENE UNA SECUENCIA N TERMINAL DE GPVGAGEPKCPLMVKVLDAV, QUE POSEE LA CAPACIDAD DE INHIBIR LA PROLIFERACION DE CELULAS ENDOTELIALES EN LOS ENSAYOS IN VITRO.

Description

Inhibidor de la proliferación de células endoteliales y utilización de éste.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo inhibidor de la proliferación de células endoteliales. El inhibidor es capaz de inhibir enfermedades relacionadas con la angiogénesis y de modular los procesos angiogénicos.

Antecedentes de la invención

Según se utiliza en la presente, el término "angiogénesis" indica la generación de nuevos vasos sanguíneos en un tejido o en un órgano, e implica la proliferación de células endoteliales. Bajo condiciones fisiológicas normales, los humanos o animales experimentan angiogénesis solamente en situaciones restringidas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis se observa normalmente en la cicatrización de heridas, en el desarrollo fetal y embrionario y en la formación del cuerpo lúteo, del endometrio y de la placenta. El término "endotelio" indica una capa fina de células epiteliales planas que tapiza cavidades serosas, vasos linfáticos y vasos sanguíneos.

Se cree que la angiogénesis controlada y la angiogénesis incontrolada tienen lugar de manera similar. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados por una membrana basal, forman los vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana basal por enzimas liberados por las células endoteliales y los leucocitos. Las células endoteliales, que tapizan la luz de los vasos sanguíneos, salen fuera posteriormente a través de la membrana basal. Los estimulantes angiogénicos inducen la migración de las células endoteliales a través de la membrana basal erosionada. Las células que migran forman un "brote" fuera del vaso sanguíneo parental, en el que las células endoteliales sufren mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se funden entre sí para formar bucles capilares, creando el nuevo vaso sanguíneo.

Una angiogénesis persistente, no regulada, tiene lugar en múltiples estados de enfermedad, en las metástasis tumorales y en el crecimiento anormal de células endoteliales, y respalda el daño patológico observado en estas condiciones. Los diversos estados de enfermedad patológicos en los que está presente una angiogénesis no regulada han sido agrupados como enfermedades dependientes de la angiogénesis o enfermedades asociadas a angiogénesis.

La hipótesis de que el crecimiento tumoral es dependiente de la angiogénesis fue propuesta por vez primera en 1971. (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications, N. Engl. Jour. Med. 285:1182-1186, 1971). En sus términos más sencillos manifiesta: "Una vez que ha tenido lugar el "prendimiento" del tumor, cada incremento de la población de células tumorales debe estar precedido por un incremento de nuevos capilares que converjan en el tumor". Se entiende actualmente que el "prendimiento" del tumor indica una fase prevascular del crecimiento tumoral en la que una población de células tumorales que ocupa un volumen de unos pocos milímetros cúbicos y que no excede de unos pocos millones de células, puede sobrevivir de los microvasos del huésped existentes. La expansión del volumen tumoral más allá de esta fase requiere la inducción de nuevos vasos sanguíneos capilares. Por ejemplo, las micrometástasis pulmonares en la fase prevascular temprana en ratones serían indetectables a no ser mediante microscopía de alta potencia en secciones histológicas.

Ejemplos de la evidencia indirecta que apoyan este concepto incluyen:

(1) La velocidad de crecimiento de tumores implantados en cámaras transparentes subcutáneas en ratones es lento y lineal antes de la neovascularización, y rápido y casi exponencial después de la neovascularización. (Algire, G.H. y col., Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6:73-85, 1945).

(2) Tumores crecidos en órganos perfundidos aislados en los que no proliferan los vasos sanguíneos están limitados a 1-2 mm^{3}, pero se expanden rápidamente hasta >1000 veces este volumen cuando son trasplantados a ratones y resultan neovascularizados. (Folkman, J. y col., Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth
and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164:491-502, 1966).

(3) El crecimiento tumoral en la córnea avascular transcurre lentamente y a velocidad lineal, pero cambia a un crecimiento exponencial después de la neovascularización. (Gimbrone, M.A., Jr. y col., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52:41-427, 1974).

(4) Tumores suspendidos en el fluido acuoso de la cámara anterior del ojo del conejo permanecen viables, avasculares y limitados en tamaño a <1 mm^{3}. Una vez que son implantados en el lecho vascular del iris, son neovascularizados y crecen rápidamente, alcanzando 16.000 veces su volumen original en 2 semanas. (Gimbrone, M.A., Jr. y col., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136:261-276).

(5) Cuando se implantan tumores en la membrana corioalantoidea de embrión de pollo, crecen lentamente durante una fase avascular de >72 horas, pero no exceden de un diámetro medio de 0,93 + 0,29 mm. Tiene lugar una rápida expansión del tumor dentro de las 24 horas siguientes a la aparición de neovascularización, y hacia el día 7 estos tumores vascularizados alcanzan un diámetro medio de 8,0 + 2,5 mm. (Knighton, D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1977).

(6) Las formas vasculares de metástasis en el hígado de conejo revelan heterogeneidad en el tamaño de las metástasis, pero muestran un punto de corte relativamente uniforme para el tamaño al cual está presente la vascularización. Los tumores son generalmente avasculares hasta 1 mm de diámetro, pero son neovascularizados por encima de ese diámetro. (Lien, W. y col., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970).

(7) En ratones transgénicos que desarrollan carcinomas en las células beta de los islotes pancreáticos, los islotes hiperplásicos prevasculares están limitados en tamaño hasta <1 mm. A las 6-7 semanas de edad, el 4-10% de los islotes resultan neovascularizados, y a partir de estos islotes se producen grandes tumores vascularizados de más de 1000 veces el volumen de los islotes prevasculares. (Folkman, J. y col., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989).

(8) Un anticuerpo específico contra el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) reduce la densidad de microvasos y produce una inhibición "significativa o radical" del crecimiento de tres tumores humanos que se basan en VEGF como su único mediador de la angiogénesis (en ratones desnudos). El anticuerpo no inhibe el crecimiento de las células tumorales in vitro. (Kim, K.J. y col., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844, 1993).

(9) Un anticuerpo monoclonal anti-bFGF produce el 70% de inhibición del crecimiento de un tumor de ratón que depende de la secreción de bFGF como su único mediador de angiogénesis. El anticuerpo no inhibe el crecimiento de las células tumorales in vitro. (Hori, A. y col., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research 51:6180-6184, 1991).

(10) La inyección intraperitoneal de bFGF incrementa el crecimiento de un tumor primario y sus metástasis mediante la estimulación del crecimiento de células endoteliales capilares en el tumor. Las propias células del tumor carecen de receptores para bFGF, y el bFGF no es un mitógeno para las células tumorales in vitro. (Gross, J.L. y col., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79, 1990).

(11) Un inhibidor específico de la angiogénesis (AGM-1470) inhibe el crecimiento del tumor y las metástasis in vivo, pero es mucho menos activo para inhibir la proliferación de las células tumorales in vitro. Inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares de forma semimáxima a una concentración 4 logs menor que la que inhibe la proliferación de células tumorales. (Ingber, D. y col., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature 48:555-557, 1990). Existe también una evidencia clínica indirecta de que el crecimiento tumoral es dependiente de la angiogénesis.

(12) Retinoblastomas humanos que son metastásicos para el vítreo se desarrollan para dar esferoides avasculares que están limitados a menos de 1 mm^{3}, a pesar del hecho de que son viables e incorporan ^{3}H-timidina (cuando son extraídos de un ojo enucleado y analizados in vitro).

