CN100355458C

CN100355458C - 人增殖抑制基因－腺病毒表达载体的应用

Info

Publication number: CN100355458C
Application number: CNB2005100552173A
Authority: CN
Inventors: 邱晓彦; 陈光慧; 李志新; 马大龙; 汤健; 毋丽娜
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2005-03-16
Filing date: 2005-03-16
Publication date: 2007-12-19
Anticipated expiration: 2025-03-16
Also published as: CN1834242A

Abstract

本发明公开了一种人的增殖抑制基因(human hyperplasia suppress gene，hHSG)腺病毒表达载体，它能够有效诱导多种肿瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡活性，并且该HSG腺病毒表达载体对放、化疗药物有很好的协同作用，在多种肿瘤基因治疗中具有重要的应用价值。

Description

人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用

技术领域

本发明涉及一种人的增殖抑制基因(human hyperplasia suppress gene，hHSG)腺病毒表达载体，尤其涉及该人HSG腺病毒表达载体在诱导多种肿瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡活性上的用途，并且本发明还涉及该HSG腺病毒表达载体对放、化疗药物及热疗的协同作用。

背景技术

恶性肿瘤已经成为人类死亡的第一、二位杀手，恶性肿瘤的发病率明显上升。攻克肿瘤是全人类亟待解决的重大课题之一。近年来肿瘤的生物治疗(包括免疫治疗和基因治疗)、特别是基因治疗的应用研究已成为生命科学研究的热点。基因治疗由于能针对肿瘤组织内特有的基因变异情况进行修复或促进肿瘤细胞死亡，具有广阔的应用前景；特别是随着一些高效而具有组织/细胞选择性的给药载体的成功构建和一些新的更具有杀伤力的目的基因的发现，使基因治疗将有可能在21世纪成为常规而有效的治疗手段。

一、针对抑癌基因的基因治疗

抑癌基因(tumor suppressor gene)，又称抗癌基因(antioncogene)，根据其功能，该基因又可分为控制细胞增生的看门基因(gatekeeper gene)和维持基因完整的看管基因(caretaker gene)。

研究表明，几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与肿瘤的生长有着密切的关系。因此，将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的抑癌基因作为治疗恶性肿瘤的策略，必将成为肿瘤基因治疗中的一种重要的治疗模式。

p53基因是1979年Lane和Grawford在SV40大T抗原基因转染的细胞中发现的(Nature 1979，278(5701)：261-263)，是目前研究最广泛和深入抑癌基因。其正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变。迄今已发现的10000种人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393个氨基酸就有280个以上发生了突变。由于这种点突变，直接的后果是导致氨基酸的改变，最终产生没有活性的p53蛋白，失去抑癌作用。

鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高，以正常p53基因治疗肿瘤就自然成了研究的热点。大量的体内外试验已证实，引入p53基因确实可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导其出现凋亡。如2002年Kunihisa等(Cancer Ther：2002，1：247-252)利用电穿孔的方法，把野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞PC-3中，发现肿瘤细胞形态改变，细胞生长速度降低，裸鼠致瘤性消失，进一步研究发现肿瘤抑制是因为其凋亡增加所致。此后，研究者又相继将p53基因导入肝癌、口腔癌、肺癌、头颈部肿瘤以及乳腺癌等肿瘤细胞，同样发现类似的结果。但不同的细胞类型，p53基因的抑制作用各不相同。Ramesh等(Mol Ther：2001，3(3)：337-350)用脂质体作载体将p53导入肺的原位癌和转移癌中，Hagivara等(Nippon Rinsho；2001，59(1)：81-84)将载有野生型p53的腺病毒载体直接进行瘤体内注射均可使动物的生存期明显延长。

除了直接的抑瘤作用外，正常p53基因的导入还可以诱导癌细胞对化疗药物及放疗的敏感性，加快肿瘤细胞的凋亡。如Spitz等(Clin Cancer Res.1996，2：1665-1671)研究了腺病毒介导的p53基因与放射线对小鼠皮下异体移植SW260结直肠癌的作用，发现应用这两种治疗措施小鼠肿瘤生长均有明显抑制。一般来讲，小鼠再生的肿瘤仅需2天就可长至1000mm3，若受到5Gy的放射治疗需要15天，如果再施以p53基因治疗，则需要37天。说明p53基因确可提高小鼠对放射线的敏感性。Roth等在H1299(p53缺陷)肺癌，Nielsen等在头颈部肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中均得出了同样的结论(Clin Cancer res；1998，4：835-846)，在联合治疗中，肿瘤的体积比单独使用其中任一方法均可减少60％-90％。目前，P53已经作为有效的肿瘤基因治疗药物被批准应用于临床。

