JP7468958B2 - 腫瘍溶解性ウイルスワクチン及びそれと免疫細胞の併用による腫瘍治療薬物 - Google Patents

Description

本願は、バイオ医薬品の分野に関し、具体的には、腫瘍溶解性ウイルスワクチン及びそれと免疫細胞の併用による腫瘍治療薬物に関する。

中国国立がんセンターが２０１９年１月に発表した全国がん統計データによると、２０１５年に悪性腫瘍の発生は約３９２万９０００人で、死亡は約２３３万８０００人であったという。平均で毎日１００００人超ががんと診断され、１分当たり７．５人ががんと診断される。肝がん、結腸がん・直腸がん、女性の乳がんなどの固形腫瘍は、依然として我が国の主流の悪性腫瘍である。悪性腫瘍（がん）は既に中国人の健康に深刻な影響をもたらす主要な公衆衛生課題の１つとなっている。現在、がんの治療は手術、化学療法、放射線療法、分子標的治療などの集学的・包括的治療で大きな発展を遂げているが、腫瘍の再発と転移に対する有効な治療方法はまだない。そのために、腫瘍免疫療法という新たな治療方法が、徐々に注目を集めている。

２００３年、Ｇｉｅｄｌｉｎ ＭＡは、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ）が腫瘍溶解性ウイルスとして腫瘍の治療に使用できることを述べていた。原理は、それが正常な細胞内の内因性ＩＦＮ－βと相互作用することができず、選択的に腫瘍細胞内で増幅又は成長しかできないことである。２００９年のカナダのマックマスター大学の研究が、ＶＳＶは免疫応答を促進する新たな腫瘍ワクチンベクターとして使用できることを示していた。近年、ＶＳＶ関連の研究はますます研究者の注目を集めている。安全性の観点上、ＶＳＶは人間に比較的安全であり、現在ＶＳＶの人間への感染の例がまだ見られていない。

ＶＳＶは、プロトタイプ非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、サイズが１１ｋｂのそのゲノムは、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、基質タンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）の５つのタンパク質をコードする。ＶＳＶは、低密度リポタンパク質受容体、ホスファチジルセリン、シアロ糖脂質、ヘパラン硫酸などの様々な細胞表面分子を発現し、かつこれらの分子によって細胞の表面に付着することができる。複製速度とシナプス通過速度が早く、外来遺伝子の発現量が非常に高いという特徴を有する。現在開発中の他の腫瘍溶解性ウイルスプラットフォームと比べると、ＶＳＶの方がゲノムは小さくて、取り扱いやすく、複製時間がより短く、独立する細胞周期を有し、様々な細胞株における迅速な増加が可能で、且つ高い力価を有し、大規模な生産が可能であり、宿主細胞の細胞質の複製では形質転換のリスクがない。このような腫瘍溶解性ウイルスはＤＮＡに組み込まれず、かつ、弱毒化により野生型ウイルスによって引き起こされる神経系の炎症を避けることができる。そのために、ＶＳＶは腫瘍免疫療法として大きな可能性を秘めている。

腫瘍モデル動物での研究では、ＶＳＶは脳腫瘍を顕著に解消することができ、乳がん及び骨肉腫にも明らかな阻害効果があることを見出した。研究者は、ＶＳＶの肝がんに対する抗腫瘍機能及び毒性と副作用に関する研究によって、肝がん担持マウスの生存期間が顕著に延長し、しかも明らかな毒性と副作用が生じなかったことを見出した。ＶＳＶ－ＧＰ処理後に前立腺がんマウスの皮下腫瘍及び骨転移腫瘍が明らかに縮小しており、縮小黒色腫担がんマウスにおける同所性腫瘍と肺転移腫瘍も顕著に改善している。Ｍ５１Ｒ ＶＳＶは直接結腸がん・直腸がん細胞のアポトーシスを誘導することができる。また、ＶＳＶは自然免疫又は獲得免疫の調節で腫瘍の進行に一層影響を与えることができる。Ｍ５１Ｒ ＶＳＶは結腸がん・直腸がん組織における免疫抑制細胞ＭＤＳＣ、マクロファージの浸潤を軽減し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の浸潤を増加させることによって、悪性腹水の生成を減少させる。ＶＳＶは、ＣＤ８特異的Ｔ細胞の免疫応答を誘導し、他の免疫抑制細胞の作用を軽減することによって、腫瘍ワクチンの有効性を向上させることができる。上記の研究では、ＶＳＶは抗腫瘍効果が高く、優れた安全性を有することが分かった。

直近の研究が、腫瘍免疫療法としてＶＳＶを単独で使用すると、治療反応率にはある程度制限があり、これは主にその特異性の不十分と腫瘍内微小環境の阻害効果に関係していることを示している。そのために、ＶＳＶと他の治療の併用がますます多くなる。乳頭腫マウスモデルでの研究は、ＶＳＶと腫瘍ワクチンの併用が抗腫瘍効果を明らかに改善していることを見出した。ミネソタ大学医学部のＭａｎｉｓｈ Ｒ．Ｐａｔｅｌらが、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤（ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ））とＶＳＶ－ＩＦＮβの併用で肺がんを治療することを発表し、結果は、ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）とＶＳＶ－ＩＦＮβの併用が良い腫瘍溶解治療効果を収めたことを示している。様々なサイトカインを搭載させた腫瘍溶解性ウイルスはＣＡＲ－Ｔ細胞療法とも併用されており、異種移植腫瘍モデルでは、このような併用の方式が抗腫瘍活性を強化している。

Ｔ細胞受容体遺伝子操作Ｔ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＴＣＲ－Ｔ）療法は、改変Ｔ細胞に基づく悪性腫瘍に用いる養子細胞免疫療法であり、ＭＨＣ分子によって提示される抗原をＴ細胞が認識するようＴＣＲが媒介することによって、抗原特異的Ｔ細胞は腫瘍標的細胞に免疫効果を発揮する。従来の研究によりＶＳＶとＴＣＲ－Ｔの併用による腫瘍治療が可能になる。ＶＳＶは腫瘍細胞内での選択的な複製により腫瘍細胞を溶解することができ、溶解した腫瘍細胞が腫瘍特異的免疫応答を誘導して、Ｔ細胞の活性化、増幅、動員を促進し、活性化したＴ細胞はまた腫瘍内で免疫抑制の調節などの方式で腫瘍細胞を殺傷する。両者の併用は、理論的には、ＶＳＶ療法又はＴＣＲ－Ｔ療法の単独使用よりも優れた効果を発揮できる。

しかし、ＶＳＶとＴＣＲ－Ｔの併用で腫瘍免疫療法を行う時には、依然として少なくとも次の問題がある。（１）直接ＶＳＶ野生株又は弱毒化株とＴＣＲ－Ｔを併用すると、治癒率は高くなく、１つの療法の単独使用と比べると、効果の改善が明らかではない。（２）野生型ＶＳＶには依然としてある程度安全上のリスクがあり、今のところげっ歯類動物には強い神経毒性があることが分かり、臨床的使用のためには、その遺伝子を改変して、その病原性をさらに軽減させる必要がある。（３）ランダムに遺伝子の改変を行っては、腫瘍溶解効果が優れないか、パッケージングが成功できないため、ましてや組換えウイルスの製造もできない。

そこで、安全性が良好で、治癒率の高いＶＳＶ組換えウイルスを提供し、それをＴＣＲ－Ｔ又は他の免疫細胞と薬物として併用することが、腫瘍の遺伝子治療分野で大きな研究価値と使用上の意味を有するのであろう。

本発明の目的は、腫瘍溶解性ウイルスワクチン及びそれと免疫細胞の併用による腫瘍治療薬物を提供することである。

上記の発明の目的を達成するために本発明の採用する技術的解決手段は次のとおりである。腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株であって、その基質タンパク質（Ｍ）の遺伝子配列は、配列番号３に示されるとおりである。

さらに、腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株であって、前記弱毒化株は、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株を元に、少なくとも、５１位のメチオニン（Ｍ）のアルギニン（Ｒ）への変異、１１１位のロイシン（Ｌ）のコード塩基ノックアウト、２２１位のバリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）への変異、２２６位のセリン（Ｓ）のアルギニン（Ｒ）への変異である部位特異的変異導入を行って得られる。

さらに、医薬品分野における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用である。

好ましくは、薬物又はワクチンの製造における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の使用である。

