CN117402836A - 重组溶瘤病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物医药的技术领域，具体公开了一种重组溶瘤病毒及其应用。所述重组溶瘤病毒包括M蛋白和外源基因编码的细胞因子；所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下位点突变：在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸（M51R）；在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸（V221F）；在第226位丝氨酸突变为精氨酸（S226R）。本申请提供的重组溶瘤病毒均对异常增生性（肿瘤）LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞具有较好的侵染能力和体外杀伤能力，且在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内均不容易清除，对正常细胞的侵染能力大大降低。

Description

重组溶瘤病毒及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药的技术领域，具体地说，涉及一种重组溶瘤病毒及其应用。
背景技术
溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，目前已被大众接受作为肿瘤免疫治疗的重要分支。溶瘤病毒能够特异性地靶向感染肿瘤细胞，例如利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而选择性地感染肿瘤细胞；溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，会在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。同时，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号，从而吸引更多的免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。
虽然溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗方面具有较好的应用前景，但野生型溶瘤病毒往往会引起机体神经系统炎症等问题，在利用野生型病毒感染肿瘤细胞的过程中，还存在较大的致病风险。因此，为进一步推进溶瘤病毒的临床应用，需要对野生型溶瘤病毒进行改造，以获得减毒后的溶瘤病毒。将减毒后的溶瘤病毒用于临床应用，从而降低溶瘤病毒的致病风险，提高溶瘤病毒的安全性。
然而，在对溶瘤病毒改造的过程中，若仅是对野生型溶瘤病毒随机进行基因修饰，虽然能够降低其毒性，但改造后的溶瘤病毒可能治愈率效果不佳，甚至改造后的溶瘤病毒无法进行包装，不利于推进溶瘤病毒的临床应用。
发明内容
为了进一步提高溶瘤病毒对肿瘤细胞的体外和体内的侵染能力和杀伤能力，且降低溶瘤病毒对正常细胞的侵染能力，本申请提供一种重组溶瘤病毒及其应用。
本申请提供的一种重组溶瘤病毒采用如下的技术方案：
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包括M蛋白和外源基因编码的细胞因子；所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下位点突变：在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；在第226位丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
进一步地，所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
进一步地，所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：敲除第111位亮氨酸编码碱基；或，在第111位亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)。
进一步地，所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第21位甘氨酸突变为丙氨酸(G21E)；和/或，在第33位甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第226位丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含敲除第111位亮氨酸编码碱基。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第111位亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第21位甘氨酸突变为丙氨酸(G21E)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第33位甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)。
在一个具体的实施方式中，所述M蛋白的位点突变包含在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有M51R、V221F、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、M51R、H54Y、敲除第111位亮氨酸编码碱基、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、M51R、H54Y、L111A、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型M蛋白包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。
进一步地，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族。
进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-β、TGF-β和TNF-α。
进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、IL-2、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、IFN-β。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为GM-CSF。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-2。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-12。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-15。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IL-18。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为TNF-α。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子为IFN-β。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子GM-CSF包含如SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-2包含如SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12-A包含如SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12-B包含如SEQ ID NO 23所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-15包含如SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-18包含如SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子TNF-α包含如SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IFN-β包含如SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12-A包含如SEQ ID NO 28所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12-A包含如SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-12-A包含如SEQ ID NO 30所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-15包含如SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述细胞因子IL-18包含如SEQ ID NO 32所示的氨基酸序列。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括G蛋白；所述G蛋白与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的位点突变包含在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有Y487H的氨基酸取代。
在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型G蛋白包含如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白，或上述M蛋白和G蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括N蛋白；所述N蛋白与SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白的位点突变包含在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白的位点突变包含在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白的位点突变包含在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有I14V的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有I14V、R155K的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有I14V、R155K、S353N的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有R155K、S353N的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有S353N的氨基酸取代。
在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型N蛋白包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白；或上述M蛋白和G蛋白；或上述M蛋白、G蛋白和N蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括P蛋白；所述P蛋白与SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)；和/或，在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的位点突变包含在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有N237D的氨基酸取代。
