KR20010020458A - 안지오스타틴 단편 및 사용방법 - Google Patents

안지오스타틴 단편 및 사용방법 Download PDF

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포크먼엠.쥬더
오레일리마이클에스.
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윌리엄 뉴
더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
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Abstract

내피세포 증식 억제제의 단편 및 이의 사용방법이 제공됨. 내피세포 증식 억제제는 플라스미노겐으로부터 유도된 단백질, 또는 좀더 구체적으로는 안지오스타틴 단편이다. 안지오스타틴 단편은 일반적으로 내피세포 증식 억제제내에서 발생하는 크링글 구조에 상응한다. 이러한 단편의 내피세포 억제 활성은 종양의 맥관형성 억제 및 맥관형성-매개 질환 치료용 수단을 제공한다.

Description

안지오스타틴 단편 및 사용방법{ANGIOSTATIN FRAGMENTS AND METHOD OF USE}
여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "맥관형성"는 조직 또는 기관 내로 새로운 혈관의 생성을 의미한다. 정상적인 생리 조건 하에서, 인간 또는 동물은 매우 특별하게 한정된 조건에서만 맥관형성을 게 된다. 예를 들어, 맥관형성은 보통 상처의 치유, 태아 및 배의 생성 및 몸의 자궁 내막 및 태반 형성 등의 경우 일반적으로 관찰된다. 용어 "자궁 내막"은 장액을 분비하는 동공, 림프관, 및 혈관 등이 배열된 평평한 내피세포의 얇은 층을 의미한다.
조절된 그리고 조절되지 않은 맥관형성 모두 유사한 방식으로 진행하는 것으로 생각된다. 기저막에 의해 둘러싸인 내피세포 및 외막 세포는 모세 혈관을 형성한다. 맥관형성은 막 세포 및 백혈구에 의해 분비된 효소에 의한 기저막의 침식과 함께 시작된다. 혈관의 내강을 형성하는 내피세포들은, 그 후 기저막을 통해 돌출한다. 맥관형성 자극체들은 내피세포들로 하여금 침식된 기저막을 통해 이동해가도록 유도한다. 이동하는 세포들은 모 혈관으로 부터 "발아"를 형성하며, 여기서 내피세포들은 세포 분열 및 증식을 하게 된다. 내피세포의 발아는 서로 흡수되어 모세혈관 루프를 형성하며 새로운 혈관을 만들게 된다.
지속적이고도 통제되지 않는 맥관형성은 질병 상태, 종양의 전이, 및 내피세포에 의한 비정상적인 생장이 중복되는 경우 일어나게 되며, 이러한 조건 하에 나타나는 병리학적 손상을 뒷받침한다. 통제되지 않은 맥관형성이 존재하는 다양한 병리학적 질병 상태들은 맥관형성 의존성 또는 맥관형성 관련 질병으로 함께 분류되어 왔다.
종양의 생장이 맥관형성은 의존성이라는 가설이 1971 년 처음 제안되었다 (Folkman J., Tumor angiogenesis : Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285 : 1182-1186, 1971). 가장 간단한 용어로서, 그것은 다음과 같이 말한다 : "일단 종양의 '발생'이 일어나면, 종양 세포수에서의 모든 증가는 종양으로 수렴되는 새로운 모세혈관들의 증가에 의해 진행되어야만 한다". 종양의 '발생'은 현재, 수 입방 밀리미터 체적을 차지하며 수 밀리온 세포를 초과하지는 않는 종양 세포수의 증가가 존재하는 숙주 미세혈관 상에서 생존할 수 있는 단계인 종양 생장의 전 혈관화 단계를 나타내는 것으로 이해된다. 이 단계를 넘으면 종양 체적의 확장은 새로운 모세 혈관의 유도를 필요로 한다. 예컨대, 쥐에서의 초기 전 혈관화 단계에서 폐의 미세 전이는 조직부 상에 높은 해상도를 가지는 현미경에 의한 경우를 제외하고는 발견하지 못할 것이다.
이러한 개념을 지지하는 간접적인 증거의 예들은 다음과 같다 :
(1) 쥐의 피하 전이 공동에 이식된 종양의 생장 속도는 신생 혈관화 이전에는 느리며 거의 선형적이며, 신생 혈관화 후에는 빠르고 거의 지수적이다. (Algire GH, et al. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6:73-85, 1945).
(2) 혈관이 증식하지 않는 분리되어 살포된 조직에서 자라는 종양은 1-2 mm3에 제한되지만, 이들이 쥐에 이식되면 이 체적의 1000 배 이상으로 빠르게 증식하며 신생 혈관화된다. (Folkman J, et al., Tumor behavior in isolated perfused organs : In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164 : 491-502, 1966).
(3) 구혈 각막 내에서의 종양의 생장은 느리며 선형 속도로 일어나지만, 신생 혈관화 이후에는 지수적 생장으로 전환한다. (Gimbrone, M.A. Jr. et al., Tumor growth and neovascularization : An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cnacer Institute 52 : 41-427, 1974).
(4) 토끼 눈의 앞쪽 공동의 수액에 현탁된 종양은 구혈 상태로 생존하며 유지되고 1 mm3미만의 크기로 제한된다. 이들이 일단 홍채의 혈관 베드 상으로 이식되면, 그들은 신생 혈관화되며 빠르게 생장하여 2 주 내에 그들 최초 용적의 16,000 배까지 도달한다. (Gimbrone MA Jr. et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136 : 261-276).
(5) 종양이 병아리의 배의 융모뇨막 상으로 이식되면, 그들은 구혈 단계 동안에는 72 시간 이상 동안 느리게 생장하지만, 평균 직경 크기 0.93 + 0.29 mm 이상을 초과하지 않는다. 빠른 종양의 확장은 신생 혈관화 단계가 시작된 후 24 시간 이내에 일어나며, 7 일 이내에 이러한 혈관화된 종양은 평균 직경 8.0 + 2.5 mm 에 이르게 된다. (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35 : 347-356, 1977).
(6) 토끼 간에서의 전이의 혈관화 계산은 전이의 크기에 있어서 이질성을 나타내었지만, 혈관화가 존재하는 크기에 대해서는 비교적 균일한 절단점을 나타낸다. 종양은 일반적으로 직경에 있어서 1 mm 미만까지는 구혈 상태이지만, 그 직경을 넘어서는 신생 혈관화된다. (Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68 : 334-340, 1970).
(7) 췌장의 베타 세포 내에서 암을 일으키는 트랜스제닉(transgenic) 쥐에 있어서, 전 혈관화 과형성 섬조직들은 1 mm 미만의 크기로 제한된다. 6-7 주령에서, 4-10% 의 섬조직이 신생 혈관화되며, 이들 섬조직으로 부터 전 혈관화 섬조직 체적의 1000 배 이상 큰 혈관화된 종양이 생성되게 된다. (Folkman J. et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989).
(8) VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor : 혈관 내피세포 생장 인자)에 대한 특이 항체는 미세혈관 밀도를 감소시키며, (누드 마우스에 있어서) 맥관형성에 대한 그들 단독의 매개체로서 VEGF 에 의존하는 세가지 인간 종양 생장의 "상당하거나 현저한" 억제를 일으킨다. 그 항체는 시험관 내(in vitro)에서는 종양 세포의 생장을 억제하지 않는다 (Kim K J, et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844, 1993).
(9) 항-bFGF 모노클로날 항체는 맥관형성의 유일한 매개체로서의 bFGF 의 분비에 의존하는 마우스 종양의 생장을 70% 억제한다. 그 항체는 시험관 내(in vitro)에서 종양 세포의 생장을 억제하지 않는다. (Hori A., et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51 : 6180-6184, 1991).
(10) bFGF 의 복강내 주사는 일차 종양의 생장 및 종양 내에서의 모세혈관 내피세포의 생장을 자극하므로써 그것의 전이를 증가시킨다. 종양 세포 자체는 bFGF 에 대한 수용체가 부족하며, bFGF 는 시험관 내에서 (in vitro) 종양 세포에 대한 유사 분열 물질이 아니다. (Gross JL, et al., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79, 1990).
(11) 특이 맥관형성은 억제제(AGM-1470)는 생체 내에서 (in vivo) 종양 생장 및 전이를 억제하지만, 시험관 내에서는 종양 세포의 증식을 억제함에 있어서 훨씬 덜 활성을 나타낸다. 그것은 종양 세포의 증식을 억제하는 것에 비하여 최대 4 로그(log) 만큼 낮게 혈관 내피세포의 반(half) 증식을 억제한다. (Ingber D. et al., Angioinhibins : Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48 : 555-557, 1990). 종양 생장이 맥관형성은 의존적이라는 간접적인 임상학적 증거가 또한 있다.
(12) 유리질에 대해 전이되는 인간 망막아종은, (척출된 안구로 부터 분리되거나 시험관 내에서 분석될 때) 그들이 생존할 수 있으며3H-티미딘을 포함한다는 사실에도 불구하고, 1 mm3미만으로 제한되는 구혈구로서 생장한다.
(13) 난소암은 작은 구혈의 하얀 종자로서 (1-3 mm3) 복막으로 전이된다. 이러한 전이는 이들 중 하나 또는 그 이상이 신생 혈관화되기 전에는 거의 더 크게 생장하지 못한다.
(14) 유방암 (Weidner N, et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324 : 1-8, 1991, and Weidner N, et al., Tumor angiogenesis : A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J. Narl. Cancer Inst. 84 : 1875-1887, 1992) 및 전립선 암(Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143 (2) : 401-409, 1993)에 있어서의 신생 혈관화의 정도는 장래 전이의 위험과 매우 높게 연관된다.
(15) 인간 피부 흑색종으로 부터의 전이는 신생 혈관화 이전에는 거의 일어나지 않는다. 신생 혈관화의 개시는 증가된 병변 두께 및 전이의 증가된 위험으로 이끈다. (Srivastava A, et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76-4.0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133 :419-423, 1988)
(16) 방광암에 있어서, 맥관형성 단백질 bFGF 의 소변에서의 수준은 상태의 세포학적이기 보다 질병의 상태 및 정도에 대한 더욱 정밀한 지시를 나타낸다. (Nguyen M, et al., Elevated levels of an angiogenic protein, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85 : 241-242, 1993).
이리하여, 맥관형성은 암의 전이에 있어 중요한 역할을 함이 분명하다. 이러한 맥관형성 활성이 억제되거나 제거될 수 있다면, 암은, 비록 존재한다고 하더라도, 생장하지는 않을 것이다. 질병 상태에 있어서, 맥관형성의 억제는 새로운 미세 혈관 시스템의 침입에 의해 야기되는 손상을 피할 수 있을 것이다. 맥관형성 과정의 조절과 관련된 치료는 이러한 질병들의 폐지 또는 완화를 일으킬 수 있을 것이다.
그러므로, 필요로 되는 것은 원하지 않는 혈관, 특히 종양으로의 생장을 억제할 수 있는 조성물 및 방법이다. 그 조성물을 발견하고, 측정하며, 국부화시킬 수 있는 방법 또한 필요하다. 그 조성물은 전이 단계 이전의 종양에서 내인성 생장 인자의 활성을 극복하고 또한 종양 내에서의 모세혈관의 형성을 방지할 수 있음으로 인하여, 종양의 생장을 억제할 수 있어야 한다. 그 조성물, 조성물의 단편, 및 그 조성물에 특이적인 항체는 또한 다른 맥관형성 과정, 예컨대 상처 치유 및 재생과 같은 곳에서 모세 혈관의 형성을 조절할 수 있어야 한다. 맥관형성을 억제하기 위한 방법 및 조성물은 바람직하게 비독성이어야 하며 부작용을 거의 나타내지 않아야 한다. 그 조성물의 생합성 위치 뿐만 아니라, 그 조성물의 결합 위치를 발견하고, 측정하며, 고정하기 위한 방법 또한 필요하다. 그 조성물 및 조성물의 단편은 방사성 및 비 방사성 표지 목적 모두를 위한 다른 분자에 결합할 수 있는 것이어야 한다.
발명의 요약
본 발명에 따라, 원하지 않는 맥관형성은, 특히 종양 생장과 관련된 맥관형성을 억제하며, 맥관형성을 조절하는데 효과적인 방법 및 조성물들이 제공된다. 본 발명은, 시험관 내에서 bFGF 와 같은 내인성 생장 인자의 맥관형성 활성을 정복하는 그의 능력 및 그에 의한 거의 플라스미노겐 아미노산 98 위치에서 시작되는 플라스미노겐의 내부 부분에 대한 아미노산 서열의 상동성 및 구조적 유사성에 의하여 정의된 "안지오스타틴"이라고 명명된 단백질을 포함한다. 안지오스타틴은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 환원시키고 또한 쥐의 고유한 플라스미노겐 분자의 아미노산 번호 98 에서 시작하는 쥐 플라스미노겐의 단편의 그것과 거의 유사한 아미노산 서열(서열번호 2)을 가지므로써 결정되는 바와 같은, 약 38 킬로달톤 내지 45 킬로달톤 사이의 분자량을 가지는 단백질을 포함한다.
안지오스타틴의 아미노산 서열은 종에 따라 약간씩 다양하다. 예를 들어, 인간 안지오스타틴에 있어서 아미노산 서열은, 활성 인간 안지오스타틴 서열이 비록 고유한 인간 플라스미노겐 아미노산 서열의 97 또는 99 번 위치의 아미노산에서 시작한다고는 하나, 상기 서술한 쥐의 플라스미노겐 단편의 서열과 거의 유사하다. 또한, 인간 플라스미노겐 단편은 마우스 종양 모델에서 나타나는 바와 같이, 유사 항 맥관형성 활성을 가진다. 활성 안지오스타틴 분자에 있어서의 아미노산의 수는 다양할 수 있고, 내피세포 억제 활성을 가지는 모든 아미노산 서열은 본 발명에 속하는 것으로 생각됨을 알 수 있다.
본 발명은 인간 또는 동물에 상당히 정제된 안지오스타틴 또는 안지오스타틴 유도체를 맥관형성을 억제하기에 충분한 투여량으로 함유한 조성물을 투여하므로써, 원하지 않고 통제되지 않는 맥관형성에 의해 매개되는 질병 및 증상을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 종양 생장의 억제 또는 종양의 치료를 위하여 유용하다. 전 혈관화되어 전이된 종양을 가진 인간 또는 동물에게 안지오스타틴의 투여는 그러한 종양의 생장 또는 확장을 방지할 것이다.
본 발명은 또한 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열, 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터, 및 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 하나 또는 그 이상의 발현 벡터들을 포함하는 세포들을 포함한다. 나아가 본 발명은 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열이 생체 내에서 안지오스타틴 수준을 조정하기 위하여 환자에게 도입되는 유전자 치료법을 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 액체 및 조직 내에서 안지오스타틴의 측정 및 검침을 위한 키트, 및 조직 및 세포 내에서 안지오스타틴을 고정화시키기 위한 키트, 및 진단 방법들을 포함한다. 진단 방법 및 키트는 본 발명 분야의 숙련가들에게 잘 알려진 어떠한 구조라도 좋다. 본 발명은 또한 안지오스타틴 분자 및 이들의 부분에 특이적인 항체 및 안지오스타틴에 특이적인 항체의 결합을 억제하는 항체들을 포함한다. 이들 항체들은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체들일 수 있다. 안지오스타틴에 특이적인 항체들은 맥관형성에 의해 매개되는 암 또는 다른 질병의 발생 또는 재발을 진단 또는 예측하는 안지오스타틴의 존재 및 양을 측정하기 위한 진단 키트 내에서 사용될 수 있다. 안지오스타틴에 특이적인 항체들은 또한 인간 또는 동물을 안지오스타틴에 대하여 수동적으로 면역화하고, 그로 인하여 맥관형성 억제를 감소시키기 위하여 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 체액 내에서 안지오스타틴에 결합하는 항체의 존재 및 양을 측정하기 위한 키트 및 진단 방법을 포함한다. 진단 방법 및 키트는 당업자에게 잘 알려진 임의의 구조일 수 있다.
본 발명은 또한 안지오스타틴 수용체에 결합하고 세포에 적절한 신호를 전달하며, 촉진제 또는 길항제로서 작용하는 항 안지오스타틴 수용체 특이적 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 방사선 동위 원소적으로, 또는 검출 및 양전자 방출 단층 X선 사진 촬영법, 자가방사사진, 흐름 혈구 계산법, 라디오 수용체 결합 검사, 및 면역조직화학 등을 비롯하나 이에 제한되지 않는 기술들로써 안지오스타틴 결합 부위의 가시화에 사용되는 다른 분자 또는 단백질로써 라벨화될 수 있는 안지오스타틴 단백질 단편 및 유사체들을 포함한다.
이러한 안지오스타틴 단백질들 및 유사체들은 또한 안지오스타틴 수용체에서 촉진제 및 길항제로서 작용하며, 그리하여 안지오스타틴의 생물학적 활성을 증가시키거나 또는 막는다. 그러한 단백질들은 안지오스타틴 수용체의 분리에 사용된다.
본 발명은 또한 안지오스타틴, 안지오스타틴 단편들, 안지오스타틴 항혈청, 또는 치료적 및 연구 분야를 위한 세포 독성제와 관련된 안지오스타틴 수용체 촉진제 및 안지오스타틴 수용체 길항제들을 포함한다. 나아가, 안지오스타틴, 안지오스타틴 단편들, 안지오스타틴 항혈청, 안지오스타틴 수용체 촉진제 및 안지오스타틴 수용체 길항제들은 제약학적으로 수용할 수 있는 부형제, 및 선택적으로 생분해 가능한 중합체와 같은 지효성 방출 화합물 또는 조성물들과 함께 조합되어 치료적 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명은 안지오스타틴의 전사 및 해독과 관련된 리보핵산 및 데옥시리보핵산을 위한 분자적 탐침물들을 포함한다. 이러한 탐침물들은 조직 및 세포들에서 안지오스타틴 생합성을 검출 및 측정하기 위한 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 안지오스타틴을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 맥관형성에 의해 매개되는 질병 및 증상을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 체액 또는 조직 내의 안지오스타틴의 양 및 존재를 검출하기 위한 키트 및 진단 또는 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 헤마지오마(hemagioma), 충실성 종양, 혈액 내 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관 확장증, 건선, 공피증, 화농성 육아종, 심근층 맥관형성은, 크론(Crohn)씨 병, 플라크 신생 혈관화, 관상 측부, 뇌측부, 동정맥 기형, 허혈성 지절 맥관형성은, 각막 질환, 피부 조흥, 신생 혈관성 녹내장, 당뇨성 망막증, 후수정체 섬유 증식증, 관절염, 당뇨성 신생 혈관증, 반점 퇴화 (macular degeneration), 상처 치유, 소화성 궤양, 헬리코박터 관련 질병, 골절, 해족종, 혈관생성, 혈액 생성, 배란, 생리, 태반 형성, 및 묘조열을 비롯한, 그러나 이에 제한되지는 않는, 맥관형성에 의해 매개되는 질병 및 증상을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 암의 생장을 치료 또는 억제하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생체 내 또는 시험관 내에서 안지오스타틴을 생산하는 효소의 활성 또는 생산을 조절하거나 흉내내는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 안지오스타틴 또는 항-안지오스타틴 항체를 필요로하는 인간 또는 동물에게 안지오스타틴 DNA 를 직접 주사하므로써, 안지오스타틴 또는 항-안지오스타틴 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 체액 내의 안지오스타틴에 특이적인 항체의 존재를 검출 및 정량화하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 플라스미노겐을 인식하지 못하는 안지오스타틴 분자의 특정 영역에 선택적인 안지오스타틴에 대한 항체들로 구성된 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 암의 검출 또는 예측을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생체 내 및 시험관 내에서 안지오스타틴 결합 부위를 가시화 및 정량화함에 있어 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 안지오스타틴 생합성의 검출 및 정량화에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 최소의 부작용을 갖는 암 치료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 암의 생장을 치료 또는 억제하기 위한 세포 독성제와 관련된 안지오스타틴 또는 안지오스타틴 단백질을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 안지오스타틴 관련 조성물을 특정 부위로의 표적화된 전달을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 맥관형성 과정의 조절을 위한 유전자 치료법에 유용한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들, 그리고 다른 목적, 특징 및 유용성 등은 이하 개시된 실시예의 상세한 기술 및 첨부된 청구범위를 살펴본 후 명확해질 것이다.
본 발명은 안지오스타틴이라고 불리는 내피세포 억제제에 관한 것으로서, 이는 내피세포의 증식을 가역적으로 억제하는 것이다. 특히, 본 발명은 혈액 또는 소변과 같은 체액으로 부터 분리 가능하거나, 또는 재조합, 효소적, 또는 화학적 방법에 의하여 합성 가능한 안지오스타틴 단백질에 관한 것이다. 안지오스타틴은 맥관형성 관련 질병을 억제하며 또한 맥관형성 과정을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한, 안지오스타틴 측정을 위한 키트 및 진단 검사, 안지오스타틴의 위치추정을 위한 조직 화학 키트, 안지오스타틴 및 안지오스타틴 생합성을 모니터하기 위한 분자 탐침을 암호화하는 DNA 서열, 안지오스타틴에 특이적인 항체, 안지오스타틴 수용체에 대한 단백질 촉진제 및 길항제의 개발, 항-안지오스타틴 수용체 특이 항체 촉진제 및 길항제, 그리고 안지오스타틴 단백질과 관련된 세포독성제에 관한 것이다.
제 1 도는 서열번호 1 의, 전체 쥐 플라스미노겐의 아미노산 서열이다.
제 2 도는 쥐 안지오스타틴의 시작 서열(서열번호 2)를 나타내며, 쥐 서열을 대응하는 인간 (서열번호 3), 붉은털 원숭이 (서열번호 4), 돼지 (서열번호 5), 및 소 (서열번호 6) 플라스미노겐 단백질 단편의 서열들과 비교하였다. 마우스 서열이 처음에 나타나고, 그 다음으로 인간, 붉은털 원숭이, 돼지 및 소의 순으로 기록되었다.
제 3 도는 일차 종양의 존재 및 부재 하에서 폐 내의 종양 세포의 BrdU 표지화의 인덱스를 나타낸다.
제 4 도는 생체 내에서 bFGF 유도 맥관형성은 상의 루이스(Lewis) 폐 일차 종양의 영향의 마트리겔(Matrigel) 분석을 나타낸다.
제 5 도는 루이스(Lewis) 폐암(LLC-아래)을 가지는 마우스로 부터의 혈청 대 정상 마우스로 부터의 혈청에 대한 투여량 응답 곡선을 나타낸다. 소의 모세혈관 내피세포들이 bFGF 에 의해 유도된 72 시간의 증식 검사에서 검사되었다.
제 6 도는 낮고 높은 전이 종양 모두가 그들의 복수 내에 내피세포의 유사 분열적 활성을 가지나, 낮은 전이 종양주가 혈청 내에서 내피세포의 억제적 활성을 가짐을 나타낸다.
제 7 도는 종양 함유 동물로 부터의 부분적으로 정제된 혈청 또는 소변의 C4 역상 크로마토그래피 곡선을 나타낸다.
제 8 도는 고유한 플라스미노겐 분자, 인간 플라스미노겐의 라이신 결합 부위 I 로 부터의 활성 단편, 종양 함유 마우스로 부터의 농축 소변, 및 정상 마우스로 부터의 농축 소변으로써 13 일 동안 마우스를 치료한 후의 표면 폐 전이를 나타낸다.
제 9 도는 고유한 플라스미노겐 분자, 인간 플라스미노겐의 라이신 결합 부위 I 로 부터의 활성 단편, 종양 함유 마우스로 부터의 농축 소변, 및 정상 마우스로 부터의 농축 소변으로써 13 일 동안 마우스를 치료한 후의 폐 무게를 나타낸다.
제 10 도는 pTrcHis 벡터의 개략도를 나타낸다.
제 11 도는 10L 로 스케일된 발효로 부터 인간 안지오스타틴을 발현시키고, 인간 플라스미노겐 크링글(kringle) 영역 1-3 에 대한 모노클로날 항체로써 추적된 이.콜라이 의 면역 블롯을 나타낸다. 화살표는 재조합 인간 안지오스타틴을 나타낸다. A) 는 0.2 M 아미노 카프로산으로 용출시킨 재조합 안지오스타틴을 나타내고; B) 는 라이신 칼럼을 1 X PBS 로써 마지막으로 세척한 것을 나타내며; C) 는 부서진 세포들로 부터의 명백한 분해질을 나타낸다.
제 12 도는 용매의 희석의 함수로서 생장하는 소 모세혈관 내피세포의 퍼센트 억제를 나타내는 그래프이다 ; A1, A2, B1, B2 및 E 는 인간 안지오스타틴 항-맥관형성은 활성을 나타내는 재조합 클론들이다 ; C1, C2, D1 및 D2 대조군들은 안지오스타틴을 암호화하는 인간 DNA 서열 없이 오직 벡터만을 함유한 음성 대조군 클론들이다.
제 13 도는 시험관 내에서 소 모세혈관 내피세포 상의 재조합 인간 안지오스타틴의 증식에 대한 억제 효과를 나타내는 것이다.
제 14 도는 일차 종양의 제거 및 식염수 또는 맥관형성 활성을 가지는 푸마길린 유사체로써 처치된 후의 생장 증식 지수 및 세포 자멸사 지수를 나타낸다.
제 15 도는 생체 내에서 인간 안지오스타틴을 40 mg/kg/day 의 일회 주사로써 처치함에 따른 쥐에서의 T241 일차 종양의 생장 억제를 나타낸다.
제 16 도는 생체 내에서 인간 안지오스타틴을 투여량 당 40 mg/kg 으로 두번 (80 mg/kg/day) 투여하여 처치함에 따른 마우스 내에서의 LLC-LM 일차 종양의 생장 억제를 나타낸다.
제 17 도는 그의 폐 전이의 생장 상에서, 루이스 폐암 일차 종양의 제거 효과를 나타낸다.
제 18 도는 종양 제거 후의 생장 증식 및 세포 자멸사 지수를 나타낸다.
제 19 도는 이식된 T241 섬유육종 세포를 가지는 쥐에게 전체 종양 체적에 대하여 안지오스타틴 단백질을 투여한 효과를 시간의 함수로서 나타낸 것이다.
제 20 도는 이식된 루이스 폐암(LM) 세포를 가지는 쥐에게 전체 종양 체적에 대하여 안지오스타틴 단백질을 투여한 효과를 시간의 함수로서 나타낸 것이다.
제 21 도는 이식된 세망 세포 육종 세포를 가지는 쥐에게 전체 종양 체적에 대하여 안지오스타틴 단백질을 투여한 효과를 시간의 함수로서 나타낸 것이다.
제 22 도는 이식된 인간 전립선 암 PC-3 세포를 가지는 면역 결핍 SCID 마우스에게 전체 종양 체적에 대하여 안지오스타틴 단백질을 투여한 효과를 24 일 기간 동안 시간의 함수로서 나타낸 것이다.