二、关于HSG

HSG是我们课题组在前期工作中利用mRNA差异显示技术从正常血压和高血压大鼠的血管平滑肌细胞中发现的新基因(中华医学杂志；1997，77：823-828)。根据大鼠cDNA序列，利用PCR和RACE反应，我们又克隆了人的HSG，其长度为45500bp，编码757个氨基酸，定位于人的1号染色体短臂36.3位置上，此区域为许多肿瘤的突变高发区，GenBank登录号为：U43734。已证明该基因与高血压发病的相关，该基因能明显抑制血管内膜增厚，防止管腔狭窄的发生。

三、表达载体

目前基因治疗中常用的表达载体主要分为真核表达质粒和病毒表达载体，虽然二者都能有效地使外源基因在细胞中表达，但由于真核表达质粒在体内难以定向导入靶细胞，故在基因治疗应用上受到限制。而病毒表达载体是利用宿主细胞表面天然存在的受体将外源基因定向导入靶细胞，能转导不分裂的细胞，甚至能稳定整合到宿主染色体上，如反转录病毒和腺相关病毒(AVV)可以整合到宿主基因组，其转导率几乎可达100％，并可获得持续的表达。但是反转录病毒与其他病毒相比又是不稳定的，纯化和浓缩后的反转录病毒会明显丧失感染能力，这都限制了反转录病毒在活体内应用的进一步开展。另外，逆转录病毒仅能感染复制细胞，纯化的DNA转染的对象必须是复制细胞，而非复制细胞则不被感染。腺相关病毒(AVV)的整合效率不及反转录病毒，但最近的研究表明，它可直接注射于患者体内，是携带基因产生表达产物治疗疾病。有人把携带有因子IX基因的腺相关病毒注射到一个患有B型血友病的病人肌肉中，产生了较好的效果。而对它的进一步研究也正在进行中。另外，单纯疱疹病毒在中枢神经系统疾病中特别有用，但其复杂的复制特性和很难获得重组病毒的原液，均限制了它的应用前途。

腺病毒(AdV)载体系统由于其基因组较易操作，具有可大量制备、表达量高及不整合等优点因而在目前的基因治疗中倍受青眯。腺病毒系统已被广泛应用于表达人体和非人体蛋白，腺病毒能感染很大范围的哺乳动物细胞，除了一些淋巴细胞外，腺病毒可以感染其他所有类型的细胞，并在非复制细胞中研究基因表达，腺病毒系统为最佳。腺病毒系统已用于多项临床实验，取得了预期临床效果。

发明内容

本发明的目的在于提供人增殖抑制基因(hHSG)-腺病毒表达载体在制备抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用。hHSG腺病毒表达载体在对多种组织来源的肿瘤治疗，包括上皮来源的及间叶组织来源的恶性肿瘤都有明显的抑制作用。

本发明的hHSG腺病毒表达载体可以抑制实体瘤，如肺癌，肝癌，乳腺癌，大肠癌及宫颈癌等，另外也可以抑制非实体瘤的生长，如造血系统来源的肿瘤。

本发明的进一步提供了人增殖抑制基因-腺病毒载体在制备与放射治疗物联合给药来抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。其中所述的放射治疗物是各种用于肿瘤治疗的放射物，优选铯源放射物。

本发明还进一步提供了人增殖抑制基因-腺病毒载体在制备与化疗物联合给药来抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。该化疗物可以是任何一种化疗药物，优选VP-6或放线酮。

本发明还提供了人增殖抑制基因-腺病毒载体在制备与热疗联合应用来抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。

我们通过大量的体内或/和体外实验发现hHSG对多种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。另外免疫组化和原位杂交结果显示，多种肿瘤组织与其相应的正常组织比较，HSG的表达水平明显降低。

我们又发现在hHSG腺病毒表达载体与放疗共同作用后，肿瘤细胞凋亡及生长抑制的比例也明显高于二者单独的作用。甚至强于P53与放疗药物的协同作用。并且hHSG腺病毒表达载体与化疗药物，如VP-16、放线菌酮共同作用后，肿瘤细胞凋亡及生长抑制的比例明显高于二者单独的作用。甚至强于P53与化疗药物的协同作用。