(13) El carcinoma de ovario metastatiza la membrana peritoneal en forma de pequeñas semillas blancas avasculares (1-3 mm^{3}). Estos implantes raramente crecen para hacerse más grandes hasta que uno o más de los mismos resultan neovascularizados.

(14) La intensidad de la neovascularización en cáncer de mama (Weidner, N. y col., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991, y Weidner, N. y col., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992) y en cáncer de próstata (Weidner, N., Carroll, P.R., Flax, J., Blumenfeld, W., Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993) se correlaciona enormemente con el riesgo de futuras metástasis.

(15) La metástasis a partir de melanoma cutáneo humano es rara antes de la neovascularización. La aparición de neovascularización conduce a un grosor incrementado de la lesión y a un riesgo creciente de metástasis. (Srivastava, A. y col., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76-4.0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988).

(16) En cáncer de vejiga, el nivel urinario de un péptido angiogénico, bFGF, es un indicador del estado y el grado de la enfermedad más sensible que la citología. (Nguyen, M. y col., Elevated levels of an angiogenic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85:241-242, 1993).

Por tanto, está claro que la angiogénesis tiene un papel principal en la metástasis de un cáncer. Si esta actividad angiogénica pudiera ser reprimida o eliminada, o controlada y modulada de otro modo, entonces el tumor, aunque estuviera presente, no crecería. En el estado de enfermedad, la prevención de la angiogénesis podría impedir el daño causado por la invasión del nuevo sistema microvascular. Las terapias dirigidas al control del proceso angiogénico podrían conducir a la eliminación o a la mitigación de estas enfermedades.

Por tanto, lo que se necesita es una composición y un uso terapéutico que puedan inhibir la proliferación de células endoteliales tal como el crecimiento no deseado de vasos sanguíneos, especialmente en tumores.

La composición debe ser capaz de vencer la actividad de los factores de crecimiento endógenos en los tumores premetastásicos e impedir la formación de capilares en los tumores, inhibiendo de este modo el crecimiento de los tumores. La composición debe también poder modular la formación de capilares en otros procesos angiogénicos, tales como la cicatrización de heridas y la reproducción. La composición y el uso terapéutico para inhibir la angiogénesis deben ser preferiblemente no tóxicos y producir pocos efectos colaterales.

Resumen de la invención

La presente invención incluye la utilización de la región Kringle 5 del plasminógeno aislada con el fin de fabricar un medicamento para inhibir la actividad proliferativa de células endoteliales. El fragmento peptídico Kringle 5 aislado que tiene actividad inhibidora comprende una secuencia de ochenta (80) aminoácidos aproximadamente:

CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRK
LYDYCDVPQ

\hskip-0.5cm en la cual	C = Cys	Y = Tyr	D = Asp
	M = Met	R = Arg	W = Trp
	F = Phe	T = Thr	H = His
	G = Gly	V = Val	S = Ser
	N = Asn	P = Pro	I = Ile
	K = Lys	Q = Gln	A = Ala
	E = Glu	L = Leu

El péptido inhibidor de la proliferación de células endoteliales corresponde a un fragmento peptídico generado a partir del plasminógeno humano, comenzando en el aminoácido 462 del plasminógeno humano y extendiéndose 80 aminoácidos.

La presente invención incluye también la administración terapéutica del péptido a pacientes con necesidad de cantidades terapéuticamente eficaces de tales compuestos para regular la proliferación de células endoteliales.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición conteniendo un inhibidor de la proliferación de células endoteliales que comprende un fragmento peptídico de 80 aminoácidos del plasminógeno humano correspondiente a la región Kringle 5 que comienza en el aminoácido 462 del plasminógeno humano.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades y procesos que estén mediados por la proliferación de células endoteliales, especialmente la angiogénesis.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un uso terapéutico y una composición para el tratamiento de enfermedades y procesos que están mediados por la angiogénesis, incluyendo, pero sin limitarse a, hemangioma, tumores sólidos, leucemia, metástasis, telangiectasia, psoriasis, escleroderma, granuloma piogénico, angiogénesis miocárdica, neovascularización de la placa, colaterales coronarios, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis en miembros isquémicos, enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, artritis, neovascularización diabética, degeneración macular, cicatrización de heridas, úlcera péptica, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas, queloides, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación, placentación y fiebre por arañazo de gato.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición para tratar o reprimir el crecimiento de un cáncer.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un medicamento para la terapia del cáncer que tenga mínimos efectos colaterales.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán obvios después de una revisión de la descripción detallada siguiente de las realizaciones descritas y de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la inhibición de la proliferación de células endoteliales como porcentaje del cambio del número de células como función de la concentración del fragmento peptídico Kringle 5 aislado del plasminógeno humano añadido a las células.

La Figura 2 muestra un análisis de electroforesis en gel de una preparación del fragmento peptídico Kringle 5 aislado del plasminógeno humano. La Calle 1 es Kringle 5 aislado; la Calle 2 son marcadores de peso molecular.

La Figura 3 muestra una comparación de aminoácidos de las regiones Kringle 1, 2, 3, 4 y 5 del plasminógeno humano.

La Figura 4 muestra la actividad anti-proliferativa de células endoteliales del Kringle 5 del plasminógeno humano, con o sin ácido aminocarbónico (AMCHA), demostrando que los sitios de unión de lisina no eran responsables de la actividad anti-proliferativa de células endoteliales de Kringle 5.

La Figura 5 muestra el efecto inhibidor del Kringle 5 recombinante sobre la proliferación de células endoteliales bovinas.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones y usos terapéuticos que son eficaces para inhibir la proliferación de células endoteliales, para modular la angiogénesis y para inhibir la angiogénesis no deseada, especialmente la angiogénesis relacionada con el crecimiento tumoral. La presente invención incluye un inhibidor proteico de la proliferación de células endoteliales, caracterizado como una secuencia de 80 aminoácidos aproximadamente derivable del plasminógeno humano como Kringle 5. La secuencia de aminoácidos del inhibidor puede variar ligeramente entre especies.

La presente invención proporciona usos terapéuticos y composiciones para tratar enfermedades y procesos mediados por una proliferación no deseada e incontrolada de células epiteliales, tal como la angiogénesis, mediante la administración a un humano o a un animal, que tenga una proliferación no deseada de células endoteliales, de una composición conteniendo Kringle 5 del plasminógeno humano capaz de inhibir la proliferación de células endoteliales en ensayos in vitro. Es deseable que la proteína aislada sea al menos un 80% aproximadamente pura, más deseablemente al menos un 90% aproximadamente pura, e incluso más deseable al menos un 95% aproximadamente pura. La presente invención es particularmente útil para la fabricación de un medicamento para tratar o para reprimir el crecimiento de tumores. La administración de dicho medicamento a un humano o a un animal con tumores metastatizados prevascularizados ayuda a prevenir el crecimiento o la expansión de esos tumores.

Además, el inhibidor es combinado con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con compuestos o composiciones de liberación mantenida, tales como polímeros y matrices biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.

