【発明の詳細な説明】
好中球の接着および移動の遮断に有用なＭａｃ-１ Ｉ-ドメイン蛋白質
発明の背景
細胞接着分子は、免疫および炎症、細胞固定および移動、ならびに細胞増殖お
よび分化を包含する数多くの細胞プロセスに必須である。多数の種々の細胞接着
蛋白質の中で、白血球インテグリンは、白血球の炎症組織への接着および内皮細
胞間-移動の媒介に関与している。これらのインテグリンは、白血球表面の膜-固
定蛋白質であり、種々のリガンドに対する受容体として機能している。これらの
受容体は、アルファおよびベータサブユニットよりなるヘテロダイマー蛋白質で
あり、３種の公知白血球インテグリンが共通のベータ-２サブユニットを共有し
ているところから、それらはベータ-２インテグリンとも呼称されている。これ
ら３種のインテグリンにおいては、ＬＦＡ-１(ＣＤ１１ａ/ＣＤ１８)、Ｍａｃ-
１(ＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８)、およびｐ１５０,９５(ＣＤ１１ｃ/ＣＤ１８)、βサ
ブユニットＣＤ１８が、非共有結合様式にてαサブユニットＣＤ１１と相互作用
する。
これらのインテグリンのαおよびβサブユニットは両方とも大きな糖蛋白質で
あり；ＣＤ１８サブユニットは分子量で約９５ｋｄである。Ｍａｃ-Ｉの１７０
Ｋｄ αサブユニットＣＤ１１ｂは、Ｉ-ドメイン(またはＡ-ドメイン)を含んで
おり、これはＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃおよび数種の他のインテグリンにも保存さ
れている(Ｌarsonら、Ｊ.Ｃell.Ｂiol.、108:703-12(1989))。約２００アミノ酸
残基のこのＩ-ドメインは挿入配列のようであり；それは他の数種のインテグリ
ンには見い出されない。Ｉ-ドメインは、フォンビルブランド因子、軟骨マトリッ
クス蛋白質、および補体蛋白質Ｃ２およびＢ因子のごとき蛋白質のリガンド結合
に関与するドメインに配列類似を示す。
したがって、β２インテグリン中のＩ-ドメインがそれらのリガンドに対する
これらのインテグリンの相互作用に役割を演じ得ると考えられることは興味をそ
そる。Ｉ-ドメインがリガンド結合における認識領域として機能し得ることを示
唆する結果が、Ｄiamondら、Ｊ.Ｃell Ｂiol.、120:1031-43(1993)によって報告
され；彼らは、ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインに対するモノクローナル抗体が、ｉＣ３
、フィブリノーゲン、ＩＣＡＭ-１および好中球リガンドに対するＭａｃ-１の結
合を遮断し得ることを示した。Ｍａｃ-１リガンド結合には、カチオンの存在を
要することが知られている。Ｍichishitaら、Ｃell、72:857-67(1993)は、ＣＤ１
１ｂのイー・コリ(Ｅ.coli)-由来組換えＩ-ドメインに対するＭｎ2+の結合を示
しており、再度、リガンド結合におけるＩ-ドメインの関与を示唆している。
ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインの機能および構造を研究するためにＣＤ１１ｂ Ｉ-ド
メインを得るためには、組換え蛋白質のイー・コリ(Ｅ.coli)発現を要した。残
念なことには、それ自体によるＩ-ドメインの発現レベルは低く、該蛋白質は精
製するのが困難であった。融合産物からＩ-ドメインを回収し得るように融合結
合部にトロンビン切断サイトを有するＧＳＴ(グルタチオン Ｓ-トランスフェラ
ーゼ)の融合物としてのＩ-ドメインを、高レベルで発現する菌株を作製する試行
が行われた。しかしながら、この融合蛋白質は、トロンビン蛋白質加水分解に対
して感受性ではなかった。
本発明は、ＧＳＴとの融合物としてイー・コリ(Ｅ.coli)中で産生される組換
え蛋白質が、以下のいくつかの利点：１）ＧＳＴ自体が高レベルで発現し、よっ
て融合蛋白質の高レベルの産生が促進されるにちがいないこと；２）ＧＳＴはそ
れ自体が高可溶性であるため、融合蛋白質のホールディングを促進/安定化する
ように作用して、可溶性で活性な産物に通じ得ること；および３）ＧＳＴは精製
機会、すなわち、グルタチオン セファロース４Ｂカラムを用いた固定化グルタ
チオン上のアフィニティークロマトグラフィーによって融合蛋白質の一工程精製
として使用できること；を有することを示す。
本発明の構築物により、切断サイトの接近し易さをマスクするＧＳＴおよびＩ
-ドメインの物理的極隣接性によって引き起こされる問題が克服される。本発明
の構築物は、グリシンのごとき残基をＧＳＴおよびＩ-ドメイン融合点に導入し
て、２つの構造物を分離する。加えて、本発明は、Ｘa因子(factor Ｘa)切断
サイトを有するＧＳＴおよびＩ-ドメイン融合物を教示し、かかる融合産物にお
けるトロンビンおよびＸa因子蛋白質加水分解の効率を比較する。種々の融合結
合部-結合ＧＳＴおよびＩ-ドメインを以下に示す。下線を引いた残基はトロンビ
ンまたはＸa因子の認識配列であり、矢印(-↑-)は切断点を示す。太字で強調し
た残基は、蛋白質加水分解後のＩ-ドメインのＮ-末端の伸長である。プロテアー
ゼによる認識を要するため、所望の２グリシンにくわえて臨時残基が融合構築物
からのＩ-ドメインの伸長に必要である。
トロンビン
トロンビン
Ｘa因子
主題の組換え産物において、ＣＤ１１b Ｉ-ドメイン配列がポジション＃１３３
のセリンで規定され、＃３３７のグルタミン酸で終結することを特記しておく。
Ｍichishitaら(前掲)の報告において、彼らのイー・コリ(Ｅ.coli)-由来組換え
ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメイン(Ａドメインと呼ぶ)は＃１１１のグリシンで出発し、＃
３１８のアラニンで終結する(図１参照)。正確なＩ-ドメイン配列を設計するこ
となしに、Ｍichishitaらは、Ｉ-ドメイン周辺の領域をコードする配列をクローン
化するために利用できる制限酵素サイトの利点を得、よってＣＤ１１ｂのＮ-末
端に向けてＩ-ドメインがシフトする。
独特なことには、主題の構築物におけるＧＳＴおよびＩ-ドメインの間の２個
のグリシン残基の付加により、融合蛋白質のトロンビン修飾が可能となる。Ｘa
因子切断サイトを有する構築物も、Ｘa因子によって効率的に修飾され得、トロ
ンビン切断を有する融合物からのものよりも、良好な収率のＩ-ドメインが得ら
れる。主題の発明は、ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインの下流単離用のＸa切断サイトを
有する融合蛋白質を産生するイー・コリ(Ｅ.coli)株から調製した細胞抽出物を
提供する。
情報公開の陳述
欧州特許出願0365837号(Ｓpringerら)は、細胞間接着分子(ＩＣＡＭ-１)の一
般的背景および炎症の治療に有用となり得るその機能性誘導体を開示している。
欧州特許出願0391088号(Ｓpringerら)は、ウイルス感染症の治療に有用となり
得る細胞間接着分子(ＩＣＡＭ-１)およびその機能性誘導体を開示している。
欧州特許出願0364690号(Ｓpringerら)は、炎症の治療に有用となり得る白血球
接着受容体Ｍａｃ-１アルファサブユニット、ならびに対応するＤＮＡおよび誘
導体を開示している。
欧州特許出願0387668号(Ｓpringerら)は、炎症サイトに白血球が移動するプロ
セスに関与すると記載されているＩＣＡＭ-２として分類される細胞間接着分子
を開示している。
Ｄiamondら、「４種の異なる接着リガンドの白血球インテグリンＭａｃ-１(Ｃ
Ｄ１１ｂ/ＣＤ１８)の主要な認識サイトであるＩ-ドメイン(Ｔhe I-domainis ａ
Ｍajor Ｒecognition Ｓite on the Ｌeukocyte Ｉnteglin Ｍac-1(CD11b/CD18
)for Ｆour Ｄistinct Ａdhesion Ｌigands)」Ｊ.of Ｃell.Ｂiology、120、4、103
1-1043(1993)は、Ｉ-ドメインに特異的なｍＡｂがＭａｃ-１-依存性の接着を遮
断することを開示している。
Ｍichishitaら、「リガンド結合に必須であるベータ-２ インテグリンＣＲ３(C
D11/CD18)のＡドメイン中の新規な二価カチオン-結合サイト(Ａ Ｎovel Ｄi-val
ent Ｃation-Ｂinding Ｓite in the Ａ Ｄomain of the Ｂeta-2 ＩntegrinＣ
Ｒ３(CD11/CD18)Ｉs Ｅssential for Ｌigand Ｂinding)」Ｃell、72、857-867(19
93年3月26日)は、Ｍac-１のＩ-ドメイン領域におけるある種の突然変異がiＣ３ｂ
への接着を遮断することを開示している。
Ｚhouら、「組換えＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８インテグリン Ｉ-ドメインの異なるリ
ガンド結合特異性(Ｄifferential Ｌigand Ｂinding Ｓpecificities of Ｒecom
binant CD11b/CD18 Ｉntegrin Ｉ-Ｄomain)」J.Biological Chemistry、269、25、1
7075-17079(1994年6月24日)は、ＣＤ１１ｂの組換え形のＩ-ドメインの発
現、およびこのドメインはフィブリノーゲンおよびＩＣＡＭ-１に結合するが、
それはＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８リガンドレパートリー全体を再現していないことを
報告している。
Ｋernら、 「ヒトインテグリンα1β1のリガンド結合におけるＩ-ドメインの役
割り(Ｔhe Ｒole of the Ｉ Ｄomain in Ｌigand Ｂinding of the Ｈuman Ｉnt