在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型P蛋白包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白；或上述M蛋白和G蛋白；或上述M蛋白、G蛋白和N蛋白；或上述M蛋白、G蛋白、N蛋白和P蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括L蛋白；所述L蛋白与SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白的位点突变包含在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白的位点突变包含在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白具有S87P、I487T的氨基酸取代。
在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型L蛋白包含如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以棒状病毒为基础，进行定点突变后获得的。
在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以Vesicular Stomatitis Virus(简称“VSV”)病毒为基础，进行定点突变后获得的。
在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒是以VSV病毒Indiana MuddSummer亚型为基础，进行定点突变后获得的。
在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒还包含或表达外源目的蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列、和编码所述细胞因子的核酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。
在一些具体的实施方案中，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。
第二方面，本申请提供一种重组溶瘤病毒表达载体，采用如下技术方案：
一种重组溶瘤病毒表达载体，所述重组溶瘤病毒表达载体能够表达上述重组溶瘤病毒。
第三方面，本申请提供一种病毒生产细胞，采用如下技术方案：
一种病毒生产细胞，所述病毒生产细胞能够产生上述重组溶瘤病毒。
第四方面，本申请提供一种疫苗，采用如下技术方案：
一种疫苗，所述疫苗是利用上述充重组溶瘤病毒制备的。
第五方面，本申请提供一种药物组合物，采用如下技术方案：
一种药物组合物，所述药物组合物包括上述重组溶瘤病毒、或上述疫苗，以及任选地药学上可接受的载剂。
第六方面，本申请提供上述重组溶瘤病毒、上述重组溶瘤病毒表达载体、上述病毒生产细胞、上述疫苗、上述药物组合物的制备方法。
第七方面，本申请提供上述重组溶瘤病毒、上述重组溶瘤病毒表达载体、上述病毒生产细胞、上述疫苗、上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
在一些具体的实施方式中，所述重组溶瘤病毒、所述重组溶瘤病毒表达载体、所述病毒生产细胞、所述疫苗和/或所述药物组合物用于持续杀伤异常增生性细胞的方法中。
在一些具体的实施方式中，所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞。
第八方面，本申请提供上述重组溶瘤病毒、上述疫苗、上述药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
在一些具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、感觉神经母细胞瘤、尤文肉瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、肝细胞癌、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞增生症、喉癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、咽癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状颈癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌和血管肿瘤。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的重组溶瘤病毒均对异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞具有较好的侵染能力、体外杀伤能力，且在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内均不容易清除。并且，本申请提供的重组溶瘤病毒均对正常MEF细胞的侵染能力较差，体外杀伤能力较差，且本申请提供的重组溶瘤病毒在正常MEF细胞内均容易清除。因此，本申请提供的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染和杀伤，且在肿瘤、癌症等细胞内不易清除，进一步提高了重组溶瘤病毒对肿瘤、癌症等细胞的治愈率；同时，上述提供的重组溶瘤病毒不会损伤正常细胞，且在正常细胞内时更加容易清除，进一步保证了正常细胞的安全性。
附图说明
图1为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的侵染能力的检测结果。
图2为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的侵染能力的检测结果。
图3为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的侵染能力的检测结果。
图4为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的侵染能力的检测结果。
图5为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的侵染能力的检测结果。
图6为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的侵染能力的检测结果。
图7为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的侵染能力的检测结果。
图8为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的侵染能力的检测结果。
图9为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的侵染能力的检测结果。
图10为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的侵染能力的检测结果。
图11为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图12为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图13为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图14为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图15为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图16为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图17为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图18为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图19为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图20为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图21为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图22为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在4T1细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图23为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MC38细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图24为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在Hela细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图25为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MEF细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图26为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图27为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在4T1细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图28为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MC38细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图29为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在Hela细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图30为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MEF细胞内诱导IFN-β的表达情况。
以上附图中，横坐标上0号表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-105号分别表示制备例1-105制备的重组溶瘤病毒。
纵坐标Log10 TCID50表示利用Karber法计算得出的TCID50值，Log10 TCID50的值越大，表示重组溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越好；Log10 TCID50的值越小，表示重组溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越差；
纵坐标OD570表示细胞的OD值，OD570的值越大，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；OD570的值越小，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。
纵坐标IFN-β水平表示IFN-β基因的表达情况，IFN-β水平的值越大，表示重组溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越弱，越容易清除；IFN-β水平的值越小，表示重组溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越强，越不容易清除。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“溶瘤病毒”通常指能够在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的病毒。溶瘤病毒包括但不限于：水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，简称“VSV病毒”)、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以提高对肿瘤细胞的选择性。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以降低其免疫原性。
