KR20230002564A - 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포와 결합된 종양 치료 약물 - Google Patents

종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포와 결합된 종양 치료 약물 Download PDF

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구어칭 저우
허 양
판 장
수홍 장
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Abstract

본 출원은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주, 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포와 결합된 종양 치료 약물에 관한 것이다. 본 발명은 VSV 야생형 바이러스 기질 단백질M에 대해 부위 지정 돌연변이를 수행하여 새로운 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 제공한다. 본 발명은 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기초 상에서, 종양 치료에 적용될 수 있는 백신을 더 제공한다. 상기 백신은 치유율이 높고, 생물 안정성이 높다. 본 발명은 상기 백신의 기초 상에서, 백신과 면역 세포를 병용하여 여러 유형의 종양을 고효율적으로 치료할 수 있는 약물을 제공한다.

Description

종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포와 결합된 종양 치료 약물
본 출원은 생물 의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포와 결합된 종양 치료 약물에 관한 것이다.
국립 암센터가 2019년 1월에 발표한 전국 암 통계 데이터에 따르면, 2015년 악성 종양 발생은 약 392.9만명이고, 사망자는 약 233.8만명이다. 평균적으로 매일 1만명이 암 진단을 받고, 1분에 7.5명이 암 진단을 받는다. 간암, 대장암, 여성 유방암과 같은 고형암은 여전히 중국의 주요 악성 종양이다. 악성 종양(암)은 중국 인구의 건강을 심각하게 위협하는 주요 공중 보건 문제 중 하나가 되었다. 현재의 암 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법 및 분자 표적 치료 등 다학과적 종합 치료에서 큰 발전을 이루었지만 종양의 재발과 전이에 효과적인 치료 수단은 없었다. 따라서, 새로운 치료 수단, 즉 종양 면역 치료는 점차적으로 사람들의 관심을 받고 있다.
2003년, Giedlin MA는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)는 종양을 치료하는 종양 용해성 바이러스로 사용될 수 있다고 제안하였다. 그 원리는 정상 세포에서 내인성 IFN-β와 상호 작용할 수 없고, 종양 세포에서만 선택적으로 확장, 성장할 수 있다는 것이다. 2009년, 캐나다 맥마스터대학교의 연구에 따르면, VSV는 면역 응답을 촉진하는 새로운 종양 백신 담체로 사용될 수 있다. 최근 몇 년 동안, VSV의 관련 연구는 연구원들에 의해 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 안전성의 관점에서 볼 때, VSV는 인간에게 비교적 안전하고, 현재 인간에서 VSV 감염 사례는 없다.
VSV는 뉴클레오캡시드 단백질(N), 인단백질(P), 기질 단백질(M), 당단백질(G) 및 대형 중합 효소 단백질(L)과 같은 5가지 단백질을 인코딩하는 게놈 크기가 11kb인 원형 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스이다. VSV는 저밀도 지단백질 수용체, 포스파티딜세린, 시알당지질 및 헤파란 설페이트를 비롯한 다양한 세포 표면 분자를 발현하고, 이러한 분자를 통해 세포 표면에 부착될 수 있다. 빠른 복제 및 시냅스 횡단 속도, 외인성 유전자의 높은 발현이 특징이다. 현재 연구개발 중인 다른 종양 용해성 세포 바이러스 플랫폼에 비해, VSV게놈이 작고, 조작이 용이하며; 복제 시간이 더 짧고; 독립적인 세포 주기가 있으며; 광범위한 세포계에서 빠르게 성장하고, 역가가 높아 대규모 생산이 가능하며; 숙주 세포의 세포질 복제는 형질전환의 위험이 없다. 이러한 종양 용해성 바이러스는 DNA에 통합되지 않고, 약독화되어 야생형 바이러스로 인한 신경계 염증을 방지할 수 있다. 따라서, VSV는 종양 면역 치료에서 큰 잠재력을 갖는다.
종양 모델 동물에서, 연구에 따르면 VSV는 뇌종양을 유의하게 제거할 수 있고, 유방암과 골육종에도 유의한 억제 작용이 있다. 연구자들은 간암에 대한 VSV의 항종양 기능 및 독성 부작용의 연구를 통해 간암에 걸린 마우스의 생존 기간이 유의하게 증가하고, 유의한 독성 부작용이 발생하지 않았다. VSV-GP 처리 후 전립선암 마우스의 피하 종양 및 골전이암은 유의하게 감소되고; 흑색종에 걸린 마우스의 제자리 종양 및 폐 전이암도 유의하게 개선된다. M51R VSV는 대장암 세포의 사멸을 직접적으로 유도할 수 있다. 동시에, VSV도 선천 면역 또는 후천 면역을 조절하여 종양 발달에 추가로 영향을 미칠 수 있다. M51R VSV는 대장암 조직의 면역 억제 세포MDSC, 대식세포의 침윤을 감소시키고, CD4+T세포의 침윤을 증가함으로써 악성 복수의 형성을 감소시킨다. VSV는 CD8 특이성 T세포의 면역 응답을 유도하고, 기타 면역 억제 세포의 작용을 감소시킴으로써 종양 백신의 효능을 향상시킬 수 있다. 이상 연구에 따르면 VSV는 강한 항종양 작용이 있고, 우수한 안전성을 갖는다.
현재 연구에 따르면, VSV를 단독으로 사용하여 종양 면역 치료할 경우, 치료 반응률은 일정한 병목 현상이 있고, 이는 주로 특이성 부족 및 종양 내 미세 환경의 억제 작용과 관련된다. 따라서, VSV와 다른 치료의 병용도 점점 증가하고 있다. 유두종 마우스 모델의 연구에 따르면, 종양 백신과 결합된 VSV가 항종양 효과를 유의하게 향상시키는 것을 발견하였다. 미네소타대학교 의학원의 Manish R. Patel 등은 JAK/STAT억제제(Ruxolitinib)와 VSV-IFNβ를 결합하여 폐암 치료에 사용한 결과, Ruxolitinib과 VSV-IFNβ를 결합하여 우수한 종양 용해성 치료 효과를 수득하였음을 발표하였다. 다양한 사이토카인 무장 종양 용해성 바이러스는 CAR-T세포 요법과 병용되기도 하고; 이종 이식 종양 모델에서, 이러한 결합 전략은 항종양 활성을 향상시켰다.
T세포 수용체 유전자 변형된 T세포(T cell receptor gene engineered T cells, TCR-T) 요법은 변형된 T세포를 기반으로, 악성 종양의 입양 세포 면역 치료에 적용되고, TCR은 MHC분자가 제시하는 항원을 인식하도록 T세포를 매개함으로써 항원 특이성 T세포가 종양 표적 세포에 면역 효과를 발휘하도록 한다. 기존의 연구는 VSV와 TCR-T를 병용하여 종양을 치료하는 것이 가능하도록 한다. VSV는 종양 세포 내의 선택적 복제를 통해 종양 세포를 용해시킬 수 있고, 용해된 종양 세포는 종양 특이성 면역 응답을 유도할 수 있으며, T세포의 활성화, 증폭, 모집을 촉진하고, 활성화된 T세포는 종양 내에서 면역 억제 조절과 같은 방식으로 종양 세포를 사멸할 수 있다. 양자의 병용은 이론적으로 VSV 요법 또는 TCR-T 요법을 단독으로 사용하는 경우보다 우수한 효과를 발휘한다.
그러나 VSV와 TCR-T를 병용하여 종양 면역 치료할 경우, 여전히 다음과 같은 문제가 존재한다. (1)VSV 야생형 또는 약독화 균주를 TCR-T와 병용하면 치유율이 높지 않고, 한가지 요법을 단독으로 사용하는 경우에 비해 효과가 유의하게 향상되지 않으며; (2)야생형 VSV는 여전히 일정한 안전 위험이 존재하고, 현재 설치류 동물에 대하여 강한 신경 독성이 있는 것으로 알려졌으며, 임상 사용을 고려하여 질병의 위험을 보다 줄이기 위해 유전자 변형이 필요하고; (3)무작위 유전자 변형은, 종양 용해 효과가 좋지 않을 수 있거나, 성공적으로 포장되지 않을 수 있어 재조합 바이러스를 전혀 제조할 수 없다.
