KR102566552B1 - 종양 치료용 바이러스 - Google Patents

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Abstract

EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 상기 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 엔테로바이러스 D68 (EV-D68) 또는 이의 변이형, 또는 핵산 분자, 또는 상기 EV-D68 또는 이의 변이형, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물, 및 종양 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형, 또는 상기 핵산 분자의 사용을 제공한다.

Description

종양 치료용 바이러스
본 발명은 바이러스 분야 및 종양 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 인간)에서 종양을 치료하기 위한, 및 대상체 (예를 들어, 인간)에서 종양을 치료하는 약제를 제조하기 위한 엔테로바이러스 D68 (EV-D68) 또는 이의 변이형(modified form), EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈(genomic) 서열 또는 cDNA 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적(complementary) 서열의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한, EV-D68 또는 이의 변이형, EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양 치료 방법에 관한 것이다.
악성 종양을 치료하는 최근의 방법은 수술 화학요법 및 방사선요법을 포함한다. 이러한 전통적 요법들은 전이성 종양의 치료에는 만족스럽지 않으며, 환자의 건강에 해를 끼칠 수도 있다. 반면, 새로운 유형의 치료 방법으로서, 항암 바이러스(oncolytic virus)를 이용한 종양 치료 방법은 특이성이 높고, 효과가 우수하며, 부작용이 적어, 현재 촉망되는 종양 치료 방법으로 여겨지고 있다.
항암 바이러스는 종양 세포에서 자가-복제(self-replicate)되어 종양 세포를 사멸시키고 용해시키거나, 종양세포의 성장을 저지할 수 있는 바이러스이다. 인 비보(in vivo) 치료에 사용되는 경우, 항암 바이러스는 종양 세포에 대한 특이성을 나타내고, 종양 세포의 사멸을 직접 유도할 수 있지만, 정상 세포에는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 한편, 항암 바이러스는 또한 면역계에서 세포독성 T 림프구 반응을 유도하여 간접적으로 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
엔테로바이러스(Enterovirus)는 피코르나바이러스 과(Picornaviridae family)에 속하며, 이의 게놈은 단일 가닥 양의 방향 RNA(single-stranded positive-sense RNA)이다. 엔테로바이러스를 항암 바이러스로 사용하는 경우 다음과 같은 이점이 있다: 첫째, 단일 가닥 RNA 바이러스로서, 이의 게놈은 숙주에서 DNA 단계를 거치지 않으므로, 숙주의 DNA로의 바이러스성 게놈의 삽입으로 인한 유전독성이 없어 안전성이 더 좋다; 둘째, 엔테로바이러스 게놈은 비교적 작고, 단기간에 많은 양의 바이러스가 복제되어 다른 종양 세포를 더 감염시킬 수 있어 강력한 세포변성 효과(cytopathic effect)를 유발할 수 있다; 다음으로, 엔테로바이러스는 종양 유전자(oncogenes)을 함유하지 않으므로 종양을 유도하지 않는다; 끝으로, 엔테로바이러스의 게놈은 역유전학(reverse genetics) 기술에 의해 변형되어 바이러스가 약화되어 그 부작용을 감소시킬 수 있다.
현재, 항암 활성을 갖는 것으로 보고된 엔테로바이러스는 악성 신경교종과 같은 인간 고형 종양의 치료를 위한 키메릭 폴리오바이러스(chimeric polioviruses) (Dobrikova et al., Mol Ther 2008, 16 (11): 1865-1872 ); 인간 흑색종 세포를 사멸시키는 콕삭키 바이러스(Coxsackie viruses) A13, A15, A18, 및 A21 (Au et al., Virol J 2011, 8: 22); 인간 위암 세포 및 난소암 세포를 사멸시키는 에코 바이러스(Echo virus) ECHO1 (Shafren et al., Int J Cancer 2005, 115 (2): 320-328; Haley et al., J Mol Med (Berl) 2009, 87 (4): 385-399) 등을 포함한다. 그러나, 종양-특이성 및 종양-사멸 활성 모두를 갖는 바이러스를 얻을 필요는 여전히 존재한다.
