JP2024525781A - 腫瘍溶解性ウイルス及びその使用 - Google Patents

腫瘍溶解性ウイルス及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024525781A
JP2024525781A JP2024501981A JP2024501981A JP2024525781A JP 2024525781 A JP2024525781 A JP 2024525781A JP 2024501981 A JP2024501981 A JP 2024501981A JP 2024501981 A JP2024501981 A JP 2024501981A JP 2024525781 A JP2024525781 A JP 2024525781A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
protein
oncolytic virus
cells
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2024501981A
Other languages
English (en)
Inventor
周国慶
張凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Joint Biosciences Sh Ltd
Original Assignee
Joint Biosciences Sh Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Joint Biosciences Sh Ltd filed Critical Joint Biosciences Sh Ltd
Publication of JP2024525781A publication Critical patent/JP2024525781A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

腫瘍溶解性ウイルスを提供し、当該腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍタンパク質と、Ｇタンパク質と、を含み、当該Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるアミノ酸配列と比較して、５１位、２２１位及び２２６位のアミノ酸置換を含み、当該Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。当該腫瘍溶解性ウイルスの発現ベクター、当該腫瘍溶解性ウイルスを生産するウイルス生産細胞、当該腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物、及び上記腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び／又は医薬組成物の製造方法及び使用をさらに提供する。
【選択図】なし

Description

本願は、生物医薬の技術分野に関し、より具体的には、腫瘍溶解性ウイルス及びその使用に関する。
腫瘍溶解性ウイルスは、複製能力を持つ腫瘍殺傷性ウイルスの１種であり、現在、腫瘍免疫治療の重要な分枝として広く受け入れられている。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に特異的に標的化して感染することができ、例えば腫瘍細胞内の癌抑制遺伝子の不活性化又は欠損を利用し、それによって腫瘍細胞に選択的に感染し、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞に感染すると、腫瘍細胞内で大量に複製し、最終的には腫瘍細胞を破壊し、それによって腫瘍細胞を死滅させる。同時に、腫瘍溶解性ウイルスは、宿主自身の抗癌反応を増進させるのに必要な免疫刺激シグナルをさらに提供し、それによって、より多くの免疫細胞を誘引して、残存する腫瘍細胞を死滅し続けることもできる。
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍免疫治療において比較的良い応用の将来性があるが、野生型腫瘍溶解性ウイルスは、よく生体神経系炎症などの問題を引き起こし、野生型ウイルスを利用して腫瘍細胞に感染する過程において、大きな病原性リスクがある。したがって、腫瘍溶解性ウイルスの臨床応用をさらに進めるために、野生型腫瘍溶解性ウイルスを改変し、弱毒化した腫瘍溶解性ウイルスを得る必要がある。弱毒化した腫瘍溶解性ウイルスを臨床応用に用いることにより、腫瘍溶解性ウイルスの病原性リスクを低下させ、腫瘍溶解性ウイルスの安全性を向上させる。
しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスの改変過程において、野生型腫瘍溶解性ウイルスに対してランダムに遺伝子修飾を行うだけでは、その毒性を低減することができるが、改変後の腫瘍溶解性ウイルスは治癒率効果が良くない可能性があり、ひいては改変後の腫瘍溶解性ウイルスをパッケージングすることができず、腫瘍溶解性ウイルスの臨床応用を推進するのに不利である。したがって、安全性能が良好で、同時に治癒率が高い改変後の腫瘍溶解性ウイルスを提供することは、腫瘍免疫治療の分野における重要な科学的価値と応用意義を有する。
本願は、腫瘍溶解性ウイルス及びその使用を提供し、本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、良好な安全性及び治癒率を有する。
第１態様において、本願は、腫瘍溶解性ウイルスを提供し、以下の技術案を採用し、
本願において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍタンパク質と、Ｇタンパク質と、を含み、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるアミノ酸配列と比較して、５１位、２２１位及び２２６位のアミノ酸置換を含み、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質のアミノ酸置換は、５１位のメチオニンからアルギニンへの変異（Ｍ５１Ｒ）、及び／又は、２２１位のバリンからフェニルアラニンへの変異（Ｖ２２１Ｆ）、及び／又は、２２６位のセリンからアルギニンへの変異（Ｓ２２６Ｒ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質のアミノ酸置換は、５１位のメチオニンからアルギニンへの変異（Ｍ５１Ｒ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質のアミノ酸置換は、２２１位のバリンからフェニルアラニンへの変異（Ｖ２２１Ｆ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質のアミノ酸置換は、２２６位のセリンからアルギニンへの変異（Ｓ２２６Ｒ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、Ｍ５１Ｒ及びＶ２２１Ｆのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、Ｍ５１Ｒ及びＳ２２６Ｒのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、Ｍ５１Ｒ、Ｖ２２１Ｆ及びＳ２２６Ｒのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、Ｖ２２１Ｆ及びＳ２２６Ｒのアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位の１つ以上の部位のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位の１つ以上の部位のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、５３位のバリンからイソロイシンへの変異（Ｖ５３Ｉ）、及び／又は、１４１位のアラニンからバリンへの変異（Ａ１４１Ｖ）、及び／又は、１７２位のアスパラギン酸からチロシンへの変異（Ｄ１７２Ｙ）、及び／又は、２１７位のリジンからグルタミン酸への変異（Ｋ２１７Ｅ）、及び／又は、２３２位のアスパラギン酸からグリシンへの変異（Ｄ２３２Ｇ）、及び／又は、３３１位のバリンからアラニンへの変異（Ｖ３３１Ａ）、及び／又は、３７１位のバリンからグルタミン酸への変異（Ｖ３７１Ｅ）、及び／又は、４３６位のグリシンからアスパラギン酸への変異（Ｇ４３６Ｄ）、及び／又は、４３８位のトレオニンからセリンへの変異（Ｔ４３８Ｓ）、及び／又は、４５３位のフェニルアラニンからロイシンへの変異（Ｆ４５３Ｌ）、及び／又は、４７１位のトレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ４７１Ｉ）、及び／又は、４８７位のチロシンからヒスチジンへの変異（Ｙ４８７Ｈ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、５３位のバリンからイソロイシンへの変異（Ｖ５３Ｉ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、１４１位のアラニンからバリンへの変異（Ａ１４１Ｖ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、１７２位のアスパラギン酸からチロシンへの変異（Ｄ１７２Ｙ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、２１７位のリジンからグルタミン酸への変異（Ｋ２１７Ｅ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、２３２位のアスパラギン酸からグリシンへの変異（Ｄ２３２Ｇ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、３３１位のバリンからアラニンへの変異（Ｖ３３１Ａ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、３７１位のバリンからグルタミン酸への変異（Ｖ３７１Ｅ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、４３６位のグリシンからアスパラギン酸への変異（Ｇ４３６Ｄ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、４３８位のトレオニンからセリンへの変異（Ｔ４３８Ｓ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、４５３位のフェニルアラニンからロイシンへの変異（Ｆ４５３Ｌ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、４７１位のトレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ４７１Ｉ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、４８７位のチロシンからヒスチジンへの変異（Ｙ４８７Ｈ）を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ及びＡ１４１Ｖを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ及びＤ１７２Ｙを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ及びＫ２１７Ｅを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ及びＤ２３２Ｇを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ及びＶ３３１Ａを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ及びＶ３７１Ｅを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ及びＧ４３６Ｄを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ及びＴ４３８Ｓを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ及びＦ４５３Ｌを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ及びＴ４７１Ｉを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈである。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １１に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １９に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２０に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２１に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２２に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２３に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２４に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２５に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２６に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２７に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、コリネ型ウイルスに基づいて、部位特異的変異を行った後に得られる。
一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ（略称「ＶＳＶ」）ウイルスに基づいて、部位特異的変異を行った後に得られる。
一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＳＶウイルスＩｎｄｉａｎａ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプに基づいて、部位特異的変異を行った後に得られる。
一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、外来目的タンパク質を含むか又は発現する。
一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、アミノ酸置換を有する前記Ｍタンパク質をコードする核酸配列と、アミノ酸置換を有する前記Ｇタンパク質をコードする核酸配列と、を含む核酸分子を含む。
一部の実施形態において、前記核酸分子は、前記外来目的タンパク質をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態において、前記核酸分子中の前記外来目的タンパク質をコードする核酸配列は、アミノ酸置換を有する前記Ｍタンパク質をコードする前記核酸配列と、アミノ酸置換を有する前記Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列との間に位置する。
一部の実施形態において、前記核酸分子は、前記腫瘍溶解性ウイルスのＮタンパク質（核タンパク質Ｎ）、Ｌタンパク質（マクロポリメラーゼタンパク質Ｌ）及びＰタンパク質（リン酸タンパク質Ｐ）をコードする。
第２態様において、本願は、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクターを提供し、以下の技術案を採用し、
腫瘍溶解性ウイルス発現ベクターであって、前記腫瘍溶解性ウイルス発現ベクターは、本願に記載のいずれかの腫瘍溶解性ウイルスを産生することができる。
第３態様において、本願は、ウイルス生産細胞を提供し、以下の技術案を採用し、
ウイルス生産細胞であって、前記ウイルス生産細胞は、本願に記載のいずれかの腫瘍溶解性ウイルスを産生することができる。
第４態様において、本願は、医薬組成物を提供し、以下の技術案を採用し、
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、本願に記載のいずれかの腫瘍溶解性ウイルス、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。
第５態様において、本願は、上記腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び／又は医薬組成物の製造方法を提供する。
第６態様において、本願は、上記腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び／又は医薬組成物の、疾患及び／又は病状の予防及び／又は治療のための医薬の製造における使用を提供する。
一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び／又は医薬組成物は、異常増殖性細胞をゆっくりと持続的に殺傷する方法で用いられる。
一部の実施形態において、前記疾患及び／又は病状は、腫瘍細胞又は腫瘍組織に関連する細胞から選択される異常増殖性細胞を含み、好ましくは、前記腫瘍細胞は、癌細胞であり、より好ましくは、前記癌細胞は、転移性癌細胞である。
一部の実施形態において、前記腫瘍は、固形腫瘍及び／又は血液腫瘍を含む。
以上をまとめると、本願は、以下の有益な効果を有する。
本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、いずれもＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞に対して良好な侵入感染能力を有し、ＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及び４Ｔ１細胞に対していずれも良好なインビトロ殺傷能力を有し、ＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内でいずれも容易に除去することができない。また、本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、いずれもＭＥＦ細胞に対して低い侵入感染能力、インビトロ殺傷能力及び除去容易度を有する。したがって、本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍、癌などの細胞の侵入感染及び殺傷に好適に用いることができ、且つ腫瘍、癌などの細胞内で除去されにくく、腫瘍、癌などの細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの治癒率をさらに向上させ、同時に、上記で提供された腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を損傷させることがなく、しかも正常細胞内にいる場合にはより容易に除去され、正常細胞の安全性がさらに確保される。
本願に係る発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に示されている。本願に係る発明の特徴及び利点は、以下に詳細に説明される例示的な実施形態及び図面を参照することにより、よりよく理解することができる。添付図面の簡単な説明は、次のとおりである。
本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＣ３８細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＨｅｌａ細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＣ３８細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスの４Ｔ１細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞内での除去難易度の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＣ３８細胞での除去難易度の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＨｅｌａ細胞での除去難易度の検出結果である。 本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞での除去難易度の検出結果である。
上記の図面において、横軸０は野生型腫瘍溶解性ウイルスを表し、横軸１～２６はそれぞれ製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルスを表し、
縦軸Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０はＫａｒｂｅｒ法により算出されたＴＣＩＤ５０値を表し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０の値が大きいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する侵入感染能力が高いことを示し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０の値が小さいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する侵入感染能力が低いことを示し、
縦軸ＯＤ５７０は細胞のＯＤ値を表し、ＯＤ５７０の値が大きいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する殺傷能力が低いことを示し、ＯＤ５７０の値が小さいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する殺傷能力が高いことを示す。