さらに、前記弱毒化株に抗原を挿入して製造された腫瘍溶解性ウイルスワクチンである。

さらに、前記弱毒化株に腫瘍抗原を挿入して製造された腫瘍溶解性ウイルスワクチンである。

好ましくは、前記抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ３３、ｇｐ１００、ＴＸ１０３、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＷＴ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｂ２、ＰＲＡＭＥ、サバイビン（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ＭＡＲＴ－１、ｃｏｌ６Ａ３、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、Ｔ抗原（Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＬＣ４５Ａ２、ＶＣＸ／Ｙ、ＨＰＶ、α－フェトプロテイン、がん胎児性抗原、ＣＡ １２５、Ｈｅｒ２、ドーパクロムトートメラーゼ、ＢＡＧＥタンパク質、ＧＡＧＥタンパク質、サバイビン、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、サイクリンＡ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｍｅｌｏｅ、レングシン（Ｌｅｎｇｓｉｎ）、カリクレイン４、ＩＧＦ２Ｂ３、グリピカン３及び他の腫瘍抗原のいずれかである。

さらに、腫瘍免疫療法薬物の製造における前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンの使用である。

好ましくは、前記薬物は、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチン及び免疫細胞を同時に含み、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、又は他の免疫細胞である。

好ましくは、前記免疫細胞がＴ細胞であるときは、前記Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、γ／δ－Ｔ細胞のいずれかであり、前記Ｔ細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞であるときは、前記ＴＣＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルスによってトランスフェクトされたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は血液の中から分離されたＴＣＲ－Ｔ細胞であり、前記免疫細胞がＮＫ細胞であるときは、前記ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－ＮＫのいずれかであり、前記免疫細胞がマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であるときは、前記マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は、ＣＡＲ－Ｍ細胞のいずれかである。

好ましくは、前記腫瘍又はがんは、頭頸部がん、黒色腫、軟部肉腫、乳がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、滑膜肉腫、円形細胞型脂肪肉腫のいずれかである。

本発明は次の有益な効果を有する。本発明は、ＶＳＶ野生型ウイルスの基質タンパク質Ｍに部位特異的変異導入を行うことにより、新規な腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を提供し、当該弱毒化株は単独で薬物として腫瘍を治療することができ、安全性と治癒率はいずれも野生型ウイルス及び他の弱毒化株より優れている。また、当該弱毒化株はベクター（骨格）として、抗原又はサイトカインなどと接続して、抗原又はサイトカインなどの物質を部位特異的に所定の位置に輸送することで、ワクチン又は薬物になる。具体的には、接続先抗原又はサイトカインのタイプは実際に治療する腫瘍又は他の疾患のタイプから決めることができるため、適合性が高い。本発明は、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を元に、弱毒化株に外来遺伝子ＮＹ－ＥＳＯ－１を挿入することで、腫瘍治療で使用可能なワクチンをも提供する。前記ワクチンは治癒率が高く、かつバイオセキュリティが高い。本発明は、さらに、前記ワクチンを元に、ワクチンとＴＣＲ－Ｔ細胞の併用で、複数のタイプの腫瘍を効率的に治療できる薬物を提供している。マウスの肺がんモデルでは、驚くべきことに、治癒率が９５％に達している。

本願の一態様において、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株と比べると、基質タンパク質Ｍの遺伝子が改変されており、前記改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウトを含むことを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を提供する。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウトである。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置５１位のメチオニンのアルギニンへの変異をさらに含む。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト及び５１位のメチオニンのアルギニンへの変異である。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異をさらに含む。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト及び２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異である。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、２２６位のセリンのアルギニンへの変異であるアミノ酸変異をさらに含む。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異である。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異である。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、５１位のメチオニンのアルギニンへの変異、１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異である。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる群のいずれかのアミノ酸配列を有する。

本願の別の態様において、さらに、医薬品分野における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用を提供する。

特定の実施形態では、医薬品分野における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用は、薬物又はワクチンの製造における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の使用であることを特徴とする。

本願の別の態様において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株に抗原を挿入して製造されたことを特徴とする腫瘍溶解性ウイルスワクチンを提供する。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、前記抗原が特異的腫瘍抗原であることを特徴とする。

特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、前記抗原が、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ３３、ｇｐ１００、ＴＸ１０３、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＷＴ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｂ２、ＰＲＡＭＥ、サバイビン（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ＭＡＲＴ－１、ｃｏｌ６Ａ３、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、Ｔ抗原（Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＬＣ４５Ａ２、ＶＣＸ／Ｙ、ＨＰＶ、α－フェトプロテイン、がん胎児性抗原、ＣＡ １２５、Ｈｅｒ２、ドーパクロムトートメラーゼ、ＢＡＧＥタンパク質、ＧＡＧＥタンパク質、サバイビン、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、サイクリンＡ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｍｅｌｏｅ、レングシン（Ｌｅｎｇｓｉｎ）、カリクレイン４、ＩＧＦ２Ｂ３、グリピカン３のいずれかであることを特徴とする。

本願の別の態様において、さらに、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンによって製造された抗腫瘍薬物又はがん治療薬を提供する。

特定の実施形態では、前記抗腫瘍薬物又はがん治療薬は、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチン及び免疫細胞を同時に含む。

特定の実施形態では、前記抗腫瘍薬物又はがん治療薬の特徴は次のとおりである。前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、ＴＩＬ細胞のいずれかであり、前記免疫細胞がＴ細胞であるときは、前記Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、γ／δ－Ｔ細胞、遺伝子操作Ｔ細胞のいずれかであり、前記Ｔ細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞であるときは、前記ＴＣＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルス又はｍＲＮＡ技術によってトランスフェクトされたＴＣＲ－Ｔ細胞、血液の中から分離されたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は任意の技術で得たＴＣＲ－Ｔであり、前記免疫細胞がＮＫ細胞であるときは、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ又はＣＡＲ－ＮＫのいずれかであり、前記免疫細胞がマクロファージであるときは、前記マクロファージは、マクロファージ又はＣＡＲ－Ｍ細胞のいずれかである。

特定の実施形態では、前記抗腫瘍薬物又はがん治療薬は、前記腫瘍又はがんが、頭頸部がん、黒色腫、軟部肉腫、乳がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、滑膜肉腫、円形細胞型脂肪肉腫のいずれかであることを特徴とする。

当業者は次の詳細な説明の中から本願の他の態様及び利点を容易に知ることができる。次の詳細な説明は本願の例示的な実施形態を示し、それを説明しているに過ぎない。当業者の理解しているように、本願の内容は当業者が開示されている特定の実施形態に、本願に係る発明の趣旨と範囲を逸脱することなく変更を行うことを可能にするものである。そのために、本願の図面と明細書の説明は限定を加えるのではなく、例示的なものに過ぎない。