따라서, 안전성이 우수하고, 치유율이 높은 VSV재조합 바이러스를 제공하여 이를 TCR-T 및 다른 면역 세포와 약물로서 병용함으로써 종양 유전자 치료 분야에서 중요한 과학적 연구 가치와 응용 의미를 갖는다.
본 발명의 목적은 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포와 결합된 종양 치료 약물을 제공하는 것이다.
상기 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서 사용된 기술적 해결수단은, 기질 단백질(M)의 유전자 서열이 SEQ ID NO 3으로 표시되는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주이다.
상응하게, 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 있어서, 상기 약독화 균주는 VSV MuddSummer 아형 균주를 기반으로 하고, 적어도 51번째 메티오닌(M)이 아르기닌(R)으로의 돌연변이; 111번째 류신(L) 인코딩 염기의 녹아웃; 221번째 발린(V)이 페닐알라닌(F)으로의 돌연변이; 226번째 세린(S)의 아르기닌(R)으로의 돌연변이와 같은 위치 지정 유전자 돌연변이를 수행한 후 수득된다.
상응하게, 담체로서 의약 분야에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용이다.
바람직하게, 약물 또는 백신의 제조에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용이다.
상응하게, 종양 용해성 바이러스 백신은, 상기 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조된다.
상응하게, 종양 용해성 바이러스 백신은, 상기 약독화 균주에 종양 항원을 삽입하여 제조된다.
바람직하게, 상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3, 글리피칸3 및 다른 종양 항원에서의 임의의 하나이다.
상응하게, 종양 면역 치료 약물의 제조에서의 상기 종양 용해성 바이러스 백신의 응용이다.
바람직하게, 상기 약물은 상기 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포를 동시에 포함하는데, 상기 면역 세포는 T세포, NK세포, 대식세포(macrophage) 또는 다른 면역 세포이다.
바람직하게, 상기 면역 세포가 T세포인 경우, 상기 T세포는 TCR-T세포, CAR-T세포, γ/δ-T세포에서의 임의의 하나이고; 상기 T세포가 TCR-T세포인 경우, 상기 TCR-T세포는 렌티바이러스로 형질감연된 TCR-T세포이거나, 혈액에서 분리한 TCR-T세포이며; 상기 면역 세포가 NK세포인 경우, 상기 NK세포는 CAR-NK에서의 임의의 하나이고; 상기 면역 세포가 대식세포(macrophage)인 경우, 상기 대식세포(macrophage)는 CAR-M세포에서의 임의의 하나이다.
바람직하게, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종, 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나이다.
본 발명은 다음과 같은 유리한 효과가 있다. 본 발명은 VSV 야생형 바이러스의 기질 단백질M에 대한 부위 지정 돌연변이를 통해, 새로운 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 제공하고, 상기 약독화 균주는 단독으로 약물로서 종양을 치료할 수 있으며, 안전성과 치유율은 모두 야생형 바이러스 및 기타 약독화 균주보다 우수하다. 상기 약독화 균주는 또한 항원 또는 사이토카인에 연결되는 담체(골격)로 사용될 수 있어 항원 또는 사이토카인과 같은 물질이 원하는 위치에 전달되어 백신 또는 약물이 되고; 구체적으로 연결된 항원 또는 사이토카인의 종류는 실제적으로 치료가 필요한 종양 또는 기타 질환의 유형에 따라 결정될 수 있으며, 적응성이 강하다. 본 발명은 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기초 상에서, 약독화 균주에 외인성 유전자NY-ESO-1을 삽입하여 종양 치료에 적용될 수 있는 백신을 더 제공한다. 상기 백신은 치유율이 높고, 생물 안정성이 높다. 본 발명은 상기 백신의 기초 상에서, 백신을 TCR-T세포와 병용하여 여러 유형의 종양을 효율적으로 치료할 수 있는 약물을 제공하고; 마우스의 폐암 모델에서, 치유율은 놀라운 95%에 도달할 수 있다.
한편으로, 본 출원은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 제공하는데, VSV MuddSummer 아형 균주와 비교하여 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M 유전자가 변형되고, 상기 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃과 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 226번째 세린이 아르기닌으로 돌연변이된 아미노산 돌연변이를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이; 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에서의 임의의 하나를 갖는다.
다른 양태에서, 본 출원은 담체로서 의약 분야에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 담체로서 의약 분야에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용은, 약물 또는 백신의 제조에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 출원은 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 백신을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은, 상기 항원이 특이성 종양 항원인 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은, 상기 항원이 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3, 글리피칸3에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 출원은 상기 종양 용해성 바이러스 백신으로부터 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 항종양 약물 또는 암 치료 약물은 상기 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포를 동시에 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항종양 약물 또는 암 치료 약물에 있어서, 상기 면역 세포는 T세포, NK세포, 대식세포, DC세포, TIL세포에서의 임의의 하나이고, 상기 면역 세포가 T세포인 경우, 상기 T세포는 TCR-T세포, CAR-T세포, γ/δ-T세포, 유전자 편집된 T세포에서의 임의의 하나이며; 상기 T세포가 TCR-T세포인 경우, 상기 TCR-T세포는 렌티바이러스 또는 mRNA기술로 형질감염된 TCR-T세포이거나, 혈액에서 분리한 TCR-T세포이거나, 임의의 기술로 얻은 TCR-T이고; 상기 면역 세포가 NK세포인 경우, 상기 NK세포는 NK 또는 CAR-NK에서의 임의의 하나이며; 상기 면역 세포가 대식세포인 경우, 상기 대식세포는 대식세포 또는 CAR-M세포에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 상기 항종양 약물 또는 암 치료 약물에 있어서, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종, 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이하의 상세한 설명으로부터 본 출원의 다른 측면 및 이점을 용이하게 인식할 수 있다. 이하의 상세한 설명은 본 출원의 예시적인 실시형태만을 도시하고 설명한다. 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 출원의 내용은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 출원과 관련된 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 구체적인 실시형태를 변경할 수 있다는 것을 알 수 있다. 상응하게, 본 출원의 첨부 도면 및 명세서의 설명은 단지 예시적일뿐 제한적이지 않다.
본 출원에 관련된 발명의 구체적인 특징은 첨부된 특허청구범위에 의해 나타난다. 이하의 상세한 설명의 예시적인 실시형태 및 첨부 도면을 참조하여 본 출원과 관련된 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있다. 첨부 도면에 대해 다음과 같이 간략하게 설명한다.
도 1a-도 1b는 체외의 LLC세포 및 MEF세포에서 각 약독화 균주의 복제 능력 모식도이다.
도 2a-도 2b는 체외의 LLC세포 및 Hela세포에 대한 각 약독화 균주의 사멸 능력 모식도이다.
도 3은 체외의 MEF세포에 대한 각 약독화 균주의 사멸 능력 모식도이다.
도 4a-도 4b는 체외 LLC세포 및 MEF세포에서 IFN-β의 발현 수준에 대한 각 약독화 균주의 영향 모식도이다.
도 5는 종양 용해성 바이러스 백신의 구성 모식도이다.
도 6은 각 약독화 균주가 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 7은 각 백신이 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 8은 실험 종료 시, 각 약독화 균주 및 백신으로 처리된 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 9는 각 약독화 균주 및 백신이 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 10은 각 백신이 마우스 체내에서 섬유육종(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 11은 실험 종료 시, 각 백신으로 처리된 마우스 체내에서 섬유육종(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 12는 각 백신이 마우스 체내에서 흑색종(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 13은 실험 종료 시, 각 백신으로 처리된 마우스 체내에서 흑색종(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 14는 상이한 용량의 JBS004가 마우스 체내 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 15는 실험 종료 시, 상이한 용량의 JBS004로 처리된 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 16은 상이한 용량의 JBS004가 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 17은 상이한 용량의 JBS004가 폐암 마우스의 체중에 미치는 영향의 모식도이다.
도 18은 상이한 용량의 JBS004가 폐암 마우스의 체온에 미치는 영향의 모식도이다.