egrinα1β1)」J.Biological.Chemistry、269、36、22811-22816(1994年9月9日)は
、このドメインを含むすべてのインテグリンαサブユニットのリガンド認識にお
いて、Ｉ ドメインが中心的な役割を演じていることを報告している。
Ｍuchowskiら、「インテグリン・アンタゴニスト好中球阻害因子およびCD11b/
CD18のＩ ドメインの間の機能的相互作用(Ｆunctional Ｉnteraction between t
he Ｉntegrin Ａntagonist Ｎeutrophil Ｉnhibitory Ｆactor and the Ｉ Ｄom
ain of CD11b/CD18)」J.Biological.Chemistry、269、42、26419-26423(1994年10月
21日)は、組換え好中球阻害因子(ｒＮＩＦ)がＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８の約２００ア
ミノ酸残基のＩ ドメインと結合すること、およびこの相互作用がＮＩＦによる
好中球機能の阻害に必須であることを報告している。
Ａrnaoutらに対する米国特許第5,091,303号は、ウェゲナー肉芽腫症を有する
個人の血清中に存在する自己抗体に結合する２９ｋＤ好中球蛋白質、およびウェ
ゲナー肉芽腫症に苦しむ個人を診断するためのこの自己抗体の使用方法を開示し
ている。
Ａrnaoutらに対する米国特許第5,200,319号は、患者における小-免疫壊死症お
よび/または半月糸球体炎を診断する方法において使用する２９ｋＤ好中球蛋白
質を開示している。
発明の概要
一態様において、本発明は、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)お
よびヒト白血球Ｂ2-インテグリンＭａｃ-１由来のＩ-ドメインの融合蛋白質であ
り、その中で該ＧＳＴおよび該Ｉ-ドメインは、配列番号：Ｉに記載するＸa因子
切断サイトを含むペプチドセグメントによって結合している。この融合蛋白質は
、
合成および発現用のＩ-ドメイン蛋白質を扱う改善された手段、ならびにＸa因子
酵素による切断のための接近し易さを供するユニークな切断サイトを供する。
もう一態様において、本発明は、配列番号：Ｉに記載する、アミノ酸配列Ｇly
２２６ないしＧlu４３５によって規定されるＩ-ドメイン蛋白質である。この配
列には、Ｉ-ドメインおよび前記した特別の切断サイトが含まれる。
さらにもう一態様において、本発明は、配列番号：Ｉに記載するアミノ酸配列
Ｇly２２６ないしＧlu４３５によって規定されるヒト白血球Ｂ2-インテグリン
Ｍａｃ-１由来の組換えＩ-ドメイン蛋白質；および医薬上許容される担体または
賦形剤よりなる医薬組成物である。また、該医薬組成物は、前記したＩ-ドメイ
ン蛋白質の断片、アナログまたは化学誘導体よりなり得る。
さらにもう一態様において、本発明は、配列番号：Ｉに記載するアミノ酸配列
Ｇly２２６ないしＧlu４３５によって規定されるヒト白血球Ｂ2-インテグリン
Ｍac-１由来の組換えＩ-ドメインよりなる医薬上有効量の抗-炎症剤を、炎症状
態に苦しむ患者に投与することよりなる炎症を治療する方法である。また、該方
法は、前記した組換えＩ-ドメイン蛋白質の断片、アナログまたは化学誘導体か
らもなり得る。
融合蛋白質、Ｉ-ドメイン蛋白質(特別な切断セグメントを含み得る)およびそ
れらから調製した医薬組成物は、汚染物または他の生物学的不純物を実質的に含
まない全組換え蛋白質である。
図面の簡単な説明
図１． Ｍichishitaら、「リガンド結合に必須であるベータ-２インテグリン
ＣＲ３(ＣＤ１１/ＣＤ１８)のＡドメイン中の新規な二価カチオン-結合性サイト
(Ａ Ｎovel Ｄivalent Ｃation-Ｂinding Ｓite in the Ａ Ｄomain of the Ｂe
ta-2 Ｉntegrin CR3(CD11/CD18)Ｉｓ Ｅssential for Ｌigand Ｂinding)」Ｃel
l、72、857-867(1993年3月6日)により記載されたＡ-ドメインおよび本発明のＩ-ド
メインの模式図である。Ａ-ドメインはＩ-ドメインとほぼ同じサイズであるが、
Ｍａｃ-１の配列中の約２０アミノ酸上流(Gly111)で開始することは特記してお
く。したがって、それは、Ｉ-ドメイン中のＣ-末端残基(Ｇｌｕ337)の２０残基
上流のＡｌａ318で終結する。Ａ-ドメインは、クローニング戦略の一部として導
入したＡｓｎ-Ｓｅｒ-ＳｅｒのＣ-末端伸長を有する。Ｉ-ドメインは、Ｘa因子
による切断を促進するのに要する配列、Ｈ2Ｎ-Ｇly-Ｉle-Ｐro-Ｇly-Ｇly-..によ
ってＮ-末端で伸長する。Ｉ-ドメイン構築物中の１番目のＭac-１残基はＳer133
に相当するセリンである。
発明の詳細な説明
本発明は、グルタチオン Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との可溶性融合蛋白
質として組換えエスシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)で発現される、ヒト
白血球β2-インテグリン Ｍac-１からのＩ-ドメインに相当する単離および精製
蛋白質である。該蛋白質は、細胞接着機構を妨害して好中球の接着および移動を
遮断することによって、炎症を治療するのに有用である。
グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)およびヒト白血球β2-インテグ
リン Ｍａｃ-１からのＩ-ドメインに相当する融合蛋白質を、完全なアミノ酸配
列として示す(配列番号：Ｉ)。Ｉ-ドメイン蛋白質アミノ酸は、融合蛋白質にお
けるそれらの位置に従って番号付けする。該分子のＮＨ2-末端部分(残基２２０)
は、可溶性発現のレベルの上昇を補助し、ＧＳＨ-アフィニティークロマトグラ
フィーによる精製を容易ならしめる融合パートナー、グルタチオン-Ｓ-トランス
フェラーゼ(ＧＳＴ)である。２２１-２３０からの残基は、Ｉ-ドメインへＧＳＴ
を結合するセグメントを示し、Ａｒｇ２２５-Ｇｌｙ２２６のＸa因子による切断
のサイトは配列；[Ｉle-Ｇlu-Ｇly-Ａrg-↓-Ｇly-Ｉle-Ｐro-]によって示される
。太字のＧly-Ｇly配列は、Ａrg-Ｇlyの切断サイトにプロテイナーゼを適応させ
るスペーサーを表している。２３１のＳerにつづくＧly-Ｇly配列は、Ｉ-ドメイ
ンの開始、プロセシングされたＭａｃ-Ｉ中のＳer133に相当し、該構築物はＧlu3 37
で終結する。したがって、Ｉ-ドメインは、Ｘa因子につづくＭａｃ-１のＩ-ド
メイン(残基１３３〜３３７)によるＧＳＴの除去に要するペンタペブチド配列：
Ｇly-Ｉle-Ｐro-Ｇly-Ｇly-で開始する。この構造を図１に模式化する。
単離蛋白質は、非経口または経口投与によって、ヒト患者および他の恒温動物
における炎症および関連症状の治療に有用である。
本発明の医薬組成物は、標準的および慣用的な技術を用いて、本発明のヒト白
血球β2-インテグリン Ｍａｃ-１(配列番号：Ｉ)からのＩ-ドメインの蛋白質、
その断片、変形、アナログまたは化学誘導体を、医薬上許容される担体、医薬上
許容されるアジュバントまたは賦形剤と合わせることによって調製し得る。
好ましくは、該医薬組成物は、慣用技術を用いて、抗-炎症有効量または適量
の有効成分、蛋白質、すなわちヒト白血球β2-インテグリン Ｍac-１(配列番号:
Ｉ)、その断片、変形、アナログまたは化学誘導体からのＩ-ドメインを含有する
単位投与量形態に調製する。
医薬組成物およびその単位投与量形態における本発明による有効成分の量は、
特定の適用、特定の化合物の能力、または所望の濃度に大きく依存して変動また
は調整し得る。治療するための治療上使用、またはかかるもので診断し得る患者
における炎症またはそのいずれの関連病徴を駆逐することにおいて、該単離およ
び精製した組換え蛋白質またはその医薬組成物は、投与量で経口および/または
非経口投与して、抗-炎症的に有効であろう治療を行う患者において有効成分の
濃度、すなわち、量または血中レベルが達成し維持されるであろう。一般に、有
効成分の投与量のかかる医薬上有効量は、炎症サイトをモニターすることによっ
て明らかとなるであろう。患者の要求性、治療する炎症の程度、および用いる特
定成分に依存して、該投与量が変動し得ることは理解されよう。また、投与した
初期投与量が所望の血中レベルを迅速に達成するために所定の上限レベルを超え
て上昇し得ること、または初期投与量が最適よりも少量となり得ること、および
日投与量が特定の状況に依存して治療の過程の間に進行的に上昇し得ることは理
解されよう。望むなら、該日用量は、投与のために複数用量、例えば、一日当た
り２ないし４回に分割してもよい。
本発明の組成物は、非経口、すなわち、注射、例えば、静脈注射または他の投
与の非経口経路によって投与できる。非経口投与用の医薬組成物は、一般に、ヒ
ト白血球β2-インテグリン Ｍａｃ-１(配列番号：Ｉ)、その断片、変形、アナロ
グまたは化学誘導体からの、例えば、注射用水および緩衝液のごとき医薬上許容
される液体担体中で混合した医薬上許容される量の組換え Ｉ-ドメイン蛋白質を
含み、適当に緩衝化された等張溶液が得られる。
有効成分は、十分量の担体中に混合して、医薬上許容される注射濃度が得られ
るであろう。得られた液体医薬組成物は、前記した抗-炎症有効量の投与量が得
られるように投与されるであろう。
本発明の融合蛋白質構築物は、ＧＳＴパートナーを利用して、可溶性蛋白質の
高レベルの発現を促進し、固定化グルタチオン(ＧＳＨ)上のアフィニティークロ
マトグラフィーによる精製ができる。また、Ｎ-末端的に結合したＧＳＴ基が除
去し得るように、Ｉ-ドメインに領域結合ＧＳＴ中の接近可能なＸa-因子感受性
サイトを含むようにも設計した。ＧＳＨ-セファロースカラム上のイー・コリ(Ｅ