本願に係る発明の具体的な特徴は特許請求の範囲に示されるとおりである。次の詳細な説明における例示的な実施形態と図面を参照すれば、本願に係る発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は次のとおりである。
図１Ａは、各弱毒化株のインビトロにおけるＬＬＣ細胞内での複製能の模式図である。 図１Ｂは、各弱毒化株のインビトロにおけるＭＥＦ細胞内での複製能の模式図である。 図２Ａは、各弱毒化株のインビトロにおけるＬＬＣ細胞に対する殺傷能の模式図である。 図２Ｂは、各弱毒化株のインビトロにおけるＨｅｌａ細胞に対する殺傷能の模式図である。 図３は、各弱毒化株のインビトロにおけるＭＥＦ細胞に対する殺傷能の模式図である。 図４Ａは、各弱毒化株のインビトロにおけるＬＬＣ細胞内でのＩＦＮ－βの発現量に対する影響の模式図である。 図４Ｂは、各弱毒化株のインビトロにおけるＭＥＦ細胞内でのＩＦＮ－βの発現量に対する影響の模式図である。 図５は、腫瘍溶解性ウイルスワクチンの構築の模式図である。 図６は、各弱毒化株のマウス体内の非小細胞肺がん（移植腫瘍）の体積に対する影響の模式図である。 図７は、各ワクチンのマウス体内の非小細胞肺がん（移植腫瘍）の体積に対する影響の模式図である。 図８は、実験終了時の、各弱毒化株及びワクチン処理下のマウス体内の非小細胞肺がん（移植腫瘍）の体積の模式図である。 図９は、各弱毒化株及びワクチンのマウス体内の非小細胞肺がん細胞の転移状況に対する影響の模式図である。 図１０は、各ワクチンのマウス体内の線維肉腫（移植腫瘍）の体積に対する影響の模式図である。 図１１は、実験終了時の、各ワクチン処理下のマウス体内の線維肉腫（移植腫瘍）の体積の模式図である。 図１２は、各ワクチンのマウス体内の黒色腫（移植腫瘍）の体積に対する影響の模式図である。 図１３は、実験終了時の、各ワクチン処理下のマウス体内の黒色腫（移植腫瘍）の体積の模式図である。 図１４は、異なる用量のＪＢＳ００４のマウス体内の非小細胞肺がん（移植腫瘍）の体積に対する影響の模式図である。 図１５は、実験終了時の、異なる用量のＪＢＳ００４処理下のマウス体内の非小細胞肺がん（移植腫瘍）の体積の模式図である。 図１６は、異なる用量のＪＢＳ００４のマウス体内の非小細胞肺がん細胞の転移状況に対する影響の模式図である。 図１７は、異なる用量のＪＢＳ００４の肺がんマウスの体重に対する影響の模式図である。 図１８は、異なる用量のＪＢＳ００４の肺がんマウスの体温に対する影響の模式図である。 図１９は、ＰＣＲ検出方法の定量標準曲線である。 図２０は、ＬＬＣ移植腫瘍モデルにおける、異なる時刻での腫瘍内のＪＢＳ００４の核酸コピー数の模式図である。 図２１は、異なる時刻での異なる用量のＪＢＳ００４の健康な雌マウスの体温に対する影響の模式図である。 図２２は、異なる時刻での異なる用量のＪＢＳ００４の健康な雄マウスの体温に対する影響の模式図である。 図２３は、異なる時刻での異なる用量のＪＢＳ００４の健康な雌マウスの体重に対する影響の模式図である。 図２４は、異なる時刻での異なる用量のＪＢＳ００４の健康な雄マウスの体重に対する影響の模式図である。 図２５は、各ワクチンの単独治療又はＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔとの併用治療時の肺がん（移植腫瘍）の体積に対する影響の模式図である。 図２６は、実験終了時の、各ワクチンの単独治療又はＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔとの併用治療時の肺がん（移植腫瘍）の体積の模式図である。 図２７は、各ワクチンの単独治療又はＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔとの併用治療の肺がん細胞の転移状況に対する影響の模式図である。

次に、特定の実施例で本願に係る発明の実施形態を説明し、当業者は本明細書において開示されている内容から本願に係る発明の他の利点及び効果を容易に知ることができる。

「用語の定義」
本願において、用語「改変された」は、一般に人工的手段によって天然に存在する生物体／分子の構造及び／又は特性に変化を加えること指す。変化の方式は、例えば、前記分子に対する改変、変異、合成及び／又は外因性分子の挿入などであってもよい。「改変された」ものは、天然に存在するものと違う。例えば、もし細胞又は生物体は操作によりその遺伝情報が変化していれば（例えば、形質転換、マッチング、体細胞交雑、トランスフェクション、形質導入又は他のメカニズムなどにより、以前には存在しなかった新しい遺伝物質を導入し、又は、例えば、置換又は欠失変異により、以前に存在した遺伝物質を変化させ又は除去する）、「改変された」ものと見なされる。例えば、改変された腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を変異させたものであってもよいし、腫瘍溶解性ウイルスの遺伝子に外来遺伝子を挿入したものであってもよいし、腫瘍溶解性ウイルスのタンパク質のアミノ酸を変異させたものであってもよい。

本願において、用語「基質タンパク質Ｍ」は「Ｍタンパク質」と入れ替えて使用され、一般に水疱性口内炎ウイルスの基質タンパク質を指す。基質タンパク質ＭはＶＳＶの重要な病原性因子であり、水疱性口内炎ウイルスでマウスの自然免疫応答に干渉を与えられるタンパク質として知られる。用語「基質タンパク質Ｍ」は、そのホモログ、オルソログ、バリアント、機能的に活性な断片などをさらに含む。例えば、野生型水疱性口内炎ウイルスのＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ・インディアナ株の基質タンパク質Ｍは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

本願において、タンパク質変異部位は、一般に「アミノ酸＋アミノ酸位置番号＋（変異後のアミノ酸）」で表記される。本願において、前記変異は、アミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は削除を含み、ただしそれらに限定されない。例えば、用語「Ｍ５１Ｒ」は、一般に５１位のメチオニンＭのアルギニンＲへの変異を指す。

本願において、用語「変異」は、一般に野生型分子のヌクレオチド又はアミノ酸配列を変化させることを指す。ＤＮＡにおける変異はコドンを変化させることによって、アミノ酸配列における変化を引き起こすことができる。ヌクレオチドの変化は、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、核酸配列に対する選択的なスプライシング及び／又は短縮を含んでもよい。アミノ酸変化は、アミノ酸の置換、削除、欠失、挿入、付加、短縮、又はタンパク質の加工若しくは分割を含んでもよい。

本願において、用語「腫瘍」は、一般に任意の新たな病理学的組織の過形成を指す。腫瘍は、良性でもよいし、悪性でもよい。本願において、前記腫瘍は、固形腫瘍及び／又は血液腫瘍であってもよい。

本願において、用語「含む」は一般に、明確に指定された特徴を含み、ただし他の要素は排除しないことを指す。

「発明の詳細な説明」
１．基質タンパク質Ｍに改変が行われており、改変後の基質タンパク質Ｍの遺伝子配列は配列番号３に示されるとおりであることを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株。

２．ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株を元に、少なくとも、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株のＭタンパク質遺伝子に、５１位のメチオニンのアルギニンへの変異、１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異、２２６位のセリンのアルギニンへの変異である部位特異的変異導入を行って得られることを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株。

３．医薬品分野における実施形態１又は２に記載の腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用。

４．薬物又はワクチンの製造における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の使用であることを特徴とする、医薬品分野における実施形態３に記載の腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用。

５．実施形態１又は２に記載の弱毒化株に抗原を挿入して製造されたことを特徴とする腫瘍溶解性ウイルスワクチン。

６．前記抗原は、特異的腫瘍抗原であることを特徴とする実施形態５に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチン。

７．前記抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ３３、ｇｐ１００、ＴＸ１０３、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＷＴ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｂ２、ＰＲＡＭＥ、サバイビン（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ＭＡＲＴ－１、ｃｏｌ６Ａ３、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、Ｔ抗原（Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＬＣ４５Ａ２、ＶＣＸ／Ｙ、ＨＰＶ、α－フェトプロテイン、がん胎児性抗原、ＣＡ １２５、Ｈｅｒ２、ドーパクロムトートメラーゼ、ＢＡＧＥタンパク質、ＧＡＧＥタンパク質、サバイビン、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、サイクリンＡ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｍｅｌｏｅ、レングシン（Ｌｅｎｇｓｉｎ）、カリクレイン４、ＩＧＦ２Ｂ３、グリピカン３のいずれかであることを特徴とする実施形態６に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチン。

８．実施形態５～７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチンによって製造された抗腫瘍薬物又はがん治療薬。

９．前記薬物は、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチン及び免疫細胞を同時に含むことを特徴とする実施形態８に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチンによる抗腫瘍薬物又はがん治療薬。

１０．前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージのいずれかであり、
前記免疫細胞がＴ細胞であるときは、前記Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、γ／δ－Ｔ細胞のいずれかであり、前記Ｔ細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞であるときは、前記ＴＣＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルス又はｍＲＮＡ技術によってトランスフェクトされたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は血液の中から分離されたＴＣＲ－Ｔ細胞であり、前記免疫細胞がＮＫ細胞であるときは、前記ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－ＮＫのいずれかであり、前記免疫細胞がマクロファージであるときは、前記マクロファージは、ＣＡＲ－Ｍ細胞のいずれかであることを特徴とする実施形態９に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチンによって製造された抗腫瘍薬物又はがん治療薬。

１１．前記腫瘍又はがんは、頭頸部がん、黒色腫、軟部肉腫、乳がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、滑膜肉腫、円形細胞型脂肪肉腫のいずれかであることを特徴とする実施形態９又は１０に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチンによって製造された抗腫瘍薬物又はがん治療薬。