도 19는 PCR 검출 방법의 정량적 표준 곡선이다.
도 20은 LLC이식 종양 모델에서, 상이한 시점에서 종양 내 JBS004의 핵산 카피 수의 모식도이다.
도 21은 상이한 시점에서 상이한 용량의 JBS004가 건강한 암컷 마우스의 체온에 미치는 영향의 모식도이다.
도 22는 상이한 시점에서 상이한 용량의 JBS004가 건강한 수컷 마우스의 체온에 미치는 영향의 모식도이다.
도 23은 상이한 시점에서 상이한 용량의 JBS004가 건강한 암컷 마우스의 체중에 미치는 영향의 모식도이다.
도 24는 상이한 시점에서 상이한 용량의 JBS004가 건강한 수컷 마우스의 체중에 미치는 영향의 모식도이다.
도 25는 각 백신이 단독으로 치료되거나 JBS-NY TCR-T와 결합하여 치료될 경우, 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 26은 실험 종료 시, 각 백신이 단독으로 치료되거나 JBS-NY TCR-T와 결합하여 치료될 경우 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 27은 각 백신이 단독으로 치료되거나 JBS-NY TCR-T와의 결합 치료가 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
이하 특정된 구체적인 실시예로 본 출원 발명의 실시형태를 설명하는데, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 명세서에 개시된 내용은 본 출원 발명의 다른 이점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
용어 정의
본 출원에서, 용어 "변형된"은 일반적으로 인공적인 수단에 의해 천연적으로 존재하는 생물체/분자의 구조 및/또는 성능을 변화를 의미한다. 변형의 방식은 예를 들어 상기 분자를 변형, 돌연변이, 합성하고 및/또는 외인성 분자 등을 삽입할 수 있다. "변형된"은 천연적으로 존재하는 것과 구별될 수 있다. 예를 들어, 만약 세포 또는 생물체가 유전자 정보가 변경되도록 조작되면(예를 들어 형질전환, 매칭, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입 또는 기타 메커니즘에 의해 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질을 도입하거나, 치환 또는 결실 돌연변이에 의해 이전에 존재하는 유전 물질을 제거하는 경우), 이는 "변형된"으로 간주된다. 예를 들어, 변형된 종양 용해성 바이러스는 종양 용해성 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시킬 수 있거나, 종양 용해성 바이러스의 유전자에 외인성 유전자를 삽입할 수 있거나, 종양 용해성 바이러스 단백질의 아미노산을 돌연변이시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "기질 단백질M"은 "M단백질"과 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 일반적으로 수포성 구내염 바이러스 기질 단백질을 지칭한다. 기질 단백질M은 VSV에 대한 중요한 독성 인자이고, 마우스의 선천적 면역 응답을 간섭하는 것으로 알려진 수포성 구내염 바이러스의 단백질이다. 용어 "기질 단백질M"은 상동체, 이종상동체, 변이체, 기능 활성 세그먼트 등을 포함한다. 예를 들어, 야생형 수포성 구내염 바이러스 MuddSummer 아형 인디애나 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단백질 돌연변이 사이트의 발현은 일반적으로 "아미노산+아미노산 사이트+(돌연변이된 아미노산)"으로 표현된다. 본 출원에서, 상기 돌연변이는 아미노산의 증가, 치환, 결실 및/또는 삭제를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 용어 "M51R"은 일반적으로 51번째 메티오닌M이 아르기닌R로의 돌연변이를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "돌연변이"는 일반적으로 야생형 분자의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 변경하는 것을 지칭한다. DNA의 돌연변이는 코돈을 변경시킴으로써 아미노산 서열을 변화시킬 수 있다. 뉴클레오티드 변화는 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입, 핵산 서열의 대체 스플라이싱 및/또는 절단을 포함할 수 있다. 아미노산 변화는 아미노산의 치환, 삭제, 결실, 삽입, 추가, 절단, 또는 단백질의 가공 또는 절단을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "종양"은 일반적으로 임의의 새로운 병리학적 조직 증식을 지칭한다. 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 본 출원에서, 상기 종양은 고형 종양 및/또는 혈액 종양일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함"은 일반적으로 명시적으로 지정된 특징을 포함하지만, 다른 요소를 배제하지 않는 것을 지칭한다.
발명의 상세한 설명
1. 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스의 기질 단백질M이 변형되고, 변형된 기질 단백질M의 유전자 서열은 SEQ ID NO 3으로 표시되는 것을 특징으로 한다.
2. 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 있어서, 상기 약독화 균주는 VSV MuddSummer 아형 균주를 기반으로 하고, 적어도 VSV MuddSummer 아형 균주의 M단백질 유전자에 대해 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이; 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이; 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이와 같은 위치 지정 유전자 돌연변이를 수행한 후 수득된다.
3. 담체로서 의약 분야에서의 실시형태1 또는 2에 따른 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용이다.
4. 담체로서 의약 분야에서의 실시형태3에 따른 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용은, 약물 또는 백신의 제조에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용을 특징으로 한다.
5. 종양 용해성 바이러스 백신은, 실시형태1 또는 2에 따른 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
6. 실시형태5에 따른 종양 용해성 바이러스 백신은, 상기 항원이 특이성 종양 항원인 것을 특징으로 한다.
7. 실시형태6에 따른 종양 용해성 바이러스 백신은, 상기 항원이 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3, 글리피칸3에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
8. 실시형태5 내지 실시형태7에서의 어느 하나에 따른 종양 용해성 바이러스 백신으로 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물이다.
9. 실시형태8에 따른 종양 용해성 바이러스 백신의 항종양 약물 또는 암 치료 약물에 있어서, 상기 약물은 상기 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포를 동시에 포함하는 것을 특징으로 한다.
10. 실시형태9에 따른 종양 용해성 바이러스 백신으로 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물에 있어서, 상기 면역 세포는 T세포, NK세포, 대식세포에서의 임의의 하나이고;
상기 면역 세포가 T세포인 경우, 상기 T세포는 TCR-T세포, CAR-T세포, γ/δ-T세포에서의 임의의 하나이며; 상기 T세포가 TCR-T세포인 경우, 상기 TCR-T세포는 렌티바이러스 또는 mRNA기술로 형질감염된 TCR-T세포이거나, 혈액에서 분리한 TCR-T세포이고; 상기 면역 세포가 NK세포인 경우, 상기 NK세포는 CAR-NK에서의 임의의 하나이며; 상기 면역 세포가 대식세포인 경우, 상기 대식세포는 CAR-M세포에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
11. 실시형태9 또는 실시형태10에 따른 종양 용해성 바이러스 백신으로 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물에 있어서, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종, 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
가. 본 발명은 종양 용해성 바이러스를 정확하게 변형시켜 제조한 새로운 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 제공한다. 상기 종양 용해성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)이고, 구체적으로 수포성 구내염 바이러스 인디애나 균주, VSV MuddSummer 아형 균주로부터 선택되며, 이의 M단백질 유전자 서열은 SEQ ID NO 1로 표시되고, M단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 2로 표시된다. 본 발명은 상기 수포성 구내염 바이러스는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 수득하기 위해 다음과 같이 변형된다. 상기 수포성 구내염 바이러스의 M단백질 유전자에 위치 지정 유전자 돌연변이를 수행하여 약독화 균주를 수득하였다. 상기 돌연변이의 사이트는, (1)51번째 메티오닌(M)이 아르기닌(R)로의 돌연변이; (2)111번째 류신(L) 인코딩 염기 녹아웃; (3)221번째 발린(V)이 페닐알라닌(F)으로의 돌연변이; (4)226번째 세린(S)이 아르기닌(R)으로의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이된 수포성 구내염 바이러스를 JBS003으로 넘버링하고; XN2-M51R-△L111-V221F-S226R로 명명하며; 이의 M단백질의 유전자 서열은 SEQ ID NO 3으로 표시되고, M단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 4로 표시된다.