엔테로바이러스 D68 (EV-D68)은 피코르나바이러스 과의 엔테로바이러스 속의 일종인 엔테로바이러스 D이며, 1962년 캘리포니아의 호흡기 감염이 있는 어린이에게서 처음 분리되었다 (Schieble et al., Am J Epidemiol 1967, 85 (2): 297-310). 산(acids)에 내성이 있고 사람의 위장관에서 번식하는 대부분의 엔테로바이러스와는 달리, EV-D68은 산에 민감하고 주로 호흡기에서 복제된다. EV-D68 감염에 대한 보고가 오랫동안 없었기 때문에, EV-D68은 콧물, 재채기 및 기침을 포함하는 가벼운 호흡기 질환을 주로 유발하는 희귀한 병원체로 간주된다. 현재, 엔테로바이러스 68이 항암 활성을 갖는다는 문헌은 보고되지 않았다.
많은 실험과 반복적인 연구 끝에, 예상치 않게 엔테로바이러스 D68이 광범위(broad spectrum)하고 상당한 종양 세포 사멸 활성을 가지고 있음이 발견되었다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 종양을 치료하기 위한 새로운 항암 바이러스 및 그 바이러스에 기초한 종양 치료 방법을 개발하였다.
의료 용도(Medical use)
첫 번째 측면에서, 본 발명은 대상체의 종양 치료, 또는 대상체의 종양 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 엔테로바이러스(Enterovirus) D68 (EV-D68) 또는 이의 변이형(modified form), 또는 분리된 핵산 분자의 사용을 제공한다; 상기 핵산 분자는 하기에서 선택되는 서열을 포함한다:
(1) 상기 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈(genomic) 서열 또는 cDNA 서열; 및
(2) 상기 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적(complementary) 서열.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68은 야생형(wild-type) EV-D68이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68은 엔테로바이러스 D68에 감염된 객체(individual)로부터 분리된 임상 분리체(clinical isolate)일 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형은 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성(identity)을 갖는 게놈 서열을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열은 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형은 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 cDNA 서열을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형의 cDNA 서열은 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이형은 야생형 EV-D68과 비교하여 게놈에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환(substitution), 삽입(insertion), 또는 결실(deletion)을 갖는 변이 EV-D68이다.
특정 바람직한 구체예에서, 야생형 EV-D68과 비교하여, 상기 변이 EV-D68은 하기에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 변형(modifications)을 갖는다:
(1) 비번역 부위(untranslated region) (예를 들어, 5'UTR 또는 3'UTR)의 하나 또는 그 이상의 돌연변이(mutation);
(2) 하나 또는 그 이상의 외인성(exogenous) 핵산의 삽입;
(3) 하나 또는 그 이상의 내인성(endogenous) 유전자의 결실 또는 돌연변이; 및
(4) 상기 세 가지 항목의 조합.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 5' 비번역 부위 (5'UTR)의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 상기 5'UTR의 서열 전체 또는 그 일부의 치환을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 상기 5'UTR의 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site; IRES) 서열은 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열과 같은 외인성 IRES 서열로 대체된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열은 서열번호 2에 개시된다.
