CN110305198A - 一种溶瘤棒状病毒减毒株及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种重组溶瘤棒状病毒的改性基质蛋白、具有前述改性基质蛋白的溶瘤棒状病毒减毒株、含有前述减毒株的组合物及其在制备杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用。本公开涉及的溶瘤棒状病毒减毒株具有持续性复制表达，高滴度，刺激肿瘤局部微环境的免疫反应，以及在保持高选择性侵染肿瘤细胞的同时对正常细胞毒性低的特点，在肿瘤的临床治疗中具有重大意义。

Description

一种溶瘤棒状病毒减毒株及其在肿瘤治疗中的应用
技术领域
本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开涉及一种病毒减毒株及其在治疗疾病中的应用。更具体来说，本公开涉及一种突变的减毒溶瘤棒状病毒株，特别是VSV-MuddSummer株及其在癌症中的治疗方法和应用。
背景技术
目前小分子药物、单克隆抗体等被开发应用于肿瘤的新型治疗，但治愈率不高，有待更多的研究。另外，仅用单一药物治疗可能会导致肿瘤细胞出现耐药性，因此急需开发有效的生物治疗方法。溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒，经过高度稀释的减毒病毒能利用肿瘤(靶)细胞中抑癌基因的失活或缺陷，选择性地在靶细胞内复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡，而在正常细胞内它只是少量存在或不能增殖。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制，导致细胞溶解和死亡；而且通过死亡的细胞释放出病毒颗粒，产生一种级联效应，放大溶细胞效果，直至肿瘤细胞被清除。同时，肿瘤细胞的破裂会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放，从而诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应，这可能会增强病毒的溶细胞活性。溶瘤病毒进入肿瘤细胞后由于自我复制可陆续破坏宿主细胞，进而向周围扩散，进入其他肿瘤细胞。如此反复循环，可发挥有效的抗肿瘤效果。
已有大量报道显示，在体外实验中，很多病毒会在多种肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞，例如仙台病毒(Kinoh等，2004)；柯萨奇病毒(Coxackie Virus)(Shafren等，2004)；单纯性疱疫病毒(Mineta等，1995)；细小病毒(Abschuetz等,2006)；腺病毒(Heise等,2000)；脊髓灰质炎病毒(Gromeier等,2000)；新城疫病毒；麻疹病毒(Grote等，2001)；呼肠病毒(Coffey等，1998)；逆转录病毒(Logg等，2001)；痘苗病毒(Timiryasova等，1999)以及流感病毒(Bergmann等，2001))。此外，已证明，这些病毒对治疗肿瘤动物模型有效。但是，大多数活病毒的安全性是一个重要的关注点，因此仍有必要开发更加安全可靠的方法来治疗癌症。
随着分子遗传学及基因工程编辑技术的迅速发展，已经能够在分子水平上对病毒进行基因工程编辑，选择性的对DNA进行重组或者定点突变(in vitro site-directedmutagenesis)等。通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的存在与变化。因此，现代遗传学中就出现了另一条由里及表的认知路线，即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。
水疱性口炎病毒(VSV)是一种负链RNA病毒，其感染大部分哺乳动物细胞并在受感染细胞中表达高达总蛋白60％的病毒蛋白。在自然界中，VSV感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。虽然已有报道人感染VSV，但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状。VSV编码5种蛋白，包括核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。由VSV基质蛋白(M)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。
随着RNA 病毒遗传技术的进展，水疱性口炎病毒属载体已被开发成为一种有效的治疗制剂。VSV病毒载体是一种高效的溶瘤棒状病毒载体，具有非常广的溶瘤范围。根据资料报道，VSV载体几乎能够侵染溶解所有的肿瘤细胞，在体外实验中VSV载体的溶瘤率都在50％以上，在体内实验中VSV载体能够显著延长荷瘤动物模型的寿命。VSV载体也被开发成为一种有效的疫苗载体，VSV病毒载体作为疫苗载体应用到获得性免疫缺陷综合症病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制过程中。因此水疱性口炎病毒载体具有非常好的应用前景。
在肿瘤基因治疗领域，常常利用病毒作为治疗基因的载体。出于安全考虑，通常会控制病毒在正常细胞体内复制，因此要达到100％的侵染效率在技术上很困难。于是，运用可自我复制的病毒(增殖型病毒)来治疗肿瘤(溶瘤棒状病毒治疗)备受瞩目和期待。溶瘤棒状病毒治疗是指在被感染的肿瘤细胞内，利用病毒自我复制达到破坏肿瘤宿主细胞，并利用病毒原有的直接杀伤细胞的功效达到治疗目的。另外，溶瘤棒状病毒治疗与基因治疗不同，主要依赖其在肿瘤细胞内复制而产生杀伤肿瘤细胞的效应。溶瘤病毒治疗的概念早已存在，100年前就有人尝试用野生型或自然弱毒株来治疗肿瘤，随着基因工程学技术的发展，病毒用于治疗的研究飞跃发展，现在已开发到第2代基因重组病毒。
但是，现有技术已知的基于VSV的基因重组病毒，要么存在一定的对于正常体细胞的毒性，导致存在安全性风险；要么溶瘤效果不佳，导致治疗实体瘤的效果不好。因此，仍需要开发一种既具有良好的安全性，又具有良好的溶瘤效果的基于VSV的重组溶瘤棒状病毒。
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术中存在的问题，需要提供一种能够有效降低病毒在正常体细胞中的毒性，同时保证相对于正常细胞，对于异常增生性细胞具有高选择性，并且具有良好溶瘤效果的溶瘤棒状病毒减毒株。
用于解决问题的方案
在一个技术方案中，本公开涉及一种重组溶瘤棒状病毒的改性基质蛋白(M)，其特征在于，编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列；并且，所述氨基酸序列和SEQ ID NO：1相比，在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。
在另一个技术方案中，本公开涉及一种改性基质蛋白(M)，其中，所述重组溶瘤棒状病毒选自水疱性口炎病毒；优选的，所述重组溶瘤棒状病毒选自水疱性口炎病毒MuddSummer株。