我们又发现在hHSG腺病毒表达载体与热疗共同作用后，肿瘤细胞凋亡及生长抑制的比例也明显高于二者单独的作用。

因此，hHSG腺病毒表达载体有望成为肿瘤治疗上的新药物。

附图说明

图1为MTT方法检测HSG重组腺病毒对肿瘤细胞(MCF-7)增殖能力的抑制作用

其中Adv-hHSG(100)代表Adv-hHSG为100个有感染能力的病毒颗粒，Adv-hHSG(200)代表Adv-hHSG为200个有感染能力的病毒颗粒。

图2为HSG对肿瘤细胞HT-29的体外诱导凋亡作用

未感染组：加入生理盐水；对照组：加入空载体adv；HSG组：加入人HSG重组腺病毒。

左上象限为晚期凋亡细胞或非凋亡方式死亡细胞百分比；左下象限为存活细胞百分比；右上象限为中期凋亡细胞百分比；右下象限为早期凋亡细胞百分比。每个象限所标的数字为该象限中出现的细胞百分比。

图3人HSG重组腺病毒对HT-29细胞(左栏)及A549细胞(右栏)在裸鼠体内成瘤及生长速度的影响。

图4为人HSG重组腺病毒与P53对肿瘤细胞周期的影响

其中箭头所指的右峰代表处于G2/M期细胞的比例。

图5为HSG与P53比较其对放疗药物的协同作用

具体实施方式

实施例1.人HSG腺病毒重组载体的构建

细胞总RNA的提取：利用GIBCO-BRL公司的TRIZOL^TM试剂。取K562(红白血病细胞系，来自ATCC)5×10⁶，离心后收集，加入1ml Trizol^TM试剂，反复吹打破碎细胞，室温静置5分钟后，加入0.2ml氯仿，充分混匀，4℃ 12000rpm 15分钟，收集上清用异丙醇沉淀，70％乙醇洗一次，室温干燥后，总RNA重悬于DEPC处理的H₂O中，分光光度计(Beckman 640)定量后用于cDNA第一链的合成。cDNA第一链的合成按照Gibico公司SUPERSCRIPT^TM说明书进行。合成后cDNA第一链于-80℃冷冻保存或直接用于PCR反应。

HSG PCR：以一定量的cDNA为模板，加10×buffer(含Mg²⁺)2.5ul，4ul10mM dNTP，HSG特异的上下游引物各0.5ul，0.25ul Taq，最后加无菌水至25ul。引物：上游：5‘g gaattcc atgtccctgctcttctctcga 3’(下划线部分为EcoR I酶切位点)；下游：

5’attt aagcttctatctgctgggctgcaggta 3’(下划线部分为HindIII酶切位点。

循环条件：先94℃变性4min，然后进入35轮变性→退火→延伸(94℃，1min→60℃，1min→72℃，2min)循环，最后在72℃反应7min。GAPDH的PCR循环条件为94℃，15sec→58℃，15sec→72℃，40sec进行25轮循环，最后在72℃反应7min。在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定并照相，利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit回收HSG PCR产物连接到肿瘤所T-Vector(promega公司)，进行亚克隆，以备测序。T-Vector-HSG PCR产物测序由上海基康公司完成。

人HSG重组腺病毒载体(Adv-hHSG)：分别用EcoR I和HindIII处理pAC16质粒(本元正阳公司)和含有序列正确的HSG T-Vector，纯化和回收相应的片断后，用T4连接酶将HSG基因连接到pAC16质粒上，筛选阳性克隆，并通过测序确认后，将其再与Ad5(腺病毒骨架)(本元正阳公司)进行重组，在293A细胞中包装、扩增，得到HSG重组腺病毒用于下面的实验。

实施例2.人HSG重组腺病毒对肿瘤细胞增殖指标的测定

采用MTT法进行分析。收集常规培养的肿瘤细胞，如K562、Hec-1A(子宫内膜癌)，HeLa(宫颈癌)，A549(肺腺癌)，MCF-7(乳腺癌)及HT-29(大肠癌)等(上述细胞系均购自ATCC)，按照700cells/孔接种96孔板，培养在含10％胎牛或小牛血清的DMEM培养基中，培养24h以后，弃去上清，每孔再分别加入含腺病毒(Adv或Adv-HSG)，试验组和对照组均做6重复孔，2×10⁵pfu的DMEM 0.1ml，继续培养至24hr开始每天进行检测：每孔加入浓度为500μg/ml的MTT，培养4-6h以后，1900rpm 15min离心弃上清，分别加入PBS pH 7.2的缓冲液及细胞裂解液各0.1ml，37℃孵育过夜后，在BioTek Elisa Reader上读取OD570nm的吸收值。