在一些实施方案中，本申请所述溶瘤病毒为VSV病毒。
在一些实施方案中，VSV病毒为VSV病毒Indiana MuddSummer亚型株的突变体。
在一些实施方案中，可以对VSV病毒的M蛋白、和/或G蛋白、和/或N蛋白、和/或P蛋白、和/或L蛋白进行定点基因突变。
在某些实施方式中，本申请所述重组溶瘤病毒可以是经过基因水平改造的溶瘤病毒，如经过一个或多个基因的修饰来改造，从而提高其肿瘤选择性和/或在分裂细胞中优先复制。所述基因水平的改造可以为修饰参与DNA/RNA复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散过程的基因，也可以为整合外源基因的改造。所述外源基因可以包括外源免疫调节基因、外源筛选基因、外源报告基因等。所述经过改造的溶瘤病毒也可以是经过氨基酸水平改造的溶瘤病毒，如一个或多个氨基酸的插入、缺失、置换。
在本申请中，术语“M蛋白”通常指VSV病毒基质蛋白。M蛋白是VSV病毒重要的毒力因子，也是VSV病毒中已知可干扰小鼠天然免疫应答的蛋白。术语“M蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型M蛋白可以包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的M蛋白可以包含如SEQ ID NO 2-11所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“G蛋白”通常指VSV病毒的糖蛋白，也称包膜蛋白。术语“G蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒IndianaMuddSummer亚型G蛋白可以包含如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的G蛋白可以包含如SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“N蛋白”通常指VSV病毒的核衣壳蛋白。术语“N蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒IndianaMuddSummer亚型N蛋白可以包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的N蛋白可以包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“P蛋白”通常指VSV病毒的磷酸蛋白。术语“P蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型P蛋白可以包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的P蛋白可以包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“L蛋白”通常指VSV病毒RNA聚合酶蛋白。VSV病毒的L基因编码RNA poly E蛋白。术语“L蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型L蛋白可以包含如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的L蛋白可以包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。
在本申请中，蛋白突变位点的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+突变后的氨基酸”来表述。在本申请中，所述突变可以包括但不限于氨基酸的增加、替换、缺失和/或删除。例如，术语“M51R”通常指第51位甲硫氨酸M突变为精氨酸R。
在本申请中，术语“氨基酸取代”通常是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的一个氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，“在xx位置处取代”通常是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置xx处的氨基酸。在本申请中，所述氨基酸取代可以包括氨基酸突变。
在本申请中，术语“突变”通常是指改变野生型分子的核苷酸或氨基酸序列。氨基酸变化可以包括氨基酸的置换、删除、缺失、插入、添加、截短、或蛋白质的加工或切割。
本申请中，所述重组溶瘤病毒是在对VSV病毒的M蛋白、和/或G蛋白、和/或N蛋白、和/或P蛋白、和/或L蛋白进行定点基因突变的同时，整合外源基因。所述外源基因具体为编码细胞因子的基因。
在本申请中，术语“细胞因子”(cytokines)是由免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)及其相关细胞(血管内皮细胞、成纤维细胞等)合成和分泌的调节其他免疫细胞或靶细胞功能的生物活性物质，属小分子多肽或糖蛋白。具有免疫调节作用的细胞因子都可以通过重组溶瘤病毒进行表达。按其主要功能，细胞因子分为：白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、转化生长因子-β家族(transforming growthfactor-βfamily，TGF-βfamily)、生长因子(growth factor，GF)、趋化因子家族(chemokinefamily)。
白细胞介素包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21、IL-4、IL-12、IL-18。
具体地，白细胞介素1(IL-1)：IL-1是一种多效细胞因子，涉及皮质的炎症反应、细胞生长和组织修复。IL-1超家族有11个成员，如IL-1A、IL-1B、IL-1Ra、IL-18等。IL-1是一些癌症的药物靶点，也用于细胞治疗。在细胞免疫治疗方面，IL-1可体外刺激CD4+T细胞的增殖，诱导IL-2的产生，共刺激CD8+/IL1R+T细胞活化，并刺激成熟的B细胞增殖和免疫球蛋白的分泌。
具体地，白细胞介素2(IL-2)：IL-2也称为T细胞生长因子，由T细胞响应于抗原或有丝分裂刺激产生，广泛应用于促进T细胞和NK细胞的活化和增殖。IL-2能够刺激NK细胞增殖、增加细胞毒作用并刺激NK细胞分泌多种细胞因子。但是进一步的研究发现，IL-2可以引起T细胞过度分化和诱导活化的T细胞凋亡，还可以激活CD4+FoxP3 Treg调节细胞，进而抑制T细胞的活化和肿瘤杀伤活性，因此认为IL-2属于T细胞调节因子而不单单是激活因子，所以现在有的研究已经用IL-7，IL-15，IL-21来代替IL-2了。
具体地，白细胞介素7(IL-7)：IL-7属于造血生长因子，由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌，与IL-2共用γc受体亚单位，刺激淋巴祖细胞的增殖。IL-7可以为T细胞和记忆T细胞提供持续的刺激信号。如上所述，IL-7在激活CD8+T细胞过程中，不会激活CD4+FoxP3+Treg细胞。在临床上，IL-7还可以应用于化疗或造血干细胞移植后T细胞数量的恢复。并且IL-7在B细胞成熟的某些阶段具有重要作用，可以影响其增殖。IL-7还可以作为肠粘膜淋巴细胞的调节因子。
具体地，白细胞介素15(IL-15)：IL-15与IL-2具有相似的结构，共用γc受体亚单位，属于具有4个α-helix螺旋束家族(其它的如IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，G-CSF和GM-CSF)。IL-15调节T细胞和NK细胞的激活和增殖。IL-15在先天免疫系统中主要是杀死病毒感染的细胞。同时IL-15可活化NKT细胞和γδT细胞。在免疫细胞治疗中，IL-15不会引起活化的T细胞凋亡，激活CD8+效应T细胞。IL-15维持记忆性T细胞存活，从而对长期抗肿瘤活性中起重要作用。
具体地，白细胞介素21(IL-21)：IL-21同样属于IL-2家族，共用γc受体亚单位，对免疫系统的细胞有很强的调节作用，可以在其靶细胞中诱导细胞分裂、增殖。在细胞免疫治疗中，IL-21可以促进CD4+和CD8+T细胞的增殖，增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性，不会因活化造成细胞凋亡。IL-21会优先扩增“年轻态”的CD27+CD28+的CD8+T细胞，这类细胞具有更强的细胞毒性。当然，IL-21也不会引起Treg的扩增，因此，IL-21在细胞免疫治疗中的应用越来越广泛。
具体地，白细胞介素4(IL-4)：IL-4激活活化的B细胞和T细胞增殖，调节淋巴细胞和单核细胞上Fc受体的表达。IL-4诱导Th1细胞向Th2细胞转化。IL-4刺激Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。IL-4通过抑制巨噬细胞的生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。培养体系中不加IL-4时单核细胞将分化为巨噬细胞。IL-4在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用,诱导B细胞抗体类别转换向IgE，上调MHC II类分子的产生。IL-4和GM-CSF共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力较弱，IL-4和TNF-α顺序使用可以促进DC成熟。
具体地，白细胞介素12(IL-12)：IL-12作用于活化的T和NK细胞，具有广泛的生物活性，通过转录蛋白STAT4的活化剂介导来对淋巴细胞产生作用。IL-12是IFN-γ的T细胞非依赖性诱导所必需的，对于Th1和Th2细胞的分化有重要作用。IL12B与IL23A结合形成IL-23白介素，具有先天和适应性免疫功能。IL-12属于药物靶点。在细胞免疫治疗中，IL-12促进CD4+T细胞分化为CD4+Th1 T细胞，增强CD8+CTLs细胞活性。IL-12的治疗效果与其剂量、作用时间以及其它相互作用的细胞因子等有关，通过多种机制促进免疫细胞的肿瘤杀伤活性。在小鼠抗黑色素瘤模型中，高剂量的IL-12通过NK细胞起作用，而低剂量的IL-12则通过NKT起到肿瘤杀伤作用。
具体地，白细胞介素18(IL-18)：IL-18也称为干扰素-γ诱导因子，属于促炎细胞因子，由巨噬细胞和其他细胞产生。IL-18能够刺激NK细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ，增强NK细胞与CD8+T细胞的细胞毒作用。IL-18还可以活化巨噬细胞，促进Th1 CD4+T细胞的发育，促进淋巴细胞表达FasL等功能。IL-18可为过敏性疾病提供潜在的治疗靶点。此外，IL-18、IL-12和IL-15协同作用可以维持自身免疫疾病中的Th1应答和单核因子生成。
伽马干扰素属于II型干扰素，主要由NK和NKT细胞产生，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，包括IFN-γ、IFN-β。IFN-γ对转化细胞具有抗增殖作用，可加强I型干扰素的抗病毒和抗肿瘤作用。IFN-γ通过激活巨噬细胞，诱导抗原呈递细胞(APCs)上的MHC I、MHCII和共激活分子表达。此外，IFN-γ可以诱导蛋白酶体的表达变化从而增强抗原呈递能力。IFN-γ还可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化，阻遏依赖于IL-4的B细胞亚型切换。IFN-γ通过磷酸化JAK1和JAK2蛋白进而激活JAK-STAT细胞途径。在细胞免疫治疗中，IFN-γ作用于宿主免疫细胞，对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。IFN-γ通过促进巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达，或使某些正常情况不表达MHCⅡ类分子的细胞(如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHCⅡ类分子，进而增强抗原递呈能力。IFN-γ可以促进B细胞和CD8+T细胞的分化，但不能促进其增殖。IFN-γ能增强TH1细胞的活性及免疫功能。IFN-γ增强中性粒细胞吞噬能力及活化NK细胞，增强其细胞毒作用。IFN-γ表达异常与许多自身炎症和自身免疫性疾病有关。