在另一个技术方案中，本公开涉及一种改性基质蛋白(M)，其中，所述的改性的基质蛋白(M)的序列和SEQ ID NO:1相比，编码改性基质蛋白(M)的氨基酸序列同时存在如下突变：(i)第21位甘氨酸G突变为谷氨酸E，(ii)第51甲硫氨酸M突变为丙氨酸A，(iii)第111位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，(iv)第221位缬氨酸V突变为苯丙氨酸F；优选的，所述改性基质蛋白(M)的序列为如SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个技术方案中，本公开涉及一种重组溶瘤棒状病毒，其中，所述重组溶瘤棒状病毒包含改性基质蛋白(M)，其中，所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列为如上所示的氨基酸序列；优选的，所述重组溶瘤棒状病毒为减毒的溶瘤棒状病毒。
在一个技术方案中，本公开涉及一种包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物，所述重组溶瘤棒状病毒具有核酸片段，所述核酸片段编码改性基质蛋白(M)，其特征在于，所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列为如上所示的氨基酸序列；优选的，所述重组溶瘤棒状病毒为减毒的重组溶瘤棒状病毒。
在另一个技术方案中，本公开涉及的组合物进一步包含第二溶瘤病毒；优选的，所述第二溶瘤病毒选自包含弹状病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒、甲病毒、细小病毒、肠道病毒株的一种或多种；更优选的，所述第二溶瘤病毒为减毒的溶瘤病毒；最优选的，其中所述第二溶瘤病毒为减毒的弹状病毒。
在另一个技术方案中，本公开涉及的组合物进一步包括第二抗肿瘤制剂；优选的，所述第二抗肿瘤制剂是免疫治疗剂、化学治疗剂或放射治疗剂；更优选的，所述第二抗肿瘤制剂选自小分子，大分子，细胞，病毒载体，基因载体，DNA，RNA，多肽，和纳米复合物中的一种或多种。
在一个技术方案中，本公开涉及一种疫苗，所述疫苗包含治疗有效量的一种或多种重组溶瘤棒状病毒，其中，所述一种或多种重组溶瘤棒状病毒包含前述改性基质蛋白(M)。
在另一个技术方案中，本公开涉及的疫苗还可以包含第二溶瘤病毒，或第二抗肿瘤制剂。
在一个技术方案中，本公开涉及一种分离的肽，其由氨基酸序列编码而成，所述氨基酸序列选自包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列，并且，所述氨基酸序列和SEQ ID NO：1相比，在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。
在另一个技术方案中，本公开涉及的编码所述分离的肽的氨基酸序列同时存在如下突变：(i)第21位甘氨酸G突变为谷氨酸E，(ii)第51甲硫氨酸M突变为丙氨酸A，(iii)第111位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，(iv)第221位缬氨酸V突变为苯丙氨酸F；优选的，所述氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个技术方案中，本公开涉及一种用于编码所述的分离的肽的分离的核苷酸序列。
在一个技术方案中，本公开涉及包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗在制备用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用。
在另一个技术方案中，本公开涉及的上述应用中，所述异常增生性细胞被包含在患者体内。
在另一个技术方案中，本公开涉及的上述应用中，所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。
在一个技术方案中，本公开涉及包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗在制备治疗患有肿瘤的患者的药物中的应用。
在一个技术方案中，本公开涉及—种缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，包括将所述异常增生性细胞与重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗接触的步骤。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，所述异常增生性细胞被包含在患者体内。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，所述重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗被施用至患者体内。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，所述重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗通过包括腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮肤内、瘤内、皮下或鼻内给药中的一种或多种的给药方式而被施用；优选的，所述给药方式的给药途径包括内镜、腔镜、介入、微创、传统手术中的一种或多种。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，所述方法进ー步包括施用第二抗肿瘤疗法的步骤。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，其中所述第二抗肿瘤疗法选自施用第二溶瘤病毒。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，其中所述第二溶瘤病毒选自包含弹状病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒、甲病毒、细小病毒、肠道病毒株的一种或多种；更优选的，所述第二溶瘤病毒为减毒的溶瘤病毒；最优选的，其中所述第二溶瘤病毒为减毒的弹状病毒。
在另一个技术方案中，本公开涉及的缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，其中所述第二抗肿瘤疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。
在一个技术方案中，本公开涉及—种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包含对受试者施用重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗中的一种或多种。
在一个技术方案中，本公开涉及—种诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的方法，包括将肿瘤或肿瘤组织与重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗接触的步骤。
