CN116350759A

CN116350759A - 溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法

Info

Publication number: CN116350759A
Application number: CN202310328769.5A
Authority: CN
Inventors: 周国庆; 马良; 田婷; 程隆鑫; 马奇斌; 张凡
Original assignee: Shanghai Rongrui Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Rongrui Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-30
Filing date: 2023-03-30
Publication date: 2023-06-30
Also published as: WO2024198985A1

Abstract

本申请涉及生物医药的技术领域，具体涉及一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法。具体包括如下步骤：利用免疫细胞和溶瘤病毒疫苗联合治疗肿瘤；所述溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞；所述免疫细胞嵌合与所述肿瘤抗原配对的抗原受体，用于杀伤或杀灭被标靶的肿瘤细胞；所述重组溶瘤病毒包括定点突变后的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白。本申请利用溶瘤病毒疫苗和杀伤或杀灭该肿瘤抗原的免疫细胞联合攻击杀死肿瘤细胞，溶瘤病毒疫苗表达的肿瘤抗原不仅能够引导免疫细胞到达靶肿瘤组织中心，而且溶瘤病毒联合免疫细胞杀死肿瘤细胞，并能够达到1+1大于2的疗效，肿瘤细胞杀伤率最高可达100%。

Description

溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法

技术领域

本申请涉及生物医药的技术领域，具体地说，涉及一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法。

背景技术

免疫细胞疗法有望成为“治愈”癌症的突破性策略。其中，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)已经在多种血液瘤的治疗上取得了瞩目的效果。截止到目前，全球已经有7款CAR-T细胞治疗产品上市，其中包括在中国上市的3款。

CAR-T细胞治疗虽然在治疗血液瘤方面获得了成功，但是在治疗实体瘤方面仍然有许多局限性。其中，导致局限性的关键因素如下：

(1)实体瘤细胞的肿瘤相关抗原异质性，缺乏CAR-T细胞攻击的抗原靶点；

(2)CAR-T细胞缺乏渗透穿过实体瘤组织微环境系统，并最终到达靶肿瘤组织内的能力。

同样，其它免疫细胞疗法，包括但不限于TCR-T细胞、γδ-T细胞、Crispered-T细胞、STAR-T细胞，CAR-NK细胞、CAR-M细胞，包括但不限于来自自体细胞、异体细胞或IPSC来源的免疫细胞，同样存在上述这两大局限性。

另外，即使在血液瘤的治疗有效的病人中，仍然有相当大的一部分病人治疗后存在复发的情况，复发后的病人会丢失先前治疗的CAR-T细胞治疗的靶点，因此，不能再用同一靶点进行治疗。

发明内容

为了进一步提高肿瘤细胞的治疗效果，本申请提供一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法。

溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，目前已被大众接受作为肿瘤免疫治疗的重要分支。溶瘤病毒能够特异性地靶向感染肿瘤细胞，例如利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而选择性地感染肿瘤细胞；溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，会在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。同时，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号，从而吸引更多的免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。因此，溶瘤病毒具有打破肿瘤组织微环境、把“冷肿瘤”变为“热肿瘤”的能力。

同时，通过溶瘤病毒在肿瘤细胞中表达肿瘤相关抗原构建成溶瘤病毒疫苗，利用溶瘤病毒疫苗不仅能够利用溶瘤病毒自身杀死肿瘤细胞，同时打破肿瘤组织微环境，而且，还能够利用溶瘤病毒表达的肿瘤相关抗原标靶肿瘤细胞(MARK),把“没有肿瘤相关抗原靶点、不能被治疗的肿瘤”转化为“有肿瘤相关抗原靶点且能够治疗的肿瘤”。利用溶瘤病毒疫苗和针对该肿瘤相关抗原靶点的免疫细联合攻击杀死肿瘤细胞，溶瘤病毒疫苗表达的肿瘤抗原不仅能够引导免疫细胞到达靶肿瘤组织中心，而且溶瘤病毒联合免疫细胞杀死肿瘤细胞，并能够达到1+1大于2的疗效。

进一步，为了提高治疗效果，在溶瘤病毒中还可以插入细胞因子。在溶瘤病毒、细胞因子和免疫细胞三种抗肿瘤机制的协同作用下，发挥了更强的抗肿瘤作用。

本申请提供的一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，采用如下的技术方案：

一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，利用免疫细胞和溶瘤病毒疫苗联合治疗肿瘤；所述溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞；所述免疫细胞嵌合与所述肿瘤抗原配对的抗原受体，用于杀伤或杀灭被标靶的肿瘤细胞。

所述重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白。

与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，所述M蛋白的位点突变包含M51R、V221F、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、敲除第111位亮氨酸编码碱基、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、L111A、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R。

与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列相比，所述G蛋白的位点突变包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H。

与SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列相比，所述N蛋白的位点突变包含I14V、R155K、S353N。

与SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列相比，所述P蛋白的位点突变包含R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D。

与SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列相比，所述L蛋白的位点突变包含S87P、I487T。

在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型M蛋白包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。

在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型G蛋白包含如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列。

在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型N蛋白包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列。

在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型P蛋白包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列。

在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型L蛋白包含如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以棒状病毒为基础，进行定点突变后获得的。

在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以水疱性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus，简称“VSV”)病毒为基础，进行定点突变后获得的。

在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以VSV Indiana MuddSummer亚型为基础，进行定点突变后获得的。

进一步地，所述肿瘤抗原选自实体瘤抗原或血液瘤抗原。

进一步地，所述实体瘤抗原包括但不限于5T4、RORl、EGFR、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、CD28、CD137(4-1BB)、CTLA-4、HER-2、FAS、FAP(成纤维细胞活化蛋白)、LGR5、C5aR1、A2AR、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、FGFR2、FGFR3、FGFR4、糖皮质激素诱导的TNFR相关(GITR)蛋白、淋巴毒素-β受体(LTβR)、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体1(TRAIL受体1)、TRAIL受体2、前列腺特异性膜抗原(PSMA)蛋白、前列腺干细胞抗原(PSCA)蛋白、肿瘤相关蛋白碳酸酐酶IX(CAIX)、表皮生长因子受体1(EGFR1)、EGFRvIII、ErbB3(HER3)、叶酸受体、肝配蛋白受体、PDGFRa、ErbB-2、CD2、CD40、CD74、CD80、CD86、CCAM5(CD66e)、CCAM6(CD66c)、p53、cMet(酪氨酸蛋白激酶Met)、HGFR、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BACE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC2、P-钙粘蛋白、肌肉抑制素(Myostatin)(GDF8)、Cripto(TDGF1)、MUC5AC、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、CD28、CD137、CanAg、Mesothelin(MSLN)、DR5、PD-1、PD-L1、IGF-1R、CXCR4、神经纤毛蛋白1(Neuropilin，NRP-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖类(glypican2/3，GPC2/3)、EphA2、B7-H3、B7-H4、gpA33、GPC3、SSTR2、GD2、VEGF-A、VEGFR-2、PDGFR-a、ANKL、RANKL、MSLN、EBV、TROP2、FOLR1、AXL、Claude 18.2、MUC1、TPBG。

进一步地，所述血液瘤抗原包括但不限于BCMA(TNFRSF17)、CD4、CD5(Leu-1)、CD7、CD10、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b)、CD19、CD20(MS4A1)、CD22(Siglec-2)、CD23、CD30(TNFRSF8)、CD33(Siglec-3)、CD34、CD37、CD38、CD44、CD47、CD56(NCAM1)、CD70、CD117、CD123(IL3RA)、CD138(SDC1)、CD174、CLL-1、ROR1、NKG2DL1/2(ULBP1/2)、IL1R3(IL-1-RAP)、FCRL5、GPRC5D、CLEC12A、WT1、FLT3、TLR8、SHP2、KAT6A/B、CSNK1A1、FLI1、IKZF1/3、PI3K、c-Kit、SLAMF3(CD229)、SLAMF7(CD319)、TCR B-chain、ITGB7、k-1gG、TACI、TRBCI、LeY。

进一步地，所述肿瘤抗原选自如下任意一种或多种：CD19、CD22、BCMA、MUC1、NY-ESO-1、MAGE A4、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG、AFP、MAGE-A10。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为CD19。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为CD22。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为BCMA。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为MUC-1。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为NY-ESO-1。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为MAGE A4。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为cMet。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为Claude 18.2。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为MSLN。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为EGFR。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为VEGFR2。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原为HER-2。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原CD19包含如SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原CD22包含如SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原BCMA包含如SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原MUC-1包含如SEQ ID NO 23所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原NY-ESO-1包含如SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原MAGE A4包含如SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原cMet包含如SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原Claude 18.2包含如SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原MSLN包含如SEQ ID NO 28所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原EGFR包含如SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原VEGFR2包含如SEQ ID NO 30所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原HER-2包含如SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原TPBG包含如SEQ ID NO 32所示的氨基酸序列。

进一步地，所述重组溶瘤病毒表达的所述肿瘤抗原至少为一个或多个。

进一步地，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞和M细胞。

进一步地，所述免疫细胞选自CAR-T细胞、TCR-T细胞、CAR-γδ-T细胞、CAR-Crispered-T细胞、STAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-M细胞。

进一步地，所述免疫细胞选自自体细胞、异体细胞或IPSC来源的免疫细胞。

进一步地，所述免疫细胞包含经体外扩增得到的免疫细胞。

进一步地，所述免疫细胞表达所述抗原受体的数量至少为一个或多个。

进一步地，所述重组溶瘤病毒还包括外源基因编码的细胞因子。

进一步地，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族。

进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-β、TGF-β和TNF-α。

进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、IFN-β。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为GM-CSF。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-2。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-12。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-15。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-18。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为TNF-α。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IFN-β。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12包含如SEQ ID NO 33所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12包含如SEQ ID NO 34所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-15包含如SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-18包含如SEQ ID NO 36所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列、编码所述肿瘤抗原的核酸序列和编码所述细胞因子的核酸序列。

在一个具体的实施方式中，所述核酸分子中，所述编码肿瘤抗原的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述具有位点突变的L蛋白的核酸序列之间。

在一个具体的实施方式中，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。

在一个具体的实施方式中，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于所述编码肿瘤抗原的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间或位于编码所述位点突变的G蛋白与所述编码肿瘤抗原的核酸序列之间。

在一些具体的实施方式中，所述溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法用于持续杀伤异常增生性细胞。

在一些具体的实施方式中，所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞。

在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。

在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、感觉神经母细胞瘤、尤文肉瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、肝细胞癌、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞增生症、喉癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、咽癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状颈癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌和血管肿瘤。

本申请还提供了一种组合物，该组合物包括上述溶瘤病毒疫苗和免疫细胞。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法对异常增生性(肿瘤)LLC细胞具有较好的体外杀伤能力，并且对正常MEF细胞的体外杀伤能力较差。因此，本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染和杀伤，且在肿瘤、癌症等细胞内不易清除，进一步提高了重组溶瘤病毒对肿瘤、癌症等细胞的治愈率；同时，上述提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法不会损伤正常细胞，且重组溶瘤病毒在正常细胞内时更加容易清除，进一步保证了正常细胞的安全性。

附图说明

图1为本申请制备例9-83提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。

图2为本申请制备例9-83提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。

图3为本申请制备例84-95提供的溶瘤病毒疫苗和制备例96-113提供的免疫细胞以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。

图4为本申请制备例84-95提供的溶瘤病毒疫苗和制备例96-113提供的免疫细胞以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。