인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열의 사용은 일부 경우에 유리하고, 예를 들어 항암 바이러스의 상기 종양 특이성의 개선에 도움이 된다. 정상 인간 신경 세포에서, 인간 라이노바이러스 2의 내부 리보솜 유입점 서열은 숙주 RNA-결합 단백질 (DRBP76 및 NF45)에 의해 특이적으로 결합되어, elF4G와 같은 인자의 동원을 막는 것으로 이전에 보고된 바 있다 (Merrill et al. J Virol 2006,80 (7): 3147-3156; Merrill 및 Gromeier, J Virol 2006,80 (14): 6936-6942; Neplioueva et al., PLoS One 2010,5 (7): e11710); 한편, Raf/Erk1/2/MAPK와 같은 신호 경로의 지원이 부족하기 때문에, 리보솜이 인간 라이노바이러스 2의 내부 리보솜 유입점 서열에 결합하기 어려우며, 이로 인해 바이러스 단백질의 번역을 개시하는 것이 불가능하다 (Dobrikov et al., Mol Cell Biol 2011, 31(14): 2947-2959; Dobrikov et al., Mol Cell Biol 2013, 33(5): 937-946). 인간 신경교종 종양 세포에서, 인간 라이노바이러스 2의 내부 리보솜 유입점은 상기 2가지 인자에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 바이러스 단백질의 전사 및 번역을 정상적으로 개시할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에, EV-D68의 내부 리보솜 유입점 서열을 인간 라이노바이러스 2의 내부 리보솜 유입점 서열로 대체하는 것은 인간 신경교종의 치료에서 바이러스의 사용에 영향을 미치지 않으면서, 정상 인간 신경 세포에 대한 본 발명의 바이러스의 독성 및 부작용을 피하거나 감소시키는 데 유리하다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 외인성 핵산을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF, 바람직하게는 인간 GM-CSF), 또는 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv)를 인코딩한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 상기 5'UTR 및 VP4 유전자 사이에 삽입되거나, VP1 유전자 및 2A 유전자 사이에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 마이크로RNA(microRNA; miRNA)의 타겟 서열 (예를 들어, miR-133 또는 miR-206)을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 마이크로RNA의 타겟 서열은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 3' 비번역 부위 (3'UTR)에 삽입된다.
종양 세포에서 특정 마이크로RNA의 발현 수준이 정상 세포보다 현저히 낮고/거나 명백한 조직 특이성을 갖는 것으로 이전에 보고된 바 있다. 그러므로, 일부 경우에, 이러한 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함하는 본 발명의 상기 변이 EV-D68이 유리하다. 이는 정상 세포 또는 조직에서 높게 발현되는 마이크로RNA가 상응하는 타겟 서열에 의해 정상 세포 또는 조직에서 상기 변이 EV-D68의 복제를 감소시키거나 심지어 차단시켜, 상기 변이 EV-D68의 비-종양 세포에 대한 독성 부작용을 감소시키거나 피할 수 있기 때문이다. 이러한 마이크로RNA는 miR-133, miR-206, miR-1, miR-143, miR-145, miR-217, let-7, miR-15, miR-16, 등 (예를 들어, PCT 국제 출원 WO2008103755A1, US 특허 출원 US20160143969A1, 또는 Baohong Zhang et al., Developmental Biology, Volume 302, Issue 1, 1 February 2007, Pages 1-12 참조; 상기 모든 문헌이 본원에 참조로 포함된다)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 상기 기술된 바와 같이, 하나 또는 그 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4)의 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 miR-133 및/또는 miR-206의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-133의 타겟 서열은 서열번호 3에 개시된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-206의 타겟 서열은 서열번호 4에 개시된다. 일부 경우에, miR-133 및/또는 miR-206의 타겟 서열의 삽입이 유리하다. 이는 miR-133 및 miR-206이 근육 조직에서 특이적으로 발현되어, miR-133 및/또는 miR-206의 타겟 서열을 상기 변이 EV-D68로 삽입함으로써 상기 항암 바이러스의 조직 굴성(tissue tropism)을 변화시켜, 정상 근육 조직에 대한 손상을 감소시키거나 피할 수 있기 때문이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 적어도 하나의 상기에서 설명된 외인성 핵산의 삽입 및/또는 적어도 하나의 상기에서 설명된 비번역 부위의 돌연변이를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
본 발명에서, 상기 변이 EV-D68은 역유전학 기술에 의해 수득될 수 있고, 상기 역유전학 기술은 당업계, 예를 들어, Yang LS, Li SX, Liu YJ, et al Virus Res, 2015, 210: 165-168; Hou WH, Yang LS, Li SX, et al. Virus Res, 2015, 205: 41-44에 공지되어 있으며; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 전형적으로 야생형 EV-D68의 cDNA을 변형 (예를 들어, 외인성 핵산의 삽입, 내인성 유전자의 결실 또는 돌연변이, 또는 비-번역 부위에서의 돌연변이)시킴으로써 수득된다.