一．本発明は、正確に改変された腫瘍溶解性ウイルスによって製造された新規な腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を提供する。前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ）であり、具体的には、水疱性口内炎ウイルス・インディアナ株のＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株から選ばれ、そのＭタンパク質の遺伝子配列は、配列番号１に示されるとおりであり、Ｍタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示されるとおりである。本発明は、前記水疱性口内炎ウイルスに次の改変を行って、腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を得る。前記水疱性口内炎ウイルスのＭタンパク質遺伝子に部位特異的変異導入を行って、弱毒化株を得る。前記変異部位は、（１）５１位のメチオニン（Ｍ）のアルギニン（Ｒ）への変異、（２）１１１位のロイシン（Ｌ）のコード塩基ノックアウト、（３）２２１位のバリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）への変異、（４）２２６位のセリン（Ｓ）のアルギニン（Ｒ）への変異を含む。変異を完了した水疱性口内炎ウイルスの番号はＪＢＳ００３とし、ＸＮ２－Ｍ５１Ｒ－△Ｌ１１１－Ｖ２２１Ｆ－Ｓ２２６Ｒと命名し、そのＭタンパク質の遺伝子配列は、配列番号３に示されるとおりであり、Ｍタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４に示されるとおりである。

野生型ＶＳＶ及び他の既知のＶＳＶ弱毒化株と比べると、前記ＪＢＳ００３は、安全性がより高いため、抗原、サイトカインなどの物質のベクター（骨格）として、抗原、サイトカインなどと結合して、ワクチン又は薬物として使用することができる。また、ＪＢＳ００３は他の物質と結合せず、直接腫瘍溶解性ウイルスとして腫瘍免疫療法に使用することもでき、その方の効果も野生型ＶＳＶ及び他のＶＳＶ弱毒化株の治療効果より優れている。

二．本発明は、腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を元に、腫瘍溶解性ウイルスワクチンを提供する。上述したとおり、本発明において提供される弱毒化株は抗原と結合してワクチンを構成できる。本発明では、ＪＢＳ００３のＧタンパク質とＬタンパク質の間にＮＹ－ＥＳＯ－１を発現できる遺伝子を挿入して、腫瘍溶解性ウイルスワクチンを構築し、番号は、ＪＢＳ００４である。

ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ １）は、がん・精巣抗原（Ｃａｎｃｅｒ－Ｔｅｓｔｉｓ Ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＴＡ）ファミリーに属し、精巣、卵巣及び様々な腫瘍組織で発現されるが、他の正常な組織では発現されず、現在発見している腫瘍特異的抗原の中で免疫原性が最も強いものである。ＮＹ－ＥＳＯ－１は腫瘍組織によって発現量が異なり、タンパク質の発現が最も高いのは粘液様円形細胞型脂肪肉腫（８９～１００％）、神経芽細胞腫（８２％）、滑膜肉腫（９０％）、黒色腫（４６％）、卵巣がん（４３％）である。ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原は、免疫原性及び安全性を有し、免疫療法で使用される臨床的に優勢な抗原である。現在、再発・転移性の頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、軟部肉腫、乳がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫などはまだ効果的に治療できない。ＮＹ－ＥＳＯ－１を導入して構築されたＪＢＳ００４腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、体内の末梢リンパ系及び腫瘍組織において特異的抗腫瘍免疫応答を効率的に誘導することができる。試験は、抗腫瘍免疫療法、特に前記がん及び腫瘍に対する治療で、腫瘍溶解性ウイルスワクチンは免疫原性、有効性、標的化、安全性及び忍容性に明らかな利点があることを示していた。

三．本発明は、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンを元に、さらに、的確に腫瘍を治療できる薬物を提供する。前記薬物は、前記腫瘍溶解性ウイルス又は腫瘍溶解性ウイルスワクチンを含む。使用方法は次のとおりである。前記ＪＢＳ００３腫瘍溶解性ウイルス又はＪＢＳ００４腫瘍溶解性ウイルスワクチンを腫瘍内注射又は静脈内注射する。少量を複数回注射する方法を採用する。

治癒率を高めるための好ましい構成は次のとおりである。前記薬物はＴＣＲ－Ｔ細胞をさらに含む。前記ＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１受容体をトランスフェクトされたＴリンパ球であり、製造方法は具体的には次のとおりである。（１）ＮＣＧ－ＨＬＡ－Ａ２．１／Ｇｐｔヒト化マウス末梢血の中からＴリンパ球を分離し、（２）目標遺伝子ＮＹ－ＥＳＯ－１受容体配列を人工的に合成して遺伝子配列決定を行い、それとレンチウイルスベクターの組換えで、ＮＹ－ＥＳＯ－１受容体組換えレンチウイルスを得て、（３）前記ＮＹ－ＥＳＯ－１受容体組換えレンチウイルスを利用してＴリンパ球をトランスフェクトすることにより、ＮＹ－ＥＳＯ－１受容体をトランスフェクトされたＴリンパ球を得て、ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔと命名する。構築したＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔ細胞をインビトロで増幅させて、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）法でＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔ細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量を検出して、構築の成功を確認する。

腫瘍溶解性ウイルス又は腫瘍溶解性ウイルスワクチンとＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔの併用の方法は次のとおりである。最初に、ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔを１回静脈内注射し、続いて少量の腫瘍溶解性ウイルス又は腫瘍溶解性ウイルスワクチンを複数回腫瘍内注射又は静脈内注射する。

本願の一態様において、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株と比べると、基質タンパク質Ｍの遺伝子が改変されていることを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株を提供する。特定の実施形態では、前記ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍは、配列番号１に示される核酸配列を含む。

本願において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウトを含んでもよい。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍと比べると、１１１位のロイシンのコード塩基がノックアウトされている。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号７に示されるとおりである。

本願において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト及び５１位のメチオニンのアルギニンへの変異をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍと比べると、１１１位のロイシンをコードする塩基がノックアウトされており且つ５１位のメチオニンがアルギニンに変異している。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号８に示されるとおりである。

本願において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト及び２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異を含んでもよい。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍと比べると、１１１位のロイシンをコードする塩基がノックアウトされており且つ２２１位のバリンがフェニルアラニンに変異している。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号９に示されるとおりである。

本願において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異を含んでもよい。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍと比べると、１１１位のロイシンをコードする塩基がノックアウトされており且つ２２６位のセリンがアルギニンに変異している。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるとおりである。

本願において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異を含んでもよい。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍと比べると、１１１位のロイシンをコードする塩基がノックアウトされており、２２１位のバリンがフェニルアラニンに変異し且つ２２６位のセリンがアルギニンに変異している。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号１１に示されるとおりである。

本願において、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍの改変は、アミノ酸位置１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト、５１位のメチオニンのアルギニンへの変異、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異を含んでもよい。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍは、ＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍと比べると、１１１位のロイシンをコードする塩基がノックアウトされており、５１位のメチオニンがアルギニンに変異し、２２１位のバリンがフェニルアラニンに変異し且つ２２６位のセリンがアルギニンに変異している。特定の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号４に示されるとおりである。

本願の別の態様において、さらに、前記腫瘍溶解性ウイルスの基質タンパク質Ｍをコードできる核酸分子を提供する。例えば、前記腫瘍溶解性ウイルスの基質タンパク質Ｍをコードする核酸配列は、配列番号３に示されるとおりであってもよい。

本願の別の態様において、さらに、医薬品分野における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用を提供する。

本願において、医薬品分野における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のベクターとしての使用は、薬物又はワクチンの製造における前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の使用を含んでもよい。

本願の別の態様において、さらに、腫瘍溶解性ウイルスワクチンを提供し、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株に抗原を挿入して製造されてもよい。例えば、前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株に特異的腫瘍抗原を挿入して前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンを得てもよい。本願において、前記抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ３３、ｇｐ１００、ＴＸ１０３、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＷＴ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｂ２、ＰＲＡＭＥ、サバイビン（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ＭＡＲＴ－１、ｃｏｌ６Ａ３、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、Ｔ抗原（Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＬＣ４５Ａ２、ＶＣＸ／Ｙ、ＨＰＶ、α－フェトプロテイン、がん胎児性抗原、ＣＡ １２５、Ｈｅｒ２、ドーパクロムトートメラーゼ、ＢＡＧＥタンパク質、ＧＡＧＥタンパク質、サバイビン、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、サイクリンＡ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｍｅｌｏｅ、レングシン（Ｌｅｎｇｓｉｎ）、カリクレイン４、ＩＧＦ２Ｂ３及びグリピカン３からいずれか選ばれてもよい。例えば、本願において、構築された腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株をベクターとして、ＮＹ－ＥＳＯ－１を導入して、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンを得る。

