WO2023143023A1 - 溶瘤病毒及其应用 - Google Patents

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WO2023143023A1
WO2023143023A1 PCT/CN2023/071375 CN2023071375W WO2023143023A1 WO 2023143023 A1 WO2023143023 A1 WO 2023143023A1 CN 2023071375 W CN2023071375 W CN 2023071375W WO 2023143023 A1 WO2023143023 A1 WO 2023143023A1
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amino acid
oncolytic virus
acid substitution
mutation
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周国庆
张凡
马良
田婷
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上海荣瑞医药科技有限公司
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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • This application relates to the technical field of biomedicine, more specifically, it relates to an oncolytic virus and its application.
  • Oncolytic virus is a kind of tumor-killing virus with replication ability, which has been accepted by the public as an important branch of tumor immunotherapy.
  • Oncolytic viruses can specifically target and infect tumor cells, such as using the inactivation or defect of tumor suppressor genes in tumor cells to selectively infect tumor cells; after oncolytic viruses infect tumor cells, they will replicate in large numbers in tumor cells And eventually destroy tumor cells, thereby killing tumor cells.
  • oncolytic viruses can also provide the immunostimulatory signals necessary to improve the host's own anti-cancer response, thereby attracting more immune cells to continue to kill residual tumor cells.
  • oncolytic viruses Although oncolytic viruses have good application prospects in tumor immunotherapy, wild-type oncolytic viruses often cause inflammation in the nervous system of the body and other problems. disease risk. Therefore, in order to further promote the clinical application of oncolytic viruses, it is necessary to modify wild-type oncolytic viruses to obtain attenuated oncolytic viruses.
  • the attenuated oncolytic virus is used for clinical application, thereby reducing the pathogenic risk of the oncolytic virus and improving the safety of the oncolytic virus.
  • the application provides an oncolytic virus and its application.
  • an oncolytic virus provided by the present application adopts the following technical scheme:
  • an oncolytic virus the oncolytic virus includes an M protein, and the M protein, compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 1, contains amino acid substitutions at one or more of the following sites: 32nd, 33rd bit, 49th, 54th, 133rd, 225th.
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of asparagine at position 32 to serine (N32S); and/or, a mutation of methionine at position 33 to alanine ( M33A); and/or, mutation of asparagine at position 49 to aspartic acid (N49D); and/or, mutation of histidine at position 54 to tyrosine (H54Y); and/or, Alanine at position 133 is mutated to threonine (A133T); and/or, valine at position 225 is mutated to isoleucine (V225I).
  • the M protein also includes amino acid substitutions at one or more of the following positions: 21st, 51st, 111th, 221st and 226th.
  • the amino acid substitution of the M protein further comprises a mutation of glycine at position 21 to glutamic acid (G21E); and/or, the amino acid substitution of the M protein comprises a methyl group at position 51 Mutation of thionine to arginine (M51R); and/or, mutation of methionine at position 51 to alanine (M51A); and/or, mutation of leucine to alanine at position 111 and/or, mutation of valine at position 221 to phenylalanine (V221F); and/or mutation of serine at position 226 to arginine (S226R).
  • M51R Mutation of thionine to arginine
  • M51A methionine at position 51 to alanine
  • V221F valine at position 221 to phenylalanine
  • S226R mutation of serine at position 226 to arginine
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of glycine at position 21 to glutamic acid (G21E).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of asparagine at position 32 to serine (N32S).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of methionine at position 33 to alanine (M33A).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of asparagine at position 49 to aspartic acid (N49D).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of histidine at position 54 to tyrosine (H54Y).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of leucine to alanine at position 111 (L111A).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises the mutation of alanine at position 133 to threonine (A133T).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of valine at position 225 to isoleucine (V225I).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of methionine at position 51 to arginine (M51R).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of methionine at position 51 to alanine (M51A).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of valine at position 221 to phenylalanine (V221F).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of serine at position 226 to arginine (S226R).
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of serine at position 226 to glycine (S226G).
  • said M protein has an amino acid substitution of G21E.
  • the M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S.
  • said M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A.
  • said M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D.
  • said M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D, H54Y.
  • said M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D, H54Y, L111A.
  • said M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D, H54Y, L111A, A133T.
  • the M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D, H54Y, L111A, A133T, V225I.
  • said M protein has G21E, N32S, M33A, N49D, M51R, H54Y, L111A, A133T, V225I amino acid substitutions.
  • the M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D, M51R, H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I.
  • the M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, M33A, N49D, M51R, H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, M33A, N49D, M51R, H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • the M protein has amino acid substitutions of M33A, N49D, M51R, H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of N49D, M51R, H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • the M protein has amino acid substitutions of M51R, H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of H54Y, L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of L111A, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of V221F, V225I, S226R.
  • the M protein has amino acid substitutions of V225I, S226R.
  • said M protein has an amino acid substitution of S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, N49D, H54Y, V225I.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, N49D, H54Y, V225I, S226G.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, N49D, M51R, H54Y, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, M33A, N49D, M51R, H54Y, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, N49D, M51R, H54Y, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of N32S, M33A, N49D, M51R, H54Y, A133T, V221F, V225I, S226R.
  • said M protein has amino acid substitutions of G21E, N32S, N49D, M51A, H54Y, L111A, V225I, S226R.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 2.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 3.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 4.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 5.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 6.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 7.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 8.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 9.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 10.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 11.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 12.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 13.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 14.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 15.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 16.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 17.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 18.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 19.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 20.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 21.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 22.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 23.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 24.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 25.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 26.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 27.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 28.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 29.
  • the M protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 30.
  • An oncolytic virus comprising the above-mentioned M protein; the oncolytic virus also includes a G protein; compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 31, the G protein comprises amino acid substitutions at one or more of the following sites: 438th, 453rd, 471st and 487th.
  • the G protein further comprises amino acid substitutions at one or more of the following positions: 53rd, 141st, 172nd, 217th, 232nd, 331st, 371st, 436th.
  • the amino acid substitution of the G protein comprises the mutation of valine at position 53 to isoleucine (V53I); and/or, the mutation of alanine at position 141 to valine acid (A141V); and/or, mutation of aspartic acid at position 172 to tyrosine (D172Y); and/or, mutation of lysine at position 217 to glutamic acid (K217E); and/or Or, aspartic acid at position 232 is mutated to glycine (D232G); and/or, valine at position 331 is mutated to alanine (V331A); and/or, valine at position 371 is mutated acid mutation to glutamic acid (V371E); and/or, glycine at position 436 to aspartic acid (G436D); and/or threonine at position 438 to serine (T438S); and /or, phenylalanine at position 453 is mutated to leucine (V53I); and
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of valine at position 53 to isoleucine (V53I).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises the mutation of alanine at position 141 to valine (A141V).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of aspartic acid at position 172 to tyrosine (D172Y).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of lysine at position 217 to glutamic acid (K217E).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of aspartic acid at position 232 to glycine (D232G).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of valine at position 331 to alanine (V331A).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of valine at position 371 to glutamic acid (V371E).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises the mutation of glycine at position 436 to aspartic acid (G436D).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises the mutation of threonine at position 438 to serine (T438S).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of phenylalanine to leucine at position 453 (F453L).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises the mutation of threonine at position 471 to isoleucine (T471I).
  • the amino acid substitution of the G protein comprises a mutation of tyrosine at position 487 to histidine (Y487H).
  • said G protein has a V53I amino acid substitution.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I and A141V.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I.
  • the G protein has amino acid substitutions of V53I, A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of A141V, D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of D172Y, K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of K217E, D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of D232G, V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of V331A, V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of V371E, G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of G436D, T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of T438S, F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of F453L, T471I, Y487H.
  • the G protein has amino acid substitutions of T471I, Y487H.
  • said protein G has an amino acid substitution of Y487H.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 32.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 33.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 34.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 35.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 36.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 37.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 38.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 39.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 40.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 41.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 42.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 43.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 44.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 45.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 46.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 47.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 48.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 49.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 50.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 51.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 52.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 53.
  • the G protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 54.
  • An oncolytic virus comprising the above-mentioned M protein, or M protein and G protein; the oncolytic virus also includes an N protein; compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 55, the N protein contains one or more of the following Amino acid substitutions at positions: 14th, 155th, and 353rd.
  • the amino acid substitution of the N protein comprises the mutation of isoleucine at position 14 to valine (I14V); and/or, the mutation of arginine at position 155 to lysine acid (R155K); and/or, mutation of serine at position 353 to asparagine (S353N).
  • the amino acid substitution of the N protein comprises a mutation of isoleucine to valine at position 14 (I14V).
  • the amino acid substitution of the N protein comprises arginine at position 155 to lysine (R155K).
  • the amino acid substitution of the N protein comprises a mutation of serine at position 353 to asparagine (S353N).
  • said N protein has an amino acid substitution of I14V.
  • the N protein has amino acid substitutions of I14V, R155K.
  • said N protein has amino acid substitutions of I14V, R155K, S353N.
  • the N protein has amino acid substitutions of R155K, S353N.
  • said N protein has an amino acid substitution of S353N.
  • the N protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 56.
  • the N protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 57.
  • the N protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 58.
  • the N protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 59.
  • the N protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 60.
  • An oncolytic virus comprising the above-mentioned M protein, or M protein and G protein, or M protein, G protein and N protein, or M protein and N protein; the oncolytic virus also includes P protein; the P protein and Compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 61, amino acid substitutions at one or more of the following positions are included: 50th, 76th, 99th, 126th, 140th, 151st, 168th bit, 170th, 189th, 237th.
  • the amino acid substitution of the P protein comprises the mutation of arginine at position 50 to lysine (R50K); and/or, the mutation of valine at position 76 to alanine (V76A); and/or, mutation of asparagine at position 99 to glutamic acid (D99E); and/or mutation of leucine at position 126 to serine (L126S); and/or, mutation of Leucine at position 140 is mutated to serine (L140S); and/or, histidine at position 151 is mutated to tyrosine (H151Y); and/or isoleucine at position 168 is mutated to formazan Thionine (I168M); and/or, lysine at position 170 to glutamic acid (K170E); and/or, tyrosine at position 189 to serine (Y189S); and/or , the asparagine at position 237 was mutated to aspartic acid (N237D).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises the mutation of arginine at position 50 to lysine (R50K).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of valine at position 76 to alanine (V76A).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of asparagine at position 99 to glutamic acid (D99E).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of leucine to serine at position 126 (L126S).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of leucine to serine at position 140 (L140S).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of histidine at position 151 to tyrosine (H151Y).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of isoleucine at position 168 to methionine (I168M).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of lysine at position 170 to glutamic acid (K170E).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of tyrosine at position 189 to serine (Y189S).
  • the amino acid substitution of the P protein comprises a mutation of asparagine at position 237 to aspartic acid (N237D).
  • said P protein has an amino acid substitution of R50K.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K and V76A.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S, L140S.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S, L140S, H151Y.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S, L140S, H151Y, I168M.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S, L140S, H151Y, I168M, K170E.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S, L140S, H151Y, I168M, K170E, Y189S.
  • the P protein has amino acid substitutions of R50K, V76A, D99E, L126S, L140S, H151Y, I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • the P protein has amino acid substitutions of V76A, D99E, L126S, L140S, H151Y, I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • the P protein has amino acid substitutions of D99E, L126S, L140S, H151Y, I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • said P protein has amino acid substitutions of L126S, L140S, H151Y, I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • said P protein has amino acid substitutions of L140S, H151Y, I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • the P protein has amino acid substitutions of H151Y, I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • said P protein has amino acid substitutions of I168M, K170E, Y189S, N237D.
  • the P protein has amino acid substitutions of K170E, Y189S, N237D.
  • the P protein has amino acid substitutions of Y189S, N237D.
  • said P protein has an amino acid substitution of N237D.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 62.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 63.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 64.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 65.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 66.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 67.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 68.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 69.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 70.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 71.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 72.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 73.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 74.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 75.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 76.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 77.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 78.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 79.
  • the P protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 80.
  • An oncolytic virus comprising the above-mentioned M protein, or M protein and G protein, or M protein, G protein and N protein, or M protein, G protein, N protein and P protein, or M protein and N protein, or M protein protein and P protein, or M protein, G protein and P protein, or M protein, N protein and P protein; the oncolytic virus also includes L protein; the L protein is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 81 ratio, including amino acid substitutions at one or more of the following positions: 87th, 487th.