发明的效果
本公开通过基因重组技术，提供了一种能够有效降低病毒在正常体细胞中的毒性，同时保证相对于正常细胞，对于异常增生性细胞具有高选择性，并且具有侵染肿瘤细胞，进而产生良好的溶瘤效果的溶瘤棒状病毒减毒株。与此同时，前述减毒株具有持续性复制表达，高滴度，刺激肿瘤局部微环境的免疫反应，以及在保持高选择性侵染肿瘤细胞的同时对正常细胞毒性低的特点。在一个技术方案中，本公开记载的肿瘤具有诱导促进抗肿瘤免疫反应，消除肿瘤组织微环境免疫抑制的效果，在肿瘤的临床治疗中具有重大意义。
附图说明
图1所示的是VSV减毒溶瘤病毒随机突变(RV-Mut)单点多点突变的病毒拯救情况。
图2所示的是肿瘤细胞LLC中，包括RV-4Mut在内的不同减毒株的不同时间点的病毒复制情况。
图3所示的是正常细胞中，包括RV-4Mut在内的不同减毒株在不同时间点的病毒复制情况。
图4所示的是不同病毒载量的，包括RV-4Mut在内的不同减毒株对不同肿瘤细胞的体外杀伤比较。
图5所示的是包括RV-4Mut在内的不同减毒株对MEF细胞的毒副作用比较情况。
图6所示的是包括RV-4Mut在内的不同减毒株在不同细胞中的外源蛋白持续表达能力情况。
图7所示的是包括RV-4Mut在内的不同减毒株在人源肿瘤细胞中的持续复制表达能力的比较情况。
图8所示的是包括RV-4Mut在内的不同减毒株在不同细胞中刺激诱导干扰素免疫反应能力的比较情况。
图9所示的包括RV-4Mut在内的不同减毒株在不同品系小鼠中神经毒性的检测。
图10所示的是包括RV-4Mut在内的不同减毒株在肿瘤模型中的治疗效果评价。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如肿瘤治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
本公开的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的肿瘤，可选的，本公开的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。
术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。
本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的溶瘤载体给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。
本公开中采用的术语“RV病毒”是指减毒的VSV溶瘤棒状病毒。术语“RV-Mut”是指和野生型的VSV溶瘤棒状病毒相比，存在突变的溶瘤棒状病毒。
技术方案
根据Claus O.Wilke等人发表的文章表明，VSV印第安纳株的亚型MuddSummer株与其它两个病毒株相比较，发现在传代到第25代时，MuddSummer株的突变总数最少，同义突变的位点主要集中在M与G两个病毒基因上，稳定性是最好的。因此，将VSV-MuddSummer的亚型毒株开发成溶瘤病毒载体具备先天的优异性。
在本公开的一个实施方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括用适于诱导针对目标肿瘤细胞的免疫反应的肿瘤抗原给哺乳动物接种疫苗的步骤。例如，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，例如在引发哺乳动物的免疫应答的肿瘤细胞中产生的物质。这类抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetal antigen)(例如甲胎蛋白，AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA 125)、癌基因(例如Her2)、黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睾丸抗原(cancer-testesantigen)(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)、病毒癌基因(例如HPV E6和E7)、在通常限于胚胎组织或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质(例如PLAC1)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据待采用本公开的方法治疗的癌症的类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。
可以给予抗原本身，或者优选通过载体给予抗原，例如腺病毒(Ad)载体、痘病毒载体或反转录病毒载体、质粒或荷载的抗原呈递细胞，例如树突细胞。将抗原引入载体的方法为本领域技术人员所知。一般而言，可对载体进行修饰以表达抗原。在这一方面，使用广为接受的重组技术，将编码选定抗原的核酸整合到选定载体上。
用以下若干方法的任一种将抗原给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。
建立对抗原的免疫应答，采用广为接受的技术，进行使用抗原的疫苗接种。因此，可以足以产生免疫应答的量将选定抗原或表达抗原的载体给予哺乳动物。正如本领域技术人员应理解的一样，产生免疫应答所需要的量将随多种因素而变化，包括例如选定抗原、递送抗原所使用的载体和待治疗的哺乳动物，例如品种、年龄、体型等。在这一方面，例如，肌内给予小鼠腺病毒载体至少约107PFU的最低量足以产生免疫应答。对于给予人，相应的量应足够产生免疫应答。
在另一个实施方案中，对抗原的免疫应答可在哺乳动物内天然发生，不需要第一疫苗接种步骤以诱导免疫应答。对抗原的天然存在的免疫应答可由任何既往暴露于抗原而产生。
一旦在适当的免疫应答间隔期内在哺乳动物中产生免疫应答，例如至少约24小时，优选至少约2-4天或更久，例如至少约1周，则以适于溶瘤病毒疗法的量将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒给予哺乳动物，正如本领域技术人员应理解的一样，这可随选定的溶瘤病毒和待治疗的哺乳动物而变化。例如，静脉内给予小鼠108PFU溶瘤VSV的最低量足以用于溶瘤疗法。相应的量可足以用于人。
可通过采用标准重组技术，将编码抗原的转基因整合到病毒中来制备表达选定肿瘤抗原的溶瘤病毒。例如，可将转基因整合到病毒基因组，或者可采用整合转基因的质粒将转基因整合到病毒中。本公开的方法对于可利用的溶瘤病毒没有特别限制，可包括能够破坏肿瘤同时适于给予哺乳动物的任何溶瘤病毒。
在一个实施方案中，本公开所描述的是ー种用以反向遗传操作系统制造的减毒棒状病毒病毒，是一种全新的基因肿瘤治疗开发的重组系统。减毒棒状病毒四重突变株(RV-4Mut)已被制造出来，并且在多种肿瘤模型(具有免疫功能的肿瘤模型)中证实通过系统递送是安全和有效的。
在一个实施方案中，本公开的减毒四重突变棒状病毒(和/或其它溶瘤试剂)可被连续使用，而不会引起宿主针对治疗病毒的强烈免疫反应。基于此，在一定时间内可以对宿主进行多次相同病毒系统的治疗，延长治疗时间，进一步降低了机体对单一药物耐药性的产生，进而改善肿瘤治疗的效果。本公开的实施方式包括有关棒状病毒的组合物和方法以及它们作为抗肿瘤治疗的用途。这些棒状病毒在体内和体外都具备杀死肿瘤细胞的性质。在本公开中，棒状病毒可以是减毒棒状病毒或减毒棒状病毒的基因工程变异体。本申请所述的病毒可以与其它棒状病毒结合使用。