本願において、さらに、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンの製造方法を提供し、前記方法は以下を含む。腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株プラスミドの構築として、制限酵素切断部位を有するリンク配列を人工的に合成し、生物学的手法及び遺伝子組換え技術を利用して、それを腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のＧタンパク質とＬタンパク質の間の非コード領域に挿入し、外来遺伝子を挿入して、外来遺伝子を有する弱毒化株組換えプラスミドを得て、ワクチンレスキューステップによって前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンを構築する。

本願の別の態様において、さらに、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチンによって製造された抗腫瘍薬物又はがん治療薬を提供する。

本願において、前記抗腫瘍薬物又はがん治療薬は、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチン及び免疫細胞を同時に含む。本願において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、ＴＩＬ細胞のいずれかを含んでもよく、前記免疫細胞がＴ細胞であるときは、前記Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、γ／δ－Ｔ細胞、遺伝子操作Ｔ細胞のいずれかを含んでもよく、前記Ｔ細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞であるときは、前記ＴＣＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルス又はｍＲＮＡ技術によってトランスフェクトされたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は血液の中から分離されたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は任意の技術で得たＴＣＲ－Ｔ細胞を含んでもよく、前記免疫細胞がＮＫ細胞であるときは、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ又はＣＡＲ－ＮＫのいずれかを含んでもよく、前記免疫細胞がマクロファージであるときは、前記マクロファージは、マクロファージ又はＣＡＲ－Ｍ細胞のいずれかを含んでもよい。本願において、前記腫瘍又はがんは、頭頸部がん、黒色腫、軟部肉腫、乳がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、滑膜肉腫及び／又は円形細胞型脂肪肉腫を含んでもよい。本願において、前記薬物は、薬学的に許容される担体を任意選択でさらに含んでもよい。

いかなる理論からも制限されないものではあるが、下記の実施例は本願に係る発明の各技術的解決手段を説明するためのもので、本願に係る発明の範囲を限定するためのものではない。

「実施例」
（実施例１）
１．表１の方式の通りに、前記水疱性口内炎ウイルス・インディアナ株に部位特異的変異導入を行って、７群の変異後の弱毒化株を得た。遺伝子変異のない群は、番号がＪＢＳ０００であり、対照とした。
[表１]
表１：各群の変異状況の表示

弱毒化株の具体的な構築方法は本分野の通常の技術であり、概要は次のとおりである。
（１）プラスミドの構築であった。ｐＶＳＶ－ＸＮ２プラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法を利用して表１に記載の異なる変異部位を導入した。プラスミドを各変異部位のプライマーと一緒にＰＣＲし、さらにＰＣＲ産物に対して１％アガロースゲル電気泳動を行い、続いてゲル回収キットにおいてゲルを切り出して回収して、Ｍ基質タンパク質の異なる変異を有するプラスミドを得た。

（２）ウイルスレスキューであった。ＭＯＩ＝５で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するポックスウイルスｖＴＦ７－３をＢＨＫ－２１細胞への感染で接種し、１時間感染した後、ＤＰＢＳバッファーを使用してＢＨＫ－２１細胞を１回すすぎ洗いした。続いてプラスミドトランスフェクションプレミックスを調製し、具体的には、ｐＢＳ－Ｎ、ｐＢＳ－Ｐ、ｐＢＳ－Ｌ、ステップ（１）において調製された変異プラスミドを含む。ここで、ｐＢＳ－Ｎ、ｐＢＳ－Ｐ、ｐＢＳ－Ｌは、それぞれ、ＶＳＶ Ｎ、ＶＳＶ Ｐ、ＶＳＶ Ｌタンパク質の遺伝子をクローニングされた発現プラスミドを指し、それぞれがウイルスレスキューに必要なＮ、Ｐ及びＬタンパク質を発現する。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００取扱説明書に記載の方法に従ってプラスミドトランスフェクションを行い、４時間後に新しい１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ完全培地に交換し、４８時間後に上清を吸い出して、０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過してポックスウイルスを除去した。濾液を新しいＢＨＫ－２１細胞に加え、毎日細胞の病変の状況を観察し、細胞に病変の状況が出現する時に上清を回収し、ＲＴＰＣＲ同定で成功を確認した後、ウイルスプラーク実験でウイルスを精製した。これで弱毒化株を得た。

（３）Ｍタンパク質遺伝子の配列決定であった。Ｔｒｉｚｏｌキットを利用してウイルスゲノムＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行い、Ｍタンパク質の遺伝子配列に対して設計したプライマーで、逆転写から得たｃＤＮＡをＰＣＲした。プライマー配列は、５'－ＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＣ－３'（配列番号５）、５'－ＡＣＡＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＧ－３'（配列番号６）であった。産物に１％アガロースゲル電気泳動を行って回収し、配列決定専門会社に送って配列決定を行わせた。

２．異なる弱毒化株の細胞に対するインビトロ感染能の表示であった。ＭＥＦ細胞（ヒト線維芽細胞）培養液、ＬＬＣ細胞（マウス非小細胞肺がん細胞）培養液に、それぞれＪＢＳ０００、ＪＢＳ００１、ＪＢＳ００２、ＪＢＳ００３、ＪＢＳ００８、ＪＢＳ００９、ＪＢＳ０１０、ＪＢＳ０１４を各２００ｐｆｕ加え、各群弱毒化株の５０％組織培養感染量（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ、ＴＣＩＤ５０）を検出した。試験方法は、具体的には次のとおりであった。
（１）６ウェル培養プレートの各ウェルに３ｍＬの細胞懸濁液を加えて、細胞量を４×１０^５個／ウェルとし、合計で６つのウェルであり、３７℃×５％ＣＯ_２の条件で１６時間培養した。

（２）各ウェルに、それぞれ、ウイルスＪＢＳ０００、ＪＢＳ００１、ＪＢＳ００２、ＪＢＳ００３、ＪＢＳ００８、ＪＢＳ００９、ＪＢＳ０１０、ＪＢＳ０１４を各２００ｐｆｕ加え、２つのウェルを正常細胞対照とした。２４時間で、１００μＬの細胞上清を取得した。

（３）９６ウェル培養プレートの各ウェルに、１００μＬのＶｅｒｏ細胞懸濁液を加えて、細胞量を１×１０^４個／ｍＬとし、３７℃×５％ＣＯ_２の条件で１６時間培養した。

（４）１．５ｍＬＥＰ管においてステップ（２）で得た上清を連続１０倍希釈して、１０^－１～１０^－１１と、合計で１１力価であった。

（５）希釈した上清をステップ（３）の９６ウェル培養プレートに接種し、各希釈度は１列接種し（合計で８ウェル）、各ウェルには１００μＬを接種した。１列を正常細胞対照群とした。

（６）４８時間後に各ウェルの細胞の蛍光状況を観察し、蛍光マーカーがあるのは当該ウェルが感染されていた。

（７）Ｋａｒｂｅｒ法でＴＣＩＤ５０を計算した。

結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。構築した各腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株のインビトロにおける肺がん細胞（ＬＬＣ）での複製増幅能が正常な線維芽細胞（ＭＥＦ）内での各腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の複製増幅能より強く、中でもＪＢＳ００３はインビトロにおける肺がん細胞（ＬＬＣ）での複製増幅能が強く、感染２４時間後に生成したウイルス粒子数が野生型ウイルスの場合に近かった。一方、正常な線維芽細胞（ＭＥＦ）内での各腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の複製感染能がいずれも低下していた。したがって、ＪＢＳ００３ベクターは、腫瘍細胞に比較的強い特異的感染能を有する。

３．異なる弱毒化株の細胞に対するインビトロ殺傷能の表示であった。同量の各弱毒化株を使用してそれぞれインビトロで異なる細胞を感染し、２４時間後にＭＴＴ法で細胞活性を検出した。方法は、具体的には次のとおりであった。
（１）９６ウェル培養プレートの各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液を加えて、細胞量を１×１０^４個／ウェルとし、３７℃×５％ＣＯ_２の条件で１６時間培養した。試験細胞のタイプは、ＬＬＣ、ＭＥＦ、Ｈｅｌａ（ヒト腫瘍細胞）であった。