제 23 도는 이식된 인간 유방암 MDA-MB 세포를 가지는 면역 결핍 SCID 마우스에게 전체 종양 체적에 대하여 안지오스타틴 단백질을 투여한 효과를 24 일 기간 동안 시간의 함수로서 나타낸 것이다.
제 24 도는 마우스 플라스미노겐 cDNA 로 부터 유래된 마우스 안지오스타틴 단백질을 암호화하는 마우스 DNA 서열의 클로닝에 대한 개략도이다. 마우스 안지오스타틴은 마우스 플라스미노겐 크링글 영역 1-4 를 포함한다. PCR 은 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 의미한다 ; P1 은 PCR 을 위한 5'-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머이고 ; P2 는 PCR 을 위한 3'-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머이며 ; SS 는 시그널 서열을 나타내고 ; ATG 는 해독 개시 코돈이며 ; TAA 는 해독 중지 코돈이고 ; HA 는 헤마글루티닌 에피토프 택(YPYDVPDYASL)을 나타내며 ; K1, K2, K3 및 K4 는 마우스 플라스미노겐 크링글 영역 1, 2, 3 및 4 를 각각 나타낸다. CMV 는 거대세포 바이러스 (cytomegalovirus) 프로모터이고 ; T7 은 세균 파아지 프로모터이며 ; PA 는 전-활성 (pre-activation) 단백질이고 ; SP6 는 Sp6 프로모터이다.
제 25 도는 형질감염되지 않은 세포(mock)에 대한 일수의 함수로서 세포수를 나타낸다 ; 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열 없이 (벡터 5) 벡터만으로 형질감염된 세포들, 및 두개의 안지오스타틴 발현 클론들 (AST 31 및 AST 37). 패널 (a)는 T241 세포의 형질감염의 결과를 나타낸다. 패널 (b)는 LL2 세포의 결과를 나타낸다.
제 26 도는 안지오스타틴 클론을 함유하는 이.콜라이 세포들로 부터 유래된 배양액의 결과를 세포 번호 상에 나타낸다. 형질감염되지 않은 세포 (mock); 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열 없이 (벡터 5) 벡터만으로 형질감염된 세포, 및 세개의 안지오스타틴 발현 클론들 (AST 25, AST 31 및 AST 37). 패널 (a)는 대조군 (mock) 및 모든 안지오스타틴 클론들(발현 및 비발현)의 접종 결과를 세포 번호 상에 나타낸다. 패널 (b)는 대조군 (mock), 벡터만을 포함한 것(벡터 6), 및 마우스 안지오스타틴을 발현하는 안지오스타틴 클론들로 부터 유래된 배양액의 접종 결과를 세포 번호 상에 나타낸다. 패널 (c)는 대조군 (mock) 및 마우스 안지오스타틴을 발현하는 클론들로 부터 유래된 정제된 배양액의 접종 결과를 나타내는데, 여기서 배양액은 라이신-세파로스 칼럼 상에서 라이신 결합 성분들을 수확하므로써 정제되었다.
제 27 도는 마우스 내에서 T241 섬유육종 세포를 이식한 효과를 전체 종양 체적 상에서 시간의 함수로서 나타낸 것이며, 여기서 섬유육종 세포는 안지오스타틴 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로써 형질감염된 것이고, 또한 그 벡터는 안지오스타틴 단백질을 발현할 수 있는 것이다. "형질감염되지 않은"이란 변형되지 않은 T241 섬유육종 세포가 마우스 내에 이식되는 것을 의미한다. "벡터 6"은 마우스 내에 이식되는 벡터가 안지오스타틴 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하지 않은 것으로만 형질감염된 T241 섬유육종 세포를 나타낸다. "클론 25, 클론 31, 및 클론 37"은 마우스 내에 이식된 안지오스타틴 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로써 형질감염된 T241 섬유육종 세포의 세개의 안지오스타틴-생성 클론들을 나타낸다.
제 28 도는 인간 플라스미노겐의 구조 및 그의 크링글 단편들에 대한 개략도이다. 인간 플라스미노겐은 Asn 289 위치에서 N-연결된 글리코실화의 한 측쇄를 가지는 791 아미노산을 함유한 단일쇄 단백질이다. 다섯개의 분리된 영역들 내에 존재하는 N-말단 561 아미노산으로 구성된 인간 플라스미노겐의 비 프로테아제 영역은, 원 내에 표시된 바와 같은 크링글들(K1, K2, K3, K4 및 K5)을, 이들 구조를 분리하는 단백질들과 함께 명명한다. 각 삼중 디설파이드 결합 크링글은 80 개의 아미노산을 함유한다. 안지오스타틴은 이들 크링글 영역들(K1-4) 중 처음 4 개를 포함하며, 크링글 3 (K1-3) 및 크링글 4 (K4)는 인간 플라스미노겐을 엘라스타제로 소화시키므로써 얻어질 수 있다. 나머지 크링글 단편들은 이.콜라이 에서 발현된 재조합 단백질들이다. SS = 단일 서열, PA = 전 활성 단백질.
제 29 도는 환원 조건 하에서 플라스미노겐의 정제된 재조합 및 천연 크링글 단편들의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. (A) 이.콜라이 세균 분해질로 부터 정제된 각 재조합 크링글 단편들을 15% SDS 겔 상에 로딩한 뒤 쿠마시 블루(Coomasie blue)로 염색하였다. 레인 당 각 단백질 약 5 ㎍ 씩을 로딩하였다. (레인 2 = 크링글 1 (K1); 레인 3 = 크링글 2 (K2) ; 레인 4 = 크링글 3 (K3) ; 레인 5 = 크링글 4 (K4) ; 레인 1 = 분자량 마커). (B) 정제된 큰 크링글 단편들을 쿠마시 블루로 염색하였다. 크링글 1-4 (레인 2) 및 크링글 1-3 (레인 3)을 인간 플라스미노겐을 엘라스타제로 소화시켜 얻고 라이신-세파로스 크로마토그래피로 정제하였다. 크링글 2-3 (레인 4)는 이.콜라이 내에서 발현되었고 시험관 내(in vitro)에서 재용해되었다. 분자량 마커는 왼쪽(레인 1)에 나타난다.
제 30 도는 안지오스타틴의 재조합 각 크링글 단편들에 의한 내피세포 증식의 억제를 나타낸다. 크링글 단편들은 1 ng/ml bFGF 의 존재 하에 72 시간 동안 소 모세 혈관 내피세포 상에서 검사되었다. (A) 두개 라이신-결합 크링글들, rK1 및 rK4 의 항-내피세포 증식 효과. 높은 친화성 라이신 결합 크링글 K1 ( -o- )은 투여량-의존 방식으로 BCE 세포의 증식을 억제하였다. 중간 정도의 친화성 라이신 결합 크링글, K4 ( -- )는 높은 농도에서 매우 낮은 억제 효과를 나타내었다. (B) 비-라이신 결합 K2 및 K3 에 의한 BCE 세포의 억제. K2( -- ) 및 K3( -- ) 모두는 투여량 의존 방식으로 BCE 세포 증식을 억제하였다. 데이터는 삼중체들의 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
제 31 도는 안지오스타틴의 큰 크링글 단편들의 항-내피세포 증식 활성을 나타낸다. 단백질 분해성 단편들, K1-4 (안지오스타틴)( -o- ) 및 K1-3( -- )은 투여량 의존 방식으로 BCE 세포 증식을 억제하였다. 재조합 K2-3 ( -- ) 단편들은 K1-3 및 K1-4 보다는 낮은 잠재적인 억제를 나타내었다. 데이터는 억제의 퍼센트로서 세개의 측정값의 평균(+/- SEM)을 나타낸다.
제 32 도는 재조합 크링글 2 및 크링글 3 의 부가적인 억제 활성을 나타낸다. rK2-3 의 고유 단편은 (제 31 도를 또한 참조하라) 320 nM 의 농도에서만 약한 억제 효과를 나타내었다. 동일한 농도에서, rK2 (시스테인이 제 169 번 위치에서 세린에 의해 치환된 것) 및 K3 (297 번 위치에서 세린에 의해 시스테인이 치환됨)의 돌연변이체가 BCE 세포 상에서 함께 분석되었을 때, 부가적인 억제가 나타났다. 각 값은 삼중체들의 +/- SEM 값을 나타낸다. (B) K2 및 K3 의 아미노산 서열 및 개략적 구조. 쇄 내 크링글 디설파이드 결합은 K2 의 시스테인 169 와 K3 의 시스테인 297 사이에 존재하는 것으로 이미 보고되었다 (Sohndel, S., Hu, C.K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press).
제 33 도는 조합된 크링글 단편들에 의한 내피세포 증식의 억제를 나타낸다. 검사는 각 크링글 단편에 대하여 320 nM 의 농도로써 수행되었다. 값은 억제의 퍼센트로서 세개 측정값들의 평균(+/- SEM)을 나타낸다. (A) 다양한 각각의 크링글들의 조합에 의한 단편들의 억제 효과. (B) 조합된 크링글 단편들의 조합적 억제 활성.
제 34 도는 환원 및 알킬화 후 내피세포들 상에서 안지오스타틴의 억제 활성을 나타낸다. (A) 인간 안지오스타틴의 환원된 것 (레인 2) 및 환원되지 않은 (레인 1) 형태들의 SDS-PAGE 분석. 정제된 인간 안지오스타틴은 DTT 및 과량의 아이오도아세트아미드로써 단백질을 알킬화하므로써 환원되었다. 처리된 샘플들을 투석시킨 후 BCE 세포 상에서 분석하였다. (B) 320 nM 의 농도에서 환원되고 환원되지 않은 형태의 안지오스타틴에 의한 BCE 세포 증식의 억제. 데이터는 삼중체들의 억제 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
제 35 도는 인간 안지오스타틴의 추정되는 크링글 영역의 아미노산 서열 배치를 나타낸다. 네개 크링글 영역들의 서열은 그들의 보존적 시스테인에 따라 배열되었다. 동일하며 보존적인 아미노산들은 검은 부분으로 표시하였다. 크링글 4 에서 상자 내의 아미노산들은 22 번 및 80 번의 보존적 시스테인 잔기들 옆의 양전하를 띤 이중 라이신들을 나타낸다.
제 36 도는 발현된 안지오스타틴의 라이신-결합 특성 및 반응성을 나타낸다.
제 36a 도는 쿠마시 염색된 겔(40 ㎕ 로딩)을 나타낸다.
제 36b 도는 유사한 겔의 염색 블롯(20 ㎕ 로딩)을 나타낸다. 레인 1 은 약 50 kD 에서의 안지오스타틴 단백질 및 몇몇 다른 단백질들을 나타내는 유도된 배양액의 교반 플라스크들로 부터의 배양액을 나타낸다. 유도된 배양물로 부터의 배양액은 완충액으로 1 : 1 희석된 후 직접 라이신-세파로스 상으로 로딩된다. 레인 2 는 라이신 칼럼을 통과하여 결합하지 않은 분획을 나타낸다. 피. 파스토리스에 의해 발현된 모든 안지오스타틴 단백질은 라이신 칼럼에 결합하였다. 레인 3 은 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질은 라이신에 결합하며, 따라서 라이신-세파로스를 통과시켜 단일 단계로써 균일하게 정제될 수 있음을 보여주는 0.2 M 아미노 카프로산에 의한 특정 용출을 나타낸다. 또한, 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질은 크링글 1 내지 3 에 대하여 발생된 순응적으로 의존적인 모노클로날 항체(VAP)에 의해 인식되었다.
제 37 도는 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질이 분리되고 환원되지 않은 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔 상에서 49 kD 및 51.5 kD 으로 이동하는 이중체로서 나타남을 보여 준다. N-결합된 복합 쇄를 고 만노스 구조에 대하여 특이적인 N-글리카나제를 가지는 발현된 안지오스타틴 단백질로 부터 분리하면 49.5 kD 의 단일 밴드만이 남게 된다. 패널 A 및 패널 B 는 쿠마시 염색 겔 및 유사 겔의 면역 블롯을 각각 나타낸다. 레인 1 은 정제된 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질을 나타낸다. 레인 2 는 정제된 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질이 N-글리카나제 없는 소화 조건 내에 접종된 것을 나타낸다. 레인 3 은 N-글리카나제로써 소화된, 정제된 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질을 나타낸다.
제 38a 도는 쿠마시 겔 상에서 이중체로서의 4 ㎍ 의 정제된 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질을 나타낸다.
제 38b 도는 정제된 재조합체가 BCE 증식을 억제함을 나타낸다. 72 시간 후에 얻어진 BCE 분석 세포 계수가 bFGF 의 존재 () 및 부재 () 하, 및 대조군으로서 PBS 와 함께 bFGF 의 존재 (), 그리고 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질과 함께 bFGF 의 존재 () 하에 나타난다.
제 38c 도는 억제가 투여량 의존적임을 나타낸다.
제 39 도는 피. 파스토리스 발현된 정제된 안지오스타틴을 일차 종양을 가지는 마우스에 전신으로 (피하 지방을 통하여) 투여되는 것을 나타낸다.
제 39a 및 b도는 식염수 또는 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 또는 플라스미노겐 유도된 안지오스타틴 단백질로써 매일 처리된 마우스의 전이 수 및 폐 무게를 각각 나타낸다. 식염수로 처리된 마우스의 폐와는 대조적으로, 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질 또는 플라스미노겐 유도된 안지오스타틴 단백질로 처리된 마우스의 폐는 비 혈관화되었으며 전이도 잠재적으로 억제되었다.
제 40 도는 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴으로 처리한 마우스의 폐가 전이됨에 따라 분홍빛이었음에 반하여, 식염수 대조군의 폐는 혈관화된 전이에 의하여 완전히 뒤덮혀 있었음을 나타낸다.
본 발명은 맥관형성에 수반하거나 또는 이에 의해 매개되는 질병 및 증상의 치료 및 검출을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 조성물은 혈청, 소변 및 복수액을 포함하나 이에 제한되지 않는 체액으로 부터 분리할 수 있거나, 또는 화학적 또는 생화학적 방법(예컨대, 세포 배양, 재조합 유전자 발현, 단백질 합성, 및 활성 안지오스타틴을 얻기 위한 플라스미노겐 또는 플라스민의 시험관 내 효소적 분해)에 의하여 합성될 수 있는 안지오스타틴이다. 재조합 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용한 DNA 급원으로 부터의 유전자의 증폭, 및 역 전사/PCR 을 이용한 RNA 급원으로 부터의 유전자의 증폭을 포함한다. 안지오스타틴은 혈관화되었거나 혈관화되지 않은 종양과 같은 조직으로의 혈관의 생장을 억제한다.
본 발명은 또한 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터(이 때 벡터는 세포 내에 존재할 때 안지오스타틴을 발현할 수 있는 것)를 함유하는 조성물, 벡터를 함유하는 세포(이 때 벡터는 안지오스타틴 또는 이의 유사체 또는 단편들을 암호화하는 DNA 서열을 함유하며, 그 벡터는 세포 내에 존재할 때 안지오스타틴을 발현할 수 있는 것)를 포함하는 조성물, 및 인간 또는 비 인간 동물에게 벡터를 함유하는 세포(이 때 벡터는 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하며, 그 벡터는 세포 내에 존재할 때 안지오스타틴을 발현할 수 있는 것)를 이식하는 것으로 구성되는 방법을 포함한다.
나아가, 본 발명은 치료적 조성물을 제조하기 위하여, 안지오스타틴, 안지오스타틴 단편, 안지오스타틴 항혈청, 및 제약학적으로 수용 가능한 부형제, 및 선택적으로, 생분해되는 중합체와 같은 서방출 화합물 또는 조성물들과 조합되는 안지오스타틴 수용체 촉진제 또는 안지오스타틴 수용체 길항제들을 포함한다. 특히, 본 발명은 안지오스타틴에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 조성물을 포함하는데, 여기서 항체는 플라스미노겐에는 결합하지 않는다.
더 구체적으로, 본 발명은 약 38 내지 45 킬로달톤(kD)의 분자량을 가지며 시험관 내에서 bFGF 와 같은 내인성 생장 인자의 맥관형성 활성을 극복할 수 있는 안지오스타틴으로 명명된 단백질을 포함한다. 안지오스타틴은 환원 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의하여 측정된 바 약 38 킬로달톤 내지 45 킬로달톤의 분자량을 가지며 고유 쥐 플라스미노겐 분자의 98 번 아미노산에서 시작하는 쥐 플라스미노겐 단편과 거의 유사한 아미노산 서열을 가지는 단백질이다. 여기서 아미노산의 번호매김은 플라스미노겐 분자의 개시 메티오닌으로 부터 번호를 매기는 종래의 방법에 상응한다.
안지오스타틴 아미노산 서열을 언급하면서 사용되는 용어 "거의 유사한"이란, 항-맥관형성 활성을 가지며 약 38 kD 내지 45 kD 의 분자량을 가지는 아미노산 서열을 의미하는데, 이는 또한 38 kD 내지 45 kD 중량의, 대략 마우스 플라스미노겐 98 번 아미노산에서 시작하는 마우스 플라스미노겐의 단백질 단편과 높은 정도의 서열 상동성을 가진다. 높은 정도의 상동성이란 적어도 약 60% 의 아미노산 상동성을 의미하며, 바람직하게는 적어도 70% 의 아미노산 상동성이고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 의 아미노산 상동성을 의미한다. 여기 사용된 용어 "내피세포 억제 활성"이란 대체로 분자의 맥관형성을 억제할 수 있는 능력을 의미하하는데, 예컨대, 섬유아세포 생장 인자의 존재 하에 배양액 내에서 소 모세 혈관 내피세포의 생장을 억제할 수 있는 능력을 의미한다.
전체 쥐 플라스미노겐 분자의 아미노산 서열은 제 1 도에 나타나 있고, 서열번호 1 이다. 안지오스타틴 단백질에 대한 서열은 대략 아미노산 98 에서 시작할 수 있다. 활성 인간 안지오스타틴은 그러나, 여러 다른 위치에서도 또한 시작할 수 있다. 예들은 활성 안지오스타틴 단백질을 암호화하는 유전적 구조가 예를 들어 93 번 아미노산 또는 102 번 아미노산에서 시작할 수 있음을 보여 준다.
마우스로 부터의 안지오스타틴의 첫번째 339 아미노산의 아미노산 서열이 제 2 도에 나타나 있고 (서열번호 2), 이것이 인간 (서열번호 3), 붉은털 원숭이 (서열번호 4), 돼지 (서열번호 5) 및 소 (서열번호 6)로 부터의 대응하는 플라스미노겐 단백질 단편의 서열들과 비교된다. 이러한 서열들이 그들의 아미노산 서열의 50% 이상에서 일치한다는 사실을 고려할 때, 안지오스타틴의 아미노산 서열은 종 사이에서 실질적으로 유사함을 알 수 있다. 안지오스타틴 내 아미노산의 전체 수는 정확하게 알려져 있지 않으나, 활성 분자의 분자량에 의해 정의된다. 본 발명의 안지오스타틴의 아미노산 서열은 플라스미노겐 분자가 어느 종으로 부터 유래하느냐에 따라 다양할 수 있다. 따라서, 인간 플라스미노겐으로 부터 유래되는 본 발명의 안지오스타틴이 마우스로 부터 유래되는 안지오스타틴과 약간 다른 서열을 가진다고 하더라도, 마우스 종양 모델에서 나타나는 바와 같이 그것은 항-맥관형성 활성을 가진다.
안지오스타틴은 시험관 내에서 내피세포의 생장을 억제할 수 있는 것으로 보여져 왔다. 안지오스타틴은 다른 세포 타입으로 부터 유래된 세포주의 생장은 억제하지 않는다. 특히, 안지오스타틴은 루이스 폐암 세포주, 밍크 폐 상피, 3T3 섬유아세포, 소 대동맥 평활근 세포, 소 망막 색체 상피, MDCk 세포 (개의 신장 상피), W138 세포 (인간 태아 폐 섬유아세포), EFN 세포 (쥐 태아 섬유아세포), 및 LM 세포 (쥐 연결 조직) 상에서는 아무런 효과도 나타내지 않는다. 종양 함유 마우스에서의 내인성 안지오스타틴은 약 10 mg 안지오스타틴/kg 체중의 전신 농도에서 전이를 억제하는데 효과적이다.
안지오스타틴은 플라스미노겐 분자의 크링글 영역에 의해 구획되는 특이적인 3 차원적 구조를 가진다. (Robbins, K. C., "The plasminogen-plasmin enzyme system" Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2nd Edition, ed. by Colman, R.W. et al. J.B. Lippincott Company, pp. 340-357, 1987). 플라스미노겐 분자의 NH2말단부에는, 형태적으로 관련된 모티프이고 상당한 서열 상동성을 가지는 다섯개의 그러한 크링글 영역이 있다. 기능적 안지오스타틴의 삼차원 구조는 1 번 부터 5 번까지의 플라스미노겐 크링글 영역들을 포함하기 위한 것으로 생각된다. 플라스미노겐 분자의 각 크링글 영역은 약 80 개의 아미노산을 함유하며 3 개의 디설파이드 결합을 포함한다. 이 시스테인 모티프는 다른 생물학적으로 활성인 단백질에도 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질들은 프로트롬빈, 간세포 생장 인자, 분산 인자 및 마크로파지 자극 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. (Yoshimura, T, et al., :Cloning, sequencing, and expression of human macrophage stimulating protein (MSP, MST1) confirms MSP as a member of the family of kringle proteins and locates the MSP gene on Chromosome 3" J. Biol. Chem., Vol. 268, No. 21, pp. 15461-15468, 1993). 생체 내에서 항-맥관형성 활성을 가지며 삼차원 크링글과 같은 구조 또는 시스테인 모티프를 가지는 어떠한 분리된 단백질 또는 단백질도 본 발명의 부분인 것으로 생각된다.
본 발명은 또한 암과 같은 질병의 진단 또는 예후의 목적으로 체액 및 조직에서의 안지오스타틴의 검출을 또한 포함한다. 본 발명은 또한 세포 및 조직 내에서 안지오스타틴 결합 부위 및 수용체들의 검출을 포함한다. 본 발명은 또한 안지오스타틴의 생성을 자극하고/하거나, 실질적으로 정제된 안지오스타틴, 또는 안지오스타틴 촉진제 또는 길항제, 및/또는 안지오스타틴 항혈청 또는 안지오스타틴 항혈청에 대한 항혈청을 환자에게 투여하므로써, 관절염 및 종양과 같은 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는 맥관형성 질병 및 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 부가적인 치료 방법은 안지오스타틴, 안지오스타틴 단편, 안지오스타틴 유사체, 안지오스타틴 항혈청, 또는 세포독성제와 관련된 안지오스타틴 수용체 촉진제 및 길항제의 투여를 포함한다. 안지오스타틴은 동물 또는 인간 급원의 것일 수 있음을 알 수 있다. 안지오스타틴은 또한 화학 반응 또는 발현 시스템과 결합된 재조합 기술에 의하여 합성될 수 있다. 안지오스타틴은 또한 항-맥관형성 활성을 가지는 단백질을 생성하도록 효소적으로 절단 분리된 플라스미노겐 또는 플라스민에 의하여 생성될 수 있다. 안지오스타틴 생성은 플라스미노겐 절단 효소의 활성에 영향을 미치는 화합물들에 의하여 조절될 수도 있을 것이다.
안지오스타틴에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 수동적 항체 요법이 재생, 발생, 및 상처 치유 및 조직 복구와 같은 맥관형성-의존성 증상을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 안지오스타틴 항체의 Fab 영역과 관련된 항혈청은 안지오스타틴을 결합하기 위한 내인성 안지오스타틴 항혈청의 능력을 막기 위하여 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 안지오스타틴을 암호화하는 유전자가 환자 내에서 조절되도록 하는 유전자 요법을 포함한다. 유전자 생성 단백질의 발현을 위한 세포로의 DNA 의 전달 또는 이동, 또는 유전자 요법으로 일컬어지는 다양한 방법들이 Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4) : 335-356 (1992))에 개시되어 있으며, 이것은 여기 참고로 포함된다. 유전자 요법은 ex vivo 또는 in vivo 요법 중 하나에서 사용되기 위한 체세포 또는 생식 세포로의 DNA 서열의 통합을 포함한다. 유전자 요법은 유전자를 대치하고, 정상 또는 비정상 유전자 기능을 증가시키고, 또한 감염성 질병 및 다른 병상을 퇴치하기 위하여 작용한다.
유전자 요법과 관련된 이러한 의학적 문제들을 치료하기 위한 전략에는, 결함있는 유전자를 확정하고, 그 후 결함 유전자의 기능을 대체하거나 또는 약간 기능적인 유전자를 가하는 것과 같은 치료적 전략 ; 또는 상태를 치료하거나 또는 조직 또는 기관이 처치 부위에 보다 잘 적응할 수 있도록 하는 산물 단백질을 위한 유전자를 첨가하는 것과 같은 예방적 전략이 포함된다. 예방적 전략의 일례로서는, 안지오스타틴과 같은 유전자를 환자 내에 놓아 안지오제네시스의 발생을 예방하거나, 또는 종양 세포를 방사선에 대하여 보다 순응적으로 만드는 유전자를 삽입하여 종양의 방사선이 종양 세포를 더 많이 죽이도록 하는 방법들을 들 수 있다.
본 발명에서, 안지오스타틴 DNA 또는 안지오스타틴 조절 서열들의 전달을 위한 많은 전략을 생각할 수 있다. 특히 안지오스타틴과 관련하여 정상적으로 발견되는 것 이외의 프로모터 서열 또는 안지오스타틴 단백질의 생산을 증가시킬 다른 서열들의 형질감염 또한 유전자 치료법으로서 구체화된다. 이러한 기술의 예는, 세포 내 에리트로포에틴을 공격하는 "유전적 스위치"를 삽입하는 상동 재조합을 이용하는 것으로 캠브리지, 매사츄세츠에 소재하는 Transkaryotic Therapies, Inc. 에서 찾을 수 있다. 유전공학 뉴스 1994. 4. 15자를 참조하라. 그러한 "유전적 스위치"는 정상적으로는 안지오스타틴(또는 안지오스타틴 수용체)을 발현시키지 않는 세포 내 안지오스타틴(또는 안지오스타틴 수용체)을 활성화시키는데 이용될 수 있다.
유전자 치료법을 위한 유전자 전달 방법은 광범위하게 세 가지 범주로 구분된다-물리적(예를 들면, 일렉트로포레이션, 직접적 유전자 전달 및 입자 포격), 화학적(지질-기본 담체, 또는 비-바이러스성 벡터) 및 생물학적(바이러스-유도 벡터 및 수용체 업테이크). 예를 들면, DNA로 코팅된 리포솜을 포함하는 비-바이러스성 벡터가 이용될 수 있다. 그러한 리포솜/DNA 복합체는 직접적으로 환자 정맥 내로 주사될 수 있다. 리포솜/DNA 복합체는 간 내 집중되어 있으며, 여기서 DNA를 마크로파지 및 쿠퍼 셀로 운반한다고 믿어진다. 이들 세포들은 장기간 생존하며 따라서 운반된 DNA의 장기간 발현을 제공한다. 부가적으로, 유전자의 천연 DNA 또는 벡터는 직접적으로 치료 DNA의 표적 운반을 위해 원하는 기관, 조직 또는 종양 내로 주사될 수 있다.