야생형 VSV 및 기타 알려진 VSV 약독화 균주에 비해 상기 JBS003의 안전성은 더 높고, 항원, 사이토카인 등 물질의 담체(골격)로 사용할 수 있으며, 항원, 사이토카인 등과 결합한 후, 백신 또는 약물로 사용할 수 있다. 동시에, JBS003은 기타 물질과 결합하지 않고, 종양 면역 치료에서 종양 용해성 바이러스로 직접 사용할 수 있으며, 그 효과도 야생형 VSV 및 기타 VSV약독화 균주의 치료 효과보다 우수하다.
나. 본 발명은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기초 상에서, 종양 용해성 바이러스 백신을 제공한다. 상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 약독화 균주는 항원과 결합하여 백신을 구성할 수 있다. 본 발명은 JBS003의 G단백질 및 L단백질 사이에 NY-ESO-1을 발현할 수 있는 유전자를 삽입하여 JBS004로 넘버링된 종양 용해성 바이러스 백신을 구축하였다.
NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)은 종양-고환 항원(Cancer-Testis Antigen, CTA) 패밀리에 속하고, 고환, 난소 및 다양한 종양 조직에서 발현되지만 다른 정상 조직에서 발현되지 않으며, 현재까지 알려진 면역 원성이 가장 강한 종양 특이성 항원이다. NY-ESO-1은 상이한 종양 조직에서 다른 존재비로 발현되고, 단백질 발현이 가장 높은 것은 점액성 원형 세포 지방육종(89%~100%), 신경모세포종(82%), 활막육종(90%), 흑색종(46%), 난소암(43%)이다. NY-ESO-1항원은 면역 원성 및 안정성을 갖고, 면역 치료를 위한 임상적으로 지배적인 항원이다. 현재, 재발성, 전이성 두경부 편평세포암종, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종 등은 여전히 효과적인 치료가 불가능하다. NY-ESO-1 도입 후 구축된 JBS004종양 용해성 바이러스 백신은 말초 림프계와 종양 조직에서 유기체의 특이성 항종양 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있다. 시험에 따르면, 항종양 면역 치료, 특히 상기 암 및 종양 치료에서, 종양 용해성 바이러스 백신의 면역 원성, 유효성, 표적화, 안전성 및 내성은 유의한 이점을 갖는다.
다. 본 발명은 상기 종양 용해성 바이러스 백신의 기초 상에서, 표적 방식으로 종양을 치료할 수 있는 약물을 제공한다. 상기 약물은 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 백신을 포함한다. 사용 방법은 다음과 같다. 상기 JBS003종양 용해성 바이러스 또는 JBS004종양 용해성 바이러스 백신을 종양 내 주사 또는 정맥 주사한다. 소량으로 여러 차례 주사하는 방법을 사용한다.
치유율을 향상시키기 위해, 바람직한 방안은, 상기 약물이 TCR-T세포를 더 포함하는 것이다. 상기 TCR-T세포는 NY-ESO-1수용체로 형질전환된 T림프구이고, 구체적인 제조 방법은 다음과 같다. (1)NCG-HLA-A2.1/Gpt인간화 마우스의 말초 혈액에서 T림프구를 분리하고; (2)목표 유전자 NY-ESO-1수용체 서열을 인공적으로 합성하여 유전자 시퀀싱을 수행하며, 이를 렌티바이러스 담체와 재조합하여 NY-ESO-1수용체 재조합 렌티바이러스를 수득하고; (3)상기 NY-ESO-1수용체 재조합 렌티바이러스를 사용하여 T림프구를 형질감염시킴으로써 NY-ESO-1수용체로 형질전환된 T림프구를 수득하며, JBS-NY TCR-T로 명명한다. 구축된 JBS-NY TCR-T세포를 체외에서 증폭시키고, Western Blot 방법으로 JBS-NY TCR-T세포의 NY-ESO-1 발현량을 검출하여 구축이 성공적임을 결정한다.
종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 백신이 JBS-NY TCR-T와 병용되는 방법은 다음과 같다. 먼저 JBS-NY TCR-T를 1회 정맥 주사한 후, 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 백신을 소량으로 여러 차례 종양 내 주사 또는 정맥 주사한다.
한편으로, 본 출원은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 제공하는데, VSV MuddSummer 아형 균주와 비교하여 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M 유전자가 변형되는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 상기 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃, 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃, 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시된다.
다른 양태에서, 본 출원은 상기 종양 용해성 바이러스의 기질 단백질M을 인코딩하는 핵산 분자를 더 제공한다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스의 기질 단백질M을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 표시된다.
다른 양태에서, 본 출원은 담체로서 의약 분야에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용을 더 제공한다.
본 출원에서, 담체로서 의약 분야에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용은 약물 또는 백신의 제조에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 출원은 종양 용해성 바이러스 백신을 더 제공하는데, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조된다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 특이성 종양 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 얻는다. 본 출원에서, 상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3 및 글리피칸3에서의 임의의 하나로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에서, 구축된 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주를 담체로 사용하고, NY-ESO-1에 도입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 수득한다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스 백신의 제조 방법을 더 제공하는데, 상기 방법은, 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 플라스미드를 구축하고, 제한 효소 절단 사이트가 있는 연결 서열을 인공적으로 합성하며, 생물학적 기술과 유전자 재조합 기술을 이용하여 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 G단백질과 L단백질 사이의 비코딩 영역에 삽입하고, 외인성 유전자를 삽입하여 외인성 유전자를 포함하는 약독화 균주 재조합 플라스미드를 수득하며, 백신 구제 단계를 통해 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 구축하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 출원은 상기 종양 용해성 바이러스 백신으로 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물을 더 제공한다.
본 출원에서, 상기 항종양 약물 또는 암 치료 약물은 상기 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포를 동시에 포함한다. 본 출원에서, 상기 면역 세포는 T세포, NK세포, 대식세포, DC세포, TIL세포에서의 임의의 하나를 포함할 수 있고, 상기 면역 세포가 T세포인 경우, 상기 T세포는 TCR-T세포, CAR-T세포, γ/δ-T세포, 유전자 편집된 T세포에서의 임의의 하나를 포함할 수 있으며; 상기 T세포가 TCR-T세포인 경우, 상기 TCR-T세포는 렌티바이러스 또는 mRNA기술로 형질감염된 TCR-T세포이거나, 혈액에서 분리한 TCR-T세포이거나, 임의의 기술로 얻은 TCR-T세포를 포함할 수 있고; 상기 면역 세포가 NK세포인 경우, 상기 NK세포는 NK 또는 CAR-NK에서의 임의의 하나를 포함할 수 있으며; 상기 면역 세포가 대식세포인 경우, 상기 대식세포는 대식세포 또는 CAR-M세포에서의 임의의 하나를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종 및/또는 원형세포 지방육종을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 약물은 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
어떠한 이론에 제한되는 것을 의도하지 않고, 하기 실시예는 단지 본 출원의 발명의 다양한 기술적 해결수단을 설명하기 위해 사용된 것일 뿐 본 출원의 발명의 범위를 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.
실시예
실시예1
1. 표 1의 방식에 따라, 상기 수포성 구내염 바이러스 인디애나 균주에 부위 지정 돌연변이를 수행하여 7개의 그룹의 돌연변이된 약독화 균주를 수득한다. 유전자 돌연변이를 수행하지 않은 그룹 번호는 JBS000이고, 대조군으로 사용된다.
표 1 각 그룹의 돌연변이 상황 전시표
Figure pct00001
약독화 균주의 구체적인 구축 방법은 본 분야의 통상적인 기술이고, 다음과 같이 간략하게 설명한다.
(1)플라스미드의 구축. pVSV-XN2플라스미드를 주형으로 사용하고, PCR 방법을 사용하여 표 1에 기재된 상이한 돌연변이 사이트를 도입한다. 플라스미드를 각 돌연변이 사이트의 프라이머에 대해 공통으로 PCR을 수행하고, 다시 PCR산물을 1%의 아가로스겔로 전기 영동한 후, 겔 회수 키트로 겔 절단 및 회수하여 M기질 단백질의 상이한 돌연변이의 플라스미드를 수득한다.