在本公开的一个实施方案中，包括减毒棒状病毒以及包含减毒棒状病毒的组合物，所述减毒棒状病毒编码与减毒棒状病毒的M蛋白(即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)具有至少或至多20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(包括这些数值之间所有范围和百分数)的氨基酸同一性的变异M蛋白。上述减毒棒状病毒的M蛋白具有特定百分数的同一性指的是，减毒棒状病毒的M蛋白存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，上述减毒棒状病毒的M蛋白的同一性突变还包括起因于基因所来源的棒状病毒的个体差异、株、种的差异时等的天然产生的突变。
在某些情况下，对于单独的随机突变，尽管各自的单一突变株可能会减少病毒对正常健康细胞的毒性作用，但是，一旦将上述多组单独的随机突变相结合，病毒在肿瘤细胞中极有可能会变得比野生型病毒更加具有毒性。因此，本公开中的重组溶瘤棒状病毒的治疗指数出人意料地増加，是建立在体外大规模筛选减毒株过程中的意外发现，多种单一突变的减毒株进行多基因同时突变时，大部分病毒在肿瘤细胞及正常细胞中同时丧失感染力，少部分返强，细胞毒性变强。本公开意外地发现RV-4Mut的4个氨基酸突变并没有让病毒本身返强，同时继续保留了杀伤肿瘤的特性，尽管在体外细胞水平发现裂解肿瘤细胞的时间点延后，但特异性杀伤肿瘤的属性完整的保留，最难能可贵的是RV-4Mut对正常细胞没有任何毒性，完全符合生物安全要求。
本公开的方法和组合物可包括第二种治疗病毒，例如溶瘤病毒或复制缺陷型病毒。溶瘤通常指的是能够杀死、溶解或阻止肿瘤细胞生长。溶瘤病毒是指可在肿瘤细胞中一定程度上复制，导致肿瘤细胞死亡、溶解(溶瘤)或肿瘤细胞生长停止，并且通常对非肿瘤细胞具有微小的毒性作用。第二种病毒包括但不限于弹状病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒、甲病毒、细小病毒、肠道病毒株等。
本公开的实施方式包括与包含异源性N、P、M、G和/或L蛋白的弹状病毒有关的组合物和方法以及它们作为抗肿瘤疗法的用途。这种弹状病毒具有体内和体外肿瘤细胞杀伤性质。因此，如本公开所述的VSV病毒可通过联合异源性N、P、M、G和/或L蛋白而被进一步修饰。如本公开所使用的，异源性N、P、M、G和/或L蛋白包括弹状病毒N、P、M、G和/或L蛋白。
本公开的方法可进一步包括施用第二种抗肿瘤疗法，例如第二种治疗病毒。在某些方面，治疗病毒可为溶瘤病毒，更特别为VSV病毒。在其他方面，第二种抗肿瘤疗法为化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂、手术等。
另一方面，所述组合物是药学上可接受的组合物。所述组合物还可包括第二抗肿瘤制剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
本公开的另外的实施方式涉及杀死增生性细胞的方法，该方法包括将该细胞与本公开所述的分离的溶瘤弹状病毒组合物接触。
本公开另外的实施方式涉及癌症患者的治疗，包括施用有效量的本公开所述的溶瘤弹状病毒组合物。
在本公开的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性的细胞。弹状病毒可被施用至患者，该患者具有易被至少一种弹状病毒或包含弹状病毒的治疗方案或组合物杀死的细胞。治疗组合物的施用可利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种弹状病毒或重组弹状病毒(单独或以各种方式组合)进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。施用可为腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或鼻腔施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本公开采用的试剂及耗材如下：
PBS(Hyclone SH30256.01)，DMEM高糖培养基(Gibco C11995500)，RPMI1640(Gibco C22400500CP)，双抗体(Gibco 15140-122)，胎牛血清(Gibco 10099141)，Opti- I Reduced Serum Medium(Gibco 31985-070)，Lipofectamine LTX(Invitrogen15338100),96孔细胞培养板(Corning 3599)，6孔细胞培养板(Corning 3516)，0.22um滤器(Millipore SLGP033rb)，DMSO(Macklin D806645)，噻唑蓝(Sigma M2128)。
实施例1：基于VSV棒状溶瘤病毒构建的减毒突变株(RV-Mut)的病毒拯救情况
基于VSV病毒高效的拯救系统，构建了不同的减毒株体系，随机突变单点多点的病毒拯救情况。进而确认是否可以任意对VSV病毒的M蛋白进行突变，均可以获得病毒粒子(即是否可以进行任意突变，病毒粒子均可以被拯救)。
上述病毒拯救系统构建的具体步骤如下：
1、BSR-T7细胞铺6孔板，使细胞量达到4×105个/孔，铺板14-16h后加入vT7，病毒感染4h后，进行转染。
2、使用opti-MEM培养基对质粒进行稀释。其中，质粒总量为5μg，再加入7.5μlPLUS Reagent。使用培养基对10μl Lipofectamine LTX进行稀释。
3、将LTX混合液与DNA混合液等体积混合，室温孵育。
4、将6孔板中的培养基换成Opti-MEM培养基，将步骤3中的混合液逐滴加入培养细胞的6孔板中，轻轻摇动6孔板，使均匀分布在6孔板内。
5、转染6-8h后，吸去转染试剂，加入新鲜的完全培养基。
6、培养72h后收获细胞上清，使用0.22μm滤器进行过滤。
利用本领域常规的方法对病毒粒子是否成功拯救进行检测。病毒包装成功率的检测结果如图1所示。
图1的结果证明，RV病毒M基因的111位氨基酸只能由亮氨酸突变为苯丙氨酸，突变为其它氨基酸严重影响到病毒粒子的拯救，病毒M蛋白的第221位氨基酸只能替换为苯丙氨酸，若该位置氨基酸替换为丙氨酸，制造不出重组的病毒。
从图1所示的病毒的包装成功率的统计列表中反映出，在致病基因M的特定位点突变能够获得减毒株，氨基酸的突变选择并不是任意选择，而是需要遵循特定的规律，才可以制造出特定的病毒粒子。
实施例2：不同RV-Mut病毒株的病毒滴度检测
在MEF/LLC细胞培养液中，分别加入如下病毒：VSV-GFP-WT、RV-GFP-M51R、RV-GFP-M51R-V221F-S226R(RV-3Mut)、RV-GFP-G21E-M51A-L111F-V221F(RV-4Mut)各200PFU，检测病毒株产生的病毒的滴度(TCID50)。
检测上述病毒的滴度的具体步骤如下：
1、在6孔培养板中每孔加入Vero(LLC/Hela)细胞悬液3mL，使细胞量达到4×105个/孔，共6个孔，37℃，5％CO2培养16h。