유전자 치료 방법학은 또한 운반 지역에 의해 기술될 수 있다. 유전자를 운반하는 근본적인 방법은 생체 외 유전자 전달, 생체 내 유전자 전달 및 시험관 내 유전자 전달을 포함한다. 생체 외 유전자 전달에서, 세포는 환자로부터 채취되어 세포 배양물 내에서 생장한다. DNA는 세포 내로 형질감염되고, 형질감염된 세포는 숫적으로 확대된 다음 환자 내 재이식된다. 시험관 내 유전자 전달에서, 형질전환된 세포는 조직 배양 세포와 같이 배양물 내에서 생장하는 세포이며, 특정 환자로부터의 특정 세포가 아니다. 이들 "실험실 세포"들은 형질감염되고, 형질감염된 세포들은 선별되고, 환자 내 이식 또는 기타 용도를 위해 확대된다.
생체 내 유전자 전달은 세포가 환자 내에 있을 때 DNA를 환자의 세포 내로 도입시키는 것을 수반한다. 방법은, 비감염 바이러스를 이용하여 환자 내에서 유전자를 운반시키는 바이러스-매개 유전자 전달을 이용하는 방법 또는 천연 DNA를 환자 내 부위 내로 주입시켜 유전자 산물 단백질이 발현되는 세포 백분율에 의해 DNA가 업테이크되는 방법을 포함한다. 부가적으로, "유전자 포"의 이용과 같은 기타 본원에 기술된 방법이 안지오스타틴 DNA 또는 안지오스타틴 조절 서열의 시험관 내 삽입을 위해 이용될 수 있다.
유전자 치료법의 화학적 방법은 DNA를 세포막을 통과하여 운반하기 위하여 지질-기본 화합물(반드시 지질일 필요는 없다)을 수반한다. 하전된 DNA에 음성적으로 결합하는 지질-기본 양이온인 리포펙틴 또는 사이토펙틴은 세포막을 통과할 수 있는 복합체를 형성하여 DNA를 세포 내부로 제공한다. 다른 화학적 방법은, 특이 리간드를 세포 표면 수용체에 결합시켜 엔빌로핑하고 이를 세포막을 통과하여 운반하는, 수용체-기본 엔도사이토시스를 이용한다. 리간드는 DNA에 결합하고 복합체 전체가 세포 내로 운반된다. 리간드 유전자 복합체가 혈류 내로 주입된 다음, 수용체를 가지는 표적 세포가 특이적으로 리간드에 결합하여 리간드-DNA 복합체를 세포 내로 운반시킬 것이다.
많은 유전자 치료 방법학은 유전자를 세포 내로 삽입시키기 위해 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들면, 변질된 레트로바이러스 벡터는 유전자를 말초 및 종양-침투 림프구, 간세포, 표피세포, 근세포 또는 기타 체세포 내로 도입시키기 위해 생체 외 방법에서 사용되어 왔다. 다음, 이들 변질 세포들은 환자내로 도입되어 삽입된 DNA로부터의 유전자 산물을 제공한다.
바이러스성 벡터는 또한 생체 내 프로토콜을 이용하여 유전자를 세포 내로 삽입시키는 데에 이용되어 왔다. 외부 유전자의 직접적인 조직-특이성 발현, 시스-활성 조절 요소 또는 조직 특이적인 것으로 알려진 프로모터가 이용될 수 있다. 대안적으로, 이는 생체 내 특이 해부학적 부위로의 DNA 또는 바이러스성 벡터의 in situ 운반을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 생체 내 혈관으로의 유전자 전달은 시험관 내 형질도입된 내피세포를 동맥 벽 상에 선별된 부위 내 이식함에 의해 달성되었다. 바이러스는 또한 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 주위 세포를 감염시켰다. 바이러스성 벡터는, 예를 들면 카테테르에 의해, 생체 내 부위로 직접적으로 운반되어, 단지 특정 부위만이 바이러스에 의해 감염되도록 하여 장기간 부위 특이적 유전자 발현을 제공할수 있다. 레트로바이러스 벡터를 이용하는 생체 내 유전자 전달은 또한 변질된 바이러스의 기관으로 유도하는 혈관 내로의 주입에 의해 포유동물 조직 및 간 조직 내에서 입증되어 왔다.
유전자 치료법 프로토콜을 위해 사용되어 온 바이러스성 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스바이러스, SV 바이러스, 백시니아 및 기타 DNA 바이러스를 포함한다. 복제-결손 쥐 레트로바이러스는 가장 널리 이용되는 유전자 전달 벡터이다. 쥐 백혈병 레트로바이러스는, 핵 코어 단백질 및 폴리머라제 (pol) 효소와 복합되고 단백질 코어(gag)로 봉합되고 숙주 범위를 결정하는 당단백질 엔빌로프 (env)에 의해 둘러싸인 일본쇄의 RNA로 구성된다. 레트로바이러스의 게놈 구조는 5' 및 3' 긴 말단 반복부 (LTR)에 의해 둘러싸인 gag, pol 및 env 유전자를 포함한다. 레트로바이러스성 벡터 시스템은, 바이러스 구조 단백질이 패키징 세포주 내에서 트랜스로 공급된다면, 5' 및 3' LTR 및 팩키징 시그널을 함유하는 최소의 벡터가 벡터 패키징, 감염 및 표적 세포 내로의 통합을 허용하기에 충분하다는 사실을 이용한다. 유전자 전달을 위한 레트로바이러스성 벡터의 근본적인 잇점은 대부분의 세포 유형 내에서 효율적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA 내로의 정확한 단일 카피 벡터 통합, 및 레트로바이러스 게놈 증식의 용이함을 포함한다.
아데노바이러스는, 코어 단백질과 복합되고 캡시드 단백질로 둘러싸인 선형의 이중 가닥 DNA로 구성된다. 분자 바이러스학에서의 발전은 신규 유전자 서열을 생체 내에서 표적 세포 내로 형질 도입시킬 수 있는 벡터를 창출하기 위해 이들 유기체들의 생물학을 이용하는 능력에 이르러 왔다. 아데노바이러스-기본 벡터들은 유전자 산물 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 것이다. 아데노바이러스성 벡터는 낮은 바이러스 역가에서조차도 높은 효율의 감염도를 가진다. 부가적으로, 바이러스는 무-세포 비리온으로서 완전히 감염성이어서 생산자 세포주의 주입이 불필요하다. 아데노바이러스성 벡터의 다른 잠재적인 잇점은 생체 내에서 이종 유전자의 장기간 발현을 달성하는 능력이다.
DNA 운반의 기계적인 방법은, 리포솜 또는 기타 막 융합을 위한 베시클과 같은 퓨소제닉 지질 베시클, 리포펙틴과 같은 양이온성 지질을 혼입시키는 DNA 입자, 폴리라이신-매개 DNA 전달, DNA의 배아 또는 체세포 내로의 미세주입과 같은 직접적인 DNA 주입, "유전자 포"에서 사용되는 금 입자와 같은 DNA 코팅된 입자의 공기식 운반, 및 인산칼슘 형질감염과 같은 무기화학적 접근을 포함한다. 다른 방법인 리간드-매개 유전자 치료법은, DNA를 특이적 리간드와 복합시켜 리간드-DNA 접합체를 형성하여, DNA를 특이 세포 또는 조직으로 전달하는 것을 수반한다.
플라스미드 DNA의 근육 세포 내로의 주입은 형질감염되고 지속적인 마커 유전자의 발현을 가지는 세포를 높은 백분율로 생산하는 것이 발견되었다. 플라스미드의 DNA는 세포의 게놈 내로 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 형질감염된 DNA의 비-통합은 최종 분화된 비-증식적 조직 내에서 연장된 기간 동안 세포 또는 미토콘드리아 게놈 내 돌연변이 삽입, 결실 또는 변질의 우려없이 형질감염 및 유전자 산물 단백질의 발현을 허용할 것이다. 장기간, 그러나 반드시 영구적은 아닌, 치료 유전자의 특이 세포 내로의 전달은 유전병 또는 예방 용도를 위한 치료를 제공할 수 있다. DNA는, 수용 세포의 게놈 내 돌연변이의 발발없이 유전자 산물 수준을 유지하기 위하여 정기적으로 재주입될 수 있다. 외생 DNA들의비-통합은 하나의 세포 내 다양한 유전자 산물을 발현시키는 모든 작제물과 함께 몇몇 상이한 외생 DNA 작제물의 존재를 허용할 것이다.
입자-매개 유전자 전달 방법은 식물 조직을 형질 전환시키는데 처음 이용되었다. 입자 포격 장치 또는 "유전자 포"를 이용하여, 원동력이 생성되어 DNA-코팅된 고밀도 입자(금 또는 텅스텐과 같은)를 표적 기관, 조직 또는 세포의 침투를 허용하는 높은 속도로 가속화시킨다. 입자 포격은 시험관 내 시스템에서, 또는 생체 외 또는 생체 내 기술과 함께 사용되어 DNA를 세포, 조직 또는 기관 내로 도입시킬 수 있다.
유전자 전달을 위한 일렉트로포레이션은 전류를 이용하여 세포 또는 조직을 일렉트로포레이션-매개 유전자 전달이 쉽도록 만든다. 주어진 장(field) 력(strength)으로의 짧은 전기적 충격이 DNA 분자가 세포 내로 침투될 수 있는 방식으로 막의 침투성을 증가시키는데에 이용된다. 이러한 기술은 시험관 내 시스템에서, 또는 생체 외 또는 생체 내 기술과 함께 사용되어 DNA를 세포, 조직 또는 기관 내로 도입시킬 수 있다.
생체 내 담체-매개 유전자 전달이 외부 DNA를 세포 내로 형질감염시키는데에 이용될 수 있다. 이러한 담체-DNA 복합체는 간편하게 체액 또는 혈류 내로 도입될 수 있고, 그 다음 체 내 표적 기관 또는 조직으로 부위 특이적으로 운반될 수 있다. 폴리라이신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴과 같은 리포솜 및 폴리양이온 모두 이용될 수 있다. 세포 특이적 또는 기관 특이적인 리포솜이 이용될 수 있고, 따라서 이러한 리포솜에 의해 운반되는 외부 DNA가 표적 세포에 의해 업테이크될 것이다. 특정 세포 상에서의 특이적 수용체를 표적으로 한 이뮤노리포솜의 주입이 DNA를 수용체를 함유하는 세포 내로 삽입시키는 간편한 방법으로서 사용될 수 있다. 이용된 다른 담체 시스템은 생체 내 유전자 전달을 위해 DNA를 간세포로 운반시키기 위한 아시알로글리코단백질/폴리라이신 접합체 시스템이다.
형질감염된 DNA는 다른 종류의 담체와 복합되어 DNA가 수용체 세포로 운반된 다음 세포질 또는 핵세포질 내에 거주할 수 있다. DNA는 특이적으로 엔지니어링된 베시클 복합체 내 담체 핵 단백질에 커플링되어 핵 내로 직접적으로 운반될 수 있다.
안지오스타틴의 유전자 조절은 안지오스타틴 유전자 또는 안지오스타틴 유전자와 관련된 조절 영역 또는 이에 상응하는 RNA 전사체에 결합하는 화합물을 투여하여 전사 또는 해독 속도를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 부가적으로, 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열로 형질감염된 세포가 환자에 투여되어 안지오스타틴의 생체 내 급원을 제공할 수 있다. 예를 들면, 세포는 안지오스타틴을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터로 형질감염될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 특이적 핵산 서열을 세포 내로 운반하는 기능을 하는 특이적 핵산 서열을 함유하거나 이와 결합될 수 있는 담체를 의미한다. 벡터의 예는 플라스미드 및 바이러스와 같은 감염성 미생물, 또는 리간드-DNA 접합체, 리포솜, 지질-DNA 복합체와 같은 비-바이러스성 벡터를 포함한다. 안지오스타틴 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자가 발현 조절 서열에 연결되어 안지오스타틴을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형성하는 것이 바람직할 것이다. 형질감염된 세포는 환자의 정상적인 조직, 환자의 질병 조직으로부터 유도된 세포이거나, 비-환자 세포일 수 있다.
예를 들면, 환자로부터 제거된 종양 세포는 본 발명의 안지오스타틴 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질감염될 수 있고, 환자 내로 재도입될 수 있다. 형질감염된 종양 세포는 환자 내에서 종양의 생장을 억제하는 안지오스타틴 수준을 생성한다. 세포는 비-벡터 또는 일렉트로포레이션, 이온침투 또는 "유전자 포"와 같은 당업계에 공지된 물리적 또는 화학적 방법에 의해 형질감염될 수 있다. 부가적으로, 안지오스타틴 DNA는 담체의 도움 없이 환자 내로 직접적으로 주입될 수 있다. 특히, 안지오스타틴 DNA는 피부, 근육 또는 혈액 내로 주입될 수 있다.
안지오스타틴을 환자 내로 형질감염시키기 위한 유전자 치료법 프로토콜은 안지오스타틴 DNA의 세포 게놈, 소염색체 내로의 통합을 통하거나, 세포 내 세포질 또는 핵질 내 별도의 복제 또는 비-복제 DNA 작제물로서일 수 있다. 안지오스타틴 발현은 장기간 동안 지속될 수 있거나, 세포, 조직 또는 기관 내 안지오스타틴 단백질의 바람직한 수준 또는 결정된 혈액 수준을 유지하기 위해 정기적으로 재주입될 수 있다.
안지오스타틴은 HPLC C4 칼럼 (표 3 참조) 상에서 분리될 수 있다. 안지오스타틴 단백질은 아세토니트릴 구배 내 30 내지 35%에서 용출된다. 환원 조건 하 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 겔 상에서, 활성을 가진 단백질 밴드가 대략 38 킬로달톤에서 단일 피크로서 용출된다.
본 발명자는, 생장하는 일차 종양이, 전이 내에서 맥관형성을 억제함으로써 전이 자체의 생장을 억제할 수 있는 안지오스타틴을 포함하는 특이 내피세포 증식 억제제의 혈류 내로의 방출과 관련이 있음을 보였다. 일차 종양과 관련있는 안지오스타틴의 급원은 공지되어 있지 않다. 이 화합물은 특이적 프로테아제에 의한 플라스미노겐의 분해에 의해 제조될 수 있거나, 안지오스타틴은 안지오스타틴을 암호화하는 특이 유전자의 발현에 의해 생산될 수 있다.
일차 종양의 맥관형성적 표현형은 정상 세포에 의해 동화되나 신형성으로의 형질전환 동안 하강-조절되는 것으로 믿어지는 과량의 내피세포 억제제 내 맥관형성 단백질의 생산에 의존한다. 안지오스타틴의 생산은 개인 종양 세포 내에서 모세포 유형에 의한 생성에 비해 하강-조절될 수 있는 반면, 전체 종양에 의해 동화되는 억제제의 전체 양은 순환을 개시하고 떨어진 미세전이 부위에서 내피세포생장을 억제하기에 충분할 것이다. 안지오스타틴은 일차 종양에 의해 방출되는 맥관형성 단백질 보다 상당히 장기간 순환 유지된다. 따라서,맥관형성 단백질은 국소적으로 작용하는 것으로 보이는 반면, 안지오스타틴은 전체적으로 작용하고 상대적으로 긴 반감기를 가지고 혈액 내에서 순환한다. 안지오스타틴의 반감기는 대략 12 시간 내지 5 일이다.
하기의 이론에 구애되기 원하는 것은 아니지만, 종양이 맥관형성하기 시작할 때, 이는 하나 이상의 맥관형성 단백질 (예를 들면,aFGF, bFGF, VFGF, IL-8, GM-CSF 등)을 방출하며, 이는 외부혈관 방향으로부터 일차 종양에 인접한 표적 내피에 국소적으로 작용하고 순환하지 않는(또는 짧은 반감기를 가지고 순환하는) 것으로 믿어진다. 이들 맥관형성 단백질은 일차 종양이 그 집단의 확장을 지속하도록 내피세포 억제제(맥관형성의 억제제)의 작용을 극복하기에 충분한 양으로 생산되어야 한다. 일단 그러한 일차 종양이 잘 생장하면, 이는 내피세포 억제제를 순환 내로 계속하여 방출한다. 이러한 이론에 따라, 이들 억제제들은 일차 종양, 혈관 내 방향으로부터의 전이의 표적 모세혈관 내피로부터 떨어진 곳에서 작용하고, 계속하여 순환한다. 따라서, 떨어진 전이가 맥관형성을 개시할 수 있을 때, 그 인접 지역 내 모세혈관 내피는 도입되는 안지오스타틴에 의해 억제될 수 있다.
일단 일차 종양이 안지오스타틴이 순환 내로 계속하여 방출되기에 충분한 크기에 도달하면, 이차 종양 이식(또는 미세전이)이 그 자체의 맥관형성을 개시 또는 증가하기는 어렵다. 이차 종양 이식(예를 들면, 피하 공간 또는 각막 내로, 또는 정맥 내 폐로)이 일차 종양이 이식된 직후 발발하면, 일차 종양은 이차 종양을 억제할 수 없을 것이다 (이차 종양 내 맥관형성이 이미 진행 중일 것이므로). 두 종양이 동시에 이식된다면 (예를 들면, 반대편 옆구리에), 억제제는 서로 상에 대하여 동등한 억제 효과를 가질 것이다.
본 발명의 안지오스타틴은 :
(i) 종양을 가진 인간 또는 동물에게 항-맥관형성 치료법으로서 투여되고;
(ii) 인간 또는 동물 혈청, 뇨 또는 조직 내에서 진단적 마커로서 모니터링되고; 및
(iii) 유사한 안지오스타틴 분자에 대한 암 환자의 혈청 및 뇨 분석의 기초로서 이용될 수 있다.
안지오스타틴이 환자의 혈액 또는 뇨와 같은 체액으로부터 분리될 수 있거나 안지오스타틴이 재조합 DNA 분자 방법 또는 당업자에게 잘 공지된 합성 단백질 화학적 방법에 의해 생산될 수 있음은 본 발명의 일부로서 간주된다. 단백질 정제 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 안지오스타틴의 정제 및 억제제 활성의 분석을 위한 방법의 특정 예가 하기 실시예에서 제공된다. 인간 내생 안지오스타틴의 분리는 유사한 기술을 이용하여 달성된다.
재조합 DNA 기술을 이용하여 안지오스타틴을 생산하는 방법의 한 예는 (1) 상기 논의된 바와 같은 안지오스타틴의 동정 및 정제, 및, 이하 보다 상세히 기술되는 (2) 정제된 억제제의 N-말단 아미노산 서열의 결정,(3) 안지오스타틴 서열을 위한 5' 및 3' DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성적 생산, (4) 폴리머라제를 이용한 안지오스타틴 유전자 서열의 증폭, (5) 증폭된 서열의 발현 벡터와 같은 적절한 벡터 내로의 삽입, (6) 벡터 함유 유전자의 미생물 또는 기타 억제제 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 시스템 내로의 삽입, 및 (7) 재조합 생산된 억제제의 분리를 필요로 한다. 적절한 벡터는 바이러스, 세균 및 효모와 같은 원핵세포 발현 벡터를 포함한다. 상기 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2판, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989와 같은 실험실 매뉴얼에 보다 상세히 기술되어 있다. 인간 플라스미노겐의 DNA 서열은 공표되어 있고 (Browne, M.J., et al., "Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in HeLa cells" Fibrinolysis Vol. 5(4). 257-260, 1991), 본원에서 참고로 인용한다.
안지오스타틴을 위한 유전자는 또한 안지오스타틴을 높은 수준으로 발현시키는 세포 또는 조직 (종양 세포와 같은)으로부터, (1) 조직으로부터 메신저 RNA를 분리시키고, (2) 역 전사효소를 이용하여 상응하는 DNA 서열을 생성한 다음 (3) 적절한 프라이머와 함께 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 활성 안지오스타틴 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 증폭시킴에 의해 분리될 수 있다.
그러나, 다른 안지오스타틴 또는 그의 생물학적으로 활성 단편을 생성하는 법은 단백질 합성에 의한 것이다. 일단 생물학적으로 활성인 안지오스타틴 단편이 이하 보다 상세히 기술하는 분석 시스템을 이용하여 발견되면, 이는 예를 들면 자동화된 단백질 서열화 방법에 의해 서열화될 수 있다. 대안적으로, 일단 안지오스타틴을 암호화하는 유전자 또는 DNA 서열이 예를 들면 하기하는 방법에 의해 분리되면, 당업계에 잘 공지된 매뉴얼 또는 자동화된 서열화 방법을 이용하여 DNA 서열이 결정될 수 있다. 핵산 서열은 아미노산 서열에 대한 정보를 제공한다. 따라서, 생물학적으로 활성인 단편이 트립신 분해와 같은 특정 방법에 의해 생성되거나, 단편이 N-말단 서열화되면, 잔류 아미노산 서열은 상응하는 DNA 서열로부터 결정될 수 있다.
일단 단백질의 아미노산 서열이 알려지면, "Solid Phase Protein Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R.C. Sheppardm IRL Press, Oxford, England.에 의해 예증되는 바와 같이, 단편은 당업계에 잘 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다. 유사하게, 다수 단편이 합성되어, 연이어 함께 연결되어 보다 큰 단편을 형성할 수 있다. 이들 합성 단백질 단편들은 또한 시험관 내 또는 생체 내 촉진제 및 길항제 활성을 시험하기 위해 특정 부위에서 아미노산 치환을 이용하여 제조될 수 있다. 조직에 결합하는 고 친화성을 가지는 단백질 단편은 친화성 칼럼 상에서 안지오스타틴 수용체를 분리시키는 데에 이용될 수 있다. 안지오스타틴 수용체의 분리 및 정제는 안지오스타틴 작용 메커니즘을 밝히는 근본적인 단계이다. 안지오스타틴 수용체의 분리 및 안지오스타틴 촉진제 및 길항제의 동정은 약물의 발전을 촉진시켜 생물학적 활성의 최종 경로인 안지오스타틴 수용체의 활성을 조절할 것이다. 수용체의 분리는, in situ 및 용액 하이브리드화 기술을 이용하여, 수용체의 위치 및 합성을 모니터링하기 위한 뉴클레오티드 탐침의 작제를 가능케 한다. 더욱이, 안지오스타틴 수용체를 위한 유전자는 분리되어 발현 벡터 내로 통합되고, 환자 종양 세포와 같은 세포 내로 형질감염되어 세포 유형, 조직 또는 종양의 안지오스타틴에 결합 및 국소적 맥관형성을 억제하는 능력을 증가시킬 수 있다.
안지오스타틴은 맥관형성에 의해 매개되거나 이를 수반하는 질병 또는 과정을 치료함에 있어 효율적이다. 본 발명은 맥관형성-매개 질병을 효율적인 양의 안지오스타틴 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 항-맥관형성 활성을 집학적으로 가지는 안지오스타틴 단편의 조합, 또는 안지오스타틴 촉진제 및 길항제를 이용하여 치료하는 방법을 포함한다. 맥관형성-매개 질병은, 이에 제한되지는 않으나, 충실성 종양; 백혈병과 같은 혈종; 종양 전이; 양성 종양, 예를 들면 혈관종, 청음 신경종, 신경 섬유종, 과립성 결막염 및 화농성 육아종, 류머티스성 관절염; 건선; 눈의 맥관형성 질환, 예를 들면, 당뇨성 망막증, 조발성 망막증, 반점성 변성, 각막 이식 거부, 신혈관 녹내장, 후수정체 섬유증식증; 오슬러 웨버 증후군; 심근 맥관형성; 플라크 신생 혈관화; 모세혈관 확장증; 혈우병 관절; 섬유성 혈관종; 및 창상 과립을 포함한다. 안지오스타틴은 과도하거나 비정상적인 내피세포 자극 질환의 치료에 유용하다. 이들 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 장 유착증, 크론병, 동맥경화증, 공피증, 및 반흔 비대, 즉, 해족종을 포함한다. 안지오스타틴은 태아 이식에 요구되는 혈관화를 방지함으로써 산아조절제로서 이용될 수 있다. 안지오스타틴은 묘조병 (Rochele minalia quintosa) 및 궤양 (Helicobacter pylori)과 같은 병리학적 결과로서 맥관형성을 가지는 질환의 치료에 유용하다.
안지오스타틴의 합성 단백질 단편은 다양한 용도를 가진다. 안지오스타틴 수용체에 높은 특이성 및 결합성을 가지고 결합하는 단백질이 방사선 라벨링되고, 방사능 사진 및 막 결합 기술을 이용하는 결합 부위의 시각화 및 정량을 위해 이용된다. 본원은 중요한 진단 및 조사 방법을 제공한다. 안지오스타틴 수용체의 결합 특성에 대한 지식은 이 수용체와 연관된 형질도입 메커니즘의 조사를 촉진시킨다.
더욱이, 짧은 수명의 방사성 동위 원소로의 안지오스타틴 단백질의 라벨링은 양전자 방출 단층촬영법 또는 기타 현대적 방사선 사진 기술을 이용하여 생체 내 수용체 결합 부위를 시각화하여 안지오스타틴 결합 부위를 가진 종양의 위치추정을 가능케 한다.
이들 합성 단백질 내에서의 체계적인 아미노산 치환은, 안지오스타틴 수용체에의 안지오스타틴 결합을 증진 또는 감소시키는 안지오스타틴 수용체에 대한 높은 친화성 단백질 촉진제 및 길항제를 생산한다. 그러한 촉진제는 미세전이의 생장을 억제함으로써 암의 퍼짐을 제한하는데 이용된다. 안지오스타틴에 대한 길항제는 부적절한 혈관 신생의 상황에 적용되어, 안지오스타틴의 억제 효과를 막고 맥관형성을 촉진시킨다. 예를 들면, 이러한 처리는 당뇨병 환자에서의 창상 치료를 촉진시키는 효과를 가진다.
안지오스타틴 단백질은 안지오스타틴 수용체의 배양된 종양 세포로부터의 분리를 위한 친화성 칼럼 전개에 이용된다. 안지오스타틴 수용체의 분리 및 정제 후 아미노산 서열화가 뒤따른다. 이러한 정보를 이용하여, 안지오스타틴 수용체를 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 동정 및 분리될 수 있다. 다음, 클로닝된 핵산 서열이 상기 수용체를 발현시킬 수 있는 벡터 내로의 삽입을 위해 전개된다. 이러한 기술은 당업자게에 잘 공지되어 있다. 안지오스타틴 수용체를 암호화하는 핵산 서열(들)의 종양 세포 내로의 형질감염 및 형질감염된 종양 세포에 의한 수용체의 발현은 이들 세포의 외생 또는 내생 안지오스타틴에 대한 반응성을 증진시킴으로써 전이 생장의 속도를 감소시킨다.