图5为本申请制备例9-83提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法的肿瘤细胞杀伤率。

图6为本申请制备例84-95提供的溶瘤病毒疫苗和制备例96-113提供的免疫细胞的肿瘤细胞杀伤率。

以上附图中，横坐标上0号表示野生型溶瘤病毒；横坐标9-113号分别表示制备例9-113。

纵坐标OD₅₇₀表示细胞的OD值，OD₅₇₀的值越大，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；OD₅₇₀的值越小，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“溶瘤病毒”(oncolytic virus)通常指能够在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的病毒。溶瘤病毒包括但不限于：水疱性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus，简称“VSV病毒”)、痘病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒(SVV)、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒(NDV)和马拉巴病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以提高对肿瘤细胞的选择性。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以降低其免疫原性。

在一些实施方案中，VSV病毒为VSV病毒Indiana MuddSummer亚型株的突变体，可以用来治疗肿瘤。这种病毒不会与正常细胞中的内源IFN-β相互作用，只能在肿瘤细胞中选择性地扩增和生长。

VSV病毒能够表达多种细胞表面分子，包括低密度脂蛋白受体、磷脂酰丝氨酸、唾液脂(sialolipid)和硫酸类肝素，并且能够通过这些分子附着于细胞表面。与目前正在开发的其他溶瘤细胞病毒平台相比，VSV病毒具有以下优势：(1)基因组小，复制时间短，跨突触速度快；(2)外源基因表达极高，因此其可以具有高滴度，允许大规模生产；(3)有独立的细胞周期，且在宿主细胞的细胞质中没有转化的风险。这种溶瘤病毒不会整合到DNA中，经过减毒后，可以避免野生型病毒所引起的神经系统炎症。鉴于上述特点，VSV在肿瘤免疫疗法中具有很好的潜力。

在一些实施方案中，可以对VSV病毒的M蛋白、和/或G蛋白、和/或N蛋白、和/或P蛋白、和/或L蛋白进行定点基因突变。

在某些实施方式中，本申请所述重组溶瘤病毒可以是经过基因水平改造的溶瘤病毒，如经过一个或多个基因的修饰来改造，从而提高其肿瘤选择性和/或在分裂细胞中优先复制。所述基因水平的改造可以为修饰参与DNA/RNA复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散过程的基因，也可以为整合外源基因的改造。所述外源基因可以包括外源免疫调节基因、外源筛选基因、外源报告基因等。所述经过改造的溶瘤病毒也可以是经过氨基酸水平改造的溶瘤病毒，如一个或多个氨基酸的插入、缺失、置换。

在本申请中，术语“M蛋白”通常指VSV病毒基质蛋白。M蛋白是VSV病毒重要的毒力因子，也是VSV病毒中已知可干扰小鼠天然免疫应答的蛋白。术语“M蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型M蛋白可以包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的M蛋白可以包含如SEQ ID NO 2-11所示的氨基酸序列。

在本申请中，术语“G蛋白”通常指VSV病毒的糖蛋白，也称包膜蛋白。术语“G蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒IndianaMuddSummer亚型G蛋白可以包含如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的G蛋白可以包含如SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列。

在本申请中，术语“N蛋白”通常指VSV病毒的核衣壳蛋白。术语“N蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒IndianaMuddSummer亚型N蛋白可以包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的N蛋白可以包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列。

在本申请中，术语“P蛋白”通常指VSV病毒的磷酸蛋白。术语“P蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型P蛋白可以包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的P蛋白可以包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列。

在本申请中，术语“L蛋白”通常指VSV病毒RNA聚合酶蛋白。VSV病毒的L基因编码RNA poly E蛋白。术语“L蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型L蛋白可以包含如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的L蛋白可以包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。

在本申请中，蛋白突变位点的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+突变后的氨基酸”来表述。在本申请中，所述突变可以包括但不限于氨基酸的增加、替换、缺失和/或删除。例如，术语“M51R”通常指第51位甲硫氨酸M突变为精氨酸R。

在本申请中，术语“氨基酸取代”通常是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的一个氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，“在xx位置处取代”通常是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置xx处的氨基酸。在本申请中，所述氨基酸取代可以包括氨基酸突变。

在本申请中，术语“突变”通常是指改变野生型分子的核苷酸或氨基酸序列。氨基酸变化可以包括氨基酸的置换、删除、缺失、插入、添加、截短、或蛋白质的加工或切割。

本申请中，所述重组溶瘤病毒是在对VSV病毒的M蛋白、和/或G蛋白、和/或N蛋白、和/或P蛋白、和/或L蛋白进行定点基因突变的同时，整合外源基因。所述外源基因具体为编码肿瘤抗原和/或细胞因子的基因。

在本申请中，术语“抗原”(antigen)是指能引起抗体或者免疫细胞生成的物质，是任何可诱发机体发生免疫应答的物质。即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞.使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此，抗原物质具备两个重要特性：免疫原性(immunogenicity)和免疫反应性(immunoreactivity)。免疫原性即指抗原诱导机体发生特异性免疫应答，产生抗体和/或致敏淋巴细胞的能力；免疫反应性是指能与相应的免疫效应物质(抗体或致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合反应的能力。

在一个具体的实施方式中，所述溶瘤病毒被工程化为携带可以被免疫细胞(如CAR-T细胞)识别的抗原的编码序列。

在一些具体的实施方式中，所述抗原是外源性的，意味着所述抗原来自不同的物种。

在一些具体的实施方式中，所述抗原是内源性抗原。具体的，所述抗原是通常在肿瘤细胞上表达的抗原。

在一个具体的实施方法中，所述抗原为肿瘤相关抗原(Tumor AssociatedAntigen:TAA)或者肿瘤特异性抗原(Tumor Specific Antigen:TSA)。

在一个具体的实施方法中，TAA或TSA涵盖了呈递在细胞表面上(CAR识别的抗原)或者细胞膜内(TCR识别的抗原)或存在于肿瘤环境中(例如在肿瘤微环境中)的分子或其中一部分。

在一些具体的实施方式中，所述细胞为肿瘤细胞。

在一些具体的实施方式中，TAA或TSA包括细胞表面或细胞膜内的肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原。

在一些具体的实施方式中，所述细胞是存在于肿瘤环境中的非肿瘤细胞。例如但不限于存在于与肿瘤或癌症相关的脉管系统组织内的细胞。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA是肿瘤微环境中的血管生成的抗原。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA是肿瘤微环境中的血管上的抗原。

在一些具体的实施方式中，所述细胞是存在于肿瘤环境中的基质细胞。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA是肿瘤微环境中的基质细胞抗原。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包括肿瘤细胞表面抗原的细胞外表位、肿瘤细胞膜内外的四聚体或者其他可被抗体或者免疫细胞识别的结构。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包括细胞外基质抗原。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包含存在于肿瘤微环境(TME)中的抗原。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包含由肿瘤细胞分泌到TME中的分子。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包含由肿瘤细胞分泌到TME中的效应分子。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包含由肿瘤细胞分泌到TME中以下调或抑制细胞毒性自然杀伤(NK)细胞或T细胞的活性的效应分子。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA包含由肿瘤细胞分泌到TME中以阻断NK细胞或T细胞对肿瘤细胞的识别的可溶性激活受体配体。

在一些具体的实施方式中，TAA或者TSA的实例包括但不限于5T4、RORl、EGFR、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、CD28、CD137、CTLA-4、FAS、FAP(成纤维细胞活化蛋白)、LGR5、C5aR1、A2AR、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、FGFR2、FGFR3、FGFR4、糖皮质激素诱导的TNFR相关(GITR)蛋白、淋巴毒素-β受体(LTβR)、toll样受体(TLR)、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体1(TRAIL受体1)、TRAIL受体2、前列腺特异性膜抗原(PSMA)蛋白、前列腺干细胞抗原(PSCA)蛋白、肿瘤相关蛋白碳酸酐酶IX(CAIX)、表皮生长因子受体1(EGFR1)、EGFRvIII、人表皮生长因子受体2(Her2/neu；Erb2)、ErbB3(Her3)、叶酸受体、肝配蛋白受体、PDGFRa、ErbB2、CD2、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38、CD70、CD74、CD56、CD80、CD86、CD123、CCAM5、CCAM6、BCMA、p53、cMet(酪氨酸蛋白激酶Met)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、Wilms肿瘤抗原(WT1)、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、P-钙粘蛋白、肌肉抑制素(Myostatin)(GDF8)、Cripto(TDGF1)、MUC5AC、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、CD28、CD137、CanAg、间皮素、DR5、PD-1、PD-L1、HER-2、IGF-1R、CXCR4、神经纤毛蛋白1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖类、EphA2、CD138、B7-H3、B7-H4、gpA33、GPC3、SSTR2或VEGF-R2。

可用于本申请的示例性免疫细胞包括但不限于树突状细胞(包括未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞)、T淋巴细胞(如初始T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤T细胞、Treg细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、外周血单核细胞(PBMC)及其组合。免疫细胞亚群可以通过本领域已知的一种或多种细胞表面标记(例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)的存在或不存在来定义。在药物组合物包含多个工程化哺乳动物免疫细胞的情况下，这些工程化哺乳动物免疫细胞可以是免疫细胞类型的特定亚群、免疫细胞类型的亚群的组合或者两种或更多种免疫细胞类型的组合。

NK细胞是一种先天淋巴细胞，是T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，无需抗原预先致敏即可非特异性杀伤肿瘤细胞。

过继性NK细胞疗法，向患者注输的是健康的、经过细胞因子活化的NK细胞。通过不同渠道收集NK细胞，例如外周血NK细胞、来自脐带血或胎盘的NK细胞以及从诱导多能干细胞(IPSC)分化生成的NK细胞，在体外增强功能后进行注输，从而增强患者体内的肿瘤杀伤能力。

基因工程化NK细胞疗法，与过继性NK细胞疗法不同的是，这一治疗方法采取注输基因改造的NK细胞，包括CAR-NK细胞，从而实现针对性杀伤，增强其抗肿瘤效应。与CAR-T疗法相比，CAR-NK细胞具有细胞因子释放综合征风险更小等优势。基于CAR-T的成功，CAR-NK这一治疗手段的热度在逐年上升，相关研究人员针对CAR-NK疗法体外扩增难、转染效率低、细胞持久性较差等挑战开发创新性应对措施。

在一些具体的实施方式中，该免疫细胞存在于同质细胞群中。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞存在于可在免疫细胞中增强的异质细胞群中。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是淋巴细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞不是淋巴细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞适用于过继免疫疗法。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是PBMC。在一些实施例中，该工程化免疫细胞衍生自PBMC的免疫细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是T细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是CD4+T细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是CD8+T细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是表达TCRα和TCRβ链的T细胞(即αβT细胞)。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是表达TCRγ和TCRδ链的T细胞(即γδT细胞)。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是γ9δ2T细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是δ1T细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是δ3T细胞。

在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是B细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是NK细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是NK-T细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是树突状细胞(DC)。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是DC激活的T细胞。

在一些具体的实施方式中，该免疫细胞衍生自原代细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞是分离自个体的原代细胞。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞从分离自个体的原代细胞繁殖(例如，增殖和/或分化)而来。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自胸腺。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自淋巴或淋巴结(例如，肿瘤引流淋巴结)。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自脾。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自骨髓。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自血液，例如外周血。在一些具体的实施方式中，该原代细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些具体的实施方式中，该原代细胞衍生自血浆。在一些具体的实施方式中，该原代细胞衍生自肿瘤。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自粘膜免疫系统。在一些具体的实施方式中，该原代细胞获取自活检样品。