本实验选用了上述6种人的肿瘤细胞系，经MTT法检测表明，无论是造血系统来源的肿瘤细胞(K562)还是上述各种上皮来源的肿瘤细胞，HSG重组腺病毒均可明显抑制它们的生长，即从感染HSG重组病毒36小时开始，其细胞生长抑制率即可达到20％-30％，到了96小时其抑制率可达到70％-80％，与对照组(加入空载体Adv)及非感染组(不加入任何病毒颗粒)相比，P＜0.05-P＜0.001。 (见表1及图1)。

表1.人HSG重组腺病毒对下列肿瘤细胞增殖抑制率的影响

分组	K562	HT-29	MCF-7	HeLa	Hec-1A	A549
分组	K562	HT-29	MCF-7	HeLa	Hec-1A	A549		36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h
空载体	7％，5％，8％	0,5％，4％	0,1％，4％	5％，0,4％	3％，2％，6％	0,3％，5％		36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h	36h，72h，96h
空载体	7％，5％，8％	0,5％，4％	0,1％，4％	5％，0,4％	3％，2％，6％	0,3％，5％	人HSG重组腺病毒	10％，20％，23％	20％，56％，70％	17％，40％，63％	20％，35％，59％	34％，54％，80％	33％，54％，72％

说明：(1)每种细胞在不同时间的抑制率是以该时间点的非感染组做比较的，故在图中没有显示。

(2)36h、72h和96h下面所对应的百分比数为该时间点的抑制率。

实施例3.人HSG重组腺病毒对肿瘤细胞周期及细胞凋亡分析

按2×10⁵cells/孔将上述细胞接种于6孔板，培养24小时后感染腺病毒(Adv或Adv-HSG)2×10⁷pfu，分别在24小时、48小时和72小时收集肿瘤细胞，用PBS pH7.4洗涤后，用Annexin V & PI染色检测转染后细胞凋亡情况。按AnnexinV & PI双染凋亡检测试剂盒说明操作，流式细胞仪检测。用于细胞周期检测的细胞，先于70％乙醇、4℃固定24小时以上，经0.01M PBS洗涤后重悬于0.5ml的PBS中，RNaseA消化30min后进行PI染色，用FACScan检测细胞的DNA含量，ModFitLT V2.0计算机软件进行细胞周期和凋亡的分析，每个样品分析10⁴个细胞。

凋亡检测结果显示，肿瘤细胞系(HT-29、Hec-1A、HeLa和A549)在感染腺病毒24hr、48hr和72hr后，人HSG重组腺病毒(图2中的HSG组)均可明显地诱导这些肿瘤细胞的凋亡。即从感染HSG重组病毒48小时开始，其细胞生长凋亡率可达到30％，到了72小时其凋亡率达到高峰(可达到60％-80％，与腺病毒空载体(对照组)及非感染组相比，P＜0.05-P＜0.001)(见表2及图2)

表2人HSG重组腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡百分比分析

分组	Hec-1A	HT-29	A549	HeLa
分组	Hec-1A	HT-29	A549	HeLa		24h，48h，72h	24h，48h，72h	24h，48h，72h	36h，72h，96h
非感染组	13％，7％，10％	3％，7％，6％	6％，10％，11％	12％，10％，15％		24h，48h，72h	24h，48h，72h	24h，48h，72h	36h，72h，96h
非感染组	13％，7％，10％	3％，7％，6％	6％，10％，11％	12％，10％，15％	空载体	10％，8％，13％	3％，6％，10％	7％，12％，12％	11％，12％，18％
人HSG重组腺病毒	20％，34％，58％	17％，45％，68％	20％，34％，70％	20％，32％，58％	空载体	10％，8％，13％	3％，6％，10％	7％，12％，12％	11％，12％，18％

说明：24h，48h，72h下列所对应的百分比数为该时间点的抑制率。

通过流式细胞仪对人肿瘤细胞系(HT-29、Hec-1A、HeLa和A549)的不同时间(24hr、48hr和72hr)细胞周期的检测分析发现，HSG重组腺病毒对所检测的肿瘤细胞的细胞周期均有影响，表现为G2-M期细胞百分比明显增高。实验组G2-M期细胞百分比与对照组相比，可增加30％-50％，p＜0.05-P＜0.001(见表3).