．coli)抽出物のアフィニティークロマトグラフィーにより、当該カラムに直接
通す夾雑物を含む蛋白質から結合したＧＳＴ/Ｉ-ドメインを分離することができ
る。ＧＳＴ/Ｉ-ドメインの除去は、該カラムをＧＳＨを含む緩衝液で洗浄するこ
とによって達成した。かくして、精製した融合蛋白質は、リンカー領域中で特異
的に切断するＸa因子で加水分解され、得られたＧＳＴおよびＩ-ドメイン蛋白質
はＳ-セファロースカラム上のイオン-交換クロマトグラフィーによって分離した
。配列および組成分析によって、およびＩ-ドメインについて予想されていたも
のと一致する分子量(２５,７６７)を供するエレクトロスプレーイオン化質量分
析によって、最終的なＩ-ドメイン産物が＞９９％純度であることが示された。
Ｉ-ドメインがトリプシンに対して耐性であったという事実は、円二色性および
二次元ＮＭＲによる物理学的特徴付けと併せて、組換えＩ-ドメインが折り畳ま
れ、かつ規則正しい三次元構造を有するという事実を提供した。
β2-インテグリンの巨大なサイズでしかも複雑なために、それは、慣用的な方
法による構造分析になじまない。しかしながら、Ｉ-ドメインは妥当な標的であ
る；それはサイズで比較的小さく、ジスルフィド架橋および低レベルのみの糖化
しか有さず、最も重要なことには、それは、機能的に適当であるようである。標
題Ｉ-ドメイン産物の調製において、イー・コリ(Ｅ.coli)中のＭａｃ-１のＩ-ド
メインをクローン化し、発現した。２種のＩ-ドメイン構築物を設計した。１つ
は、ＣＯＯＨ-末端に６個のヒスチジンの伸長(６Ｈｉｓタグ)を有し、固定化金
属イオンアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易ならしめる。この
構築物は、Ｈ2Ｎ-Ｓer133-Ａsp-Ｉle-Ａla-Ｐhe-Ｌeu...で開始し、..Ｓer-Ｇln-
ＧlU337-Ｉle-Ｌeu-Ｇly-Ａrg-↓-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-ＣＯＯＨで
終結し、ここに数字はＭａｃ-１αサブユニット(配列番号：Ｉ、図１)中の残基
を示し、矢印は前の４個のアミノ酸によってＸa因子の切断点となるように設計
された結合を示す。この記載全体を通して、数字付け系は、シグナルペプチドを
欠く修飾Ｍａｃ-１のものであり、命名法はＭichishitaら、Cell、72:857-67(1993
)のものと一致する。これらの知見は、組換えＩ-ドメインにおける興味の促進を
援助した。
結合蛋白質としてＧＳＴを含むもう１つの構築物を作製した。この分子の一般
的レイアウトを以下に示す：
ＧＳＴ-Ｌeu-Ｖal-Ｐro-Ａrg-↓-Ｇly-Ｓer-Ｓer133....Ｇlｕ337-Ｉle-Ｇlu-
Ｇly-Ａrg-↑-(Ｈis)6(ここに、↓はトロンビン切断配列を示し、↑はＸa因子切
断配列を示す)。したがって、Ｉ-ドメインは、Ｓer133およびＧlU337からの配列
として、６Ｈis構築物として規定される。したがって、この構築物は、精製用に
２つの機会、ＧＳＴおよび６Ｈｉｓタグを有していた。残念なことには、該蛋白
質はトロンビン、Ｘa因子またはトリプシンでさえも切断できなかった。分子間-
ドメイン領域に隠れるために、該トロンビンサイトは接近性につき制限されてい
るようであった。
この問題点を解決するために、新たなセットの構築物を設計し、その中では６
個のＨisタグを除去し、さらなるアミノ酸がＧＳＴおよびＩ-ドメインに結合し
たリンカー領域にさらなるアミノ酸を挿入した、かくして：
再度、矢印は、２種のプロテアーゼによって修飾されるサイトを示し、したが
って、構築物は、太字で強調したＮ-末端の伸長を有するが、ＣＯＯＨ-末端を有
していなかった。両方の融合蛋白質は、各々トロンビンおよびＸa因子によって
修飾されることが見い出されたが、後者はＩ-ドメインの収率において、よりは
るかに良好であろうことが証明された。
ＧＳＴに対するＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインの２種の融合蛋白質のクローニングおよ
び発現
イー・コリ(Ｅ.coli)の細胞質でＧＳＴへの融合物としてのＣＤ１１ｂ Ｉ-ド
メインを発現させるために、２種の構築物を作製した。１つの構築物は、融合ジ
ャンクションにＸa因子切断用の認識サイトを有するが、もう１つの構築物はト
ロンビン蛋白質加水分解サイトを有する。該融合蛋白質を精製した後に、該Ｉ-
ドメインはＸa因子またはトロンビン修飾によって融合蛋白質から回収できる。
蛋白質加水分解サイトの接近し易さを許容するＧＳＴ構造物からＩ-ドメインを
分離するために、２個のグリシン残基を該融合セグメントに導入した。蛋白質加
水分解認識配列により、２個のグリシン残基に加えて他の残基を導入することが
必要であった。蛋白質加水分解修飾の後に、ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインは太字で示
すＮ-末端伸長を有する。ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインには、Ｓer１３３ないしＧlu
３３７のアミノ酸残基が含まれる。
ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインをコードする２種のＤＮＡ配列は、実施例に記載する
ごとく、プラスミドｐＥＴ-ＣＤ１１ｂ/Ｉ(Ｈｉｓ)6からのＰＣＲによってクロー
ン化した。これらのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化６６０ｂｐＤＮＡ断片を、
ファルマシア(Ｐharmacia)発現ベクターｐＧＥＸ-３ＸおよびｐＧＥＸ-２Ｔにク
ローン化し、これをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ＰＣＲプライマー
ＫＡＣ２５０およびＫＡＣ２５１からの６６０ｂｐ断片をｐＧＥＸ-３Ｘにクロ
ーン化し、プライマーＫＡＣ２４９およびＫＡＣ２５１からのものをｐＧＥＸ-
２Ｔにクローン化した。ＧＳＴに融合したＩ-ドメインを運搬する得られた発現
プラスミドベクターは、Ｘa因子切断サイトおよびトロンビンプロセスサイトを
各々有する、ｐＧＳＴ-Ｘa-ＣＤ１１ｂ/ＩおよびｐＧＳＴ-Throm-ＣＤ１１ｂ/Ｉ
と命名した。発現プラスミドにおいて、該融合蛋白質は、ＩＰＴＧによって誘導
され得る強力なｔａｃプロモーターの制御下にある。また、プラスミドは、ＩＰＴ
Ｇのごときインデューサー不存在下でｔａｃプロモーター活性を抑制するｌacＩq
配列も運搬している。抑制性ｌａｃＩqが存在することは組換え蛋白質のバック
グラウンド発現を最小限化するのに、特に組換え蛋白質が宿主細胞に有害な場合
には重要である。ｌａｃＩqリプレッサー配列がプラスミドに存在しない場合に
は、該プラスミドを、通常はＦ'エピソーム上にあるリプレッサーを運搬するイー
・コリ(Ｅ.coli)宿主に維持しておきたいであろう。前記ベクターはｌａｃＩqを
運搬するため、プラスミド構築に用いたイー・コリ(Ｅ.coli)ＤＨ１および発現
に用いたイー・コリ(Ｅ.coli)Ｋ１２Ｓにはリプレッサー配列が含まれていない
。
前記発現ベクターからの融合蛋白質の発現を試験するため、ｐＧＳＴ-Ｘa-ＣＤ
１１ｂ/ＩおよびｐＧＳＴ-Throm-ＣＤ１１ｂ/Ｉを３種のイー・コリ(Ｅ.coli)宿
主、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９およびＫ１２Ｓに形質転換した。これらの菌株を、
実施例に記載のごとく、１×１０-3Ｍ ＩＰＴＧにより融合蛋白質の発現につき
誘導した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって細胞抽出物を分析した場合、該融合蛋白質
の予想サイズ(約４５ｋｄ)に相当する顕著な蛋白質バンドが認められた。この蛋
白質バンドは、Ｉ-ドメイン融合物なしにＧＳＴを発現する菌株由来の細胞抽出
物には存在しない。予想されたように、これらの対照抽出物において、ＧＳＴは
高レベルで発現する。１×１０-3Ｍ ＩＰＴＧにより誘導したこれら３種の宿主
における融合蛋白質の発現は、２回以上反復させた。ＪＭ１０９およびＫ１２Ｓ
は、高レベルの融合蛋白質を産生し、全細胞蛋白質の３０％の融合蛋白質の蓄積
に通じ、ＪＭ１０３よりも良好な宿主のようである。
１×１０-3Ｍ ＩＰＴＧで発現を誘導することによって、融合蛋白質の大部分
は不溶性で、凝集形で、すなわち封入体で蓄積する。ある種の場合において、プ
ロモーターが徐々に作動し始める場合には、組換え蛋白質が可溶性状態にホール
ディングするためのより望ましい条件に導き得る蛋白質合成が可能である。種々
のレベルのＩＰＴＧのプロモーター誘導下での、可溶性および不溶性形のＧＳＴ
Ｉ-ドメイン融合蛋白質の分布を検査した。ＩＰＴＧレベルが１×１０-3Ｍから
、１×１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１×１０-5Ｍに低下するほど、より融合産物は
可溶性状態で蓄積する。１×１０-5Ｍ ＩＰＴＧにおいては、産生された融合蛋
白質の約６０-８０％が可溶性状態である。
Ｘa因子切断サイトでＧＳＴに融合したＩ-ドメインを産生するイー・コリ(Ｅ
．coli)Ｋ１２Ｓ株(ｐＧＳＴ-Ｘa-ＣＤ１１ｂ/Ｉ)を用いれば、１×１０-5Ｍ Ｉ
ＰＴＧを入れた振盪-フラスコ中で２５Ｌを超える細胞を増殖させ発現を誘導す
ることができる。これらの細胞から、超音波処理によって細胞抽出物を調製し、
不溶性物質を除去する遠心によって封入体を含有しない上清抽出物を得ることが
できる。これらの上清抽出物は、Ｉ-ドメインにつき精製し得る。細胞１Ｌから
１０ｍｇを超える精製Ｉ-ドメインを得ることができる。この産生量は重要であ