Más particularmente, la presente invención incluye composiciones y usos terapéuticos para la detección y el tratamiento de enfermedades y procesos que estén mediados por, o asociados con, la proliferación de células endoteliales, tales como la angiogénesis. El fragmento peptídico Kringle 5 aislado que tiene actividad inhibidora comprende una secuencia de ochenta (80) aminoácidos aproximadamente:

CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRK
LYDYCDVPQ

\hskip-0.5cm en la cual	C = Cys	Y = Tyr	D = Asp
	M = Met	R = Arg	W = Trp
	F = Phe	T = Thr	H = His
	G = Gly	V = Val	S = Ser
	N = Asn	P = Pro	I = Ile
	K = Lys	Q = Gln	A = Ala
	E = Glu	L = Leu

El inhibidor puede ser aislado de plasminógenos, tal como el plasminógeno humano, o sintetizado mediante métodos químicos o biológicos (por ejemplo cultivo celular, expresión génica recombinante, síntesis peptídica y catálisis enzimática in vitro de plasminógeno o plasmina para producir el inhibidor activo). Las técnicas recombinantes incluyen amplificación génica a partir de fuentes de ADN utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la amplificación génica a partir de fuentes de ARN utilizando transcriptasa inversa/PCR.

Una composición conteniendo un vector que comprenda una secuencia de ADN puede codificar el inhibidor de la proliferación de células endoteliales, en la que el vector es capaz de expresar el inhibidor cuando está presente en una célula; una composición conteniendo una célula que comprenda un vector, en la que el vector contiene una secuencia de ADN que codifica el inhibidor o fragmentos o análogos del mismo, y en la que el vector es capaz de expresar el inhibidor cuando está presente en la célula.

El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente homóloga" cuando se utiliza en relación a la secuencia de aminoácidos y a la secuencia de ácido nucleico del inhibidor, indica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad inhibidora de la proliferación de células endoteliales y que tiene un peso molecular de aproximadamente, que tiene también un alto grado de homología de secuencias con la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal específica aquí descrita, o una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la proliferación de células endoteliales que tiene un peso molecular de aproximadamente y un alto grado de homología con la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal específica descrita en la presente.

Un alto grado de homología significa al menos un 80% aproximadamente de homología de aminoácidos, deseablemente al menos un 90% de homología de aminoácidos aproximadamente y más deseablemente al menos un 95% de homología de aminoácidos aproximadamente. El término "actividad inhibidora endotelial", según se utiliza en la presente, indica la capacidad de una molécula para inhibir la angiogénesis en general y, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de células endoteliales de capilares bovinos en cultivo en presencia de un factor de crecimiento de fibroblastos.

La presente invención incluye también la utilización de un inhibidor aislado, o de un inhibidor purificado deseable, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades y procesos angiogénicos incluyendo, pero sin limitarse a, artritis y tumores.

En terapia génica, el gen que codifica el inhibidor está regulado en un paciente. Varios métodos para transferir o administrar ADN a células para la expresión del producto génico proteico, referidos por otra parte como terapia génica, están descritos en Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 (1992), que se incorpora a la presente por referencia. La terapia génica incluye la incorporación de secuencias de ADN a células somáticas o a células de la línea germinal para utilización en terapia ex vivo o in vivo. La terapia génica funciona sustituyendo genes, aumentando la función génica normal o anormal y combatiendo enfermedades infecciosas y otras patologías.

Las estrategias para tratar estos problemas médicos con terapia génica incluyen estrategias terapéuticas tales como la identificación del gen defectuoso y la adición posterior de un gen funcional para sustituir la función del gen defectuoso o bien para aumentar un gen ligeramente funcional; o estrategias profilácticas, tales como la adición de un gen para el producto proteico que tratará la condición o que hará al tejido o al órgano más susceptible a un régimen de tratamiento. Como ejemplo de estrategia profiláctica, una secuencia de ácido nucleico que codifique el inhibidor puede ser colocada en un paciente y de este modo se prevendrá la aparición de angiogénesis; o puede insertarse un gen que haga a las células tumorales más susceptibles a la radiación y posteriormente la irradiación del tumor producirá una destrucción incrementada de las células tumorales.

Muchos protocolos para transferir el ADN inhibidor o las secuencias reguladoras del inhibidor están previstos en esta invención. Se prevén también como métodos de terapia génica la transfección de secuencias promotoras distintas de las encontradas normalmente asociadas específicamente con el inhibidor, o de otras secuencias que incrementarán la producción de la proteína inhibidora. Un ejemplo de esta tecnología se encuentra en Transkaryotic Therapies, Inc., de Cambridge, Massachusetts, utilizando recombinación homóloga para insertar un "interruptor genético" que "enciende" un gen de la eritropoyetina en las células. Ver Genetic Engineering News, 15 de Abril de 1994. Tales "interruptores genéticos" podrían ser utilizados para activar el inhibidor (o el receptor del inhibidor) en células que no expresan normalmente el inhibidor (o el receptor del inhibidor).

Los métodos de transferencia de genes para terapia génica se dividen en tres categorías generales - físicos (por ejemplo, electroporación, transferencia génica directa y bombardeo de partículas), químicos (transportadores basados en lípidos u otros vectores no víricos) y biológicos (vector derivado de un virus y captación por receptores). Por ejemplo, pueden utilizarse vectores no víricos que incluyen liposomas revestidos con ADN. Tales complejos liposoma/ADN pueden ser inyectados directamente en el paciente por vía intravenosa. Se cree que los complejos liposoma/ADN se concentran en el hígado, donde suministran el ADN a los macrófagos y a las células de Kupffer. Estas células tienen una larga vida y proporcionan por tanto una expresión de larga duración del ADN administrado. Adicionalmente, los vectores o el ADN "desnudo" del gen pueden ser inyectados directamente en el órgano, tejido o tumor deseado para la administración dirigida del ADN terapéutico.

Las metodologías de terapia génica pueden ser también descritas por el lugar de administración. Las formas fundamentales para administrar genes incluyen transferencia génica ex vivo, transferencia génica in vivo y transferencia génica in vitro. En la transferencia génica ex vivo, se toman células del paciente y se hacen crecer en un cultivo celular. El ADN es transfectado a las células, las células transfectadas son expandidas en número y posteriormente reimplantadas al paciente. En la transferencia génica in vitro, las células transformadas son células que crecen en cultivo, tal como células de un cultivo de tejidos, y no son células particulares de un paciente particular. Estas "células de laboratorio" son transfectadas, las células transfectadas son seleccionadas y expandidas para su implantación a un paciente o para otros usos.

La transferencia génica in vivo implica la introducción del ADN en las células del paciente cuando las células están en el paciente. Los métodos incluyen la utilización de transferencia de genes mediada por un virus, empleando un virus no infeccioso para administrar el gen al paciente o la inyección de ADN desnudo en un lugar del paciente, y el ADN es captado por un porcentaje de células en las cuales se expresa la proteína producto del gen. Adicionalmente, los demás métodos aquí descritos, tales como la utilización de una "pistola de genes", pueden ser utilizados para la inserción in vitro del ADN del inhibidor de la proliferación de células endoteliales o de secuencias reguladoras del inhibidor.

Los métodos químicos de terapia génica pueden implicar un compuesto basado en lípidos, no necesariamente un liposoma, para transportar el ADN a través de la membrana celular. Las lipofectinas o citofectinas, iones positivos basados en lípidos que se unen a ADN cargado negativamente, forman un complejo que puede atravesar la membrana celular y proporcionar el ADN al interior de la célula. Otro método químico utiliza endocitosis basada en receptores, la cual implica la unión de un ligando específico a un receptor de la superficie celular y la envoltura y transporte del mismo a través de la membrana celular. El ligando se une al ADN y el complejo completo es transportado a la célula. El complejo ligando-gen es inyectado en el torrente sanguíneo y posteriormente las células diana que tienen el receptor se unirán específicamente al ligando y transportarán el complejo ligando-ADN a la célula.