（２）ＪＢＳ０００、ＪＢＳ００１、ＪＢＳ００２、ＪＢＳ００３、ＪＢＳ００８、ＪＢＳ００９、ＪＢＳ０１０、ＪＢＳ０１４を、それぞれ、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、感染多重度）がそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１．０になるよう希釈し、各希釈度は４つのウェルに接種し、各ウェルには１００μＬを接種し、３７℃×５％ＣＯ_２の条件で４０時間培養した。

（３）９６ウェル培養プレートから上清を捨て、新しいＤＭＥＤ培地を加えて、さらに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を加え、２０μＬ／ウェルとした。３７℃×５％ＣＯ_２の条件で４時間培養した。

（４）９６ウェルプレートを遠心分離し、速度を２５００ｇ／分に設定して、室温で５分間遠心分離した。続いて１ｍＬ使い捨て滅菌シリンジを使用して、軽やかに上清を吸い取った。

（５）さらに各ウェルにＤＭＳＯを加え、１００μＬ／ウェルとして、３７℃で１０分間静置した。

（６）マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、２分間振とうし、波長５７０ｎｍにて、各ウェルのＯＤ値を測定した。

結果を図２Ａ、図２Ｂ、及び図３に示す。結果は、各腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株がいずれも良好な腫瘍細胞殺傷能を示しており、ＪＢＳ０００を除いて、いずれもＭＥＦ細胞に顕著な殺傷がないことを示していた。即ち、インビトロ状態では、ＪＢＳ０００を除いて、各弱毒化株がいずれも腫瘍細胞を特異的に殺傷し、正常な細胞には顕著な影響がなかった。

４．異なる弱毒化株の細胞内における除去の難しさの試験であった。ＩＦＮ－βを試験の指標とした。前記ステップ３のステップ（１）、（２）に従って細胞を培養し弱毒化株を加えた。続いて各群の細胞を破砕し、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で各細胞の中からトータルＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラ）逆転写キットを利用してｃＤＮＡに逆転写し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）色素で染色し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０定量的ＰＣＲ装置において各遺伝子のＣｔ値を検出した。ΔΔＣｔ法で目標遺伝子のＩＦＮ－β、ＶＳＶ－Ｇの相対的発現量を計算した。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。ＬＬＣ細胞株では、ＪＢＳ０００を除いて、いずれの弱毒化株もＩＦＮ－β発現量の上昇を引き起こすことができ、中でもＪＢＳ００３ベクターの調節能が最も低く、ＭＥＦ細胞では、いずれのウイルスもＩＦＮ－βの発現量を上方制御することができ、中でもＪＢＳ００３の量は最も高く、野生型ウイルスベクター（ＪＢＳ０００）の３倍であった。つまり、ＪＢＳ００３は腫瘍細胞の中で除去されにくいが、正常な細胞では除去されやすい。

（実施例２：腫瘍溶解性ウイルスワクチンの構築及び効果表示）
１．実施例１において製造した各弱毒化株及び野生型ウイルスを元に、ＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子を挿入して、腫瘍溶解性ウイルスワクチンを構築し、構築模式図は、図５に示されるとおりである。各群の断片挿入状況は、表２に示されるとおりである。
[表２]
表２：各群の断片挿入状況の表示

前記ＪＢＳ００４～ＪＢＳ００７、ＪＢＳ０１１～ＪＢＳ０１３、ＪＢＳ０１５の具体的な製造方法は本分野の通常の技術であり、概要は次のとおりである。なお、次の内容は、ＪＢＳ００４～ＪＢＳ００７、ＪＢＳ０１１～ＪＢＳ０１３、ＪＢＳ０１５を下記の方法でしか製造しないように限定するものではなく、例を示しただけであった。

（１）弱毒化株プラスミドの構築であった。制限酵素切断部位Ｘｈｏ Ｉ及びＭｌｕ Ｉを有するリンク配列を人工的に合成し、生物学的手法及び遺伝子組換え技術を利用して、それを実施例１において調製した各弱毒化株のＧタンパク質とＬタンパク質の間の非コード領域に挿入して、各弱毒化株プラスミドを得た。

（２）外来遺伝子の挿入であった。各弱毒化株プラスミドをＸｈｏ Ｉ及びＭｌｕ Ｉで二重消化し、続いてＮＹ－ＥＳＯ－１外来遺伝子を挿入して、ＮＹ－ＥＳＯ－１を有する弱毒化株組換えプラスミドを得た。

（３）ワクチンレスキューであった。実施例１の「ウイルスレスキュー」の方法を参照して各弱毒化株組換えプラスミドに対応するワクチンをレスキューすることによって、各腫瘍溶解性ウイルスワクチンを構築した。

２．ＬＬＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１非小細胞肺がん（移植腫瘍）の治療効果の表示であった。

差異が顕著でない１３６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを選択して、それぞれ２×１０^５個のＬＬＣ細胞（マウス肺がん細胞）を皮下接種した。接種９日目に、移植腫瘍の体積が１００ｍｍ^３程度に増えたら、マウス全体を１７群（ｎ＝８）に分け、対照群（ＰＢＳ群）は５０μＬのＰＢＳを腫瘍内注射し、他の１６群は治療群として、それぞれ、ＪＢＳ０００、ＪＢＳ００１、ＪＢＳ００２、ＪＢＳ００３、ＪＢＳ００４、ＪＢＳ００５、ＪＢＳ００６、ＪＢＳ００７、ＪＢＳ００８、ＪＢＳ００９、ＪＢＳ０１０、ＪＢＳ０１１、ＪＢＳ０１２、ＪＢＳ０１３、ＪＢＳ０１４、ＪＢＳ０１５を腫瘍内接種し、２日に１回投与し、合計で３回の投与とし、１回接種量はいずれも１０^７ｐｆｕ／匹であった。投与開始から実験終了まで、移植腫瘍の体積を２日に１回記録し、体積（ｍｍ^３）＝（長径×短径^２）／２であった。がん細胞の転移率を検出し、検出方法は次のとおりであった。ＬＬＣ細胞は赤色蛍光タンパク質を有しているため、緑色蛍光顕微鏡下では黄色の蛍光を放つ。がん細胞が肺組織に転移していると、肺組織を顕微鏡下に置き、蛍光画像を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊによって画像の濃淡値を分析することで、肺がん細胞の割合を分析して、がん細胞の転移率を得た。

腫瘍体積の変化状況を図６～図８に示す。結果は、各治療群はいずれも移植腫瘍にある程度阻害効果があることを示していた。ＪＢＳ００３群で１匹が完治された。ＪＢＳ００４の移植腫瘍に対する治癒率は３７．５％に達していた。がん細胞の転移状況を図９に示す。図６～図９からは、移植腫瘍の体積と肺転移は多かれ少なかれある程度関連性があることが分かった。ＪＢＳ００３による肺転移巣の治療は、ＪＢＳ０００及びＪＢＳ００１群より優れており、ＪＢＳ００４の肺がん細胞転移を阻害又は防止する能力は他の群より優れていた。

３．ＭＣＡ－２０５－ＮＹ－ＥＳＯ－１線維肉腫（移植腫瘍）の治療効果の表示であった。

「ＬＬＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１非小細胞肺がん移植腫瘍の治療」方法でマウスを処理し、１０^６個のＭＣＡ－２０５－ＮＹ－ＥＳＯ－１線維肉腫細胞を皮下接種し、移植腫瘍の体積が１００ｍｍ^３程度に増えたら処理を行った。同様に５０μＬのＰＢＳ腫瘍内注射を対照群とし、治療で群では、それぞれ、ＪＢＳ００４、ＪＢＳ００５、ＪＢＳ００６、ＪＢＳ００７、ＪＢＳ０１１、ＪＢＳ０１２、ＪＢＳ０１３、ＪＢＳ０１５を腫瘍内接種し、各群は６匹の動物として、２日に１回投与し、合計で３回の投与とし、１回接種量はいずれも１０^８ｐｆｕ／匹であった。投与開始から実験終了まで、移植腫瘍の体積を２日に１回記録した。結果を図１０、図１１に示す。結果は、各治療群がいずれも腫瘍の体積をある程度低減できることを示していた。ＪＢＳ００４での治療後に、２匹のマウスは移植腫瘍が完全に解消しており（割合３３．３３％）、残りのマウスは腫瘍体積も効果的に制御されており、他の群と差異が顕著であった。ＪＢＳ００４による線維肉腫治療の全奏効率は１００％であった。