肿瘤坏死因子属于TNF超家族细胞因子，是生物过程调控的多功能分子，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血等。TNF-α参与抗肿瘤。在细胞免疫治疗方面，TNF-α使未成熟DC分化为成熟DC。这一过程通过TNF-α下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，上调细胞表面MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80，CD86等)的表达来实现。成熟DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，但抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。TNF-α还可以影响其它细胞因子的生成，如刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN-γ等淋巴因子产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在胚胎移植及其发育中具有关键作用。GM-CSF是最早发现的对于DC有作用的细胞因子之一。在DC培养中，GM-CSF促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，促进细胞表面MHC II类分子的表达，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。在细胞免疫治疗方面，GM-CSF可以激活免疫反应，通过激活巨噬细胞和DC而产生抗肿瘤活性。在抗原呈递方面，GM-CSF可以促进DC细胞成熟，促进共刺激分子上调和CD1d受体表达。近期研究发现，GM-CSF刺激造血祖细胞分化为单核细胞和嗜中性粒细胞，从而降低癌症患者发热性中性粒细胞减少的风险。还有研究证明GM-CSF可以诱导骨髓DC的分化，促进Th1细胞偏向免疫应答，促进血管生成，影响过敏性炎症和自身免疫疾病的发展。因此，GM-CSF在临床上被用来治疗恶性肿瘤。
在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的核苷酸。在本申请中，术语“核酸分子”可以编码所述溶瘤病毒包含的蛋白。在本申请中，所述核酸分子可以包含DNA和/或RNA。在某些情形下，所述RNA可以包含单链RNA(ssRNA)，也可以包含双链RNA(dsRNA)，单链RNA可以包含正义RNA，也可以包含反义RNA(anti-sense RNA),也可以包含双义RNA。
在本申请中，术语“表达载体”通常指一种核酸载体。在适当的条件下，其通常能够表达目标基因和/或目标蛋白。在本申请的某些实施方式中，所述表达载体包括用于表达病毒(例如，溶瘤病毒)的一种或多种组分的核酸分子。例如，所述表达载体可包括至少一个病毒基因组元件，并可以被包装入病毒或被包装为病毒粒子。
在本申请中，术语“病毒生产细胞”通常指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子或表达载体，或能够表达本申请所述重组溶瘤病毒的细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。所述细胞可以通过使用本申请所述的表达载体体外转染而得到。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在的制剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成分。在某些实施方案中，这些制剂可以包含药物的活性组分以及药学上可接受的载剂。在某些实施方式中，所述药物产品包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的药物产品。所述药物产品可以通过不同方式给药，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
在本申请中，术语“预防”通常是指通过预先采取某些措施而防止疾病或其一种或多种症状的产生和发作，复发，和/或扩散。在本申请中，术语“治疗”通常指消除或改善疾病，或与疾病相关的一种或多种症状。在某些实施方案中，治疗通常指向患有这种疾病的患者施用一种或多种药物使得疾病消除或缓解。在某些实施方案中，“治疗”可以是在特定疾病的症状发作后，在其他药物存在或不存在的情况下施用所述药物组合和/或药物产品。例如，使用本申请所述药物组合和/或药物产品防止肿瘤的产生，发展，复发和/或转移。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。在本申请中，所述肿瘤可以是实体瘤和/或血液瘤。用于研究时，可通过本领域技术人员熟知的方法从易于获得的资源中将这些组织分离出来。
发明详述
一种野生型VSV病毒，具体为VSV病毒印第安纳株，VSV病毒Indiana MuddSummer亚型株。其M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；其G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示；其N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 14所示；其P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示；其L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。在本申请中，所述M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白均可以被改造。
一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒是以上述野生型VSV病毒为基础，通过对其M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白的氨基酸序列上的位点进行突变获得的。
本申请提供了一种重组溶瘤病毒。所述重组溶瘤病毒是在上述溶瘤病毒的基础上导入编码细胞因子的外源基因获得的。
上述重组溶瘤病毒包括M蛋白和外源基因编码的细胞因子；所述M蛋白与SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下位点突变：在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；在第226位丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：敲除第111位亮氨酸编码碱基；或，在第111位亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)。
所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第21位甘氨酸突变为丙氨酸(G21E)；和/或，在第33位甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)。例如：所述M蛋白如SEQ ID NO 2-11所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述M蛋白包含第51位、第221位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第32位、第49位、第51位、第54位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第32位、第49位、第51位、第54位、第111位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第21位、第32位、第49位、第51位、第54位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第21位、第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第21位、第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第133位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第133位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白包含第32位、第49位、第51位、第54位、第133位、第221位、第225位、第226位的氨基酸取代。
在本申请中，所述M蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
进一步地，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族、生长因子。
进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-β、TGF-β和TNF-α。
进一步地，所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、IFN-β。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白，所述重组溶瘤病毒还包括G蛋白；所述G蛋白与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。例如，所述G蛋白如SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
在某些实施方式中，所述G蛋白至少包含在保守区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述保守区可以包含G蛋白的第437-461位氨基酸。在某些实施方式中，所述G蛋白至少包含在胞质域的截短区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述胞质域的截短区可以包含G蛋白的第483-511位氨基酸。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白，或上述M蛋白和G蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括N蛋白；所述N蛋白与SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。例如，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述N蛋白可以包含第14位、第155位和第353位的氨基酸突变。
在本申请中，所述N蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白；或上述M蛋白和G蛋白；或上述M蛋白、G蛋白和N蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括P蛋白；所述P蛋白与SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)；和/或，在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。例如，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包含上述M蛋白；或上述M蛋白和G蛋白；或上述M蛋白、G蛋白和N蛋白；或上述M蛋白、G蛋白、N蛋白和P蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括L蛋白；所述L蛋白与SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。例如，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第87位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列、和编码所述细胞因子的核酸序列。
进一步地，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。
进一步地，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。