縦軸ＩＦＮ－βレベルはＩＦＮ－β遺伝子の発現状況を表し、ＩＦＮ－βレベルの値が大きいほど、腫瘍溶解性ウイルスが当該細胞内で容易に除去されることを示し、ＩＦＮ－βレベルの値が小さいほど、腫瘍溶解性ウイルスが当該細胞内で容易に除去できないことを示す。
当業者は、以下の詳細な説明から本願の他の態様及び利点を容易に見抜くことができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者が認識するように、本願の内容は、当業者が、本願に係る発明の精神及び範囲を逸脱することなく、開示された具体的な実施形態を変更することを可能にする。相応して、本願の図面及び明細書の記載は、単なる例示であって限定的ではない。
以下では、特定の具体的な実施例によって本願発明の実施形態を説明するが、当業者は、本願発明の他の利点及び効果を、本明細書に開示された内容から容易に理解することができる。
用語定義
本願において、用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、通常、腫瘍細胞内で腫瘍細胞を複製し、死滅させることが可能なウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＳＶウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコー型腸管ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス及びマラバウイルスを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に対する選択性を向上させるように改変される。一部の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、その免疫原性を低下させるように改変される。いくつかの実施形態において、本願に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＳＶウイルスである。いくつかの実施形態において、ＶＳＶウイルスは、ＶＳＶウイルスＩｎｄｉａｎａ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株の変異体である。いくつかの実施形態において、ＶＳＶウイルスのＭタンパク質及びＧタンパク質に部位特異的遺伝子変異を行うことができる。
一部の実施形態において、本願に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子レベルで改変された腫瘍溶解性ウイルスであってもよく、例えば１つ以上の遺伝子の修飾によって改変され、それによってその腫瘍選択性を向上させるか及び／又は分裂細胞内で優先的に複製される。前記遺伝子レベルの改変は、ＤＮＡ複製、核酸代謝、宿主指向性、表面付着、毒性、開裂及び拡散過程に関与する遺伝子の修飾であってもよいし、外来遺伝子の組み込みの改変であってもよい。前記外来遺伝子は、外来免疫調節遺伝子、外来スクリーニング遺伝子、外来レポーター遺伝子などを含んでもよい。前記改変された腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換などのアミノ酸レベルで改変された腫瘍溶解性ウイルスであってもよい。
本願において、用語「Ｍタンパク質」は、通常、ＶＳＶウイルスマトリックスタンパク質を指す。Ｍタンパク質は、ＶＳＶウイルスの重要な毒性因子であり、ＶＳＶウイルスの中でマウスの自然免疫応答を妨害することが知られているタンパク質でもある。用語「Ｍタンパク質」は、そのホモログ、オーソログ、変異体、機能的に活性な断片なども含む。本願において、野生型ＶＳＶウイルスＩｎｄｉａｎａ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプＭタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。本願において、前記腫瘍溶解性ウイルスのＭタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３－５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、用語「Ｇタンパク質」は、通常、水ＶＳＶウイルスの糖タンパク質を指し、エンベロープタンパク質とも呼ばれる。用語「Ｇタンパク質」は、そのホモログ、オーソログ、変異体、機能的に活性な断片なども含む。本願において、野生型ＶＳＶウイルスＩｎｄｉａｎａ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプＧタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。本願において、前記腫瘍溶解性ウイルスの糖タンパク質Ｇは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６－２８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、用語「Ｌタンパク質」は、通常、ＶＳＶウイルスＲＮＡポリメラーゼタンパク質を指す。ＶＳＶウイルスのＬ遺伝子は、ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ｅタンパク質をコードする。用語「Ｌタンパク質」は、そのホモログ、オーソログ、変異体、機能的に活性な断片なども含む。
本願において、用語「Ｎタンパク質」は、通常、ＶＳＶウイルスのヌクレオカプシドタンパク質を指す。用語「Ｎタンパク質」は、そのホモログ、オーソログ、変異体、機能的に活性な断片なども含む。
本願において、タンパク質の変異部位の表記は、通常、「アミノ酸＋アミノ酸位数＋（変異後のアミノ酸）」で表記される。本願において、前記変異は、アミノ酸の増加、置換、欠失及び／又は削除を含んでもよいが、これらに限定されない。例えば、用語「Ｍ５１Ｒ」は、通常、５１位メチオニンＭからアルギニンＲへの変異を指す。
本願において、用語「アミノ酸置換」は、通常、親配列中に存在する１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することを指す。親配列中のアミノ酸は、例えば、ケミカルペプチドを介して合成されるか、又は当該技術分野で知られている組換え方法によって置換されてもよい。したがって、「ｘｘ位における置換」は、通常、位置ｘｘに存在するアミノ酸を置換アミノ酸残基で置換することを指す。本願において、前記アミノ酸置換は、アミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、用語「変異」は、通常、野生型分子のヌクレオチド又はアミノ酸配列を変化させることを指す。アミノ酸の変化は、アミノ酸の置換、削除、欠失、挿入、付加、切り縮め、又はタンパク質のプロセシング若しくは切断を含んでもよい。
本願において、用語「核酸分子」は、通常、任意の長さのヌクレオチドを指す。本願において、用語「核酸分子」は、前記腫瘍溶解性ウイルスに含まれるタンパク質をコードしてもよい。本願において、前記核酸分子は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含んでもよい。場合によっては、前記ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含んでもよいし、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含んでもよく、一本鎖ＲＮＡは、センスＲＮＡを含んでもよいし、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を含んでもよいし、アンビセンスＲＮＡを含んでもよい。
本願において、用語「発現ベクター」は、通常、核酸ベクターを指す。適切な条件下で、それは、通常、目的遺伝子及び／又は目的タンパク質を発現することができる。本願の一部の実施形態において、前記発現ベクターは、ウイルス（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）の１つ以上の成分を発現するための核酸分子を含む。例えば、前記発現ベクターは、少なくとも１つのウイルスゲノム要素を含むことができ、ウイルスにパッケージングされてもよく、又はウイルス粒子としてパッケージングされてもよい。
本願において、用語「ウイルス生産細胞」は、通常、本願に記載の核酸分子又は発現ベクターを含むことができるか、又はそれを含んでいるか、又は本願に記載の腫瘍溶解性ウイルスを発現することができる細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。前記細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含んでもよい。前記細胞は、本願に記載の発現ベクターを用いて、インビトロでトランスフェクトすることにより得ることができる。
本願において、用語「医薬組成物」は、通常、活性成分の生物学的活性を可能にする形態で存在する製剤を指し、前記製剤が投与される被験体に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含まない。一部の実施形態において、これらの製剤は、薬学的に許容される成分及び薬学的に許容される担体を含んでもよい。一部の実施形態において、前記医薬製品は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内及び／又は鼻腔内投与、又は組織への直接注射のための医薬製品を含む。前記医薬製品は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は真皮内投与などの異なる方式で投与することができる。
本願において、用語「予防」は、通常、何らかの処置を事前に講じることにより、疾患又はその１つ以上の症状の発生及び発作、再発、及び／又は拡散を防止することを指す。本願において、用語「治療」は、通常、疾患又は疾患に関連する１つ以上の症状を消滅するか又は改善することを指す。一部の実施形態において、治療は、通常、疾患が消滅又は寛解されるように、そのような疾患に罹患している患者に１つ以上の薬剤を投与することを指す。一部の実施形態において、「治療」は、特定の疾患の症状の発作後、他の薬剤の存在下又は非存在下で前記医薬組合せ及び／又は医薬製品を投与することであってもよい。例えば、本願に記載の医薬組合せ及び／又は医薬製品を用いて腫瘍の発生、進行、再発及び／又は転移を防止する。
本願において、用語「腫瘍」は、通常、任意の新規な病的組織増殖を指す。腫瘍は良性であっても悪性であってもよい。本願において、前記腫瘍は、固形腫瘍及び／又は血液腫瘍であってもよい。研究に用いられる場合、これらの組織は、当業者によく知られている方法により、容易に入手可能なリソースから分離することができる。