  • the amino acid substitution of the L protein comprises a mutation of serine at position 87 to proline (S87P); and/or, a mutation of isoleucine at position 487 to threonine ( I487T).
  • the amino acid substitution of the L protein comprises a mutation of serine at position 87 to proline (S87P).
  • the amino acid substitution of the L protein comprises a mutation of isoleucine at position 487 to threonine (I487T).
  • said L protein has an amino acid substitution of S87P.
  • the L protein has amino acid substitutions of S87P, I487T.
  • said L protein has an amino acid substitution of I487T.
  • the L protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 82.
  • the L protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 83.
  • the L protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 84.
  • the oncolytic virus is obtained by site-directed mutation based on a baculovirus.
  • the oncolytic virus is obtained after site-directed mutation based on Vesicular Stomatitis Virus ("VSV”) virus.
  • VSV Vesicular Stomatitis Virus
  • the oncolytic virus is obtained after performing site-directed mutation based on the Indiana MuddSummer subtype of VSV virus.
  • the oncolytic virus comprises or expresses an exogenous protein of interest.
  • the oncolytic virus comprises a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the M protein with amino acid substitutions, and/or a nucleic acid sequence encoding the G protein with amino acid substitutions , and/or the nucleic acid sequence encoding the N protein with amino acid substitutions, and/or the nucleic acid sequence encoding the P protein with amino acid substitutions, and/or the nucleic acid sequence encoding the L protein with amino acid substitutions.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding the exogenous protein of interest.
  • the nucleic acid sequence encoding the exogenous target protein in the nucleic acid molecule is located in the nucleic acid sequence encoding the M protein with amino acid substitutions, and/or the nucleic acid sequence encoding the G protein with amino acid substitutions Nucleic acid sequence, and/or the nucleic acid sequence encoding the N protein with amino acid substitution, and/or the nucleic acid sequence encoding the P protein with amino acid substitution, and/or the nucleic acid sequence encoding the L protein with amino acid substitution between.
  • the present application provides an oncolytic virus expression vector, which adopts the following technical scheme:
  • An oncolytic virus expression vector capable of producing any one of the oncolytic viruses described in this application.
  • the present application provides a virus production cell, adopting the following technical scheme:
  • a virus-producing cell capable of producing any one of the oncolytic viruses described in the application.
  • the present application provides a pharmaceutical composition, adopting the following technical scheme:
  • a pharmaceutical composition which includes any oncolytic virus described in this application, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present application provides methods for preparing the above-mentioned oncolytic virus, oncolytic virus expression vector, virus production cell and/or pharmaceutical composition.
  • the present application provides the use of the above-mentioned oncolytic virus, oncolytic virus expression vector, virus production cell and/or pharmaceutical composition in the preparation of medicines for preventing and/or treating diseases and/or disorders.
  • the oncolytic virus, oncolytic virus expression vector, virus producing cell and/or pharmaceutical composition are used in a method for slow and sustained killing of dysplastic cells.
  • the diseases and/or conditions include: abnormal proliferative cells selected from tumor cells or related cells of tumor tissues; preferably, the tumor cells are cancer cells; more preferably, the The cancer cells are metastatic cancer cells.
  • the tumor comprises solid tumors and/or hematological tumors.
  • the oncolytic viruses provided by this application all have good infective ability and in vitro killing ability to abnormally proliferative (tumor) LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells, and Hela cells, and are effective in LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells, and Hela cells. are not easily cleared from the cells. Moreover, all the oncolytic viruses provided in the present application have poor infective ability to normal MEF cells, and poor killing ability in vitro, and the oncolytic viruses provided in the present application are all easy to clear in normal MEF cells.
  • the oncolytic virus provided by this application can be better used for the infection and killing of cells such as tumors and cancers, and it is not easy to be cleared in cells such as tumors and cancers, which further improves the oncolytic virus’s effect on cells such as tumors and cancers. Cure rate; at the same time, the above-mentioned oncolytic virus will not damage normal cells, and is easier to remove when inside normal cells, further ensuring the safety of normal cells.
  • Fig. 1 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to LLC cells.
  • Fig. 2 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to 4T1 cells.
  • Fig. 3 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to MC38 cells.
  • Fig. 4 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to Hela cells.
  • Fig. 5 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to MEF cells.
  • Fig. 6 is the detection result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on LLC cells.
  • Fig. 7 is the test result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on 4T1 cells.
  • Fig. 8 is the test result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on MC38 cells.
  • Fig. 9 is the detection result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on Hela cells.
  • Fig. 10 is the detection result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on MEF cells.
  • Figure 11 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in LLC cells.
  • Figure 12 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in 4T1 cells.
  • Figure 13 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in MC38 cells.
  • Figure 14 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in Hela cells.
  • Figure 15 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in MEF cells.
  • the number 0 on the abscissa represents the wild-type oncolytic virus; the numbers 1-79 on the abscissa represent the oncolytic viruses prepared in Preparation Examples 1-79, respectively.
  • the ordinate Log 10 TCID50 represents the TCID50 value calculated by the Karber method. The larger the value of Log 10 TCID50, the better the ability of the oncolytic virus to infect the cell; the smaller the value of Log 10 TCID50, the better the oncolytic virus The poorer the ability to infect the cell;
  • the vertical axis OD 570 represents the OD value of the cell. The larger the value of OD 570 , the worse the killing ability of the oncolytic virus on the cell; the smaller the value of OD 570 , the better the killing ability of the oncolytic virus on the cell.
  • the IFN- ⁇ level on the ordinate indicates the expression of the IFN- ⁇ gene.
  • the term "oncolytic virus” generally refers to a virus capable of replicating in and killing tumor cells.
  • Oncolytic viruses include, but are not limited to: Vesicular Stomatitis Virus (VSV virus for short), poxvirus, herpes simplex virus, measles virus, Semliki Forest virus, poliovirus, reovirus virus, Seneca Valley virus, Echo enterovirus, Coxsackie virus, Newcastle disease virus, and Maraba virus.
  • VSV virus Vesicular Stomatitis Virus
  • poxvirus herpes simplex virus
  • measles virus Semliki Forest virus
  • poliovirus poliovirus
  • reovirus virus Seneca Valley virus
  • Echo enterovirus Coxsackie virus
  • Newcastle disease virus and Maraba virus.
  • the oncolytic virus is engineered to increase selectivity for tumor cells.
  • the oncolytic virus is engineered to reduce its immunogenicity.
  • the oncolytic virus described herein is a VSV virus.
  • the VSV virus is a mutant of the Indiana MuddSummer subtype strain of the VSV virus.
  • site-directed gene mutation can be performed on the M protein, and/or G protein, and/or N protein, and/or P protein, and/or L protein of VSV virus.
  • the oncolytic virus described in the present application may be an oncolytic virus that has undergone genetic modification, such as modification of one or more genes, so as to improve its tumor selectivity and/or enhance its tumor selectivity in dividing cells. Copy first.
  • the modification at the gene level can be the modification of genes involved in DNA replication, nucleic acid metabolism, host tropism, surface attachment, virulence, lysis and diffusion, or the modification of integrating foreign genes.
  • the exogenous genes may include exogenous immune regulation genes, exogenous screening genes, exogenous reporter genes and the like.
  • the modified oncolytic virus may also be an oncolytic virus modified at the amino acid level, such as insertion, deletion, or substitution of one or more amino acids.
  • M protein generally refers to the VSV viral matrix protein. M protein is an important virulence factor of VSV virus, and it is also a protein in VSV virus that is known to interfere with the natural immune response of mice. The term “M protein” also includes homologues, orthologs, variants, functionally active fragments, etc. thereof.
  • the wild-type VSV virus Indiana MuddSummer subtype M protein can comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 1.
  • the M protein of the oncolytic virus may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 2-29.
  • G protein generally refers to the glycoprotein of water VSV virus, also known as envelope protein.
  • G protein also includes homologues, orthologs, variants, functionally active fragments and the like thereof.
  • wild-type VSV virus Indiana MuddSummer subtype G protein can comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 31.
  • the G protein of the oncolytic virus may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 32-54.
  • N protein generally refers to the nucleocapsid protein of VSV virus.
  • the term “N protein” also includes its homologues, orthologs, variants, functionally active fragments and the like.
  • the wild-type VSV virus Indiana MuddSummer subtype N protein can comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 55.
  • the N protein of the oncolytic virus may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 56-60.
  • the term "P protein” generally refers to the phosphoprotein of VSV virus.
  • the term “P protein” also includes its homologues, orthologs, variants, functionally active fragments and the like.
  • the wild-type VSV virus Indiana MuddSummer subtype P protein can comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 61.
  • the P protein of the oncolytic virus may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 62-80.
  • L protein generally refers to the VSV viral RNA polymerase protein.
  • the L gene of VSV virus encodes RNA poly E protein.
  • L protein also includes its homologues, orthologs, variants, functionally active fragments and the like.
  • the wild-type VSV virus Indiana MuddSummer subtype L protein can comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 81.
  • the L protein of the oncolytic virus may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 82-84.
  • the protein mutation site is usually expressed by "amino acid + amino acid number + (mutated amino acid)".
  • the mutation may include, but not limited to, addition, substitution, deletion and/or deletion of amino acids.
  • M51R generally refers to a mutation of methionine M at position 51 to arginine R.
  • amino acid substitution generally refers to the replacement of an amino acid residue present in a parent sequence by another amino acid residue.
  • Amino acids in the parent sequence may be substituted, eg, via chemical peptide synthesis or by recombinant methods known in the art.
  • substitution at position xx generally refers to substitution of the amino acid present at position xx with an alternative amino acid residue.
  • the amino acid substitution may include amino acid mutation.
  • mutation generally refers to changing the nucleotide or amino acid sequence of a wild-type molecule.
  • Amino acid changes may include amino acid substitutions, deletions, deletions, insertions, additions, truncations, or processing or cleavage of proteins.
  • nucleic acid molecule generally refers to nucleotides of any length.
  • nucleic acid molecule may encode a protein comprised by said oncolytic virus.
  • the nucleic acid molecule may comprise DNA and/or RNA.
  • the RNA can comprise single-stranded RNA (ssRNA) or double-stranded RNA (dsRNA), and single-stranded RNA can comprise sense RNA or antisense RNA (anti-sense RNA).
  • ssRNA single-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • anti-sense RNA anti-sense RNA
  • the term "expression vector” generally refers to a nucleic acid vector. Under appropriate conditions, it is usually capable of expressing the gene and/or protein of interest.
  • the expression vector includes a nucleic acid molecule for expressing one or more components of a virus (eg, an oncolytic virus).
  • the expression vector can include at least one viral genomic element and can be packaged into a virus or as a virion.
  • virus producing cell generally refers to a cell, cell line or cell culture that can or already contains the nucleic acid molecule or expression vector described in the application, or can express the oncolytic virus described in the application.
  • the cells may include progeny of a single host cell.
  • the cells can be obtained by in vitro transfection using the expression vector described in this application.
  • the term "pharmaceutical composition” generally refers to a preparation in a form that allows the biological activity of the active ingredients to be effective, and which does not contain additional ingredients that are unacceptably toxic to the subject to which the preparation is to be administered .
  • these formulations may comprise the active ingredient of a drug together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the drug product comprises a drug product for parenteral, transdermal, intracavity, intraarterial, intrathecal and/or intranasal administration or direct injection into tissue.
  • the pharmaceutical product can be administered in different ways, for example intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, topically or intradermally.
  • prevention generally refers to preventing the occurrence and onset, recurrence, and/or spread of a disease or one or more symptoms thereof by taking certain measures in advance.
  • treating generally refers to eliminating or ameliorating a disease, or one or more symptoms associated with a disease.
  • treatment generally refers to the administration of one or more drugs to a patient with the disease such that the disease is eliminated or remitted.
  • treatment may be administration of the drug combination and/or drug product in the presence or absence of other drugs after the onset of symptoms of a particular disease.
  • the use of the pharmaceutical combinations and/or pharmaceutical products described herein prevents the development, progression, recurrence and/or metastasis of tumors.
  • the term "neoplastic” generally refers to any new pathological growth of tissue. Tumors can be benign or malignant. In the present application, the tumor may be a solid tumor and/or a hematological tumor. For research, these tissues can be isolated from readily available sources by methods well known to those skilled in the art.