在本申请中，可以通过病毒包装过程和病毒拯救过程获得本申请所述的重组溶瘤病毒。具体过程可以包括用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感染接种BSR-T7细胞，使用分别克隆VSV N、VSV P、VSV L基因的表达质粒和骨架质粒进行lipofectamine转染，获得目的溶瘤病毒。
本申请还提供了一种重组溶瘤病毒表达载体、一种病毒生产细胞、一种疫苗以及一种药物组合物。
所述重组溶瘤病毒表达载体可以包含编码所述重组溶瘤病毒的M蛋白和G蛋白的核酸序列；所述重组溶瘤病毒表达载体还可以包含编码所述重组溶瘤病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白的核酸序列。
所述病毒生产细胞能够产生上述的重组溶瘤病毒；所述病毒生产细胞可以包含BSR-T7细胞、Vero细胞、293细胞、MRC-5细胞、WI38细胞。
所述疫苗是是利用上述重组溶瘤病毒制备的。
所述药物组合物包括上述重组溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包括一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。药物组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选对接受者无毒。本申请的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
所述药物组合物包括上述重组溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的其它药物。
上述药物组合物可用于进行联合治疗疾病，包括但不限于治疗肿瘤。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮下、腔内、动脉内、静脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、真皮内或组织内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
此外，本申请提供上述重组溶瘤病毒、上述重组溶瘤病毒表达载体、上述病毒生产细胞、上述疫苗、上述药物组合物的制备方法。任何适于生产溶瘤病毒的方法都可用于产生本申请的重组溶瘤病毒。例如，可以向细胞中加入表达T7 RNA聚合酶的痘病毒进行转染，加入表达所述重组溶瘤病毒N蛋白、L蛋白和P蛋白的质粒以及骨架质粒进行转染，通过病毒拯救过程获得本申请的重组溶瘤病毒。
本申请还提供了上述重组溶瘤病毒、上述重组溶瘤病毒表达载体、上述病毒生产细胞、上述疫苗、上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
本申请提供的重组溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力。同时，上述制备的重组溶瘤病毒对正常细胞(正常MEF细胞)的侵染能力均较差，说明本申请制备的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。
本申请提供的重组溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力。从而进一步提高了溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的体外杀伤能力。同时，上述制备的重组溶瘤病毒对正常MEF细胞几乎无影响，说明本申请制备的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。
本申请提供的重组溶瘤病毒在异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内均不易清除。相对而言，野生型溶瘤病毒在LLC细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更容易清除。而本申请提供的重组溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，使得溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更加不容易清除，进一步保证溶瘤病毒能够在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更好的发挥侵染和杀伤能力；同时，本申请提供的重组溶瘤病毒在正常MEF细胞内更加容易清除，进一步保证了正常MEF细胞的安全性，从而提高了重组溶瘤病毒的安全性。
以下结合制备例1-106和实施例1-3对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1-70
制备例1-70分别提供了一种重组溶瘤病毒。该重组溶瘤病毒包括M蛋白和细胞因子。
具体如下：
制备例1-10分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为GM-CSF，细胞因子GM-CSF包含如SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
制备例11-20分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-2，细胞因子IL-2包含如SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
制备例21-30分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-12，细胞因子IL-12包含如SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
制备例31-40分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-15，细胞因子IL-15包含如SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
制备例41-50分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IL-18，细胞因子IL-18包含如SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
制备例51-60分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为TNF-α，细胞因子TNF-α包含如SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
制备例61-70分别提供的重组溶瘤病毒包括的细胞因子为IFN-β，细胞因子IFN-β包含如SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列。且各制备例的不同之处在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点，具体如表1所示。
上述各制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法如下：
(1)构建载体
以pRV-core质粒(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)为模板，利用PCR技术引入如表1所示的M蛋白突变位点。
合成包含XbaI和MluI酶切位点的含该蛋白突变位点的基因片段，以此为模板进行PCR扩增，然后将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用XbaI和MluI双酶切，再利用凝胶回收试剂盒进行割胶回收，获得具有该蛋白突变位点的基因片段。
pRV-core质粒用XbaI和MluI双酶切，利用凝胶回收试剂盒进行割胶回收获得pRV-core酶切回收骨架片段。
将上述具有该蛋白突变位点的基因片段和pRV-core酶切回收骨架片段进行连接转化涂平板，挑选单克隆摇菌进行PCR验证，提质粒获得构建好的质粒pRV-core Mut，送测序公司进行测序。
(2)插入外源基因
将步骤(1)获得的质粒pRV-core Mut用Xho I和Mlu I进行双酶切处理回收长片段。
编码细胞因子的外源基因由基因合成公司合成后用相应引物扩增，用XhoI和NheI进行双酶切处理回收目的基因片段，将上述双酶切处理的pRV-core Mut和外源基因片段进行连接转化，挑选单克隆，进行PCR或酶切鉴定后送测序公司测序，具体如表1所示，获得携带外源基因的质粒pRV-core Mut。
表1制备例1-70中重组溶瘤病毒的突变情况表
(3)病毒拯救
利用磷酸钙转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，通过细胞转染技术，将携带外源基因的质粒pRV-core Mut转染至BSR-T7细胞(购自ATCC，美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)。
按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；
利用200μl opti-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX 10μl(Thermo FisherScientific)，获得LTX混合液；
按照Lipofectamine LTX使用说明书所述的方法进行质粒转染，6h后利用PBS清洗BSR-T7细胞两次，进一步接种于10％胎牛血清的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养3天；
将培养BSR-T7细胞获得的的细胞上清转移到Vero细胞(Thermo FisherScientific)中，并将Vero细胞置于37℃的环境条件下培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况；进一步将拯救的突变棒状病毒库，通过Vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒株。
(3)基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对M蛋白基因序列设计的引物和编码细胞因子基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
针对M蛋白基因序列设计的引物序列为：
PF:ATGAGTTCCTTAAAGAA；
PR:TCATTTGAAGTGG。
编码细胞因子基因序列设计的引物序列为：
GMCSF F：CCCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCT，
GMCSF R：CGGCTAGCTCACTCCTGGACTGGCTCC。
IL-2 F：CCGATGTACAGGATGCAACTCC，
IL-2 R：CGGCTAGCTCAAGTCAGTGTTG。
IL12 F：CCCTCGAGATGTGGCCCCCTGGGT，
IL12 R：CGGCTAGCTTAACTGCAGGGCACAGATG。
IL-15 F:CCGCTCGAGATGAGAATTTCGAAACC，
IL-15 R:CGGCTAGCTCAAGAAGTGTTGATGAAC。
IL-18 F:CCCTCGAGATGGCTGCTGAACCAGTAG，
IL-18 R:CGGCTAGCCTAGTCTTCGTTTTGAAC。
TNFαF:CCGCTCGAGATGAGCACTGAAAGC，
TNFαR:CGGCTAGCTCACAGGGCAATGATCC。
IFNβF:CCTCGAGATGACCAACAAGTGTC，
IFNβR:CGGCTAGCTCAGTTTCGGAGG。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表1所示。
制备例71-77
制备例71-77分别提供了一种重组溶瘤病毒。该重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白和细胞因子。其中，M蛋白的突变位点与制备例2中相应的突变位点相同，G蛋白包含如SEQ IDNO 13所示的氨基酸序列，如表2所示。各制备例的不同之处在于：包括的细胞因子的类型不同，具体如表2所示。
上述制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法同制备例7的构建方法，不同之处在于：还包括如表2所示突变位点的G蛋白。构建方法的不同之处具体为：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表2所示的突变位点；