本願は、腫瘍溶解性ウイルスを提供し、前記腫瘍溶解性ウイルスは、野生型ＶＳＶウイルスに基づいて、具体的にはＶＳＶウイルスインディアナ株、ＶＳＶウイルスＩｎｄｉａｎａ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプ株に基づいて、そのＭタンパク質及び／又はＧタンパク質のアミノ酸配列上の部位を変異させることによって得られる。そのＭタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示され、そのＧタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示される。本願において、前記Ｍタンパク質は改変されてもよく、前記Ｇタンパク質も改変されてもよい。
本願は、腫瘍溶解性ウイルスを得るために、前記ＶＳＶウイルスを次のように修飾する。
前記腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍタンパク質と、Ｇタンパク質と、を含み、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるアミノ酸配列と比較して、５１位、２２１位及び２２６位にアミノ酸置換を含み、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
前記Ｍタンパク質のアミノ酸置換は、５１位のメチオニンからアルギニンへの変異（Ｍ５１Ｒ）、及び／又は、２２１位のバリンからフェニルアラニンへの変異（Ｖ２２１Ｆ）、及び／又は、２２６位のセリンからアルギニンへの変異（Ｓ２２６Ｒ）を含む。例えば、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されるアミノ酸配列を含む。本願において、前記Ｍタンパク質は、他の位置のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、５３位のバリンからイソロイシンへの変異（Ｖ５３Ｉ）、及び／又は、１４１位のアラニンからバリンへの変異（Ａ１４１Ｖ）、及び／又は、１７２位のアスパラギン酸からチロシンへの変異（Ｄ１７２Ｙ）、及び／又は、２１７位のリジンからグルタミン酸への変異（Ｋ２１７Ｅ）、及び／又は、２３２位のアスパラギン酸からグリシンへの変異（Ｄ２３２Ｇ）、及び／又は、３３１位のバリンからアラニンへの変異（Ｖ３３１Ａ）、及び／又は、３７１位のバリンからグルタミン酸への変異（Ｖ３７１Ｅ）、及び／又は、４３６位のグリシンからアスパラギン酸への変異（Ｇ４３６Ｄ）、及び／又は、４３８位のトレオニンからセリンへの変異（Ｔ４３８Ｓ）、及び／又は、４５３位のフェニルアラニンからロイシンへの変異（Ｆ４５３Ｌ）、及び／又は、４７１位のトレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ４７１Ｉ）、及び／又は、４８７位のチロシンからヒスチジンへの変異（Ｙ４８７Ｈ）を含み、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位及び１４１位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位及び１７２位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位及び２１７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位及び２３２位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位及び３３１位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位及び３７１位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位及び４３６位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位及び４３８位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位及び４５３位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位及び４７１位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、４３６位、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、４７１位、４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、４８７位のアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、他の位置のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、少なくとも保存領域における１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、前記保存領域は、Ｇタンパク質の４３７～４６１位のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、前記Ｇタンパク質は、少なくとも細胞質領域の切り縮め領域における１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、前記細胞質領域の切り縮め領域は、Ｇタンパク質の４８３～５１１位のアミノ酸を含んでもよい。
本願において、前記Ｇタンパク質は、少なくとも４３８、第４５３位、４７１位及び４８７位のアミノ酸置換を含んでもよい。
前記腫瘍溶解性ウイルスは、核酸分子及び外来目的タンパク質をさらに含んでもよい。当該核酸分子は、アミノ酸置換を有する前記Ｍタンパク質をコードする核酸配列と、アミノ酸置換を有する前記Ｇタンパク質をコードする核酸配列と、を含んでもよく、当該核酸分子は、前記外来目的タンパク質をコードする核酸配列をさらに含んでもよい。さらに、当該核酸分子中の外来目的タンパク質をコードする前記核酸配列は、アミノ酸置換を有する前記Ｍタンパク質をコードする前記核酸配列と、アミノ酸置換を有する前記Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列との間に位置する。さらに、当該核酸分子は、前記腫瘍溶解性ウイルスのＮタンパク質（核タンパク質Ｎ）、Ｌタンパク質（マクロポリメラーゼタンパク質Ｌ）及びＰタンパク質（リン酸タンパク質Ｐ）をコードする。
本願において、ウイルスパッケージング過程及びウイルスレスキュー過程によって本願に記載の腫瘍溶解性ウイルスを得ることができる。具体的な過程は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するポックスウイルスｖＴＦ７－３をＢＳＲ－Ｔ７細胞に感染接種し、ＶＳＶ Ｎ、ＶＳＶ Ｐ、ＶＳＶ Ｌ遺伝子をそれぞれクローニングした発現プラスミド及び骨格プラスミドを用いてｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションを行い、目的腫瘍溶解性ウイルスを得ることを含んでもよい。
本願は、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び医薬組成物をさらに提供する。
前記腫瘍溶解性ウイルス発現ベクターは、前記腫瘍溶解性ウイルスのＭタンパク質及びＧタンパク質をコードする核酸配列を含んでもよく、前記腫瘍溶解性ウイルス発現ベクターは、前記腫瘍溶解性ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質をコードする核酸配列をさらに含んでもよい。
前記ウイルス生産細胞は、上記の腫瘍溶解性ウイルスを産生することができ、前記ウイルス生産細胞は、ＢＳＲ－Ｔ７細胞を含んでもよい。
前記医薬組成物は、上記の腫瘍溶解性ウイルス、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。
一部の実施形態において、前記医薬組成物は、１つ以上の（薬学的に有効な）アジュバント、安定化剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤及び／又は防腐剤の適切な製剤を含んでもよい。医薬組成物の許容可能な成分は、使用される用量及び濃度で受容体に対して無毒であることが好ましい。本願の医薬組成物は、液体、凍結及び凍結乾燥組成物を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、医薬投与に適合性のある、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張化剤及び吸収遅延剤を含んでもよく、通常、安全で、非毒性である。
一部の実施形態において、前記医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内及び／又は鼻腔内投与、又は組織への直接注射を含んでもよい。例えば、前記医薬組成物は、注入又は注射によって患者又は被験体に投与されてもよい。一部の実施形態において、前記医薬組成物の投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は真皮内投与などの異なる方式で投与することができる。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、中断することなく投与されてもよい。前記無中断（又は連続）投与は、ＷＯ２０１５／０３６５８３に記載されているように、患者に装着された小型ポンプシステムによって実現され、患者の体内に流入する治療薬を測定することができる。
また、本願は、上記腫瘍溶解性ウイルスの製造方法をさらに提供し、当該製造方法は、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び／又は医薬組成物の製造方法を含んでもよい。腫瘍溶解性ウイルスの生産に適した任意の方法は、本願の腫瘍溶解性ウイルスを産生するために用いることができる。例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するポックスウイルスを細胞に加えてトランスフェクションし、前記腫瘍溶解性ウイルスＮタンパク質、Ｌタンパク質及びＰタンパク質を発現するプラスミド及び骨格プラスミドを加えてトランスフェクションし、ウイルスレスキュー過程によって本願の腫瘍溶解性ウイルスを得ることができる。
本願は、上記腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、ウイルス生産細胞及び／又は医薬組成物の、疾患及び／又は病状の予防及び／又は治療のための医薬の製造における使用をさらに提供する。