라이신과 같은 세포 독성제가 안지오스타틴 및 고 친화성 안지오스타틴 단백질 단편과 연결됨으로써, 안지오스타틴에 결합하는 세포의 분해를 위한 도구를 제공한다. 이들 세포는, 이에 제한되지는 않으나, 미세전이 및 일차 종양을 포함하는 많은 부위에서 발견될 수 있다. 세포 독성제와 연결된 단백질은 원하는 부위로의 운반을 최대화하도록 고안된 방식으로 융합된다. 예를 들면, 고 친화성 안지오스타틴 단편과 연결된 라이신은 캐뉼라를 통하여 혈관 내로 운반되어 표적 부위를 제공하거나 직접적으로 표적으로 운반된다. 그러한 제제는 또한 조절된 방식으로 융합 캐뉼라와 커플링된 삼투성 펌프를 통하여 운반된다. 안지오스타틴 길항제의 조합은 조직의 혈관 신생을 증가시키기 위한 맥관형성의 자극에 동시 적용될 수 있다. 이러한 치료법은 전이 암을 파괴시키기 위한 효율적인 수단을 제공한다.
안지오스타틴은 질환의 치료를 위해 다른 조성물 및 방법과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양은 간편하게 안지오스타틴과 조합된 수술, 방사선, 또는 화학요법으로 처리된 다음, 안지오스타틴은 연이어 환자에게 투여되어 미세전이의 잠재성을 연장시키고 임의의 잔류 일차 종양의 생장을 안정화 및 억제시킬 수 있다. 부가적으로, 안지오스타틴, 안지오스타틴 단편, 안지오스타틴 항혈청, 안지오스타틴 수용체 촉진제, 안지오스타틴 수용체 길항제 또는 이들의 조합이 약학적으로 허용가능한 담체 및 임의로 생분해성 중합체와 같은 지속-방출 매트릭스와 결합되어 치료적 조성물을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와같은 지속-방출 매트릭스는 대부분 효소 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해가능한 중합체 물질로 제조된 매트릭스이다. 일단 체 내로 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 작용한다. 상기 지속-방출 매트릭스는 바람직하게 리포솜, 폴리락티드 (폴리락트산), 폴리글리콜리드 (글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르토)에스테르, 폴리프로틴, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 포스포리피드, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소루신과 같은 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생적합성 물질로부터 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜리드 또는 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 공중합체) 중 하나의 매트릭스이다.
본 발명의 맥관형성-조절 치료 조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸일 수 있으며, 임의의 공지된 투여 경로에 의하여 투여될 수 있다. 고체 치료 조성물의 예는 정제, 크림 및 이식 가능한 투여 단위를 포함한다. 정제는 경구적으로 투여될 수 있으며, 치료적 크림은 국소적으로 적용될 수 있다. 이식가능한 투여 단위들은 국소적으로 예를 들면 종양 부위에 적용되거나, 치료 맥관형성-조절 조성물의 전신 방출을 위해 예를 들면 피하로 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예는 피하, 정맥 내, 동맥 내 주사를 위한 배합물 및 국소적 및 망막 내 투여를 위한 배합물을 포함한다. 에어로졸 배합물의 예는 폐로의 투여를 위한 흡입 배합물을 포함한다.
본 발명의 안지오스타틴은 또한 억제제 및 그 수용체에 특이적인 항체를 생성하는데에 이용될 수 있다. 이러한 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 안지오스타틴 또는 안지오스타틴 수용체에 특이적으로 결합하는 이들 항체는 혈액 또는 조직 내 안지오스타틴 또는 안지오스타틴 수용체의 검출 및 정량화를 위해 당업자에게 잘 공지된 진단 방법 및 키트에 이용될 수 있다. 이들 시험 결과는 암 및 기타 맥관형성-매개 질환의 발발 및 재발의 진단 또는 예측에 이용될 수 있다.
안지오스타틴은 또한 안지오스타틴에 결합할 수 있는 항체의 검출 및 정량을 위한 방법 및 키트에 이용될 수 있다. 이들 키트는 in situ에서 일차 종양에 의해 가려지는 안지오스타틴의 존재 하에 미세전이의 분포를 나타내는 순환 안지오스타틴 항체의 검출을 허용할 것이다. 그러한 순환 항-안지오스타틴 항체를 가지는환자들은 다수의 종양 및 암을 발전시킬 가능성이 높으며, 치료 또는 차도 기간 후에 암의 재발 가능성이 높다. 이들 항-안지오스타틴 항체의 Fab 단편은, 항-안지오스타틴 항체를 중화하는데 이용될 수 있는 항-안지오스타틴 Fab 단편 항혈청을 생성하기 위해 항원으로서 이용될 수 있다. 그러한 방법은 항-안지오스타틴 항체에 의해 순환 안지오스타틴의 제거를 감소시킴으로써 효율적으로 순환 안지오스타틴 수준을 상승시킬 것이다.
본 발명의 다른 측면은 과도한 내생 안지오스타틴의 작용을 방지하는 방법이다. 이는 인간 또는 동물을 시스템 내 바람직하지 않은 안지오스타틴에 대해 특이적인 항체로 수동적으로 면역화시킴에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 처리는 비정상적 배란, 월경 및 태반형성, 및 혈관 신생을 치료하는데 중요하다. 이는 안지오스타틴 제거의 전이 과정에 대한 영향을 검사하는 유용한 도구를 제공한다. 안지오스타틴 항체의 Fab 단편은 안지오스타틴에 대한 결합 부위를 포함한다. 이 단편은 안지오스타틴 항체로부터 당업자에게 잘 공지된 기술을 이용하여 분리된다. 안지오스타틴 항혈청의 Fab 단편은 항-Fab 단편 혈청의 생성을 위한 항원으로서 이용된다. 안지오스타틴의 Fab 단편에 대항하는 이 항혈청의 융합은 안지오스타틴으로 하여금 안지오스타틴 항체에 결합하는 것을 방지한다. 치료적 잇점은 안지오스타틴의 항-안지오스타틴 Fab 단편으로의 결합을 막음으로써 내생 항-안지오스타틴 항체를 중화함에 의해 얻어진다. 이러한 치료의 순수한 효과는 내생 순환 안지오스타틴의 표적 세포에 도달하는 능력을 촉진시킴으로써 전이의 분포를 감소시키는 것이다.
본 발명은 내피세포억제 활성을 가지는 안지오스타틴의 임의의 유도체를 포함하는 것으로 간주된다고 이해되어야 할 것이다. 본 발명은 전체 안지오스타틴 단백질, 안지오스타틴 단백질의 유도체 및 생물학적으로 활성인 안지오스타틴 단백질의 단편을 포함한다. 이들은 아미노산 치환 또는 아미노산 작용기에 부착된 당 또는 기타 분자를 가지는 안지오스타틴 활성을 가지는 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 안지오스타틴 및 안지오스타틴 수용체를 암호화하는 유전자 및 이들 유전자에 의해 발현되는 단백질을 포함한다.
상기한 안지오스타틴 활성을 가지는 단백질 및 단백질 단편은, 당업자에게 공지된 배합 방법을 이용하여 제약학적으로 허용가능한 배합물 내 분리되고 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 이들 배합물은 표준 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조합물은 국소, 경피, 복막 내, 두개 내, 대뇌실 내, 대뇌 내, 질 내, 자궁 내, 경구, 직장 또는 비경구적으로 (예를 들면, 정맥 내, 척추 내, 피하 또는 근육 내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 더욱이, 안지오스타틴은 생분해성 중합체 내로 혼입되어 화합물의 지속적인 방출을 허용할 수 있으며, 중합체는 약물 운반이 바람직한 곳 가까이에, 예를 들면 종양 부위에 이식되거나 안지오스타틴이 체계적으로 서서히 방출되도록 이식될 수 있다. 삼투성 미니펌프가 또한 고 농도의 안지오스타틴의 캐뉼라를 통한 바람직한 부위, 예컨대 전이 생장 내로의 직접적으로 또는 종양으로의 혈관 공급 내로의 조절된 운반을 제공하는 데에 이용될 수 있다. 생분해성 중합체 및 그들의 용도는, 예를 들면 Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991)에 상세히 기술되어 있으며, 이는 본원에서 참조로 인용한다.
본 발명의 안지오스타틴의 투여량은 치료되는 질병 상태 또는 증상 및 체중 및 인간 또는 동물의 증상과 같은 기타 임상학적 요인 및 화합물의 투여 경로에 의존할 것이다. 인간 또는 동물의 치료를 위해, 대략 0.5 mg/kg 내지 500 mg/kg의 안지오스타틴이 투여될 것이다. 특정 동물 또는 인간 내 안지오스타틴의 반감기에 따라, 안지오스타틴은 1일 수 회 내지 1주에 1회로 투여될 수 있다. 본 발명은 인간 및 수의학적 용도를 가지는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 방법은 동시 또는 연장된 기간에 걸쳐 주어지는 다수 투여뿐 아니라 단일 투여 또한 고려한다.
안지오스타틴 배합물은 경구, 직장, 눈 내 (안구 내 또는 카메라 내를 포함하는), 코 내, 국소적 (볼 및 설하를 포함하는), 자궁 내, 질 내 또는 비경구적 (피하, 복막 내, 근육 내, 정맥 내, 경피, 두개 내, 기관 내, 및 경막 외를 포함하는) 투여에 적합한 것들을 포함한다. 안지오스타틴 배합물은 간편하게 단위 투여 형태로 제시될 수 있으며, 전형적인 제약학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 그러한 기술은 활성 성분 및 제약학적 담체 또는 부형제를 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 배합물은 균일하게 제조되며, 활성 성분을 지질 담체 또는 균일하게 분포된 고체 담체 또는 이들 모두와 가까이 결합시킨 다음, 필요하다면 산물을 성형한다.
비경구 투여에 적합한 배합물은, 항-산화제, 완충제, 제균제, 및 배합물을 의도하는 수용체의 혈액과 등장액으로 할 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 살균 주사액; 및, 현탁제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 살균 현탁액을 포함한다. 배합물은 단위 투여 또는 다수 투여 용기, 예를 들면 밀봉된 앰퓰 및 작은 병 내에 제시될 수 있으며, 사용 직전에 살균 담체액, 예를 들면 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다. 즉시 주사액 및 현탁액은 살균 분말, 입자 및 이전에 기술된 유형의 정제로부터 제조될 수 있다.
바람직한 단위 투여 배합물은 투여되는 성분의 매일 투여 또는 단위, 매일 서브-투여 또는 이의 적절한 분획을 함유하는 것들이다. 특히 상기한 성분들 이외에 본 발명의 배합물은 기타 당업계에서 문제시 되는 배합물 유형에 대해 전형적으로 사용되는 제제들을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 임의로, 세포 독성제가 혼입되거나 안지오스타틴 단백질 또는 이의 생물학적 기능성 단백질 단편과 조합되어 환자에게 이중 치료를 제공할 수 있다.
본 발명의 맥관형성 억제 단백질은 표준 미세화학 설비 내에서 합성될 수 있고, HPLC 및 질량 분광측광법을 이용하여 순도 체크될 수 있다. 단백질 합성 방법, HPLC 정제 및 질량 분광측광법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 안지오스타틴 단백질 및 안지오스타틴 수용체 단백질은 또한 재조합 이.콜라이 또는 효모 발현 시스템 내에서 생산되며, 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
온전한 안지오스타틴 분자의 상이한 단백질 단편이, 이에 제한되지는 않으나, 하기를 포함하는 몇몇 용도를 위해 합성될 수 있다; 특정 항혈청의 개발을 위한 항원으로서, 안지오스타틴 결합 부위에서 활성인 촉진제 및 길항제로서, 안지오스타틴과 결합하는 세포의 표적화된 사멸을 위한 세포 독성제와 연결 또는 이와 조합되어 사용될 단백질로서. 이들 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 그들의 분자의 외부 영역 상의 위치를 기준으로 하여 선별되며, 항혈청에의 결합을 위해 접근가능하다. 안지오스타틴의 중간 영역 뿐 아니라 아미노 및 카르복실 말단 또한 합성될 단편 중에 개별적으로 표현된다.
이들 단백질 서열은, 잠재적인 서열 상동성을 측정하기 위해, GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT 및 PIR과 같은 단백질 서열 데이터베이스를 이용하여 공지 서열과 대조된다. 이러한 정보는 다른 분자와 높은 정도의 서열 상동을 보이는 서열의 제거를 촉진시킴으로써, 항혈청, 안지오스타틴에 대한 촉진제 및 길항제의 개발에 있어서 높은 특이성을 위한 잠재성을 증진시킨다.
안지오스타틴 및 안지오스타틴 유도 단백질은 표준 방법을 이용하여 다른 분자에 커플링될 수 있다. 안지오스타틴의 아미노 및 카르복실 말단 모두 티로신 및 라이신 잔기를 함유하며, 다양한 기술, 예컨대 전형적인 기술을 이용하는 방사성 라벨링 기술 (티로신 잔기-클로라민 T, 아이오도겐, 락토퍼옥시다제; 라이신 잔기-볼튼-헌터 시약)을 이용하여 방사성 동위원소로 및 비-방사성 동위원소로 라벨링된다. 이들 커플링 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 대안적으로, 티로신 또는 라이신은 이들 잔기를 가지지 않은 단편에 첨가되어 단백질 상의 반응성 아미노 및 히드록실기의 라벨링을 촉진시킨다. 커플링 기술은, 이에 제한되지는 않으나, 아미노, 설프히드릴, 카르복실, 아미드, 페놀, 및 이미다졸을 포함하는, 아미노산 상에서 이용 가능한 작용기를 토대로 선별된다. 이들 커플링을 실행시키기 위해 이용되는 다양한 시약은 다른 것들 중에서, 글루타르알데히드, 디아조티즈드 벤지딘, 카르보디이미드 및 p-벤조퀴논을 포함한다.
안지오스타틴 단백질은 방사성 동위원소, 효소, 담체 단백질, 세포 독성제, 형광성 분자, 화학발광체, 생발광체 및 기타 다양한 용도를 위한 화합물들과 화학적으로 커플링된다. 커플링 반응의 효율은 특이적 반응에 적절한 상이한 기술을 이용하여 측정된다. 예를 들면, 안지오스타틴 단백질의125I로의 방사성 라벨링은 높은 특이적 활성을 가진 클로라민 T와 Na125I를 이용하여 달성된다. 반응은 나트륨 메타비설파이트를 이용하여 중단되며 혼합물은 1회용 칼럼 상에서 탈염된다. 라벨링된 단백질은 칼럼으로부터 용출되고 분획이 수집된다. 분취액이 각 분획으로부터 제거되고 방사능 활성이 감마 카운터 내에서 측정된다. 이러한 방식으로, 미반응 Na125I가 라벨링된 안지오스타틴 단백질로부터 분리된다. 최고의 특이적 방사능을 가진 단백질 분획이 안지오스타틴 항혈청에의 결합능력의 분석과 같은 후속적 사용을 위해 저장된다.
단백질 접합체의 다른 용도는 폴리클로날 항혈청의 생성을 위한 것이다. 예를 들면, 라이신 잔기를 함유하는 안지오스타틴 단백질이 글루타르알데히드를 이용하여 정제된 소 혈청 알부민에 연결된다. 이 반응의 효율은 방사성 라벨링된 단백질의 혼입을 측정함으로써 측정된다. 미반응 글루타르알데히드 및 단백질은 투석에 의해 분리된다. 이 접합체는 후속 사용을 위해 저장된다.
안지오스타틴에 대항하는 항혈청, 안지오스타틴 유사체, 안지오스타틴의 단백질 단편 및 안지오스타틴 수용체가 생성될 수 있다. 단백질 합성 및 정제 후, 모노클로날 및 폴리클로날 항혈청 모두 당업계에 공지된 확립된 기술을 이용하여 배양된다. 예를 들면, 폴리클로날 항혈청은 토끼, 양, 산양 또는 기타 동물들 내에서 배양될 수 있다. 소 혈청 알부민과 같은 담체 분자에 접합된 안지오스타틴 단백질 또는 안지오스타틴 그 자체는 부형제 혼합물과 조합되고, 유화되고, 등, 목, 옆구리, 때때로 발바닥 상의 다수 부위에서 피하 주사될 수 있다. 부스터 주사는 2 내지 4 주에 한번과 같이 정기적인 간격으로 행하여 진다. 혈액 샘플이, 주사 후 대략 7 내지 10 일 후, 예를 들면 희석 후 귀 주위 정맥을 이용하는 정맥천자에 의해 얻어진다. 이 혈액 샘플은 밤새 4℃에서 응고되도록 허용되고, 대략 2400 Xg에서 4℃에서 약 30 분 동안 원심분리된다. 이 혈청은 제거되고, 분취되고, 4℃에서 즉시 사용을 위해 또는 -20 내지 -90℃에서 후속적 분석을 위해 저장된다.
폴리클로날 항혈청의 생성으로부터의 모든 혈청 샘플 또는 모노클로날 항혈청의 생성으로부터의 배지 샘플은 항체 역가의 측정을 위해 분석된다. 역가가 몇몇 수단을 통해, 예를 들면 도트 블랏 및 밀도 분석을 이용하여 및 또한 단백질 A, 이차 항혈청, 냉 에탄올 또는 샤코올-덱스트란을 이용하는 방사성 라벨링된 단백질-항체 복합체의 침전 후 감마 카운터를 이용하여 활성 측정을 통하여 확립된다. 최고의 역가 항혈청 또한 상업적으로 유용한 친화성 칼럼 상에서 정제된다. 안지오스타틴 단백질은 친화성 칼럼 내에서 겔에 커플링된다. 항혈청 샘플은 칼럼을 통과하고, 항-안지오스타틴 항체는 칼럼에 결합된 채 남는다. 이들 항체는 후속적으로 용출되고, 수집되고, 역가 및 특이성의 측정을 위해 평가된다.
최고 역가 안지오스타틴 항혈청이 하기를 확립하기 위해 시험된다: a) 항원의 최고 특이적 결합 및 최저의 비-특이적 결합을 위한 최적의 항혈청 희석, b) 표준 전위 곡선 내 증가량의 안지오스타틴 단백질에의 결합 능력 , c) 관련된 단백질과의 잠재적인 교차 반응성 및 플라스미노겐 및 관련 종의 안지오스타틴을 포함하는 단백질, d) 혈장, 뇨, 조직 및 세포 배양 배지 추출물 내 안지오스타틴 단백질의 검출 능력.
안지오스타틴 및 안지오스타틴 수용체 측정을 위한 키트 또한 본 발명의 일부로서 간주된다. 최고의 역가 및 특이성을 가지며 혈장, 뇨, 조직 추출물 및 세포 배양 배지 내에서 안지오스타틴 단백질을 검출할 수 있는 항혈청이 추가적으로 검사되어, 신속, 의존성, 감도 및 특이적 측정 및 안지오스타틴의 위치추정을 위한 도구 이용의 용이성을 확립한다. 이들 분석 키트는, 이에 제한되지는 않으나, 하기 기술을 포함한다: 경쟁 및 비-경쟁적 분석, 방사선면역 분석, 생발광체 및 화학발광체 분석, 형광측정 분석, 샌드위치 분석, 면역방사능 분석, 도트 블랏, ELISA를 포함하는 분석에 연관된 효소, 마이크로타이터 플레이트, 신속한 뇨 또는 혈액 모니터링을 위한 항체 코팅된 스트립 또는 딥스틱, 및 면역세포화학. 각각의 도구에 있어서, 분석의 범위, 감도, 정확성, 의존성, 특이성 및 재현가능성이 확립된다. 분석을 통한 및 분석 내 변형이 치환 또는 활성의 표준 곡선 상에서 20%, 50%, 및 80% 점에서 확립된다.
조사 및 임상학적으로 일반적으로 사용되는 분석 키트의 한 예는 방사선면역 분석(RIA) 키트이다. 안지오스타틴 RIA는 하기한다. 성공적인 방사선요오드화 및 안지오스타틴 또는 안지오스타틴 단백질의 정제 후, 최고의 역가를 가지는 항혈청이 적절한 완충 시스템 내 수 회 희석으로 10,000 cpm과 같이 상대적으로 지속적인 양의 방사능을 함유하는 튜브에 첨가된다. 기타 튜브는 완충제 또는 비-특이적 결합을 측정하기 위한 예비면역 혈청을 함유한다. 4℃에서 24 시간 동안 항온 처리 후, 단백질 A가 첨가되고 튜브는 와동되고, 실온에서 90 분 간 배양되고, 대략 2000-2500 Xg로 4℃에서 원심분리되어, 라벨링된 항체에 결합된 항체의 복합체를 침전시킨다. 상청액이 흡인에 의해 제거되고, 펠릿 내 방사능이 감마 카운터 내에서 측정된다. 비-특이적 결합의 추출 후 대략 10 내지 40%의 라벨링된 단백질에 결합하는 항혈청 희석이 더욱 규명된다.
다음, 항혈청의 개발에 이용되는 안지오스타틴 단백질의 희석 범위 (대략 0.1 pg 내지 10ng)가 공지 양의 단백질을 방사성 라벨링된 단백질 및 항혈청을 함유하는 튜브에 첨가함으로써 측정된다. 부가적인 배양 기간, 예컨대, 24 내지 48 시간 후, 단백질 A가 첨가되고 튜브가 원심분리되고, 상청액이 제거되고, 펠릿 내 방사능이 측정된다. 비-라벨링된 안지오스타틴 단백질 (표준)에 의한 방사성 라벨링된 안지오스타틴의 결합의 전위는 표준 곡선을 제공한다. 다른 안지오스타틴 단백질 단편, 플라스미노겐, 상이한 종으로부터의 안지오스타틴 및 상동 단백질의 몇몇 농도가 분석 튜브에 첨가되어 안지오스타틴 항혈청의 특이성을 규명한다.
이에 제한되지는 않으나, 일차 및 이차 종양, 루이스 폐암 , 안지오스타틴 생성 세포, 태반, 자궁, 및 기타 뇌, 간, 및 장과 같은 조직의 배양물을 포함하는,다양한 조직의 추출물이 안지오스타틴 추출을 위해 성공적으로 사용되어 온 추출 기술을 이용하여 제조된다. 조직 추출물의 동결건조 또는 스피드 백 (Speed Vac) 후, 분석 완충액이 첨가되고 상이한 분취액이 RIA 튜브 내로 위치한다. 공지 안지오스타틴 생성 세포 추출물은 표준 곡선에 평행한 변위 곡선을 생성하는 반면, 안지오스타틴을 생성하지 않는 조직 추출물은 방사성 라벨링된 안지오스타틴을 안지오스타틴 혈청으로부터 변위시키지 않는다. 더욱이, 뇨, 혈장 및 루이스 폐 종양을 가진 동물로부터의 뇌척수액의 추출물이 분석 튜브에 증가량으로 첨가된다. 평행한 변위 곡선은 조직 및 혈액 내 안지오스타틴 측정을 위한 안지오스타틴 분석의 유용성을 나타낸다.
안지오스타틴을 함유하는 조직 추출물이 분취액을 역상 HPLC에 적용함에 의해 부가적으로 규명된다. 용출액 분획이 수집되고, 스피드 백 내에서 건조되고, RIA 완충액 내에서 재작제되고, 안지오스타틴 RIA 내에서 분석된다. 최대 양의 안지오스타틴 면역반응성이 안지오스타틴의 용출 위치에 상응하는 분획 내 위치된다.
분석 키트는 지시, 항혈청, 안지오스타틴 또는 안지오스타틴 단백질, 및 가능하게는 방사성 라벨링된 안지오스타틴 및/또는 안지오스타틴-안지오스타틴 항체 복합체의 침전을 위한 시약을 제공한다. 이 키트는 생물학적 액체 내 및 종양이 있고 없는 동물 및 인간의 조직 추출물 내 안지오스타틴의 측정에 유용하다.
다른 키트가 조직 및 세포 내 안지오스타틴의 위치추정을 위해 이용된다. 이 안지오스타틴 면역조직화학 키트는 지시, 안지오스타틴 항혈청 및 가능하게는 차단 혈청 및 플루오레신 이소티오시아네이트와 같은 형광성 분자 또는 일차 항혈청을 시각화하는데 이용되는 다른 시약과 연결된 이차 항혈청을 제공한다. 면역조직화학 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이 안지오스타틴 면역조직화학 키트는 광학 및 전자 현미경검사법을 이용하여 안지오스타틴의 조직 부위 및 배양된 세포 내 위치추정을 한다. 이는 조사 및 임상학적 목적 모두를 위해 이용된다. 예를 들면, 종양이 생검되거나 수집되고, 조직 절편이 안지오스타틴 생성 부위의 검사를 위해 마이크로톰으로 컷팅된다. 그러한 정보는 암의 검출 및 치료에 있어 진단 및 가능하게는 치료 목적으로 유용하다. 안지오스타틴 생합성 부위를 시각화하기 위한 다른 방법은 안지오스타틴 메신저 RNA에 대한 탐침에 대한 in situ 하이브리드화에서 이용을 위해 핵산을 방사선 라벨링하는 것을 수반한다. 유사하게, 안지오스타틴 수용체는 면역조직화학 기술을 이용하여 위치추정, 시각화 및 정량화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 기술될 것이며, 하기 실시예는 본 발명의 범위에 어떠한 방식으로도 제한을 가하는 것으로 해석되어서는 않된다. 이와는 대조적으로, 본 발명에 대한 다양한 다른 양태, 변경 및 본원의 기술을 읽은 후 당업자가 본발명의 사상 및/또는 부가되는 청구범위의 범위로부터 이탈됨이 없이 제안할 수 있는 본 발명의 등가물을 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1
전이 생장이 일차 종양에 의해 억제되고 일차 종양의 제거 후 가속화되는 동물-종양 시스템의 선별
그들 자체의 전이를 억제할 수 있는 다양한 쥐 종양을 스크리닝함으로써, 일차 종양이 가장 효율적으로 폐 전이를 억제하는 루이스 폐암을 선별하였다. 6주된 동유전자형의 C57BI6/J 수컷 마우스에 1 ×106종양 세포를 주입한다(피하 배부). 육안으로 보이는 종양은 3-4일 후 나타난다. 종양이 대략 1500㎣ 크기일 때, 마우스를 두 개의 그룹으로 랜덤하게 나눈다. 첫번째 그룹에서 1차 종양을 완전하게 절개하고, 두번째 그룹에서는 모의 수술 후 1차 종양을 온전하게 남겨놓는다. 500㎣ 내지 3000㎣의 종양이 전이의 생장을 억제함에도 불구하고, 1500㎣가 고 생존율과 국부적 재발 없이 안전하게 절제될 수 있는 가장 큰 크기의 1차 종양이다.