(2)바이러스 구조. MOI=5에 따라, T7 RNA 중합 효소를 발현하는 폭스 바이러스vTF7-3로 BHK-21세포를 감염 접종하고, 1h 동안 감염시킨 후, DPBS완충액을 사용하여 BHK-21세포를 1회 세척한다. 다음 구체적으로 pBS-N, pBS-P, pBS-L, 단계(1)에서 제조된 돌연변이 플라스미드를 포함하는 플라스미드 형질감염 프리믹스 용액을 제조한다. 여기서 pBS-N, pBS-P, pBS-L은 각각 VSV N, VSV P, VSV L 단백질 유전자가 클로닝된 발현 플라스미드를 지칭하고, 바이러스 구조에 필요한 N, P, 및 L단백질을 각각 발현한다. lipofectamine 2000 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 플라스미드 형질감염을 수행하고, 4h 후 10%의 소태아혈청을 함유하는 신선한 DMEM완전 배지를 교체하며, 48h 후 상청액을 흡인하고, 0.22μm의 여과막으로 폭스 바이러스를 제거한다. 여과액을 신선한 BHK-21세포에 첨가하고; 매일 세포 병변 상태를 관찰하며, 세포에 병리학적 변화가 나타날 경우 상청액을 취하고, RTPCR 감정하여 성공적인 것을 확인한 후, 바이러스 플라크 분석으로 바이러스를 정제한다. 즉 약독화 균주를 수득한다.
(3)M단백질 유전자 시퀀싱. Trizol키트를 이용하여 바이러스 게놈RNA를 추출하고, 무작위 프라이머로 역전사 반응을 수행하며, M단백질 유전자 서열에 맞게 설계된 프라이머로 역전사된 cDNA에 대해 PCR을 수행한다. 프라이머 서열은 5'-AAAAAAGTAACAGATATCAC-3'(SEQ ID NO: 5); 5'-ACATTTTTCCAGTTTCCTTTTTGG-3'(SEQ ID NO: 6)이다. 산물은 1%의 아가로스겔로 전기 영동한 후 회수하고, 시퀀싱 회사로 보내 시퀀싱을 수행한다.
2. 세포에 대한 상이한 약독화 균주의 체외 감염 능력 전시. MEF세포(인간 섬유아세포) 배양액, LLC세포(마우스 유래 비-소세포성 폐암 세포) 배양액에, JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS008, JBS009, JBS010, JBS014를 각각 200pfu 첨가하고, 각 그룹의 약독화 균주에 의해 생성된 절반의 조직 배양 감염 용량(Tissue culture infective dose,TCID50)을 검출한다. 구체적인 테스트 방법은 다음과 같다.
(1)6웰의 배양 플레이트의 각 웰에 3mL의 세포 현탁액을 넣어, 세포량이 4×105개/웰, 총 6개의 웰이 되도록 하고, 37℃, 5％의 CO2조건 하에서 16h 동안 배양한다.
(2)각 웰에 각각 바이러스JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS008, JBS009, JBS010, JBS014를 200pfu씩 첨가하고, 2개의 웰을 정상 세포 대조군으로 설정한다. 24h에, 100μL의 세포 상청액을 취한다.
(3)96웰의 배양 플레이트에, 각 웰에 100μL의 Vero세포 현탁액을 첨가하여 세포량이 1×104개/mL가 되도록 하고, 37℃, 5％의 CO2조건 하에서 16h 동안 배양한다.
(4)1.5mL EP튜브에 단계(2)에서 수득한 상청액을 10-1~10-11, 총 11개의 역가로 연속 10배 희석한다.
(5)희석된 상청액을 단계(3)의 96웰의 배양 플레이트에 접종하고, 각 희석액에 대해 컬럼 1개(총 8개 웰), 각 웰에 100μL를 접종한다. 정상 세포 열을 대조군으로 설정한다.
(6)48h 후 각 웰의 세포의 형광 상황을 관찰하고, 형광 마커가 있으면 이 웰이 감염된 것이다.
(7)Karber법에 따라 TCID50을 계산한다.
결과는 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같다. 체외 폐암 세포(LLC)에서의 구축된 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 복제 및 증폭 능력은 정상 섬유아세포(MEF)의 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 복제 및 증폭 능력보다 강하고, 여기서 체외 폐암 세포(LLC)에서의 JBS003의 복제 및 증폭 능력은 강하며, 24h 감염 후 생성된 바이러스 입자 수는 야생형 바이러스에 가깝다. 그러나 정상 섬유아세포(MEF)에서 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 복제 및 감염 능력은 모두 감소된다. 따라서, JBS003담체는 종양 세포에 대해 강한 특이성 감염 능력을 갖는다.
3. 세포에 대한 상이한 약독화 균주의 체외 사멸 능력 전시. 동일한 양의 각 약독화 균주를 사용하여 상이한 세포를 각각 체외 감염시키고, 24h 후 MTT법으로 세포 활력을 검출한다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
(1)96웰의 배양 플레이트의 각 웰에 100μL의 세포 현탁액을 첨가하여 세포량이 1×104개/웰이 되도록 하고, 37℃, 5％의 CO2조건 하에서 16h 동안 배양한다. 테스트한 세포 종류는 LLC, MEF, Hela(인간 종양 세포)이다.
(2)JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS008, JBS009, JBS010, JBS014를 각각 MOI(multiplicity of infection, 감염 다중도)에 희석하고 각각 0.001, 0.01, 0.1, 1.0이며, 각각의 희석 구배를 4개의 웰에 접종하고, 각 웰에 100μL를 접종하여 37℃, 5％의 CO2 조건 하에서 40h 동안 배양한다.
(3)96웰의 배양 플레이트의 상청액을 제거하고, 신선한 DMED배지를 첨가한 다음, 다시 5mg/mL의 MTT 용액을 첨가하여 20μL/웰이다. 37℃, 5％의 CO2조건 하에서 4h 동안 배양한다.
(4)96웰 플레이트를 원심분리하고, 회전속도를 2500g/min으로 설정하여 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 다음 1mL의 1회성 무균 주사기를 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인한다.
(5)다시 각 웰에 DMSO를 첨가하고, 100μL/웰이며, 37℃에서 10분 동안 방치한다.
(6)다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 2분 동안 진탕하고, 570nm의 파장에서 각 웰의 OD값을 측정한다.
결과는 도 2a, 도 2b, 및 도 3에 도시된 바와 같다. 결과는 MEF세포에 대해 현저한 사멸 능력이 없는 JBS000을 제외하고 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주가 모두 우수한 종양 세포 사멸 능력을 나타내는 것을 입증한다. 즉, 체외 상태에서, JBS000 외에, 각 약독화 균주는 모두 종양 세포에 대해 특이성 사멸을 갖고, 정상 세포에는 현저한 영향이 없다.
4. 세포 내에서의 상이한 약독화 균주의 제거 난이도 테스트. IFN-β 지표로 테스트를 수행한다. 상기 단계3의 단계(1), (2)에 따라 세포를 배양하고 약독화 균주를 첨가한다. 다음 각 그룹의 세포를 파괴하고, TRIzol(Invitrogen)로 각 세포로부터 총 RNA를 추출하며, PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser(Takara) 역전사 키트를 사용하여 cDNA로 역전사하고, LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche) 염료로 염색하며, LightCycler 480 정량적 PCR 기기에서 각 유전자의 Ct값을 검출한다. ΔΔCt법으로 목적 유전자IFN-β, VSV-G의 상대 발현량을 계산한다. 결과는 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같다. LLC세포계에서, JBS000을 제외하고, 모든 약독화 균주는 모두 IFN-β 발현 수준을 향상시킬 수 있으며, 여기서 JBS003담체의 조절 능력이 가장 낮고; MEF세포에서, 모든 바이러스는 모두 IFN-β의 발현 수준을 상향 조절할 수 있으며, 여기서 JBS003의 수준이 가장 높고, 야생형 바이러스 담체(JBS000)의 3배이다. 즉, JBS003은 종양 세포에서 제거되기 어렵지만, 정상 세포에서는 제거하기 용이하다.