본 발명에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형은 대상체에서 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위하여 전처리될 수 있으며, 상기 전처리는 리피도좀(lipidosome) 또는 미셀(micelle)에 EV-D68을 패키징하고, 및/또는 숙주에서 바이러스에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역을 감소시키기 위하여 바이러스의 캡시드 단백질을 제거하기 위한 프로테아제 (예를 들어, 키모트립신 또는 트립신)를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형은 종양 세포에서 적응을 위해 연속적으로 계대될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양 세포는 당업계에 공지된 종양 세포주 또는 종양 세포 균주(strain)일 수 있고, 또는 외과적 절제 또는 종양을 갖는 객체 (예를 들어, 대상체)로부터의 임상적 분리에 의해 얻은 종양 세포일 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 또는 이의 변이형은 종양을 갖는 객체 (예를 들어, 대상체)로부터 얻은 종양 세포에서 적응을 위해 연속적으로 계대될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양 세포는 외과적 절제 또는 종양을 갖는 객체 (예를 들어, 대상체)로부터의 임상적 분리에 의해 얻는다. 특정 바람직한 구체예에서, 적응을 위한 연속 계대 방법은 다음 단계로 이루어진 복수 (예를 들어, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20)의 사이클을 포함한다: 1) 바이러스로 타겟 종양 세포를 감염시키는 단계; 2) 상청액에서 바이러스를 수득하는 단계; 및 3) 수득된 바이러스로 새로운 타겟 종양 세포를 재감염시키는 단계.
특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및 이의 변이형은 조합하여 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 제제는 하나 또는 그 이상의 EV-D68 및 이의 변이형을 포함할 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열로 이루어진다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 RNA이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 12-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 cDNA 서열, 또는 상기 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 1, 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 벡터이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열의 상보적 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 서열은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다:
(1) 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열;
(2) 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
(3) 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(4) 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 서열은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다:
(1) 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열;
(2) 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
(3) 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(4) 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
본 발명에서, 상기 분리된 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 전달될 수 있고, 예를 들어, 나출된(naked) 핵산 분자 (예를 들어, 나출된 RNA)가 직접 주사될 수 있거나, 또는 비-바이러스성 전달 시스템이 사용될 수 있다. 상기 비-바이러스성 전달 시스템은 "Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55." 및 "Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."에 상세히 설명된 물질을 포함하여, 당업계에 잘 알려진 다양한 물질로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이는 리포좀, 무기 나노입자 (금 나노입자와 같은), 폴리머 (PEG와 같은), 등과 같은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 치료학적 유효량의 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 치료학적 유효량의 상기에서 설명된 분리된 핵산 분자를 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 의료 분야에 알려진 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 약제는 정제, 환제, 현탁액, 유제, 용액, 겔, 캡슐, 분말, 과립, 엘릭시르(elixir), 로렌지(lozenge), 좌제, 또는 주사제 (주사 용액, 동결건조된 분말 포함) 등의 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약제는 주사 용액 또는 동결건조된 분말이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable) 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 더 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 안정제(stabilizer)를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 선택적으로 추가적인 약제 활성제(pharmaceutically active agent)를 더 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 추가적인 약제 활성제는 추가적인 항암 바이러스, 화학요법제(chemotherapeutic agent) 또는 면역요법제(immunotherapeutic agent)와 같이 항종양 활성을 갖는 약제이다.