  • the application provides an oncolytic virus.
  • the oncolytic virus is based on the wild-type VSV virus, specifically on the basis of the Indiana strain of the VSV virus and the Indiana MuddSummer subtype strain of the VSV virus.
  • M protein, G protein Through its M protein, G protein, It is obtained by mutating the amino acid sequence of N protein, P protein and L protein.
  • the amino acid sequence of its M protein is shown in SEQ ID NO 1; the amino acid sequence of its G protein is shown in SEQ ID NO 31; the amino acid sequence of its N protein is shown in SEQ ID NO 55; the amino acid sequence of its P protein is shown in SEQ ID NO 55 Shown in ID NO 61;
  • the amino acid sequence of its L protein is shown in SEQ ID NO 81.
  • the M protein, G protein, N protein, P protein, and L protein can all be modified.
  • the present application makes the following modifications to the VSV virus to obtain an oncolytic virus.
  • an oncolytic virus the oncolytic virus includes an M protein, and the M protein, compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 1, contains amino acid substitutions at one or more of the following sites: 32nd, 33rd, 49th, 54th, 133rd, 225th.
  • the M protein also includes amino acid substitutions at one or more of the following positions: 21st, 51st, 111th, 221st and 226th.
  • the amino acid substitution of the M protein comprises a mutation of asparagine at position 32 to serine (N32S); and/or, a mutation of methionine at position 33 to alanine (M33A); and/or, at Asparagine at position 49 to aspartic acid (N49D); and/or, histidine at position 54 to tyrosine (H54Y); and/or, alanine at position 133 Mutation to threonine (A133T); and/or, mutation of valine at position 225 to isoleucine (V225I); the amino acid substitution of the M protein also includes the mutation of glycine at position 21 to glutamine acid (G21E); and/or, the amino acid substitution of the M protein comprises the mutation of methionine at position 51 to arginine (M51R); and/or, the mutation of methionine at position 51 to Alanine (M51A); and/or, comprising a mutation of leucine at position 111 to alanine (L111A
  • the M protein may contain an amino acid mutation at position 21.
  • the M protein may contain amino acid mutations at positions 21 and 32.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32 and 33.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 33 and 49.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 33, 49 and 54.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 33, 49, 54 and 111.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 33, 49, 54, 111 and 133.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 33, 49, 54, 111, 133 and 225.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 33, 49, 51, 54, 111, 133 and 225.
  • the M protein may comprise the 21st, 32nd, 33rd, 49th, 51st, 54th, 111th, 133rd, 221st and 225th amino acid mutations.
  • the M protein may comprise the 21st, 32nd, 33rd, 49th, 51st, 54th, 111th, 133rd, 221st, 225th and amino acid mutation at position 226.
  • the M protein may comprise the 32nd, 33rd, 49th, 51st, 54th, 111th, 133rd, 221st, 225th and 226th amino acid mutations.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 33, 49, 51, 54, 111, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 49, 51, 54, 111, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 51, 54, 111, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 54, 111, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 111, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 225 and 226.
  • the M protein may contain an amino acid mutation at position 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 32, 49, 54 and 225.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 32, 49, 54, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 32, 49, 51, 54, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 32, 33, 49, 51, 54, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 32, 49, 51, 54, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 32, 33, 49, 51, 54, 133, 221, 225 and 226.
  • the M protein may comprise amino acid mutations at positions 21, 32, 49, 51, 54, 111, 225 and 226.
  • the M protein may also contain amino acid substitutions at other positions.
  • the oncolytic virus also includes a G protein; compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 31, the G protein contains amino acid substitutions at one or more of the following sites: 438th, 453rd, 471st and the 487th.
  • the amino acid substitution of the G protein comprises the mutation of valine at position 53 to isoleucine (V53I); and/or, the mutation of alanine at position 141 to valine (A141V ); and/or, the aspartic acid at position 172 is mutated to tyrosine (D172Y); and/or, the lysine at position 217 is mutated to glutamic acid (K217E); and/or, at Aspartic acid at position 232 is mutated to glycine (D232G); and/or, valine at position 331 is mutated to alanine (V331A); and/or, valine at position 371 is mutated to glutamic acid (V371E); and/or, mutation of glycine at position 436 to aspartic acid (G436D); and/or, mutation of threonine at position 438 to serine (T438S); and/or, Mutation of phenylalanine at position 4
  • the G protein may contain an amino acid mutation at position 53.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53 and 141.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53, 141 and 172.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at position 53, position 141, position 172 and position 217.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53, 141, 172, 217 and 232.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53, 141, 172, 217, 232 and 331.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53, 141, 172, 217, 232, 331 and 371.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53, 141, 172, 217, 232, 331, 371 and 436.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 53, 141, 172, 217, 232, 331, 371, 436 and 438.
  • the G protein may comprise the 53rd, 141st, 172nd, 217th, 232nd, 331st, 371st, 436th, 438th and 453rd positions amino acid mutations.
  • the G protein may comprise the 53rd, 141st, 172nd, 217th, 232nd, 331st, 371st, 436th, 438th, 453rd and amino acid mutation at position 471.
  • the G protein may comprise the 53rd, 141st, 172nd, 217th, 232nd, 331st, 371st, 436th, 438th, 453rd , amino acid mutations at positions 471 and 487.
  • the G protein may comprise the 141st, 172nd, 217th, 232nd, 331st, 371st, 436th, 438th, 453rd, 471st and amino acid mutation at position 487.
  • the G protein may comprise the 172nd, 217th, 232nd, 331st, 371st, 436th, 438th, 453rd, 471st and 487th amino acid mutations.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 217, 232, 331, 371, 436, 438, 453, 471 and 487.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 232, 331, 371, 436, 438, 453, 471 and 487.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 331, 371, 436, 438, 453, 471 and 487.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 371, 436, 438, 453, 471 and 487.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 436, 438, 453, 471 and 487.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 438, 453, 471 and 487.
  • the G protein may comprise amino acid mutations at positions 453, 471 and 487.
  • the G protein may contain amino acid mutations at positions 471 and 487.
  • the G protein may contain an amino acid mutation at position 487.
  • the G protein may also include amino acid substitutions at other positions.
  • the G protein comprises at least one or more amino acid substitutions in conserved regions.
  • the conserved region may comprise amino acids 437-461 of the G protein.
  • the G protein comprises at least one or more amino acid substitutions in the truncated region of the cytoplasmic domain.
  • the truncated region of the cytoplasmic domain may comprise amino acids 483-511 of the G protein.
  • the G protein may at least include amino acid substitutions at positions 438, 453, 471 and 487.
  • the oncolytic virus also includes an N protein; compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 55, the N protein contains amino acid substitutions at one or more of the following sites: 14th, 155th, and 353rd .
  • the amino acid substitution of the N protein comprises the mutation of isoleucine at position 14 to valine (I14V); and/or, the mutation of arginine at position 155 to lysine (R155K) and/or, the serine at position 353 is mutated to asparagine (S353N).
  • the N protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 58.
  • the N protein may contain an amino acid mutation at position 14.
  • the N protein may contain amino acid mutations at positions 14 and 155.
  • the N protein may comprise amino acid mutations at positions 14, 155 and 353.
  • the N protein may contain amino acid mutations at positions 155 and 353.
  • the N protein may contain an amino acid mutation at position 353.
  • the N protein may also contain amino acid substitutions at other positions.
  • the oncolytic virus also includes a P protein; compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 61, the P protein includes amino acid substitutions at one or more of the following positions: 50th, 76th, and 99th , 126th, 140th, 151st, 168th, 170th, 189th, 237th.
  • the amino acid substitution of the P protein comprises the mutation of arginine at position 50 to lysine (R50K); and/or, the mutation of valine at position 76 to alanine (V76A) and/or, asparagine at position 99 is mutated to glutamic acid (D99E); and/or, leucine at position 126 is mutated to serine (L126S); and/or, at position 140 Leucine is mutated to serine (L140S); and/or, histidine at position 151 is mutated to tyrosine (H151Y); and/or isoleucine at position 168 is mutated to methionine (I168M); and/or, the lysine at position 170 is mutated to glutamic acid (K170E); and/or, the tyrosine at position 189 is mutated to serine (Y189S); and/or, at The asparagine at position 237 was mutated to aspartic
  • the P protein may contain an amino acid mutation at position 50.
  • the P protein may contain amino acid mutations at positions 50 and 76.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76 and 99.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76, 99 and 126.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76, 99, 126 and 140.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76, 99, 126, 140 and 151.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76, 99, 126, 140, 151 and 168.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76, 99, 126, 140, 151, 168 and 170.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 50, 76, 99, 126, 140, 151, 168, 170 and 189.
  • the P protein may comprise the 50th, 76th, 99th, 126th, 140th, 151st, 168th, 170th, 189th and 237th amino acid mutations.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 76, 99, 126, 140, 151, 168, 170, 189 and 237.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 99, 126, 140, 151, 168, 170, 189 and 237.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 126, 140, 151, 168, 170, 189 and 237.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 140, 151, 168, 170, 189 and 237.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 151, 168, 170, 189 and 237.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 168, 170, 189 and 237.
  • the P protein may comprise amino acid mutations at positions 170, 189 and 237.
  • the P protein may contain amino acid mutations at positions 189 and 237.
  • the P protein may contain an amino acid mutation at position 237.
  • the P protein may also include amino acid substitutions at other positions.
  • the oncolytic virus also includes L protein; compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 81, the L protein includes amino acid substitutions at one or more of the following positions: 87th and 487th.
  • the L protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 83.
  • the amino acid substitution of the L protein includes the mutation of serine at position 87 to proline (S87P); and/or the mutation of isoleucine at position 487 to threonine (I487T).
  • the P protein may contain an amino acid mutation at position 87.
  • the P protein may contain amino acid mutations at positions 87 and 487.
  • the P protein may contain an amino acid mutation at position 487.
  • the P protein may also include amino acid substitutions at other positions.
  • the oncolytic virus may also comprise a nucleic acid molecule and an exogenous protein of interest.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding the M protein with amino acid substitutions, and/or a nucleic acid sequence encoding the G protein with amino acid substitutions, and/or a nucleic acid sequence encoding the N protein with amino acid substitutions, and/or Or the nucleic acid sequence encoding the P protein with amino acid substitution, and/or the nucleic acid sequence encoding the L protein with amino acid substitution.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding the exogenous protein of interest.
  • the nucleic acid sequence encoding the exogenous target protein is located in the nucleic acid sequence encoding the M protein with amino acid substitutions, and/or the nucleic acid sequence encoding the G protein with amino acid substitutions, and/or encoding the amino acid substitutions Between the nucleic acid sequence of the N protein, and/or the nucleic acid sequence encoding the P protein with amino acid substitutions, and/or the nucleic acid sequence encoding the L protein with amino acid substitutions.
  • the oncolytic virus described in this application can be obtained through a virus packaging process and a virus rescue process.
  • the specific process can include infecting and inoculating BSR-T7 cells with poxvirus vTF7-3 expressing T7 RNA polymerase, using expression plasmids and backbone plasmids for cloned VSV N, VSV P, and VSV L genes to perform lipofectamine transfection to obtain the target oncolytic virus .
  • the present application also provides an oncolytic virus expression vector, a virus production cell and a pharmaceutical composition.
  • the oncolytic virus expression vector may comprise nucleic acid sequences encoding the M protein and G protein of the oncolytic virus; the oncolytic virus expression vector may also comprise the N protein, P protein and L protein encoding the oncolytic virus nucleic acid sequence.
  • the virus production cells can produce the above-mentioned oncolytic virus; the virus production cells may include BSR-T7 cells, Vero cells, 293 cells, MRC-5 cells, WI38 cells.
  • the pharmaceutical composition includes the above-mentioned oncolytic virus, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may include one or more (pharmaceutically effective) adjuvants, stabilizers, excipients, diluents, solubilizers, surfactants, emulsifiers and/or Suitable preparation of preservatives.
  • the acceptable ingredients of the pharmaceutical compositions are preferably nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed.
  • Pharmaceutical compositions of the present application include, but are not limited to, liquid, frozen and lyophilized compositions.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include any and all solvents, dispersion media, coatings, isotonic agents and absorption delaying agents compatible with pharmaceutical administration, generally safe, nontoxic .