在一些具体的实施方式中，该免疫细胞衍生自细胞系。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞获取自商业细胞系。在一些具体的实施方式中，该免疫细胞从分离自个体的原代细胞建立的细胞系繁殖(例如，增殖和/或分化)而来。在一些具体的实施方式中，该细胞系是短命(mortal)细胞系。在一些具体的实施方式中，该细胞系是永生化(immortalized)细胞系。在一些具体的实施方式中，该细胞系是肿瘤细胞系，例如白血病或淋巴瘤细胞系。在一些具体的实施方式中，该细胞系是衍生自PBMC的细胞系。在一些具体的实施方式中，该细胞系是干细胞系。在一些具体的实施方式中，该细胞系是NK-92。在一些具体的实施方式中，该工程化免疫细胞衍生自干细胞。在一些具体的实施方式中，该干细胞是胚胎干细胞(ESC)。在一些具体的实施方式中，该干细胞是造血干细胞(HSC)。在一些具体的实施方式中，该干细胞是间充质干细胞。在一些实施例中，该干细胞是诱导多能干细胞(IPSC)。

在本申请中，术语“细胞因子”(cytokines)是由免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)及其相关细胞(血管内皮细胞、成纤维细胞等)合成和分泌的调节其他免疫细胞或靶细胞功能的生物活性物质，属小分子多肽或糖蛋白。具有免疫调节作用的细胞因子都可以通过重组溶瘤病毒进行表达。按其主要功能，细胞因子分为：白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、转化生长因子-β家族(transforming growthfactor-βfamily，TGF-βfamily)、生长因子(growth factor，GF)、趋化因子家族(chemokinefamily)。

白细胞介素包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21、IL-4、IL-12、IL-18。

具体地，白细胞介素1(IL-1)：IL-1是一种多效细胞因子，涉及皮质的炎症反应、细胞生长和组织修复。IL-1超家族有11个成员，如IL-1A、IL-1B、IL-1Ra、IL-18等。IL-1是一些癌症的药物靶点，也用于细胞治疗。在细胞免疫治疗方面，IL-1可体外刺激CD4+T细胞的增殖，诱导IL-2的产生，共刺激CD8+/IL1R+T细胞活化，并刺激成熟的B细胞增殖和免疫球蛋白的分泌。

具体地，白细胞介素2(IL-2)：IL-2也称为T细胞生长因子，由T细胞响应于抗原或有丝分裂刺激产生，广泛应用于促进T细胞和NK细胞的活化和增殖。IL-2能够刺激NK细胞增殖、增加细胞毒作用并刺激NK细胞分泌多种细胞因子。但是进一步的研究发现，IL-2可以引起T细胞过度分化和诱导活化的T细胞凋亡，还可以激活CD4+FoxP3 Treg调节细胞，进而抑制T细胞的活化和肿瘤杀伤活性，因此认为IL-2属于T细胞调节因子而不单单是激活因子，所以现在有的研究已经用IL-7，IL-15，IL-21来代替IL-2了。

具体地，白细胞介素7(IL-7)：IL-7属于造血生长因子，由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌，与IL-2共用γc受体亚单位，刺激淋巴祖细胞的增殖。IL-7可以为

T细胞和记忆T细胞提供持续的刺激信号。如上所述，IL-7在激活CD8+T细胞过程中，不会激活CD4+FoxP3+Treg细胞。在临床上，IL-7还可以应用于化疗或造血干细胞移植后T细胞数量的恢复。并且IL-7在B细胞成熟的某些阶段具有重要作用，可以影响其增殖。IL-7还可以作为肠粘膜淋巴细胞的调节因子。

具体地，白细胞介素15(IL-15)：IL-15与IL-2具有相似的结构，共用γc受体亚单位，属于具有4个α-helix螺旋束家族(其它的如IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，G-CSF和GM-CSF)。IL-15调节T细胞和NK细胞的激活和增殖。IL-15在先天免疫系统中主要是杀死病毒感染的细胞。同时IL-15可活化NKT细胞和γδT细胞。在免疫细胞治疗中，IL-15不会引起活化的T细胞凋亡，激活CD8+效应T细胞。IL-15维持记忆性T细胞存活，从而对长期抗肿瘤活性中起重要作用。

具体地，白细胞介素21(IL-21)：IL-21同样属于IL-2家族，共用γc受体亚单位，对免疫系统的细胞有很强的调节作用，可以在其靶细胞中诱导细胞分裂、增殖。在细胞免疫治疗中，IL-21可以促进CD4+和CD8+T细胞的增殖，增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性，不会因活化造成细胞凋亡。IL-21会优先扩增“年轻态”的CD27+CD28+的CD8+T细胞，这类细胞具有更强的细胞毒性。当然，IL-21也不会引起Treg的扩增，因此，IL-21在细胞免疫治疗中的应用越来越广泛。

具体地，白细胞介素4(IL-4)：IL-4激活活化的B细胞和T细胞增殖，调节淋巴细胞和单核细胞上Fc受体的表达。IL-4诱导Th1细胞向Th2细胞转化。IL-4刺激Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。IL-4通过抑制巨噬细胞的生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。培养体系中不加IL-4时单核细胞将分化为巨噬细胞。IL-4在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用,诱导B细胞抗体类别转换向IgE，上调MHC II类分子的产生。IL-4和GM-CSF共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力较弱，IL-4和TNF-α顺序使用可以促进DC成熟。

具体地，白细胞介素12(IL-12)：IL-12作用于活化的T和NK细胞，具有广泛的生物活性，通过转录蛋白STAT4的活化剂介导来对淋巴细胞产生作用。IL-12是IFN-γ的T细胞非依赖性诱导所必需的，对于Th1和Th2细胞的分化有重要作用。IL12B与IL23A结合形成IL-23白介素，具有先天和适应性免疫功能。IL-12属于药物靶点。在细胞免疫治疗中，IL-12促进CD4+T细胞分化为CD4+Th1 T细胞，增强CD8+CTLs细胞活性。IL-12的治疗效果与其剂量、作用时间以及其它相互作用的细胞因子等有关，通过多种机制促进免疫细胞的肿瘤杀伤活性。在小鼠抗黑色素瘤模型中，高剂量的IL-12通过NK细胞起作用，而低剂量的IL-12则通过NKT起到肿瘤杀伤作用。

具体地，白细胞介素18(IL-18)：IL-18也称为干扰素-γ诱导因子，属于促炎细胞因子，由巨噬细胞和其他细胞产生。IL-18能够刺激NK细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ，增强NK细胞与CD8+T细胞的细胞毒作用。IL-18还可以活化巨噬细胞，促进Th1 CD4+T细胞的发育，促进淋巴细胞表达FasL等功能。IL-18可为过敏性疾病提供潜在的治疗靶点。此外，IL-18、IL-12和IL-15协同作用可以维持自身免疫疾病中的Th1应答和单核因子生成。

伽马干扰素属于II型干扰素，主要由NK和NKT细胞产生，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，包括IFN-γ、IFN-β。IFN-γ对转化细胞具有抗增殖作用，可加强I型干扰素的抗病毒和抗肿瘤作用。IFN-γ通过激活巨噬细胞，诱导抗原呈递细胞(APCs)上的MHC I、MHCII和共激活分子表达。此外，IFN-γ可以诱导蛋白酶体的表达变化从而增强抗原呈递能力。IFN-γ还可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化，阻遏依赖于IL-4的B细胞亚型切换。IFN-γ通过磷酸化JAK1和JAK2蛋白进而激活JAK-STAT细胞途径。在细胞免疫治疗中，IFN-γ作用于宿主免疫细胞，对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。IFN-γ通过促进巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达，或使某些正常情况不表达MHCⅡ类分子的细胞(如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHCⅡ类分子，进而增强抗原递呈能力。IFN-γ可以促进B细胞和CD8+T细胞的分化，但不能促进其增殖。IFN-γ能增强TH1细胞的活性及免疫功能。IFN-γ增强中性粒细胞吞噬能力及活化NK细胞，增强其细胞毒作用。IFN-γ表达异常与许多自身炎症和自身免疫性疾病有关。

肿瘤坏死因子属于TNF超家族细胞因子，是生物过程调控的多功能分子，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血等。TNF-α参与抗肿瘤。在细胞免疫治疗方面，TNF-α使未成熟DC分化为成熟DC。这一过程通过TNF-α下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，上调细胞表面MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80，CD86等)的表达来实现。成熟DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，但抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。TNF-α还可以影响其它细胞因子的生成，如刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN-γ等淋巴因子产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在胚胎移植及其发育中具有关键作用。GM-CSF是最早发现的对于DC有作用的细胞因子之一。在DC培养中，GM-CSF促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，促进细胞表面MHC II类分子的表达，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。在细胞免疫治疗方面，GM-CSF可以激活免疫反应，通过激活巨噬细胞和DC而产生抗肿瘤活性。在抗原呈递方面，GM-CSF可以促进DC细胞成熟，促进共刺激分子上调和CD1d受体表达。近期研究发现，GM-CSF刺激造血祖细胞分化为单核细胞和嗜中性粒细胞，从而降低癌症患者发热性中性粒细胞减少的风险。还有研究证明GM-CSF可以诱导骨髓DC的分化，促进Th1细胞偏向免疫应答，促进血管生成，影响过敏性炎症和自身免疫疾病的发展。因此，GM-CSF在临床上被用来治疗恶性肿瘤。

在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的核苷酸。在本申请中，术语“核酸分子”可以编码所述溶瘤病毒包含的蛋白。在本申请中，所述核酸分子可以包含DNA和/或RNA。在某些情形下，所述RNA可以包含单链RNA(ssRNA)，也可以包含双链RNA(dsRNA)，单链RNA可以包含正义RNA，也可以包含反义RNA(anti-sense RNA),也可以包含双义RNA。

在本申请中，术语“预防”通常是指通过预先采取某些措施而防止疾病或其一种或多种症状的产生和发作，复发，和/或扩散。在本申请中，术语“治疗”通常指消除或改善疾病，或与疾病相关的一种或多种症状。在某些实施方案中，治疗通常指向患有这种疾病的患者施用一种或多种药物使得疾病消除或缓解。在某些实施方案中，“治疗”可以是在特定疾病的症状发作后，在其他药物存在或不存在的情况下施用所述药物组合和/或药物产品。例如，使用本申请所述药物组合和/或药物产品防止肿瘤的产生，发展，复发和/或转移。

在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。在本申请中，所述肿瘤可以是实体瘤和/或血液瘤。用于研究时，可通过本领域技术人员熟知的方法从易于获得的资源中将这些组织分离出来。

在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、乳腺癌(BRCA)、宫颈癌、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、感觉神经母细胞瘤、尤文肉瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、肝细胞癌、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞增生症、喉癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、咽癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状颈癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌和血管肿瘤。

发明详述

一种野生型VSV病毒，具体为VSV病毒印第安纳株，VSV病毒Indiana MuddSummer亚型株。其M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；其G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示；其N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 14所示；其P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示；其L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。在本申请中，所述M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白均可以被改造。

一种重组溶瘤病毒，该溶瘤病毒是以上述野生型VSV病毒为基础，通过对其M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白的氨基酸序列上的位点进行突变获得的。

本申请提供一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，具体包括：

利用免疫细胞和溶瘤病毒疫苗联合治疗肿瘤。

溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞(MARK)。该重组溶瘤病毒不仅能够靠自身杀死肿瘤细胞，还能够标靶肿瘤细胞，能将“没有靶标但需要被治疗的肿瘤”转化为“有靶标且能够被治疗的肿瘤”。