21일 후, 모든 마우스를 죽여서 부검한다. 온전한 1차 종양을 가진 마우스에서 4+2의 육안으로 보이는 전이가 있었는데, 이는 종양이 제거된 마우스에서의 50+5의 전이에 비교된다(P<0.0001). 이들 데이터는 폐 중량에 의해 확인되었으며, 이는 앞서 나타낸 바와 같이, 종양 무게와 밀접하게 연관된다. 종양을 온전한 채로 보유하고 있는 마우스에 비교하여 종양이 제거된 마우스에서 습식 폐 중량에 있어서 400%의 증가가 있었다.
이 실험 모델은 재현가능한 데이터를 제공하며, 기술된 실험은 재현가능하다. 이 종양은 "루이스 폐암 - 저 전이성" (LLC-Low)로 라벨링된다. 이 종양은 또한 B 및 T 림프구를 결여하고 있는 SCID 마우스에서 거의 동일한 패턴으로 전이를 억제한다.
실시예 2
1차 종양의 제거여부에 관계없이 고도로 전이적인 루이스 폐암 종양의 변이체의 단리
고도로 전이적인 루이스 폐암의 변이체는 한 그룹의 마우스에서 실시예 1의 LLC-Low 세포주로부터 자발적으로 발생하고 실시예 1에 기술된 방법에 따라 단리되었으며 반복적으로 이식되었다. 이 종양(LLC-High)은 1차 종양의 존재 여부에 따라 30개 이상의 육안으로 보이는 폐 전이를 형성한다.
실시예 3
전이의 크기 및 전이내 종양 세포의 증식율. 전이를 억제하는 1차 종양의 영향(LLC-Low)
C57BI6/J 마우스를 모든 실험에 사용한다. 마우스에 LLC-Low 세포를 피하로 접종하고, 14일 후 1차 종양을 절반의 마우스에서 제거한다. 종양 제거 후 5, 10 및 15일 째, 마우스를 죽인다. 폐 전이의 조직학 절편을 얻는다. 온전한 1차 종양을 가진 마우스는 신생 혈관화가 되지 않은 폐에서 미세전이를 갖는다. 이들 전이는 12-15 세포층의 직경에 국한되며, 종양 제거후 15일째 조차도 상당한 크기 증가를 보이지 않는다. 반대로, 1차 종양이 제거된 동물은 수술 후 5일째와 같이 빨리, 크게 혈관화된 전이를 드러낸다. 더 나아가, 이들 전이들은 종양이 제거된 후 15일째에 4배의 부피 증가를 나타낸다(폐 중량 및 조직학에 의해). 1차 종양이 제거된 동물의 대략 50%는 실험이 끝나기 전에 폐 전이로 인해 사망한다. 온전한 1차 종양을 가진 모든 동물은 실험이 종기까지 생존한다.
전이내 종양 세포의 복제율은 이전에 마우스로 주입된 BrdU로 염색된 핵을 카운팅함으로써 측정된다. BrdU를 작게 혼입하는 높은 %의 종양 세포, 온전한 1차 종양을 가진 동물의 구혈 전이는 1차 종양이 제거된 마우스의 큰 혈관화된 전이에서의 종양 세포의 BrdU 혼입에 상당한다(도 3). 이러한 발견은 1차 종양의 존재가 전이내 종양 세포의 복제율에 직접적인 영향이 없다는 것을 제시한다.
도 3에서, 좌측 패널은 1차 종양의 존부재시 폐에서의 종양 세포의 BrdU 라벨링 인덱스를 보여준다. 면역조직학 염색 전에, 단면을 0.2 M HCl로 10분 동안 투과시키고, 0.2M Tris-HCl, 2mM CaCl2내 1㎍/㎖의 프로테이나제 K (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)로 37℃에서 15분 동안 소화시킨다. 라벨링 인덱스는 250 파워에서 양성 핵의 퍼센트를 카운팅함에 의해 측정된다. 도 3의 우측 패널은 온전한 1차 종양을 가지거나, 수술 후 5, 10 및 15일째 1차 종양이 제거된 종양의 총 폐 중량의 분석을 나타낸다. 동물들을 BrdU의 복강 내 주입 후 6시간째 죽인다.
실시예 4
온전한 1차 종양의 존재시 폐 전이에서의 안지오스타틴의 억제
폐 전이에서의 혈관화의 정도를 측정하기 위하여 조직을 본 윌레브랜드 인자(von Willebrand factor; 내피세포 특이 마커, CA, 카펜테리아 Dako Inc.로부터 구입가능함)에 대한 항체로 염색한다. 온전한 종양을 가진 동물로부터의 전이는 존재하는 폐 혈관 둘레로 얇은 커프(8-12 종양 층)를 형성한다. 혈관 라이닝의 내피세포를 제외하고는, 본 윌레브랜드 인자에 양성을 보이는 세포는 없거나 거의 없다. 반대로 1차 종양이 제거된 후 5일째 동물의 폐 전이는 더 클 뿐만 아니라, 본 윌레브랜드 인자에 강하게 염색된 내피세포를 함유하는 모세혈관 발아로 침윤되어 있다.
폐 전이시 내피세포의 존재에 대한 면역조직학 분석에서, 접종 후 19일째 온전한 1차 폐 종양을 가진 폐 전이는 폐에서 기존의 미세혈관 둘레로 종양 세포의 커프를 가진다. 전이는 8 내지 12 세포 층에 국한된다. 미세혈관 둘레에 신생 혈관화의 증거는 없으며, 어떠한 새로은 미세 혈관도 함유하지 않았다. 이는 구혈의 프리(pre)-안지오스타틴 전이의 전형적인 최대 크기이다.
1차 종양 절제(1차 종양 접종 후 19일) 후 5일 째 수집된 조직의 면역조직학 분석에서, 전이는 기존의 폐의 혈관을 에워싸고 있었다. 반대로, 1차 종양이 절제되지 않은 샘플에서는, 종양이 신생 혈관화되어있었다. 이리하여, 온전한 1차 종양은 전이시 새로운 모세혈관의 형성을 억제하며, 전이내에서의 종양세포의 증식은 1차 종양에 의해 영향받지 않는다.
실시예 5
1차 종양은 마우스 각막에 이식된 2차 종양의 맥관형성을 억제한다. 2차 종양의 생장은 억제된다.
0.25 내지 0.5㎣의 루이스 폐 종양(LLC-Low)을 마우스 각막내로 0일째 이식한다(Muthukkaruppan Vr., et al., Angiogenesis in the mouse cornea. Science 205:1416-1418, 1979). 1차 종양은 배면에서 피하로 1 ×106LLC-Low 세포를 접종함에 의해 각막 이식 전 4 내지 7일 전; 각막 이식날; 또는 각막 이식 후 4 내지 7일 후에 형성된다. 대조군 마우스는 각막 이식은 받으나, 피하 종양은 받지 않는다. 다른 대조군 마우스는 각막 이식을 받고 각막 이식 전 4일째 배면에 LLC-High 종양 세포의 접종을 받는다. 각막들을 각막 종양의 생장에 대해(접안 마이크로미터에 의해 측정) 그리고 각막 주변의 가장자리로부터의 신 모세혈관의 생장에 대해 슬릿-램프 입체현미경에 의해 매일 평가한다.
1차 피하 종양을 품지 않는 대조군 마우스에서, 각막의 대부분(6/8)은 각막 이식 후 6 내지 7일째 신생 혈관화 개시를 전개시키며, 10일까지 계속한다. 10일째, 혈관화된 각막 종양은 대략 전체 눈의 체적의 1/4에 도달한다. 1차 피하 LLC-Low 종양의 존재시, 각막 이식은 1차 종양이 각막 이식 전 적어도 4일 또는 그 이상까지 제자리에 있다면 혈관화되지 않게 된다(표 1). 신생 혈관화의 부재시 각막 종양은 각막 내에서 얇고 하얀 구혈 디스크로서 천천히 자란다.
그러나, 1차 종양이 각막 이식 후 4일까지 이식되지 않는다면, 각막은 혈관화되고 3/3 각막 종양은 비-종양 대조군과 같이 유사한 비율로 자란다. 1차 피하 LLC-High 종양의 존재, 대부분의 각막(2/3)은 각막 이식 후 7일째에 신생 혈관화 개시를 전개시키며, 10일까지 계속한다. 10일째, 혈관화된 각막 종양은 다시 전체 눈의 체적의 대략 1/4에 도달한다.
1차 피하 종양에 의한 각막에서의 종양 맥관형성의 억제. [모든 1차 종양은 LLC-High(*)를 제외하고는 LLC-Low이다]
눈 이식일 0 0 0 0 0 0 0
1차 종양 이식일 -7 -4 -4* 0 없음 +4 +7
10일째 신 각막 혈관을 가진 마우스이 갯수 2/10 0/9/ 2/3 2/3 6/8 3/3 2/3
1차 LLC-Low 피하 종양이 눈 종양 이식 전 7일째 이식되었을 때 0/10 각막이 신생 혈관화를 보일 것으로 기대된다. 그러나, 2개의 종양(2/10)이 너무 커서(＞3㎤)로서 괴사되었다.
실시예 6
1차 온전한 종양은 기본 섬유아세포 생장 인자(bFGF)의 2차 피하 이식에 의해 유도된 맥관형성을 억제한다.
실시예 V 및 VI에 기술된 모든 실험이 1차 종양이 2차 전이에서의 맥관형성을를 억제하는 것을 보여줌에도 불구하고, 모든 연구가 1차 종양이 (i) 내피세포증식(맥관형성)을 직접적으로 억제하는지 또는 (ii) 전이적 종양 세포의 안기오제닉 활성을 하양-제어함에 의해 간접적으로 억제하는지를 보여주는 것은 아니다. 이들 두가지 가능성을 구별하기 위해서, 피하 맥관형성의 병소는 기본 섬유아세포 생장 인자(bFGF)를 함유하는 매트리겔의 이식에 의해 유도된다(Passaniti A, et al., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and anti-angiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast growth factor. Lab. Invest. 67:519,1992].
헤파린의 존재시 25 내지 50ng/㎖의 bFGF를 함유하는 매트리겔(기저막 단백의 추출물)을 정상 마우스 및 종양(LLC-Low)을 푸는 마우스의 복부 표면상에 피하주입한다. 마우스를 4일후 죽이고 겔의 혈관형성을 정량화하기 위해 헤모글로빈 농도를 측정한다. 매트리겔에 들어가는 신 혈관의 갯수는 헤모글로빈 농도와 연관되는 것으로 이전에 밝혀진 바 있다(Folkman J., Angiogenesis and its inhibitors in "Important Advances in Oncology 1985", VT DeVita, S. Hellman and S. Rosenberg, editors, J.B. Lippincott, Philadelphia 1985). 일부 겔 또한 조직학 검사를 위해 준비한다. 정상 마우스에서, 50ng/㎖ bFGF를 함유하는 매트리겔 펠릿은 완전히 적색이다. 그들은 새로운 모세 혈관에 의해 심각하게 공략되었고, 2.4g/dl 헤모글로빈을 함유한다. bFGF가 결여된 매트리겔은 반투명하고 회색이며, 0.4g/dl 헤모글로빈만을 함유한다(6배 차이). 반대로, 1차 종양을 가진 마우스로부터의 매트리겔은 단지 0.5g/dl을 함유한다(도 4).
본 실험에서의 맥관형성의 거의 완전한 억제는 루이스 폐 1차 종양이 bFGF-유도된 맥관형성을 직접적으로 억제할 수 있음을 제시한다.
실시예 7
종양을 품는 동물로부터 1차 종양이 제거된 동물로의 혈청 이송은 전이를 억제한다.
상기 기술된 바와 같이 루이스 폐암을 마우스에 이식한다. 15일 후, 종양이 대략 1500㎣일 때, 마우스를 랜덤하게 4개의 그룹으로 나눈다. 세 개의 그룹은 1차 종양의 완전한 외과 절제를 수행하고; 한 그룹에서는 종양을 그대로 남겨둔다(모의 수술 절차 후). 이후 세 개의 절제 그룹내 마우스에 식염수, 정상의 비종양 마우스로부터의 혈청, 또는 1500㎣ 루이스 폐암을 가진 마우스로부터의 혈청을 매일마다 복강내 주입한다. 종양이 온전한 채로 방치된 마우스 그룹에 복강내 식염수를 주입한다. 모든 마우스를 21일동안 처리하고, 이 후 동물을 안락사시키고 폐 전이를 카운팅한다(표 2).
제거된 1차 종양 온전한 1차 종양
처리(복강내 주입) 식염수 정상 마우스로부터의 종양을 품는 식염수 주입혈청 마우스로부터의 혈청
폐 전이 갯수 55±5 50±4 7±2 3±1
이들 결과는 폐 중량에 의하여 확인되었다. 두 그룹간의 차이에 대하여 p = ＜0.0001 [(55 ＆ 50) vs. (7 ＆ 3)]. 유사한 결과가 종양을 품는 동물의 뇨로부터 안지오스타틴을 사용하여 얻어졌다.
실시예 8
소 모세혈관 내피 (BCE) 세포 분석
BCE 세포는 계대접종 9 및 14 사이에서만 사용된다. 0일째, BCE 세포를 젤라틴화(24시간동안 37℃에서 PBS내 1.5% 젤라틴, 10% CO2및 이어서 0.5㎖로 세정됨)된 24 웰 플레이트에 12,500 세포/웰의 농도로 플레이팅한다. 혈구계를 사용하여 세포 카운팅을 수행한다. 세포를 10%-열 불활성화된 소 혈청 및 1% 글루타민-펜-스트렙과 함께 500㎕ DMEM에 플레이팅한다.
BCE 세포를 다음과 같이 챌린징한다: 배지를 제거하고 250㎕ DMEM/5% BCS/1%GPS로 교환한다. (양은 시험되는 샘플에 따라 변할 것이다) 플레이트를 대략 10분동안 37℃/10% CO2에 위치시킨다. 2ng/㎖ bFGF와 함께 250㎕ DMEM/5% BCS/1%GPS를 각 웰에 가한다. 플레이트를 72시간동안 37℃/10% CO2배양기에 재위치시킨다.
4일째, 배지를 제거하여 세포를 카운팅한 다음, 3 내지 3분동안 모든 웰을 트립신화한다(0.5㎖ 트립신/EDTA). 현탁된 세포를 이어서 9.5㎖ 헤메탈과 함께 신틸레이션병에 이송시키고 쿨터 카운터를 사용하여 카운팅한다. 활성 단위는 내피세포가 72시간동안 bFGF 1ng/㎖내에서 배양될 때 모세혈관 내피세포 증식의 최대 억제의 1/2을 생산할 수 있는 안지오스타틴을 함유한 혈청의 그 양이다.
실시예 9
저 전이 루이스 폐 종양(LLC-Low)를 품는 마우스로부터의 혈청은 시험관내에서 모세혈관 내피세포 증식을 억제한다.
소 모세혈관 내피세포를 72시간 증식 분석에서 기본 섬유아세포 생장 인자(bFGF 1ng/㎖)로 자극시킨다. 이들 배양액에 가해진 종양을 품는 마우스의 혈청은 투여량-의존적이며 가역적인 방법으로 내피세포 증식을 억제한다. 정상 혈청은 억제적이지 않다(도 5). 내피세포 증식은 종양을 품는 nu/nu 마우스 및 SCID 마우스로부터 얻어진 혈청에 의해 유사한 방식으로 억제되었다. 1차 종양이 제거된 후, 안지오스타틴 활성은 3-5일에 혈청으로부터 사라졌다.
종양을 품는 혈청 또한 소 대동맥 내피세포 및 자발적 마우스 혈관내피종으로부터 유도된 내피세포를 억제하나(Obeso, et al., "Methods in Laboratories Investigation, A Hemangioendothelioma-derived cell line; Its use as a Model for the Study of Endothelial Cell Biology," Lab Invest.,63(2), pgs 259-269, 1990), 루이스 폐 종양 세포, 3T3 섬유아세포, 대동맥 평활근 세포, 밍크 폐 상피세포, 또는 W138 인간 태아 폐 섬유아세포를 억제하지는 않는다.
실시예 10
전이를 억제하지 않는 루이스 폐 종양(LLC-High)을 품는 마우스로부터의 혈청은 시험관내에서 모세혈관 내피세포 증식을 억제하지 않는다.
LLC-High 일차 종양을 품는 마우스로부터의 혈청은 대조군에 비하여 bFGF 자극된 소 모세혈관 내피세포의 증식을 상당할 정도로 억제하지는 않는다. 또한, 이 혈청이 정제의 첫번째 두 단계에 적용되었을 때(헤파린-세파로스 크로마토그래피 및 겔 투과), 안지오스타틴 활성은 어느 분획에서도 발견되지 않았다.
실시예 11
루이스 폐암(저 전이)으로부터의 복수 또한, 안지오스타틴 혈청을 발생시킨다.
마우스에 LLC-Low 또는 LLC-High 종양 세포(106)를 복강내 주입하고, 1주 후, 1-2㎖ 혈복수를 각 10-20 마우스로부터 얻는다. 장간막 종양 시딩(seeding)이 보인다. 이후 마우스를 안락사시킨다. 혈청을 심장 펀치에 의해 얻는다. 또한, 혈청을 정상, 비-종양 마우스로부터도 대조군으로서 얻는다. 혈청과 복수를 세포를 제거하기 위해 원심분리하고, 상청액을 bFGF(1ng/㎖)에 의해 자극된 소 모세혈관 내피세포 상에서 분석한다(실시예 IX 참조). 두 유형의 종양으로부터 기원하는 복수는 72시간 후 대조군에 비하여 모세혈관 내피세포의 증식을 상당히 자극한다(도 6). 반대로, 저 전이 마우스로부터의 혈청은 내피세포 증식을 억제한다(대조군의 79% 억제). 고 전이주로부터의 혈청은 200% 자극적이다.
이들 데이터는 저 전이주의 복수가 안지오스타틴에 대하여 우세한 내피세포생장 자극제를 함유함을 보여준다. 이 조건은 충실성 1차 종양에 유사하다. 더욱이, 안지오스타틴 활성은 자극 활성에 의해 부정되지 않는다고 하더라도, 혈청에 나타난다. 이러한 패턴은 충실성 1차 종양(LLC-Low)와 유사하다. 고 전이 종양(LLC-High)으로부터의 복수 또한 우세한 내피세포 자극제를 함유하는 것으로 보이나, 안지오스타틴은 혈청에서 확인될 수 없다.
실시예 12
칼럼 크로마토그래피에 의한 혈청으로부터의 안지오스타틴의 분획화 및 SDS-PAGE에 의한 생장-억제 분획의 분석
안지오스타틴을 정제하기 위하여, 혈청을 종양을 품는 마우스로부터 수집하였다. 상기 기술된 시험관내 억제 활성 분석에 따라 분석되는 억제 활성은 헤파린-세파로스, 바이오겔 A 0.5㎜ 아가로스, 및 수회의 C4-역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 연속적으로 크로마토그래핑한다. 내피세포억제 활성을함유하는 HPLC 분획의 SDS-PAGE는 38,000 달톤의 뚜렷한 환원 MR의 분리 밴드를 드러내는데, 이는 대략 2×107의 특이 활성으로 대략 백만배(표 3 참조) 정제된 것이다. 다른 정제 단계에서, 수비된 분획을 공지의 내피세포억제제의 존재를 위해 특이 항체로 시험하였다. 혈소판 인자-4, 트롬보스폰딘, 또는 형질전화 생장 인자 베타는 부분적으로 정제되거나 정제된 분획에서 관찰되지 않았다.
특이 활성 (단위*/㎎) 정제 배수
혈청 1.69 1헤파린 세파로스 14.92 8.8바이오-겔 A0.5m 69.96 41.4HPLC/C4 2×1071.2×106
* 활성 단위는 내피세포가 72시간동안 bFGF 1ng/㎖내에서 배양될 때 모세혈관 내피세포증식의 최대 억제의 1/2을 생산할 수 있는 안지오스타틴을 함유한 혈청의 그 양이다.
실시예 13
칼럼 크로마토그래피에 의한 뇨로부터 안지오스타틴의 분획화 및 SDS-PAGE에 의한 생장-억제 분획의 분석
혈청으로부터의 내피세포 억제제의 정제는 각 마우스로부터 얻을 수 있는 혈청의 소량 체적에 그리고 혈청내 다량의 단백질에 의해 지장받는다.
종양을 품는 마우스로부터의 뇨를 분석한 결과, 이는 비-종양 마우스의 뇨 및 LLC-High 종양을 가진 마우스에 부재하는 내피세포 증식 억제제를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 내피세포 억제 활성의 정제는 혈청 정제를 위해 사용되는 동일 전략에 의해 수행된다(상기 기술됨)(도 7).
도 7은 종양을 품는 동물로부터의 부분적으로 정제된 혈청 또는 뇨의 C4 역상 크로마토그래피를 보여준다. 모든 분획을 실시예 IX에 기술된 바와 같이 72시간 증식 분석에서 bFGF와 함께 소 모세혈관 내피세포상에서 분석하였다. 분리 억제 피크가 분획 23 내 30-35% 아세토니트릴에서의 양쪽 용출에서 관찰된다. 종양을 품는 동물로부터의 혈청의 C4 역상 크로마토그래피의 세번째 사이클로부터의 억제 분획의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 약 38,000 달톤에서 단일 밴드를 보여준다.
실시예 14
순환하는 안지오스타틴의 특징규명
내피세포억제는 실시예 9에 기술된 절차에 따라 분석된다. 안지오스타틴을 신크로파크(Synchropak) HPLC C4 칼럼 상에서 단리하였다(Synchrom, Inc. Lafayette, IN). 억제제를 30 내지 35% 아세토니트릴 구배에서 용출하였다. 환원 조건(b-머캅토에탄올(5% v/v)하 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 겔 상에서, 활성 단백질 밴드를 38 킬로달톤에서 용출하였다. 비-환원 조건하에서, 활성 단백질은 28 킬로달톤에서 용출된다. 활성은 개시 샘플이 뇨로부터 단리되었건, 혈청으로부터 단리되었건간에 관계없이 유사한 지점에서 관찰되었다. 활성은 어느 다른 밴드에서도 감지되지 않았다.
밴드와 연관된 활성은 열이 가해지거나(100℃에서 10분동안) 트립신으로 처리하면 상실된다. 활성 밴드를 물/클로로포름 혼합물(1:1)로 추출하였을 때, 활성은 수상에서만 관찰된다.
실시예 15
인간 플라스미노겐으로부터의 억제 단편의 정제
플라스미노겐 라이신 결합 부위 I를 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company)로부터 얻는다. 엘라스타제로 소화 후 인간 플라스미노겐을 정제하여 제조한다. 이 방식으로 얻어진 라이신 결합 부위 I은 플라스민 A-쇄 내 적어도 세 개의 트리플-루프 구조(1번 내지 3번)를 집합체로 함유하는 단백질 그룹이다(Kringle 1+1+3). (Sotrrup-Jensen, L., et al. in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, 191, Davidson, J.F., et al. eds, Raven Press, New York 1978 and Wiman, B., et al., Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)). 플라스미노겐 라이신 결합 부위 I (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)을 물에 재현탁하고, HPLC-구배 물/0.1% TFA로 평형화된 C4-역상 칼럼에 적용한다. 칼럼을 물/0.1% TFA 내지 아세토니트릴/0.1% TFA 구배로 용출하고 분획을 폴리프로필렌 튜브내로 수집한다. 각 분취량을 스피드 백(speed vac)에서 증발시키고, 물로 재현탁시키고 증식 분석에서 BCE에 적용시킨다. 이 절차를 용출을 위한 유사한 구배를 사용하여 억제 분획에 대해 두 번 되풀이한다. 억제 활성은 C4 칼럼의 최종 운행에서 30-35% 아세토니트릴에서 용출되었다. 억제 분획의 SDS-PAGE는 환원 분자량 40, 42.5, 45kd의 뚜렷한 세 개의 분리 밴드를 드러낸다. 비-환원 조건하에서의 SDS-PAGE는 각각 분자량 30, 32.5, 35kd의 세 개의 밴드를 드러낸다.
실시예 16
SDS-PAGE로부터의 억제 활성의 추출
인간 플라스미노겐 기본 정제로부터의 정제된 억제 분획을 비-변성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분해하였다. 은 염색에 의해 동일 샘플로 로딩된 인접 레인에서 보여지는 밴드에 상응하는 겔 지역을 겔로부터 떼어내어 폴리프로필렌 튜브내에서 12시간동안 4℃에서 1㎖ 포스페이트 중화 식염수에서 배양하였다. 상청액을 제거하여 6시간동안 식염수에 대하여 두 번(MWCO=6-8000), 그리고 6시간동안 증류수에 대하여 두번 투석하였다. 투석물을 진공 원심분리에 의해 증발시켰다. 산물을 식염수 내 재현탁하고 72시간 분석에서 1ng/㎖ 기본 섬유아세포 생장 인자에 의해 자극된 소 모세혈관 내피세포에 적용하였다. 세 개의 밴드 각각으로부터 추출된 단백질은 모세혈관 내피세포를 억제하였다.
실시예 17
플라스미노겐 단편 처리 연구
마우스에 루이스 폐암을 이식하여 종양이 1500-2000㎣일 때 절제하였다. 수술 당일, 마우스를 6개의 그룹으로 랜덤하게 나눈다. 마우스에 인간 플라스미노겐의 세 개의 정제 억제 단편, 전체 인간 플라스미노겐, 종양을 품는 마우스로부터의 뇨, 정상 마우스로부터의 뇨, 또는 식염수를 복강내 주입한다. 모의 절차만을 받은 종양을 품는 한 그룹의 마우스에 식염수를 주입한다. 종양 제거 후 즉시, 마우스에 로딩 투여량으로서 24㎍의 억제 플라스미노겐 단편을 복강내 주입한다(1.2㎎/㎏/일/마우스). 이어서, 실험 기간동안 12㎍의 억제 단편을 매일 복강내 주입한다(0.6㎎/㎏/일/마우스). 대조군 마우스에는 종양 제거후 동일 투여량의 전체 플라스미노겐 분자를 받도록 한다. 뇨 처리를 위해서, 정상 마우스 또는 종양을 품는 마우스의 뇨를 필터링하여 광범위하게 투석하고 동결건조한 다음 살균수내 재현탁하여 250배 농도를 얻는다. 마우스에 종양을 품는 마우스 또는 정상 마우스로부터의 투석된 뇨 농축액 0.8㎖를 로딩 투여량으로서 1차 종양의 제거일 날 두 번의 복강내 주입으로 제공한다. 이어서 투석되고 농축된 뇨 0.4㎖를 실험 과정동안 매일 복강내 주입한다. 13일 동안 처리를 계속한 다음, 모든 마우스를 죽여서 부검한다.