本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、いずれもＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞に対して良好な侵入感染能力を有し、特に番号ＪＢＳ１０４－ＪＢＳ１２６の腫瘍溶解性ウイルスは、番号ＪＢＳ１０３の腫瘍溶解性ウイルスに基づいて、腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質上のアミノ酸に部位特異的変異を行い、それによって腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞に対する侵入感染能力をさらに向上させる。同時に、上記で製造された腫瘍溶解性ウイルスの正常細胞ＭＥＦ細胞に対する侵入感染能力がいずれも低いことから、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞を損傷させることなく、腫瘍、癌などの細胞の侵入感染に好適に用いることができ、幅広い応用の将来性があることが分かる。
本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、いずれもＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及び４Ｔ１細胞に対して良好なインビトロ殺傷能力を有し、特に番号ＪＢＳ１０４－ＪＢＳ１２６の腫瘍溶解性ウイルスは、番号ＪＢＳ１０３の腫瘍溶解性ウイルスに基づいて、腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質上のアミノ酸に部位特異的変異を行い、それによって腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及び４Ｔ１細胞に対するインビトロ殺傷能力をさらに向上させる。同時に、上記で製造された腫瘍溶解性ウイルスがＭＥＦ細胞に対してほとんど影響がないことから、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞を損傷させることなく、腫瘍、癌などの非正常細胞の損傷及び死滅に好適に用いることができることが分かる。
番号ＪＢＳ１０１及びＪＢＳ１０２の腫瘍溶解性ウイルスは、ＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内でいずれも容易に除去することができない。対照的に、番号ＪＢＳ１０３の腫瘍溶解性ウイルスは、ＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内でより容易に除去される。一方、本願の番号ＪＢＳ１０４－ＪＢＳ１２６の腫瘍溶解性ウイルスは、番号ＪＢＳ１０３の腫瘍溶解性ウイルスに基づいて、さらに腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質上のアミノ酸に部位特異的変異を行い、それによって腫瘍溶解性ウイルスはＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内でより容易に除去できなくなり、さらに腫瘍溶解性ウイルスがＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内で侵入感染及び殺傷の能力をより良好に発揮できることを確保し、同時に、本願にて提供される腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＥＦ細胞内でより容易に除去され、ＭＥＦ細胞の安全性をさらに確保し、それによって腫瘍溶解性ウイルスの安全性を向上させる。
如何なる理論にも限定されないように、以下の実施例は、単に本願発明の個々の技術的解決手段を説明するためにのみ用いられ、本願発明の範囲を限定するために用いられるものではない。
製造例
製造例１～３
製造例１～３は、それぞれ腫瘍溶解性ウイルスを提供し、その違いは、主に野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭタンパク質上のアミノ酸の部位特異的変異の部位にある。各製造例に対応する腫瘍溶解性ウイルスの構築方法は、具体的には以下のとおりである。
（１）プラスミド構築
ｐＲＶ－ｃｏｒｅプラスミド（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣプラスミドベクター菌種細胞遺伝子寄託センター）を鋳型として、ＰＣＲ技術を用いて表１に示されるような変異部位を導入した。ｐＲＶ－ｃｏｒｅプラスミドを、各変異部位を担持するプライマーとそれぞれＰＣＲを行い、そしてＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動し、さらにゲル回収キットを用いてゲル切断回収を行い、それによってＭタンパク質の異なる変異部位を有するプラスミドを得、構築されたプラスミドｐＲＶ－ｃｏｒｅ Ｍｕｔを得た。
表１ 製造例１～３における腫瘍溶解性ウイルスのＭタンパク質の変異状況表
（２）ウイルスレスキュー
リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、細胞トランスフェクション技術によって、構築したプラスミドｐＲＶ－ｃｏｒｅ ＭｕｔをＢＳＲ－Ｔ７細胞にトランスフェクションした（ＡＴＣＣより購入し、アメリカ菌種寄託センター、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションとも呼ばれる）。
ｐＲＶ－ｃｏｒｅ Ｍｕｔ、ｐＰ、ｐＮ、ｐＬの質量比１０：５：４：１に従って、４つのプラスミドを混合し、プラスミドの総量が５μｇであり、２００μｌ ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプラスミドを希釈し、且つ７．５μｌのトランスフェクション試薬Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、トランスフェクションプラスミドスプリミックスを得、ここでｐＰ（コリネ型ウイルスリン酸タンパク質遺伝子を担持したプラスミド）、ｐＮ（コリネ型ウイルス核タンパク質遺伝子を担持したプラスミド）、ｐＬ（コリネ型ウイルスポリメラーゼタンパク質遺伝子を担持したプラスミド）、ｐＮ、ｐＰ、ｐＬの３つのプラスミドに対応する親ベクターはいずれもｐＣＡＧＧＳであり（ＡＴＣＣより購入）、
２００μｌ ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ １０μｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を希釈し、ＬＴＸ混合液を得、
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸの取扱説明書に記載の方法に従ってプラスミドのトランスフェクションを行い、６ｈ後にＰＢＳでＢＳＲ－Ｔ７細胞を２回洗浄し、さらに１０％ウシ胎児血清のＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接種して３日間培養し、
ＢＳＲ－Ｔ７細胞を培養して得られた細胞上清をＶｅｒｏ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、且つＶｅｒｏ細胞を３７℃の環境条件下で３日間培養し、細胞内の緑色蛍光を蛍光顕微鏡で観察し、ウイルスレスキューの状況を決定し、さらにレスキューされた変異コリネ型ウイルスライブラリーをＶｅｒｏ細胞により継代し、確立されたプラークスクリーニングシステムでモノクローナルウイルス株を選んだ。
（３）Ｍタンパク質遺伝子の配列決定。Ｔｒｉｚｏｌキットを用いてウイルスゲノムＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行い、Ｍタンパク質遺伝子配列に対して設計されたプライマーを用いて逆転写されたｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。
プライマー配列は、次のとおりである。
５'－ＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＣ－３'、
５'－ＡＣＡＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＧ－３'。
生成物は１％アガロースゲル電気泳動後に回収され、且つ配列決定のために配列決定会社に送られた。配列決定の結果を表１に示す。
製造例４～２６
製造例４～２６はそれぞれ腫瘍溶解性ウイルスを提供し、その違いは、主に野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭタンパク質及びＧタンパク質上のアミノ酸の部位特異的変異の部位にあり、ここでＭタンパク質の変異部位は、製造例３の対応する変異部位と同じである。各製造例に対応する腫瘍溶解性ウイルスの構築方法は、以下の点を除いて、製造例１～３に記載の構築方法と同じである。
ステップ（１）のプラスミド構築にＰＣＲ技術を用いて表２に示されるような変異部位を導入した。
ステップ（３）はＧタンパク質遺伝子の配列決定であった。Ｔｒｉｚｏｌキットを用いてウイルスゲノムＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行い、Ｇタンパク質遺伝子配列に対して設計されたプライマーを用いて逆転写されたｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。
プライマー配列は、次のとおりである。
５'－ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴ－３'、
５'－ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧ－３'。
生成物は１％アガロースゲル電気泳動後に回収され、且つ配列決定のために配列決定会社に送られた。配列決定の結果を表２に示す。
表２ 製造例４～２６における腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質の変異状況表
製造例２７
本製造例は、上記実施例１～２６を用いて製造した腫瘍溶解性ウイルスのパッケージング過程を提供し、具体的には以下のステップを含む。
１）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するポックスウイルスｖＴＦ７－３（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣプラスミドベクター菌種細胞遺伝子寄託センター）をＢＳＲ－Ｔ７細胞（ＡＴＣＣより購入）に感染接種した。
具体的なステップは、次のとおりである。ＢＳＲ－Ｔ７細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、１ウェルあたりの細胞数を３×１０５個に達するように制御し、１４～１６ｈプレーティング後に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するポックスウイルスｖＴＦ７－３を加え、ポックスウイルスｖＴＦ７－３のＢＳＲ－Ｔ７細胞に対する感染を行い、６ｈ感染後、ＤＰＢＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＢＳＲ－Ｔ７細胞を１回リンスし、トランスフェクションした。