免疫细胞嵌合与所述肿瘤抗原配对的抗原受体，用于杀伤或杀灭被标靶的肿瘤细胞，并供给和杀死b被溶瘤病毒疫苗标靶的肿瘤细胞，达到1+1大于2的疗效。

进一步地，所述重组溶瘤病毒是在上述重组溶瘤病毒的基础上导入编码肿瘤抗原的外源基因获得的。

进一步地，所述肿瘤抗原选自血液癌抗原和实体瘤抗原。

进一步地，所述肿瘤抗原选自如下任意一种或多种：CD19、CD22、BCMA、MUC1、NY-ESO-1、MAGE A4、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2。

进一步地，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞和M细胞。

进一步地，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族、生长因子。

所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列、编码所述肿瘤抗原的核酸序列和编码所述细胞因子的核酸序列。

在本申请中，可以通过病毒包装过程和病毒拯救过程获得本申请所述的重组溶瘤病毒。具体过程可以包括用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感染接种BSR-T7细胞，使用分别克隆VSV N、VSV P、VSV L基因的表达质粒和骨架质粒进行lipofectamine转染，获得目的溶瘤病毒。

本申请提供了一种组合物，该组合物包含上述重组溶瘤病毒和免疫细胞。

在某些实施方案中，该组合物可以包括一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选对接受者无毒。本申请的组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。

在某些实施方案中，所述组合物可以包含肠胃外、经皮下、腔内、动脉内、静脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、真皮内或组织内施用。在某些实施方案中，所述组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。

本申请还提供了上述组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。

本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法中，溶瘤病毒疫苗中的重组溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，同时插入了外源基因编码的肿瘤抗原和/或细胞因子，同时免疫细胞上嵌合有杀死或杀伤肿瘤细胞的抗原受体，从而进一步提高了溶瘤病毒对异常增生性(肿瘤)LLC细胞的侵染能力。同时，上述制备的重组溶瘤病毒对正常细胞(正常MEF细胞)的侵染能力均较差，说明本申请制备的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。

本申请中，溶瘤病毒疫苗中的重组溶瘤病毒在异常增生性(肿瘤)LLC细胞均不易清除。相对而言，野生型溶瘤病毒在LLC细胞内更容易清除。而本申请提供的重组溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，同时插入了外源基因编码的抗原和/或细胞因子，使得溶瘤病毒在LLC细胞内更加不容易清除，进一步保证溶瘤病毒能够在LLC细胞内更好的发挥侵染和杀伤能力；同时，本申请提供的重组溶瘤病毒在正常MEF细胞内更加容易清除，进一步保证了正常MEF细胞的安全性，从而提高了重组溶瘤病毒的安全性。

以下结合制备例1-113和实施例对本申请作进一步详细说明。

制备例

制备例1-8

制备例1

制备例1提供了CAR-T细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

(1)CAR表达用逆转录病毒的生产

构建CD19-CAR序列，将构建的CD19-CAR序列插入到慢病毒包装系统中，使用lipofectamin3000(Invitrogen)将每个质粒转染到PhoenixECO细胞系(ATCC)后，将含有分泌24-48h的亲嗜性逆转录病毒(ecotropic retrovirus)的培养上清液添加到PG13逆转录病毒包装细胞系(PG13 retroviral packaging cellline)(ATCC)中并进行旋转感染(spininfection)(2500rpm，90min)。

将通过上述方法制备的PG13逆转录病毒生产细胞株的培养上清液收获并过滤(0.45μm过滤器)，去除细胞残留颗粒，并使用离心过滤装置(centrifugal filtrationdevice，Millipore Amicon100KD cut-off)浓缩4次后，获得CD19-CAR逆转录病毒，被用作CAR-T细胞构建用逆转录病毒浓缩液。

(2)制备CAR-T细胞

将通过正常人的白细胞成分采血(leukapheresis)获得的白细胞与抗-CD28抗体(CD28.2，2μg/ml，BD Biosciences)一起添加到包被抗-CD3抗体(OKT3，10μg/ml，BioXcell)的24孔板后，培养48h来活化T细胞。将活化的T细胞洗涤2次后，用于逆转录病毒转导(transduction)。

在4℃温度条件下将纤维连接蛋白(Retronectin)(20μg/ml，TaKaRa)过夜包被后，向洗过的24孔板中加入2％BSA-DPBS，并在37℃条件下封闭(blocking)30min，进行洗涤后，添加1ml逆转录病毒浓缩液，在2000×g、32℃条件下离心2h，以将逆转录病毒粘附于孔(well)的底面。去除逆转录病毒浓缩液并洗涤孔后，将1ml活化的T细胞(1×10⁶cells/ml)加入孔中并离心10min(1000×g，32℃)，以将细胞粘附于逆转录病毒。

接着，在人IL-2(300IU/ml，Proleukin，诺华(Novartis))存在下，培养48h。像这样，将逆转录病毒转导的T细胞洗涤2次后，加入含人IL-2(200IU/ml)的新鲜的培养液来增殖3-6d，以用作CAR-T细胞。

针对细胞表面的CAR蛋白的表达，将逆转录病毒转导后增殖3d的CAR-T细胞用CD19-Ck蛋白(CD19胞外区与人免疫球蛋白κ链恒定区(Ck)的融合蛋白)和标记有APC的抗-Ck抗体(anti-Ck-APC，BioLegend)进行染色后，通过流式细胞术(FACS-Calibur，BDBiosciences)来检测CAR-T细胞。

通过检测结果可知，CD19-CAR-T细胞构建成功。其中，CD19 CAR-T细胞(3^rdgeneration)的氨基酸序列如SEQ ID NO 66所示。

根据制备例1所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代CD19，可获得其他类型肿瘤抗原-CAR-T细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG、AFP等。除T细胞上装载的CAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD22-CAR-T细胞、BCMA-CAR-T细胞、MUC-1-CAR-T细胞、cMet-CAR-T细胞、Claude 18.2-CAR-T细胞、MSLN-CAR-T细胞、EGFR-CAR-T细胞、VEGFR2-CAR-T细胞、HER-2-CAR-T细胞、TPBG-CAR-T细胞、AFP-CAR-T细胞。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体CD19的氨基酸序列如SEQID NO 37所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体CD22重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 38所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 39所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体BCMA重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 40所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 41所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体cMet重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 42所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 43所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体Claude 18.2重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 44所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 45所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体MSLN重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 46所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 47所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体EGFR重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 48所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 49所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体VEGFR2重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 50所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 51所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体HER-2重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 52所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 53所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体TPBG重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 54所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 55所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体AFP重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 56所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 57所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体PD-L1的氨基酸序列如SEQID NO 72所示，PD-L1 CAR-T细胞(3^rd generation)的氨基酸序列如SEQ ID NO 73所示。

制备例2

制备例2提供了TCR-T细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

(1)特异性T细胞的克隆及测序

利用化学合成的肿瘤特异性短肽或者特异性抗原(NY-ESO-1)体外刺激来源于特定基因型的外周血单个核细胞(PBMC)。经过2轮多肽刺激后，使用肿瘤特异性短肽或者特异性抗原刺激多克隆T细胞于37℃共培养过夜，并用流式细胞仪分选出T细胞活化标志物阳性的目标T细胞。

分选后的T细胞(1×10⁶)经离心去除上清后重悬于1mL Trizol(RNeasyPlusuniversal Mini Kit，QIAGEN)，液氮速冻后送CRO公司测序(免疫组库测序)。

根据测序结果将TCRα链及TCRβ链进行配对，PCR构建包含恒定区的全长TCR(TCR序列的元件示意：TCRα可变区-TCRα，恒定区-P2A-TCRβ，可变区-TCRβ恒定区)并插入逆转录病毒载体中。

(2)制备特异性TCR-T细胞

将目标T细胞至逆转录病毒载体pMSGV1中(addgene)构建pMSGV1-TCR载体。转染病毒包装细胞系293GP细胞pMSGV1-TCR及pVSV-G质粒，制备逆转录病毒并采用病毒上清转导T细胞。

转染操作如下：第0天将293GP细胞接种至6孔板(6×10⁵/孔)；第1天，pMSGV1-TCR及pVSV-G质粒转染293GP细胞(2μg pMSGV1-TCR及1.4μg pVSV-G/孔)，同一天，采用抗人CD3抗体(OKT3)活化健康人的PBMC；第3天，收集含病毒上清的培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的DMEM)至293GP细胞中；用收集的病毒上清离心转染活化后的T细胞；第4天采用同样的方法第二次转染活化的T细胞；第5天将转染后的T细胞收集至T25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清及300IU/mL IL2的X-VIVO(Lonza))。第10天进行流式检测目标TCR的表达水平，通过抗体检测TCRβ链恒定区(TRBC)的表达率来检测TCR-T细胞的阳性率。

通过检测结果可知，NY-ESO-1TCR-T细胞构建成功。

根据制备例2所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代NY-ESO-1，可获得其他类型肿瘤抗原-TCR-T细胞。肿瘤抗原的类型还可以是MAGE A4、AFP、MAGE-A10、MAGE-1、MAGE-B2、MAGE-3、MAGE-6、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、SAGE、HAGE、SSX、SCP1、LAGE及黑色素瘤分化抗原，包括Melan-A、Mart-1、gp100、gp75、TRP21及TRP22等。除T细胞上装载的TCR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为MAGE A4、AFP、MAGE-A10、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-6、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、SAGE、HAGE、SSX、SCP1、LAGE及黑色素瘤分化抗原，包括Melan-A、Mart-1、gp100、gp75、TRP21及TRP22时，分别获得MAGE A4 TCR-T细胞、AFP-1TCR-T细胞、MAGE-A10 TCR-T细胞、MAGE-1TCR-T细胞、MAGE-2TCR-T细胞、MAGE-3TCR-T细胞、MAGE-6TCR-T细胞、BAGE TCR-T细胞、GAGE-1TCR-T细胞、GAGE-2TCR-T细胞、GAGE-8TCR-T细胞、GAGE-3TCR-T细胞、GAGE-4TCR-T细胞、GAGE-5TCR-T细胞、GAGE-6TCR-T细胞、GAGE-7b TCR-T细胞、SAGE TCR-T细胞、HAGE TCR-T细胞、SSX TCR-T细胞、SCP1 TCR-T细胞、LAGE TCR-T细胞、Melan-A TCR-T细胞、Mart-1 TCR-T细胞、gp100TCR-T细胞、gp75 TCR-T细胞、TRP21 TCR-T细胞、TRP22 TCR-T细胞。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体NY-ESO-1TCRα链的氨基酸序列如SEQ ID NO 58所示，TCRβ链的氨基酸序列如SEQ ID NO 59所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体MAGE A4 TCRα链的氨基酸序列如SEQ ID NO 60所示，TCRβ链的氨基酸序列如SEQ ID NO 61所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体AFP TCRα链的氨基酸序列如SEQ ID NO 62所示，TCRβ链的氨基酸序列如SEQ ID NO 63所示。

在一个具体的实施方式中，与肿瘤抗原配对的抗原受体MAGE-B2 TCRα链的氨基酸序列如SEQ ID NO 64所示，TCRβ链的氨基酸序列如SEQ ID NO 65所示。

制备例3

制备例3提供了CAR-γδ-T细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

(1)慢病毒包装

质粒转染：构建CD19-CAR序列，将构建的CD19-CAR序列插入到慢病毒包装系统中，将质粒、PEI、Opti-MEM培养基置于室温5min；取Opti-MEM 436μl于1.5ml EP管中，再加入64μl PEI混匀，室温静置5min；按6:9:9:16加入pLP1，pLP2，pLP-BaEVTR，表达质粒加，并加入Opti-MEM至500μl，室温静置5min；将配好的PEI-Opti-MEM溶液加入含质粒的Opti-MEM中，室温静置20min；将1ml DNA/PEI混合物慢慢滴入293T细胞中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，16-18h后更换新鲜培养基，放入5％CO₂、37℃培养箱继续孵育，获得CD19-CAR逆转录病毒。