  • the pharmaceutical composition includes the above-mentioned oncolytic virus, and optionally other pharmaceutically acceptable drugs.
  • the above pharmaceutical composition can be used for combined treatment of diseases, including but not limited to the treatment of tumors.
  • the pharmaceutical composition may comprise parenteral, subcutaneous, intracavity, intraarterial, intravenous, intrathecal and/or intranasal administration or direct injection into tissue.
  • the pharmaceutical composition can be administered to a patient or subject by infusion or injection.
  • the administration of the pharmaceutical composition can be performed by different means, such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, topical or intradermal administration.
  • the pharmaceutical composition can be administered without interruption. Such uninterrupted (or continuous) administration can be achieved by a small pump system worn by the patient to measure the influx of the therapeutic agent into the patient, as described in WO2015/036583.
  • the present application also provides a preparation method of the above-mentioned oncolytic virus, which may include a preparation method of an oncolytic virus expression vector, a virus production cell and/or a pharmaceutical composition.
  • Any method suitable for the production of oncolytic viruses can be used to produce the oncolytic viruses of the present application.
  • a poxvirus expressing T7 RNA polymerase can be added to the cells for transfection
  • plasmids expressing the N protein, L protein and P protein of the oncolytic virus and a backbone plasmid can be added for transfection, and the virus of the present application can be obtained through the virus rescue process.
  • Oncolytic virus can be obtained through the virus rescue process.
  • the present application also provides the use of the above-mentioned oncolytic virus, oncolytic virus expression vector, virus production cell and/or pharmaceutical composition in the preparation of medicaments for preventing and/or treating diseases and/or conditions.
  • the oncolytic virus provided by the application performs site-directed mutations on the amino acids on the M protein, G protein, N protein, P protein, and L protein of the oncolytic virus, thereby further improving the effect of the oncolytic virus on abnormally proliferative (tumor) LLC cells. , 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells.
  • the oncolytic virus prepared above has poor infectivity to normal cells and normal MEF cells, indicating that the oncolytic virus prepared by the present application can be better used for infecting cells such as tumors and cancers without damaging normal cells. cells have broad application prospects.
  • the oncolytic virus provided by the application performs site-directed mutations on the amino acids on the M protein, G protein, N protein, P protein, and L protein of the oncolytic virus, thereby further improving the effect of the oncolytic virus on abnormally proliferative (tumor) LLC cells. , 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells.
  • abnormally proliferative (tumor) LLC cells 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells.
  • the in vitro killing ability of the oncolytic virus on LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells was further improved.
  • the oncolytic virus prepared above has almost no effect on normal MEF cells, indicating that the oncolytic virus prepared in the present application can be used to damage and kill abnormal cells such as tumors and cancers without damaging normal cells.
  • the oncolytic virus provided by the present application is not easily cleared in abnormally proliferative (tumor) LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells. Relatively speaking, wild-type oncolytic virus is easier to clear in LLC cells, MC38 cells and Hela cells. However, the oncolytic virus provided by this application performs site-directed mutations on the amino acids on the M protein, G protein, N protein, P protein, and L protein of the oncolytic virus, so that the oncolytic virus can be used in LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells, and Hela cells.
  • Preparation Examples 1-29 respectively provide an oncolytic virus, the difference mainly lies in: the amino acid site-directed mutation site on the M protein of the wild-type oncolytic virus.
  • the construction method of the oncolytic virus corresponding to each preparation example is as follows:
  • the mutation sites shown in Table 1 were introduced by PCR technology. Perform PCR on the pRV-core plasmid and primers carrying each mutation site; then perform 1% agarose gel electrophoresis on the PCR product; then use the gel recovery kit for gel extraction to obtain different mutation sites with M protein Point the plasmid to obtain the constructed plasmid pRV-core Mut.
  • the constructed plasmid pRV-core Mut was transfected into BSR-T7 cells (purchased from ATCC, American Type Culture Collection, also known as the American model) by cell transfection technology. strain collection center).
  • pP, pN, and pL According to the mass ratio of pRV-core Mut, pP, pN, and pL as 10:5:4:1, the four plasmids were mixed, and the total amount of plasmids was 5 ⁇ g; the plasmids were diluted with 200 ⁇ l opti-MEM medium (Thermo Fisher Scientific), And add 7.5 ⁇ l transfection reagent Plus Reagent (Life Technologies) to obtain transfection plasmid master mix; wherein, pP (plasmid carrying baculovirus phosphoprotein gene), pN (plasmid carrying baculovirus nucleoprotein gene), pL (Plasmid carrying the baculovirus polymerase protein gene); pN, pP, and pL three corresponding parent vectors are all pCAGGS (purchased from ATCC);
  • the cell supernatant obtained by culturing BSR-T7 cells was transferred to Vero cells (Thermo Fisher Scientific), and the Vero cells were cultured at 37°C for 3 days, and the green fluorescence in the cells was observed under a fluorescence microscope to determine the degree of virus rescue. Situation; Further, the rescued mutant baculovirus library was passaged through Vero cells, and monoclonal virus strains were picked in the established phage plaque screening system.
  • the primer sequences are:
  • the product was recovered by 1% agarose gel electrophoresis and sent to a sequencing company for sequencing.
  • the sequencing results are shown in Table 1.
  • Preparation Examples 30-52 respectively provide an oncolytic virus, the main difference of which is: the sites of amino acid site-directed mutations on the M protein and G protein of the wild-type oncolytic virus.
  • the mutation site of the M protein is the same as the corresponding mutation site in Preparation Example 24, and the mutation site of the G protein is shown in Table 2.
  • the construction method of the oncolytic virus provided in the above preparation example is the same as the construction method of preparation example 11, the difference lies in:
  • step (1) PCR technology is utilized to introduce mutation sites as shown in Table 2;
  • Step (3) is G protein gene sequencing.
  • the primer sequences are:
  • the product was recovered by 1% agarose gel electrophoresis and sent to a sequencing company for sequencing.
  • the sequencing results are shown in Table 2.
  • Table 2 The mutation table of oncolytic virus G protein in preparation examples 30-52
  • Preparation Examples 53-57 respectively provide an oncolytic virus, the difference mainly lies in the sites of amino acid site-directed mutations on the M protein, G protein, and N protein of the wild-type oncolytic virus.
  • the mutation sites of M protein and G protein are the same as the corresponding mutation sites in Preparation Example 41, and the mutation sites of N protein are shown in Table 3.
  • the construction method of the oncolytic virus provided in the above preparation example is the same as the construction method of preparation example 41, the difference lies in:
  • step (1) PCR technology is utilized to introduce mutation sites as shown in Table 3;
  • Step (3) is N protein gene sequencing.
  • the primer sequences are:
  • the product was recovered by 1% agarose gel electrophoresis and sent to a sequencing company for sequencing.
  • the sequencing results are shown in Table 3.
  • Preparation Examples 58-76 respectively provide an oncolytic virus, which differs mainly in the sites of amino acid site-directed mutations on the M protein, G protein, N protein, and P protein of the wild-type oncolytic virus. Among them, the mutation sites of M protein, G protein, and N protein are the same as those in Preparation Example 55, and the mutation sites of P protein are shown in Table 4.
  • the construction method of the oncolytic virus provided in the above preparation example is the same as the construction method of preparation example 55, the difference lies in:
  • step (1) PCR technology is utilized to introduce mutation sites as shown in Table 4;
  • Step (3) is P protein gene sequencing.
  • the primer sequences are:
  • the product was recovered by 1% agarose gel electrophoresis and sent to a sequencing company for sequencing.
  • the sequencing results are shown in Table 4.
  • Preparation Examples 77-79 respectively provide an oncolytic virus, which differs mainly in the sites of amino acid site-directed mutations on the M protein, G protein, N protein, P protein, and L protein of the wild-type oncolytic virus.
  • the mutation sites of M protein, G protein, N protein, and P protein are the same as those in Preparation Example 67, and the mutation sites of L protein are shown in Table 5.
  • the construction method of the oncolytic virus provided in the above preparation example is the same as the construction method of preparation example 67, the difference lies in:
  • step (1) PCR technology is used to introduce mutation sites as shown in Table 5;
  • Step (3) is L protein gene sequencing.
  • the primer sequences are:
  • PR TTAATCTCTCCAAGAGTTTTTCCT.
  • the product was recovered by 1% agarose gel electrophoresis and sent to a sequencing company for sequencing.
  • the sequencing results are shown in Table 5.
  • This preparation example provides the packaging process of the oncolytic virus prepared by any one of the above preparation examples 1-79, which specifically includes the following steps:
  • BSR-T7 cells purchased from ATCC
  • poxvirus vTF7-3 expressing T7 RNA polymerase BioVector NTCC Plasmid Vector Strain Cell Gene Collection Center
  • the specific steps are as follows: spread BSR-T7 cells on a 6-well plate, and control the number of cells per well to 3 ⁇ 105 ; add poxvirus vTF7-3 expressing T7 RNA polymerase 14-16 hours after plating, and conduct poxvirus vTF7- 3. Infection of BSR-T7 cells; 6 hours after infection, the BSR-T7 cells were washed once with DPBS buffer (Thermo Fisher Scientific) for transfection.
  • DPBS buffer Thermo Fisher Scientific
  • the oncolytic virus prepared in Preparation Examples 1-79 and the wild-type oncolytic virus were used to test the infectivity of different cells.
  • the detection method is the TCID50 detection method, that is, 200 pfu each of Preparation Examples 1-79 and wild-type oncolytic viruses were added to the culture medium of different cells, and half of the tissue culture infectious dose (Tissue culture infectious dose) produced by each oncolytic virus was detected. TCID50).
  • the detected cells include: LLC cells (murine lung cancer cell line), 4T1 cells (murine breast cancer cell line), MC38 cells (murine colon cancer cell line), Hela cells (human cervical cancer cell line), MEF cells (human fibroblast cell line).
  • the specific detection method is:
  • step (3) In a 1.5ml EP tube, make serial 10-fold dilutions of the supernatant harvested in step (2), from 10 -1 to 10 -11 , a total of 11 titers; inoculate the diluted supernatant into 96 wells In the culture plate, inoculate a row of 8 wells for each dilution, and inoculate 100 ⁇ l in each well;
  • TCID50 is calculated according to the Karber method.
  • the test results are shown in Figure 1- Figure 5.
  • the abscissa 0 represents the wild-type oncolytic virus
  • the abscissa 1-79 represents the oncolytic virus prepared in Preparation Examples 1-79
  • the ordinate Log 10 TCID50 represents the TCID50 value calculated by the Karber method
  • the Log 10 TCID50 The larger the value, the better the ability of the oncolytic virus to infect the cell; the smaller the value of Log 10 TCID50, the worse the ability of the oncolytic virus to infect the cell.
  • Fig. 1 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to LLC cells.
  • Fig. 2 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to 4T1 cells.
  • Fig. 3 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to MC38 cells.
  • Fig. 4 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to Hela cells.
  • Fig. 5 is the detection result of the infectivity of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus to MEF cells.
  • the oncolytic viruses prepared in Preparation Examples 1-79 of the present application all have good infectivity to LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells, especially the oncolytic viruses provided in Preparation Examples 77-79.
  • the ability of the virus to infect LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells reached the infectivity of wild-type oncolytic virus.
  • the oncolytic viruses prepared above all have poor ability to infect MEF cells, especially the oncolytic viruses provided in Preparation Examples 77-79, indicating that the oncolytic viruses prepared in this application can be better used for tumors, cancers, etc. Infection of cells without damaging normal cells has broad application prospects.
  • the oncolytic virus prepared in Preparation Examples 1-79 and the wild-type oncolytic virus were used to perform in vitro killing tests on different cells.
  • the detection method is the MTT detection method, that is, 200 pfu each of Preparation Examples 1-79 and wild-type oncolytic virus are added to the culture medium of different cells, and the cell viability is detected by the MTT detection method after 24 hours.
  • the detected cells include: LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells, Hela cells, MEF cells.