2、每个孔分别加入病毒VSV-GFP-WT、RV-GFP-M51R、RV-GFP-M51R-V221F-S226R、RV-GFP-G21E-M51A-L111F-V221F各200PFU，设正常细胞对照2个孔。在12h、24h、48h、72h、80h、96h各时间点收获细胞上清100μl。
3、在96孔培养板中每孔加入Vero细胞悬液100μl，使细胞量达到1×104个/ml，37℃，5％CO2培养16h。
4、在1.5ml EP管中将步骤2中收获的上清作连续10倍的稀释，从10-1～10-11，共11个滴度。
5、将稀释好的上清接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一列共8孔，每孔接种100μl。设正常细胞对照组一列。
6、48h后观察每孔细胞荧光情况，有荧光则记为此孔被感染。
7、按Karber法计算TCID50。
上述病毒的滴度的检测结果如图2和图3所示。
从图2中可以发现，RV-4Mut在体外肿瘤细胞中在早期感染复制释放到上清中的病毒粒子数较对照病毒大大降低，但是当感染时间延长到5天时，病毒感染肿瘤细胞释放的病毒载量与野生病毒趋于一致，证明RV-4Mut具备缓慢感染肿瘤细胞的特性。
从图3中可以发现，RV-4Mut减毒株在感染正常的成纤维细胞时，原始上清中加入的病毒载量为200PFU，在24h和120h这2个时间点检测上清中不同减毒株的病毒滴度，发现RV-4Mut减毒株较原始上清中的病毒粒子数降低(120h的感染上清液中显著降低)，而对照组都呈现了不同程度的上升，表明RV-4Mut株在正常的成纤维细胞中不具备复制能力，而野生病毒株及对照病毒株RV-M51R和RV-3Mut仍具备较强的感染复制能力(从图3中可以得出，与RV-4Mut减毒株的感染复制能力相比，野生病毒株及对照病毒株RV-M51R和RV-3Mut存在高达三个数量级的差异)。
实施例3：检测不同病毒载量的RV-4Mut对不同肿瘤细胞的体外杀伤的对比情况
通过MTT检测的方法，检测不同病毒载量的RV-4Mut减毒株对不同肿瘤细胞的体外杀伤情况。
上述检测方法的具体步骤如下：
1、在96孔培养板中每孔加入Vero(LLC/Hela/MEF/MC38)细胞悬液100μl，使细胞量达到1×104个/孔，37℃，5％CO2培养16h。
2、分别将病毒VSV-GFP-WT、RV-GFP-M51R、RV-GFP-M51R-V221F-S226R(RV-3Mut)、RV-GFP-G21E-M51A-L111F-V221F(RV-4Mut)稀释到MOI(感染复数)分别为0.001,0.01,0.1,1.0，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，37℃，5％CO2培养40h。
3、弃去96孔培养板中的上清，加入新鲜培养基，加入MTT溶液，20μL/孔。37℃，5％CO2培养4h。
4、将96孔板离心，设置转速2500rpm/分钟，室温离心5分钟。
5、使用1mL一次性无菌注射器，轻轻吸掉上清。
6、向每孔中加入DMSO，100ul/孔，37℃放置10分钟。
7、使用多功能酶标仪，震荡2分钟，在570nm或490nm波长下，测定各孔的OD值。
上述不同病毒株的体外杀伤情况的检测结果如图4和图5所示。
如图4所示，在病毒感染复数为0.01时，LLC和Hela中RV-4Mut对肿瘤细胞的裂解能力与对照组病毒相比有轻微的下降，而当RV-4Mut株病毒感染复数提高到0.1时，无论对LLC或者Hela等肿瘤细胞的直接杀伤能力显著提高，与野生株病毒相比没有显著差异，表明RV-4Mut尽管有四个位点的突变，但是保留了野生病毒特有的对肿瘤细胞的嗜侵性，具备较强的持续杀伤肿瘤细胞的能力。
同时在MEF细胞上重复相同的实验，如图5所示，实验结果显示RV-4Mut株在MOI为0.1或者0.01时对正常细胞的毒副作用与PBS组相比不存在显著差异。
MTT实验的结果表明，四突变株RV-4Mut在体外对正常细胞的不存在显著的毒副作用，同时不会引起正常细胞的凋亡和坏死。而野生株和对照组RV-M51R病毒对正常细胞都存在一定的毒副作用，野生株毒副作用最强，RV-4Mut病毒株在三种减毒株里的毒副作用最低，安全性最好。
实施例4：不同减毒株嵌合的外源基因GFP在不同细胞中的表达情况
通过FACS流式检测不同减毒株嵌合的外源基因GFP在不同细胞中的表达情况。
上述检测的具体步骤如下：
1、在48孔培养板中每孔加入Vero(LLC/Hela/MEF)细胞悬液100μl，使细胞量达到2×104个/孔，37℃，5％CO2培养16h。
2、每个孔分别加入病毒VSV-GFP-WT、RV-GFP-M51R、RV-GFP-M51R-V221F-S226R(RV-3Mut)、RV-GFP-G21E-M51A-L111F-V221F(RV-4Mut)各100PFU，每种病毒21个孔，空白对照组12个孔。
3、在各时间点(24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)分别收获细胞,每种病毒收获3个细胞孔的细胞，空白对照组收获1个孔的细胞，均用400ul PBS重悬细胞，取100μL细胞悬液用Life Launch Attune NxT–Next型流式细胞仪进行分析，统计GFP阳性细胞总数。
上述流式检测的检测结果如图6所示。
如图6A所示，RV-4Mut病毒株在Vero细胞(干扰素缺陷)中随着时间的推移，GFP阳性的细胞比例持续升高，感染72h后，被RV-4Mut病毒株感染阳性细胞超过野生病毒对应的比例，表明RV-4Mut病毒株与其它候选病毒株相比，在干扰素表达能力缺陷的细胞中具备更强的持续复制扩增能力，在Vero工程细胞系中复制的时间较其它对照病毒株延长，更符合工业规模生产的要求。
而在MEF细胞中，如图6B所示，将4种病毒的初始病毒载量增加200倍后，RV-4Mut是所有病毒中，GFP阳性的细胞没有随着时间的迁移显著增加的，而MEF细胞的干扰素通路是正常的，当外界病原感染时，会快速产生应答，而图6B的结果证明RV-4Mut与对照减毒株相比具备更高的安全性(MEF细胞中病毒感染复制情况)，潜在的原因是RV-4Mut对干扰素更敏感。
因此，当病毒GMP工业化生产时，在Vero工程化细胞(干扰素缺陷)中扩增病毒时，RV-4Mut病毒株具备了高效持续的表达外源基因的能力，与对照减毒株相比，具备了天然的优势，同等体积的反应罐体系中，可以生产制备更高滴度的病毒制品。
实施例5：不同减毒株嵌合的相同的外源基因GFP在不同肿瘤细胞(Hela和A549)中 的表达情况
通过流式检测不同减毒株嵌合的相同的外源基因(GFP)在不同肿瘤细胞中(Hela和A549)的表达情况。
上述检测的具体步骤和实施例4相同。
上述流式检测的检测结果如图7所示。
从图7A-D来看，通过流式染色活细胞的比例(图7A-7C)，无论时在Hela还是A549细胞中，RV-4Mut的活细胞比例都是比较高的，有利于病毒在细胞内复制，最终通过制造更多的病毒粒子来扩大感染肿瘤细胞的范围。
如图7B-7D所示四点突变株RV-4Mut在体外感染Hela细胞时，随着时间的推移GFP阳性的细胞比例持续升高，在60h后比例达到最高，随后呈现开始下降的趋势，A549细胞中(图7D)，在48h和60h两个时间节点上，RV-4Mut与对照组相比，GFP阳性的细胞的比例最高，同时随着感染时间的增加而增加，与在Hela中的趋势保持一致性。