病毒收集和浓缩：质粒转染48h后，收集上清后，于4℃、2820g离心20min，除去细胞碎片，用0.45μm滤器过滤得到的上清；将过滤后的病毒上清转入超离管中，于50000g离心2h，去除上清，加入适量培养基溶解沉淀，得到病毒液，分装于冻存管中，置于-80℃中保存，并取200μl病毒进行滴度测定。

病毒滴度检测：接种1×10⁵个293T细胞于24孔板，加入不同体积的病毒浓缩液，于5％CO₂、37℃培养箱培养，于72h后检测细胞的阳性率，从而计算病毒滴度。

(2)制备CAR-γδ-T细胞

分离PBMC：采集外周血50ml，在超净工作台正常工作状态下，用2支50ml灭菌离心管，分别加入15ml淋巴细胞分离液。将外周全血缓慢注入2只离心管中淋巴细胞分离液液面上层，每支离心管加25-30ml外周血。离心，700g×20min，升速1，降速2，室温。离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第2层)、分离液(第3层)和红细胞层(底层)构成。用吸管将第2层单个核细胞收集至新的离心管。加入PBS 20ml稀释细胞悬液，500g离心10min。

Day0刺激γδ-T细胞：移除上清，加入10ml GT-T551 H3培养基重悬PBMC后，取20μl细胞悬液计数。将上述细胞悬液以2×10⁶个细胞/mL接种于细胞培养瓶，加入10％(v/v)FBS、唑来膦酸终浓度为5μM、IL2终浓度为500IU/mL、IL21终浓度为10ng/mL。

感染病毒：Day3使用RetroNectin包被Non-tissue culture treated 24-wellplate，将RetroNectin母液用PBS液稀释至40ug/mL，添加1mL至24孔板中；用封口膜封闭，4℃过夜孵育。Day4吸走RetroNectin，用2％人血清白蛋白(0.5mL/孔)室温封闭30min，然后用PBS洗一遍；将慢病毒加至包被的孔中，培养板于32℃，1500g离心2h；所用培养基为GT-T551 H3培养基，并添加10％(v/v)FBS、IL2终浓度为500IU/mL、IL21终浓度为10ng/mL(后续若非特别说明则培养基均为此培养基)。然后吸走病毒，用PBS洗一遍孔(PBS在加入细胞时才吸走)。将离心收集的γδT细胞，用新鲜的完全培养基重悬至1×10⁶个细胞/mL(500uL/孔，即5E5个细胞/孔)；前后左右晃匀细胞，将孔板于32℃、1500g离心30min-2h，然后在37℃培养箱中继续过夜培养。

Day 5，再次进行一遍上述操作：包被，负载，感染。

Day 6，收集每孔的细胞，离心，然后用PBS洗一遍，用完全培养基重悬，接种至新的孔板中，接种密度为1-1.5×10⁶个细胞/mL。

αβT细胞去除：收集细胞，计数，用预冷DPBS洗涤细胞，离心后加入工作缓冲液(PBS，pH7.2，0.5％BSA，2mM EDTA)重悬，加入10μL Anti-TCRγ/δHapten-Antibody/10⁷细胞，于4℃孵育10min，加入工作缓冲液和MACS Anti-Hapten MicroBeads-FITC，混匀后于4℃孵育15min，加工作缓冲液洗涤细胞，离心后加入500μL工作缓冲液重悬，制得CD19-CAR-γδ-T细胞。

CAR表达率检测：于D10、D12、D14、D16、D18取CAR-γδ-T细胞和未转导病毒的γδ-T细胞(Mockcontrol)，加入Protein L染色，结果表明CAR-γδ-T细胞的阳性率在35％-50％之间，在培养过程中表达稳定，在D18天略有下降；Mock control细胞不表达CAR。

通过检测结果可知，CD19-CAR-γδ-T细胞构建成功。

根据制备例3所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代CD19，可获得其他类型肿瘤抗原-CAR-γδ-T细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG等。除T细胞上装载的CAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD22-CAR-γδ-T细胞、BCMA-CAR-γδ-T细胞、MUC-1-CAR-γδ-T细胞、cMet-CAR-γδ-T细胞、Claude 18.2-CAR-γδ-T细胞、MSLN-CAR-γδ-T细胞、EGFR-CAR-γδ-T细胞、VEGFR2-CAR-γδ-T细胞、HER-2-CAR-γδ-T细胞、TPBG-CAR-γδ-T细胞。

制备例4

制备例4提供了CAR-Crispered-T细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

(1)T细胞免疫检查点基因敲除

根据人PD-1、CTLA4、LAG-3和Tim-3基因的序列结构，并参考相关CRISPR基因编辑工具的现有研究内容，设计各自的sgRNA序列，其中为PD-1基因的sgRNA为gaggaccgcagccagcc，CTLA4基因的sgRNA为ctgcaaagca atgcacg，LAG-3基因的sgRNA为ggtgtgggcccaggagg，Tim-3基因的sgRNA为ggtcatcaaa ccagcca。将上述sgRNA核酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成并分别插入标准载体连接至CRISPR/CAS9表达载体pX330A，得到pX330A-PD-1、pX330A-CTLA4、pX330A-LAG-3、pX330A-Tim-3载体。

将上述载体电转染T细胞，具体步骤包括：取1×10⁷个T细胞，加入500μL电转缓冲液重悬细胞，并上下吹打均匀；细胞悬液中加入上述载体质粒(10ug)，上下吹打均匀，并转入无菌洁净的电转杯中，预定条件设置参数：300V，10ms，进行2次电击操作；电击完成后，将电转杯置于冰上孵育10min，以使核酸充分进入细胞；将电击杯从冰上取出，将细胞从电转杯中转移出来，过滤后计数，按照一定的细胞密度接种于新鲜的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

电转后第2～3天通过流式细胞术检测T细胞的目标表达情况，目标基因敲除效率＝(对照组表达量-实验组表达量)/对照组表达量×100％，结果显示T细胞的PD-1、CTLA4、LAG-3和Tim-3基因的敲除效率分别为98.5％、98.7％、99.2％和97.2％。

(2)CAR表达用逆转录病毒的生产

构建CD19-CAR序列，将构建的CD19-CAR序列插入到慢病毒包装系统中，使用lipofectamin3000(Invitrogen)将每个质粒转染到PhoenixECO细胞系(ATCC)后，将含有分泌24-48小时的亲嗜性逆转录病毒(ecotropic retrovirus)的培养上清液添加到PG13逆转录病毒包装细胞系(PG13 retroviral packaging cellline)(ATCC)中并进行旋转感染(spin infection)(2500rpm，90min)。

(3)制备CAR-Crispered-T细胞

将免疫检查点基因敲除的T细胞与抗-CD28抗体(CD28.2，2μg/ml，BDBiosciences)一起添加到包被抗-CD3抗体(OKT3，10μg/ml，BioXcell)的24孔板后，培养48小时来活化T细胞。将活化的T细胞洗涤2次后，用于逆转录病毒转导(transduction)。

在4℃温度条件下将纤维连接蛋白(Retronectin)(20μg/ml，TaKaRa)过夜包被后，向洗过的24孔板中加入2％BSA-DPBS，并在37℃条件下封闭(blocking)30min，进行洗涤后，添加1ml逆转录病毒浓缩液，在2000×g、32℃条件下离心2h，以将逆转录病毒粘附于孔(well)的底面。去除病毒(Virus)浓缩液并洗涤孔后，将1ml活化的T细胞(1×10⁶cells/ml)加入孔中并离心10min(1000×g，32℃)，以将细胞粘附于逆转录病毒。

接着，在人IL-2(300IU/ml，Proleukin，诺华(Novartis))存在下，培养48h。像这样，将逆转录病毒转导的T细胞洗涤2次后，加入含人IL-2(200IU/ml)的新鲜的培养液来增殖3-6d，以用作CAR-Crispered-T细胞。

针对细胞表面的CAR蛋白的表达，将逆转录病毒转导后增殖3天的CAR-Crispered-T细胞用CD19-Ck蛋白(CD19胞外区与人免疫球蛋白κ链恒定区(Ck)的融合蛋白)和标记有APC的抗-Ck抗体(anti-Ck-APC，BioLegend)进行染色后，通过流式细胞术(FACS-Calibur，BDBiosciences)来检测CAR-Crispered-T细胞。

通过检测结果可知，结果显示CD19-CAR-Crispered-T细胞构建成功。

根据制备例4所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代CD19，可获得其他类型肿瘤抗原-CAR-Crispered-T细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG等。除T细胞上装载的CAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD22-CAR-Crispered-T细胞、BCMA-CAR-Crispered-T细胞、MUC-1-CAR-Crispered-T细胞、cMet-CAR-Crispered-T细胞、Claude 18.2-CAR-Crispered-T细胞、MSLN-CAR-Crispered-T细胞、EGFR-CAR-Crispered-T细胞、VEGFR2-CAR-Crispered-T细胞、HER-2-CAR-Crispered-T细胞、TPBG-CAR-Crispered-T细胞。

制备例5

制备例5提供了靶向EGFR的STAR-T细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

(1)TCR恒定区序列确定

STAR中的TCR的α链和β链的恒定区(C区)均来源于人外周血T细胞的cDNA经PCR分子克隆而得；在原始TCR序列的基础上，分别把α链和β链的恒定区的第48和57个氨基酸位点突变为半胱氨酸，以帮助α链和β链之间形成额外的一个二硫键，增加其相互配对效率，并命名为E1-TCR。其中，TCRα链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO 67所示，TCRβ链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO 68所示。

(2)靶向EGFR的抗体序列确定

抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)选择西妥昔单抗(Cetuximab，简称Cetux)，仅作为实例解释本发明的内容，其他已知抗体均可进行替换。

(3)靶向EGFR的STAR构建

STAR含有两条多肽链，将Cetux-VL与TCR-β链融合为第一多肽链，将Cetux-VH与TCR-α链融合为第二多肽链。STAR的基因序列通过furin和p2A蛋白酶切位点多肽段相连，两条多肽链将一同被转录并翻译成一条融合多肽，之后再被furin和p2A对应的蛋白酶切割成为两个独立的蛋白亚基，这两个亚基间通过二硫键共价结合，并与T细胞内源的CD3亚基(ε、δ、γ、ζ)形成复合体。

整个基因通过限制性内切酶切位点NheI和NotI插入进慢病毒表达载体pHAGE中。该载体携带氨苄抗性、EF1α启动子以及IRES-RFP荧光报告基因。

(4)基因片段的克隆与组装

获得的四个片段“Cetux VL”，“TCRβ-C”，“Cetux-VH”，“TCRα-C”分别从pHAGE-Cetux-28zCAR载体以及pHAGE-E1-TCR载体上克隆获得。每对引物上都带有与前后同源的25bp碱基，四个片段通过Gibson Assembly的方法一步重组连接到慢病毒载体中。从而获得STAR。

其中，所述Cetux VL的氨基酸序列如SEQ ID NO 69所示，所述Cetux VL的氨基酸序列如SEQ ID NO 70所示。

(5)载体转化和测序

Gibson Assembly的产物被转化入了DH5α菌株，使其在含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆隆菌进测序，测序引物选用pHAGE载体上的引物seq-pHAGE-F和seq-pHAGE-R。

(6)质粒提取

将测序结果正确的菌接种在LB液体培养基中，过夜培养。使用具有去内毒素功能的试剂盒提取质粒。质粒浓度用Nanodrop测量，质粒终浓度在1000ng/μl左右，A260/A280值大于1.8。