表3 HSG重组腺病毒对肿瘤细胞细胞周期的影响(G2-M期细胞百分比)

分组	Hec-1A	HT-29	A549	HeLa
分组	Hec-1A	HT-29	A549	HeLa		24h，48h，72h	24h，48h，72h	24h，48h，72h	24h，48h，72h
非感染组	13％，11％，10％	12％，13％，10％	12％，10％，11％	12％，10％，15％		24h，48h，72h	24h，48h，72h	24h，48h，72h	24h，48h，72h
非感染组	13％，11％，10％	12％，13％，10％	12％，10％，11％	12％，10％，15％	空载体	10％，8％，13％	3％，6％，10％	7％，12％，12％	11％，12％，18％
人HSG重组腺病毒	20％，30％，55％	17％，35％，44％	17％，30％，35％	20％，32％，44％	空载体	10％，8％，13％	3％，6％，10％	7％，12％，12％	11％，12％，18％

说明：24h，48h，72h下面所对应的百分比数为该时间点的G2-M期细胞百分比。

实施例4.荷瘤动物实验

培养的HT-29和A549细胞计数后，继续培养24hr，按每个细胞加入100pfu的浓度，将HSG重组腺病毒加入培养基中再培养12hr，胰酶消化，生理盐水洗2-3次。取0.1ml(含5×10⁶cells)接种于4周龄雌性Balb/C裸鼠小鼠腋下，以空载体作为对照，观察小鼠成瘤情况，并每两天测量肿瘤的大小，并观察肿瘤变化及小鼠状态。

结果显示，与空载体及非感染组相比，感染HSG重组腺病毒组的成瘤率明显减少，多数不成瘤，即使成瘤，其肿瘤生长速度明显减慢.(见图3)

实施例5.人HSG重组腺病毒与P53重组腺病毒载体的活性比较分析

按2×10⁵cells/孔将上述细胞接种于6孔板，培养24小时后感染腺病毒(Adv、Adv-HSG或Adv-P53，即今又生(Adv-P53的商品名，深圳赛百诺公司研制开发)，为市售产品)2×10⁷pfu/孔，分别在24小时、48小时和72小时收集肿瘤细胞，用PBS pH7.4洗涤后，用Annexin V&PI染色检测转染后细胞凋亡情况。按AnnenixV&PI双染凋亡检测试剂盒说明操作，流式细胞仪检测。用于细胞周期检测的细胞，先于70％乙醇、4℃固定24小时以上，经0.01M PBS洗涤后重悬于0.5ml的PBS中，RnaseA消化30min后进行PI染色，用FACScan检测细胞的DNA含量，ModFitLT V2.0计算机软件进行细胞周期的分析，每个样品分析2×10⁴个细胞。

凋亡检测结果显示，肿瘤细胞系(HT-29和A549)在感染HSG重组腺病毒24hr、48hr和72hr后，HSG重组腺病毒均可明显地诱导这些肿瘤细胞的凋亡，其抑制效应较P53强20-30％(见表4)。

表4.人HSG重组腺病毒与P53重组腺病毒载体诱导细胞凋亡活性比较分析

分组	HT-29	A549
分组	HT-29	A549		24h，48h，72h	24h，48h，72h
非感染组	3％，7％，6％	6％，10％，11％		24h，48h，72h	24h，48h，72h
非感染组	3％，7％，6％	6％，10％，11％	空载体	3％，6％，10％	7％，12％，12％
P53重组病毒	8％，23％，40％	12％，20％，45％	空载体	3％，6％，10％	7％，12％，12％
P53重组病毒	8％，23％，40％	12％，20％，45％	人HSG重组腺病毒	17％，45％，68％	20％，34％，70％

说明：24h，48h，72h下面所对应的百分比数为该时间点的凋亡率。

通过流式细胞仪对人肿瘤细胞系(HT-29和A549)的不同时间(24hr、48hr和72hr)细胞周期的检测分析发现，人HSG重组腺病毒对所检测的肿瘤细胞的细胞周期均有影响，表现为G2-M期细胞百分比明显增高，此效应基本等同于P53。(见图4)

实施例6.HSG的放疗协同效应

肿瘤细胞系(HT-29和A549)在感染HSG重组腺病毒24hr后，用不同的放射剂量(铯源，分别为0，2，4，8Gy)照射细胞，在48小时收集肿瘤细胞。

结果显示，随着放射剂量的增加，HSG显示出明显的协同作用，较单纯用放射线组比较，凋亡率可提高50-80％，较单纯用HSG组比较，凋亡率可提高30％，这种协同作用同样强于P53(增强20-30％)。(见表5及图5)