上述结果表明，RV-4Mut具备在肿瘤细胞中持续复制的能力，与对照组相比，外源基因的表达的持续性更好，优异性显著。
实施例6：不同的细胞系对不同减毒株病毒的抗病毒干扰素的表达量
将不同的减毒株体外感染MEF或者肿瘤细胞系LLC，通过RT-PCR实验技术，分别检测不同的细胞系对不同减毒株病毒的抗病毒干扰素的表达量。
上述检测的具体步骤如下：从LLC,MEF细胞中用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)反转录试剂盒逆转录成cDNA，并用480SYBR Green I Master(Roche)染料进行染色在480定量PCR仪上检测各个基因的Ct值。用ΔΔCt法来计算目的基因IFN-β、VSV-G相对于管家基因GAPDH的表达量。
上述检测的检测结果如图8所示。
如图8B和图8D所示，四种病毒分别侵染MEF和肿瘤细胞LLC，MEF被上述四种病毒感染后，IFN的mRNA水平的变化情况如图8B所示，RV-4Mut的诱导干扰素的能力与另外两株减毒株相比最低。与此同时，病毒本身复制能力VSV-G的mRNA水平与对照组相比(图8A)，RV-4Mut在MEF细胞中的RNA水平非常低，进一步佐证RV-4Mut病毒的安全性高，同时在肿瘤细胞LLC进行相同的实验发现，与MEF细胞中的现象截然相反，RV-4Mut减毒株刺激LLC细胞的干扰素的量最高，同时在肿瘤细胞中病毒复制能力与对照组相比也是最强的(图8C)。
上述实验结果证明了RV-4Mut的对肿瘤细胞的高选择性侵染，同时诱导肿瘤细胞干扰素表达能力的增强(肿瘤内干扰素量的增加会显著提高局部免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力)，同时不影响病毒的复制能力，而正常细胞中针对该RV-4Mut的干扰素诱导能力并没有显著增强，进一步证明RV-4Mut具备连续刺激肿瘤局部免疫细胞并产生持续抗肿瘤的免疫应答。
实施例7：RV-4Mut与其它病毒株在神经毒性上的差异的验证
为了验证RV-4Mut与其它病毒株在神经毒性上的差异，选取6周龄的Balb/c小鼠作为实验对象，每组10只小鼠，每组小鼠滴鼻50μl的108PFU/mL的病毒稀释液(前述病毒分别为VSV-GFP-WT(即RV-GFP)、RV-GFP-M51R、RV-GFP-M51R-V221F-S226R(RV-3Mut)、RV-GFP-G21E-M51A-L111F-V221F(RV-4Mut))，隔天滴鼻一次，共滴鼻2次。已知通过鼻腔感染野生的棒状病毒，会使部分实验小鼠后肢神经麻痹，严重的小鼠会死亡，持续记录并统计5组实验小鼠，在滴鼻实验后的体重变化，小鼠后肢瘫痪情况，小鼠毛发顺滑程度及是否有流感样症状。
上述实验的具体统计结果如表1和图9所示。
表1 RV-4Mut在动物模型中的神经毒性鉴定
从表1和图9来看，VSV-WT滴鼻组小鼠，10只全部发病，同时症状严重，病情恶化迅速最终，死亡率达到60％(如图9B所示10只接种野生病毒株的小鼠死了6只)，均出现了后肢麻痹瘫痪现象，病症持续时间较长，而另外3株减毒株的症状稍有减轻，尤其是RV-4Mut滴鼻组小鼠仅有5只小鼠有轻微症状，同时RV-4Mut组小鼠恢复能力也是最快的。与此同时，RV-4Mut组的小鼠均没有出现后肢瘫痪现象，只有轻微的毛发杂乱的现象，如图9A所述的一样，RV-4Mut组是体重下降最不明显的实验组，与PBS滴鼻组的变化趋势一致。
上述实验结果证明了RV-4Mut减毒株在动物模型中的安全性的优势是非常显著的，过量的RV-4Mut对小鼠的生存情况没有任何不良影响。
实施例8：建立小鼠肺癌模型，验证RV-4Mut减毒株的药效
进一步通过建立小鼠肺癌模型，通过局部瘤内给药对减毒株的性能进行测试，验证RV-4Mut减毒株的药效。
上述小鼠肺癌模型的建立具体步骤如下。
按每只CB7BL/6小鼠皮下接种1.0×106(200μL)LLC-t2细胞。每隔1天测量肿瘤大小，按如下公式计算：1/2×M2×M12(M1：短径，M2：长径)。待每组小鼠肿瘤体积生长超过200mm3后，分别在第12天，第14天和第16天给予106PFU(20ul)的瘤内注射病毒进行治疗，连续观察记录肿瘤体积的变化情况。
上述实验的结果如图10所示。
如图10C所示，连续3次隔天的瘤内注射RV-4Mut治疗能有效抑制肿瘤的生长趋势，大大延缓小鼠的生命周期，通过独立分析每只小鼠接受三种不同减毒株治疗效果发现RV-4Mut与对照组RV-GFP-M51R均能将30％的小鼠肿瘤缩小直至消失，达到完全缓解，近40％的小鼠肿瘤的生长速度得到有效抑制，部分缓解。
从图10可以发现，RV-4Mut免治疗组的小鼠肺部转移的数目最少。进一步通过对荷瘤小鼠接受治疗后的有效生存期记录发现，实验组的存活率最高，接近40％的小鼠在近2个月内维持正常的生命状态(图10F)，同时部分肿瘤模型小鼠的肿瘤逐渐消退，彻底治愈，进一步表明RV-4Mut减毒株给予实体瘤治疗效果显著，具备良好的临床应用价值。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州奥特铭医药科技有限公司
<120> 一种溶瘤棒状病毒减毒株及其在肿瘤治疗中的应用
<130> 6514-170751I-2
<150> 201810259493.9
<151> 2018-03-27
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 229
<212> PRT
<213> 水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)
<400> 1
Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys
1 5 10 15
Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser
20 25 30
Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val
35 40 45
Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe
50 55 60
Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile
85 90 95
Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln
115 120 125
Pro Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg
130 135 140
Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg
145 150 155 160
Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr
165 170 175
Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His