(7)慢病毒包装

将携带目标基因的pHAGE载体与包装质粒pMD2.G与psPAX2按比例转染进293T细胞(使用PEI转染)。收集48h和72h的细胞培养基上清，并将上清与PEG8000混合，静置过夜后离心，可得病毒沉淀。用小体积的培养基重悬，起到病毒浓缩的效果。

(8)人类原代T细胞的分离、培养和慢病毒感染

取得人外周血细胞，使用全T细胞磁珠分离试剂盒将其中CD4和CD8T细胞纯化出来。然后将T细胞在用抗CD3/CD28的抗体包被的培养皿中刺激激活48-72h后，可观察到T细胞体积变大、聚团生长以及形状发生极化等现象。此时，用慢病毒病载体将目标基因转入T细胞，感染方法为32℃下1500rpm离心感染2h。病毒感染后，在含20％血清和200IU IL-2的RPMI 1640培养基中培养至足够数量。

(9)靶向EGFR的STAR上膜情况及抗原结合能力检测

取感染3天后的T细胞，用anti-human TCRα/β-BV421的流式抗体染色，之后进行流式检测。检测结果表明，与未转基因的阴性对照细胞相比，STAR可以被抗TCRα/β的抗体染色，并且染色水平与天然的E1-TCR相当。这一结果表明STAR分子可以上膜，并且其α链和β链可以配对。

取感染3天后的T细胞，用抗原蛋白EGFR-His以及anti-His-APC的流式抗体染色，之后进行流式检测。检测结果表明，与天然的E1-TCR(特异性不针对于EGFR)的阴性对照细胞相比，STAR显示较强的染色，并且染色水平与anti-EGFR的CAR相当。这一结果表明，STAR具有和CAR分子相当的抗原识别和结合能力。

(10)靶向EGFR的STAR-T细胞与靶细胞共孵育及其介导T细胞激活能力检测

取感染3天后的T细胞，分别在EGFR抗原包被的细胞培养板中培养、以及与肿瘤细胞A549(EGFR阳性的人肺癌细胞系)共孵育。24h后，收集细胞，并用anti-human CD69-FITC的流式抗体染色，之后进行流式检测。检测结果表明，STAR在抗原刺激下可以使得T细胞表达CD69的激活标志物，即STAR可以介导T细胞在抗原刺激后的激活，并且激活程度与CAR相当。同时可以发现，在无抗原刺激的静息状态下，STAR无自激活现象，而CAR有较高的自激活水平。

根据制备例5所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代CD19，可获得其他类型肿瘤抗原-STAR-T细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG等。除T细胞上装载的STAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD22-STAR-T细胞、BCMA-STAR-T细胞、MUC-1-STAR-T细胞、cMet-STAR-T细胞、Claude 18.2-STAR-T细胞、MSLN-STAR-T细胞、EGFR-STAR-T细胞、VEGFR2-STAR-T细胞、HER-2-STAR-T细胞、TPBG-STAR-T细胞。

制备例6

制备例6提供了CAR-NK细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

(1)NK细胞的制备

采用密度梯度离心法获得患者外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclear Cell,PBMC)。

具体步骤包括：用加有抗凝剂的采血管抽取20mL人外周血至离心管中，2000rpm离心10min；收集上层血浆，剩余血细胞沉淀中，加入等体积预温的生理盐水重悬，充分混匀；另取一支离心管，将混匀的血细胞沉淀按1:1体积轻轻地加到淋巴细胞分离液表面，18000rpm离心25min；小心吸取白色淋巴细胞层；将白膜层转移至新的离心管中，用PBS补至45mL，1500rpm离心5min，洗涤两次；加入适量的RPMI1640(含10％FBS)完全培养基重悬细胞并计数。

使用NK细胞分选试剂盒(购自biolegend公司)分选出NK细胞，使用RPMI1640(含10％FBS)进行扩大培养，并加入细胞因子IL-18(100U/mL)和IL-15(100U/mL)进行激活。

(2)制备CAR-NK细胞

将本发明中所提供的嵌合抗原受体基因片段(CD19)导入psb1576载体中，再将上述载体导入感受态细胞中，采用质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)提取质粒，测序鉴定目标基因序列是否正确。将阳性克隆质粒交由CRO公司分别合成慢病毒载体。

将制备的NK细胞激活，加入新鲜培养基中，在37℃，5％CO₂的环境下培养10天后，离心收集细胞；用新鲜培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁶cells/mL，按MOI＝10分别加入慢病毒于24孔培养板中，混匀后放置于37℃、5％CO₂培养箱培养，培养48-96h后更换新鲜培养基；应用PCR法测定CAR-NK细胞(CD19-CAR-NK细胞)的转导效率，阳性率达95％以上，符合实验要求。

根据制备例6所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代CD19，可获得其他类型肿瘤抗原-CAR-NK细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG等。除T细胞上装载的CAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD22-CAR-NK细胞、BCMA-CAR-NK细胞、MUC-1-CAR-NK细胞、cMet-CAR-NK细胞、Claude 18.2-CAR-NK细胞、MSLN-CAR-NK细胞、EGFR-CAR-NK细胞、VEGFR2-CAR-NK细胞、HER-2-CAR-NK细胞、TPBG-CAR-NK细胞。

制备例7

制备例7提供了IPSC CAR-NK细胞的构建方法。本制备例中的构建方法参考CN114958771A中提到的构建方法。具体包括以下步骤：

S1：将带有嵌合抗原受体CAR基因(CD19)的慢病毒载体感染由血液细胞重编程得到的诱导性多能干细胞IPSC，得到表达嵌合抗原受体CAR的IPSC细胞；

S2：将表达嵌合抗原受体CAR的IPSC细胞在含有55ng/ml干细胞因子SCF、2μm/mlGSK3β抑制剂、28ng/ml骨形态发生蛋白BMP、55ng/ml FGF2和、35mg/ml VEGF的培养基中培养，并添加30ng/ml FLT-3L配体、60ng/ml血小板生成素TPO和20ng/ml IL7，进行定向分化诱导，得到造血祖细胞HPC；

S3：将造血祖细胞HPC转入含有1.0％P/S双抗、60ng/mlTGF-β转化生长因子、15ng/ml细胞因子、5μM磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂和4μM拮抗剂的无血清的DMEM培养基中；拮抗剂为1μM血管紧张素II 1型受体AT1拮抗剂(沙坦)、1μM Mek/Erk拮抗剂(PD0325901)和1μMTGFβ拮抗剂(SB431542)；细胞因子为3ng/ml SCF、4ng/ml TPO、3ng/ml IL3、3ng/ml IL-11和2ng/ml IL-15的组合；每18h更换新培养基，培养5d；

调整细胞密度2×10²个/mL，依次转入含有浓度为0.2g/L氨甲环酸的第一扩增培养基和含有浓度为0.8g/L的氨甲环酸第二扩增培养基中扩增；其中，第一扩增培养基为含有6％体积比自体灭活血清、100ng/mL IL-2、3ng/mL FGF2、0.008g/L i-肌醇、0.04g/L叶酸、0.15g/L羊胎盘素、0.7g/L盐酸吡哆醇和0.2g/L氨甲环酸的DMEM培养基；24h后更换相同扩增培养基。

经过第一扩增培养基培养48h后转入第二扩增培养基，第二扩增培养基为含有2.5％体积比自体灭活血清、110ng/mL IL-2、4ng/mL FGF2、0.013g/L i-肌醇、0.04g/L叶酸、0.2g/L羊胎盘素、1.3g/L盐酸吡哆醇和0.8g/L氨甲环酸的DMEM培养基；继续培养至72h，得到抗原特异性的IPSC-CAR-NK细胞(CD19-IPSC CAR-NK细胞)。

根据制备例7所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代CD19，可获得其他类型肿瘤抗原-IPSC CAR-NK细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG等。除T细胞上装载的CAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD22-IPSC CAR-NK细胞、BCMA-IPSC CAR-NK细胞、MUC-1-IPSCCAR-NK细胞、cMet-IPSC CAR-NK细胞、Claude 18.2-IPSC CAR-NK细胞、MSLN-IPSC CAR-NK细胞、EGFR-IPSC CAR-NK细胞、VEGFR2-IPSC CAR-NK细胞、HER-2-IPSC CAR-NK细胞、TPBG-IPSC CAR-NK细胞。

制备例8

制备例8提供了CAR-M细胞的构建方法。具体包括以下步骤：

1)PD-L1-CAR慢病毒载体的构建和PD-L1-CAR慢病毒的制备

(1)PD-L1-CAR慢病毒载体的构建

通过前期实验筛选和调研，设计合成PD-L1-CAR序列(SEQ ID NO 71)：从5’端到3’端依次是信号肽SP、PD-L1 scFv抗体、CD8α的跨膜区、CD86胞内功能区及FcγR I胞内功能区。将合成的PD-L1-CAR序列克隆到pLVX-EF1α-AcGFP1-N1载体中，获得PD-L1-CAR慢病毒载体。

(2)PD-L1-CAR慢病毒的制备

将上述PD-L1-CAR慢病毒载体与慢病毒包装载体pMD2.G、psPAX2一起共转染293T细胞，制备PD-L1-CAR慢病毒。293T细胞融合度为70％-80％时进行慢病毒的包装。在慢病毒包装的24h，48h时收集病毒上清，4000rpm离心10min，0.45um滤膜过滤除去细胞碎片，4℃，25000rpm超高速离心2h获得PD-L1-CAR慢病毒浓缩液，分装后置于-80℃保存。

(3)PD-L1-CAR慢病毒载体的鉴定

利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对构建的PD-L1-CAR慢病毒表达质粒进行切割后，用1.2％琼脂糖凝胶在120V的电压下电泳40分钟进行检测，分析电泳条带以判断重组PD-L1-CAR慢病毒表达质粒是否正确插入PD-L1基因片段。

2)人脐带血来源造血干细胞的扩增培养

造血干细胞完全培养基的配制：造血细胞无血清培养基StemSpan^TM SFEM(StemCell，09600)中加入细胞因子SCF(100ng/ml)、Flt-3L(100ng/ml)、TPO(50ng/ml)、IL-6(50ng/ml)、LDL(10ug/ml)、SR1(750nM)和UM171(35nM)。

第1天：从脐带血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，用配制好的造血干细胞完全培养基重悬PBMCs，细胞密度5×10⁶个/ml，取10mL接种至T25细胞培养瓶中，将T25细胞培养瓶竖直放到摇床上，摇床转速100rpm/min，置于二氧化碳培养箱，37℃，5％CO₂中培养。第2-5天，每天添加2-3mL新鲜的CD34⁺造血干细胞完全培养基，当每个培养瓶的培养体积达到20ml-25ml，可将摇床的转速调整到110-120rpm/min。第6-9天，每天添加4-6mL新鲜的CD34⁺造血干细胞完全培养基。第9天取样进行计数，流式检测CD34⁺造血干细胞(HSCs)的比例。

3)PD-L1-CAR-HSCs细胞的制备

PD-L1-CAR慢病毒感染HSCs细胞：利用PD-L1-CAR慢病毒感染HSCs细胞(MOI＝60)，并在感染后48小时用嘌呤霉素(0.25μg/ml)处理3天，以筛选出稳定表达PD-L1-CAR的HSCs细胞，构建PD-L1-CAR-HSCs稳定细胞系，大量扩增后，冻存至液氮中备用。