表5 HSG的放疗协同效应(48小时凋亡率)

分组	非感染组	空载体组	P53重组病毒	HSG重组病毒
分组	非感染组	空载体组	P53重组病毒	HSG重组病毒		HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549
0G	8％ 9％	10％ 9％	20％ 23％	53％ 48％		HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549
0G	8％ 9％	10％ 9％	20％ 23％	53％ 48％	2G	9％ 10％	14％ 17％	31％ 27％	54％ 55％
4G	8％ 10％	15％ 10％	33％ 32％	61％ 58％	2G	9％ 10％	14％ 17％	31％ 27％	54％ 55％
4G	8％ 10％	15％ 10％	33％ 32％	61％ 58％	6G	8％ 11％	34％ 15％	38％ 45％	65％ 60％

实施例7.HSG的化疗协同效应

肿瘤细胞系(HT-29和A549)在感染HSG重组腺病毒24hr后，用一定剂量的VP-16(足叶乙甙，0.5μg/ml，SIGMAG公司产品)或放线菌酮(0.5μg/ml，SIGMAG公司产品)作用于肿瘤细胞，分别在48小时收集肿瘤细胞。

结果显示，随着作用时间的延长，HSG显示出明显的协同作用。VP-16与HSG重组腺病毒合用后，较单纯用VP-16组比较，凋亡率可提高40-50％，较单纯用HSG组比较，凋亡率可提高20-30％。放线菌酮与HSG重组腺病毒合用后，较单纯放线菌酮组比较，凋亡率可提高20-30％，较单纯用HSG组比较，凋亡率可提高20％。这种协同作用同样强于P53(见表6)。

表6 HSG的化疗协同效应(48小时凋亡率)

分组	非感染组	空载体	P53重组病毒	HSG重组病毒
分组	非感染组	空载体	P53重组病毒	HSG重组病毒		HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549
未加药组	8％ 7％	9％ 5％	30％ 34％	52％ 45％		HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549
未加药组	8％ 7％	9％ 5％	30％ 34％	52％ 45％	VP-16	20％ 18％	21％ 22％	30％ 33％	67％ 63％
放线菌酮	31％ 25％	30％ 23％	34％ 28％	60％ 55％	VP-16	20％ 18％	21％ 22％	30％ 33％	67％ 63％

实施例8.HSG的热疗协同效应

肿瘤细胞系(HT-29和A549)在感染HSG重组腺病毒8hr后，用42℃水浴1小时后分别在48小时收集肿瘤细胞，与空载体及未感染组相比，通过细胞凋亡和细胞周期分析，探讨HSG及P53的热疗协同作用。

结果显示，在48小时，HSG显示出明显的协同作用，较不加热组比较，凋亡率可提高20-50％，较单纯用HSG组比较，凋亡率可提高20％，而P53组在24小时看不到协同作用，48小时出现协同作用，其效应等同或略强于HSG，但到72小时时几乎见不到协同作用。(见表7)

表7 HSG的热疗协同效应(48小时凋亡率)

分组	非感染组	空载体	P53重组腺病毒	人HSG重组腺病毒
分组	非感染组	空载体	P53重组腺病毒	人HSG重组腺病毒		HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549
未加热组	8％ 9％	9％ 8％	32％ 30％	51％ 47％		HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549	HT-29 A549
未加热组	8％ 9％	9％ 8％	32％ 30％	51％ 47％	加热组	10％ 8％	11％ 12％	61％ 45％	58％ 60％

Claims

1、人增殖抑制基因-腺病毒表达载体在制备抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用，其中所述的肿瘤细胞为实体瘤细胞。

3、根据权利要求1所述的人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用，其中所述的肿瘤细胞为非实体瘤细胞。

4、根据权利要求2所述的人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用，其中所述的实体瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞及宫颈癌细胞。

5、人增殖抑制基因-腺病毒表达载体在制备与放射治疗物联合给药来抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。

6、根据权利要求5所述的人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用，其中所述的放射治疗物为铯源的放射物。

7、人增殖抑制基因-腺病毒表达载体在制备与化疗物联合给药来抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。

8、根据权利要求7所述的人增殖抑制基因-腺病毒表达载体的应用，其中所述的化疗物为VP-6或放线酮。

9、人增殖抑制基因-腺病毒表达载体在制备与热疗联合应用来抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。