る。なぜなら、振盪-フラスコを用いてイー・コリ(Ｅ.coli)培養物を増殖させて
も、約１.５ Ａ５５０の細胞密度しか達しないためである。
ＮＭＲ分析用の標識Ｉ-ドメインの単離のために融合蛋白質を15Ｎおよび15Ｎ/13
Ｃで標識するために、細胞増殖条件を試験して、何が標識蛋白質を効率的であ
るが経済的に産生するかを決定した。先行実験には、(15Ｎまたは13Ｃを含まな
い)セルトン(Ｃeltone)-Ｎ培地(実施例参照)を用いることが含まれる。非標識セ
ルトン-Ｎ培地を１：１、１：２および１：３の比率にて非標識Ｍ９塩培地で希
釈し、それを用いて、発現誘導用の１×１０-5Ｍ ＩＰＴＧと共にＫ１２Ｓ(ｐＧ
ＳＴ-Ｘa-ＣＤ１１ｂ/Ｉ)を培養した。セルトン培地自体は、ルリア(Luria)ブロ
ス(全細胞タンパク質の３０％)よりも低い発現レベルしか供しない(全細胞蛋白
質の２４％)ようである。セルトン培地を１部または２部のＭ９塩培地で希釈し
ても、発現を顕著に低下しなかったが、３部のＭ９で希釈すると発現を低下させ
た。これらの培養条件下においては、約６０％の融合産物が可溶性状態で残って
いた。
２部の15Ｎ-および15Ｎ/13Ｃ-含有Ｍ９塩培地で希釈した15Ｎ-および15Ｎ/
13
Ｃ-含有セルトン培地を用いて、数リットルのＫ１２Ｓ(ｐＧＳＴ-Ｘa-CD11b/I)
細胞を増殖させ(Ｘa因子切断サイトでＧＳＴに融合したＩ-ドメインを発現する
菌株)、封入体を含まない上清抽出物を調製した。15Ｎ-および15Ｎ/13Ｃ-標識Ｉ-
ドメイン分子をＮＭＲ分析用に単離した。
ヒト白血球インテグリンＭａｃ-Ｉのα-サブユニットＣＤ１１ｂの組換えＩ-
ドメインを、ｐＢＲ-ベースのベクターバックグラウンド中のｔａｃプロモーター
の制御下にて、ＧＳＴ(グルタチオン Ｓ-トランスフェラーゼ)への融合物として
イー・コリ(Ｅ.coli)中で産生した。高レベルの発現により、融合産物の蓄積は
全細胞蛋白質の少なくとも３０％まで達する。高レベルのＩＰＴＧでｔａｃプロ
モーターを誘導すると、大部分の融合産物が、不溶性で凝集した封入体形となる
。ＩＰＴＧレベルを１×１０-5Ｍまで低下させることにより、産生された融合蛋
白質の６０％を超えるものがイー・コリ(Ｅ.coli)の細胞質中に可溶性形で残る
。
各々、特異的な蛋白質加水分解切断サイト(Ｘa因子またはトロンビン)を融合
ジャンクションに有して、Ｘa因子またはトロンビンのいずれかでの消化により
融合産物からＩ-ドメインを回収できる、２種の融合蛋白質を産生した。Ｉ-ドメ
インおよびＧＳＴが物理学的に接近し過ぎて、プロテアーゼに対する切断サイト
の接近し易さをマスクすることがないことを確認するため、該融合結合部にグリ
シン残基を導入して２種のポリペプチド構造を分離した。切断後に、得られたＩ
-ドメインはＮ-末端に４-５の臨時の残基を有している。Ｉ-ドメイン精製用の出
発物質を供するため、複数リットルのイー・コリ(Ｅ.coli)細胞を振盪-フラスコ
中で培養し、封入体を含まない細胞抽出物を調製した。
実施例
酵素および基本的分子生物学的技術
制限エンドヌクレアーゼ、他のＤＮＡ修飾酵素およびＴ４ ＤＮＡリガーゼは、
ニューイングランド・バイオラボズ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs)社またはベーリン
ガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim)社製であった。全ての酵素は、製造
業者の指示書に従って用いた。
用いた全てのプラスミドはアンピシリン耐性マーカーを運搬しており、ルリア
ブロス中または抗生物質培地(Ａntibiotic Ｍedium)＃２(ディフコ(Ｄifco)社）
寒天プレートのいずれか中、１００μｇ/ｍlアンピシリン存在下にてイー・コリ
(Ｅ.coli)ＤＨ１中で構築し、維持した。ＤＮＡ断片の単離、形質転換、小さい
および大きなスケールのプラスミド調製、および他の基本的な分子生物学的技術
は、Ｓambrookら、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル
第２版(Ｍolecular Ｃloning:Ａ Ｌaboratory Ｍanual,２nd Ｅdition)」、ニュー
ヨーク州、コールドスプリングハーバー(Ｃo1d Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ):コール
ド・スプリング・ハーバー・プレス社(１９８９年)に記載されているものに従った
。プラスミド構築物の確認は、ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コー
ポレイション(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorporation)社製のシークエナ
ーゼ・キット(Ｓequenase kit)を用いた制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によ
って行った。
ＧＳＴに融合したＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメイン発現用のベクターの構築
ＧＳＴに融合したＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメイン配列を有するプラスミドの構築には
、ベクターｐＧＥＸ-３ＸおよびｐＧＥＸ-２Ｔを用い、これらはファルマシア(
Ｐharmacia)社から購入した。プラスミドｐＧＥＸ-３ＸはＸa因子切断認識サイ
トを、そしてｐＧＥＸ-２ＴはＧＳＴ配列から下流のポリリンカー領域にトロン
ビン切断サイトを運搬している。これらのベクターには、ＧＳＴ発現を制御する
ためのｔａｃプロモーター[ＩＰＴＧ(イソプロピルチオガラクトシド)によって
誘導される]、ＩＰＴＧ不存在ではｔａｃプロモーター活性を最小限化するため
のｌａｃＩqリプレッサー、ＧＳＴへの融合物としての遺伝子クローニング用の
ポリリンカー領域、アンピシリン-耐性マーカー、およびｐＢＲ３２２由来の複
製開始点が含まれる。
ＣＤ11ｂ Ｉ-ドメイン配列は、Ｃorbiら(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、263:12403-11(1988)
)によって元々構築されたヒトＣＤ１１ｂ ｃＤＮＡを含むプラスミドからクロー
ン化した。ＰＣＲ鋳型としてｐＥＴ-ＣＤ１１ｂ/Ｉ(Ｈis)6と共に、ＫＡＣ２５０
およびＫＡＣ２５１と命名したオリゴヌクレオチドを用いて、ＧＳＴと融合用の
Ｉ-ドメイン配列をｐＧＥＸ-３Ｘ中にクローン化したが、ＫＡＣ２４９およびＫ
ＡＣ２５１を用いて、ＧＳＴと融台用のI-ドメインをｐＧＥＸ-２Ｔ中にクローン
化した。これらのオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す。該プライ
マーの下線部分はＩ-ドメイン配列(配列番号：Ｉ参照)と重複する。ＫＡＣ２４
９およびＫＡＣ２５０中の他の部分は、Ｎ-Ｉ-ドメイン用のＮ-末端伸長配列お
よびＩ-ドメインをベクターｐＧＥＸ-３ＸおよびｐＧＥＸ-２Ｔにクローニング
するための制限酵素ＢａｍＨＩサイトを供する。ＫＡＣ２５１の下線部分は、ｇ
ｌｕ３３７でＩ-ドメイン配列を終止する蛋白質合成終止コドンＴＡＧ、および該
ベクターにクローニングするための制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを供する。
最終用量１００μlのＰＣＲ反応混合物は、水６８μl、１０×反応緩衝液(１
００ｍＭ トリス-ＨＣl、ｐＨ８.３、５００ｍＭ ＫＣl、１５ｍＭ ＭｇＣl2、
０.０１％ゼラチン)１０μl、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸(各１.２５
ｍＭ)の混合物１６μl、１μＭ 各適当なオリゴヌクレオチド・プライマー、ｐ
ＥＴ-ＣＤ１１ｂ/Ｉ(Ｈｉｓ)6プラスミドＤＮＡ１ｎｇ、およびＴａｑポリメラー
ゼ１μlよりなっていた。反応は、以下の様式にてジーンアンプＰＣＲシステム(
ＧeneＡmp ＰＣＲ system)(シータス(Ｃetus)社)を適用することによって行った
：
試料を９４℃に加熱し、ついで９４℃にて３０秒、６５℃にて３０秒および７２
℃にて４５秒を３０サイクル処理し、つづいて６５℃にて５分間アニーリングし
、７２℃にて５分間伸長させ、ついで４℃に冷却した。
該ＰＣＲ反応混合物のアリコットを１.５％アガロースゲル電気泳動によって
分析して、該ＤＮＡ断片のサイズが約６６０ｂｐであることを確認した。ついで
、
フェノール抽出により該ＤＮＡ断片を精製し、０.３Ｍ酢酸ナトリウム１００μl
およびエタノール４００μlを添加することによってＰＣＲ反応混合物から沈殿
させた。この６６０ｂｐのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理し、
１.５％アガロースゲル電気泳動によって精製し、フェノール抽出およびエタノー
ル沈殿によって精製し、ついで、１０ｍＭ トリス-ＨＣl、ｐＨ７.４および１ｍＭ
ＥＤＴＡ中、-２０℃にて発現ベクターにクローニングするために使用するまで
保存した。
ＧＳＴに融合したＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメインの発現
発現ベクターｐＧＳＴ-Ｘa-ＣＤ１１b/IおよびｐＧＳＴ-Ｔhrom-ＣＤ１１b/Ｉ
を、３種の異なるイー・コリ(Ｅ.coli)宿主(ＪＭ１０３およびＪＭ１０９は販売
されている；Ｋ１２Ｓは単離して融合蛋白質の発現を試験した)に形質転換した。
融合蛋白質を発現させるためのｔａｃプロモーターの誘導は、１×１０-3のＩＰ
ＴＧ(イソプロピルチオガラクトシド)を添加するか、明細書に記載したごとくす