실험 결과는 도 8 및 9에 보여진다. 도 8은 13일 처리 후 표면 폐 전이를 보여준다. 표면 폐 전이는 부검시 마우스의 폐에서 보여진 전이의 갯수를 일컫는다. 입체 현미경이 전이를 카운팅하는데 사용된다. 도 8은 카운팅된 표면 폐 전이의 평균 갯수와 평균의 표준 오차를 보여준다. 도시된 바와 같이, 1차 종양이 존재하는 그룹내 마우스는 어떠한 전이도 보이지 않는다. 1차 종양이 절제되어 식염수로 처리된 마우스는 광범위한 전이를 보인다. 인간 유래 플라스미노겐 단편으로 처리된 마우스는 어떠한 전이도 보이지 않는다. 전체 플라스미노겐으로 처리된 광범위한 전이를 보이는데, 이는 전체 플라스미노겐 분자가 내피세포 억제 활성을 가지지 않음을 나타낸다. 종양을 품는 마우스로부터의 투석되고 농축된 뇨로 처리된 마우스는 어떠한 전이도 보이지 않는다. 정상 마우스로부터의 농축뇨로 처리된 마우스는 광범위한 전이를 보인다. 폐 중량을 측정할 때, 유사한 결과가 얻어진다(도 9).
실시예 18
마우스 및 인간 안지오스타틴의 아미노산 서열
마우스 뇨로부터 단리된 안지오스타틴 및 인간 라이신 결합 부위 I 단편 제조로부터 단리된 안지오스타틴의 아미노산 서열을 어플라이드 바이오시스템 모델 (Applied Biosystem Model) 477 A 단백질 서열기상에서 결정하였다. 페닐티오히단토인 아미노산 분획을 온-라인 ABI 모델 120 A HPLC로 확인하였다. 마우스 및 인간 안지오스타틴의 N-말단 서열 및 트립신 분해로부터 결정된 아미노산 서열은 안지오스타틴의 서열이 마우스 플라스미노겐 98번 아미노산에서 시작하는 서열에 유사함을 나타낸다. 즉, 안지오스타틴의 아미노산 서열은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 환원시킴에 의해 결정되는 바와 같이 대략 30 킬로달톤 및 45 킬로달톤 사이의 분자량을 가지며 온전한 마우스 플라스미노겐 분자의 98번 아미노산에서 시작하는 마우스 플라스미노겐 단편의 그것과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 분자이다. 마우스 안지오스타틴의 출발 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)은 도 1에 도시되어 있다. 아미노산 서열의 길이는 도 1에 도시된 것보다 약간 길거나 짧을 수 있다.
인간 라이신 결합 부위 I의 활성 분획의 N 말단 아미노산 분석 및 트립신 분해(실시예 15 참조)는 분획의 서열이 인간 플라스미노겐의 대략 97 또는 99 아미노산에서 시작하고 인간 안지오스타틴이 마우스 안지오스타틴에 상동성임을 보여준다. 인간 안지오스타틴의 시작 아미노산 서열(98번 아미노산에서 시작)은 도 2에 보여진다(SEQ ID NO:3). 마우스 및 인간 안지오스타틴의 아미노산 서열은 돼지, 소, 및 붉은털 원숭이 플라스미노겐을 포함하는 다른 종의 플라스미노겐으로부터의 상응하는 내부 아미노산 서열과 도 2에서 비교되는데, 이는 이들 종에서의 안지오스타틴의 존재를 가리킨다.
실시예 19
이.콜라이에서 인간 안지오스타틴의 발현
pTrcHisA 벡터(Invitrogen) (도 10)를 이.콜라이에서 진핵 유전자의 향상된 해독 효율을 위해 trc 프로모터로부터 고-수준의 제어 전사를 얻기 위해서 사용한다. 안지오스타틴을 금속 친화 수지를 사용한 1 단계 정제를 위해 N-말단 니켈-결합 폴리 히스티딘 꼬리에 융합시켜 발현시킨다. 융합 단백질 내 엔테로키나아제 절단 인식 부위는 정제된 재조합 단백질로부터 N-말단 히스티딘 융합 단백질의 후속 제거를 허용한다. 재조합 인간 안지오스타틴 단백질은 라이신을 결합시키는 것으로 밝혀졌고; 크링글 지역 1, 2 및 3에 특이적인 모노클로날 항체와 교차 반응하며, 시험관내에서 bFGF-유래 내피세포 증식을 억제한다.
삽입물을 작제하기 위해, 인간 안지오스타틴을 암호화하는 유전자 단편을 인간 간 mRNA로부터 이를 역전사하고 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 및 특이 프라이머를 사용하여 증폭시킴에 의해 얻는다. 1131 염기쌍 산물은 인간 플라스미노겐의 93 내지 470 아미노산을 암호화한다. 증폭된 단편을 pTrcHisA의 XhoI/KpnI 부위내로 클로닝하고 결과 작제물을 XL-1B (Stratagene으로부터 구입가능함) 이.콜라이 숙주 세포내로 형질전환시킨다. 플라스미드 벡터 pTrcHisA만을 함유하는 대조군 클론을 마찬가지로 XL-1B 이.콜라이 숙주 세포내로 형질전환시킨다. 이 클론은 벡터 대조군 클론으로 언급한다. 양 클론을 하기에 기술된 바와 같이 동일하게 정제한다.
발현 콜로니를 하기의 방식에 따라 선별한다. 안지오스타틴 암호화 유전자로 형질전환된 이.콜라이 콜로니 리프트를 IPTG 함침 니트로셀룰로오스 필터상에서 자라게 하고 LB 한천 플레이트상에 오버레잉한다. IPTG 발현 유도에 이어서 콜로니를 니트로셀룰로오스 필터상에서 용출시킨다. 니트로셀룰로오스 리프트를 블로킹하고 세정한 다음, 안지오스타틴의 특이 구조를 인식하는 두 개의 다른 모노클로날 항체로 탐침한다(mAbs Dcd and Vap; gift of S.G. McCance and F.J.Castellino, University of Notre Dame). mAb에 의하여 강하게 발현되는 콜로니를 선별한다.
최대 발현을 위한 적정 시간을 규명하기 위하여, 세포를 IPTG 유도 전, 후로 다양한 시간대에서 수집하고, 반복된 냉각-해동 사이클에 처하게 하고, SDS-PAGE, 면역블로팅 및 mAbs Dcd 및 Vap으로 프로빙 분석한다.
이들로부터, 클론 pTrcHisA/HAsH4을 선별한다. IPTG로의 유도는 4시간이며, 이후 세포 펠릿을 수집하여 50mM Tris pH 8.0, 2mM EDTA, 5% 글리세롤 및 200㎎/㎖ 리소자임 내에서 재현탁한 다음 4℃에서 30분동안 교반한다. 슬러리를 14,000rpm에서 25분동안 원심분리하고, 펠릿을 50mM Tris pH 8.0, 2mM EDTA, 5% 글리세롤 및 0.1% DOC 내에서 재현탁한다. 이 현탁액을 4℃에서 1시간동안 교반한 다음, 14,000rpm에서 25분동안 원심분리한다. 인간 안지오스타틴을 발현하는 이.콜라이는 본래의 안지오스타틴의 물리적 성질, 즉, 라이신에 결합하는 능력을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 이리하여, 안지오스타틴을 발현하는 이.콜라이는 단일 단계로 라이신-세파로스(Pharmacia 또는 Sigma) 칼럼상에서 정제된다. 칼럼으로부터 안지오스타틴은 0.2M 엡실론-아미노-n-카프로산 pH 7.5로 용출된다.
이들 실험에 이어서, 규모가 확장된 10L 발효 배지의 클론 pTrcHisA/HAsH4이 수행된다. 이러한 규모가 확장된 유도로부터 얻어지는 세포를 펠릿화하고 50mM Tris pH 7.5 내에서 재현탁하고, 10℃ 내-사이 통과(in-between pass)에서 세번의 10,000psi 냉각에서 크래킹한다. 얻어진 여액을 4℃에서 30분동안 10,000rpm에서 원심분리하여 맑게 하고, 발현된 안지오스타틴을 라이신-세파로스상에서 단리한다(도 11).
정제된 이.콜라이 발현 인간 안지오스타틴을 물에 대하여 철저히 투석하고, 동결건조시킨다. 발현된 인간 안지오스타틴을 3㎍/㎖ 측정 농도로 배지(DMEM, 5% BCS, 1% 젠타마이신/페니실린/스트렙토마이신)내 재현탁하는데, 이는 실시예 8에 기술된 바와 같이 소 모세혈관 내피(BCE) 세포 분석에 사용된다. 유사하게, 벡터만을 함유하는 대조군 클론을 클론 pTrcHisA/HAsH4과 동일한 방식으로 처리한다. 동일하게 IPTG로 유도되며, 세균 여액은 라이신을 결합하는데 사용되며, 0.2M 아미노 카프로산으로 용출하며, 철저히 투석하고, 동결건조시킨다. 이 대조군 제제는 또한 3㎍/㎖ 측정 농도로 배지내에 재현탁된다. 재조합 안지오스타틴 샘플과 대조군을 다른 유도 및 발효 배치 및 다른 정제 운행으로부터 얻고, 메릴랜드의 엔트레메드(EntreMed)에서 모두 해독한다. 보스톤의 Children's Hospital에서 맹검법(blinded fashion)에 의해 이들 해독된 샘플에서 BCE 분석을 수행한다.
재조합 인간 안지오스타틴의 BCE 분석 결과는 이.콜라이에서 발현된 인간 안지오스타틴이 bFGF(1ng/㎖로 사용됨)에 기인한 BCE 세포의 증식을 억제함을 보여준다(도 12). 배지 내 스톡 재조합 안지오스타틴(대략 3㎍/㎖)은 1:5, 1:10 및 1:20 희석에서 사용된다. 억제 퍼센트는 하기와 같이 산출된다:
안지오스타틴을 가진 세포수 - 0일째 세포수
1- -------------------------------------------
bFGF를 가진 세포수 - 0일째 세포수
BCE 세포 증식의 억제%는 유사한 농도에서의 플라스미노겐-유도된 안지오스타틴의 그것보다 비교할만하거나 더 높다. BCE 분석의 반복 운행으로부터의 결과는 도 13에 도시되어 있으며, 여기에서 1:5 스톡 희석에서 재조합 안지오스타틴은 플라스미노겐-유도된 안지오스타틴으로 얻어진 것과 유사한 억제%를 제공한다. 도 13은 인간 재조합 안지오스타틴 단백질이 배양액 내에서 60% 이상, 및 75% 이상만큼 BCE 증식을 억제한다는 놀랄만한 결과를 보여준다.
실시예 20
안지오스타틴은 세포괴사율을 증가시킴에 의하여 미세전이의 휴면을 유지한다.
루이스 폐암 세포(1×106)로의 C57BL6/J 마우스의 피하 접종에 따라서, 대략 1.5㎤의 1차 종양이 전개된다. 동물을 1차 종양의 외과 절개 또는 모의 수술에 처하게 한다. 수술 후 5, 10 및 15일째, 마우스를 죽여서 이들의 폐를 조직학 검사용으로 준비한다. 1차 종양이 절제된 동물은 모의 수술된 대조군에 비하여 육중한 미세전이의 증식을 보인다(도 14). 이들 변화는 상당한 폐 중량 증가를 동반한다.
브로모-데옥시우리딘(BrdU)의 흡취에 의해 측정되는 바와 같이, 종양 세포 증식의 분석은 온전한 1차 종양 또는 절제된 종양을 가진 동물 사이에 차이가 없음을 보여주는데, 이는 종양 부피의 증가가 증가된 증식에 의해 설명될 수 없음을 나타낸다(도 15). 따라서, 세포 괴사를 이들 동물에서 시험하였다. 세포괴사, 즉, 세포 사망 과정은 유전자 발현에서의 변화에 의존적이며, 전개동안 세포의 제거를 설명하며, 이는 소장과 같이 빠르게 증식하는 조직에서 터미널 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 기술로 단편화된 DNA를 면역조직학 라벨링함으로써 검사된다. 세포괴사율은 각 사망 시간별로 측정된다. 1차 종양의 제거는 검사된 모든 시간대에서 통계적으로 유의미한 세포괴사율 증가(대략 3 내지 4배)를 야기한다(도 15).
지지하는 증거가 제거된 1차 종양을 가진 마우스에 안지오스타틴의 외래성 억제제로 처리함에 의하여 얻어졌다. 이 물질, TNP-1470(O-클로로아세틸카바모일 푸마질로일, 이전에 AGM-1470으로 지칭되었음)은 보고된 안지오스타틴 활성을 가진 푸마질린의 유사체이다. TNP-1470의 피하 주입(이틀간격으로 30㎎/㎏)은 온전한 1차 종양을 가진 동물에 대해 상기 기술된 것과 놀랍게도 유사한 결과를 가져왔다. 이들 동물은 식염수-유도 대조군과 비교하여 더 낮은 폐 중량, 상당한 증식율 및 증가된 세포괴사율을 보인다(도 16).
이들 데이터는 전이가 종양 세포 증식이 등가의 세포 사망에 의해 밸런싱될 때 휴면을 유지함을 가리킨다. 1차 종양의 제거는 전이 생장의 빠른 증가를 야기하는데, 이는 아마도 종양 세포에서 세포괴사를 증가시킴에 의해 전이 생장을 제어하는 맥관형성 억제제(안지오스타틴)의 제거에 기인할 것이다. 이러한 영향은 뒤따르는 1차 종양의 제거 및 맥관형성의 외래성 억제제의 투여에서 보여지는 것과 유사하다. 종합하면, 이들 데이터는 1차 종양이 미세전이의 휴면을 유지하는 안지오스타틴을 방출함을 제시한다.
실시예 21
안지오스타틴으로의 1차 종양의 생체내 처리
안지오스타틴을 상기 실시예 15에 기술된 바와 같이 국한된 엘라스타제 소화에 의해 인간 플라스미노겐으로부터 정제한다. 안지오스타틴을 6주된 수컷 C57BI6/J 마우스로의 투여용으로 포스페이트-완충 식염수에 재현탁시킨다. 동물을 루이스 폐암 또는 T241 섬유육종의 1×106종양 세포로 피하 이식한다. 안지오스타틴의 처리는 종양이 80-160㎣ 크기일 때의 4일 후에 시작한다. 마우스에 안지오스타틴을 복강내 또는 피하 경로로 40㎎/㎏으로 단일 주입하거나 또는 80㎎/㎏ 두번 주입한다. 동물을 처리 19일에 이르기까지의 다양한 시간대에 죽인다.
날마다 복강내 40㎎/㎏의 투여량으로 투여된 안지오스타틴은 T241 1차 종양의 생장을 상당할 정도로 억제한다(도 17). 생장에 대한 이러한 억제 효과는 2일 내에 육안으로 드러나며, 연구 기간에 걸쳐서 크기 증가를 보인다. 18일까지 안지오스타틴-처리된 마우스는 식염수 주입 대조군의 체적의 대략 38%인 종양을 갖는다. 이 차이는 통계적으로 유의미하다(p<0.001, Students t-test).
안지오스타틴 처리(80㎎/㎏/일의 총 투여량, 하루에 두번 40㎎/㎏으로 복강내 또는 피하 투여)는 또한 LLC-LM 1차 종양의 생장율을 상당히 감소시킨다(도 17). 이 억제 효과는 4일째에 드러나며, 검사된 모든 후속 시간대에서 크기 증가를 보인다. 검사 마지막날(19일), 안지오스타틴-처리된 마우스는 식염수-주입된 대조군의 단지 20%인 평균 종양 체적을 가지는데, 이는 유의미하게 다르다(p<0.001 Students t-test).
다른 일련의 실험에서, 안지오스타틴을 T241 섬유육종, 루이스 폐암(LM) 또는 세망 세포 육종 세포로 이식된 마우스에 투여하였다(50㎎/㎏ q12h). 각종 종양 세포에 대해, 안지오스타틴을 받은 마우스는 실질적으로 감소된 종양 크기를 갖는다. 도 19는 T241 섬유육종에 대해, 안지오스타틴 처리된 마우스가 24일째 미처리된 마우스의 단지 15%인 평균 종양 체적을 가짐을 나타낸다. 도 20은 루이스 폐암(LM)에 대해, 안지오스타틴 처리된 마우스가 24일째 미처리된 마우스의 단지 13%인 평균 종양 체적을 가짐을 나타낸다. 도 21은 세망 육종에 대해, 안지오스타틴 처리된 마우스가 24일째 미처리된 마우스의 단지 19%인 평균 종양 체적을 가짐을 나타낸다. 이들 데이터는 각 시간대별로 4개의 마우스의 평균을 가리킨다.
이들 결과는 안지오스타틴이 생체내 세 개의 다른 1차 종양의 생장의 극히 유력한 억제제임을 나타낸다.
실시예 22
안지오스타틴으로 마우스 내 인간세포-유도된 1차 종양의 생체내 처리
두 개의 인간 종양 세포주, 인간 전립선 암 PC-3 및 인간 유방암 MDA-MB 에 대한 안지오스타틴의 영향을 연구하였다. 면역결핍 SCID 마우스에 인간 종양 세포를 이식하고, 마우스를 실시예 21에 기술된 바와 같이 필수적으로 매 12시간마다 50㎎/㎏의 안지오스타틴을 처리한다. 결과는 본 발명의 안지오스타틴 단백질이 인간 종양 세포 생장의 유력한 억제제임을 나타낸다. 도 22는 인간 전립선 암 PC-3에 대해, 안지오스타틴 처리된 마우스가 24일째 미처리된 대조군 마우스와 비교하여 단지 2%의 평균 종양 체적을 가짐을 보여준다. 도 23은 인간 유방암 MDA-MB에 대해, 안지오스타틴 처리된 마우스가 24일째 미처리된 대조군 마우스와 비교하여 단지 8%의 평균 종양 체적을 가짐을 보여준다.
실시예 23
유전자 치료 - 종양 체적에 대한 안지오스타틴 유전자의 형질감염 효과
마우스 플라스미노겐 아미노산 1-460을 암호화하는 마우스 플라스미노겐 cDNA로부터 유래된 안지오스타틴에 대한 1380 염기쌍(American Type Culture Collection으로부터 구입)을 PCR을 사용하여 발생시켜 발현 벡터내로 삽입한다. 발현 벡터를 T241 섬유육종 세포내로 형질감염시킨 후, 형질감염된 세포를 마우스 내로 이식한다. 대조군 마우스에 비-형질감염 T241 세포 또는 벡터만으로 형질감염된 T241 세포(즉, 비-안지오스타틴 발현 형질감염 세포)를 받게 한다. 세 개의 안지오스타틴-발현 형질감염된 세포 클론을 실험에 사용한다. 평균 종양 체적을 시간대에 걸쳐서 측정한다. 결과는, 비-형질감염된 대조군 마우스 및 비-발현 대조군 세포주와 비교할 때, 안지오스타틴-발현 세포 클론에 대한 마우스에서 평균 종양 체적의 놀랄만하고 급격한 감소를 보여준다.
마우스 안지오스타틴 단백질을 암호화하는 마우스 DNA 서열은 마우스 플라스미노겐 cDNA로부터 유래된다. 마우스 안지오스타틴은 플라스미노겐 크링글 지역 1-4를 망라한다. 이 클론을 작제하는 도식은 도 24에 보여진다.
마우스 안지오스타틴 단백질 클론을 LIPOFECTINTM형질감염 시스템(MD, 게이더스버그, Life Technologies로부터 구입가능함)을 사용하여 T241 섬유육종 세포내로 형질감염한다. LIPOFECTINTM시약은 막 여과수 내 1:1((w/w) 양이온 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 디올레코일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)의 리포솜 제제이다.
세포의 일시적인 형질감염 절차는 하기와 같다:
1. T241 세포를 60㎠ 조직 배양 디쉬 내에서 자라게 하고, 혈청으로 보충된 2㎖의 적절한 생장 배지에 1-2×105세포 시딩.
2. 세포가 40-70% 융합될 때까지(이는 통상 18-24 시간이 걸리나, 시간은 세포 유형에 따라 다양할 것이다) 37℃ CO2배양기에서 세포 배양. T241 종양 세포 융합은 대략 70%이다.
3. 12×75㎜ 살균 튜브 내 하기 용액 준비:
용액 A: 각각의 형질감염에 대하여, 혈청이 유리된 OPTI-MEM I Reduced Serum Medium 100㎕내 희석 DNA 5㎍ (Life Technologies로부터 구입가능함) (조직 배양 등급의 탈이온수 또한 사용될 수 있다).
용액 B: 각각의 형질감염에 대하여, OPTI-MEM 배지 100㎕ 내 희석 LIPOFECTIN 30㎍.
4. 두 개의 용액을 결합하여 완만하게 섞고, 10-15분동안 실온에서 배양.
5. 무혈청 배지로 세포 두 번 세척.
6. 각 형질감염에 대하여, LIPOFECTINTM시약-DNA 혼합물을 함유하는 각 튜브에 0.8㎖ 무혈청 배지 첨가. 혼합물을 완만히 섞고 세포상에 오버레잉.
7. 37℃ CO2배양기내에서 대략 12시간동안 세포 배양.
8. 혈청을 함유하는 1㎎/㎖ 선별 배지로 DNA 함유 배지를 교환하고 총 48-72 시간동안 37℃ CO2배양기내에서 세포 배양.
9. 48-72시간 후 형질감염에서 유전자 활성에 대한 세포 추출물 분석.
안지오스타틴-특이성 항체를 이용하여 안지오스타틴 단백질의 발현을 위해 형질감염된 세포를 분석할 수 있다. 다르게는, 약 10-14일 후, G418 내성 콜로니는 CMV-안지오스타틴 형질감염된 T241 세포에서 나타난다. 또한, 다수의 콜로니는 벡터만으로 형질감염된 클론에서만 관찰되고 비형질감염된 클론에서는 관찰되지 않는다. G418 내성 클론을 면역형광법을 이용하여, 안지오스타틴의 발현을 선별해낸다.
흥미롭게도, 시험관내에서 세포 생장 T241 세포 및 안지오스타틴으로 형질감염된 루이스 폐 세포는 도 25와 26에 도시된 바와 같이, 억제되거나 악영향을 받지 않는다.
도 27은 형질감염 실험의 결과를 나타낸다. 안지오스타틴-발현 T241 형질감염된 클론 세가지 모두 대조군 마우스에서의 종양 크기에 비해 상당히 감소된 마우스내 평균 종양 크기를 생성한다. 클론 37이 이식된 마우스의 평균 종양 크기는 단지 대조군의 13%이지만, 클론 31과 클론 25 종양 크기는 각각 대조군 종양 크기의 단지 21% 및 34%이다. 이들 결과는 안지오스타틴을 암호화하는 DNA 서열이 세포에 형질감염될 수 있음을 입증하는데, 형질감염된 DNA 서열은 이식된 세포에 의해 안지오스타틴 단백질을 발현할 수 있고, 발현된 안지오스타틴은 종양 생장을 감소시키기 위해 생체내에서 기능한다.
실시예 24
안지오스타틴 발현의 생체내 부위의 위치추정
안지오스타틴 단백질, 각종 세포형에서 총 RNA, 루이스 폐 암종 세포(마우스), T241 섬유육종(마우스), 및 Burkitt's 림프종 세포(인간) 발현의 생체 부위를 위치추정하기 위해, 다수의 계대접종 후 새로생긴 종양 또는 세포 배양물 모두를 분석하여 안지오스타틴 전사체의 존재를 결정한다. 샘플의 노던 분석은 마우스 플라스미노겐에 상응하는 대략 2.4 kg의 단일 시그널을 보이는 정상 마우스 간 RNA의 것을 제외하고 모든 샘플로부터의 thn 서열과 하이브리드화하는 정상 시그널의 부재를 보여준다. 인간 샘플의 노던 분석은 인간 플라스미노겐에 상응하는 대략 2.4 kb의 단일 시그널을 보이는 정상인 간 RNA의 것을 제외한 모든 샘플로부터의 인간 안지오스타틴 서열과 하이브리드화하는 시그널의 부재를 보여준다.
역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 분석은 정상 마우스 간의 것을 제외한 마우스 안지오스타틴 서열로 탐침된 모든 샘플로부터 산물의 부재를 보여준다. RT-PCR 분석은 정상인 간(마우스의 경우 1050 bp 및 인간의 경우 1134 bp의 예측 크기)의 것을 제외한 인간 안지오스타틴 서열로 탐침된 모든 인간 샘플로부터 산물의 부재를 보여준다.
따라서 마우스 안지오스타틴 전사체(마우스 플라스미노겐의 아미노산 97-450과 일치한다고 가정)는 모든 상기 마우스 샘플에 의해 생성되는 것은 아니고 인간 안지오스타틴 전사체(인간 플라스미노겐의 아미노산 93-470과 일치한다고 가정)는 상기 인간 샘플에 의해 생성되지 않는 것으로 보인다. 정상 마우스/인간 간에서 얻어진 양성 시그널은 플라스미노겐을 이용한 하이브리드화에서 나온다.
실시예 25
효모에서 안지오스타틴의 발현
인간 플라스미노겐의 아미노산 93-470을 암호화하는 유전자 단편을 효모 피치아 파스토리스에서 PHO1 분비를 이용한 분비된 단백질의 발현을 허용하는 pHIL-SI(Invitrogen)의 XhoI/EcoRI 부위 중으로 클로닝한다. 마찬가지로, 인간 플라스미노겐의 아미노산 93-470을 암호화하는 유전자 단편을 효모 피치아 파스토리스에서 a-인자 분비 시그널을 이용한 분비된 단백질을 발현시키는 pPIC9(Invitrogen)의 SnaBI/EcoRI 부위 중으로 클로닝한다. 이들 시스템에서 발현된 인간 안지오스타틴 단백질은 단백질 프로세싱, 단백질 접힘 및 글리코실화를 포함한 후해독 변형과 같이 이.콜라이에서 발현된 것들보다 많은 이점을 가질 것이다.
Sreekrishna, K. 등(1988)은 피.파스토리스에서 유전자 발현에 관해 기재하고 있다. 메틸로트로픽 효모 피치아 파스토리스에서 이종 단백질의 고수준 발현은 문헌[참조: J.Basic Microbiol. 29(4): 265-278, and Clare, J.J. et al. (1991) Production of epidermal growth factor in yeast: High-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies, Gene 105:205-212]에 기재되어있고, 둘 모두 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
실시예 26
트랜스제닉 동물과 식물에서 안지오스타틴 단백질의 발현
안지오스타틴 유전자 전사체를 발현시키는 소 또는 돼지과 같은 트랜스제닉 동물을 창조한다. 트랜스제닉 동물은 예를 들면 이들 동물의 우유에서 안지오스타틴 단백질을 발현한다. 추가로 안지오스타틴 유전자 전사체를 발현하는 식용 트랜스제닉 식물을 작제한다.
외래 DNA를 발현시키는 트랜스제닉 동물의 작제에 관해서는 본원에서 참조문헌으로 인용된 문헌[참조: Smith H. Phytochrome transgenics:functional, ecological and biotechnical applications, Semin. Cell. Biol. 1994 5(5):315-325]에 기재되어있다.