Muchas metodologías de terapia génica emplean vectores víricos para insertar genes en las células. Por ejemplo, se han utilizado vectores retrovíricos alterados en métodos ex vivo para introducir genes en linfocitos periféricos y en linfocitos que se infiltran en los tumores, en hepatocitos, células epidérmicas, miocitos u otras células somáticas. Estas células alteradas son luego introducidas en el paciente para proporcionar el producto génico procedente del ADN insertado.

Se han utilizado también vectores víricos para insertar genes en células utilizando protocolos in vivo. Para dirigir la expresión específica de un tejido de genes foráneos, pueden utilizarse elementos reguladores o promotores que actúan en cis y que se sabe que son específicos de un tejido. Alternativamente, esto puede realizarse utilizando la administración in situ de ADN o de vectores víricos en lugares anatómicos específicos in vivo. Por ejemplo, se ha conseguido la transferencia de genes a vasos sanguíneos in vivo mediante la implantación in vitro de células endoteliales transducidas en lugares elegidos de las paredes arteriales. El virus infectaba las células circundantes que expresaban también el producto génico. Un vector vírico puede ser administrado directamente al lugar in vivo, por ejemplo mediante un catéter, permitiendo de este modo que sean infectadas solamente ciertas áreas por el virus y proporcionando una expresión génica específica de un sitio, de larga duración. Se ha demostrado también la transferencia génica in vivo utilizando vectores retrovíricos en tejido mamario y en tejido hepático mediante la inyección del virus alterado en los vasos sanguíneos que se dirigen a los órganos.

Los vectores víricos que han sido utilizados para protocolos de terapia génica incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, otros virus de ARN tales como el virus de la polio o el virus Sindbis, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, SV40, vaccinia y otros virus de ADN. Los vectores retrovíricos murinos con replicación defectuosa son los vectores de transferencia génica más ampliamente utilizados. Los retrovirus de la leucemia murina están compuestos por un ARN de hebra sencilla que forma un complejo con una proteína "core" nuclear y enzimas polimerasa (pol), revestidos por una proteína "core" (gag) y rodeados por una envoltura glicoproteica (env) que determina el rango del huésped. La estructura genómica de los retrovirus incluye los genes gag, pol y env protegidos por las repeticiones terminales largas (LTR) 5' y 3'. Los sistemas de vectores retrovíricos aprovechan el hecho de que un vector mínimo que contenga las LTRs 5' y 3' y la señal de empaquetamiento es suficiente para permitir el empaquetamiento del vector, la infección y la integración en las células diana, con la condición de que las proteínas estructurales víricas sean suministradas in trans en la línea celular de empaquetamiento. Las ventajas fundamentales de los vectores retrovíricos para la transferencia génica incluyen una infección y una expresión génica eficaces en la mayoría de los tipos celulares, la integración precisa de una sola copia del vector en el ADN cromosómico de la célula diana y la facilidad de manipulación del genoma retrovírico.

El adenovirus está compuesto por ADN lineal de doble hebra acomplejado con proteínas "core" y rodeado por las proteínas de la cápsida. Los avances en la virología molecular han conducido a la capacidad para aprovechar la biología de estos organismos con el fin de crear vectores capaces de transducir nuevas secuencias genéticas a células diana in vivo. Los vectores basados en adenovirus expresarán los productos génicos peptídicos a niveles elevados. Los vectores adenovíricos tienen elevadas eficacias de infectividad, incluso con títulos bajos de virus. Adicionalmente, el virus es totalmente infectivo como un virión sin células, de tal manera que no es necesaria la inyección de líneas celulares productoras. Otra ventaja potencial de los vectores adenovíricos es la capacidad para conseguir la expresión de larga duración de genes heterólogos in vivo.

Los métodos mecánicos de administración de ADN incluyen las vesículas lipídicas fusogénicas tales como liposomas u otras vesículas que se funden a la membrana, partículas lipídicas de ADN que incorporan un lípido catiónico tal como lipofectina, la transferencia de ADN mediada por polilisina, la inyección directa de ADN tal como microinyección de ADN en células germinales o somáticas, partículas revestidas con ADN administradas neumáticamente, tales como las partículas de oro utilizadas en una "pistola de genes", y planteamientos de química inorgánica tales como la transfección con fosfato de calcio. Otro método, la terapia génica mediada por un ligando, implica la formación del complejos del ADN con ligandos específicos para formar conjugados ligando-ADN con el fin de dirigir el ADN a una célula o tejido específico.

Se ha encontrado que la inyección de ADN plasmídico en células musculares hace que un alto porcentaje de las células que han sido transfectadas tengan una expresión mantenida de los genes marcadores. El ADN del plásmido puede integrarse o no en el genoma de las células. La no integración del ADN transfectado permitirá la transfección y la expresión de las proteínas producto del gen en tejidos no proliferativos terminalmente diferenciados durante un periodo prolongado de tiempo sin peligro de mutaciones por inserciones, deleciones o alteraciones del genoma celular o mitocondrial. La transferencia de genes terapéuticos de larga duración, pero no necesariamente permanente, a células específicas puede proporcionar tratamientos para enfermedades genéticas o para uso profiláctico. El ADN podría ser reinyectado periódicamente con el fin de mantener el nivel del producto génico sin que tengan lugar mutaciones en los genomas de las células receptoras. La no integración de ADNs exógenos puede permitir la presencia de varias construcciones de ADN exógeno diferentes en una célula, expresando todas las construcciones varios productos génicos.

Los métodos de transferencia génica mediada por partículas fueron utilizados por vez primera para transformar tejidos vegetales. Con un dispositivo de bombardeo de partículas, o una "pistola de genes", se genera una fuerza motriz para acelerar partículas de alta densidad revestidas con ADN (tales como partículas de oro o tungsteno) hasta una velocidad elevada que permite la penetración de los órganos, tejidos o células diana. El bombardeo de partículas puede ser utilizado en sistemas in vitro o con técnicas ex vivo o in vivo para introducir ADN en células, tejidos u órganos.

La electroporación para transferencia génica utiliza una corriente eléctrica para hacer a las células o tejidos susceptibles a la transferencia génica mediada por electroporación. Se utiliza un breve impulso eléctrico con una intensidad de campo dada para incrementar la permeabilidad de una membrana, de tal manera que puedan penetrar en las células las moléculas de ADN. Esta técnica puede ser utilizada en sistemas in vitro o con técnicas ex vivo o in vivo para introducir ADN en células, tejidos u órganos.

La transferencia génica in vivo mediada por un transportador puede ser utilizada para transfectar ADN foráneo a las células. El complejo transportador-ADN puede ser introducido convenientemente en fluidos corporales o en la corriente sanguínea y posteriormente dirigido al órgano o tejido diana en el organismo de manera específica de un sitio. Pueden utilizarse liposomas y policationes tales como polilisina, lipofectinas o citofectinas. Pueden desarrollarse liposomas que sean específicos de una célula o específicos de un órgano y de este modo el ADN foráneo transportado por el liposoma será captado por las células diana. Puede utilizarse la inyección de inmunoliposomas que estén dirigidos a un receptor específico en ciertas células como un método idóneo para insertar el ADN en las células portadoras del receptor. Otro sistema transportador que ha sido utilizado es el sistema conjugado de asialoglicoproteína/polilisina con el fin de transportar ADN a hepatocitos para transferencia génica in vivo.