ることによって行った。イー・コリ(Ｅ.coli)細胞は、増殖培地(１００μｇ/ｍl
アンピシリンを入れたルリアブロス)中で通気しつつ３７℃にて増殖させた。詳
細には、イー・コリ(Ｅ.coli)細胞の一晩培養物を増殖培地で５０-１００倍に希
釈してＡ５５０にて約０.１とし、対数増加期中期(Ａ５５０ ０.６-０.８)まで
増殖させ、ついで、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。誘導の最後(２-
４時間)に、遠心によって細胞を回収し、１０ｍＭ トリス-ＨＣl、ｐＨ７.４お
よび１ｍＭ ＥＤＴＡで２０のＡ５５０に再懸濁し、さらに使用するまで-２０℃
にて保存した。ブランソン・ソニファー(Ｂranson Ｓonifier)中で細胞懸濁液を
超音波処理することによって、超音波処理細胞抽出物を調製した。
発現レベルを測定するために、超音波処理細胞抽出物をＳＤＳ-ＰＡＧＥによ
って分析し、クーマシー染色蛋白質バンドを有するゲルをシマズ(Ｓhimadzu)・
デンシトメーターによりスキャンした。細胞抽出物中の融合蛋白質量は、全細胞
蛋白質の％として算出した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、１７％濃度のポリアクリルア
ミドにて架橋リンカーがＮ,Ｎ'-ジアリルターター ジアミドであるゲルシステム
を
用いて行った(Ｍorseら、「単純ヘルペスウイルスＤＮＡの解剖学(Ａnatomy of
herpes simplex virus ＤＮＡ)」J.Virol.26:389-410(1978))。蛋白質分子量標
準はアマーシャム(Ａmersham)社から購入した。
封入体を含まない抽出物の調製
イー・コリ(Ｅ.coli)細胞の細胞質に見出された可溶性融合蛋白質を、Ｉ-ドメ
インの下流精製のための出発物質として用いた。不溶性で、凝集形の融合蛋白質
(封入体内のもの)を取り除くため、超音波処理細胞抽出物を、ＳＳ３４ローター
を用いたソルボール(Ｓorvall)ＲＣ-５Ｂ遠心機中、４℃、１３,０００×ｇにて
５分間遠心した。封入体を含まない上清は、さらに使用するまで-２０℃にて保
存した。
Ｉ-ドメインの15Ｎおよび15Ｎ/13Ｃ標識用の培地の調製
15Ｎ-および15Ｎ/13Ｃ-標識Ｉ-ドメインを産生するイー・コリ(Ｅ.coli)は、
メリーランド州、コロンビアのマーテック・バイオサイエンス・コーポレイショ
ン(Ｍartek Ｂioscience Ｃorp.)社から購入した。培地はＭ９塩培地で希釈した
(Ｓambrookら(前掲))。適当な希釈率を試験するために、マーテック非-標識培地
セルトン(Ｃeltone)-Ｕを、アミノ酸を補充することなくＭ９塩培地と用いた。
１００μｇ/ｍlのアンピシリンを用い、細胞増殖は３７℃で行った。該蛋白質を15
Ｎで標識するために、唯一のアンモニア源として２ｇｍ/l15Ｎ-塩化アンモニ
ウムを用いるＭ９塩培地２部で希釈したマーテック・セルトン-Ｎ培地(＞９８％15
Ｎ)中で細胞を増殖させた。該蛋白質を15Ｎおよび13Ｃで標識するために、２
ｇｍ/l15Ｎ-塩化アンモニウムおよび４ｇｍ/l13Ｃ-グルコースを唯一のアンモニ
アおよび炭素源として用いるＭ９塩培地２部で希釈したマーテック・セルトン-Ｃ
Ｎ培地(＞９８％13Ｃおよび15Ｎ)中で細胞を増殖させた。
方法：ＧＳＴ-Ｉ-ドメインの発現
Ｘa因子での切断によってこの融合蛋白質から生成した主題のＩ-ドメインは、
(成熟Ｍａｃ-１の残基１３３ないし３３７)＋(蛋白質加水分解切断が可能なよう
に要するペンタペプチドＮ-末端伸長Gly-Ile-Pro-Gly-Gly)に正確に相当する。
Ｉ-ドメイン構造とＡ-ドメインについてＭichishitaら(前掲)により公開された
ものとの模式的な比較を図１に示す。主題の蛋白質は、Ａ-ドメインから約２０-
残基下流で開始し、終結する(図１)。これは重要な相異であり、これらの蛋白質
の機能に示され得る相異を説明し得る。さらに、主題のＩ-ドメインはＮ-末端伸
長を有するが、Ａ-ドメインはＣＯＯＨ-末端セグメントを有し、両方のものが蛋
白質に属するかは疑問である。
Ｉ-ドメインの精製：グルタチオン・セファロース・クロマトグラフィー
グルタチオン-セファロース(Ｓepharose)およびＳ-セファロース・ファースト
・フローは、ファルマシアＬＫＢ社から購入した。還元型グルタチオン(ＧＳＨ)
は、シグマ(Ｓigma)社から購入した。配列決定グレードのＸa因子はベーリンガ
ー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim)社から得た。限外濾過膜はアミコン社(
Ａmicon)製で、ポリアクリルアミドゲルはＩＳＳエンプロテック(Ｅnprotech)社
から購入した。他の全ての試薬は、販売されている最高品質のものであった。イ
ー・コリ(Ｅ.coli)細胞ホモジネートは、４０,０００×ｇで遠心し、つづいて０
.４５μｍフィルターを通して濾過した。その濾液は、ＰＢＳ/０.２％β-オクチ
ルグルコシド、ｐＨ７.４で予め平衡化したグルタチオン・セファロースカラム(
５０-ｍl;１.６cm i.d.×２６ｃｍ長)上に直接負荷した。そのカラムを１.０ｍl/
分で負荷し、溶出液中の蛋白質は２８０ｎｍでモニターした。そのカラムを４カ
ラム容量(ＣＶ)の平衡緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ還元型グルタチオンを含有する
２ＣＶの５０ｍＭ トリス緩衝液、ｐＨ８.０で段階-溶出した。溶出液は９ｍl画
分に採取した。全てのプロセス画分を、非-還元条件(ＮＲ)下にてＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅに付した。ＧＳＴ/Ｉ-ドメインを含有する画分を貯め、４℃にて保存した。
Ｘa因子の切断
精製した融合蛋白質を、Ｘa因子(１重量％)での消化に２３℃にて１６-２４時
間付した。常時、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、消化が完全であるかを確認した。
Ｓ-セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィー
蛋白質消化物は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５で予め平衡化
したＳ-セファロース・ファースト・フロー・カラム(５０-ｍl;１.６ｃｍi.d.×
２６ｃｍ長)上に直接負荷した。カラムは１.０ｍl/分で流し、その溶出液を２８０
ｎｍでモニターした。そのカラムを４ＣＶの平衡緩衝液で洗浄し、５０ｍＭリン
酸ナトリウム、ｐＨ６.５が存在する０-１.０Ｍ ＮａＣlからの２ＣＶ線形塩グ
ラジエントを行い溶出した。カラム画分はＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ＮＲ)に付した。精
製Ｉ-ドメインは、約２５ｋＤの単一バンドとして認められ、約１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃlでカラムから溶出した。
限外濾過
精製Ｉ-ドメインは、ＹＭ０５膜を含むアミコン(Ａmicon)撹拌-細胞限外濾過
モジュールを用いて２０ｍｇ/ｍlに濃縮した。窒素圧は、濃縮の間６０ｐｓｉに
維持した。
Ｉ-ドメインの特徴付け：分析方法
蛋白質は、フェニルチオヒダントイン(ＰＨＴ)アミノ酸の同定および定量用の
オン-ラインＨＰＬＣアナライザー(モデル１２０Ａ)に連結したアプライド・バイ
オシステムズ・モデル470ガスフェーズ・シークエンサー(Ａpplied Ｂiosystems
Ｍodel 470 Ｇas Ｐhase Ｓequencer)における自動化エドマン分解によって配列
決定した。ＨＰＬＣからのピークの積算は、モデル１２０Ａ ＨＰＬＣシステム
の出力へのレコーダーと並列連結したネルソンアナリティカル3000シリーズ・ク
ロマトグラフィー・データシステム(Ｎelson Ａnalytical 3000 Ｓeries Ｃhrom
atography data system)で行った。
アミノ酸分析は、ベックマン・モデル6300アナライザー(Ｂeckman Ｍodel 6300
analyzer)の援助で行った。試料は、６Ｎ ＨＣl中、１１０℃真空下にて２４時
間加水分解し、つづいてスピード・バック・コンセントレイター(Ｓpeed Ｖac
Ｃoncentrator)(サバント(Savant)社)で乾燥した。得られた残渣を緩衝液(ＮaＳ;
ベックマン(Ｂeckman)社)中で再現し、該アナライザーに適用した。
逆相(ＲＰ)ＨＰＬＣは、４.６×２５０ｍｍ ビダック(Ｖydac)Ｃ４カラムを付
したＨＰ 1090液体クロマトグラフィー上で行った。グラジエント移動相は、各
々、０.１５％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含有する、水およびアセトニトリル
であった。グラジエントは、１.０ｍl/分の流速で７０分間、０-７０％アセトニ
トリルで行った。溶出液は２２０ｎｍおよび２８０ｎｍで同時にモニターした。
Ｉ-ドメインは単一のピークとして溶出され、２-ｍlポリプロピレン卓上遠心用
試験管に採取し、スピード・バック中で乾燥し、分析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥは
、Ｌaemmli、Ｎature、277:680-85(1970)に記載のごとく行うか、またはＳchagge
rおよびvon Ｊagow、Ａnal.ＢioＣhem、166:368-79(1987)に記載のトリシン緩衝
液系を用いて行った。ゲルを固定し、つづいて０.１％クーマシー・ブリリアン
ト・ブルーＲ-２５０で染色した。
全てのエレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)質量分析は、ベステック(Ｖestec
)201A質量分析器上で記録した。アセトニトリル/水/０.１％ＴＦＡ中のＩ-ドメ
イン溶液のアリコット(5μl)(アセトニトリル/ＴＦＡグラジエント系中のＨＰＬ
Ｃによって単離した蛋白質約０.０５〜０.５μｇ)を、ループインジェクターを
介してイオン源に注射した。質量分析は、ｍ/ｚ５００から２０００まで２秒/ス
キャンにてスキャンした。データは、テクニベント・ベクター２データシステム
(Ｔeknivent Ｖector 2 data system)で獲得した。１０スキャンを平均し、さら
なる処理のためにハリス(Ｈarris)800コンピューターに移行した。平均分子量(平
均Ｍ.Ｗ.)は社内で開発されたプログラムを用いて決定した。単一成分には、セ
ントロイド・プログラム(centroid program)およびデコンボルーション・プログ
ラム(deconvolution program)を用いた。混合物には、デコンボリューション・
プログラムで良好な結果が得られた。ついで、実験的に得られた平均Ｍ.Ｗ.を、
Ｉ-ドメインの種々の試料の理論平均Ｍ.Ｗ.と比較した。
Ｉ-ドメイン(１.０ｍｇ/ｍl)の円二色性(ＣＤ)分析は、０.０８６ｍｍセル中
にて、２６０-１９０ｎｍまでジャスコ・モデル(Ｊasco Ｍodel)J-720CD分光偏
光計上、室温(２０-２２℃)にて測定した。分光偏光計は、Ｄ-１０-カンファス
ルホン酸で２９０ｎｍにて補正した。モル強度は、蛋白質試料濃度および113.2
の平均残基分子量からコンピューター処理した。二次構造は、１６種の蛋白質の
データベースに対するコンプトン(Ｃompton)およびジョンソン(Ｊohnson)の方法
を用いて算出した。
Ｉ-ドメインの精製
プラスミドｐＧ-３×-ＣＤ１１ｂを有するイー・コリ(Ｅ.coli)発現系は、納
得のいくレベルのＧＳＴ/Ｉ-ドメイン融合蛋白質を供した。良好な収率として非
常に率直であることが証明された固定化ＧＳＨ上のＧＳＴ/Ｉ-ドメイン構築精製
物は、極めて高い純度であることが認められた。実際、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析で
認められた無比の夾雑物は非常に低いレベル(＜５％)の遊離ＧＳＴのようであり
、それは融合蛋白質と同時-精製されたと予想される。ＧＳＨ-カラムから回収し
た蛋白質のＲＰ-ＨＰＬＣにより、単一のピークを得た。これは、Ｎ-末端配列分
析の際には、ＧＳＴのＮ-末端に相当する単一配列を供した。二次配列の不存在
は、第一プロセス段階の間には融合蛋白質の蛋白質加水分解がほとんどまたは全
く起こらなかったという点で良好な事実であった。ＲＰ-ＨＰＬＣピークのアミ
ノ酸分析は、無傷ＧＳＴ/Ｉ-ドメイン融合蛋白質の予想された組成と非常に良好
な相関を示す。これらの分析結果に基づいて、無傷融合蛋白質の純度は＞９５％
と概算された。
融合蛋白質からのＩ-ドメインの遊離は、Ｘa因子とのインキュベートを介して
酵素的に達成された。Ｘa因子はセリンプロテアーゼであり、これは構築物の設
計により、Arg-Gly結合で融合蛋白質を特異的に切断して、Ｉ-ドメインのGly-Ile
-Pro-Gly-Gly-N末端伸長(配列番号：Ｉ、図１)に導く。Ｘa因子は精製した融合
蛋白質に、最終濃度１％(重量％)にて直接添加し、インキュベートは室温にて行
った。Ｘa因子での経時的酵素消化物のＳＤＳ-ＰＡＧＥ図は、融合蛋白質の消化
が
１６-２４時間の間に完了することを示している。ＧＳＴおよびＩ-ドメインは分
子量で酷似しているため、これらの蛋白質産物はこの方法によっては分割しなか
った。それにも拘わらず、ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、消化の程度をモニターするため
の有用な技術を提供した。なぜならば、融合蛋白質の損失が容易に追跡できるた
めである。
ＧＳＴおよびＸa因子の等電点(各々、ｐＩ＝６.５およびｐＩ＝４.３)が互い
に顕著に異なり、無傷Ｉ-ドメインのもの(ｐＩ＝９.０)からも異なるため、イオ
ン交換クロマトグラフィーをＩ-ドメイン精製の最終段階とした。Ｘa因子消化物
は、Ｉ-ドメインのみを結合させるであろう条件下にてカチオン交換樹脂Ｓ-セフ
ァロース・ファースト・フロー上に直接負荷した。Ｉ-ドメインは、グラジエン
ト中の１５０ｍＭ ＮａＣl周辺で単一の均一なバンドとして溶出され、生理-型
緩衝液のその回収物となった。結合効率は、ＲＰ-ＨＰＬＣによってモニターし
、これにより、Ｉ-ドメインからＧＳＴを分割した。負荷したＳ-セファロースは
、ＲＰ-ＨＰＬＣ上で２本のピーク(ＧＳＴおよびＩ-ドメインに相当する)を示し
たが、フロースルー、洗液、および保存画分には、各々主に、ＧＳＴ、ＧＳＴ、
およびＩ-ドメインに相当する１本のピークが各々含まれていた。
Ｉ-ドメインの特徴付け
Ｎ-末端配列分析およびアミノ酸分析は、夾雑物または分解の徴候を全く有さ
ない予想された結果と非常に高い相関があった最終産物で行った。ＳＤＳ-ＰＡ
の２本の初期-溶出ピークが存在することも示した。これらのピークの採取、凍
種であることが確認された。両方のピークのＮ-末端配列決定およびアミノ酸分
析により、これらがＡｒｇ残基３０６(配列番号：Ｉ)での単一内部切断から生じ
たＩ-ドメインの分解産物であることが示された。これらの結果に基づいて、こ
のプロセスに由来するＩ-ドメインの純度は＞９５％であると決定した。この高
品質の物質は、この精製プロトコールの手段により、一貫して得られた(ｎ＝７)
。
エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いて、Ｉ-ドメイン調製物の完全性
をさらに評価した。精製Ｉ-ドメイン(２-３ｎｍｏｌ)をＲＰ-ＨＰＬＣから採取
し、凍結乾燥し、分光器プローブに適用する前に、少量の５０％アセトニトリル
中で再現した。質量/単位電荷(ｍ/ｚ)に相当する一連の分子イオンを得、これか
ら平均分子量を決定し得る。全てのＸa因子-由来Ｉ-ドメイン調製物は実質的に
同一の結果が得られた。スペクトルは、異なる分子量を有する２種と同定した。
多い方の種(８０-９５％)の分子量は２３,７６７と決定され、これは理論値に正
確に合致するが、少ない方の種は１６４ダルトン低い分子量が得られた。この種
の生成は、この分子量の違いに基づくＣ-末端の異種性または典型的な転写後修
飾によるもののようではない。
ＣＤ１１ｂに対して向けられたモノクローナル抗体(ｍＡｂ)３Ｈ５を生成し、
単離し、特徴付けた。フィブリノーゲンは、カビ・ファルマシア(Ｋabi Ｐharmasia
)社(オハイオ州、フランクリン)から購入し、ゼラチン-セファロース４Ｂ(ファル
マシア(Ｐharmacia)社；スウェーデン、アップサラ)を利用してフィブロネクチ
ンを枯渇させた。
細胞調製
多形核白血球(ＰＭＮ)は、以前に記載されているごとく(Ｓmith,Ｃ.Ｗ.ら、J.
Clin.Invest.、83:2008-17(1989))、デキストラン-沈降分離およびフィコール-ハ
イパーク(Ｆicoll-Ｈypaque)グラジエント遠心によってヘパリン処理血液から単
離した。ＰＭＮは１ｍＭ ＭｇＣl2および１ｍＭ ＣａＣl2を含有するリン酸緩衝
液セーライン(１.２ｍＭリン酸、１３８ｍＭ ＮａＣl、ｐＨ７.４；ＰＢＳ)中で
２回洗浄した。ＰＭＮは、２',７'-ビス-(２--カルボキシエチル)-5(および-６)
-カルボキシフルオレセイン(ＢＣＥＣＦ；オレゴン州、ユージンのモレキュラー・
プローブス・インコーポレイテッド(Ｍolecular Ｐrobes,Ｉnc.)社;９０％ＤＭ
ＳＯ中の１ｍｇ/ｍl)で標識した。
細胞接着アッセイ：
マイクロタイタープレートプレートにおける蛋白質に対する好中球接着(表１、
２および３）
ｉＣ３ｂリガンドに対する好中球接着を評価するために、９６ウェル・マイク
ロタイタープレート(イムロン２(Ｉmmulon 2)、ダイナテック・ラボズ(Ｄynatech
Ｌabs)社、バージア州、チャンティリー)を１７０μｇ/ｍlＢＳＡおよび７５μ
ｇ/ｍlヒト・ポリクローナルＩｇＧ(カルバイオケム(Ｃalbiochem)社、カリフォ
ルニア州、ラ・ジョーラ)を含有するＰＢＳ２００μlでコートした。３７℃にて
１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳ２００μlで３回洗浄した。
プラスチック上の残りのサイトは、ＰＢＳ中の１％セラチンを添加することによ
ってブロックした。プレートは、１ｍＭ ＣａＣl2および１ｍＭ ＭｇＣl2(ＰＢ
Ｓ/Ｃａ2+/Ｍｇ2+)を含有するＰＢＳ２００μlで１回洗浄し、つづいてヒト血清
(ＰＢＳ/Ｃａ2+/Ｍｇ2+中で１：３に希釈した)２００μlを添加した。プレート
は、０.０５％ツイーン(Ｔween)２０および０.０１％チメローザルを含有するＰ
ＢＳ２００μlで３回洗浄した。
標識好中球は、ｎ-ホルミル-メチオニン-ロイシン-フェニルアラニン(fＭＬＰ
；１０-7Ｍ)で、３７℃にて１０分間刺激した。抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂ３Ｈ５(陽
性対照)(２０μｇ/ｍl)またはＩ-ドメイン蛋白質(０.５、１、５、１０または２
０μＭ)５０μlを、好中球(１０7/ｍl)５０μlを添加する前に、幾つかのウェル
に添加した。３７℃にて２０分間インキュベートした後に、プレートを打ち振る
ことによって非接着細胞を除去した。ついで、プレートをＰＢＳ/Ｃａ2+/Ｍｇ2+
２００μlで３回洗浄した。ウェル中の蛍光量は、パンデックス蛍光濃度アナラ
イザー(Ｐandex fluorescence concentration analyzer)(イリノイ州、マンデレ
インのバクスター・ヘルスケア・コーポレイション(Ｂaxter Ｈealthcare Ｃorp.)