실시예2 종양 용해성 바이러스 백신의 구축 및 효과 전시
1. 실시예1에서 제조한 각 약독화 균주 및 야생형 바이러스의 기초 상에서, NY-ESO-1유전자를 삽입하여 종양 용해성 바이러스 백신을 구축하고, 구축 모식도는 도 5에 도시된 바와 같다. 각 그룹의 삽입 세그먼트 상황은 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2 각 그룹의 삽입 세그먼트 상황 전시표
Figure pct00002
상기 JBS004-JBS007, JBS011-JBS013, JBS015의 구체적인 제조 방법은 본 분야의 통상적인 기술로서, 다음과 같이 간략하게 설명한다. 하기 기재는 JBS004-JBS007, JBS011-JBS013, JBS015를 다음과 같은 방법으로만 수행되어야 함을 제한하는 것이 아니라 예시적으로 제공한다는 점에 유의해야 한다.
(1)약독화 균주 플라스미드 구축. 제한 효소 절단 사이트Xho I 및 Mlu I가 있는 연결 서열을 인공적으로 합성하고, 생물학적 기술과 유전자 재조합 기술을 이용하여 실시예1에서 제조한 각 약독화 균주의 G단백질과 L단백질 사이의 비코딩 영역에 삽입하여 각 약독화 균주의 플라스미드를 수득한다.
(2)외인성 유전자의 삽입. 각 약독화 균주 플라스미드를 Xho I 및 Mlu I로 이중 소화한 후, NY-ESO-1외인성 유전자를 삽입하여 NY-ESO-1을 포함하는 약독화 균주 재조합 플라스미드를 수득한다.
(3)백신 구조. 실시예1의 "바이러스 구조"의 방법을 참조하여 각 약독화 균주 재조합 플라스미드에 대응되는 백신을 구조함으로써 각 종양 용해성 바이러스 백신을 구축한다.
2. LLC-NY-ESO-1비-소세포성 폐암(이식 종양) 치료 효과 전시.
유의미한 차이가 없는 136마리의 C57BL/6마우스를 선택하고, 각각 2×105개의 LLC세포(마우스 폐암 세포)를 피하 접종한다. 접종 9일차에, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 모든 마우스를 17개의 그룹(n=8)으로 나눈다. 대조군(PBS 그룹)에 50μL의 PBS를 종양 내 주사하고, 나머지 16개의 그룹은 치료군이며, JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS004, JBS005, JBS006, JBS007, JBS008, JBS009, JBS010, JBS011, JBS012, JBS013, JBS014, JBS015를 각각 종양 내에 주사하고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여하되, 단일 접종량은 모두 107 pfu/마리이다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록하고, 부피(mm3)=(장경×단경2)/2이다. 암세포의 전이율을 검출하고, 검출 방법은 LLC세포에는 적색 형광 단백질이 포함되며, 녹색 형광 현미경 하에서 황생 형광을 나타내고; 암세포가 폐조직으로 전이된 후, 폐조직을 현미경으로 관찰하여 형광 이미지를 촬영하며, Image J로 이미지 회색값을 분석함으로써 폐암 세포의 비율을 분석, 즉 암세포의 전이율을 얻는다.
종양 부피 변화 상황은 도 6~도 8에 나타낸 바와 같다. 결과는, 각 치료군이 모두 이식 종양에 일정한 억제 작용이 있음을 나타낸다. 여기서 JBS003군은 1마리가 완전히 치료된다. 이식 종양에 대한 JBS004의 치유율은 37.5%에 도달한다. 암세포 전이 상황은 도 9에 도시된 바와 같다. 도 6~도 9로부터 알 수 있다 시피, 이식 종양 부피 크기와 폐 전이량 사이에는 일정한 상관성이 존재한다. JBS003은 폐 전이 치료에서 JBS000, JBS001군보다 우수하고; JBS004는 폐암 세포 전이를 억제하거나 방지하는 능력은 다른 그룹보다 우수하다.
3. MCA-205-NY-ESO-1섬유육종(이식 종양)의 치료 효과 전시.
"LLC-NY-ESO-1비-소세포성 폐암 이식 종양"을 치료하는 방법으로 마우스를 처리하고, 106개의 MCA-205-NY-ESO-1섬유육종 세포를 피하 접종하며, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 처리한다. 마찬가지로 50μL의 PBS를 대조군으로 종양 내 주사하고, 치료군에서, 각각 JBS004, JBS005, JBS006, JBS007, JBS011, JBS012, JBS013, JBS015를 종양 내 접종하며, 각 그룹당 6마리 동물이고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여하되, 단일 접종량은 모두 108 pfu/마리이다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록한다. 결과는 도 10, 도 11에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 각 치료군은 모두 종양 부피를 어느 정도 감소시킬 수 있다. JBS004 치료 후, 2마리의 마우스의 이식 종양이 완전히 제거되고(33.33% 차지), 나머지 마우스의 종양 부피도 잘 제어되어 나머지 그룹과 유의하게 상이하다. JBS004가 섬유육종을 치료하는 전체 반응률은 100%이다.
4. B16-F10-NY-ESO-1흑색종(이식 종양)의 치료 효과 전시.
상술한 이식 종양 시험의 처리 방법에 따라 마우스를 처리하고, 2×106개의 B16-F10-NY-ESO-1흑색종 세포를 피하 접종하며, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 처리한다. 마찬가지로 50μL의 PBS를 대조군으로 종양 내 주사하고, 치료군에서, 각각 JBS004, JBS005, JBS006, JBS007, JBS011, JBS012, JBS013, JBS015를 종양 내 접종하며, 각 그룹당 6마리 동물이고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여하고, 단일 접종량은 모두 108 pfu/마리이다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록한다. 결과는 도 12, 도 13에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 각 처리군이 흑색종에 대해 모두 일정한 치료 작용이 있고, JBS004군의 효과가 우수한 것을 나타낸다.
5. 상이한 용량의 JBS004의 효과 전시.
6~8주령, 약 18g의 체중의 C57BL/6마우스를 선택하고, 각각 2×105개의 LLC세포(마우스 폐암 세포)를 피하 접종한다. 접종 9일차에, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면, 모든 마우스를 5개의 그룹으로 나누고, 각 그룹은 6마리의 동물이다. 대조군(PBS 그룹)은 50μL의 PBS를 종양 내 주사하고, 나머지 4개의 그룹은 치료군이며, 각각 106 pfu/마리, 107 pfu/마리, 108 pfu/마리, 109 pfu/마리의 JBS004를 종양 내 접종하고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여한다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록하고, 결과는 도 14, 도 15에 도시된 바와 같다. 실험 종료 시, 안락사시킨 마우스를 부검하고, 마우스의 폐조직을 취하며, 암세포의 전이율을 검출하고, 결과는 도 16에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 상이한 용량의 JBS004는 모두 폐암 마우스에 일정한 치료 효과가 있고, 여기서 108 pfu/마리의 용량 수준에서, 치유율은 33.33%에 도달하며, 유효 제어율은 33.33%에 도달하고, 폐암 세포가 없는 전이율은 66.67%이며, 다른 투여군에 비해 유의하게 우수하다.
이 밖에, 도 17, 도 18에 도시된 바와 같이, 전체 실험 과정에서, 마우스의 체온, 체중은 모두 정상 범위 내로 유지되고, 체온, 체중에 이상은 없으며, 상이한 용량의 JBS004가 폐암 마우스의 체온, 체중에 유의한 영향을 미치지 않는다. 체중에 있어서, PBS 그룹 마우스의 체중은 안정적으로 증가하고, 나머지 치료군의 마우스는 느린 성장을 나타내며, 그 원인은 이식 종양의 감소와 관련이 있고, 실험 종료 시, 각 그룹의 마우스의 체중은 유의한 차이가 없다. JBS004의 안전성이 우수함을 입증한다.