４．Ｂ１６－Ｆ１０－ＮＹ－ＥＳＯ－１黒色腫（移植腫瘍）の治療効果の表示であった。

前記移植腫瘍試験の処理方法でマウスを処理し、２×１０^６個のＢ１６－Ｆ１０－ＮＹ－ＥＳＯ－１黒色腫細胞を皮下接種し、移植腫瘍の体積が１００ｍｍ^３程度に増えたら処理を行った。同様に５０μＬのＰＢＳ腫瘍内注射を対照群とし、治療で群では、それぞれ、ＪＢＳ００４、ＪＢＳ００５、ＪＢＳ００６、ＪＢＳ００７、ＪＢＳ０１１、ＪＢＳ０１２、ＪＢＳ０１３、ＪＢＳ０１５を腫瘍内接種し、各群は６匹の動物として、２日に１回投与し、合計で３回の投与とし、１回接種量はいずれも１０^８ｐｆｕ／匹であった。投与開始から実験終了まで、移植腫瘍の体積を２日に１回記録した。結果を図１２、図１３に示す。結果は、各治療群はいずれも黒色腫にある程度治療効果を有しており、ＪＢＳ００４群が効果は特に良好であったことを示していた。

５．異なる用量のＪＢＳ００４の効果表示であった。

６～８週齢で、体重が１８ｇ程度のＣ５７ＢＬ／６マウスを選択して、それぞれ２×１０^５個のＬＬＣ細胞（マウス肺がん細胞）を皮下接種した。接種９日目に、移植腫瘍の体積が１００ｍｍ^３程度に増えたら、マウス全体を５群に分け、各群は６匹の動物であった。対照群（ＰＢＳ群）は５０μＬのＰＢＳを腫瘍内注射し、他の４群は治療群として、それぞれ、ＪＢＳ００４を１０^６ｐｆｕ／匹、１０^７ｐｆｕ／匹、１０^８ｐｆｕ／匹、１０^９ｐｆｕ／匹腫瘍内接種し、２日に１回投与し、合計で３回の投与とした。投与開始から実験終了まで、移植腫瘍の体積を２日に１回記録し、結果を図１４、図１５に示す。かつ、実験終了時に、安楽死させたマウスを剖検し、マウスから肺組織を取って、がん細胞の転移率を検出し、結果を図１６に示す。結果は、異なる用量のＪＢＳ００４がいずれも肺がんマウスにある程度治療効果を有することを示しており、１０^８ｐｆｕ／匹の用量では、治癒率が３３．３３％に達し、有効制御率が３３．３３％に達しており、肺のがん細胞転移を発見しなかった割合は６６．６７％であり、他の用量群よりも顕著に優れていた。

また、図１７、図１８に示されるとおり、実験全体を通して、マウスの体温と体重はいずれも正常な範囲に維持されており、体温と体重が異常になる状況が出現しなかったのは、異なる用量のＪＢＳ００４が肺がんマウスの体温と体重に顕著な影響がないことを示していた。体重をみると、ＰＢＳ群でマウスの体重が着実に増加したが、他の治療群のマウスには増加が緩慢になる状況が出現し、その原因として移植腫瘍の縮小に関係していることが考えられ、実験終了時に、各群のマウスの体重には顕著な差異がなかった。ＪＢＳ００４の安全性が良好であることを証明した。

（実施例３：ＪＢＳ００４の薬物動態及び急性毒性実験の結果表示）
１．薬物動態実験であった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択して、２×１０^５個のＬＬＣ細胞を皮下接種し、接種９日目の頃に、移植腫瘍の体積が１００ｍｍ^３程度に増えたら、ＬＬＣ移植腫瘍モデルを確立した。ＪＢＳ００４を１０^８ｐｆｕ／匹単回腫瘍内注射して、それぞれ、０分（＋１５分）、６時間、１２時間、４８時間、９６時間、１２０時間及び１４日目に腫瘍組織のサンプルを採取し（３回繰り返した）、自動グラインダーで組織を破砕して、Ｔｒｉｚｏｌで腫瘍組織からトータルＲＮＡを抽出し、最終に定量的ＰＣＲ（蛍光プローブ法）を利用してウイルスの核酸コピー数を分析した。結果を図１９、図２０に示す。結果は、感染６時間で腫瘍内のウイルス量がピーク値に達しており、初期と比べて、約５００倍複製しており、感染４８時間後に、ウイルス量が初期注射量を下回るようになり、１４日後に、ウイルスの核酸コピー数が検出できなかったことを示していた。したがって、ＪＢＳ００４は迅速かつ効率的に腫瘍内で複製することができ、１４日後に、ＪＢＳ００４が検出されなかったのは、それが体内に長時間蓄積して、後に損傷をきたす恐れがなく、安全性が良好であることを証明した。

２．急性毒性実験であった。４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを選択して、雌と雄が半々であった。３つの投与群に分けて、ＪＢＳ００４溶液を単回筋肉内注射投与し、各群の投与量は、それぞれ、１０^３ｐｆｕ／匹、１０^６ｐｆｕ／匹、１０^９ｐｆｕ／匹であった。ブランク対照群には溶媒対照を単回投与し（ＰＢＳを単回筋肉内注射した）、投与体積はいずれも１００μＬであった。動物への投与の日は当該群の動物の観察の初日と規定した。動物への投与後に１４日間観察し、投与後１５日目に解剖した。

実験中に、マウスの体温及び体重を２日に１回記録し、結果を図２１～図２４に示す。投与前及び投与後３０分、１時間、２時間、４時間、１０時間にマウスをケージ越しに詳しく観察し、その後の実験で毎日に少なくとも１回ケージ越しに観察した。実験終了時に、血液学及び血液生化学的検出（血糖、クレアチニン、尿素窒素、血中尿素窒素／クレアチニン、リンイオン、カルシウムイオン、総タンパク質、アルブミン、グロブリンなど）のために、マウスから末梢血を採取して、剖検して主要臓器を採取し、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、精巣／卵巣の組織の重量を量り、臓器係数を計算した。紙面の都合上、ここでは血液学及び血液生化学検出の全ての指標のデータを示していなかった。検出結果は、マウスが異常に死亡した状況が見られず、ＪＢＳ００４関連の臨床症状が出現しなかったことを示していた。異なる用量のＪＢＳ００４を注射してもマウスの臓器重量に顕著な影響がなく、マウスの血液学及び血液生化学指標に顕著な影響がなかった。本実験条件では、最大耐量（ＭＴＤ）が少なくとも１０^９ｐｆｕ／匹であった。したがって、前記最適用量（１０^８ｐｆｕ／匹）は安全用量内であった。

（実施例４：ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔの構築）
ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔは、ＮＹ－ＥＳＯ－１受容体組換えレンチウイルスでＴリンパ球をトランスフェクトして得られたＴ細胞であり、具体的な構築方法は本分野の通常の技術であり、概要は次のとおりである。
（１）公開されているＮＹ－ＥＳＯ－１の受容体遺伝子配列に基づいてＮＹ－ＥＳＯ－１受容体遺伝子を人工的に合成した。

（２）組換えレンチウイルスベクターの構築であった。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、プライマーは、ＥＳＯ ＴＣＲ－Ｆ１：５'－ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴ－３'（配列番号１２）、ＥＳＯ ＴＣＲ－Ｒ１：５'－ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡ－３'（配列番号１３）であった。

クローニングされたＥＳＯ ＴＣＲ ｃＤＮＡを鋳型としてインビトロＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ反応条件は、９４℃×３分間予備変性し、９４℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×４５秒であり、３５サイクル後に７２℃で５分間延長させた。１．２％アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ増幅させた特異的断片（１８２４ｂｐ）を分離した。ＥｃｏＲ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉで、それぞれ、ＰＣＲ産物、ｐＣＬ２０ｃ－ＭＳＣＶ－ＧＦＰプラスミドを二重消化し、グラスミルクゲルで消化産物を回収した。２つの消化産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼで接続させて、１６℃で一晩保持させた。次に、接続産物でコンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、培養増幅後にプラスミドミニプレップ抽出キットでプラスミドを抽出した。

（３）ｐＣＬ２０ｃ－ＭＳＣＶ－ＥＳＯ ＴＣＲ組換えレンチウイルスベクターの同定であった。ｐＣＬ２０ｃ－ＭＳＣＶ－ＥＳＯ ＴＣＲ プラスミドをＥｃｏＲ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、ＰＣＲして配列決定させた。