社)を用いて４８５/５３５ｎｍで測定した。
フィブリノーゲンへの好中球接着を評価するために、９６ウェル・マイクロタ
イタープレートを３７℃にて２時間、フィブリノーゲン(１００μｇ/ｍl)５０μl
でコートした。プラスチック上の残りのサイトは、ＰＢＳ中の１％ゼラチンを添
加することによってブロックした。プレートはＰＢＳ/Ｃａ2+/Ｍｇ2+で３回洗浄
した。ｍＡｂ ３Ｈ５(２０μｇ/ｍl)またはＩ-ドメイン蛋白質(０.５、１、５、
１０または２０μＭ)５０μlを、細胞を添加する前に、幾つかのウェルに添加し
た。該ウェルにｆＭＬＰ刺激した標識好中球を添加し、３７℃にて２０分間イン
キュベートし、細胞接着を前記のごとく測定した。
ＩＣＡＭ-１への好中球接着を評価するために、記載された方法(Ｍarlinおよ
びＳpringer、「精製した細胞間接着分子-１(ＩＣＡＭ-１)(Ｐurified inter-ce
llular adhesion molecule-1(ICAM-1))」Ｃell、51:813-19(1987))の修飾を用い
てヒト胎盤７０ｇからこの蛋白質を免疫精製した。抗ＩＣＡＭ-１ ｍＡｂ 8.4(*
)をこれらのアフィニティークロマトグラフィー方法に用いた。好中球接着アッ
セイには、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ/Ｃａ2+/Ｍｇ2+中で１：１５(
容積/容積)に希釈した精製ＩＣＡＭ-１でコートした。３７℃にて２時間インキ
ュベートした後に、ＰＢＳ中の１％ゼラチンを添加することによってＩＣＡＭ-
１基質をブロックした。プレートは、ＰＢＳ/Ｃａ2+／Ｍｇ2+で３回洗浄した。
Ｉ-ドメイン蛋白質のｍＡｂ ３Ｈ５(２０μl/ｍl)(０.５、１、５、１０または
２０μＭ)５０μlを、細胞を添加する前に幾つかのウェルに添加した。ｆＭＬＰ
刺激標識好中球をウェルに添加し、３７℃にて２０分間インキュベートし、細胞
接着は前記のごとく測定した。
スミス-ホラーズ接着チャンバーにおける蛋白質基質への好中球接着(表４)
マイクロタイター・プレート・アッセイ(前掲)に加えて、Ｍａｃ-１基質に対
する化学走性的に刺激した好中球の接着を、以前に記載されている(Ａndersonら
、「新生児多核白血球の異常な移動(Ａbnormal mobility of neonatal polymorph
o-nucler leukocytes)」J.Clin.Invest.68:863-74(1981))ごとくスミス-ホーラー
ズ(Ｓmith-Ｈollers)チャンバーにおいてアッセイした。これらの接着チャンバ
ーを使用することにより、β2インテグリン-依存性を上昇する条件である、剪断
ストレス不存在下での接着分析が促進される(Ｌawrenceら、「ＣＤ-１８...に対す
る静脈剪断ストレスの効果(Ｅffect of venous shear stress on ＣＤ-１８...)」
Ｂlood、７５：２２７-３７(１９８９))。好中球(１０7/ｍl)は、接着チャンバー(
０.５×１０6)に取り込む前に、ｆＭＬＰ(１０ｎＭ)およびＩ-ドメイン(２.５-
２５μＭ)を含有する懸濁液中、またはＣＤ１１ｂ ｍＡｂ ３Ｈ５(１０μｇ/ｍl
)中にて、２１℃にて５分間予めインキュベートした。蛋白質基質の調製には、
ＫＬＨ(１ｍｇ/ｍｌ)またはフィブリノーゲン(１０ｍｇ/ｍl)を３７℃にて３０
分間カバーガラス上でインキュベートし、アッセイ前に洗浄した。ｉＣ３ｂ基質
は、ヒト血清(ＰＢＳで１：３に希釈したもの)を添加する前に、ヒトポリクロー
ナルＩｇＧ(７５μｇ/ｍl)-ＢＳＡ(１７０μｇ/ｍl)混合物をカバーガラス上で
３７℃にて１時間インキュベートし、３７℃にてさらに１時間インキュベートす
ることによって調製した。蛋白質基質に接触する接着好中球の％は、記載のごと
く算出した(Ａndersonら、(１９８１)、前掲)。
好中球-内皮細胞接着および移動アッセイ(表５、６)
好中球のヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の密集単層への接着、および該単層
を通しての移動の評価は、以前に記載されているごとくスミス-ホーラーズ(Ｓmi
th-Ｈollers)接着チャンバーにおいて行った(Ｓmithら、「ＬＦＡ-１およびＭａ
ｃ-１と細胞間接着分子-１...との共同的相互作用(Ｃooperative Ｉnteractions
of LFA-1 and Ｍac-1 with intercellular adhesion molecule-1...)」J.Clin.
Invest.83:2008-17(1989))。表４および５に示す代表的実験では、ＨＵＶＥＣを
ＴＮＦ(１００Ｕ/ｍl、４時間、３７℃)と予めインキュベートし、チャンバーに
取り込む前に、高レベルのＩＣＡＭ-１発現を誘導した。好中球(１０7/ｍl)は、
接着アッセイ(０.７ｍl/チャンバー)に取り込む前に、選択した濃度のＣＤ１１
ｂ Ｉ-ドメイン(Ｘa因子−切断ＧＳＴ融合蛋白質)、ＧＳＴまたは抗ＣＤ１１ｂ
ｍＡｂ ３Ｈ５(１０μｇ/ｍl)と３７℃にて５分間インキュベートした。ＨＵＶ
ＥＣと接触した接着好中球の％および内皮細胞間移動を示した細胞の％は、以前
に記載れている(Ｓmith,Ｃ.Ｗ.ら、J.Clin.Invest.82:1746-1756(1988))ごとく測
定した。
ＩＣＡＭ-１精製
ＩＣＡＭ-１は、以前に記載されている方法(Ｍarlin,Ｓ，Ｓpringer,Ｔ.Ａ.、
Cell,51:813-19(1987))の修飾によってヒト胎盤７０ｇから精製した。抗-ＩＣＡ
Ｍ-１モノクローナル抗体８.４を、アフィニティークロマトグラフィー精製に用
いた。
表１．ｉＣ３ｂに対する好中球の接着
蛍光的に標識した好中球およびＩ-ドメイン構築物を、「材料および方法」で
記載するごとくｉＣ３ｂで予めコートしたマイクロタイターウェルに(示した濃
度で)添加した。２０分間インキュベートした後に、打ち振ることにより非接着
好中球を除去し、該マイクロタイターウェルをアッセイ緩衝液で３回洗浄した。
接着細胞は、パンデックス蛍光濃度アナライザー(Ｐandex fluorescence concent
ration analyzer)を用いて蛍光強度を測定することによって定量した。好中球の
接着も、ｍＡｂ ３Ｈ５(抗-ＣＤ１１ｂ)存在下で測定した。各値(蛍光強度とし
て表した)は、３回測定値の平均±標準誤差を表す。結果は、３回実験の代表的
な値である。６-Ｈis Ｉ-ドメインは、６個のヒスチジン(６ Ｈis ｔａｇ)のＣ
ＯＯＨ-末端の伸長であり、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー
による精製を促進する。この構築物はＨ2Ｎ-Ｓer133-Ａsp-Ｉle-Ａla-Ｐhe-Ｌeu
...で開始し、...Ｓer-Ｇln-Ｇlu337-Ｉle-Ｌeu-Ｇly-Ａrg-↓-Ｈis-Ｈis-Ｈis-
Ｈis-Ｈis-Ｈis-ＣＯＯＨで終結し、ここに数字は(Ｓer２３１-Ｇlu４３５、配
列番号：１に相当する、Ｍichishitaら、Cell、72:857-67(1993)からの)
Ｍａｃ-１α-サブユニット中の残基を示し、矢印は前の４アミノ酸によりデザイ
ンされた結合を示し、Ｘa因子の切断点である。６-Ｈｉｓペプチドは、認められ
た６-Ｈｉｓ Ｉ-ドメインの活性がアーティファクトでないことを確認するため
の、Ｓer-Ｇ1n-Ｇlu-Ｉle-Ｌeu-Ｇly-Ａrg-↓-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-
Ｈis-ＣＯＯＨで出発する６-Ｈis Ｉ-ドメイン用の対照である。
これらの結果は、用量-依存性で、ｉＣ３ｂに対する好中球接着を６-Ｈis-Ｉ
ドメイン蛋白質が阻害することを示している。半分最大阻害(half maximal inhi
bition)は、１μｍｏｌ濃度で認められた。この阻害は、６-Ｈｉｓ ｔａｇ自体
によるものではないようである。なぜならば、対照ペプチドが接着を阻害しなか
ったからである。それとは反対に、Ｘ因子(無冷凍)切断Ｉ-ドメイン蛋白質は、
試験した最高濃度(２０μｍｏｌ)においてさえｉＣ３ｂに対する好中球接着を阻
害しなかった。接着は特異的であった(なぜならば、それがｍＡｂ ３Ｈ５(抗-Ｃ
Ｄ１１ｂ)によって阻害されたからである)。
表２．フィブリノーゲンに対する好中球の接着
蛍光的に標識した(所定濃度の)好中球およびＩ-ドメイン構築物を、フィブリ