  • the specific detection method is:
  • step (3) The cell supernatant in the 96-well culture plate of step (2) was taken out, and fresh medium and MTT solution were added to the 96-well culture plate in an amount of 20 ⁇ L/well, and the 96-well culture plate was placed at 37 Cultivate for 4 hours under ambient conditions of °C and 5% CO 2 ;
  • the abscissa 0 represents the wild-type oncolytic virus
  • the abscissa 1-79 respectively represent the oncolytic viruses prepared in Preparation Examples 1-79
  • the ordinate OD 570 represents the OD value of the cells, and the larger the OD 570 value, the oncolytic virus The worse the ability of the virus to kill the cell; the smaller the OD 570 value, the better the ability of the oncolytic virus to kill the cell.
  • Fig. 6 is the detection result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on LLC cells.
  • Fig. 7 is the test result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on 4T1 cells.
  • Fig. 8 is the test result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on MC38 cells.
  • Fig. 9 is the detection result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on Hela cells.
  • Fig. 10 is the detection result of the in vitro killing ability of the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus on MEF cells.
  • the oncolytic viruses prepared in Preparation Examples 1-79 of the present application all have good in vitro killing ability against LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells, especially the oncolytic viruses provided in Preparation Examples 77-79.
  • the in vitro killing ability of oncoviruses on LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells exceeded that of wild-type oncolytic virus.
  • the oncolytic virus prepared above has almost no killing effect on MEF cells, indicating that the oncolytic virus prepared in the present application can be used to damage and kill abnormal cells such as tumors and cancers without damaging normal cells.
  • the wild-type oncolytic virus has a good ability to kill LLC cells, MC38 cells and 4T1 cells in vitro, it will also damage and kill MEF cells to a large extent while damaging and killing the above-mentioned cells, which limits Clinical application of wild-type oncolytic virus. Therefore, the transformation of the wild-type oncolytic virus in the present application not only ensures the safety of the oncolytic virus to normal cells, but also ensures the killing ability of the oncolytic virus to tumor and cancer cells, and has broad clinical application prospects.
  • the oncolytic virus prepared in Preparation Examples 1-79 and the wild-type oncolytic virus induced the expression of IFN- ⁇ in different cells.
  • the detection index is the expression of gene IFN- ⁇ in different cells.
  • the gene IFN- ⁇ is a gene of soluble glycoprotein produced by cells with extensive anti-virus, anti-tumor and immunomodulatory effects.
  • the ability of cells to clear oncolytic viruses can be judged by the expression of gene IFN- ⁇ : when the gene IFN- When the expression of ⁇ is high, it indicates that the oncolytic virus is easily cleared in the cell; when the expression of gene IFN- ⁇ is low, it indicates that the oncolytic virus is not easily cleared in the cell.
  • the detected cells include: LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells, Hela cells, MEF cells.
  • the specific detection method is:
  • step (3) Disrupt each group of cells obtained in step (2), and use TRIzol (Invitrogen) to extract total RNA from each cell, and use PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser (Takara) reverse transcription kit to reverse transcribe into cDNA , and stained with LightCycler 480SYBR Green I Master (Roche) dye, and the Ct value of each gene was detected on a LightCycler 480 quantitative PCR instrument. The relative expression of the target gene IFN- ⁇ was calculated by ⁇ Ct method.
  • the abscissa 0 represents the wild-type oncolytic virus
  • the abscissa 1-79 respectively represent the oncolytic viruses prepared in Preparation Examples 1-79
  • the ordinate IFN- ⁇ level represents the expression of the IFN- ⁇ gene
  • the IFN- ⁇ level The larger the value, the weaker the reproduction ability of the oncolytic virus in the cell, and the easier it is to clear; the smaller the value of the IFN- ⁇ level, the stronger the reproduction ability of the oncolytic virus in the cell, and the easier it is to clear.
  • Figure 11 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in LLC cells.
  • Figure 12 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in 4T1 cells.
  • Figure 13 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in MC38 cells.
  • Figure 14 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in Hela cells.
  • Figure 15 shows the expression of IFN- ⁇ induced by the oncolytic virus prepared in the present application and the wild-type oncolytic virus in MEF cells.
  • the oncolytic viruses provided in Preparation Example 1 and Preparation Example 21 of the present application and the wild-type oncolytic virus have weak reproductive ability in LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells, and are easily eliminated.
  • the oncolytic viruses provided in Preparation Examples 2-20 and 22-79 are less easy to clear in LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells.
  • the oncolytic viruses provided in Preparation Examples 77-79 are more difficult to clear in LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells, further ensuring that the oncolytic viruses can be more effective in LLC cells, 4T1 cells, MC38 cells and Hela cells. Good ability to infect and kill.
  • the oncolytic virus provided by the present application is easier to clear in MEF cells, which further ensures the safety of MEF cells, thereby improving the safety of oncolytic viruses.

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Abstract

本申请涉及生物医药的技术领域，具体公开了一种溶瘤病毒及其应用。该溶瘤病毒包括M蛋白，所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第32位、第33位、第49位、第54位、第133位、第225位。以及该溶瘤病毒的表达载体、生产该溶瘤病毒的病毒生产细胞、包括该溶瘤病毒的药物组合物；以及上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物的制备方法和用途。本申请能够有效提高溶瘤病毒的安全性和治愈率。

Description

溶瘤病毒及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药的技术领域，更具体地说，它涉及一种溶瘤病毒及其应用。
背景技术
溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，目前已被大众接受作为肿瘤免疫治疗的重要分支。溶瘤病毒能够特异性地靶向感染肿瘤细胞，例如利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而选择性地感染肿瘤细胞；溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，会在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。同时，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号，从而吸引更多的免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。
虽然溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗方面具有较好的应用前景，但野生型溶瘤病毒往往会引起机体神经系统炎症等问题，在利用野生型病毒感染肿瘤细胞的过程中，还存在较大的致病风险。因此，为进一步推进溶瘤病毒的临床应用，需要对野生型溶瘤病毒进行改造，以获得减毒后的溶瘤病毒。将减毒后的溶瘤病毒用于临床应用，从而降低溶瘤病毒的致病风险，提高溶瘤病毒的安全性。
然而，在对溶瘤病毒改造的过程中，若仅是对野生型溶瘤病毒随机进行基因修饰，虽然能够降低其毒性，但改造后的溶瘤病毒可能治愈率效果不佳，甚至改造后的溶瘤病毒无法进行包装，不利于推进溶瘤病毒的临床应用。因此，提供一种安全性能良好，同时治愈率高的改造后的溶瘤病毒,对肿瘤免疫治疗领域具有重要的科研价值和应用意义。
发明内容
为了提高溶瘤病毒的安全性和治愈率，本申请提供一种溶瘤病毒及其应用。
第一方面，本申请提供的一种溶瘤病毒，采用如下的技术方案：
一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒包括M蛋白，所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第32位、第33位、第49位、第54位、第133位、第225位。
在一些具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和/或，在第33位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
进一步地，所述M蛋白还包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第21位、第51位、第111位、第221位和第226位。
在一些具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代还包含在第21位的甘氨酸突变为谷氨酸(G21E)；和/或，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；和/或，在第51位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M51A)；和/或，包含在第111位的亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)；和/或，在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；和/或，在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第21位的甘氨酸突变为谷氨酸(G21E)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第33位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第111位的亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M51A)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第226位的丝氨酸突变为甘氨酸(S226G)。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y、L111A的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y、L111A、A133T的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y、L111A、A133T、V225I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V225I氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有L111A、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、H54Y、V225I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、H54Y、V225I、S226G的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白具有G21E、N32S、N49D、M51A、H54Y、L111A、V225I、S226R的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 19所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 20所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 23所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 28所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 30所示的氨基酸序列。
一种溶瘤病毒，包含上述M蛋白；所述溶瘤病毒还包括G蛋白；所述G蛋白与SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第438位、第453位、第471位和第487位。
在一些具体的实施方案中，所述G蛋白还包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位。
在一些具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有T438S、F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有F453L、T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有T471I、Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白具有Y487H的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 32所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 33所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 34所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 36所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 37所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 38所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 39所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 40所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 41所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 42所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 43所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 44所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 45所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 46所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 47所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 48所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 49所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 50所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 51所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 52所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 53所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述G蛋白如SEQ ID NO 54所示的氨基酸序列。
一种溶瘤病毒，包含上述M蛋白、或M蛋白和G蛋白；所述溶瘤病毒还包括N蛋白；所述N蛋白与SEQ ID NO 55所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第14位、第155位、第353位。
在一些具体的实施方案中，所述N蛋白的氨基酸取代包含在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白的氨基酸取代包含在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白的氨基酸取代包含在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白的氨基酸取代包含在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有I14V的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有I14V、R155K的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有I14V、R155K、S353N的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有R155K、S353N的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白具有S353N的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 56所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 58所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 59所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 60所示的氨基酸序列。
一种溶瘤病毒，包含上述M蛋白、或M蛋白和G蛋白、或M蛋白、G蛋白和N蛋白、或M蛋白和N蛋白；所述溶瘤病毒还包括P蛋白；所述P蛋白与SEQ ID NO 61所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点的氨基酸取代：第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位、第237位。
在一些具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)；和/或，在 第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、 N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有I168M、K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有K170E、Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有Y189S、N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白具有N237D的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 62所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 63所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 64所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 65所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 66所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 67所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 68所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 69所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 70所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 71所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 72所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 73所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 74所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 75所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 76所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 77所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 78所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 79所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 80所示的氨基酸序列。