El ADN transfectado puede estar también formando complejos con otros tipos de transportadores, de tal manera que el ADN sea llevado a la célula receptora y resida luego en el citoplasma o en el núcleoplasma. El ADN puede ser acoplado a proteínas nucleares transportadoras en complejos de vesículas construidos específicamente y transportado directamente al núcleo.

La regulación génica del inhibidor de la presente invención puede ser realizada administrando compuestos que se unan al gen que codifica el inhibidor, o a regiones control asociadas con el gen, o a su correspondiente transcrito de ARN, con el fin de modificar la tasa de transcripción o de traducción. Adicionalmente, pueden administrarse a un paciente células transfectadas con una secuencia de ADN que codifique el inhibidor con el fin de proporcionar una fuente de inhibidor in vivo. Por ejemplo, las células pueden ser transfectadas con un vector que contenga una secuencia de ácido nucleico que codifique el inhibidor.

El término "vector", según se utiliza en la presente, indica un transportador que contiene o está asociado con secuencias de un ácido nucleico específico y que funciona transportando a una célula las secuencias del ácido nucleico específico. Ejemplos de vectores incluyen plásmidos y microorganismos infectivos tales como virus, o vectores no víricos, tales como conjugados ligando-ADN, liposomas y complejos lípido-ADN. Puede ser deseable que una molécula de ADN recombinante conteniendo una secuencia de ADN del inhibidor de la proliferación de células endoteliales esté unida operativamente a una secuencia para el control de la expresión con el fin de formar un vector de expresión capaz de expresar el inhibidor. Las células transfectadas pueden ser células derivadas del tejido normal del paciente, del tejido enfermo del paciente, o pueden ser incluso células que no sean del paciente.

Por ejemplo, células tumorales extraídas de un paciente pueden ser transfectadas con un vector capaz de expresar la proteína inhibidora de la presente invención y reintroducidas en el paciente. Las células tumorales transfectadas producen niveles de inhibidor en el paciente que inhiben el crecimiento del tumor. Los pacientes pueden ser animales humanos o no humanos. Adicionalmente, el ADN del inhibidor puede ser inyectado directamente en un paciente sin la ayuda de un transportador. En particular, el ADN del inhibidor puede ser inyectado en la piel, en el músculo o en la sangre.

La expresión del inhibidor puede continuar durante un largo periodo de tiempo, o el ADN del inhibidor puede ser administrado periódicamente para mantener un nivel deseado de la proteína inhibidora en la célula, el tejido o el órgano o el fluido biológico.

Aunque no se desea estar limitado por la hipótesis siguiente, se cree que cuando un tumor resulta angiogénico libera uno o más péptidos angiogénicos (por ejemplo, aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF, etc.), que actúan localmente, se dirigen al endotelio en las proximidades de un tumor primario desde una dirección extravascular y no circulan (o circulan con una semivida corta). Estos péptidos angiogénicos deben ser producidos en una cantidad suficiente para superar la acción del inhibidor de células endoteliales (inhibidores de la angiogénesis) con el fin de que un tumor primario continúe expandiendo su población. Una vez que tal tumor primario está creciendo bien, continua liberando a la circulación inhibidores de las células endoteliales. Según esta hipótesis, estos inhibidores actúan remotamente a cierta distancia del tumor primario, se dirigen al endotelio capilar de una metástasis desde una dirección intravascular, y continúan circulando. Por tanto, justo en el momento en que una metástasis remota podría comenzar a iniciar la angiogénesis, el endotelio capilar en su proximidad podría ser inhibido por el inhibidor entrante.

La producción del inhibidor de la proliferación de células endoteliales puede ser realizada utilizando técnicas de ADN recombinante que incluyen las etapas de (1) identificación y purificación del inhibidor según se describe en la presente y está ejemplificado por las Figuras, (2) determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal del inhibidor purificado, (3) la producción sintética de cebadores oligonucleotídicos de ADN 5' y 3' para la secuencia del inhibidor, (4) amplificación de la secuencia génica del inhibidor utilizando polimerasa, (5) inserción de la secuencia amplificada en un vector apropiado tal como un vector de expresión, (6) inserción del vector que contiene el gen en un microorganismo o en otro sistema de expresión capaz de expresar el gen del inhibidor y (7) aislamiento del inhibidor producido recombinantemente. Los vectores apropiados incluyen vectores de expresión víricos, bacterianos y eucarióticos (tales como levaduras). Las técnicas anteriores están descritas más detalladamente en manuales de laboratorio tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Segunda Edición, por Sambrook y col., Cold Spring Harbor Press, 1989, que se incorpora a la presente por referencia.

Otro método más para producir el inhibidor o fragmentos del mismo biológicamente activos, es mediante síntesis peptídica. La secuencia de aminoácidos del inhibidor puede ser determinada, por ejemplo, mediante métodos de secuenciación peptídica automatizados. Alternativamente, una vez que se ha aislado el gen o la secuencia de ADN que codifica el inhibidor, por ejemplo mediante los métodos anteriormente descritos, la secuencia de ADN puede ser determinada utilizando métodos de secuenciación manuales o automatizados bien conocidos en la técnica. La secuencia del ácido nucleico proporciona a su vez información referente a la secuencia de aminoácidos.

Un vez que se conoce la secuencia de aminoácidos del péptido, pueden sintetizarse fragmentos peptídicos mediante técnicas bien conocidas en el oficio, según está ejemplificado por "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton y R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford, Inglaterra. Pueden sintetizarse múltiples fragmentos que son posteriormente ligados entre sí para formar fragmentos más grandes. Estos fragmentos peptídicos sintéticos pueden ser también producidos con sustituciones de aminoácidos en localizaciones específicas con el fin de analizar la actividad agonista o antagonista in vitro e in vivo. Los fragmentos peptídicos que posean una alta afinidad de unión a tejidos pueden ser utilizados para aislar receptores que se unan al inhibidor en columnas de afinidad.

El inhibidor es eficaz para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o procesos, tales como la angiogénesis, que están mediados por, o implican, la proliferación de células endoteliales. La presente invención incluye la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por angiogénesis mediante la utilización de una cantidad eficaz del inhibidor, o de un fragmento del mismo biológicamente activo, o de combinaciones de fragmentos del inhibidor que posean colectivamente actividad antiangiogénica, o de agonistas o antagonistas del inhibidor. Las enfermedades mediadas por angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos; tumores ligados a la sangre tales como leucemias; metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de trasplantes corneales, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de la placa; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma y granulación de heridas.

El inhibidor es útil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de una estimulación excesiva o anormal de células endoteliales. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, adherencias intestinales, aterosclerosis, escleroderma y cicatrices hipertróficas, esto es, queloides. El inhibidor puede ser utilizado como un agente para el control del nacimiento impidiendo la vascularización requerida para la implantación del embrión. El inhibidor es útil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que tengan angiogénesis como una consecuencia patológica, tal como la enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori).

Los fragmentos peptídicos sintéticos del inhibidor tiene una variedad de usos. El péptido que se une a un receptor capaz de unirse al inhibidor con una elevada especificidad y avidez es radiomarcado y empleado para visualizar y cuantificar los sitios de unión utilizando técnicas autorradiográficas y de unión a membranas.