ノーゲン(１００μl/ｍl)で予めコートしたマイクロタイターウェルに添加した
。２０分間インキュベートした後に、打ち振ることにより非接着好中球を除去し
、該マイクロタイターウェルをアッセイ緩衝液で３回洗浄した。接着細胞は、パ
ンデックス蛍光濃度アナライザー(Ｐandex fluorescence concentration analyz
er)を用いて蛍光強度を測定することによって定量した。また、好中球の接着も
、ｍＡｂ ３Ｈ５(抗-ＣＤ１１ｂ)存在下で測定した。各値(蛍光強度)は、３回測
定値の平均±標準誤差を表す。結果は、３回実験の代表的な値である。
結果は、Ｘ因子切断ＧＳＴ-Ｉ-ドメイン融合蛋白質が、半分最大阻害が１μmol
の濃度で認められるように、用量-依存性で好中球接着を阻害したことを示して
いる。それとは反対に、フィブリノーゲンに対する好中球接着は、６-Ｈｉｓ Ｉ-
ドメイン融合蛋白質によりごくわずかだけ阻害された。対照ペプチドは接着に対
して影響を全く有さず、以前冷凍し解凍したＸ因子は不活性であった。接着は特
異的であった。なぜなら、それがｍＡｂ ３Ｈ５(抗-ＣＤ１１ｂ)によって阻害さ
れたからである。
表３：ＩＣＡＭ-１に対する好中球接着
蛍光的に標識した(所定濃度の)好中球およびＩ-ドメイン構築物を、精製した
胎盤ＩＣＡＭ-１で予めコートしたマイクロタイターウェルに添加した。２０分
間インキュベートした後に、打ち振ることにより非接着好中球を除去し、該マイ
クロタイターウェルをアッセイ緩衝液で３回洗浄した。接着細胞は、パンデック
ス蛍光濃度アナライザー(Ｐandex fluorescence concentration analyzer)を用
いて蛍光強度を測定することによって定量した。また、好中球の接着も、ｍＡｂ
３Ｈ５(抗-ＣＤ１１ｂ)存在下で測定した。各値(蛍光強度)は、３回測定値の平
均±標準誤差を表す。
結果は、Ｘ因子および６-Ｈｉｓ ｔａｇ Ｉ-ドメイン融合蛋白質の両方が、用
量-依存性で、精製ＩＣＡＭ-１に対する好中球接着を阻害することを示している
。半分最大阻害は、各々、１μｍｏｌおよび３μｍｏｌの濃度で認めれた。対照
ペプチドは接着に対して影響を全く有さず、冷凍し解凍したＸ因子は不活性であ
った。接着は特異的であった。なぜなら、それがｍＡｂ ３Ｈ５(抗-ＣＤ１１ｂ)
に
よって阻害されたからである。
要約すると、表１-３は、ＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメイン蛋白質が好中球接着に対し
て異なる効果を有することを示している。因子Ｘ Ｉ-ドメインは、フィブリノー
ゲンおよびＩＣＡＭ-１に対する好中球接着を用量-依存性で阻害するが、ｉＣ３
ｂに対する好中球接着には全く阻害効果を有していない。フィブリノーゲンおよ
びＩＣＡＭ-１への半分最大阻害は、両方の蛋白質とも１μｍｏｌの濃度で認め
られた。それとは反対に、半分最大阻害が各々１および３μｍｏｌの濃度で起こ
るような用量依存性で、リガンドｉＣ３ｂおよびＩＣＡＭ-１に対する好中球接
着を６-Ｈｉｓ ｔａｇ Ｉ-ドメイン蛋白質は阻害する。ヘキサヒスチジンを含有
する対照ペプチドは好中球接着に対して全く効果を有さなかった。これらの結果
は、ＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８のリガンド結合機能におけるＩ-ドメインの重要性をさ
らに支持している。
＋ＫＬＨ(１ｍｇ/ｍl)またはフィブリノーゲン(１０μｇ/ｍl)は、３７℃にて
３０分間カバーガラス上でインキュベートし、アッセイ前に洗浄した。ｉＣ３ｂ
基質は、ヒト血清の１：３希釈液を添加する前にカバーガラス上で３７℃にて１
時間、ＩｇＧ(７５μｇ/ｍl)-ＢＳＡ(１７０μｇ/ｍl)混合物をインキュベート
し、３７℃にてさらに１時間インキュベートすることによって調製した。
*好中球は、スミス-ホーラーズ(Ｓmith-Ｈollers)接着チャンバーに取り込む
前に、ｆＭＬＰおよびＩ-ドメインまたはｍＡｂ中で、２１℃にて５分間予めイン
キュベートした。蛋白質の最終濃度を示す。
**好中球接着は以前に記載されている(Ａndersonら、「新生児多形核白血球の
異常な移動(Ａbnormal mobility of neonatal polymorphonucler leukocytes)」
、J.Clin.Invest、68:863-74(1981))ごとくアッセイした。
代表的な実験の結果(前掲)は、剪断ストレス不存在下で評価した場合の、ＫＬＨ
、ｉＣ３ｂおよび/またはフィブリノーゲン基質に対する刺激好中球接着を阻害
するＣＤ１１ｂ Ｉ-ドメイン蛋白質の能力を示している。このことは、ｉＣ３ｂ
およびフィブリノーゲン結合に関して特に明白であり、２.５μＭおよび/または
１０μＭ濃度のＩ-ドメインは刺激した対照に対して３９-５３％で接着を阻害す
る。この阻害レベルは、飽和濃度(１０μｇ/ｍl)で使用した場合のＭac-１(ＣＤ
１１ｂ)に向けたｍＡｂ ３Ｈ５を遮断するものに匹敵する。Ｉ-ドメイン阻害に
関しては明白な濃度-依存性の関係が認められた。最適阻害濃度のＩ-ドメインは
、２.５μＭである。
前記した代表的な実験の結果は、ＩＣＡＭ-１および他の好中球接着リガンド
の発現を最大に誘導するＴＮＦで予め処理した内皮細胞単層への非刺激好中球の
接着を阻害するＣＤ１１ｂ-Ｉ-ドメインの能力を示している。示したごとく、５
μＭまたは２５μＭの最終Ｉ-ドメイン濃度において、（刺激した対象に比して）
各々、３７％または２４％で接着を阻害したが、陽性対照３Ｈ５ ｍＡｂは、飽
和濃度で用いた場合には、５６％で接着を阻害した。残りの接着(３Ｈ５ ｍＡｂ
により遮断していない)は、ＴＮＦにより誘起されたＥ-セレクチンおよび他の内
皮細胞リガンドの寄与を表しており、このアッセイにおけるＩ-ドメイン蛋白質
による影響であるとは予想されなかった。
前掲の代表的な実験のの結果は、ＴＮＦで予め刺激した内皮細胞単層に対する
好中球接着および該細胞を通っての移動の両方を阻害するＣＤ１１ｂ-Ｉ−ドメ
インの能力を示している。Ｉ-ドメイン濃度と接着阻害の程度との間には逆の関
係が認められる。最適阻害濃度は１μＭで、この実験においては、２５μＭ濃度
では接着を阻害しない。重要なことには、１μＭ濃度のＩ-ドメインが、飽和濃
度で用いた場合に、３Ｈ５ ｍＡｂで認められたのと同程度まで接着を阻害する
。ＧＳＴ(対照)融合蛋白質断片は非阻害である。移動評価において、幾分異なる
関係が認められた。高濃度(２５μＭ)のＩ-ドメインが接着から独立して好中球
運動を阻害し、低濃度(１μＭ)が減少した好中球-内皮細胞接着と関連する移動
を遮断するという点で、２モードの用量応答効果が明白である。各々の場合、内
皮細胞間移動は、３Ｈ５ ｍＡｂにより影響されるのと同程度まで強く阻害され
る。これらの知見は、好中球運動性(走化性)およびそれ自体への接着性に対する
、ＣＤ１１ｂ-Ｉ-ドメイン蛋白質の異なる阻害効果を示している。かかる知見は
、公知のＭａｃ-１の多機能特性と全体的に一致する(Ａndersonら、「接着-依存
性顆粒球機能...に対するＭａｃ−１糖蛋白質ファミリーの寄与(Ｃontributions
of the Ｍac-1 glycoprotein family to adherence-dependent granulocyte fu
nction...)」Ｊ.Ｉmmunol.１３７：１５-２７(１９８６)およびＳmithら「内皮
細胞間移動(Ｔransendothelial migration)」、Ａdhesion、pp85-115、ダブリュ・
イー・フリーマン・アンド・コーポレイション、ニューヨーク(1992))。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ
Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 トミッチ，チェ−シェン・シイ
アメリカ合衆国49008ミシガン州カラマズ
ー、ブラックベリー・レイン3703番
(72)発明者 フェアバンクス，マイケル・ビイ
アメリカ合衆国49004ミシガン州カラマズ
ー、マウント・オリベット2330番
(72)発明者 バジト−ジェシュケ，メアリー・エル
アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ
ー、ウインドリフト・アベニュー6233番