一种溶瘤病毒，包含上述M蛋白，或M蛋白和G蛋白，或M蛋白、G蛋白和N蛋白，或M蛋白、G蛋白、N蛋白和P蛋白，或M蛋白和N蛋白，或M蛋白和P蛋白，或M蛋白、G蛋白和P蛋白，或M蛋白、N蛋白和P蛋白；所述溶瘤病毒还包括L蛋白；所述L蛋白与SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点的氨基酸取代：第87位、第487位。
在一些具体的实施方案中，所述L蛋白的氨基酸取代包含在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白的氨基酸取代包含在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白的氨基酸取代包含在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白具有S87P的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白具有S87P、I487T的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白具有I487T的氨基酸取代。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 82所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 83所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 84所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述溶瘤病毒是以棒状病毒为基础，进行定点突变后获得的。
在一些具体的实施方案中，所述溶瘤病毒是以Vesicular Stomatitis Virus(简称“VSV”)病毒为基础，进行定点突变后获得的。
在一些具体的实施方案中，所述溶瘤病毒是以VSV病毒Indiana MuddSummer亚型为基础，进行定点突变后获得的。
在一些具体的实施方案中，所述溶瘤病毒包含或表达外源目的蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述溶瘤病毒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码所述具有氨基酸取代的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的L蛋白的核酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述核酸分子包含编码所述外源目的蛋白的核酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述核酸分子中所述编码外源目的蛋白的核酸序列位于编码所述具有氨基酸取代的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的L蛋白的核酸序列之间。
第二方面，本申请提供一种溶瘤病毒表达载体，采用如下的技术方案：
一种溶瘤病毒表达载体，所述溶瘤病毒表达载体能够产生本申请所述的任一项溶瘤病毒。
第三方面，本申请提供一种病毒生产细胞，采用如下的技术方案：
一种病毒生产细胞，所述病毒生产细胞能够产生本申请所述的任一项溶瘤病毒。
第四方面，本申请提供一种药物组合物，采用如下的技术方案：
一种药物组合物，所述药物组合物包括本申请所述的任一项溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
第五方面，本申请提供上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物的制备方法。
第六方面，本申请提供上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
在一些具体的实施方案中，所述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物用于缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法中。
在一些具体的实施方案中，所述疾病和/或病症包括：异常增生性细胞，选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。
在一些具体的实施方案中，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的溶瘤病毒均对异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞具有较好的侵染能力、体外杀伤能力，且在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内均不容易清除。并且，本申请提供的溶瘤病毒均对正常MEF细胞的侵染能力较差，体外杀伤能力较差，且本申请提供的溶瘤病毒在正常MEF细胞内均容易清除。因此，本申请提供的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染和杀伤，且在肿瘤、癌症等细胞内不易清除，进一步提高了溶瘤病毒对肿瘤、癌症等细胞的治愈率；同时，上述提供的溶瘤病毒不会损伤正常细胞，且在正常细胞内时更加容易清除，进一步保证了正常细胞的安全性。
附图说明
图1为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的侵染能力的检测结果。
图2为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的侵染能力的检测结果。
图3为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的侵染能力的检测结果。
图4为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的侵染能力的检测结果。
图5为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的侵染能力的检测结果。
图6为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图7为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图8为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图9为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图10为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图11为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图12为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在4T1细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图13为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MC38细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图14为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在Hela细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图15为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MEF细胞内诱导IFN-β的表达情况。
以上附图中，横坐标上0号表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-79号分别表示制备例1-79制备的溶瘤病毒。
纵坐标Log 10TCID50表示利用Karber法计算得出的TCID50值，Log 10TCID50的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越好；Log 10TCID50的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越差；
纵坐标OD 570表示细胞的OD值，OD 570的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；OD 570的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。
纵坐标IFN-β水平表示IFN-β基因的表达情况，IFN-β水平的值越大，表示溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越弱，越容易清除；IFN-β水平的值越小，表示溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越强，越不容易清除。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“溶瘤病毒”通常指能够在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的病毒。溶瘤病毒包括但不限于：水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，简称“VSV病毒”)、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以提高对肿瘤细胞的选择性。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以降低其免疫原性。在一些实施方案中，本申请所述溶瘤病毒为VSV病毒。在一些实施方案中，VSV病毒为VSV病毒Indiana MuddSummer亚型株的突变体。在一些实施方案中，可以对VSV病毒的M蛋白、和/或G蛋白、和/或N蛋白、和/或P蛋白、和/或L蛋白进行定点基因突变。
在某些实施方式中，本申请所述溶瘤病毒可以是经过基因水平改造的溶瘤病毒，如经过一个或多个基因的修饰来改造，从而提高其肿瘤选择性和/或在分裂细胞中优先复制。所述基因水平的改造可以为修饰参与DNA复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散过程的基因，也可以为整合外源基因的改造。所述外源基因可以包括外源免疫调节基因、外源筛选基因、外源报告基因等。所述经过改造的溶瘤病毒也可以是经过氨基酸水平改造的溶瘤病毒，如一个或多个氨基酸的插入、缺失、置换。
在本申请中，术语“M蛋白”通常指VSV病毒基质蛋白。M蛋白是VSV病毒重要的毒力因子，也是VSV病毒中已知可干扰小鼠天然免疫应答的蛋白。术语“M蛋白”还包括其同源物、直系同源 物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型M蛋白可以包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的M蛋白可以包含如SEQ ID NO 2-29所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“G蛋白”通常指水VSV病毒的糖蛋白，也称包膜蛋白。术语“G蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型G蛋白可以包含如SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的G蛋白可以包含如SEQ ID NO 32-54所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“N蛋白”通常指VSV病毒的核衣壳蛋白。术语“N蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型N蛋白可以包含如SEQ ID NO 55所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的N蛋白可以包含如SEQ ID NO 56-60所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“P蛋白”通常指VSV病毒的磷酸蛋白。术语“P蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型P蛋白可以包含如SEQ ID NO 61所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的P蛋白可以包含如SEQ ID NO 62-80所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“L蛋白”通常指VSV病毒RNA聚合酶蛋白。VSV病毒的L基因编码RNA poly E蛋白。术语“L蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。在本申请中，野生型VSV病毒Indiana MuddSummer亚型L蛋白可以包含如SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列。在本申请中，所述溶瘤病毒的L蛋白可以包含如SEQ ID NO 82-84所示的氨基酸序列。
在本申请中，蛋白突变位点的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+(突变后的氨基酸)”来表述。在本申请中，所述突变可以包括但不限于氨基酸的增加、替换、缺失和/或删除。例如，术语“M51R”通常指第51位甲硫氨酸M突变为精氨酸R。
在本申请中，术语“氨基酸取代”通常是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的一个氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，“在xx位置处取代”通常是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置xx处的氨基酸。在本申请中，所述氨基酸取代可以包括氨基酸突变。
在本申请中，术语“突变”通常是指改变野生型分子的核苷酸或氨基酸序列。氨基酸变化可以包括氨基酸的置换、删除、缺失、插入、添加、截短、或蛋白质的加工或切割。
在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的核苷酸。在本申请中，术语“核酸分子”可以编码所述溶瘤病毒包含的蛋白。在本申请中，所述核酸分子可以包含DNA和/或RNA。在某些情形下，所述RNA可以包含单链RNA(ssRNA)，也可以包含双链RNA(dsRNA)，单链RNA可以包含正义RNA，也可以包含反义RNA(anti-sense RNA),也可以包含双义RNA。
在本申请中，术语“表达载体”通常指一种核酸载体。在适当的条件下，其通常能够表达目标基因和/或目标蛋白。在本申请的某些实施方式中，所述表达载体包括用于表达病毒(例如，溶瘤病毒)的一种或多种组分的核酸分子。例如，所述表达载体可包括至少一个病毒基因组元件，并可以被包装入病毒或被包装为病毒粒子。
在本申请中，术语“病毒生产细胞”通常指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子或表达载体，或能够表达本申请所述溶瘤病毒的细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。所述细胞可以通过使用本申请所述的表达载体体外转染而得到。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在的制剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成分。在某些实施方案中，这些制剂可以包含药物的活性组分以及药学上可接受的载剂。在某些实施方式中，所述药物产品包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的药物产品。所述药物产品可以通过不同方式给药，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
在本申请中，术语“预防”通常是指通过预先采取某些措施而防止疾病或其一种或多种症状的产生和发作，复发，和/或扩散。在本申请中，术语“治疗”通常指消除或改善疾病，或与疾病相关的一种或多种症状。在某些实施方案中，治疗通常指向患有这种疾病的患者施用一种或多种药物使得疾病消除或缓解。在某些实施方案中，“治疗”可以是在特定疾病的症状发作后，在其他药物存在或不存在的情况下施用所述药物组合和/或药物产品。例如，使用本申请所述药物组合和/或药物产品防止肿瘤的产生，发展，复发和/或转移。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。在本申请中，所述肿瘤可以是实体瘤和/或血液瘤。用于研究时，可通过本领域技术人员熟知的方法从易于获得的资源中将这些组织分离出来。
发明详述
本申请提供了一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒是以野生型VSV病毒为基础，具体以VSV病毒印第安纳株，VSV病毒Indiana MuddSummer亚型株为基础，通过对其M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白的氨基酸序列上的位点进行突变获得的。其M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；其G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 31所示；其N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 55所示；其P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 61所示；其L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 81所示。在本申请中，所述M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白均可以被改造。
本申请对所述VSV病毒进行如下修饰，以获得溶瘤病毒。
一种溶瘤病毒，溶瘤病毒包括M蛋白，所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第32位、第33位、第49位、第54位、第133位、第225位。所述M蛋白还包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第21位、第51位、第111位、第221位和第226位。
所述M蛋白的氨基酸取代包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和/或，在第33位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)；所述M蛋白的氨基酸取代还包含在第21位的甘氨酸突变为谷氨酸(G21E)；和/或，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；和/或，在第51位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M51A)；和/或，包含在第111位的亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)；和/或，在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；和/或，在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位和第33位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位和第49位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位和第54位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位、第54位和第111位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位、第54位、第111位和第133位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位、第54位、第111位、第133位和第225位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第111位、第133位和第225位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位、第51位、第54 位、第111位、第133位、第221位和第225位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第33位、第49位、第51位、第54位、第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第49位、第51位、第54位、第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第51位、第54位、第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第54位、第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第111位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第49位、第54位和第225位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第49位、第54位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第49位、第51位、第54位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第49位、第51位、第54位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第32位、第33位、第49位、第51位、第54位、第133位、第221位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白可以包含第21位、第32位、第49位、第51位、第54位、第111位、第225位和第226位的氨基酸突变。
在本申请中，所述M蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
所述溶瘤病毒还包括G蛋白；所述G蛋白与SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第438位、第453位、第471位和第487位。
在本申请中，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。例如，所述G蛋白如SEQ ID NO 43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位和第141位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位和第172位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位和第217位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位和第232位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位和第331位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位和第371位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位和第436位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位和第438位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位和第453位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位和第471位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第471位、第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白可以包含第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述G蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
在某些实施方式中，所述G蛋白至少包含在保守区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述保守区可以包含G蛋白的第437-461位氨基酸。在某些实施方式中，所述G蛋白至少包含在胞质域的截短区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述胞质域的截短区可以包含G蛋白的第483-511位氨基酸。
在本申请中，所述G蛋白可以至少包含在第438、第453位、第471位和第487位的氨基酸取代。
所述溶瘤病毒还包括N蛋白；所述N蛋白与SEQ ID NO 55所示的氨基酸序列相比，包含以下 一个或多个位点的氨基酸取代：第14位、第155位、第353位。
本申请中，所述N蛋白的氨基酸取代包含在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。例如，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 58所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述N蛋白可以包含第14位的氨基酸突变。
在本申请中，所述N蛋白可以包含第14位和第155位的氨基酸突变。
在本申请中，所述N蛋白可以包含第14位、第155位和第353位的氨基酸突变。
在本申请中，所述N蛋白可以包含第155位和第353位的氨基酸突变。
在本申请中，所述N蛋白可以包含第353位的氨基酸突变。
在本申请中，所述N蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
所述溶瘤病毒还包括P蛋白；所述P蛋白与SEQ ID NO 61所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点的氨基酸取代：第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位、第237位。