步骤(3)为G蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对G蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
针对G蛋白基因序列设计的引物序列为：
PF:ATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG；
PR:TTACTTTCCAAGTCGGTTCATCT。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表2所示。
表2制备例71-77中重组溶瘤病毒的突变情况表
制备例78-84
制备例78-84分别提供了一种重组溶瘤病毒。该重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白和细胞因子。其中，M蛋白和G蛋白的突变位点与制备例71中相应的突变位点相同，N蛋白包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列，如表3所示。各制备例的不同之处在于：包括的细胞因子的类型不同，具体如表3所示。
上述制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法同制备例71的构建方法，不同之处在于：还包括如表3所示突变位点的N蛋白。构建方法的不同之处具体为：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表3所示的突变位点；
步骤(3)为N蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对N蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
针对N蛋白基因序列设计的引物序列为：
PF:ATGTCTGTTACAGTCAAGAG；
PR:TCATTTGTCAAATTCTGACTT。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表3所示。
表3制备例78-84中重组溶瘤病毒的突变情况表
制备例85-91
制备例85-91分别提供了一种重组溶瘤病毒。该重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白和细胞因子。其中，M蛋白、G蛋白和P蛋白的突变位点与制备例78中相应的突变位点相同，P蛋白包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，如表4所示。各制备例的不同之处在于：包括的细胞因子的类型不同，具体如表4所示。
上述制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法同制备例78的构建方法，不同之处在于：还包括如表4所示突变位点的P蛋白。构建方法的不同之处具体为：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表4所示的突变位点；
步骤(3)为P蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对P蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
针对P蛋白基因序列设计的引物序列为：
PF:ATGGATAATCTCACAAAAGTTCG；
PR:CTACAGAGAATATTTGACTCTCG。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表4所示。
表4制备例85-91中重组溶瘤病毒的突变情况表
制备例92-98
制备例92-98分别提供了一种重组溶瘤病毒。该重组溶瘤病毒包括M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白和细胞因子。其中，M蛋白、G蛋白、P蛋白和N蛋白的突变位点与制备例85中相应的突变位点相同，L蛋白包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列，如表5所示。各制备例的不同之处在于：包括的细胞因子的类型不同，具体如表5所示。
上述制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法同制备例85的构建方法，不同之处在于：还包括如表5所示突变位点的L蛋白。构建方法的不同之处具体为：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表5所示的突变位点；
步骤(3)为L蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对L蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
针对L蛋白基因序列设计的引物序列为：
PF:ATGGAAGTCCACGATTTTGAGA；
PR:TTAATCTCTCCAAGAGTTTTCCT。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表5所示。
表5制备例92-98中重组溶瘤病毒的突变情况表
制备例99-105
制备例99-105提供了一种重组溶瘤病毒。上述重组溶瘤病毒是在野生型溶瘤病毒的基础上，导入编码细胞因子的外源基因获得的。
上述各制备例提供的重组溶瘤病毒的构建方法如下：
(1)插入外源基因
以pRV-core质粒(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)为模板，用Xho I和Mlu I进行双酶切，随后插入编码细胞因子的外源基因(编码细胞因子的外源基因由基因合成公司合成后用相应引物扩增)，用XhoI和NheI进行双酶切处理回收目的基因片段，将上述双酶切处理的pRV-core和外源基因片段进行连接转化，挑选单克隆，进行PCR或酶切鉴定后送测序公司测序，具体如表6所示，获得携带外源基因的质粒pRV-core Mut。
(2)病毒拯救
利用磷酸钙转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，通过细胞转染技术，将携带外源基因的质粒pRV-core Mut转染至BSR-T7细胞(购自ATCC，美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)。
按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；
利用200μl opti-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX 10μl(Thermo FisherScientific)，获得LTX混合液；
按照Lipofectamine LTX使用说明书所述的方法进行质粒转染，6h后利用PBS清洗BSR-T7细胞两次，进一步接种于10％胎牛血清的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养3天；
将培养BSR-T7细胞获得的的细胞上清转移到Vero细胞(Thermo FisherScientific)中，并将Vero细胞置于37℃的环境条件下培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况；进一步将拯救的突变棒状病毒库，通过Vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒株。
(3)基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对编码细胞因子基因序列设计的引物(与实施例1所示的引物序列相同)对逆转录出来的cDNA进行PCR；
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表6所示。
表6制备例99-105中重组溶瘤病毒的突变情况表
制备例106
本制备例提供了利用上述制备例1-105中任一制备例制备的重组溶瘤病毒的包装过程，具体包括以下步骤：
1)利用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)感染接种BSR-T7细胞(购自ATCC)
具体步骤如下：将BSR-T7细胞铺在6孔板上，控制每孔细胞量达到3×105个；铺板14-16h后加入表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3，进行痘病毒vTF7-3对BSR-T7细胞的感染；感染6h后，使用DPBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific)漂洗一次BSR-T7细胞，进行转染。
2)转染过程
具体包括以下步骤：按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；
利用200μl opti-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX 10μl(Thermo FisherScientific)，获得LTX混合液；
将LTX混合液200μl与转染质粒预混液200μl混合，室温孵育15min，获得LTX-DNA混合液；
将步骤1)的6孔板中的DPBS缓冲液换成Opti-MEM培养基，将LTX-DNA混合液逐滴加入培养BSR-T7细胞的6孔板中，轻轻摇动6孔板，使LTX-DNA混合液均匀分布在6孔板内；转染6-8h后，吸去转染试剂，加入3ml新鲜的完全培养基(Thermo Fisher Scientific)；72h后收获BSR-T7细胞的细胞上清，使用0.22μm滤器进行过滤，获得制备例1-105各自对应的重组溶瘤病毒。
实施例
实施例1
本实施例分别利用制备例1-105制得的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对不同细胞的侵染能力进行试验检测。
检测方法为TCID50检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例1-105以及野生型溶瘤病毒各200pfu，检测各溶瘤病毒产生的半数组织培养感染剂量(Tissueculture infective dose，TCID50)。
所检测的细胞包括：LLC细胞(鼠源肺癌细胞系)、4T1细胞(鼠源乳腺癌细胞系)、MC38细胞(鼠源结肠癌细胞系)、Hela细胞(人源宫颈癌细胞系)、MEF细胞(人源成纤维细胞系)。
具体检测方法为：
(1)分别在6孔培养板中加入Vero(LLC/4T1/MC38/Hela/MEF)细胞悬液3mL，使细胞量达到4×105个/孔，共6个孔，其中MEF细胞2个孔；将6孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养16h；
(2)分别向6孔培养板的每个孔中加入制备例制得的重组溶瘤病毒200pfu；在24h收获MEF细胞以及每种Vero细胞的上清100μl；将收获的上清分别加入96孔培养板的孔中，使各种细胞的细胞量达到1×104个/ml，将96孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养16h；
(3)在1.5ml EP管中将步骤(2)收获的上清作连续10倍的稀释，从10-1～10-11，共11个滴度；将稀释好的上清接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一列共8孔，每孔接种100μl；
(4)48h后观察每孔细胞的荧光情况，有荧光则记为此孔被感染；按Karber法计算TCID50。
检测结果如图1-图10所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-105分别表示制备例1-105制备的重组溶瘤病毒；纵坐标Log10 TCID50表示利用Karber法计算得出的TCID50值，Log10TCID50的值越大，表示重组溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越好；Log10TCID50的值越小，表示重组溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越差。
图1为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的侵染能力的检测结果。