２）トランスフェクション過程
具体的には以下のステップを含む。ｐＲＶ－ｃｏｒｅ Ｍｕｔ、ｐＰ、ｐＮ、ｐＬの質量比１０：５：４：１に従って、４つのプラスミドを混合し、プラスミドの総量が５μｇであり、２００μｌ ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプラスミドを希釈し、且つ７．５μｌのトランスフェクション試薬Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、トランスフェクションプラスミドプレミックスを得、ここで、ｐＰ（コリネ型ウイルスリン酸タンパク質遺伝子を担持したプラスミド）、ｐＮ（コリネ型ウイルス核タンパク質遺伝子を担持したプラスミド）、ｐＬ（コリネ型ウイルスポリメラーゼタンパク質遺伝子を担持したプラスミド）；ｐＮ、ｐＰ、ｐＬの３つのプラスミドに対応する親ベクターはいずれもｐＣＡＧＧＳ（ＡＴＣＣより購入）であり、
２００μｌ ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ １０μｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を希釈し、ＬＴＸ混合液を得、
ＬＴＸ混合液２００μｌをトランスフェクションプラスミドプレミックス２００μｌと混合し、室温で１５ ｍｉｎインキュベートし、ＬＴＸ－ＤＮＡ混合液を得、
ステップ１）の６ウェルプレート中のＤＰＢＳ緩衝液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に交換し、ＬＴＸ－ＤＮＡ混合液をＢＳＲ－Ｔ７細胞を培養する６ウェルプレートに滴下し、６ウェルプレートを穏やかに振盪し、ＬＴＸ－ＤＮＡ混合液を６ウェルプレート内に均一に分布させ、６～８ｈトランスフェクション後、トランスフェクション試薬を吸引除去し、３ ｍｌの新鮮な完全培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、７２ ｈ後にＢＳＲ－Ｔ７細胞の細胞上清を採取し、０．２２μｍフィルターで濾過し、製造例１～２６のそれぞれに対応する腫瘍溶解性ウイルス力価を得た。
実施例
実施例１
本実施例では製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスをそれぞれ用いて異なる細胞の侵入感染能力を検出した。検出方法は、ＴＣＩＤ５０検出法であり、即ち異なる細胞の培養液に、それぞれ製造例１～２６及び野生型腫瘍溶解性ウイルスを２００ｐｆｕずつ加え、各腫瘍溶解性ウイルスによる半数の組織培養感染量（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ、ＴＣＩＤ５０）を検出した。検出された細胞は、ＬＬＣ細胞（マウス非小細胞肺癌細胞）、ＭＣ３８細胞（マウス結腸癌細胞）、Ｈｅｌａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、ＭＥＦ細胞（ヒト線維芽細胞）を含む。具体的な検出方法は、次のとおりであり、
（１）それぞれ６ウェル培養プレートにＶｅｒｏ（ＬＬＣ／ＭＣ３８／Ｈｅｌａ／ＭＥＦ）細胞懸濁液３ｍＬを加え、細胞数が４×１０５個／ウェルになるようにし、各種のＶｅｒｏ細胞が合計６ウェルで、ＭＥＦ細胞は対照として２ウェルとし、６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で１６ｈ培養し、
（２）６ウェル培養プレートの各ウェルに製造例で製造した腫瘍溶解性ウイルス２００ ｐｆｕを加え、２４ｈ後にＭＥＦ細胞及び各種のＶｅｒｏ細胞の上清１００μｌを採取し、採取したものをそれぞれ９６ウェル培養プレートのウェルに加え、各種の細胞の細胞数が１×１０４個／ｍｌになるようにし、９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で１６ｈ培養し、
（３）１．５ｍｌ ＥＰチューブ中で、ステップ（２）で採取した上清を連続的に１０倍希釈し、１０－１～１０－１１、合計１１力価であり、希釈した上清を９６ウェル培養プレートに接種し、各希釈勾配に１列合計８ウェルに接種し、１ウェル当たり１００μｌを接種し、
（４）４８ｈ後に各ウェルの細胞の蛍光状況を観察し、蛍光がある場合、このウェルが感染されたと記録し、Ｋａｒｂｅｒ法に従ってＴＣＩＤ５０を計算した。
検出結果を図１～図４に示し、ここで、横軸０は野生型腫瘍溶解性ウイルスを表し、横軸１～２６はそれぞれ製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルスを表し、縦軸Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０はＫａｒｂｅｒ法により算出されたＴＣＩＤ５０値を表し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０の値が大きいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する侵入感染能力が高いことを示し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０の値が小さいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する侵入感染能力が低いことを示す。
図１は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。
図２は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＣ３８細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。
図３は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＨｅｌａ細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。
図４は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞に対する侵入感染能力の検出結果である。
上記の図面から、本願の製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルスは、いずれもＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞に対して良好な侵入感染能力を有し、特に製造例４～２６では、製造例３に基づいてさらに腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質上のアミノ酸に部位特異的変異を行い、それによって腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞に対する侵入感染能力をさらに向上させる。同時に、上記で製造した腫瘍溶解性ウイルスのいずれもＭＥＦ細胞に対する侵入感染能力が低いことから、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞を損傷させることなく、腫瘍、癌などの細胞の侵入感染に好適に用いることができ、幅広い応用の将来性があることが分かる。
実施例２
本実施例では製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスをそれぞれ用いて異なる細胞に対してインビトロ殺傷試験検出を行った。検出方法は、ＭＴＴ検出法であり、即ち異なる細胞の培養液に、それぞれ製造例１～２６及び野生型腫瘍溶解性ウイルスを２００ｐｆｕずつ加え、２４ｈ後にＭＴＴ検出法により細胞活性を検出した。検出された細胞は、ＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞、ＭＥＦ細胞、４Ｔ１細胞（マウス乳房細胞）を含む。具体的な検出方法は、次のとおりであり、
（１）それぞれ９６ウェル培養プレートにＶｅｒｏ（ＬＬＣ／ＭＣ３８／４Ｔ１／ＭＥＦ）細胞懸濁液１００μｌを加え、細胞数が１×１０４個／ウェルになるようにし、９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で１６ｈ培養し、
（２）製造例で製造した腫瘍溶解性ウイルスをＭＯＩ（多重感染度）がそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１．０となるように希釈し、各希釈勾配の腫瘍溶解性ウイルスをステップ（１）の９６ウェル培養プレートにそれぞれ接種し、各希釈勾配に４ウェルに接種し、各ウェルに１００μｌであり、９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で４０ｈ培養し、
（３）ステップ（２）の９６ウェル培養プレート中の細胞上清を取り出し、且つ９６ウェル培養プレートに新鮮な培地及びＭＴＴ溶液を加え、添加量が２０μＬ／ウェルであり、９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で４ｈ培養し、
（４）９６ウェル培養プレートを室温で５ｍｉｎ遠心分離し、２５００ｒｐｍ／ｍｉｎの回転速度に設定し、上清を１ｍＬの使い捨て滅菌シリンジで穏やかに吸引除去し、そして９６ウェル培養プレートの各ウェルにＤＭＳＯを加え、添加量が１００ｕＬ／ウェルであり、３７℃の環境条件下で１０ｍｉｎ放置した。多機能マイクロプレートリーダーを用いて２ｍｉｎ振盪し、５７０ｎｍ又は４９０ｎｍ波長で９６ウェル培養プレート上の各ウェルのＯＤ値を測定した。
検出結果を図５～図８に示し、ここで、横軸０は野生型腫瘍溶解性ウイルスを表し、横軸１～２６はそれぞれ製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルスを表し、縦軸ＯＤ５７０は細胞のＯＤ値を表し、ＯＤ５７０の値が大きいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する殺傷能力が低いことを示し、ＯＤ５７０の値が小さいほど、腫瘍溶解性ウイルスの当該細胞に対する殺傷能力が高いことを示す。
図５は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。
図６は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＣ３８細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。
図７は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスの４Ｔ１細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。
図８は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞に対するインビトロ殺傷能力の検出結果である。