180 185 190
Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe
195 200 205
Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser
210 215 220
Ile Gly His Phe Lys
225
<210> 2
<211> 690
<212> DNA
<213> 水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)
<400> 2
atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60
gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120
attgacaaat cctattttgg agttgacgag atggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180
tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240
tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300
aaacgtccct tctacaaaat cttggctttt ttgggttctt ctaatctaaa ggccactcca 360
gcggtattgg cagatcaagg tcaaccagag tatcacgctc actgcgaagg cagggcttat 420
ttgccacata ggatggggaa gacccctccc atgctcaatg taccagagca cttcagaaga 480
ccattcaata taggtcttta caagggaacg attgagctca caatgaccat ctacgatgat 540
gagtcactgg aagcagctcc tatgatctgg gatcatttca attcttccaa attttctgat 600
ttcagagaga aggccttaat gtttggcctg attgtcgaga aaaaggcatc tggagcgtgg 660
gtcctggact ctatcggcca cttcaaatga 690
<210> 3
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys
1 5 10 15
Ser Lys Lys Leu Glu Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser
20 25 30
Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val
35 40 45
Asp Glu Ala Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe
50 55 60
Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile
85 90 95
Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Ala Gly
100 105 110
Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln
115 120 125
Pro Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg
130 135 140
Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg
145 150 155 160
Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr
165 170 175
Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His
180 185 190
Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe
195 200 205
Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Phe Leu Asp Ser
210 215 220
Ile Gly His Phe Lys
225
<210> 4
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60
gagatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120
attgacaaat cctattttgg agttgacgag gcggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180
tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240
tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300
aaacgtccct tctacaaaat cttggctttc gcaggttctt ctaatctaaa ggccactcca 360
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ttcagagaga aggccttaat gtttggcctg attgtcgaga aaaaggcatc tggagcgtgg 660
ttcctggact ctatcggcca cttcaaatga 690

Claims (25)

1.一种重组溶瘤棒状病毒的改性基质蛋白(M)，其特征在于，编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列；
并且，所述氨基酸序列和SEQ ID NO：1相比，在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。
2.根据权利要求1所述的改性基质蛋白(M)，其中，所述重组溶瘤棒状病毒选自水疱性口炎病毒；优选的，所述重组溶瘤棒状病毒选自水疱性口炎病毒MuddSummer株。
3.根据权利要求1-2任一项所述的改性基质蛋白(M)，其特征在于，所述的改性的基质蛋白(M)的序列和SEQ ID NO:1相比，编码改性基质蛋白(M)的氨基酸序列同时存在如下突变：
(i)第21位甘氨酸G突变为谷氨酸E，
(ii)第51甲硫氨酸M突变为丙氨酸A，
(iii)第111位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，
(iv)第221位缬氨酸V突变为苯丙氨酸F；
优选的，所述改性基质蛋白(M)的序列为如SEQ ID NO:3所示的序列。