Agentes citotóxicos tales como la ricina, son unidos al inhibidor y a fragmentos peptídicos del mismo con alta afinidad, proporcionando de este modo una herramienta para la destrucción de las células que se unen al inhibidor. Estas células pueden ser encontradas en muchas localizaciones incluyendo, pero sin limitarse a, micrometástasis y tumores primarios. Los péptidos unidos a agentes citotóxicos son infundidos de una manera diseñada para maximizar la administración a la localización deseada. Por ejemplo, la administración puede ser realizada a través de una cánula en los vasos que irrigan el sitio diana o directamente en la diana. Tales agentes son también administrados de una manera controlada a través de bombas osmóticas acopladas a cánulas de infusión. Una combinación de antagonistas del inhibidor puede ser coaplicada con estimuladores de la angiogénesis con el fin de incrementar la vascularización del tejido. Este régimen terapéutico proporciona un medio eficaz para destruir el cáncer metastásico.

El inhibidor puede ser utilizado en combinación con otras composiciones y procedimientos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un tumor puede ser tratado de manera convencional con cirugía, radiación o quimioterapia combinadas con dicho medicamento, y posteriormente puede administrarse subsiguientemente al paciente dicho medicamento para prolongar el estado latente de las micrometástasis y para estabilizar e inhibir el crecimiento de cualquier tumor primario residual. Adicionalmente, el inhibidor, fragmentos del mismo, antisueros específicos del inhibidor, agonistas y antagonistas de receptores del inhibidor, o combinaciones de los mismos, son combinados con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con una matriz de liberación mantenida, tal como polímeros biodegradables, con el fin de formar composiciones terapéuticas.

Una matriz de liberación mantenida, según se utiliza en la presente, es una matriz compuesta de materiales, normalmente polímeros, que son degradables mediante hidrólisis enzimática o mediante hidrólisis ácida/básica o por disolución. Una vez insertada en el organismo, actúan sobre la matriz enzimas y fluidos corporales. La matriz de liberación mantenida es elegida deseablemente de materiales biocompatibles tales como liposomas, poliláctidos (ácido poliláctico), poliglicólido (polímero del ácido glicólico), coglicólido de poliláctido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), polianhídridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, condroitín sulfato, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinil pirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de cualquiera de los siguientes: poliláctido, poliglicólido o coglicólido de poliláctido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).

La composición terapéutica moduladora de la angiogénesis de la presente invención puede ser un sólido, un líquido o un aerosol y puede ser administrada mediante cualquier vía de administración conocida. Ejemplos de composiciones terapéuticas sólidas incluyen píldoras, cremas y unidades de dosificación implantables. Las píldoras pueden ser administradas oralmente, las cremas terapéuticas pueden ser administradas tópicamente. Las unidades de dosificación implantables pueden ser administradas localmente, por ejemplo en un sitio tumoral, o pueden ser implantadas para la liberación sistémica de la composición terapéutica moduladora de la angiogénesis, por ejemplo subcutáneamente. Ejemplos de composiciones líquidas incluyen formulaciones adaptadas para inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial y formulaciones para administración tópica e intraocular. Ejemplos de una formulación para aerosol incluyen una formulación de inhalador para la administración a los pulmones.

La presente invención incluye proteínas con actividad inhibidora que tienen sustituciones de aminoácidos o que tienen azúcares u otras moléculas unidas a grupos funcionales de aminoácidos.

Las proteínas con actividad inhibidora descritas anteriormente pueden ser proporcionadas como proteínas aisladas y sustancialmente purificadas en formulaciones farmacéuticamente aceptables utilizando métodos de formulación conocidos por aquellas personas con experiencia habitual en la técnica. Estas formulaciones pueden ser administradas por las vías estándar. En general, las combinaciones pueden ser administradas por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutánea o intramuscular). Además, el inhibidor puede ser incorporado a polímeros biodegradables que permitan la liberación mantenida del compuesto, siendo implantados los polímeros en la proximidad del lugar en el que se desea la administración del fármaco, por ejemplo en el lugar de un tumor, o implantados de tal manera que el inhibidor sea liberado lentamente por vía sistémica. Pueden utilizarse también minibombas osmóticas para proporcionar la administración controlada de altas concentraciones del inhibidor a través de una cánula en el lugar de interés, tal como directamente en un crecimiento metastásico o en la irrigación vascular de ese tumor. Los polímeros biodegradables y su utilización están descritos con detalle en, por ejemplo, Brem y col., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991), que se incorpora de este modo a la presente por referencia en su totalidad.

La dosificación del inhibidor de la presente invención dependerá del estado o condición de la enfermedad y de otros factores clínicos tales como el peso y la condición del humano o del animal y de la vía de administración del medicamento. Para el tratamiento de humanos o animales, pueden utilizarse entre 0,5 mg/kilogramo a 500 mg/kilogramo del inhibidor aproximadamente. Dependiendo de la semivida del inhibidor en el animal o humano particular, el inhibidor puede ser utilizado desde varias veces al día hasta una vez a la semana. Debe comprenderse que la presente invención tiene aplicación para uso humano y para uso veterinario. Los usos terapéuticos de la presente invención contemplan administraciones individuales así como administraciones múltiples, dadas simultáneamente o a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

Las formulaciones del inhibidor incluyen todas aquellas adecuadas para administración oral, rectal, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), intrauterina, vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intracraneal, intratraqueal y epidural). Las formulaciones del inhibidor pueden ser presentadas adecuadamente en forma de dosificación unidad y pueden ser preparadas mediante técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo y el(los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones son preparadas asociando uniformemente e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o con vehículos sólidos finamente divididos, o con ambos, y posteriormente, si es necesario, dando forma al producto.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que conviertan la formulación en isotónica respecto a la sangre del receptor deseado; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en recipientes de dosis unidad o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales cerrados herméticamente, y pueden ser almacenadas en una condición congelada y deshidratada (liofilizada) que requiera solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de su utilización. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo previamente descrito.

Las formulaciones de dosificación unidad preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, una subdosis diaria o una fracción de la misma apropiada, del ingrediente administrado. Debe comprenderse que además de los ingredientes, particularmente de los mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica considerando el tipo de formulación en cuestión. Opcionalmente, pueden incorporarse o combinarse de otro modo agentes citotóxicos con las proteínas inhibidoras o con fragmentos peptídicos de las mismas biológicamente funcionales, con el fin de proporcionar una terapia doble al paciente.

Los péptidos inhibidores de la angiogénesis de la presente invención pueden ser sintetizados en unas dependencias estándar de microquímica y la pureza puede ser comprobada con HPLC y espectrofotometría de masas. Los métodos de síntesis peptídica, la purificación por HPLC y por espectrometría de masas son conocidos comúnmente por las personas expertas en estas técnicas. Los péptidos inhibidores y los péptidos receptores de los inhibidores son también producidos en E. coli recombinante o en sistemas de expresión de levaduras, y purificados mediante cromatografía en columna.

Pueden sintetizarse diferentes fragmentos peptídicos de la molécula inhibidora intacta para su utilización en varias aplicaciones incluyendo, pero sin limitarse a, las siguientes: como antígenos para el desarrollo de antisueros específicos, como agonistas y antagonistas activos en los sitios de unión al inhibidor, como péptidos para ser ligados a, o utilizados en combinación con, agentes citotóxicos para la destrucción dirigida de células que se unan al inhibidor. Las secuencias de aminoácidos que contienen estos péptidos son seleccionadas sobre la base de su posición en las regiones exteriores de la molécula y son accesibles para la unión a antisueros. Los extremos amino y carboxilo del inhibidor, así como la región central de la molécula, están representados separadamente entre los fragmentos a sintetizar.