上記の図面から、本願の製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルスは、いずれもＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及び４Ｔ１細胞に対して良好なインビトロ殺傷能力を有し、特に製造例４～２６では、製造例３に基づいてさらに腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質上のアミノ酸に部位特異的変異を行い、それによって腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及び４Ｔ１細胞に対するインビトロ殺傷能力を向上させる。同時に、上記で製造した腫瘍溶解性ウイルスがＭＥＦ細胞にほとんど影響がないことから、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞を損傷させることなく、腫瘍、癌などの非正常細胞の損傷及び死滅に好適に用いることができることが分かる。
野生型腫瘍溶解性ウイルスはＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及び４Ｔ１細胞に対して良好なインビトロ殺傷能力を有するが、上記細胞を損傷及び死滅させると同時に、ＭＥＦ細胞をかなり損傷及び死滅させることになり、野生型腫瘍溶解性ウイルスの臨床的適用を制限している。したがって、本願の野生型腫瘍溶解性ウイルスの改変は、腫瘍溶解性ウイルスの正常細胞に対する安全性を確保すると同時に、腫瘍、癌細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの殺傷能力を確保し、広い臨床応用の見込みを有する。
実施例３
本実施例は製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスの異なる細胞内での除去難易度を検出した。検出指標はＩＦＮ－β遺伝子の発現状況であった。遺伝子ＩＦＮ－βは、細胞が産生する、広範囲の抗ウイルス作用、抗腫瘍及び免疫調節作用を有する可溶性糖タンパク質の遺伝子であり、遺伝子ＩＦＮ－βの発現状況により細胞の腫瘍溶解性ウイルスに対する除去能力を判断することができ、遺伝子ＩＦＮ－βの発現が高い場合、腫瘍溶解性ウイルスが細胞内で容易に除去されることを示し、遺伝子ＩＦＮ－βの発現が低い場合、腫瘍溶解性ウイルスが細胞内で容易に除去できないことを示す。検出された細胞は、ＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＥＦ細胞を含む。具体的な検出方法は、次のとおりであり、
（１）それぞれ９６ウェル培養プレートにＶｅｒｏ（ＬＬＣ／ＭＣ３８／Ｈｅｌａ／ＭＥＦ）細胞及びＭＥＦ細胞懸濁液１００μｌを加え、細胞数が１×１０４個／ウェルになるようにし、９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で１６ｈ培養し、
（２）製造例で製造した腫瘍溶解性ウイルスをＭＯＩ（多重感染度）がそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１．０となるように希釈し、各希釈勾配の腫瘍溶解性ウイルスをステップ（１）の９６ウェル培養プレートにそれぞれ接種し、各希釈勾配に４ウェルに接種し、各ウェルに１００μｌであり、９６ウェル培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２の環境条件下で４０ｈ培養し、
（３）ステップ（２）で培養して得られた各群の細胞を破砕し、且つＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ）逆転写キットを用いてｃＤＮＡに逆転写し、且つＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）色素で染色し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０定量ＰＣＲ装置で各遺伝子のＣｔ値を検出した。ΔΔＣｔ法により目的遺伝子ＩＦＮ－βの相対発現量を計算した。
検出結果を図９～図１２に示し、ここで、横軸０は野生型腫瘍溶解性ウイルスを表し、横軸１～２６はそれぞれ製造例１～２６で製造した腫瘍溶解性ウイルスを表し、縦軸ＩＦＮ－βレベルはＩＦＮ－β遺伝子の発現状況を表し、ＩＦＮ－βレベルの値が大きいほど、腫瘍溶解性ウイルスが当該細胞内で容易に除去されることを示し、ＩＦＮ－βレベルの値が小さいほど、腫瘍溶解性ウイルスが当該細胞内で容易に除去できないことを示す。
図９は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＬＬＣ細胞内での除去難易度の検出結果である。
図１０は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＣ３８細胞での除去難易度の検出結果である。
図１１は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＨｅｌａ細胞での除去難易度の検出結果である。
図１２は、本願により製造された腫瘍溶解性ウイルス及び野生型腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞での除去難易度の検出結果である。
上記の図面から、本願の製造例１～２はＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞のいずれにおいても容易に除去できないことが分かる。製造例１及び製造例２よりも、製造例３はＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内でより容易に除去される。本願の製造例４～２６は、製造例３に基づいてさらに腫瘍溶解性ウイルスのＧタンパク質上のアミノ酸に部位特異的変異を行い、それによって腫瘍溶解性ウイルスはＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内でより容易に除去できなくなり、さらに腫瘍溶解性ウイルスがＬＬＣ細胞、ＭＣ３８細胞及びＨｅｌａ細胞内で侵入感染及び殺傷の能力をより良好に発揮できることを確保し、同時に、腫瘍溶解性ウイルスのＭＥＦ細胞内での除去をより容易にし、さらにＭＥＦ細胞の安全性を確保し、それによって腫瘍溶解性ウイルスの安全性を向上させる。
前述の詳細な説明は、説明及び例示として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。現在、本願に挙げられている実施形態の様々な変化は、当業者には自明であり、添付の特許請求の範囲及びそれに相当する方法の範囲内に留まる。

Claims (26)

  1. 腫瘍溶解性ウイルスであって、Ｍタンパク質と、Ｇタンパク質と、を含み、前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示されるアミノ酸配列と比較して、５１位、２２１位及び２２６位のアミノ酸置換を含み、前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、
    ことを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス。
  2. 前記Ｍタンパク質のアミノ酸置換は、５１位のメチオニンからアルギニンへの変異（Ｍ５１Ｒ）、及び／又は、２２１位のバリンからフェニルアラニンへの変異（Ｖ２２１Ｆ）、及び／又は、２２６位のセリンからアルギニンへの変異（Ｓ２２６Ｒ）を含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  3. 前記Ｍタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５に示されるアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～２のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  4. 前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位の１つ以上の部位のアミノ酸置換を含む、
    ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  5. 前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と比較して、５３位、１４１位、１７２位、２１７位、２３２位、３３１位、３７１位、４３６位、４３８位、４５３位、４７１位及び４８７位の１つ以上の部位のアミノ酸置換を含む、
    ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  6. 前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、５３位のバリンからイソロイシンへの変異（Ｖ５３Ｉ）、及び／又は、１４１位のアラニンからバリンへの変異（Ａ１４１Ｖ）、及び／又は、１７２位のアスパラギン酸からチロシンへの変異（Ｄ１７２Ｙ）、及び／又は、２１７位のリジンからグルタミン酸への変異（Ｋ２１７Ｅ）、及び／又は、２３２位のアスパラギン酸からグリシンへの変異（Ｄ２３２Ｇ）、及び／又は、３３１位のバリンからアラニンへの変異（Ｖ３３１Ａ）、及び／又は、３７１位のバリンからグルタミン酸への変異（Ｖ３７１Ｅ）、及び／又は、４３６位のグリシンからアスパラギン酸への変異（Ｇ４３６Ｄ）、及び／又は、４３８位のトレオニンからセリンへの変異（Ｔ４３８Ｓ）、及び／又は、４５３位のフェニルアラニンからロイシンへの変異（Ｆ４５３Ｌ）、及び／又は、４７１位のトレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ４７１Ｉ）、及び／又は、４８７位のチロシンからヒスチジンへの変異（Ｙ４８７Ｈ）を含む、
    ことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  7. 前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、
    １）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉを含むもの、
    ２）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ及びＡ１４１Ｖを含むもの、
    ３）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ及びＤ１７２Ｙを含むもの、
    ４）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ及びＫ２１７Ｅを含むもの、
    ５）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ及びＤ２３２Ｇを含むもの、
    ６）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ及びＶ３３１Ａを含むもの、