图2为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的侵染能力的检测结果。
图3为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的侵染能力的检测结果。
图4为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的侵染能力的检测结果。
图5为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的侵染能力的检测结果。
图6为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的侵染能力的检测结果。
图7为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的侵染能力的检测结果。
图8为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的侵染能力的检测结果。
图9为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的侵染能力的检测结果。
图10为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的侵染能力的检测结果。
通过上述附图可知，本申请制备例1-98制备的重组溶瘤病毒均对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞具有较好的侵染能力，且均优于制备例99-105利用野生溶瘤病毒结合细胞因子制备的重组溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力。尤其是制备例61-70提供的重组溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力显著由于其他制备例。同时，上述制备的重组溶瘤病毒均对MEF细胞的侵染能力较差，说明本申请制备的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。
实施例2
本实施例分别利用制备例1-105制得的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对不同细胞进行体外杀伤试验检测。
检测方法为MTT检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例1-105以及野生型溶瘤病毒各200pfu，24h后利用MTT检测法检测细胞活性。
所检测的细胞包括：LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞、Hela细胞、MEF细胞。
具体检测方法为：
(1)分别在96孔培养板中加入Vero(LLC/4T1/MC38/Hela/MEF)细胞悬液100μl，使细胞量达到1×104个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养16h；
(2)将制备例制得的重组溶瘤病毒稀释到MOI(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，将每一稀释梯度的重组溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养40h；
(3)将步骤(2)的96孔培养板中的细胞上清取出，并向96孔培养板中加入新鲜培养基和MTT溶液，加入量为20μL/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养4h；
(4)将96孔培养板于室温下离心5min，设置转速为2500rpm/min，用1mL一次性无菌注射器轻轻吸掉上清；然后向96孔培养板的每个孔中加入DMSO，加入量为100ul/孔，37℃的环境条件下放置10min。使用多功能酶标仪，震荡2min，在570nm或490nm波长下测定96孔培养板上各孔的OD值。
检测结果如图11-图20所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-105分别表示制备例1-105制备的重组溶瘤病毒；纵坐标OD570表示细胞的OD值，OD570的值越大，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；OD570的值越小，表示重组溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。
图11为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图12为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图13为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图14为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图15为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图16为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图17为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图18为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图19为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图20为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。
通过上述附图可知，本申请制备例1-98制备的重组溶瘤病毒均对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞均具有较好的体外杀伤能力，均优于制备例99-105利用野生溶瘤病毒结合细胞因子制备的重组溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的体外杀伤能力。尤其是制备例61-70提供的重组溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的体外杀伤能力超过了野生型溶瘤病毒的体外杀伤能力。同时，上述制备的重组溶瘤病毒对MEF细胞几乎无杀伤作用，说明本申请制备的重组溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。
虽然野生型溶瘤病毒对LLC细胞、MC38细胞以及4T1细胞已具有较好的体外杀伤能力，但其在损伤和杀死上述细胞的同时，还会很大程度地损伤和杀死MEF细胞，限制了野生型溶瘤病毒的临床应用。因此，本申请对野生型溶瘤病毒的改造，在保证溶瘤病毒对正常细胞的安全性的同时，还保证了溶瘤病毒对肿瘤、癌症细胞的杀伤能力，具有广泛的临床应用前景。
实施例3
本实施例对制备例1-105制得的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在不同细胞内诱导IFN-β的表达情况进行试验检测。
检测指标为基因IFN-β在不同细胞内的表达情况。基因IFN-β是细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白的基因，通过基因IFN-β的表达情况可判断细胞对重组溶瘤病毒的清除能力：当基因IFN-β的表达较高时，表明重组溶瘤病毒在细胞内容易清除；当基因IFN-β的表达较低时，表示重组溶瘤病毒在细胞内不容易清除。
所检测的细胞包括：LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞、Hela细胞、MEF细胞。
具体检测方法为：
(1)分别在96孔培养板中加入Vero(LLC/4T1/MC38/Hela/MEF)细胞悬液100μl，使细胞量达到1×104个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养16h；
(2)将制备例制得的重组溶瘤病毒稀释到MOI(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，将每一稀释梯度的重组溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、5％CO2的环境条件下培养40h；
(3)将步骤(2)培养获得的各组细胞破碎，并利用TRIzol(Invitrogen)从各细胞中提取总RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser(Takara)反转录试剂盒逆转录成cDNA，并用LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche)染料进行染色，在LightCycler 480定量PCR仪上检测各个基因的Ct值。用ΔΔCt法计算目的基因IFN-β的相对表达量。
检测结果如图21-图30所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-105分别表示制备例1-105制备的重组溶瘤病毒；纵坐标IFN-β水平表示IFN-β基因的表达情况，IFN-β水平的值越大，表示重组溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越弱，越容易清除；IFN-β水平的值越小，表示重组溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越强，越不容易清除。
图21为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图22为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在4T1细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图23为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MC38细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图24为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在Hela细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图25为本申请制备例1-70制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MEF细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图26为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图27为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在4T1细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图28为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MC38细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图29为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在Hela细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图30为本申请制备例71-105制备的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MEF细胞内诱导IFN-β的表达情况。