Estas secuencias peptídicas son comparadas con secuencias conocidas utilizando bases de datos de secuencias de proteínas tales como GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT y PIR, para determinar homologías potenciales de las secuencias. Esta información facilita la eliminación de secuencias que presenten un alto grado de homología con otras moléculas, incrementando de este modo el potencial de alta especificidad en el desarrollo de antisueros, agonistas y antagonistas del inhibidor.

El inhibidor y los péptidos derivados del inhibidor pueden ser acoplados a otras moléculas utilizando métodos estándar. Los extremos amino y carboxilo del inhibidor contienen ambos residuos de tirosina y lisina y son marcados isotópicamente y no isotópicamente con muchas técnicas, por ejemplo el radiomarcaje utilizando técnicas convencionales (residuos de tirosina- cloramina T, Iodogen, lactoperoxidasa; residuos de lisina- reactivo de Bolton-Hunter). Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por los expertos en el oficio. Alternativamente, se añade tirosina o lisina a los fragmentos que no tengan estos residuos con el fin de facilitar el marcaje de los grupos amino e hidroxilo reactivos del péptido. La técnica de acoplamiento es elegida sobre la base de los grupos funcionales disponibles en los aminoácidos incluyendo, pero sin limitarse a, amino, sulfhidrilo, carboxilo, amida, fenol e imidazol. Varios reactivos utilizados para realizar estos acoplamientos incluyen, entre otros, glutaraldehído, bencidina diazotizada, carbodiimida y p-benzoquinona.

Los péptidos inhibidores son acoplados químicamente a isótopos, enzimas, proteínas transportadas, agentes citotóxicos, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes y otros compuestos, para una variedad de aplicaciones. La eficacia de la reacción de acoplamiento es determinada utilizando diferentes técnicas apropiadas para la reacción específica. Por ejemplo, el radiomarcaje de un péptidos inhibidor con ^{125}I se lleva a cabo utilizando cloramina T y Na^{125}I de alta actividad específica. La reacción es finalizada con metabisulfito de sodio y la mezcla es desalada en columnas desechables. El péptido marcado es eluido de la columna y se recogen las fracciones. Se extraen alícuotas de cada fracción y se mide la radioactividad en un contador gamma. De esta manera, el Na^{125}I no reaccionado es separado del péptido inhibidor marcado. Las fracciones peptídicas con la radioactividad específica más elevada son almacenadas para su uso posterior, tal como un análisis de la capacidad para unirse a antisueros hacia el inhibidor.

Otra aplicación de la conjugación peptídica es para la producción de antisueros policlonales. Por ejemplo, péptidos inhibidores conteniendo residuos de lisina son ligados a seroalbúmina bovina purificada utilizando glutaraldehído. La eficacia de la reacción es determinada midiendo la incorporación de péptido radiomarcado. El glutaraldehído no reaccionado y el péptido son separados mediante diálisis. El conjugado es almacenado para su uso posterior.

Puede producirse un antisuero específico para el inhibidor, para análogos del inhibidor, para fragmentos peptídicos del inhibidor y para el receptor del inhibidor. Después de la síntesis peptídica y de la purificación, se producen antisueros monoclonales y policlonales utilizando técnicas establecidas conocidas por aquellas personas expertas en el oficio. Por ejemplo, puede producirse un antisuero policlonal en conejos, carneros, cabras u otros animales. Los péptidos del inhibidor conjugados a una molécula transportadora tal como seroalbúmina bovina, o el propio inhibidor, son combinados con una mezcla adyuvante, emulsionados e inyectados subcutáneamente en múltiples puntos sobre el lomo, el cuello, los flancos y algunas veces en las almohadillas subplantares. Se realizan inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, tal como cada 2 a 4 semanas. Se obtienen muestras de sangre mediante punción venosa, utilizando por ejemplo las venas marginales de la oreja después de dilatación, de 7 a 10 días aproximadamente después de cada inyección. Se dejan coagular las muestras de sangre durante una noche a 4ºC y se centrifugan a 2400 x g aproximadamente a 4ºC durante 30 minutos aproximadamente. Se extrae el suero, se alicuota y se almacena a 4ºC para su uso inmediato o de -20 a -90ºC para el análisis posterior.

Todas las muestras de suero procedentes de la generación de antisueros policlonales o las muestras de medio procedentes de la producción de antisueros monoclonales son analizadas para determinar el título de anticuerpos. El título se establece mediante varios medios, por ejemplo utilizando transferencias de manchas y análisis de la densidad, y también mediante la precipitación de los complejos péptido-anticuerpo radiomarcados utilizando proteína A, antisuero secundario, etanol frío o carbón vegetal-dextrano, seguido por la medida de la actividad en un contador gamma. Los antisueros con el título más elevado son también purificados en columnas de afinidad que están disponibles comercialmente. Los péptidos del inhibidor son acoplados al gel de la columna de afinidad. Se pasan muestras de antisuero a través de la columna y los anticuerpos anti-inhibidor permanecen unidos a la columna. Estos anticuerpos son posteriormente eluidos, recogidos y evaluados para determinar el título y la especificidad.

El antisuero específico del inhibidor con el título más elevado es analizado para establecer lo siguiente: a) la dilución óptima del antisuero para la unión específica al antígeno más elevada y para la unión no específica más baja, b) la capacidad para unirse a cantidades crecientes del péptido inhibidor en una curva de desplazamiento estándar, c) la reactividad cruzada potencial con péptidos y proteínas relacionados de especies relacionadas, d) la capacidad para detectar péptidos inhibidores en extractos de plasma, orina, tejidos y en medios de cultivo celular.

Son también posibles kits para medir el inhibidor y el receptor del inhibidor.

Los antisueros que posean el título y la especificidad más elevados y que puedan detectar péptidos inhibidores en extractos de plasma, orina, tejidos y en medios de cultivo celular, son examinados posteriormente con el fin de establecer kits fáciles de utilizar para una medida y una localización rápida, fiable, sensible y específica del inhibidor. Estos kits de ensayo incluyen, pero no se limitan a, las técnicas siguientes: ensayos competitivos y no competitivos, radioinmunoensayos, ensayos de bioluminiscencia y quimioluminiscencia, ensayos fluorimétricos, ensayos de sándwich, ensayos inmunorradiométricos, transferencias de manchas, ensayos ligados a enzimas incluyendo ELISA, placas de microvaloración, tiras o tiras de inmersión revestidas con anticuerpo para la monitorización rápida de orina o sangre, e inmunocitoquímica. Se establecen para cada kit el rango, la sensibilidad, la precisión, la fiabilidad, la especificidad y la reproducibilidad del ensayo. La variación intraensayo e interensayo se estable en los puntos del 20%, el 50% y el 80% de las curvas estándar de desplazamiento o actividad.

Un ejemplo de un kit de ensayo utilizado comúnmente en investigación y en clínica es un kit de radioinmunoensayo (RIA). A continuación se ilustra un RIA del inhibidor. Después de la radioyodación y de la purificación con éxito del inhibidor o de un péptido del inhibidor, se añade el antisuero que posea el título más elevado en varias diluciones a tubos que contienen una cantidad de radioactividad relativamente constante, tal como 10.000 cpm, en un sistema tamponante adecuado. Otros tubos contienen tampón o suero preinmune para determinar la unión no específica. Después de la incubación a 4ºC durante 24 horas, se añade proteína A y se agitan los tubos en vórtex, se incuban a temperatura ambiente durante 90 minutos y se centrifugan a 2000 - 2500 x g aproximadamente a 4ºC para precipitar los complejos de anticuerpo unido al antígeno marcado. Se retira el sobrenadante por aspiración y se cuenta la radioactividad de los aglutinados en un contador gamma. Se caracteriza posteriormente la dilución del antisuero que se une a un 10% - 40% aproximadamente del péptido marcado después de sustraer la unión no específica.