通过检测GFP⁺PD-L1-CAR-HSCs细胞的比例，间接检测PD-L1-CAR慢病毒对HSCs细胞的感染效率。

4)PD-L1-CAR-HSCs细胞向PD-L1-CAR-M的诱导分化

配制巨噬细胞分化培养基M1：RPMI1640培养液中添加2％(v/v)B27添加剂、2mMGlutamax、1％(v/v)非必需氨基酸(NEAA)、50ng/ml维生素C、10ng/ml人白细胞介素-3(IL-3)和50ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。

配制巨噬细胞分化培养基M2：RPMI1640培养液中添加2％(v/v)B27添加剂、2mMGlutamaxL-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1％(v/v)非必需氨基酸(NEAA)、50ng/ml维生素C和50ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。

将步骤3中的PD-L1-CAR-HSCs细胞用M1培养基重悬，于37℃、5％CO₂培养箱中培养5天，隔天半量更换M1培养基。5天后，收集细胞，离心后用M2培养基重悬，于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养3天，获得人造血干细胞来源的CAR-巨噬细胞(PD-L1-CAR-M)。

5)PD-L1-CAR-M细胞的鉴定

收集诱导分化获得的PD-L1-CAR-M细胞，用含0.1％BSA的PBS洗涤重悬后，用CD14-PE(399204，Biolegend)和CD11b-FITC(301330，Biolegend)抗体在室温下避光孵育20分钟后，利用流式细胞仪检测并分析PD-L1-CAR-M细胞表面CD14和CD11b的表达。证明我们通过诱导分化成功获得了人HSCs来源的CAR-巨噬细胞。

根据制备例8所述的构建方法，利用其他类型肿瘤抗原取代PD-L1，可获得其他类型肿瘤抗原-CAR-M细胞。肿瘤抗原的类型还可以是CD19、CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG等。除T细胞上装载的CAR不同外，本领域技术人员都可以通过同样的方法构建，并且用同样的方法检测构建成功。

当肿瘤抗原分别为CD19、CD22、BCMA、MUC-1、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG时，分别获得CD19-CAR-NK细胞、CD22-CAR-NK细胞、BCMA-CAR-NK细胞、MUC-1-CAR-NK细胞、cMet-CAR-NK细胞、Claude 18.2-CAR-NK细胞、MSLN-CAR-NK细胞、EGFR-CAR-NK细胞、VEGFR2-CAR-NK细胞、HER-2-CAR-NK细胞、TPBG-CAR-NK细胞。

制备例9-12

制备例9-12分别提供了一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法。

该方法利用溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤。其中，溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞；免疫细胞嵌合抗原受体。

该重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白和肿瘤抗原。其中，M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白均是在野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型的基础上通过点突变获得的，肿瘤抗原是通过插入编码肿瘤抗原的基因获得的。

各制备例的不同之处在于：M蛋白的突变位点不同。M蛋白的突变位点分别如SEQID NO 3、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。G蛋白包含如SEQID NO 13所示的氨基酸序列，N蛋白包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列，P蛋白包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，L蛋白包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。各蛋白的突变位点和肿瘤抗原的类型如表1所示。

一、上述各制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法如下：

(1)构建载体

以pRV-core质粒(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)为模板，利用PCR技术分别引入如表1所示的M蛋白突变位点、G蛋白突变位点、N蛋白突变位点、P蛋白突变位点、L蛋白突变位点。

分别合成包含XbaI和MluI酶切位点的含上述蛋白突变位点的基因片段，以此为模板进行PCR扩增，然后将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用XbaI和MluI双酶切，再利用凝胶回收试剂盒进行割胶回收，分别获得具有M蛋白突变位点的基因片段、具有G蛋白突变位点的基因片段、具有N蛋白突变位点的基因片段、具有P蛋白突变位点的基因片段、具有L蛋白突变位点的基因片段。RV-core质粒用XbaI和MluI双酶切，利用凝胶回收试剂盒进行割胶回收获得pRV-core酶切回收骨架片段。

将上述具有M蛋白突变位点的基因片段、具有G蛋白突变位点的基因片段、具有N蛋白突变位点的基因片段、具有P蛋白突变位点的基因片段、具有L蛋白突变位点的基因片段分别和pRV-core酶切回收骨架片段进行连接转化涂平板，挑选单克隆摇菌进行PCR验证，提质粒获得构建好的质粒pRV-core Mut，送测序公司进行测序。

(2)插入外源基因

将步骤(1)获得的质粒pRV-core Mut用Xho I和Mlu I进行双酶切处理回收长片段。

编码肿瘤抗原的外源基因由基因合成公司合成后用相应引物扩增，用XhoI和NheI进行双酶切处理回收目的基因片段，将上述双酶切处理的pRV-core Mut和外源基因片段进行连接转化，挑选单克隆，进行PCR或酶切鉴定后送测序公司测序，获得携带外源基因的质粒pRV-core Mut。

表1制备例9-12中重组溶瘤病毒和免疫细胞

(3)病毒拯救

利用磷酸钙转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，通过细胞转染技术，将携带外源基因的质粒pRV-core Mut转染至BSR-T7细胞(购自ATCC，美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)。

按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；

利用200μl opti-MEM培养基稀释lipofectamine LTX 10μl(Thermo FisherScientific)，获得LTX混合液；

按照lipofectamine LTX使用说明书所述的方法进行质粒转染，6h后利用PBS清洗BSR-T7细胞两次，进一步接种于10％胎牛血清的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养3天；

将培养BSR-T7细胞获得的的细胞上清转移到Vero细胞(Thermo FisherScientific)中，并将Vero细胞置于37℃的环境条件下培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况；进一步将拯救的突变棒状病毒库，通过Vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒株。

(4)基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对M蛋白基因序列设计的引物、针对G蛋白基因序列设计的引物、针对N蛋白基因序列设计的引物、针对P蛋白基因序列设计的引物、针对L蛋白基因序列设计的引物和编码肿瘤抗原基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；

针对M蛋白基因序列设计的引物序列为：

PF:ATGAGTTCCTTAAAGAA；

PR:TCATTTGAAGTGG。

针对G蛋白基因序列设计的引物序列为：

PF:ATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG；

PR:TTACTTTCCAAGTCGGTTCATCT。

针对N蛋白基因序列设计的引物序列为：

PF:ATGTCTGTTACAGTCAAGAG；

PR:TCATTTGTCAAATTCTGACTT。

针对P蛋白基因序列设计的引物序列为：

PF:ATGGATAATCTCACAAAAGTTCG；

PR:CTACAGAGAATATTTGACTCTCG。

针对L蛋白基因序列设计的引物序列为：

PF:ATGGAAGTCCACGATTTTGAGA；

PR:TTAATCTCTCCAAGAGTTTTCCT。

编码肿瘤抗原基因序列设计的引物序列为：

CD19 F：ACGCTCGAGATGCCACCTCCTCGCCTCC；

CD19 R：TCTGGCTAGCTCATCTTTTCCTCCTCAGG。

产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表1所示。

二、上述各制备例提供的溶瘤病毒疫苗的构建方法如下：

(1)上述提供的重组溶瘤病毒的包装过程，具体包括以下步骤：

1)利用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)感染接种BSR-T7细胞(购自ATCC)

具体步骤如下：将BSR-T7细胞铺在6孔板上，控制每孔细胞量达到3×10⁵个；铺板14-16h后加入表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3，进行痘病毒vTF7-3对BSR-T7细胞的感染；感染6h后，使用DPBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific)漂洗一次BSR-T7细胞，进行转染。

2)转染过程

具体包括以下步骤：按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；

将LTX混合液200μl与转染质粒预混液200μl混合，室温孵育15min，获得LTX-DNA混合液；

将步骤1)的6孔板中的DPBS缓冲液换成Opti-MEM培养基，将LTX-DNA混合液逐滴加入培养BSR-T7细胞的6孔板中，轻轻摇动6孔板，使LTX-DNA混合液均匀分布在6孔板内；转染6-8h后，吸去转染试剂，加入3ml新鲜的完全培养基(Thermo Fisher Scientific)；72h后收获BSR-T7细胞的细胞上清，使用0.22μm滤器进行过滤，获得各制备例对应的重组溶瘤病毒，即获得溶瘤病毒疫苗。

四、免疫细胞

免疫细胞为利用制备例1提供的构建方法制得的免疫细胞。

制备例13-29

制备例13-29分别提供了一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法。

该方法利用溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤。其中，溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞；免疫细胞及其携带的抗原受体具体如表2所示。

该重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白和肿瘤抗原。其中，M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白的突变位点与制备例9相应的突变位点相同。不同之处在于：肿瘤抗原的类型不同，具体如表2所示。

一、上述制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法同制备例9的构建方法，构建方法的不同之处具体为：

步骤(2)的插入外源基因中利用PCR技术引入如表2所示的肿瘤抗原。

步骤(4)包括对各类型肿瘤抗原的测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对编码肿瘤抗原基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；

编码抗原基因序列设计的引物序列为：

1)CD22 F：ATGCATCTCCTCGGCCCCT；

CD22 R：TCAGAGCCCACAGATTGCCAGG。

2)BCMA F：ACGCTCGAGATGTTGCAGATGGCTGGGC；

BCMA R：TCTGGCTAGCTTATAGCAAAAACATTAGC。

3)MUC-1F：ACGCTCGAGATGTCTGGTCATGCAAGC；

MUC-1-R：TCTGGCTAGCTTACAAGGCAATGAGATAG。

4)NY-ESO-1F：ACGCTCGAGATGCAGGCAGAAGGAAG；

NY-ESO-1R：TCTGGCTAGCTCATCTTCTCTGTCCGCTA。

5)MAGE A4 F：ACGCTCGAGACAGAGGAGCACCAAGGAG；

MAGE A4 R：TCTGGCTAGCATAGACTGAGGCATAAGGC。

6)cMet F：ACGCTCGAGATGGAGTGCAAGGAGGCC；

cMet R：TCTGGCTAGCTTACAGCCACAGGAAGAAG。

7)Claude 18.2F：ACGCTCGAGATGGACCAGTGGAGCACCC；

Claude 18.2R：TCTGGCTAGCTTAGGCGATGCACATCATC。

8)MSLN F：ACGCTCGAGATGGAAGTGGAGAAGACAG；

MSLN R：TCTGGCTAGCTCAGGCCAGGGTGGAGGCT。

9)EGFR F：ACGCTCGAGATGCGACCCTCCGGGACGG；

EGFR R：TCTGGCTAGCTTACATGAAGAGGCCGAT。

10)VEGFR2 F：ACGCTCGAGATGCAGAGCAAGGTGCTG；

VEGFR2 R：TCTGGCTAGCTCAGATGATGACAAGAAGT。

11)HER-2F：ATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCC；

HER-2R：TTAGATGAGGATCCCAAAGACCA。

12)TPBG F：ATGTCTTCTCCCACCTCCTCGGCAT；

TPBG R：TCACAAATACAAAACCAGGAGGAAA。

产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表3所示。

二、免疫细胞

免疫细胞为利用制备例1-8提供的构建方法制得的免疫细胞。

表2制备例9、13-29中重组溶瘤病毒和免疫细胞

制备例30-83

制备例30-83分别提供了一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法。

该方法包括溶瘤病毒疫苗和免疫细胞。其中，溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞；免疫细胞嵌合抗原受体。

上述制备例与制备例13-29的不同之处在于，该重组溶瘤病毒除了包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白和肿瘤抗原，还包括细胞因子。其中，M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白的突变位点与制备例9相应的突变位点相同。不同之处在于：肿瘤抗原的类型和细胞因子的类型不同，具体如表3所示。

具体如下：

制备例30-47分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-12，细胞因子IL-12包含如SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34所示的氨基酸序列，具体如表3所示。