실시예 27
내피세포 증식 억제 안지오스타틴 단편의 특징규명
하기 예들은 개개 및 결합 안지오스타틴 단편의 활성을 특징규명한다. 데이터는 기능차이가 개개 크링글 구조, 및 강력한 항-내피세포 사이에 존재하고 있어, 항-맥관형성 활성은 이러한 안지오스타틴의 단백질 분획에서 얻어질 수 있다.
본원에서 사용되는, "안지오스타틴 단편"은 내피세포 증식 억제 활성을 지닌 안지오스타틴, 또는 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 안지오스타틴 단편은 맥관형성-매개 질환 또는 증상을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 안지오스타틴 단편은 종양 생장을 억제하거나 억압하는데 이용될 수 있다. 이러한 안지오스타틴 단편의 아미노산 서열은 본원에서 달리 지시한 바가 없으면 예를 들어 쥐 플라스미노겐(서열번호:1), 쥐 안지오스타틴(서열번호:2); 인간 안지오스타틴(서열번호:3), 붉은털 원숭이 안지오스타틴(서열번호:4), 돼지 안지오스타틴(서열번호:5), 및 소 안지오스타틴(서열번호:6) 부위 중에서 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 "크링글 1"은 본원에서 달리 지시가 없으면, 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 가지고, 크링글 1(예를 들면, 쥐 크링글 1(서열번호:7), 인간 크링글 1(서열번호:8), 붉은털 원숭이 크링글 1(서열번호:9), 돼지 크링글 1(서열번호:10), 및 소 크링글 1(서열번호:11), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함한 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1(서열번호:7)은 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 103-181에 상응하고, 서열번호:2의 쥐 안지오스타틴의 아미노산 부위 6 내지 84에 상응한다. 인간 크링글 1(서열번호:8), 붉은털 원숭이 크링글 1(서열번호:9), 돼지 크링글 1(서열번호:10), 및 소 크링글 1(서열번호:11)은 각각 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6의 안지오스타틴의 아미노산 부위 6 내지 84에 상응한다.
본원에서 사용된, "크링글 2"는 본원에서 달리 지시가 없으면, 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 2(예를 들면,쥐 크링글 2(서열번호:12), 인간 크링글 2(서열번호:13), 붉은털 원숭이 크링글 2(서열번호:14), 돼지 크링글 2(서열번호:15), 및 소 크링글 2(서열번호:16), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 2(서열번호;12)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 185-262에 상응하고, 서열번호:2의 쥐 안지오스타틴의 아미노산 부위 88-165에 상응한다. 인간 크링글 2(서열번호:13), 붉은털 원숭이 크링글 2(서열번호:14), 돼지 크링글 2(서열번호:15), 및 소 크링글 2(서열번호:16)는 각각 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6의 안지오스타틴의 아미노산 부위 88-165에 상응한다.
본원에서 사용된, "크링글 3"는 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 3(예를 들면,쥐 크링글 3(서열번호:17), 인간 크링글 3(서열번호:18), 붉은털 원숭이 크링글 3(서열번호:19), 돼지 크링글 3(서열번호:20), 및 소 크링글 3(서열번호:21), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 3(서열번호;17)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 275-3522에 상응하고, 서열번호:2의 쥐 안지오스타틴의 아미노산 부위 178-255에 상응한다. 인간 크링글 3(서열번호:18), 붉은털 원숭이 크링글 3(서열번호:19), 돼지 크링글 3(서열번호:20), 및 소 크링글 3(서열번호:21)은 각각 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6의 안지오스타틴의 아미노산 부위 178-255에 상응한다.
본원에서 사용된,"크링글 4"는 본원에서 달리 지시가 없으면, 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 4(예를 들면,쥐 크링글 4(서열번호:22) 및 인간 크링글 4(서열번호:23), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 4(서열번호;22)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 377-454에 상응한다.
본원에서 사용된, "크링글 2-3"은 본원에서 달리 지시가 없으면, 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 2-3(예를 들면,쥐 크링글 2-3(서열번호:24), 인간 크링글 2-3(서열번호:25), 붉은털 원숭이 크링글 2-3(서열번호:26), 돼지 크링글 2-3(서열번호:27), 및 소 크링글 2-3(서열번호:28), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 2-3(서열번호;24)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 185-352에 상응하고, 서열번호:2의 쥐 안지오스타틴의 아미노산 부위 88-255에 상응한다. 인간 크링글 2-3(서열번호:25), 붉은털 원숭이 크링글 2-3(서열번호:26), 돼지 크링글 2-3(서열번호:27), 및 소 크링글 2-3(서열번호:28)은 각각 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6의 안지오스타틴의 아미노산 부위 88-165에 상응한다.
본원에서 사용된, "크링글 1-3"은 본원에서 달리 지시가 없으면, 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 1-3(예를 들면,쥐 크링글 1-3(서열번호:29), 인간 크링글 1(서열번호:30), 붉은털 원숭이 크링글 1-3(서열번호:31), 돼지 크링글 1-3(서열번호:32), 및 소 크링글 1-3(서열번호:33), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1-3(서열번호;29)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 103-352에 상응하고, 서열번호:2의 쥐 안지오스타틴의 아미노산 부위 6-255에 상응한다. 인간 크링글 1-3(서열번호:30), 붉은털 원숭이 크링글 1-3(서열번호:31), 돼지 크링글 1-3(서열번호:32), 및 소 크링글 1-3(서열번호:33)은 각각 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6의 안지오스타틴의 아미노산 부위 6-255에 상응한다.
본원에서 사용된, "크링글 1-2"은 본원에서 달리 지시가 없으면, 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 1-2(예를 들면,쥐 크링글 1-2(서열번호:34), 인간 크링글 1-2(서열번호:35), 붉은털 원숭이 크링글 1-2(서열번호:36), 돼지 크링글 1-2(서열번호:37), 및 소 크링글 1-2(서열번호:38), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1-2(서열번호;34)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 103-262에 상응하고, 서열번호:2의 쥐 안지오스타틴의 아미노산 부위 6-165에 상응한다. 인간 크링글 1-2(서열번호:35), 붉은털 원숭이 크링글 1-2(서열번호:36), 돼지 크링글 1-2(서열번호:37), 및 소 크링글 1-2(서열번호:38)은 각각 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6의 안지오스타틴의 아미노산 부위 6-165에 상응한다.
본원에서 사용된, "크링글 1-4"은 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 1-4(예를 들면, 쥐 크링글 1-4(서열번호:39) 및 인간 크링글 1-4(서열번호:40), 이에 한정되지 않음)에 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1-4(서열번호;39)는 서열번호:1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 부위 103-454에 상응한다.
크링글 1, 크링글 2, 크링글 3, 크링글 4, 크링글 2-3, 크링글 1-3, 크링글 1-2 및 크링글 1-4 아미노산 서열은 앞서 동정된 특이적 크링글 서열에 각각 상동이다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 적어도 60%, 좀더 바람직하게는 적어도 70%, 좀더 바람직하게는 적어도 80%의 기재된 서열에 상동성 정도를 가진다. 앞서 실린 단편에 대해 각종 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 기타 변형을 행하여 안지오스타틴 단편의 내피세포 증식 억제활성 또는 항-맥관형성 활성을 개선 또는 변형할 수 있음이 이해된다. 이러한 변형은 청구범위의 범주 및 취지를 넘지 않는다. 예를 들어, 크링글간 디설파이드 브리지 형성에 의한 동종이량체화를 피하기 위해, 재조합 인간 크링글 2(서열번호:13)의 시스테인 잔기 C42와 재조합 크링글 3(서열번호:18)의 C42를 세린으로 돌연변이시킨다. 또한, 앞서 동정된 안지오스타틴 단편에서 각종 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 기타 변형을 행할 수 있는데, 이는 단편의 내피세포 증식억제 활성을 상당히 변화시키지 못하는 것으로 이해되며, 이도 청구항의 범위를 초과하지 않는다. "상당히 변형시키지 않는"이란 안지오스타틴 단편이 본원에 기재된 가장 밀접한 상동성 안지오스타틴 단편의 것과 비교해 적어도 60%, 좀더 바람직하게는 적어도 70%, 좀더 바람직하게는 적어도 80%의 내피세포 증식 억제 활성을 가짐을 의미한다.
유전자 작제 및 발현
PCR-기본법을 이용하여 인간 플라스미노겐(HPg)의 크링글 1(K1), 크링글 2(K2), 크링글 3(K3), 크링글 4(K4) 및 크링글 2-3(K2-3)을 암호화하는 cDNA 단편을 생성한다. 재조합 크링글 1(rK1), 크링글 2(rK2), 크링글 3(rK3), 크링글 4(rK4) 및 크링글 2-3(rK2-3)을 앞서 기재된 바와 같이 이.콜라이에서 발현시킨다[참조문헌: Menhart, N., Shel. L.C., Kelly, R.F., and Castellino, F.J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957; Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., and Rickli, E.E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem., in press; Rejante, M.R. Byeon, I.-J.L., and Llinas, M.(1991) Biochem. 30, 11081-11092]. 도 32b에 도시된 크링글간 디설파이드 브리지의 형성에 의한 동종이량체화를 피하기 위해, 서열번호 13과 18에서 보듯이, 각각 위치 4와 42에서, rK3의 시스테인 잔기 C169 및 rK2 및 C297을 세린으로 돌연변이시킨다[참조문헌: Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E.(1996) Biochem, in press]. rK3 및 rK2-3는 단백질 정제에 사용되는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 함유한다(도시되지 않음).
단백질 분해성 소화
앞서 기재된 바와같이 돼지 엘라스타제(Sigma)를 이용한 Lys-HPg(Abbott Labs)의 소화에 의해 단편 K1-3, K1-4 및 K4를 제조한다[참조문헌: Powell, J.R., and Castellino, F.J. (1983) Biochem. 22, 923-927]. 간단히 말하면, 1.5 mg의 엘라스타제를 50 mM Tris-HCl pH 8.0에서 200 mg의 인간 플라스미노겐을 이용하여 밤새 실온에서 교반해가며 배양한다. 디이소프로필 플루오로포스페이트 (DFP)(Sigma)를 첨가하여 최종 농도 1 mM에서 반응을 마친다. 혼합물을 실온에서 추가 30분간 흔들고 50 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 밤새 투석한다.
단백질 정제
재조합 K1을 pSTII 플라스미드 벡터를 이용하여 DH5α 이.콜라이 세균 세포에서 발현시킨다. 이 단백질을 라이신-세파로스 4B(Pharmacia) 및 Mono Q(BioRad)를 이용한 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제한다. rK2 및 rK3를 발현시키는 이.콜라이 세균 세포(균주 HB101)를 100 mg/㎖ 앰피실린과 25 mg/㎖ 카나마이신을 함유하는 2배의 YT배지에서 3℃에서 대략 0.8의 OD600으로 생장시킨다. IPTG(이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드)를 1 mM의 최종 농도가 되게 첨가하고 세포를 37℃에서 추가 4.5시간 동안 생장시켜 재조합 단백질을 생성한다. 세포를 원심분리로 수거하고 펠릿을 -80℃에 저장한다. 녹은 세포 용해물을 추출 완충액(0.1 M 인산나트륨 중 6 M의 구아니딘 하이드로클로라이드, pH 8.0)에서 재현탁시킨다. 현탁물을 30분간 15,000 x g으로 원심분리하고 b-머캅토에탄올을 10mM 최종 농도에서 상청액에 첨가한다. 상청액을 추출 완충액으로 미리평형이 유지된 Ni2+-NTA 아가로스 칼럼(1.5cm x 5cm)에 로딩한다. 칼럼을 각각 pH 8.0 및 pH 6.3에서 추출 완충액으로 연속 세척한다. 재조합 K2 및 K3를 pH 50에서 추출 완충액으로 용출한다.
180 nm에서의 흡광도가 0.005에 이를 때까지 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 평형을 이룬 라이신-세파로스 4B 칼럼(2.5 cm x 15 cm)을 이용하여 K1-3, K1-4, 및 K4의 단백질 분해 절개된 단편을 정제한다. 흡수된 크링글 단편을 pH 8.0에서 200 mM ε-아미노카프로산을 함유하는 Tris 완충액으로 용출한다. 용출된 샘플을 pH 5.0에서 20 mM Tris-HCl로 밤새 투석하고, 동일한 완충액으로 평형이 유지된 BioRad Mono-S 칼럼에 적용한다. K4, K1-3 및 K1-4의 단편을 20 mM 포스페이트/1 M KCl, pH 5.0의 0-20%, 20-50% 및 50-70% 단계-구배를 이용하여 용출한다. 대부분의 K1-3과 K1-4 단편을 SDS-PAGE로 측정시 0.5 M KCl로 칼럼에서 용출해낸다. 모든 분획을 20 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 밤새 투석한다. 투석 후, K1-3과 K1-4 단편을 20 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 미리 평형이 유지된 헤파린-세파로스 칼럼(5cm x 10 cm)(Sigma)를 이용하여 추가 정제한다. K1-3 단편을 350 mM KCl로 용출하고 K1-4를 유동-통과 분획으로부터 회수한다. 정제된 크링글 단편을 SDS-겔로 분석한데 이어 은-염색, 항-인간 K4 및 K1-3 폴리클로날 항체를 이용한 웨스턴 면역블로팅 분석, 및 아미노말단 서열분석한다.
시험관내 재-접힘
rK2, rK3 및 rK2-3의 재-접힘을 표준 프로토콜(Cleary, S., Mulkerrin, M.G., and Kelley, R.R. (1989) Biochem. 28, 1884-1891)에 따라 수행한다. 정제된 단백질을 pH 8.0에 맞추고 디티오트리에톨(DTT)을 5 mM 의 최종 농도로 첨가한다. 밤새 배양 후, 용액을 1.25 mM 환원된 글루타티온을 함유한 4 용적 50 mM Tris-HC, pH 8.0으로 희석한다. 배양 1시간 후, 산화된 글루타티온을 1.25 mM의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 6시간 동안 배양한다. 재생된 단백질을 초기에 H2O로 2일간 투석하고 추가 2시간 동안 50 mM 포스페이트-완충 염, pH 8.0으로 투석한다. 용액을 동일한 포스페이트-완충 염으로 평형이 유지된 라이신-바이오-겔 칼럼(2 cm x 13 cm)상에 로딩한다. 칼럼을 포스페이트-완충 염으로 세척하고 단백질을 50 mM 6-AHA (6-아미노헥사논산)을 함유한 포스페이트 완충액으로 용출한다. 역상 HPLC를 Aquapore Butyl 칼럼(2.1 x 100 mm, 와이드포어 30 nm, 7 mm, Applied Biosystems)상에서 수행하고 아세토니트릴 구배를 이용한 Hewlett Packard 액체 크로마토그래피를 사용한다.
환원 및 알킬화
크링글 단편의 환원 및 알킬화를 표준 프로토콜(Cao, Y., and Pettersson, R.F., (1990) Growth Factors 3, 1013)에 따라 수행한다. 300-500 ㎖ DME 배지에 정제된 단백질 대략 20-80 mg을 혈청 부재하에 0.5 M DTT 15 ㎖를 이용하여 실온에서 15분간 배양한다. 배양 후, 0.5 M 아이오도아세타미드 30 ㎖를 반응에 첨가한다. 단백질 용액을 4℃에서 밤새 초기에 DMEM 20 용적으로 투석한다. 용액을 4℃에서 추가 4시간 동안 새로운 DMEM 20 용적으로 추가 투석한다. 투석 후, 샘플을 SDS-겔상에서 분석하고 내피세포 증식에 대한 억제 활성을 평가한다.
내피세포 증식 분석
소 모세혈관 내피세포(BCE)를 앞서 기재된 바와 같이(Folkman, J., Haudenschild, C.C., and Zetter, B.R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 76, 5217-5121) 분리하고 10% 열-불활성된 송아지 혈청(BCS), 항체, 및 3 mg/㎖ 재조합 인간 bFGF(Scios Nova, Mountainview, CA)로 보충된 DMEM에서 유지한다. 6-웰 플레이트에서 자라는 BCE세포의 단층을 0.05% 트립신 용액에 분산시킨다. 세포를 10% BCS를 함유하는 DMEM으로 재현탁시킨다. 0.5 ㎖에서 대략 12,500 세포를 젤라틴화된 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃(10% CO2)에서 24시간 동안 배양한다. 배지를 5% BCS를 함유한 새로운 DMEM 500 ㎖로 교체하고 개개 또는 결합 크링글 단편 세가지 샘플을 각 웰에 첨가한다. 배양 30분 후, bFGF를 1 ng/㎖의 최종 농도에 첨가한다. 배양 72 시간 후, 세포를 트립신화하고, Hematall(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)을 재현탁한 다음 쿨터 카운터로 계수한다.
인간 플라스미노겐의 크링글 단편의 정제 및 특징규명
인간 플라스미노겐의 개개 크링글(K1, K2, K3 및 K4)과 크링글 2-3(K2-3)을 암호화하는 cDNA 단편을 PCR-기본법으로 증폭한다(도 28). PCR-증폭된 cDNA 단편을 세균 발현 벡터 중으로 클로닝한다. 이.콜라이에서 발현된 재조합 단백질을 시험관내에서 재접히게하고 HPLC-커플링된 크로마토그래피를 이용하여 ＞ 98% 상동성으로 정제한다(도 29). 환원 조건하에, 재조합 K2, K3 및 K4는 12-13 kDa의 분자량으로 이동하는데(도 29a, 레인 2-4), 이는 각 크링글 단편의 예상 분자량과 일치한다. 17 kDa의 고 분자량으로 이동하는 재조합 K1을 SDS-겔 전기영동으로 동정한다. K1-4 및 K1-3의 단편을 앞서 기재된 엘라스타제를 이용한 인간 Lys-플라스미노겐(Lys-HPg)의 단백질 분해 소화에 의해 얻는다(Powell, J.R., and Castellino, F.J. (1983) Biochem. 22, 923-927; Brockway, W.J., and Castellino, F.J. (1972) Arch. Biochem. Biophys). 각각 43 kDa과 35 kDa의 예상 분자량을 지닌 이들 두 단편(도 29b, 레인 1과 2)도 균질하게 정제한다. 정제된 단편의 N-말단 아미노산 서열 분석은 동일한 서열, -YLSE-를 낳은데 이어, K1-3과 K1-4의 경우에는 각각 서열번호:30과 서열번호:40이다. K4의 N-말단 서열은 대략 20% -VOQ-를 지닌 -VVQD를 생성한데 이어, 서열번호:23이 따르는데, 각각은 인간 안지오스타틴의 Valine176과 Valine177로 개시하는 예상 서열로부터 알 수 있다(서열번호:3).
개개 크링글의 항-내피세포 증식 활성
안지오스타틴의 개개 재조합 크링글 단편을 bFGF로 촉진된 소 모세혈관 내피(BCE) 세포 생장에 대한 억제 활성을 평가한다. 도 30a에서 알 수 있듯이, rK1은 투여량-의존식으로 BCE 세포 증식을 억제한다. 50% 억제(ED50)에 이르는데 필요한 rK1의 농도는 약 320 nM이다(표 4). 반면, rK4는 내피세포 증식에 대해 거의 또는 전혀 억제 효과를 나타내지 않는다. 재조합 K2와 rK3, 두 비-라이신 결합 크링글 단편도 내피세포 증식의 투여량-의존적 억제를 낳는다(도 30b). 그러나, rK2의 억제 효과는 rK1과 rK3보다 상당히 낮다(ED50=460)(EH 30 및 표 4). 세포의 원형화, 분리 및 단편화와 같은 아폽토틱 내피세포와 관련된 어떠한 세포독성 또는 뚜렷한 형태도 심지어 고농도의 이들 크링글 단편의 배양 후에 조차 검출될 수 없다. 이들 데이터는 안지오스타틴의 항-내피세포 생장 활성이 K1, K2 및 K3의 단편에 의해 공유되고, K4에 의해서는 낮아질 수 있음을 암시한다.
모세혈관 내피세포 증식에 대한 억제 활성
단편 ED50(nM)
크링글 1 320
크링글 2 -
크링글 3 460
크링글 4 -
크링글 2-3 -
크링글 1-3 70
크링글 1-4(안지오스타틴) 135
K1-3 및 K1-4 단편의 항-내피세포 증식 활성
결합된 크링글 단편의 항-내피세포 증식 효과를 평가하기 위해, 인간 K1-4, K1-3 및 rK2-3의 정제된 단백질 분해 단편을 BCE 세포에서 분석한다. 앞서 관찰과 일치하게(O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, J., Lane, W.S., Cao, Y., Sage, E.H., and Folkman, J. (1994) Cell 79, 315-328)도, 도 31에 도시된 바와같이, BCE 세포 증식은 안지오스타틴-형 단편 1-4(ED50=135 nM)에 의해 상당히 억제된다(표 4). K1-3 단편(ED50=135 nM)으로 항-내피세포 생장 활성의 증가가 얻어진다(표 4). 내피세포 증식의 억제는 투여량-의존적 방법으로 일어난다. 이들 결과는 안지오스타틴에서 K4의 제거가 항-내피세포 생장 활성을 야기할 수 있음을 나타낸다.
rK2 및 rK3에 의한 추가 억제
rK2-3의 단편은 rK2 단독의 것과 유사한 단지 약한 억제 활성을 나타낸다(도 31). 그러나, rK2와 rK3 둘 모두 내피세포 증식을 억제한다(도 30b).
이러한 발견은 K3의 억제효과가 K2-3의 구조에 숨어있음을 암시한다. 기존의 구조 연구는 크링글간 디설파이드 결합이 서열번호:3의 시스테인 91 및 시스테인 219에 상응하는, 인간 플라스미노겐의 K2(시스테인 169)와 K3(시스테인 297) 사이에 존재함을 보여준다(Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press). 도 32b 참조. 배합형태의 rK2와 rK3의 억제효과가 시험된다. 흥미롭게도, 부가적인 억제가 개별적인 rK2와 rK3 단편을 함께 BCE 세포에 첨가하였을 때 관찰되었다. 도 32a 참조. 이러한 결과는 K2-3의 최대 억제 효과를 달성하기 위하여 K2와 K3 간의 디설파이드간 브리지를 개방하는 것이 바람직함을 암시한다.
크링글 구조의 적당한 접힘은 안지오스타틴의 항-내피세포 활성에 요구된다.
크링글 구조의 접힘이 항-내피세포 증식 활성에 요구되는지를 연구하기 위하여, 천연 안지오스타틴을 DTT로 환원시키고 소 모세혈관 내피세포 상에서 분석한다. 환원 후, 안지오스타틴을 아이오도아세트아미드로 추가 알킬화하고 SDS 겔 전기영동으로 분석한다. 도 34a에 나타난 바와 같이, DTT-처리 단백질은 33 kDa의 분자량을 갖는 천연 안지오스타틴(레인 1)에 비하여 약 42 kDa의 분자량을 갖는 더 높은 위치(레인 2)에서 이동하였으며, 이는 안지오스타틴이 완전히 환원되었음을 암시한다. 안지오스타틴의 항-증식 활성은 환원 후에 대부분 없어진다(도 34b). 이러한 결과로부터, 본 발명자는 크링글내 디설파이드 결합을 통한 안지오스타틴의 정확한 접힘이 내피세포 증식 억제에 대한 강력한 효과 유지에 바람직한 것으로 결론내렸다.
인간 플라스미노겐의 크링글 도메인의 아미노산 배열은 도 35에 나타난 바와 같이, K1, K2, K3 및 K4가 동일한 전체적 구조와 주목할만한 서열 상동성(56-82% 동일)을 보임을 보여준다. 이들 구조 가운데서, 고 친화성 라이신 결합 크링글인 K1은 내피세포 증식의 가장 강력한 억제 단편이다. 흥미로운 점은, 중간-친화성 라이신 결합 단편인 K4가 억제활성이 결핍되어 있다. 이러한 데이터는 크링글 구조의 라이신 결합 부위가 억제 활성에 직접 관련되지 않을 수도 있음을 암시한다. 이들 크링글 구조의 아미노산 보전 및 기능적인 일탈은 진화 중에 DNA 복제에 의해 일어난 역할 돌연변이 연구를 위한 이상적인 시스템을 제공한다. 구조적으로 관련된 단백질 그룹에 의해 보이는 맥관형성의 조절에 대한 유사한 일탈 활성도 -C-X-C- 케모카인 및 프로락틴-생장 호르몬 계열에서 발견된다(Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A.J., Hunt, A.L., and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79.; Koch, A.E., Polverini, P.J., Kunkel, S.L., Harlow, L.A., DiPietro, L.A., Elner, V.M., Elner, S.J., and Strieter, R.M. (1992) Science 258, 1798-1801.; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077.; Strieter, R.M., Polverini, P.J., Arenberg, D.A., and Kunkel, S.L, (1995) Shock 4, 155-160.; Jackson, D., Volpert, O.V., Bouck, N., and Linzer, D.I.H. (1994) Science 266, 1581-1584).
추가의 서열 분석은 K4가 시스테인 22 및 78에 인접한 두개의 양으로 하전된 라이신 잔기를 함유하고 있음을 보여준다.1H 핵자기 공명(NMR) 분석은 4개의 라이신이 라이신 57과 함께 K4에서 양으로 하전된 도메인이 코어를 형성함을 보여주며(Llinas M, 비공개 데이터), 반면에 다른 크링글 구조는 이러한 양으로 하전된 도메인이 결핍되어 있다. 이러한 라이신 풍부 도메인이 인간 플라스미노겐의 크링글 4의 억제 활성 상실에 원인이 되는 지는 연구과제로 남아있다. K4는 이전에 다른 유형의 세포의 증식을 촉진하고 세포내 칼슘 방출을 증가시키는 것으로 보고되었다(Donate, L.E., Gherardi, E, Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Aporicio, S., and Blundell, T.L.(1994) Prot. Sci. 3, 2378-2394). 안지오스타틴으로부터의 K4의 제거가 내피세포에 대한 이의 억제활성을 강화시키는 사실은 이러한 구조가 K1-3의 억제효과의 일부를 방지할 수 있음을 암시한다.
안지오스타틴과 이의 관련 크링글 단편이 어떻게 내피세포 생장을 특이적으로 억제하는지의 메커니즘은 특징규명되지 않았다. 억제가 증식 내피세포에서 특이적으로 발현되는 수용체에 의해 매개되는지, 아니면 안지오스타틴이 내피세포에 의해 내부화되고 계속해서 세포 증식을 억제하는 지는 아직 분명하지 않다. 이와 달리, 안지오스타틴은 인테그린-매개 맥관형성을 차단하는, 인테그린 avb3와 같은 내피세포 접착 수용체와 상호작용할 수 있다(Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeld, M., Reisfeld R.A., Hu, T. Klier, G., and Cheresh, D.A. (1994) Cell 79, 1157-1164). 흥미롭게도, Friedlander 등(Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270, 1502)은 각막 또는 융모뇨막 모델(bFGF 및 종양 괴사 인자에 의해 유도)에서의 생체내 맥관형성이 avb3 인테그린 의존성임을 보고하였다. 그러나, VEGF, 형질전환 생장 인자 a, 또는 포볼 에스테르에 의해 자극된 맥관형성은 avb5 의존성이었다. 개별 인테그린에 대한 항체는 이들 경로 중 하나를 특이적으로 차단하였고, 두 인테그린의 사이클릭 단백질 길항제는 각각의 사이토킨에 의해 유도된 맥관형성을 차단하였다(Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270, 1502). bFGF- 및 VEGF- 유도된 맥관형성은 안지오스타틴에 의해 억제되기 때문에, 이는 이들 인테그린-매개 맥관형성에 대한 공통 경로를 차단할 수 있다.