본 발명에서, 상기 추가적인 항암 바이러스는 헤르페스바이러스(herpesvirus), 아데노바이러스(adenovirus), 파르보바이러스(parvovirus), 레오바이러스(reovirus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus), 수포성구내염바이러스(vesicular stomatitis virus), 홍역바이러스(measles virus) 또는 이의 어느 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 화학요법제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 미토마이신(mitomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 하이트록시우레아(hydroxyurea), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 미토산트론(mitoxantrone), 안트라사이클린(anthracyclines) (예를 들어, 에피루비신 또는 독소루비신), 에토포시드(etoposide), 백금 화합물(platinum compounds) (예를 들어, 카보플라틴 또는 시스플라틴), 탁세인(taxanes) (예를 들어, 파클리탁셀 또는 탁소텔), 또는 이의 어느 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역요법제는 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitors) (예를 들어, PD-L1/PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제), 종양-특이적 표적 항체 (예를 들어, 리툭시맙 또는 허셉틴) 또는 이의 어느 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형의 단위 용량, 예를 들어 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형의 적어도 1Х102 pfu, 적어도 1Х103 pfu, 적어도 1Х104 pfu, 1Х105 pfu, 1Х106 pfu, 적어도 1Х107 pfu, 적어도 1Х108 pfu, 적어도 1Х109 pfu, 적어도 1Х1010 pfu, 적어도 1Х1011 pfu, 적어도 1Х1012 pfu, 적어도 1Х1013 pfu, 적어도 1Х1014 pfu, 또는 적어도 1Х1016 pfu를 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형의 1Х102 pfu to 1Х1017 pfu를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 3x1010 내지 3x1014 바이러스 게놈 카피(copies)를 함유하는 핵산 분자와 같은 상기에서 설명된 분리된 핵산 분자의 단위 용량을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 추가적인 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 이 추가적인 요법은 수술, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 유전자 요법과 같은 종양에 대해 알려진 임의의 요법일 수 있다. 이 추가적인 요법은 약제의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양(hematopoietic malignancy) (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 대상체는 인간과 같은 포유류이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 첫 번째 측면에서 정의된 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 첫 번째 측면에서 정의된 상기 분리된 핵산 분자의 약제로서의 사용에 관한 것이다.
치료 방법(treatment method)
두 번째 측면에서, 본 발명은 유효량의 EV-D68 또는 이의 변이형, 또는 유효량의 분리된 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 치료 방법을 제공한다; 상기 분리된 핵산 분자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
(1) EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열; 및
(2) 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열.
특정 바람직한 구체예에서, EV-D68은 대상체에 투여된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68는 야생형 EV-D68이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68은 엔테로바이러스 D68에 감염된 객체로부터 분리된 임상 분리체일 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, EV-D68의 변이형은 대상체에 투여된다. 특정 바람직한 구체예에서, 야생형 EV-D68과 비교하여, 상기 변이형은 게놈에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 변이 EV-D68이다.