制备例48-65分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-15，细胞因子IL-15包含如SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列，具体如表3所示。

制备例66-83分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-18，细胞因子IL-18包含如SEQ ID NO 36所示的氨基酸序列，具体如表3所示。

步骤(2)的插入外源基因中还利用PCR技术引入如表3所示的细胞因子。肿瘤抗原和细胞因子插入G蛋白和L蛋白之间。两者的插入顺序可以是先插入细胞因子，再插入肿瘤抗原；也可以是先插入肿瘤抗原，再插入细胞因子。本申请中，是先插入细胞因子，再插入肿瘤抗原。

步骤(4)还包括细胞因子的测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对细胞因子基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；

编码细胞因子基因序列设计的引物序列为：

IL12 F：CCCTCGAGATGTGGCCCCCTGGGT，

IL12 R：CGGCTAGCTTAACTGCAGGGCACAGATG。

IL-15F:CCGCTCGAGATGAGAATTTCGAAACC，

IL-15R:CGGCTAGCTCAAGAAGTGTTGATGAAC。

IL-18F:CCCTCGAGATGGCTGCTGAACCAGTAG，

IL-18R:CGGCTAGCCTAGTCTTCGTTTTGAAC。

二、上述制备例提供的免疫细胞的构建方法同上。

表3制备例30-83中重组溶瘤病毒的突变情况表

制备例84-95

制备例84-95分别提供了一种利用溶瘤病毒疫苗治疗肿瘤的方法。

上述制备例中的重组溶瘤病毒分别为制备例9、13-29中的溶瘤病毒疫苗。具体如表4所示。不同之处在于，肿瘤抗原的类型不同。

表4制备例84-95中重组溶瘤病毒的突变情况表

制备例96-113

制备例96-113分别提供了一种利用免疫细胞治疗肿瘤的方法。

上述制备例中的免疫细胞分别为制备例9、13-29中的免疫细胞。具体如表5所示。不同之处在于，免疫细胞的类型和嵌合的抗原受体不同。

表5制备例96-113中的免疫细胞

制备例	类型	制备例	类型
				96	CD19-CAR-T细胞	105	VEGFR2-CAR-T细胞
97	CD22-CAR-T细胞	106	HER-2-CAR-T细胞
				98	BCMA-CAR-T细胞	107	TPBG-CAR-T细胞
99	NY-ESO-1TCR-T细胞	108	CD19-CAR-γδ-T细胞
				100	MAGE A4 TCR-T细胞	109	CD19-CAR-Crispered-T细胞
101	cMet-CAR-T细胞	110	STAR-T-EGFR细胞
				102	Claude 18.2-CAR-T细胞	111	CD19-CAR-NK细胞
103	MSLN-CAR-T细胞	112	CD19-IPSC CAR-NK细胞
				104	EGFR-CAR-T细胞	113	CD19-CAR-M细胞

实施例

本实施例分别利用制备例9-113提供的溶瘤病毒疫苗和/或免疫细胞联合治疗肿瘤的方法对不同细胞进行体外杀伤试验检测。

检测方法为CCK8检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例9-113提供的溶瘤病毒疫苗和/或免疫细胞以及野生溶瘤病毒，24h后利用MTT检测法检测细胞活性。

所检测的细胞包括：LLC细胞、MEF细胞。

一、制备例9-83提供的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞——具体检测方法为：

(1)分别在96孔培养板中每孔加入Vero(LLC/MEF)细胞悬液100μl，使细胞量达到4×10³个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂的环境条件下培养16h。

(2)将上述制备例中制得的溶瘤病毒疫苗稀释到MOI(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0共四个梯度；将每一稀释梯度的重组溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每孔100μl，每一稀释梯度接种3个孔。

同时将免疫细胞按效靶比(E:T)分别稀释至1:1、5:1、10:1和20:1共四个梯度；将每一稀释梯度的免疫细胞分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每孔100μL，每一稀释梯度均接种3个孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂条件下培养48h。

(3)将步骤(2)的96孔培养板中的细胞上清弃去，并向96孔培养板中加入新鲜的DMED培养基(100μL/孔)，再加入CCK8溶液(10μL/孔)，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂的环境条件下培养4h。

(4)将96孔培养板于室温下离心5min，设置转速为2500rpm/min，用1mL一次性无菌注射器轻轻吸掉上清；然后向96孔培养板的每个孔中加入DMSO，加入量为100ul/孔，37℃的环境条件下放置10min。使用多功能酶标仪，震荡2min，在570nm或490nm波长下测定96孔培养板上各孔的OD值，并计算肿瘤细胞杀伤率。

肿瘤细胞杀伤率(％)＝(肿瘤细胞对照组OD值－实验组OD值)/肿瘤细胞对照组OD值×100％。

二、制备例84-95提供的溶瘤病毒疫苗和野生溶瘤病毒——具体检测方法为：

(1)分别在96孔培养板中每孔加入Vero(LLC/MEF)肿瘤细胞悬液100μL，使细胞量达到4×10³个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂的环境条件下培养16h；

(2)将上述制备例中制得的溶瘤病毒疫苗以及野生溶瘤病毒稀释到MOI(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0共四个梯度；将每一稀释梯度的溶瘤病毒疫苗以及野生溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每孔100μL，每一稀释梯度均接种3个孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂条件下培养48h；

(3)将步骤(2)的96孔培养板中的上清弃去，并向96孔培养板中加入新鲜的DMED培养基(100μL/孔)，再加入CCK8溶液(10μL/孔)，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂的环境条件下培养4h；

(4)将96孔培养板于室温下离心5min，设置转速为2500rpm/min，用1mL一次性无菌注射器轻轻吸掉上清；然后向96孔培养板的每个孔中加入DMSO，加入量为100ul/孔，37℃的环境条件下放置10min。使用多功能酶标仪，震荡2min，在570nm或490nm波长下测定96孔培养板上各孔的OD值，并计算肿瘤杀伤率。

三、制备例96-113提供的免疫细胞——具体检测方法为：

(2)免疫细胞按效靶比(E:T)分别稀释至1:1、5:1、10:1和20:1共四个梯度；将每一稀释梯度的免疫细胞分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每孔100μL，每一稀释梯度均接种3个孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO₂条件下培养48h；

检测结果如图1-图6所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标9-113分别表示制备例9-113；纵坐标OD₅₇₀表示细胞的OD值，OD₅₇₀的值越大，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；OD₅₇₀的值越小，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。

通过上述附图可知，本申请制备例1-83提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法对LLC细胞具有较好的体外杀伤能力，均优于制备例84-95提供的溶瘤病毒疫苗和制备例96-113提供的免疫细胞对LLC细胞的体外杀伤能力。

从上述检测结果可知，本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法对LLC细胞具有较好的体外杀伤能力。可以判断，本申请提供的提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法对癌细胞(4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞等)均具有较好的体外杀伤能力。同时，本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法对MEF细胞几乎无杀伤作用，说明本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。本申请提供的溶瘤病毒疫苗联合免疫细胞治疗肿瘤的方法在保证对正常细胞的安全性的同时，还保证了对肿瘤、癌症细胞的杀伤能力，具有广泛的临床应用前景。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，利用免疫细胞和溶瘤病毒疫苗联合治疗肿瘤；

所述溶瘤病毒疫苗包括表达肿瘤抗原的重组溶瘤病毒，用于标靶肿瘤细胞；

所述免疫细胞嵌合与所述肿瘤抗原配对的抗原受体，用于杀伤或杀灭被标靶的肿瘤细胞；

所述重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白；

与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，

所述M蛋白的位点突变包含M51R、V221F、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、敲除第111位亮氨酸编码碱基、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、L111A、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；

或所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；

与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列相比，所述G蛋白的位点突变包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；

与SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列相比，所述N蛋白的位点突变包含I14V、R155K、S353N；

与SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列相比，所述P蛋白的位点突变包含R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；

2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述重组溶瘤病毒包括棒状病毒。

3.根据权利要求2所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述棒状病毒包括水疱性口炎病毒。

4.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原选自血液瘤抗原和实体瘤抗原。

5.根据权利要求4所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：

所述实体瘤抗原包括但不限于5T4、RORl、EGFR、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、CD28、CD137、CTLA-4、HER-2、FAS、FAP、LGR5、C5aR1、A2AR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白、LTβR、TRAIL受体1、TRAIL受体2、前列腺特异性膜抗原蛋白、前列腺干细胞抗原蛋白、肿瘤相关蛋白碳酸酐酶IX、EGFR1、EGFRvIII、ErbB3、叶酸受体、肝配蛋白受体、PDGFRa、ErbB-2、CD2、CD40、CD74、CD80、CD86、CCAM5、CCAM6、p53、cMet、HGFR、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BACE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC2、P-钙粘蛋白、肌肉抑制素、Cripto、MUC5AC、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、CD28、CD137、CanAg、Mesothelin（MSLN）、DR5、PD-1、PD-L1、IGF-1R、CXCR4、神经纤毛蛋白1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖类、EphA2、B7-H3、B7-H4、gpA33、GPC3、SSTR2、GD2、VEGF-A、VEGFR-2、PDGFR-a、ANKL、RANKL、MSLN、EBV、TROP2、FOLR1、AXL、Claude 18.2、MUC1、TPBG；

所述血液瘤抗原包括但不限于BCMA、CD4、CD5、CD7、CD10、FcγRIIIa、FcγRIIIb、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD44、CD47、CD56、CD70、CD117、CD123、CD138、CD174 、CLL-1、ROR1、NKG2DL1/2、IL1R3、FCRL5、GPRC5D、CLEC12A、WT1、FLT3、TLR8、SHP2、KAT6A/B、CSNK1A1、FLI1、IKZF1/3、PI3K、c-Kit 、SLAMF3、SLAMF7、TCR B-chain、ITGB7、k-1gG、TACI、TRBCI、LeY。

6.根据权利要求5所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述肿瘤抗原选自如下任意一种或多种：CD19、CD22、BCMA、MUC1、NY-ESO-1、MAGE A4、cMet、Claude 18.2、MSLN、EGFR、VEGFR2、HER-2、TPBG、AFP、MAGE-A10。

7.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述重组溶瘤病毒表达的所述肿瘤抗原至少为一个或多个。

8.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞和M细胞。

9.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自CAR-T细胞、TCR-T细胞、CAR-γδ-T细胞、CAR-Crispered-T细胞、STAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-M细胞。

10.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自自体细胞、异体细胞或IPSC来源的免疫细胞。

11.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述免疫细胞包含经体外扩增得到的免疫细胞。

12.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述免疫细胞表达的所述抗原受体的数量至少为一个或多个。

13.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述重组溶瘤病毒还包括外源基因编码的细胞因子。

14.根据权利要求13所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族。

15.根据权利要求14所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-β、TGF-β和TNF-α。

16.根据权利要求15所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于：所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-β、TNF-α。

17.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列、编码所述肿瘤抗原的核酸序列和编码所述细胞因子的核酸序列。

18.根据权利要求17所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述核酸分子中，所述编码肿瘤抗原的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述具有位点突变的L蛋白的核酸序列之间。

19.根据权利要求17所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。

20.根据权利要求17所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于所述编码肿瘤抗原的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间或位于编码所述位点突变的G蛋白与所述编码肿瘤抗原的核酸序列之间。

21.根据权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法用于持续杀伤异常增生性细胞。

22.根据权利要求21所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞。

23.根据权利要求21所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。

24.根据权利要求21所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、感觉神经母细胞瘤、尤文肉瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、肝细胞癌、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞增生症、喉癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、咽癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状颈癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌和血管肿瘤。

25.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的溶瘤病毒疫苗和免疫细胞。