在本申请中，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)；和/或，在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。例如，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 71所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位和第76位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位和第99位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位和第126位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位和第140位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位、第140位和第151位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位和第168位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位和第170位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位和第189位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第140位、第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第151位、第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第168位、第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第170位、第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第189位和第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第237位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
所述溶瘤病毒还包括L蛋白；所述L蛋白与SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点的氨基酸取代：第87位、第487位。例如，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 83所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述L蛋白的氨基酸取代包含在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第87位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第87位和第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白可以包含第487位的氨基酸突变。
在本申请中，所述P蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
所述溶瘤病毒还可以包含核酸分子和外源目的蛋白。核酸分子包含编码所述具有氨基酸取代的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的L蛋白的核酸序列。
进一步地，该核酸分子包含编码所述外源目的蛋白的核酸序列。所述编码外源目的蛋白的核酸序列位于编码所述具有氨基酸取代的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的L蛋白的核酸序列之间。
在本申请中，可以通过病毒包装过程和病毒拯救过程获得本申请所述的溶瘤病毒。具体过程可以包括用表达T7RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感染接种BSR-T7细胞，使用分别克隆VSV N、VSV P、VSV L基因的表达质粒和骨架质粒进行lipofectamine转染，获得目的溶瘤病毒。
本申请还提供了一种溶瘤病毒表达载体、一种病毒生产细胞以及一种药物组合物。
所述溶瘤病毒表达载体可以包含编码所述溶瘤病毒的M蛋白和G蛋白的核酸序列；所述溶瘤病毒表达载体还可以包含编码所述溶瘤病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白的核酸序列。
所述病毒生产细胞能够产生上述的溶瘤病毒；所述病毒生产细胞可以包含BSR-T7细胞、Vero细胞、293细胞、MRC-5细胞、WI38细胞。
所述药物组合物包括上述的溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包括一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。药物组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选对接受者无毒。本申请的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
所述药物组合物包括上述的溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的其它药物。
上述药物组合物可用于进行联合治疗疾病，包括但不限于治疗肿瘤。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮下、腔内、动脉内、静脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、 皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
此外，本申请还提供了上述溶瘤病毒的制备方法，该制备方法可以包括溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物的制备方法。任何适于生产溶瘤病毒的方法都可用于产生本申请的溶瘤病毒。例如，可以向细胞中加入表达T7RNA聚合酶的痘病毒进行转染，加入表达所述溶瘤病毒N蛋白、L蛋白和P蛋白的质粒以及骨架质粒进行转染，通过病毒拯救过程获得本申请的溶瘤病毒。
本申请还提供了上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
本申请提供的溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力。同时，上述制备的溶瘤病毒对正常细胞正常MEF细胞的侵染能力均较差，说明本申请制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。
本申请提供的溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力。从而进一步提高了溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的体外杀伤能力。同时，上述制备的溶瘤病毒对正常MEF细胞几乎无影响，说明本申请制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。
本申请提供的溶瘤病毒在异常增生性(肿瘤)LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内均不易清除。相对而言，野生型溶瘤病毒在LLC细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更容易清除。而本申请提供的溶瘤病毒分别对溶瘤病毒的M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上的氨基酸进行定点突变，使得溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更加不容易清除，进一步保证溶瘤病毒能够在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更好的发挥侵染和杀伤能力；同时，本申请提供的溶瘤病毒在正常MEF细胞内更加容易清除，进一步保证了正常MEF细胞的安全性，从而提高了溶瘤病毒的安全性。
以下结合制备例1-80、实施例1-3以及附图1-15对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1-29
制备例1-29分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于：野生型溶瘤病毒M蛋白上氨基酸定点突变的位点。各制备例对应的溶瘤病毒的构建方法具体如下：
(1)构建质粒
以pRV-core质粒(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)为模板，利用PCR技术引入如表1所示的突变位点。将pRV-core质粒分别与载有各突变位点的引物进行PCR；然后将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；再利用凝胶回收试剂盒进行割胶回收，从而获得具有M蛋白不同突变位点的质粒，获得构建好的质粒pRV-core Mut。
表1制备例1-29中溶瘤病毒M蛋白的突变情况表
Figure PCTCN2023071375-appb-000001
Figure PCTCN2023071375-appb-000002
(2)病毒拯救
利用磷酸钙转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，通过细胞转染技术，将构建好的质粒pRV-core Mut转染至BSR-T7细胞(购自ATCC，美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)。
按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；
利用200μl opti-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX 10μl(Thermo Fisher Scientific)，获得LTX混合液；
按照Lipofectamine LTX使用说明书所述的方法进行质粒转染，6h后利用PBS清洗BSR-T7细胞两次，进一步接种于10％胎牛血清的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养3天；
将培养BSR-T7细胞获得的的细胞上清转移到Vero细胞(Thermo Fisher Scientific)中，并将Vero细胞置于37℃的环境条件下培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况；进一步将拯救的突变棒状病毒库，通过Vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒株。
(3)M蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对M蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
引物序列为：
PF:ATGAGTTCCTTAAAGAA；
PR:TCATTTGAAGTGG。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表1所示。
制备例30-52
制备例30-52分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于：野生型溶瘤病毒M蛋白和G蛋白上氨基酸定点突变的位点。其中，M蛋白的突变位点与制备例24中相应的突变位点相同，G蛋白的突变位点如表2所示。
上述制备例提供的溶瘤病毒的构建方法同制备例11的构建方法，不同之处在于：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表2所示的突变位点；
步骤(3)为G蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对G蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
引物序列为：
PF:ATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG；
PR:TTACTTTCCAAGTCGGTTCATCT。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表2所示。
表2制备例30-52中溶瘤病毒G蛋白的突变情况表
Figure PCTCN2023071375-appb-000003
Figure PCTCN2023071375-appb-000004
制备例53-57
制备例53-57分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于：野生型溶瘤病毒M蛋白、G蛋白、N蛋白上氨基酸定点突变的位点。其中，M蛋白、G蛋白的突变位点与制备例41中相应的突变位点相同，N蛋白的突变位点如表3所示。
上述制备例提供的溶瘤病毒的构建方法同制备例41的构建方法，不同之处在于：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表3所示的突变位点；
步骤(3)为N蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对N蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
引物序列为：
PF:ATGTCTGTTACAGTCAAGAG；
PR:TCATTTGTCAAATTCTGACTT。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表3所示。
表3制备例53-57中溶瘤病毒N蛋白的突变情况表
制备例 突变位点及突变后的氨基酸 突变位点数 氨基酸序列
53 I14V 1 SEQ ID NO 56
54 I14V、R155K 2 SEQ ID NO 57
55 I14V、R155K、S353N 3 SEQ ID NO 58
56 R155K、S353N 2 SEQ ID NO 59
57 S353N 1 SEQ ID NO 60
制备例58-76
制备例58-76分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于：野生型溶瘤病毒M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白上氨基酸定点突变的位点。其中，M蛋白、G蛋白、N蛋白的突变位点与制备例55中相应的突变位点相同，P蛋白的突变位点如表4所示。
上述制备例提供的溶瘤病毒的构建方法同制备例55的构建方法，不同之处在于：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表4所示的突变位点；
步骤(3)为P蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对P蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
引物序列为：
PF:ATGGATAATCTCACAAAAGTTCG；
PR:CTACAGAGAATATTTGACTCTCG。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表4所示。
表4制备例58-76中溶瘤病毒P蛋白的突变情况表
Figure PCTCN2023071375-appb-000005
制备例77-79
制备例77-79分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于：野生型溶瘤病毒M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白上氨基酸定点突变的位点。其中，M蛋白、G蛋白、N蛋白、P蛋白的突变位点与制备例67中相应的突变位点相同，L蛋白的突变位点如表5所示。
上述制备例提供的溶瘤病毒的构建方法同制备例67的构建方法，不同之处在于：
步骤(1)的构建质粒中利用PCR技术引入如表5所示的突变位点；
步骤(3)为L蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对L蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR；
引物序列为：
PF:ATGGAAGTCCACGATTTTGAGA；
PR:TTAATCTCTCCAAGAGTTTTCCT。
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表5所示。
表5制备例77-79中溶瘤病毒L蛋白的突变情况表
制备例 突变位点及突变后的氨基酸 突变位点数 氨基酸序列
77 S87P 1 SEQ ID NO 82
78 S87P、I487T 2 SEQ ID NO 83
79 I487T 1 SEQ ID NO 84
制备例80
本制备例提供了利用上述制备例1-79中任一制备例制备的溶瘤病毒的包装过程，具体包括以下步骤：
1)利用表达T7RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3(BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)感染接种BSR-T7细胞(购自ATCC)
具体步骤如下：将BSR-T7细胞铺在6孔板上，控制每孔细胞量达到3×10 5个；铺板14-16h后加入表达T7RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3，进行痘病毒vTF7-3对BSR-T7细胞的感染；感染6h后，使用DPBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific)漂洗一次BSR-T7细胞，进行转染。
2)转染过程
具体包括以下步骤：按照pRV-core Mut、pP、pN、pL的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂Plus Reagent(Life Technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pP(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pN(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pL(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pN、pP、pL三种质粒对应的母体载体均为pCAGGS(购自ATCC)；
利用200μl opti-MEM培养基稀释Lipofectamine LTX 10μl(Thermo Fisher Scientific)，获得LTX混合液；
将LTX混合液200μl与转染质粒预混液200μl混合，室温孵育15min，获得LTX-DNA混合液；
将步骤1)的6孔板中的DPBS缓冲液换成Opti-MEM培养基，将LTX-DNA混合液逐滴加入培养BSR-T7细胞的6孔板中，轻轻摇动6孔板，使LTX-DNA混合液均匀分布在6孔板内；转染6-8h后，吸去转染试剂，加入3ml新鲜的完全培养基(Thermo Fisher Scientific)；72h后收获BSR-T7细胞的细胞上清，使用0.22μm滤器进行过滤，获得制备例1-79各自对应的溶瘤病毒。
实施例
实施例1
本实施例分别利用制备例1-79制得的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对不同细胞的侵染能力进行试验检测。
检测方法为TCID50检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例1-79以及野生型溶瘤病毒各200pfu，检测各溶瘤病毒产生的半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose，TCID50)。
所检测的细胞包括：LLC细胞(鼠源肺癌细胞系)、4T1细胞(鼠源乳腺癌细胞系)、MC38 细胞(鼠源结肠癌细胞系)、Hela细胞(人源宫颈癌细胞系)、MEF细胞(人源成纤维细胞系)。
具体检测方法为：
(1)分别在6孔培养板中加入Vero(LLC/4T1/MC38/Hela/MEF)细胞悬液3mL，使细胞量达到4×10 5个/孔，共6个孔，其中MEF细胞2个孔；将6孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养16h；
(2)分别向6孔培养板的每个孔中加入制备例制得的溶瘤病毒200pfu；在24h收获MEF细胞以及每种Vero细胞的上清100μl；将收获的上清分别加入96孔培养板的孔中，使各种细胞的细胞量达到1×10 4个/ml，将96孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养16h；
(3)在1.5ml EP管中将步骤(2)收获的上清作连续10倍的稀释，从10 -1～10 -11，共11个滴度；将稀释好的上清接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一列共8孔，每孔接种100μl；
(4)48h后观察每孔细胞的荧光情况，有荧光则记为此孔被感染；按Karber法计算TCID50。
检测结果如图1-图5所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-79分别表示制备例1-79制备的溶瘤病毒；纵坐标Log 10TCID50表示利用Karber法计算得出的TCID50值，Log 10TCID50的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越好；Log 10TCID50的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越差。
图1为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的侵染能力的检测结果。
图2为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的侵染能力的检测结果。
图3为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的侵染能力的检测结果。
图4为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的侵染能力的检测结果。
图5为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的侵染能力的检测结果。
通过上述附图可知，本申请制备例1-79制备的溶瘤病毒均对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞具有较好的侵染能力，尤其是制备例77-79提供的溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的侵染能力达到了野生型溶瘤病毒的侵染能力。同时，上述制备的溶瘤病毒均对MEF细胞的侵染能力较差，尤其是制备例77-79提供的溶瘤病毒，说明本申请制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。
实施例2
本实施例分别利用制备例1-79制得的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对不同细胞进行体外杀伤试验检测。
检测方法为MTT检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例1-79以及野生型溶瘤病毒各200pfu，24h后利用MTT检测法检测细胞活性。
所检测的细胞包括：LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞、Hela细胞、MEF细胞。
具体检测方法为：
(1)分别在96孔培养板中加入Vero(LLC/4T1/MC38/Hela/MEF)细胞悬液100μl，使细胞量达到1×10 4个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养16h；
(2)将制备例制得的溶瘤病毒稀释到MOI(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，将每一稀释梯度的溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养40h；
(3)将步骤(2)的96孔培养板中的细胞上清取出，并向96孔培养板中加入新鲜培养基和MTT溶液，加入量为20μL/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养4h；
(4)将96孔培养板于室温下离心5min，设置转速为2500rpm/min，用1mL一次性无菌注射器轻轻吸掉上清；然后向96孔培养板的每个孔中加入DMSO，加入量为100ul/孔，37℃的环境条件下放置10min。使用多功能酶标仪，震荡2min，在570nm或490nm波长下测定96孔培养板上各孔的OD值。
检测结果如图6-图10所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-79分别表示制备 例1-79制备的溶瘤病毒；纵坐标OD 570表示细胞的OD值，OD 570的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；OD 570的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。
图6为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对LLC细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图7为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4T1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图8为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MC38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图9为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对Hela细胞的体外杀伤能力的检测结果。
图10为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对MEF细胞的体外杀伤能力的检测结果。
通过上述附图可知，本申请制备例1-79制备的溶瘤病毒均对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞均具有较好的体外杀伤能力，尤其是制备例77-79提供的溶瘤病毒对LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞的体外杀伤能力超过了野生型溶瘤病毒的体外杀伤能力。同时，上述制备的溶瘤病毒对MEF细胞几乎无杀伤作用，说明本申请制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。
虽然野生型溶瘤病毒对LLC细胞、MC38细胞以及4T1细胞已具有较好的体外杀伤能力，但其在损伤和杀死上述细胞的同时，还会很大程度地损伤和杀死MEF细胞，限制了野生型溶瘤病毒的临床应用。因此，本申请对野生型溶瘤病毒的改造，在保证溶瘤病毒对正常细胞的安全性的同时，还保证了溶瘤病毒对肿瘤、癌症细胞的杀伤能力，具有广泛的临床应用前景。
实施例3
本实施例对制备例1-79制得的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在不同细胞内诱导IFN-β的表达情况进行试验检测。
检测指标为基因IFN-β在不同细胞内的表达情况。基因IFN-β是细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白的基因，通过基因IFN-β的表达情况可判断细胞对溶瘤病毒的清除能力：当基因IFN-β的表达较高时，表明溶瘤病毒在细胞内容易清除；当基因IFN-β的表达较低时，表示溶瘤病毒在细胞内不容易清除。
所检测的细胞包括：LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞、Hela细胞、MEF细胞。
具体检测方法为：
(1)分别在96孔培养板中加入Vero(LLC/4T1/MC38/Hela/MEF)细胞悬液100μl，使细胞量达到1×10 4个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养16h；