A continuación, se evalúa un rango de diluciones (de 0,1 pg a 10 ng aproximadamente) del péptido del inhibidor utilizado para el desarrollo del antisuero mediante la adición de cantidades conocidas del péptido a tubos que contienen péptido radiomarcado y antisuero. Después de un periodo de incubación adicional, por ejemplo de 24 a 48 horas, se añade proteína A y se centrifugan los tubos, se retira el sobrenadante y se cuenta la radioactividad del aglutinado. El desplazamiento de la unión del péptido del inhibidor radiomarcado por el péptido del inhibidor no marcado (estándar) proporciona una curva estándar. Se añaden a los tubos de ensayo varias concentraciones de otros fragmentos peptídicos del inhibidor, de inhibidor de una especie diferente y de péptidos homólogos con el fin de caracterizar la especificidad del antisuero hacia el inhibidor.

Se preparan extractos de varios tejidos incluyendo, pero sin limitarse a, tumores primarios y secundarios, carcinoma pulmonar de Lewis, cultivos de células productoras del inhibidor, placenta, útero y otros tejidos tales como cerebro, hígado e intestino. Después de la liofilización o de "Speed Vac" de los extractos de tejido, se añade tampón de ensayo y se colocan en los tubos de RIA diferentes alícuotas. Extractos de las células productoras del inhibidor producen curvas de desplazamiento que son paralelas a la curva estándar, mientras que extractos de tejidos que no producen el inhibidor no desplazan al inhibidor radiomarcado del inhibidor. Además, se añaden a los tubos de ensayo en cantidades crecientes extractos de orina, plasma y fluido cerebroespinal de animales con carcinoma pulmonar de Lewis. Las curvas de desplazamiento paralelas indican la utilidad del ensayo del inhibidor para medir el inhibidor en tejidos y fluidos corporales.

Los extractos de tejido que contienen el inhibidor son caracterizados adicionalmente sometiendo alícuotas a HPLC de fase reversa. Se recogen fracciones de eluato, se secan en "Speed Vac", se reconstituyen en tampón de RIA y se analizan en el RIA del inhibidor. La cantidad máxima de inmunorreactividad del inhibidor está localizada en las fracciones correspondientes a la posición de elución del inhibidor.

El kit de ensayo proporciona instrucciones, el antisuero, el inhibidor o el péptido del inhibidor y, posiblemente, inhibidor radiomarcado y/o reactivos para la precipitación de los complejos de inhibidor unido-anticuerpo hacia el inhibidor. El kit es útil para la medida del inhibidor en fluidos biológicos y en extractos tisulares de animales y humanos con y sin tumores.

Otro kit es utilizado para localizar el inhibidor en tejidos y células. Este kit de inmunohistoquímica del inhibidor proporciona instrucciones, antisuero hacia el inhibidor y posiblemente un suero bloqueante y un antisuero secundario unido a una molécula fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceína, o a algún otro reactivo utilizado para visualizar el antisuero primario. Las técnicas de inmunohistoquímica son bien conocidas por aquellas personas expertas en el oficio. Este kit de inmunohistoquímica del inhibidor permite la localización del inhibidor en secciones de tejido y en células cultivadas utilizando microscopía óptica y microscopía electrónica. Se utiliza con fines de investigación y con fines clínicos. Por ejemplo, los tumores son sometidos a biopsia o recogidos y se cortan secciones de tejido con un microtomo con el fin de examinar los lugares de producción del inhibidor. Tal información es útil para fines de diagnóstico y posiblemente para fines terapéuticos en la detección y el tratamiento del cáncer. Otro método para visualizar los lugares de biosíntesis del inhibidor implica el radiomarcaje de ácidos nucleicos para ser utilizados en hibridación in situ para sondar el ARN mensajero del inhibidor. De manera similar, el receptor del inhibidor puede ser localizado, visualizado y cuantificado con técnicas de inmunohistoquímica.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Demostración de la actividad inhibidora de la proliferación de células endoteliales del kringle 5 del plasminógeno humano

Fuente: El plasminógeno humano es digerido con enzimas apropiados para producir un fragmento Kringle 5. El fragmento peptídico es aislado y purificado mediante métodos estándar de purificación de proteínas y péptidos bien conocidos por las personas expertas en la técnica. La pureza del Kringle 5 aislado está demostrada en la Figura 2, que muestra los resultados del procesamiento de la preparación peptídica en electroforesis en gel.

Ensayo: La actividad inhibidora de células endoteliales fue analizada mediante la inhibición de la síntesis de ADN (incorporación de [metil-^{3}H]-timidina) en células endoteliales de capilares bovinos. Las células endoteliales capilares fueron preparadas a partir de glándulas adrenales bovinas y cultivadas en placas de microvaloración de 48 pocillos revestidas con gelatina.

Se añaden a las células cultivadas cantidades variables de Kringle 5 aislado y se determina el cambio del número de células. El porcentaje del cambio del número de células se representa gráficamente como función de la cantidad de Kringle 5 añadida a los cultivos para dar la gráfica de la Figura 1.

La Figura 3 muestra una comparación de secuencias de 80 aminoácidos similares derivadas de las regiones Kringle 1, 2, 3, 4 y 5 del plasminógeno humano.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: The Childrens Medical Center Corporation

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(B)

CALLE: 300 Longwood Avenue

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(C)

CIUDAD: Boston

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(D)

ESTADO: MA

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02115

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inhibidor de la Proliferación de Células Endoteliales y Método de Utilización

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96945635.9

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: WO 9620447

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 13-DIC-1996

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/008519

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 13-DIC-1995

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/763528

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 12-DIC-1996

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 79 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

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(C)

AISLADO INDIVIDUAL: aislado

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(F)

TIPO DE TEJIDO: Sangre

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

1

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 79 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

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(F)

TIPO DE TEJIDO: Sangre

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

2

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

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(F)

TIPO DE TEJIDO: Sangre

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

3

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 78 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

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(F)

TIPO DE TEJIDO: Sangre

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

4

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 78 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

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(F)

TIPO DE TEJIDO: Sangre

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

5

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 80 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

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(F)

TIPO DE TEJIDO: Sangre

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

6

Claims (14)

1. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad inhibidora de la proliferación de células endoteliales de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de un péptido Kringle 5 aislado de una molécula de plasminógeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la proteína contiene 80 aminoácidos.

3. Una composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene un peso molecular de 14 kD.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el plasminógeno es plasminógeno humano.

5. Una composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.

6. Una composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.

7. Una composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene la capacidad de inhibir la proliferación de células endoteliales.

8. Una composición farmacéutica como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para ser utilizada como un medicamento.

9. Utilización de una proteína como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células endoteliales en un individuo.

10. Utilización de una proteína como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un individuo que tenga una enfermedad mediada por angiogénesis.

11. La utilización de la reivindicación 9 ó 10 en la que el individuo es un humano.

12. La utilización de la reivindicación 10, en la que la enfermedad mediada por angiogénesis es cáncer.

13. La utilización de la reivindicación 12, en la que la enfermedad mediada por angiogénesis es un tumor sólido.

14. Un método para inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro, que comprende la administración a una célula endotelial de una cantidad eficaz de una proteína como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.