실시예3 JBS004의 약동학 및 급성 독성 실험 결과 전시
1. 약동학 실험. C57BL/6마우스를 선택하여 2×105개의 LLC세포를 피하 접종하고, 접종 약 9일 후, 이식 종양 부피가 100mm3로 증가하며, LLC이식 종양 모델을 구축한다. 108 pfu/마리의 JBS004를 1회 종양 내 주사하고, 각각 0 min(+15min), 6h, 12h, 48h, 96h, 120h 및 14일에 종양 조직 샘플링을 수행하며(3회 반복), 자동 그라인더로 조직을 파쇄하고, Trizol로 종양 조직의 전체 RNA를 추출하며, 최종적으로 정량적 PCR(형광 프로브 방법)로 바이러스 핵산 카피 수를 분석한다. 결과는 도 19, 도 20에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 종양 내 바이러스의 양은 감염 6h에 피크값에 도달하고, 초기 용량과 비교하여 약 500배 복제되며; 감염 48h 후, 바이러스의 양은 초기 주사량보다 감소되기 시작하고; 14일 후, 바이러스 핵산 카피 수는 검출되지 않는다. 따라서, JBS004는 종양 내에서 신속하고 효율적으로 복제될 수 있고; 14일 후, JBS004는 검출되지 않으며, 장기간 체내에 축적되지 않아, 잠재적인 후속 손상을 유발할 수 있고, 안전성이 우수하다.
2. 급성 독성 실험. 40마리의 C57BL/6마우스를 선택하고, 절반은 수컷, 절반은 암컷이다. 3개의 투여군으로 나누고, JBS004 용액을 1회 근육 주사로 투여하며, 각 그룹의 투여량은 각각 103pfu/마리, 106pfu/마리, 109pfu/마리이다. 블랭크 대조군에는 용매 대조(PBS를 1회 근육내 주사)를 1회 투여하고, 투여 부피는 모두 100μL이다. 동물 투여일을 이 동물군의 첫 관찰일로 설정한다. 동물은 약물 투여 후 14일 동안 관찰하고, 투여 후 15일째에 해부한다.
실험 과정에서, 2일마다 마우스의 체온 및 체중을 기록한다. 결과는 도 21~도 24에 도시된 바와 같다. 투여 전 및 투여 후의 30min, 1h, 2h, 4h 및 10h에 마우스에 대해 상세한 케이지측 관찰을 수행하고, 후속 실험에서 매일 적어도 1회의 케이지측 관찰을 수행한다. 실험 종료 시, 마우스의 말초 혈액을 취하여 혈액학 및 혈액 생화학적 검출(혈당, 크레아티닌, 요소질소, 혈액요소질소/레아티닌, 인이온, 칼슘이온, 총단백질, 알부민, 글로불린 등)에 사용하고, 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 뇌, 고환/난소를 포함하는 주요 장기를 조직 칭량을 위해 부검하여 수집하고, 장기 계수를 계산한다. 편복의 제한으로 인해 혈액학 및 혈액 생화학적 검출의 모든 지표 데이터는 여기에 표시되지 않는다. 검출 결과에 따르면, 마우스의 비정상적인 사망은 없고, JBS004와 관련된 임상 증상이 나타나지 않는다. 상이한 용량의 JBS004를 주사하여 마우스 장기의 중량에 유의한 영향을 미치지 않고; 마우스의 혈액학 및 혈액 생화학적 지표에 유의한 영향을 미치지 않는다. 본 실험 조건 하에서, 최대 허용 용량(MTD)은 적어도 109pfu/마리이다. 따라서 상기 최적 용량(108pfu/마리)는 안전한 용량 이내이다.
실시예4 JBS-NY TCR-T의 구축
JBS-NY TCR-T는 NY-ESO-1수용체 재조합 렌티바이러스를 이용하여 T림프구를 형질감염시킨 후 수득한 T세포이고, 구체적인 구축 방법은 본 분야의 통상적인 기술이며, 다음과 같이 간략하게 설명한다.
(1)개시된 NY-ESO-1의 수용체 유전자 서열에 근거하여 NY-ESO-1수용체 유전자를 인공적으로 합성한다.
(2)재조합 렌티바이러스 담체의 구축. PCR로 NY-ESO-1 TCR유전자 세그먼트를 증폭하고, 프라이머는 ESO TCR-F1:5'-GGAATTCATGGAGACCCTCT-3' (SEQ ID NO: 12);
ESO TCR-R1:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTAGCCTCTGGAA-3' (SEQ ID NO: 13)이다.
클로닝된 ESO TCR cDNA를 주형으로 PCR 체외 증폭을 수행하고, PCR 반응 조건은 다음과 같다. 94℃에서 3min 동안 사전 변성하고, 94℃, 30s, 55℃, 30s, 72℃, 45s, 35개의 사이클 후 72℃에서 5min 동안 연장시킨다. 1.2%의 아가로스겔로 전기 영동하여 PCR로 증폭된 특이성 세그먼트(1824bp)를 분리한다. EcoR I 및 Not I로 각각 PCR산물 및 pCL20c-MSCV-GFP플라스미드를 이중 소화시키고, 유리 우유겔로 소화 산물을 회수한다. 두 가지 소화 산물을 T4 DNA 연결 효소로 연결시키고, 16℃에서 하룻밤 경과한다. 다음 연결 산물을 유능한 DH5α 박테리아로 형질전환시키고, 배양 및 증폭 후 B형 미니 플라스미드 키트로 플라스미드를 추출한다.
(3)pCL20c-MSCV-ESO TCR재조합 렌티바이러스 담체의 감정. pCL20c-MSCV-ESO TCR 플라스미드를 EcoR I 및 Not I로 이중 소화하고, PCR 후 시퀀싱을 위해 보낸다.
(4)pCL20c-MSCV-ESO TCR재조합 렌티바이러스의 포장. T293세포를 10%의 소태아혈청을 함유한 DMEM배지에서, 95%의 습도, 5%의 CO2, 37℃의 인큐베이터에서 통상적으로 배양하고, 매주마다 3~4회 계대한다. 형질감염 1d 전에, 5×106~6×106개의 T293세포를 D=10cm의 세포 배양 접시에 접종한다. 형질감염 2h 전에, 10mL의 신선한 10%의 DMEM배지를 교체한다.
형질감염 1h 전에 형질감염 용액을 준비하고, 형질감염 용액은 A용액 및 B용액으로 구성된다. A용액: pCL20c-HIV-gp플라스미드 6μg, pCAG4-RTR2플라스미드 2μg, CAG-VSV-G플라스미드 2μg, pCL20c-MSCV-ESOTCR플라스미드 10μg, 50μL의 2.5mol/L의 CaCl2, 탈이온수로 500μL의 부피까지 보충하고, 가볍게 흔들어 혼합하며, 실온에서 5min 동안 방치한다. B용액: 2×HBSS(280mmol/L의 NaCl, 50mmol/L HEPES, 1.5mmol/L Na2HPO4, pH=7.02)500μL. A용액을 B용액에 적가하고, 적가하면서 진탕하며, 실온에서 20min 동안 방치하여 형질감염 용액을 얻는다. 인큐베이터에서 배양 접시를 꺼내고, 15°경사시켜 형질감염 용액을 배양 접시의 아래쪽에 조심스럽게 적가하며, 적가하면서 좌우로 흔들어 혼합하고, 인큐베이터에서 16h 또는 밤새 배양한다. 다음 10mL의 신선한 성장 배지로 교체한다. 형질감염 48h 후 상청액을 수집하고, -80℃에서 보관한다. 100mL의 포장 상청액을 꺼내고, 실온에서 해동하며, 2000×g에서 30min 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하며, 0.45μm의 PVDF막으로 여과하고, 12000×g에서 3h 동안 초원심분리하며, 1mL의 무혈청 DMEM를 첨가하고, 바이러스 침전을 재현탁시키며, 100μL/튜브로 나누고, -80℃에서 보관한다.
(5)말초 혈액에서 T세포의 분리. NCG-HLA-A2.1/Gpt인간화 마우스의 말초 혈액에서 T림프구를 분리하고, 세포 분리액을 첨가하며, 1500g/min으로 15min 동안 원심분리하고, 제2층의 환형 유백색 림프구층을 취하며, 5mL의 세포 세척액을 첨가하고, 충분히 혼합한 후, 1800g/min으로 20분 동안 원심분리하며, 상청액을 제거한 후, 침전된 림프구를 재현탁시킨다.