    ７）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ及びＶ３７１Ｅを含むもの、
    ８）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ及びＧ４３６Ｄを含むもの、
    ９）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ及びＴ４３８Ｓを含むもの、
    １０）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ及びＦ４５３Ｌを含むもの、
    １１）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ及びＴ４７１Ｉを含むもの、
    １２）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １３）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＡ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １４）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＤ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １５）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＫ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １６）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＤ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １７）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １８）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＶ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    １９）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＧ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    ２０）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＴ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    ２１）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＦ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    ２２）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＴ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含むもの、
    ２３）前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換がＹ４８７Ｈを含むものからなる群から選択されるいずれか１つである、
    ことを特徴とする請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  8. 前記Ｇタンパク質のアミノ酸置換は、Ｖ５３Ｉ、Ａ１４１Ｖ、Ｄ１７２Ｙ、Ｋ２１７Ｅ、Ｄ２３２Ｇ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３７１Ｅ、Ｇ４３６Ｄ、Ｔ４３８Ｓ、Ｆ４５３Ｌ、Ｔ４７１Ｉ及びＹ４８７Ｈを含む、
    ことを特徴とする請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  9. 前記Ｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７に示されるアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  10. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、コリネ型ウイルスを含む、
    ことを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  11. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む、
    ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  12. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＳＶウイルスＩｎｄｉａｎａ ＭｕｄｄＳｕｍｍｅｒサブタイプを含む、
    ことを特徴とする請求項１～１１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  13. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、外来目的タンパク質を含むか又は発現する、
    ことを特徴とする請求項１～１２のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  14. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、アミノ酸置換を有する前記Ｍタンパク質をコードする核酸配列と、アミノ酸置換を有する前記Ｇタンパク質をコードする核酸配列と、を含む核酸分子を含む、
    ことを特徴とする請求項１～１３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  15. 前記核酸分子は、前記外来目的タンパク質をコードする核酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  16. 前記核酸分子中の外来目的タンパク質をコードする前記核酸配列は、アミノ酸置換を有する前記Ｌタンパク質をコードする前記核酸配列と、アミノ酸置換を有する前記Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列との間に位置する、
    ことを特徴とする請求項１５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  17. 前記核酸分子は、前記腫瘍溶解性ウイルスのＮタンパク質、Ｌタンパク質及びＰタンパク質をコードする、
    ことを特徴とする請求項１６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを発現することができる、
    ことを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター。
  19. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを産生することができる、
    ことを特徴とするウイルス生産細胞。
  20. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む、
    ことを特徴とする医薬組成物。
  21. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、請求項１９に記載のウイルス生産細胞及び／又は請求項２０に記載の医薬組成物の製造方法。
  22. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、請求項１９に記載のウイルス生産細胞及び／又は請求項２０に記載の医薬組成物の、疾患及び／又は病状の予防及び／又は治療のための医薬の製造における使用。
  23. 前記腫瘍溶解性ウイルス、前記腫瘍溶解性ウイルス発現ベクター、前記ウイルス生産細胞及び／又は前記医薬組成物は、異常増殖性細胞を持続的に殺傷する方法で用いられる、
    ことを特徴とする請求項２２に記載の使用。
  24. 前記異常増殖性細胞が、腫瘍細胞又は腫瘍組織の関連細胞から選択される、
    ことを特徴とする請求項２３に記載の使用。
  25. 前記腫瘍細胞が、癌細胞又は転移性癌細胞である、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の使用。
  26. 前記腫瘍が、固形腫瘍及び／又は血液腫瘍を含む、
    請求項２２～２４のいずれか一項に記載の使用。
JP2024501981A 2021-07-14 2022-07-08 腫瘍溶解性ウイルス及びその使用 Pending JP2024525781A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110798531.X 2021-07-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024525781A true JP2024525781A (ja) 2024-07-12

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7468958B2 (ja) 腫瘍溶解性ウイルスワクチン及びそれと免疫細胞の併用による腫瘍治療薬物
WO2023143023A1 (zh) 溶瘤病毒及其应用
EP4140502A1 (en) Oncolytic virus in combination with immune checkpoint inhibitor for treating tumors
CN110996980B (zh) 一种用于治疗肿瘤的病毒
CN109568350B (zh) 一种用于治疗肿瘤的柯萨奇病毒
JP7336791B2 (ja) 腫瘍を治療するためのコクサッキーウイルスｂ群
US11707496B2 (en) Echovirus for treatment of tumors
JP2024525781A (ja) 腫瘍溶解性ウイルス及びその使用
WO2023284635A1 (zh) 一种溶瘤病毒及其用途
US20240226209A1 (en) Oncolytic virus and use thereof
JP2023526905A (ja) マイクロｒｎａで調節及び制御可能な単離された組換え腫瘍溶解性ポックスウイルス及びその使用
WO2024012277A1 (zh) 重组溶瘤病毒及其应用
JP2013220076A (ja) 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子が組み込まれたｂ５ｒ遺伝子欠損組換えワクシニアウイルス