（４）ｐＣＬ２０ｃ－ＭＳＣＶ－ＥＳＯ ＴＣＲ組換えレンチウイルスのパッケージングであった。Ｔ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地で、９５％湿度×５％ＣＯ_２×３７℃インキュベーターにおいて通常培養し、週に３～４回継代した。トランスフェクション１日前に、５×１０^６～６×１０^６個のＴ２９３細胞をＤ＝１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに接種した。トランスフェクション２時間前に、１０ｍＬの新しい１０％ＤＭＥＭ培地に交換した。

トランスフェクション１時間前にトランスフェクション試薬を調製し、トランスフェクション試薬はＡ剤とＢ剤からなる。Ａ剤は、ｐＣＬ２０ｃ－ＨＩＶ－ｇｐプラスミド ６μｇ、ｐＣＡＧ４－ＲＴＲ２プラスミド ２μｇ、ＣＡＧ－ＶＳＶ－Ｇプラスミド ２μｇ、ｐＣＬ２０ｃ－ＭＳＣＶ－ＥＳＯＴＣＲプラスミド １０μｇ、２．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ_２ ５０μＬであり、脱イオン水で５００μＬに補足して、軽く叩いて均一に混合させ、室温で５分間静置した。Ｂ剤は、２×ＨＢＳＳ（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ＝７．０２）５００μＬであった。Ａ剤をＢ剤に滴加し、滴加と同時に振とうし、室温で２０分間静置したら、トランスフェクション試薬を得た。インキュベーターからディッシュを取り出して、自分のほうに１５°傾斜させて、トランスフェクション試薬を慎重にディッシュの低いほうに滴加し、滴加と同時に左右に振って均一に混合させ、インキュベーターにおいて１６時間又は一晩培養した。続いて１０ｍＬの新しい成長培地に交換した。４８時間トランスフェクション後に上清を回収し、－８０℃で保存した。パッケージング上清を１００ｍＬ取り分けて、室温で溶け、２０００ｇで３０分間遠心分離して、上清を回収し、０．４５μｍＰＶＤＦメンブレンで濾過し、１２０００ｇで３時間高速遠心分離して、１ｍＬの無血清ＤＭＥＭを加え、ウイルスペレットを再懸濁させ、１００μＬ／管で分注して、－８０℃で保存した。

（５）末梢血からのＴ細胞の分離であった。ＮＣＧ－ＨＬＡ－Ａ２．１／Ｇｐｔヒト化マウス末梢血の中からＴリンパ球を分離して、細胞分離液を加え、１５００ｇ／分で１５分間遠心分離し、２層目の環状の乳白色のリンパ球層を採取して、５ｍＬの細胞洗浄液を加え、充分かつ均一に混合した後、１８００ｇ／分で２０分間遠心分離して、上清を捨てた後、沈殿したリンパ球を再懸濁させた。

（６）組換えレンチウイルスとＴ細胞のコトランスフェクションであった。再懸濁させたリンパ球を２×１０^５個／ｍＬに調整して、６μｇ／ｍＬ ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）と１０^４ｐｆｕ単位の適量のウイルスを加え、繰り返し均一に混合させ、３７℃でインキュベートして、引き続き３～４日培養した後に、ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔを得た。

（実施例５：腫瘍溶解性ウイルスワクチンとＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔの併用の効果表示）
６～８週齢で、体重が１８～２０ｇのＮＣＧ－ＨＬＡ－Ａ２．１／Ｇｐｔヒト化マウスを選択して、それぞれ、２×１０^５個の非小細胞肺がんＡ５４９細胞を皮下接種し、同一の適切な条件で培養し移植腫瘍の体積が１００ｍｍ^３程度になった時、処理を始めた。各群の処理条件は表３に示されるとおりであった。表３で、ＪＢＳ ＮＹ ＴＣＲ－Ｔ細胞の接種量は１０^６個で、単回静脈内注射の方式で実行した。ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔ細胞と腫瘍溶解性ウイルスワクチンを併用する場合に、ＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔ細胞の静脈内注射２４時間後に対応する腫瘍溶解性ウイルスワクチンを腫瘍内注射した。腫瘍溶解性ウイルスワクチンを２日に１回注射し、合計で３回の投与とし、１回接種量はいずれも１０^８ｐｆｕ／匹であった。
[表３]
表３：各群の処理の表示

投与開始から実験終了まで、移植腫瘍の体積を２日に１回記録した。結果を図２５、図２６に示す。各群の肺がん細胞の転移状況を検出し、結果を図２７に示す。結果は、対照群を除いて、各群がいずれも移植腫瘍の体積にある程度阻害効果を有することを示しており、また、喜ぶべきことに、ＪＢＳ００４にＪＢＳ－ＮＹ ＴＣＲ－Ｔを併用すると治療効果が顕著に改善され、２５％の治癒率から９２～９５％の治癒率に上昇していたことが判明したため、併用治療の利点を示していた。肺がん細胞の転移阻害にも優れた効果を示していた。

例を挙げて説明する形態で提供される上記の詳細な説明は、特許請求の範囲に範囲を限定するためのものではない。本願において挙げられた実施形態の様々な変化は当業者にとって自明なものであり、且つ特許請求の範囲とその同等物に含まれる。

Claims (10)

1. アミノ酸配列が配列番号２に示されるＶＳＶ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の基質タンパク質Ｍが改変された腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株であって、前記改変は、５１位のメチオニンのアルギニンへの変異、１１１位のロイシンをコードする塩基のノックアウト、２２１位のバリンのフェニルアラニンへの変異及び２２６位のセリンのアルギニンへの変異であることを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株。
2. 前記腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の基質タンパク質Ｍのアミノ酸配列は、配列番号４に示される、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株。
3. 薬物又はワクチンの製造における請求項１又は２に記載の腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株の使用。
4. 請求項１～３のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス弱毒化株に抗原を挿入して製造されたことを特徴とする腫瘍溶解性ウイルスワクチン。
5. 前記抗原は、特異的腫瘍抗原であることを特徴とする請求項４に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチン。
6. 前記抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ３３、ｇｐ１００、ＴＸ１０３、ムチン１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＷＴ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｂ２、ＰＲＡＭＥ、サバイビン（ＳＵＲＶＩＶＩＮ）、ＭＡＲＴ－１、ｃｏｌ６Ａ３、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、Ｔ抗原（Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＬＣ４５Ａ２、ＶＣＸ／Ｙ、ＨＰＶ、α－フェトプロテイン、がん胎児性抗原、ＣＡ １２５、Ｈｅｒ２、ドーパクロムトートメラーゼ、ＢＡＧＥタンパク質、ＧＡＧＥタンパク質、サバイビン、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、サイクリンＡ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｍｅｌｏｅ、レングシン（Ｌｅｎｇｓｉｎ）、カリクレイン４、ＩＧＦ２Ｂ３、グリピカン３のいずれかであることを特徴とする請求項４又は５に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチン。
7. 請求項４～６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスワクチンによって製造された抗腫瘍薬物又はがん治療薬。
8. 前記薬物は、前記腫瘍溶解性ウイルスワクチン及び免疫細胞を同時に含むことを特徴とする請求項７に記載の抗腫瘍薬物又はがん治療薬。
9. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、ＴＩＬ細胞のいずれかであり、前記免疫細胞がＴ細胞であるときは、前記Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、γ／δ－Ｔ、遺伝子操作Ｔ細胞のいずれかであり、前記Ｔ細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞であるときは、前記ＴＣＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルス又はｍＲＮＡ技術によってトランスフェクトされたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は血液の中から分離されたＴＣＲ－Ｔ細胞、又は任意の技術で得たＴＣＲ－Ｔ細胞であり、前記免疫細胞がＮＫ細胞であるときは、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞又はＣＡＲ－ＮＫのいずれかであり、前記免疫細胞がマクロファージであるときは、前記マクロファージは、マクロファージ又はＣＡＲ－Ｍ細胞のいずれかであることを特徴とする請求項８に記載の抗腫瘍薬物又はがん治療薬。
10. 前記腫瘍又はがんは、頭頸部がん、黒色腫、軟部肉腫、乳がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、滑膜肉腫、円形細胞型脂肪肉腫のいずれかであることを特徴とする請求項７～９のいずれか１項に記載の抗腫瘍薬物又はがん治療薬。