通过上述附图可知，本申请制备例1-98提供的重组溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内繁殖能力较强，均不容易被清除，且均优于制备例99-105利用野生溶瘤病毒结合细胞因子制备的重组溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内的繁殖能力。尤其是制备例61-70提供的重组溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更加不容易清除，进一步保证溶瘤病毒能够在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更好的发挥侵染和杀伤的能力。同时，本申请提供的重组溶瘤病毒在MEF细胞内更加容易清除，进一步保证了MEF细胞的安全性，从而提高了溶瘤病毒的安全性。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (35)

1.重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒包括M蛋白和外源基因编码的细胞因子；所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下位点突变：在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；在第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；在第226位丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
2.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
3.根据权利要求1或2所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：敲除第111位亮氨酸编码碱基；或，在第111位亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)。
4.根据权利要求2或3所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述M蛋白还包含以下一个或多个位点突变：在第21位甘氨酸突变为丙氨酸(G21E)；和/或，在第33位甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述M蛋白的位点突变选自以下组中的任一项：
1)所述M蛋白的位点突变包含M51R、V221F、S226R；
2)所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；
3)所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、敲除第111位亮氨酸编码碱基、V221F、V225I、S226R；
4)所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、L111A、V221F、V225I、S226R；
5)所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；
6)所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；
7)所述M蛋白的位点突变包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；
8)所述M蛋白的位点突变包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；
9)所述M蛋白的位点突变包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；
10)所述M蛋白的位点突变包含N32S、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R。
6.根据权利要求5所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述M蛋白包含如SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化生长因子β、趋化因子家族。
8.根据权利要求7所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-β、TGF-β和TNF-α。
9.根据权利要求8所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述细胞因子选自如下任意一种或多种：GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-β、TNF-α。
10.重组溶瘤病毒，其特征在于：所述重组溶瘤病毒包含权利要求1-9中任一项所述的M蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括G蛋白；所述G蛋白与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。
11.根据权利要求10所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述G蛋白包含如SEQ ID NO13所示的氨基酸序列。
12.重组溶瘤病毒，其特征在于：所述重组溶瘤病毒包含权利要求1-9中任一项所述的M蛋白，或权利要求10-11中任一项所述的M蛋白和G蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括N蛋白；所述N蛋白与SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点突变：在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。
13.根据权利要求12所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述N蛋白包含如SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。
14.重组溶瘤病毒，其特征在于：所述重组溶瘤病毒包含权利要求1-9中任一项所述的M蛋白；或权利要求10-11中任一项所述的M蛋白和G蛋白；或权利要求12-13中任一项所述的M蛋白、G蛋白和N蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括P蛋白；所述P蛋白与SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)；和/或，在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。
15.根据权利要求14所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述P蛋白包含如SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
16.重组溶瘤病毒，其特征在于：所述重组溶瘤病毒包含权利要求1-9中任一项所述的M蛋白；或权利要求10-11中任一项所述的M蛋白和G蛋白；或权利要求12-13中任一项所述的M蛋白、G蛋白和N蛋白；或权利要求14-15中任一项所述的M蛋白、G蛋白、N蛋白和P蛋白；所述重组溶瘤病毒还包括L蛋白；所述L蛋白与SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点突变：在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
17.根据权利要求16所述的重组溶瘤病毒，其特征在于：所述L蛋白包含如SEQ ID NO19所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒还包括棒状病毒。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒还包括水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，简称VSV)。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒还包括VSV病毒Indiana MuddSummer亚型。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒还包含或表达外源目的蛋白。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒包含核酸分子；所述核酸分子包含编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列、和编码所述细胞因子的核酸序列。
23.根据权利要求22所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的G蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。
24.根据权利要求22所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述核酸分子中，所述编码细胞因子的核酸序列位于编码所述具有位点突变的M蛋白的核酸序列、编码所述具有位点突变的N蛋白的核酸序列或编码所述具有位点突变的P蛋白的核酸序列与编码所述位点突变的L蛋白的核酸序列之间。
25.重组溶瘤病毒表达载体，其特征在于，所述重组溶瘤病毒表达载体能够表达权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒。
26.病毒生产细胞，其特征在于：所述病毒生产细胞能够产生权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒。
27.利用权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒制备的疫苗。
28.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒、或权利要求27所述的疫苗，以及任选地药学上可接受的载剂。
29.如权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒、权利要求25所述的重组溶瘤病毒表达载体、权利要求26所述的病毒生产细胞、权利要求27所述的疫苗、权利要求28所述的药物组合物的制备方法。
30.如权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒、权利要求25所述的重组溶瘤病毒表达载体、权利要求26所述的病毒生产细胞、权利要求27所述的疫苗、权利要求28所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其特征在于：所述重组溶瘤病毒、所述重组溶瘤病毒表达载体、所述病毒生产细胞、所述疫苗和/或所述药物组合物用于持续杀伤异常增生性细胞的方法中。
32.根据权利要求31所述的用途，其特征在于：所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞。
33.如权利要求1-24中任一项所述的重组溶瘤病毒、权利要求27所述的疫苗、权利要求28所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
34.根据权利要求33所述的用途，其特征在于：所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
35.根据权利要求33所述的用途，其特征在于：所述肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、感觉神经母细胞瘤、尤文肉瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、肝细胞癌、下咽癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞增生症、喉癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口腔癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、咽癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状颈癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌和血管肿瘤。
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