4.一种重组溶瘤棒状病毒，其特征在于，所述重组溶瘤棒状病毒包含改性基质蛋白(M)，其特征在于，所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列为如权利要求1-3任一项中所示的氨基酸序列；优选的，所述重组溶瘤棒状病毒为减毒的溶瘤棒状病毒。
5.一种包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物，所述重组溶瘤棒状病毒具有核酸片段，所述核酸片段编码改性基质蛋白(M)，其特征在于，所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列为根据权利要求1-3任一项中所示的氨基酸序列；优选的，所述重组溶瘤棒状病毒为减毒的重组溶瘤棒状病毒。
6.根据权利要求5所述的组合物，所述组合物进一步包含第二溶瘤病毒；优选的，所述第二溶瘤病毒选自包含弹状病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒、甲病毒、细小病毒、肠道病毒株的一种或多种；更优选的，所述第二溶瘤病毒为减毒的溶瘤病毒；最优选的，其中所述第二溶瘤病毒为减毒的弹状病毒。
7.根据权利要求5-6任一项所述的组合物，所述组合物进一步包括第二抗肿瘤制剂；优选的，所述第二抗肿瘤制剂是免疫治疗剂、化学治疗剂或放射治疗剂；更优选的，所述第二抗肿瘤制剂选自小分子，大分子，细胞，病毒载体，基因载体，DNA，RNA，多肽，和纳米复合物中的一种或多种。
8.一种疫苗，其特征在于，该疫苗包含治疗有效量的一种或多种重组溶瘤棒状病毒，其中，所述一种或多种重组溶瘤棒状病毒包含改性基质蛋白(M)，所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列为如权利要求1-3任一项所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，其还可以包含如权利要求6中所述的第二溶瘤病毒，或如权利要求7中所述的第二抗肿瘤制剂。
10.一种分离的肽，其由氨基酸序列编码而成，所述氨基酸序列选自包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％相同的序列，并且，所述氨基酸序列和SEQ ID NO：1相比，在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换；
优选的，编码所述分离的肽的氨基酸序列同时存在如下突变：
(i)第21位甘氨酸G突变为谷氨酸E，
(ii)第51甲硫氨酸M突变为丙氨酸A，
(iii)第111位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，
(iv)第221位缬氨酸V突变为苯丙氨酸F；
更优选的，所述氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的序列。
11.一种用于编码权利要求10所述分离的肽的核苷酸序列。
12.根据权利要求5-7任一项所述的包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或权利要求8-9任一项所述的疫苗在制备用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用。
13.根据权利要求11所述的应用，其中所述异常增生性细胞被包含在患者体内。
14.根据权利要求12所述的应用，其中所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。
15.根据权利要求5-7任一项所述的包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或根据权利要求8-9任一项所述的疫苗在制备治疗患有肿瘤的患者的药物中的应用。
16.—种缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，包括将所述异常增生性细胞与根据权利要求4所述的重组溶瘤棒状病毒、根据权利要求5-7任一项所述的包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或根据权利要求8-9任一项所述的疫苗接触的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述异常增生性细胞被包含在患者体内。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗被施用至患者体内。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述重组溶瘤棒状病毒、包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或疫苗通过包括腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮肤内、瘤内、皮下或鼻内给药中的一种或多种的给药方式而被施用；优选的，所述给药方式的给药途径包括内镜、腔镜、介入、微创、传统手术中的一种或多种。
21.根据权利要求16所述的方法，所述方法进ー步包括施用第二抗肿瘤疗法的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二抗肿瘤疗法选自施用第二溶瘤病毒；优选的，所述第二溶瘤病毒选自包含弹状病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒、甲病毒、细小病毒、肠道病毒株的一种或多种；更优选的，所述第二溶瘤病毒为减毒的溶瘤病毒；最优选的，其中所述第二溶瘤病毒为减毒的弹状病毒。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二抗肿瘤疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。
24.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其特征在于所述方法包含对受试者施用选自如权利要求4所述的重组溶瘤棒状病毒、权利要求5-7任一项所述包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或权利要求8-9任一项所述的疫苗中的一种或多种。
25.—种诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的方法，包括将肿瘤或肿瘤组织与根据权利要求4所述的重组溶瘤棒状病毒、根据权利要求5-7任一项所述的包含分离的重组溶瘤棒状病毒的组合物或根据权利要求8-9任一项所述的疫苗接触的步骤。
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Denomination of invention: A attenuated strain of oncolytic rod-shaped virus and its application in tumor treatment

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