내생성 맥관형성 억제제의 증가하는 수가 최근 몇 십년에 동정되었다(Folkman, J. (1995) N. Engl.m, J. Med. 333, 1757-1763). 9개의 특징규명된 내피세포 억제제 중, 몇몇 억제제는 단백질 분해성 단편이다. 예를 들면, 인간 프로락틴의 16 kDa N-말단 단편은 내피세포 증식을 억제하고 생체내 맥관형성을 차단한다(Clapp, C., Martial, J.A., Guzman, R.C., Rentierdelrue, F., and Weiner, R.I. (1993) Endorinology 133, 1292-1299). 최근의 논문에서, D'Angelo 등은 항맥관형성성 16 kDa N-말단 단편이 모세혈관 내피세포에서 VEGF 및 bFGF에 의한 마이토겐-활성화 단백질 키나제의 활성화를 억제함을 보고하였다(D'Angelo, G., Struman, I., Martial, J., and Weiner, R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6374-6378). 안지오스타틴과 유사하게, 프로락틴의 온전한 모분자는 내피세포 증식을 억제하지 않고 맥관형성 억제제도 아니다. 혈소판 인자 4(PF-4)는 고농도에서 맥관형성을 억제한다(Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A.J., Hunt, A.L., and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077). 그러나, N-말단이 잘린 단백질 분해 절단된 PF-4 단편은 온전한 PF-4 분자보다 이의 항-증식활성에 있어 30배 내지 50배 증가를 보인다(Gupta, S.K., Hassel, T., and Singh, J.P. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7799-7803). 피브로넥틴, 쥐의 표피 생장인자, 및 트롬보스폰딘의 소형 단백질 단편은 내피세포 생장을 특이적으로 억제하는 것으로 나타났다(Homandberg, G.A., Williams, J.E., Grant, D., Schumacher, B., and Eisenstein, R. (1985) Am. J. Pathol. 120, 327-332; Nelson, J., Allen, W.E., Scott, W.N., Bailie, J.R., Walker, B., McFerran, N.V., and Wilson, D.J. (1995) Cancer Res. 55, 3722-3776; Tolsma, S.S., Volpert, O.V., Good, D.J., Frazer, W.A., PolVerini, P.J., and Bouck, N. (1993) J. Cell Biol. 122, 497-511). 대형 단백질의 단백질 분해 프로세싱은 최초 분자의 형태적 구조를 변화시키거나 항맥관형성성인 새로운 에피토프를 노출시킬 수 있다. 따라서, 프로테아제는 맥관형성의 조절에 중요한 역할을 할 수 있다. 현재까지는, 생체내 이들 프로테아제 활성의 조절에 대해 거의 알려진 것이 없다.
데이터는 또한, 안지오스타틴내 크링글 구조의 디설파이드 결합 매개 접힘이 내피세포 생장에 대한 이의 억제 활성 유지에 바람직함을 보여준다. 플라스미노겐에서의 것들과 유사한 크링글 구조가 다른 다양한 단백질에서도 발견된다. 예를 들면, 아포리포단백질(a)은 플라스미노겐 크링글 4의 37개 만큼의 반복부를 갖는다(McLean, J.W., Tomlinson, J.E., Kuang, W.-J., Eaton, D.L., Chen, E.Y., Fless, G.M., Scanu, A.M., and Lawn, R.M. (1987) Nature 330, 132-137). 프로트롬빈의 아미노 말단부위는 또한 플라스미노겐의 것들과 상동성인 두개의 크링글을 함유한다(Walz, D.A., Hewett-Emmett, D., and Seegers, W.H. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1969-1973). 유로키나제는 플라스미노겐과 광범위한 상동성을 공유하는 크링글 구조를 보유하는 것으로 나타났다(Gunzler, W.A., J., S.G., Otting, F., Kim, S.-M. A., Frankus, E., and Flohe, L. (1982) Hoppe-Seyler's A. Physiol. Chem. 363, 1155-1165). 또한, 계면활성제 단백질 B 및 간세포 생장 인자(HGF) 또한 크링글 구조를 운반한다(Johansson, J., Curstedt, T.,and Jornvall., H. (1991) Biochem. 30, 6917-6921; Lukker, N.A.,Presta, L.G. and Godowski, P.J. (1994) Prot. Engin. 7,895-903).
실시예 28
안지오스타틴 단편에 의한 전이 및 내피세포 증식의 억제
하기 실시예는 부수적인 안지오스타틴 단편의 활성을 특징규명한다. 데이터는 강력한 항-내피세포 및 종양 억제 활성이 이러한 안지오스타틴의 단백질 단편으로부터 수득될 수 있음을 암시한다.
본원에서 사용되는 "크링글 1-4BKLS"는 내피세포 억제 활성을 지니고, 크링글 1-4BKLS와 상동성인 서열을 갖는 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미하며, 예로는 쥐의 크링글 1-4BKLS(서열번호:41), 및 인간 크링글 1-4BKLS(서열번호:42)(사용되는 맥락에서 달리 언급하지 않는 한)의 것을 들 수 있으며 이에 한정되지는 않는다. 쥐의 크링글 1-4BKLS(서열번호:41)는 서열번호:1의 쥐의 플라스미노겐의 아미노산 위치 93 내지 470에 상응한다. 이러한 예는 "안지오스타틴 단편"이 플라스미노겐 단편일 수 있고 예를 들면, 서열번호:3으로 제시한 안지오스타틴보다 큰 아미노산 서열을 포함하며, 여전히 치료적인 내피세포 증식 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지님을 증명한다.
크링글 1-4BLKS 아미노산 서열은 전술한 특이적 크링글 1-4BLKS 서열과 상동성이다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 좀더 바람직하게는 적어도 80% 정도의 전술한 서열과의 상동성을 갖는다. 상기 수록 단편에 대한 다양한 아미노산 치환, 결실 및 기타 변형이 단편의 내피세포 억제 활성을 향상시키거나 변형시키기 위해 행해질 수 있음을 숙지하여야 한다. 이러한 변형은 청구범위의 범위와 취지를 벗어나지 않는다. 더욱이, 다양한 사일런트 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실이 전술한 크링글 단편에 행해질 수 있으며, 이는 단편의 내피세포 억제 활성을 심각하게 변화시키지는 않으며, 따라서 청구범위의 범주를 벗어나지는 않는다.
피치아 파스토리스에서 안지오스타틴의 클로닝
안지오스타틴을 암호화하는 서열은 Vent 폴리머라제(New England Biolabs)와 각각 링커 Xhol 및 EcoRl을 함유하는 프라이머 #154 (5′-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG-3′)(서열번호:43) 및 #151 (5′-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG-3′)(서열번호:44)를 사용하는 PCR에 의해 및 주형으로서 플라스미드 pTrcHis/HAs를 사용하여 증폭시킨다. 이러한 플라스미드는 피. 파스토리스 천연 분비 시그널 PHO 1을 사용하여 pHIL-S1 발현벡터의 Xho I/Eco R1 부위에 클로닝하기 위한 인간 플라스미노겐(서열번호:42)의 아미노산 93 내지 470을 암호화하는 서열을 함유한다. 이러한 동일 서열을, 알파-인자 분비 시그널을 갖는 발현 벡터 pP1C9의 Sna B1/Eco R1 부위에 클로닝하기 위해, 각각 링커 Sna B1 및 Eco R1을 함유하는 프라이머 #156(5′-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-3′)(서열번호:45) 및 #151을 사용하는 동일 방법으로 증폭시킨다. 증폭산물을 겔 정제하고, 링커를 적당한 효소로 분해한 다음 다시 유전자-클린(Bio 101)을 사용하여 정제한다. 이들 유전자 단편을 적당한 벡터 중으로 연결시킨다. 생성되는 클론을 선별하고 클론의 플라스미드 제제를 수득하며, 피. 파스토리스 숙주 균주 GS115 중으로 형질전환시킬 때 선형화시켜 His+MutS및 His+Mut+재조합 균주를 생성시킨다. 통합여부는 PCR로 확인한다.
두 His+및 His+Mut+재조합체 모두 메탄올로 유도되며 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔을 사용하여 고 발현에 대해 스크리닝하고 크링글 1 내지 3에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 면역블로팅한다(Castellino, Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). 이로부터, GS115 형질전환된 피. 파스토리스 클론 pHIL-S1/HAs18을 선별하고 His+MutS로서 표현형이 특징규명되었다.
PHIL-S1/HAs18의 발현
pHIL-S1/HAs18로부터의 발현은 His+MutS클론에 대해 전형적이다. 배플링 진탕 플라스크에서 유도시, OD600세포 1L를 1L 배플링 플라스크 중, 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산칼륨 pH 6.0, 황산암모늄이 있는 1.34% 효모 질소 염기, 0.00004% 비오틴 및 0.5% 메탄올을 함유하는 완충된 메탄올 복합 배지 150 ml에서 배양한다. 세포를 30℃에서 250 rpm으로 일정하게 진탕시킨다. 무수 메탄올을 최종 0.5%가 되게 첨가함으로써 24 시간 간격으로 메탄올을 뱃치 공급한다. 120 시간 후에 세포를 5,000 rpm으로 10분간 회전시키고 상청액을 사용시까지 -70℃에서 저장한다.
라이신-세파로스 크로마토그래피에 의한 피. 파스토리스 발효 브로스로부터의 안지오스타틴의 정제
모든 절차는 4℃에서 수행된다. 안지오스타틴을 함유하는 전형적으로 200 ml의 조 발효 브로스를 14,000 x g로 원심분리하여 청징화하고 Centriprep 30(amicon) 30 kDa 분자량 컷오프 막에 의해 최초 용적의 대략 1/4로 농축한다. 50 mM 포스페이트 완충액 pH 7.5의 1 용적을 농축 샘플에 가하고 이를 다시 Centriprep으로 농축시켜 최초 샘플 용적의 1/4로 농축한다. 다시 샘플을 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5로 용적:용적 희석한다. 60 g 라이신-세파로스 4B(Pharmacia)를 500 ml 빙냉 50 mM 포스페이트 완충액, pH 7.5에 재현탁시킨 다음 48 x 100 mm 칼럼(약 180 ml 패킹 용적)의 패킹에 사용한다. 칼럼을 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5의 7.5 칼럼 용적(CV)으로 1.5 ml/분의 유속으로 밤새 세척한다. 샘플을 1.5 ml/분의 유속으로 칼럼에 펌핑하고 칼럼을 3 ml/분의 속도에서 50 mM 인산나트륨, pH 7.5의 1.5 CV로 세척한다. 이어서, 칼럼을 1.5 CV 포스페이트-완충 생리식염수, pH 7.4로 세척한다: 이어서 안지오스타틴을 3 ml/분의 유속으로 0.2 M ε-아미노-n-카프로산으로 희석한다. 유의성 있는 흡광도를 지닌 분획을 모아서 탈이온수에 대해 24-48 시간 투석하고 동결건조한다. 100 mg 전체 단백질 로드로부터의 전형적인 회수량은 10 mg 안지오스타틴이다. 칼럼을 50 mM 인산나트륨/1 M NaCl, pH 7.5의 5 칼럼 용적을 사용하여 재생시킨다.
소 모세혈관 내피세포 증식 분석
소 모세혈관 내피세포를 전술한 바와 같이 수득한다. 세포를 75 cm2세포-배양 플라스크 중, 재조합 인간 bFGF(Scios Nova, Mountainview, CA) 3 mg/ml를 함유하고, 10% 가열-불활성화 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 및 0.25 mg/ml 펑지존(BioWhittaker)으로 보충한 DMEM에 유지시킨다. 분석을 전술한 바와 같이 수행한다.
동물 연구
6주 내지 8주된 C57BI/6J 마우스 수컷(Jackson Laboratories)에 쥐 루이스 폐 암종-저 전이성(LLC-LM) 계통(1 x 106세포/주사)을 접종한다. 대략 이식 14일 후에, 1차 종양이 1.5 cm3에 도달하였을 때, 동물을 메톡시플루란으로 마취시키고 1차 종양을 수술로 절개한다. 절개 부위를 간단한 단속적인 봉합으로 봉한다. 이 그룹에서의 동물 절반은 수술 직후 재조합 또는 플라스미노겐 유도된 안지오스타틴의 로딩 투여량(3 mg/kg, 피하 경로)을 피하 투여한 다음, 14일간 하루에 1.5 mg/kg 접종한다. 마우스의 대조군은 수술 후 14일간 동량의 PBS를 매일 투여한다. 모든 마우스를 1차 종양 제거 14일 후 참수시키고(종양 이식 28일 후), 폐를 적출하여 칭량한 다음, 표면 전이를 입체현미경으로 계수한다.
재조합 인간 안지오스타틴 단편의 특징
총 26개의 시스테인을 함유하는 인간 플라스미노겐의 크링글 1 내지 4를 포함하는 인간 안지오스타틴을 암호화하는 유전자 단편을 메틸로트로픽 효모인 피치아 파스토리스에서 발현시킨다. 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴은 라이신 세파로스와 결합하고 ε-아미노 카프로산에 의해 특이적으로 용출될 수 있다. 이는 플라스미노겐의 크링글 1 및 4의 물리적 성질인 완전 기능성의 엡실론 아미노 카프로산-결합 크링글(Sottrup-Jensen, L. et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3 (1978) Ravens Press, N.Y. p. 191)이 피. 파스토리스에 의해 발현되고 분비될 수 있으며 재접힘을 요하지 않는 기술에 의해 정제될 수 있음을 증명한다(도 36a 및 b). 피. 파스토리스로부터 발현된 안지오스타틴 및 플라스미노겐의 엘라스타제 절단에 의해 정제된 안지오스타틴은 크링글 1 내지 3에 대한 형태 의존성 모노클로날 항체에 의해 인식된다(Castellino Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN)(도 36b). 이러한 항체는 플라스미노겐 또는 안지오스타틴의 환원 형태 인식에는 실패한다.
피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴은 변성되고 비환원된 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔 상에서 49 kDa 및 51.5 kDa에서 이동하는 이중체으로 나타난다. 피. 파스토리스 발현된 단백질을 고-만노스형의 N-결합 글리코실화가 다수이고 O-결합 글리코실화가 약간 있게 후-해독 변형시킨다. 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴에서의 글리코실화 가능성을 평가하기 위하여, 본 발명자는 재조합 안지오스타틴을 고 만노스 구조에 특이적인 엔도글리코시다제 H로 분해하면, 51.5 kDa 밴드가 49 kDa에서의 밴드와 동일하게 이동된다(도 37a 및 b). 시알산 잔기 제거를 위한 선행 뉴라미니다제 처리에 의한 O-글리카나제 분해는 이중체의 이동 패턴을 변화시키지 않는다(데이터 나타내지 않았음). 이러한 결과는 피. 파스토리스가 안지오스타틴을 두 형태로 발현하였음을 시사한다: 구조식
(Man)2-150--MaN
Man--GlcNAc---GlcNAc-Asn-
(Man)a-2-Man
의 N-결합 복합 쇄를 갖는 것(1) 및 글리코실화가 없는 것(2).
시험관내 소 모세혈관 내피세포의 억제
재조합 발현된 안지오스타틴이 항-맥관형성 활성에 대한 잠재력을 가지고 있는지를 측정하기 위하여, BCE를 bFGF의 존재하에 배양하여 정제된 재조합 안지오스타틴의 첨가가 BCE의 증식을 억제하는지 측정한다. 정제된 피. 파스토리스-발현된 안지오스타틴은 시험관내 소 내피세포의 bFGF-추진된 증식(도 38b)을 투여량 의존 방식으로(도 38c) 억제하였다. 재조합 안지오스타틴 1 ㎍/ml에서 억제율은 80%였다. 50% 억제는 인간 플라스미노겐의 엘라스타제 절단으로부터 유도된 안지오스타틴으로 수득한 것과 동등하였다.
생체내 전이 억제
안지오스타틴이 최초로 확인되었던 이식가능한 쥐 LLC(LM)을 사용한다. 선천성 C57B1/6J 마우스에 피하 이식하였을 때, 이러한 종양은 신속히 생장하여, 14일 내에 1.5 cm3이상의 종양을 생성한다. 1차 종양 절제 뒤에, 폐에서의 미세 전이는 대수적으로 생장하여, 폐의 표면을 완전히 덮게된다. 이러한 전이는 1차 종양 절제 후 14일까지 고도로 혈관이 형성된다. 1차 종양이 방치되면, 미세전이는 잠복상태로 남게 되고 거시적으로는 눈에 띠지 않는다. 재조합 안지오스타틴을 1차 종양 절제 뒤에 마우스에 전신 투여하여 전이 생장의 억제를 시험한다. 30 ㎍/마우스/일로 전신 투여된 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴은 표면 전이(도 39a) 및 전체 폐 중량(도 39b)의 점수매김에 의해 정량되는 바와 같이 전이의 생장을 억제하였다. 1차 종양이 절제되고 재조합 안지오스타틴 또는 플라스미노겐의 엘라스타제 절단으로 수득한 안지오스타틴의 1일 투여량을 투여한 마우스의 폐 중량은 정상 마우스의 것에 필적하였다(190 내지 200 mg). 1차 종양이 절제되고 이어서 재조합 안지오스타틴 1일 투여량을 처리한 마우스의 폐는 혈관 신생된 미세전이수가 최소인 핑크색이었다(도 40). 이와는 대조적으로, 1차 종양 절제 후 식염수로 처리한 마우스는 신생 혈관화된 전이로 덮힌 폐를 지녔다(도 41). 또한 주목할 만한 점은 이러한 연구에서 사용된 투여량과 용법에서 피. 파스토리스에 의해 야기된 전신 또는 국소적인 독성의 부재였다. 모든 처리 마우스에서 염증이나 출혈의 증거는 존재하지 않았다.
피. 파스토리스에 의해 발현된 안지오스타틴 단백질은 천연 단백질의 두 가지 중요한 물리적 특성을 보유한다: (1)인간 플라스미노겐의 크링글 1 내지 3에 대해 생긴 형태 의존성 모노클로날 항체에 의해 인식된다 및 (2)라이신과 결합한다(도 36a 및 b). 이러한 성질은 재조합 안지오스타틴 단백질이 천연 분자를 모방하는 형태로 발현되었음을 시사한다. 피. 파스토리스 발현된 안지오스타틴 단백질은 시험관내에서 bFGF에 의해 자극된 소의 모세혈관 내피세포의 증식을 억제한다(도 38). 전신 투여되었을 때, 재조합 안지오스타틴은 이와 다른 치명적인 전이성 루이스 폐 암종을 억제 상태로 유지시켰다(도 39a 및 b와 도 40).
예비 데이터는 마우스로부터 새로 절제된 루이스 폐 종양에서 또는 시험관내 배양에서 4회 계대접종 후 LLC 세포에서 안지오스타틴에 대한 검출가능한 전사의 부재를 보여준다. 간에 의해 생성된 플라스미노겐은 1.6±0.2 μM의 안정한 혈장 농도에서 순환상태로 유지된다. LLC-LM 종양이 안지오스타틴을 생성하기 위하여, 결합되거나 순환 중인 플라스미노겐을 절단하는 효소를 생성하는 것이 가능하다. 이와 달리, 종양 부위로 이끌린 염증 세포는 이러한 효소를 생성할 수 있다.
피. 파스토리스 및 천연 인간 플라스미노겐 모두 글리코실화 형태 및 비-글리코실화 형태로 생성됨이 흥미를 끈다. 인간 플라스미노겐의 경우에, 단일 유전자에 대한 단일 전사로 두 형태 모두를 생성할 수 있다. 인간 플라스미노겐의 차등적인 후-해독 변형의 분자적 메커니즘, 및 TPA에서 보이는 것은 알려져있지 않다.
안지오스타틴은 피.파스토리스에 의해 고도로 발현된다. 상청액은 단백질 100 mg/L를 함유한다. 따라서, 임상적인 시도에 요구되는 양은 당업자에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 생산하고 정제하기에 간단하여야 한다. 이러한 발현 시스템의 개발, 및 전이에 대한 정제된 재조합 안지오스타틴의 시험관내 및 생체내 활성의 증거는 암 환자나 맥관형성-매개 질환을 앓고있는 다른 환자에서 종양 생장을 억제하고 수명을 연장하기 위한 이들 단편의 역량 평가를 위한 토대를 제공한다.
실시예 29
크링글 1-5 안지오스타틴 단백질 단편
하기 실시예는 크링글 1-5 안지오스타틴 단백질 단편의 생산을 위한 하나의 방법을 설명한다.
본원에서 사용되는 "크링글 1-5"란 용어는 내피세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지니고, 크링글 1-5와 상동성인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미하며, 예를 들면, 서열번호 1의 쥐 플라스미노겐의 아미노산 위치 102 내지 560에 상응하는 쥐의 크링글 1-5의 것을 들 수 있으며 이에 한정되지는 않는다. 크링글 5 자체는 아미노산 위치 481-560에서 서열번호:1의 플라스미노겐의 쥐의 서열에 나타난다. 플라스미노겐의 아미노산 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 Forsgren 등의 "Molecular cloning and characterization of a full-length cDNA clone for human plasminogen," FEBS 213:2, pp.254-260(1987)에 제공되어 있으며 이는 본원에서 참조로 인용된다.
크링글 1-5 아미노산 서열은 각각 전술한 특이적 크링글 1-5 서열과 상동성이다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 및 좀더 바람직하게는 적어도 80%의 기재 서열과의 상동성을 지닌다. 전술한 단편에 대한 다양한 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 기타 변형이 안지오스타틴 단편의 내피세포 증식 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 향상시키거나 변형시키기 위해 행해질 수 있다. 이러한 변형은 청구범위의 범주와 취지를 벗어나지 않는다. 예를 들면, 크링글간 디설파이드 브리지의 형성에 의한 동종 이량체화를 피하기 위하여, 시스테인 잔기는 세린으로 돌연변이될 수 있다. 더욱이, 다양한 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 기타 변형이 전술한 안지오스타틴 단편에서 행해질 수 있으며, 이는 단편의 내피세포 증식 억제 활성을 유의할 만하게 변화시키지 않으며, 따라서 청구범위를 벗어나지는 않는다. "유의할 만하게 변화시키지 않는"이란 용어는 안지오스타틴 단편이 본원에서 기재한 가장 밀접한 상동성 안지오스타틴 단편의 것과 비교하여 내피세포 증식 억제 활성의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%를 가짐을 의미한다.
크링글 1-5 안지오스타틴 단백질 단편은 하기 방법에 따라 생산될 수 있다:
1)정제된 인간 플라스미노겐(Plg)을 효소 플라스민을 사용하여 Lys Plg로 전환시킨다.
2)Lys Plg를 TPA 또는 유로키나제로 분해한다. 이렇게 함으로써 중쇄(A) 및 경쇄(B)가 생성될 것이지만, 여전히 2개의 디설파이드 결합에 의해 결합된다.
3)이들 결합은 베타 머캅토에탄올 같은 통상의 환원제에 의해 특이적으로 환원시켜 분리된 중쇄 A와 경쇄 B를 생성시킬 수 있다.
4)이어서, 시스테인을 차단하여 A쇄와 B쇄를 S-카복시메틸 유도체로 만듦으로써 이들이 다시 결합을 형성하지 않도록 한다(Robbins, KC, Bernabe P. Arzadon L, Summaria L. J. Biol. Chem. 247(21):6757-6762(1972). "The primary structure of human plasminogen. I. The NH2-terminal sequences of human plasminogen and the s-carboxymethyl heavy(A) and light(B) chain derivatives of plasmin.").
5)단계 4의 산물을 라이신-세파로스 칼럼 상에 흐르게 하여 나머지로부터 K1-5를 정제한다.
QED
크링글 1-5 안지오스타틴 단백질 단편을 사용하여 시험관내 및 생체내에서 내피세포 증식 및 맥관형성을 억제한다. 특히, 크링글 1-5 안지오스타틴 단백질 단편은 암적인 종양에서의 맥관형성 억제에 사용될 수 있다.
전술한 설명은 본 발명의 바람직한 양태에 관한 것일 뿐이며, 첨부된 특허청구 범위에 기술된 바와 같이 본 발명의 취지와 범위에서 일탈함이 없이 다양한 수정 또는 변형이 가해질 수 있다.
서열목록
(1)일반정보:
(i)출원인:포크먼, 엠. 쥬더
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(ii)발명의 명칭:안지오스타틴 단편 및 사용방법
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Claims (15)

  1. 내피세포에 플라스미노겐 분자의 크링글 1-5 영역과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 증식 억제량의 플라스미노겐 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 내피세포 증식 억제방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 쥐 플라스미노겐, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐 또는 소 플라스미노겐으로부터 유도되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 대략 플라스미노겐 분자의 아미노산 98 내지 560에 상응하는 방법.
  4. 포유동물에 플라스미노겐 분자의 크링글 1-5 영역과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 치료 유효량의 플라스미노겐 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 맥관형성-매개 질환이 있는 포유동물의 치료방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 쥐 플라스미노겐, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐 또는 소 플라스미노겐으로부터 유도되는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 대략 플라스미노겐 분자의 아미노산 98 내지 560에 상응하는 방법.
  7. 약학적으로 허용되는 부형제 및 플라스미노겐 분자의 크링글 1-5 영역과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐 단편을 포함하는, 내피세포 증식 억제용 치료 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 쥐 플라스미노겐, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐 또는 소 플라스미노겐으로부터 유도되는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 대략 플라스미노겐 분자의 아미노산 98 내지 560에 상응하는 조성물.
  10. 플라스미노겐 분자의 크링글 1-5 영역과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐 단편을 암호화하는 분리된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 쥐 플라스미노겐, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐 또는 소 플라스미노겐으로부터 유도되는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 플라스미노겐 단편이 대략 플라스미노겐 분자의 아미노산 98 내지 560에 상응하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 플라스미노겐 단편을 암호화하는 DNA 서열과 결합된 벡터를 추가로 포함하고, 벡터가 세포에 존재시 플라스미노겐 단편을 발현할 수 있는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 벡터를 함유하는 세포를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 내피세포 증식 억제 활성을 지니고 플라스미노겐 분자의 크링글 1-5 영역과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐 단편의 발현방법에 있어서, 벡터를 포유동물 세포에 형질감염시키는 단계를 포함하고, 벡터가 플라스미노겐 단편을 암호화하는 DNA 서열을 함유하며, 벡터가 세포에 존재시 안지오스타틴 단편을 발현할 수 있는 방법.
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