(2)将制备例制得的溶瘤病毒稀释到MOI(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，将每一稀释梯度的溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、5％CO 2的环境条件下培养40h；
(3)将步骤(2)培养获得的各组细胞破碎，并利用TRIzol(Invitrogen)从各细胞中提取总RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser(Takara)反转录试剂盒逆转录成cDNA，并用LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche)染料进行染色，在LightCycler 480定量PCR仪上检测各个基因的Ct值。用ΔΔCt法计算目的基因IFN-β的相对表达量。
检测结果如图11-图15所示。其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-79分别表示制备例1-79制备的溶瘤病毒；纵坐标IFN-β水平表示IFN-β基因的表达情况，IFN-β水平的值越大，表示溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越弱，越容易清除；IFN-β水平的值越小，表示溶瘤病毒在该细胞内繁殖能力越强，越不容易清除。
图11为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图12为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在4T1细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图13为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MC38细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图14为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在Hela细胞内诱导IFN-β的表达情况。
图15为本申请制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在MEF细胞内诱导IFN-β的表达情况。
通过上述附图可知，本申请制备例1和制备例21提供的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在LLC 细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内繁殖能力较弱，均容易被清除。相对而言，制备例2-20、22-79提供的溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更不容易清除。尤其是制备例77-79提供的溶瘤病毒在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更加不容易清除，进一步保证溶瘤病毒能够在LLC细胞、4T1细胞、MC38细胞以及Hela细胞内更好的发挥侵染和杀伤的能力。同时，本申请提供的溶瘤病毒在MEF细胞内更加容易清除，进一步保证了MEF细胞的安全性，从而提高了溶瘤病毒的安全性。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (43)

  1. 溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒包括M蛋白，所述M蛋白与SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第32位、第33位、第49位、第54位、第133位、第225位。
  2. 根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和/或，在第33位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M33A)；和/或，在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和/或，在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；和/或，在第133位的丙氨酸突变为苏氨酸(A133T)；和/或，在第225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)。
  3. 根据权利要求2所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述M蛋白还包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第21位、第51位、第111位、第221位和第226位。
  4. 根据权利要求3所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述M蛋白的氨基酸取代还包含在第21位的甘氨酸突变为谷氨酸(G21E)；和/或，所述M蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；和/或，在第51位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M51A)；和/或，包含在第111位的亮氨酸突变为丙氨酸(L111A)；和/或，在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；和/或，在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述M蛋白的氨基酸取代选自以下组中的任一项：
    1)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S；
    2)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A；
    3)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D；
    4)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y；
    5)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y、L111A；
    6)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y、L111A、A133T；
    7)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、H54Y、L111A、A133T、V225I；
    8)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V225I；
    9)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I；
    10)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、 A133T、V221F、V225I、S226R；
    11)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R；
    12)所述M蛋白的氨基酸取代包含M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R；
    13)所述M蛋白的氨基酸取代包含N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R；
    14)所述M蛋白的氨基酸取代包含M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R；
    15)所述M蛋白的氨基酸取代包含H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R；
    16)所述M蛋白的氨基酸取代包含L111A、A133T、V221F、V225I、S226R；
    17)所述M蛋白的氨基酸取代包含A133T、V221F、V225I、S226R；
    18)所述M蛋白的氨基酸取代包含V221F、V225I、S226R；
    19)所述M蛋白的氨基酸取代包含V225I、S226R；
    20)所述M蛋白的氨基酸取代包含S226R；
    21)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、H54Y、V225I；
    22)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、H54Y、V225I、S226G；
    23)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；
    24)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R；
    25)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；
    26)所述M蛋白的氨基酸取代包含N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、A133T、V221F、V225I、S226R；
    27)所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、N49D、M51A、H54Y、L111A、V225I、S226R。
  6. 根据权利要求5所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述M蛋白的氨基酸取代包含G21E、N32S、M33A、N49D、M51R、H54Y、L111A、A133T、V221F、V225I、S226R。
  7. 根据权利要求5所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述M蛋白包含如SEQ ID NO 12所示 的氨基酸序列。
  8. 溶瘤病毒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的M蛋白；所述溶瘤病毒还包括G蛋白；所述G蛋白与SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第438位、第453位、第471位和第487位。
  9. 根据权利要求8所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述G蛋白还包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位。
  10. 根据权利要求8或9所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述G蛋白的氨基酸取代包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V53I)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(A141V)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(D172Y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(K217E)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(D232G)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(V331A)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(V371E)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G436D)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(T438S)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F453L)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(T471I)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(Y487H)。
  11. 根据权利要求10所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述G蛋白的氨基酸取代选自下组中的任一项：
    1)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I；
    2)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V；
    3)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y；
    4)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E；
    5)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G；
    6)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A；
    7)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E；
    8)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D；
    9)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S；
    10)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L；
    11)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I；
    12)所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    13)所述G蛋白的氨基酸取代包含A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    14)所述G蛋白的氨基酸取代包含D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    15)所述G蛋白的氨基酸取代包含K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    16)所述G蛋白的氨基酸取代包含D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    17)所述G蛋白的氨基酸取代包含V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    18)所述G蛋白的氨基酸取代包含V371E、G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    19)所述G蛋白的氨基酸取代包含G436D、T438S、F453L、T471I、Y487H；
    20)所述G蛋白的氨基酸取代包含T438S、F453L、T471I、Y487H；
    21)所述G蛋白的氨基酸取代包含F453L、T471I、Y487H；
    22)所述G蛋白的氨基酸取代包含T471I、Y487H；
    23)所述G蛋白的氨基酸取代包含Y487H。
  12. 根据权利要求11所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述G蛋白的氨基酸取代包含V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I和Y487H。
  13. 根据权利要求11所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述G蛋白如SEQ ID NO 43所示的氨基酸序列。
  14. 溶瘤病毒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的M蛋白或权利要求8-13中任一项所述的M蛋白和G蛋白；所述溶瘤病毒还包括N蛋白；所述N蛋白与SEQ ID NO 55所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第14位、第155位、 第353位。
  15. 根据权利要求14所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述N蛋白的氨基酸取代包含在第14位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I14V)；和/或，在第155位的精氨酸突变为赖氨酸(R155K)；和/或，在第353位的丝氨酸突变为天冬酰胺(S353N)。
  16. 根据权利要求14或15所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述N蛋白的氨基酸取代选自以下组中的任一项：
    1)所述N蛋白的氨基酸取代包含I14V；
    2)所述N蛋白的氨基酸取代包含I14V、R155K；
    3)所述N蛋白的氨基酸取代包含I14V、R155K、S353N；
    4)所述N蛋白的氨基酸取代包含R155K、S353N；
    5)所述N蛋白的氨基酸取代包含S353N。
  17. 根据权利要求16所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述N蛋白的氨基酸取代包含I14V、R155K、S353N。
  18. 根据权利要求16所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述N蛋白包含如SEQ ID NO 58所示的氨基酸序列。
  19. 溶瘤病毒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的M蛋白、或权利要求8-13中任一项所述的M蛋白和G蛋白、或权利要求14-18中任一项所述的M蛋白、G蛋白和N蛋白；所述溶瘤病毒还包括P蛋白；所述P蛋白与SEQ ID NO 61所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点的氨基酸取代：第50位、第76位、第99位、第126位、第140位、第151位、第168位、第170位、第189位、第237位。
  20. 根据权利要求19所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述P蛋白的氨基酸取代包含在第50位的精氨酸突变为赖氨酸(R50K)；和/或，在第76位的缬氨酸突变为丙氨酸(V76A)；和/或，在第99位的天冬酰胺突变为谷氨酸(D99E)；和/或，在第126位的亮氨酸突变为丝氨酸(L126S)；和/或，在第140位的亮氨酸突变为丝氨酸(L140S)；和/或，在第151位的组氨酸突变为酪氨酸(H151Y)；和/或，在第168位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I168M)；和/或，在第170位的赖氨酸突变为谷氨酸(K170E)；和/或，在第189位的酪氨酸突变为丝氨酸(Y189S)；和/或，在第237位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N237D)。
  21. 根据权利要求19或20所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述P蛋白的氨基酸取代选自以下组中的任一项：
    1)所述P蛋白的氨基酸取代包含；R50K；
    2)所述P蛋白的氨基酸取代包含；R50K、V76A；
    3)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E；
    4)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S；
    5)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S、L140S；
    6)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y；
    7)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M；
    8)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E；
    9)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S；
    10)所述P蛋白的氨基酸取代包含：R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；
    11)所述P蛋白的氨基酸取代包含：V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；
    12)所述P蛋白的氨基酸取代包含：D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；
    13)所述P蛋白的氨基酸取代包含：L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；
    14)所述P蛋白的氨基酸取代包含：L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；
    15)所述P蛋白的氨基酸取代包含：H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D；
    16)所述P蛋白的氨基酸取代包含：I168M、K170E、Y189S、N237D；
    17)所述P蛋白的氨基酸取代包含：K170E、Y189S、N237D；
    18)所述P蛋白的氨基酸取代包含：Y189S、N237D；
    19)所述P蛋白的氨基酸取代包含：N237D。
  22. 根据权利要求21所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述P蛋白的氨基酸取代包含R50K、V76A、D99E、L126S、L140S、H151Y、I168M、K170E、Y189S、N237D。
  23. 根据权利要求21所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述P蛋白包含如SEQ ID NO 71所示的氨基酸序列。
  24. 溶瘤病毒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的M蛋白、或权利要求8-13 中任一项所述的M蛋白和G蛋白、或权利要求14-18中任一项所述的M蛋白、G蛋白和N蛋白、或权利要求19-23中任一项所述的M蛋白、G蛋白、N蛋白和P蛋白；所述溶瘤病毒还包括L蛋白；所述L蛋白与SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列相比，包括以下一个或多个位点的氨基酸取代：第87位、第487位。
  25. 根据权利要求24所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述L蛋白的氨基酸取代包含在第87位的丝氨酸突变为脯氨酸(S87P)；和/或，在第487位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I487T)。
  26. 根据权利要求24或25所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述L蛋白的氨基酸取代选自以下组中的任一项：
    1)所述L蛋白的氨基酸取代包含S87P；
    2)所述L蛋白的氨基酸取代包含S87P、I487T；
    3)所述L蛋白的氨基酸取代包含I487T。
  27. 根据权利要求26所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述L蛋白的氨基酸取代包含S87P、I487T。
  28. 根据权利要求26所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述L蛋白包含如SEQ ID NO 83所示的氨基酸序列。
  29. 根据权利要求1-28中任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒包含棒状病毒。
  30. 根据权利要求1-29中任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于：所述溶瘤病毒包含水疱性口炎病毒。
  31. 根据权利要求1-30中任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于：所述溶瘤病毒包含VSV病毒Indiana MuddSummer亚型。
  32. 根据权利要求1-31中任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于：所述溶瘤病毒包含或表达外源目的蛋白。
  33. 根据权利要求1-32中任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于：所述溶瘤病毒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码所述具有氨基酸取代的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的L蛋白的核酸序列。
  34. 根据权利要求33所述的溶瘤病毒，其特征在于：所述核酸分子包含编码所述外源目的 蛋白的核酸序列。
  35. 根据权利要求34所述的溶瘤病毒，其特征在于：所述核酸分子中所述编码外源目的蛋白的核酸序列位于编码所述具有氨基酸取代的M蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的G蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的N蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的P蛋白的核酸序列、和/或编码所述具有氨基酸取代的L蛋白的核酸序列之间。
  36. 溶瘤病毒表达载体，其特征在于，所述溶瘤病毒表达载体能够表达权利要求1-35中任一项所述的溶瘤病毒。
  37. 病毒生产细胞，其特征在于：所述病毒生产细胞能够产生权利要求1-35中任一项所述的溶瘤病毒。
  38. 药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括权利要求1-35中任一项所述的溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
  39. 权利要求1-35中任一项所述的溶瘤病毒、权利要求36所述的溶瘤病毒表达载体、权利要求37所述的病毒生产细胞和/或权利要求38所述的药物组合物的制备方法。
  40. 权利要求1-35中任一项所述的溶瘤病毒、权利要求36所述的溶瘤病毒表达载体、权利要求37所述的病毒生产细胞和/或权利要求38所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
  41. 根据权利要求40所述的用途，其特征在于：所述溶瘤病毒、所述溶瘤病毒表达载体、所述病毒生产细胞和/或所述药物组合物用于持续杀伤异常增生性细胞的方法中。
  42. 根据权利要求41所述的用途，其特征在于：所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞。
  43. 根据权利要求42所述的用途，其特征在于：所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
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