(6)재조합 렌티바이러스와 T세포의 공동 형질감염. 재현탁된 림프구를 2×105개/mL로 조정하고, 6μg/mL의 polybrene 및 적절한 양의 104pfu 바이러스를 첨가하며, 반복하여 혼합하고, 37℃에서 인큐베이션하며, 계속하여 3~4일 동안 배양한 후, JBS-NY TCR-T를 수득한다.
실시예5 종양 용해성 바이러스 백신과 JBS-NY TCR-T병용의 효과 전시
6-8주령, 18-20g의 체중의 NCG-HLA-A2.1/Gpt인간화 마우스를 선택하고, 2×105개의 비-소세포성 폐암 A549세포를 각각 피하 접종하며, 동일하고, 적절한 조건 하에서 약 100mm3의 이식 종양 부피로 배양하여 처리를 시작한다. 각 그룹의 처리 조건은 표 3에 나타낸 바와 같다. 표 3에서, JBS NY TCR-T세포의 접종량은 106개이고, 1회 정맥 주사 방식을 사용한다. 만약 JBS-NY TCR-T세포와 종양 용해성 바이러스 백신을 병용하면, JBS-NY TCR-T세포를 정맥 주사 후 24h에 대응되는 종양 용해성 바이러스 백신을 종양 내 주사한다. 2일마다 종양 용해성 바이러스 백신을 1회 주사하고, 총 3회 투여한다. 단일 접종량은 모두 108 pfu/마리이다.
표 3 각 그룹별 처리 상황 전시표
Figure pct00003
투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록한다. 결과는 도 25, 도 26에 도시된 바와 같다. 각 그룹의 폐암 세포 전이 상황을 검출하고, 결과는 도 27에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 대조군을 제외하고, 각 그룹은 모두 이식 종양 부피에 일정한 억제 작용이 있으며, 도면으로부터, JBS004와 JBS-NY TCR-T는 병용 후 치료 효과가 유의하게 향상되고, 원래의 25%의 치유율에서 92%~95%의 치유율로 향상되며, 병용 치료의 장점을 나타내고; 폐암 세포의 전이 억제에도 우수한 효과를 나타내는 것을 놀랍게도 발견하였다.
전술한 상세한 설명은 해석 및 열거 방식으로 제공되고, 첨부된 특허청구범위를 제한하려는 것이 아니다. 현재 본 출원에 열거된 실시형태의 다양한 변화는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 것이고, 첨부된 특허청구범위 및 그 균등한 방식의 범위 내에 보류된다.
SEQUENCE LISTING <110> JOINT BIOSCIENCES (SH) LTD. <120> ONCOLYTIC VIRUS VACCINE AND DRUG FOR TREATING TUMORS BY COMBINING ONCOLYTIC VIRUS VACCINE WITH IMMUNE CELLS <130> 0190-PA-007 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Indiana strain of vesicular stomatitis virus(VSV MuddSummer) <400> 1 atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60 gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120 attgacaaat cctattttgg agttgacgag atggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180 tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240 tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300 aaacgtccct tctacaaaat cttggctttt ttgggttctt ctaatctaaa ggccactcca 360 gcggtattgg cagatcaagg tcaaccagag tatcacgctc actgcgaagg cagggcttat 420 ttgccacata ggatggggaa gacccctccc atgctcaatg taccagagca cttcagaaga 480 ccattcaata taggtcttta caagggaacg attgagctca caatgaccat ctacgatgat 540 gagtcactgg aagcagctcc tatgatctgg gatcatttca attcttccaa attttctgat 600 ttcagagaga aggccttaat gtttggcctg attgtcgaga aaaaggcatc tggagcgtgg 660 gtcctggact ctatcagcca cttcaaatga 690 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Indiana strain of vesicular stomatitis virus(VSV MuddSummer) <400> 2 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Leu Gly 100 105 110 Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln 115 120 125 Pro Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg 130 135 140 Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg 145 150 155 160 Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr 165 170 175 Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His 180 185 190 Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe 195 200 205 Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser 210 215 220 Ile Ser His Phe Lys 225 <210> 3 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（M51R，ΔL111，V221F，S226R） <400> 3 atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60 gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120 attgacaaat cctattttgg agttgacgag agggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180 tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240 tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300 aaacgtccct tctacaaaat cttggctttt ggttcttcta atctaaaggc cactccagcg 360 gtattggcag atcaaggtca accagagtat cacgctcact gcgaaggcag ggcttatttg 420 ccacatagga tggggaagac ccctcccatg ctcaatgtac cagagcactt cagaagacca 480 ttcaatatag gtctttacaa gggaacgatt gagctcacaa tgaccatcta cgatgatgag 540 tcactggaag cagctcctat gatctgggat catttcaatt cttccaaatt ttctgatttc 600 agagagaagg ccttaatgtt tggcctgatt gtcgagaaaa aggcatctgg agcgtggttc 660 ctggactcta tccggcactt caaatga 687 <210> 4 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（M51R，ΔL111，V221F，S226R）（PRT） <400> 4 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Arg Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr Ile 165 170 175 Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His Phe 180 185 190 Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly 195 200 205 Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Phe Leu Asp Ser Ile 210 215 220 Arg His Phe Lys 225 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 5 aaaaaagtaa cagatatcac 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 6 acatttttcc agtttccttt ttgg 24 <210> 7 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（ΔL111） <400> 7 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr Ile 165 170 175 Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His Phe 180 185 190 Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly 195 200 205 Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser Ile 210 215 220 Ser His Phe Lys 225 <210> 8 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（ΔL111，M51R） <400> 8 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Arg Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr Ile 165 170 175 Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His Phe 180 185 190 Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly 195 200 205 Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser Ile 210 215 220 Ser His Phe Lys 225 <210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（ΔL111，V221F） <400> 9 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr Ile 165 170 175 Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His Phe 180 185 190 Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly 195 200 205 Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Phe Leu Asp Ser Ile 210 215 220 Ser His Phe Lys 225 <210> 10 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（ΔL111，S226R） <400> 10 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr Ile 165 170 175 Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His Phe 180 185 190 Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly 195 200 205 Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser Ile 210 215 220 Arg His Phe Lys 225 <210> 11 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（ΔL111，V221F，S226R） <400> 11 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro 145 150 155 160 Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr Ile 165 170 175 Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His Phe 180 185 190 Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly 195 200 205 Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Phe Leu Asp Ser Ile 210 215 220 Arg His Phe Lys 225 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 12 ggaattcatg gagaccctct 20 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 13 atagtttagc ggccgcctag cctctggaa 29

Claims (20)

  1. 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주로서,
    VSV MuddSummer 아형 균주와 비교하여 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M이 변형되고, 상기 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질 단백질M의 변형은 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 226번째 세린이 아르기닌으로 돌연변이된 아미노산 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이; 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질 단백질M은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에서의 임의의 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주.
  12. 담체로서 의약 분야에서의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용.
  13. 제12항에 있어서,
    약물 또는 백신의 제조에서의 상기 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 응용을 특징으로 하는 응용.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 백신.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항원은 특이성 종양 항원인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 백신.
  16. 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3, 글리피칸3에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 하는 종양 용해성 바이러스 백신.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 종양 용해성 바이러스 백신으로부터 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 약물은 상기 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 세포를 동시에 포함하는 것을 특징으로 하는 항종양 약물 또는 암 치료 약물.
  19. 제17항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T세포, NK세포, 대식세포, DC세포, TIL세포에서의 임의의 하나이고, 상기 면역 세포가 T세포인 경우, 상기 T세포는 TCR-T세포, CAR-T세포, γ/δ-T, 유전자 편집된 T세포에서의 임의의 하나이며; 상기 T세포가 TCR-T세포인 경우, 상기 TCR-T세포는 렌티바이러스 또는 mRNA기술로 형질감염된 TCR-T세포이거나, 혈액에서 분리한 TCR-T세포이거나, 임의의 기술로 얻은 TCR-T세포이고; 상기 면역 세포가 NK세포인 경우, 상기 NK세포는 NK세포 또는 CAR-NK에서의 임의의 하나이며; 상기 면역 세포가 대식세포인 경우, 상기 대식세포는 대식세포 또는 CAR-M세포에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 하는 항종양 약물 또는 암 치료 약물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종, 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 하는 항종양 약물 또는 암 치료 약물.
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