특정 바람직한 구체예에서, 야생형 EV-D68과 비교하여, 상기 변이 EV-D68은 하기에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 변형(modifications)을 갖는다:
(1) 비번역 부위(untranslated region) (예를 들어, 5'UTR 또는 3'UTR)의 하나 또는 그 이상의 돌연변이(mutation);
(2) 하나 또는 그 이상의 외인성(exogenous) 핵산의 삽입;
(3) 하나 또는 그 이상의 내인성(endogenous) 유전자의 결실 또는 돌연변이; 및
(4) 상기 세 가지 항목의 조합.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 5' 비번역 부위 (5'UTR)의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 상기 5'UTR의 서열 전체 또는 그 일부의 치환을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 상기 5'UTR의 내부 리보솜 유입점 서열은 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열과 같은 외인성 IRES 서열로 대체된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열은 서열번호 2에 개시된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 외인성 핵산을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF, 바람직하게는 인간 GM-CSF), 또는 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv)를 인코딩한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 상기 5'UTR 및 VP4 유전자 사이에 삽입되거나, VP1 유전자 및 2A 유전자 사이에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 마이크로RNA (예를 들어, miR-133 or miR-206)의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 마이크로RNA의 타겟 서열은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 3' 비번역 부위 (3'UTR)에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 하나 또는 그 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4)의 상기에서 설명된 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 miR-133 및/또는 miR-206의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-133의 타겟 서열은 서열번호 3에 개시된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-206의 타겟 서열은 서열번호 4에 개시된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 적어도 하나의 상기에서 설명된 외인성 핵산의 삽입 및/또는 적어도 하나의 상기에서 설명된 비번역 부위의 돌연변이를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및 이의 변이형은 조합하여 사용될 수 있다. 그러므로, 하나 또는 그 이상의 EV-D68 및 변이형이 대상체에 투여될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 분리된 핵산 분자는 대상체에 투여된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열로 이루어진다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 RNA이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 12-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 cDNA 서열, 또는 상기 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 1, 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 벡터이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열의 상보적 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 서열은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다:
(1) 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열;
(2) 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
(3) 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(4) 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 서열은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다:
(1) 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열;
(2) 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
(3) 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(4) 서열번호 8-1 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
본 발명에서, 상기 분리된 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 전달될 수 있고, 예를 들어, 나출된 핵산 분자 (예를 들어, 나출된 RNA)가 직접 주사될 수 있거나, 또는 비-바이러스성 전달 시스템이 사용될 수 있다. 상기 비-바이러스성 전달 시스템은 "Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55." 및 "Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."에 상세히 설명된 물질을 포함하여, 당업계에 잘 알려진 다양한 물질로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이는 리포좀, 무기 나노입자 (금 나노입자와 같은), 폴리머 (PEG와 같은), 등과 같은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 상기에서 설명된 분리된 핵산 분자는 약학적 조성물로서 제형화하여 투여될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 치료학적 유효량의 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 치료학적 유효량의 상기에서 설명된 분리된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 의료 분야에 알려진 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 현탁액, 유제, 용액, 겔, 캡슐, 분말, 과립, 엘릭시르, 로렌지, 좌제, 또는 주사제 (주사 용액, 동결건조된 분말 포함) 등의 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약제는 주사 용액 또는 동결건조된 분말이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 안정제를 포함한다.
본 발명에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 상기 분리된 핵산 분자는 임의의 적절한 투여 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 상기 분리된 핵산 분자의 투여 경로는 종양의 위치 및 종류에 의존한다. 예를 들어, 쉽게 접근 가능한 고형 종양의 경우, 상기 바이러스 또는 핵산 분자는 상기 종양으로의 직접적인 주사에 의해 선택적으로 투여되고 (예를 들어, 종양 내 주사); 조혈계 종양의 경우, 상기 바이러스 또는 핵산 분자는 정맥 내 또는 다른 혈관 내 경로로 투여되고; 체내에서 쉽게 접근할 수 없는 종양 (예를 들어, 전이)의 경우, 상기 바이러스 또는 핵산 분자는 전신에 걸쳐 종양에 도달할 수 있도록 체계적으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 정맥 또는 근육 주사). 선택적으로, 본 발명의 상기 바이러스 또는 핵산 분자는 피하(subcutaneous), 복강 내(intraperitoneal), 척수강 내(intrathecal) (예를 들어, 뇌 종양을 위한), 국소 (예를 들어, 흑색종을 위한), 경구 (예를 들어, 구강암 또는 식도암을 위한), 비강 또는 흡입 스프레이 (예를 들어, 폐암을 위한) 경로 등을 통해 투여될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 상기에서 설명된 분리된 핵산은 피내(intradermal), 피하, 근육 내(intramuscular), 정맥 내(intravenous), 경구 경로 등을 통하여 투여될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 항종양 활성을 갖는 추가적인 약학적 활성제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 이 추가적인 약학적 활성제는 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 분리된 핵산 분자의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 추가적인 약제 활성제는 추가적인 항암 바이러스, 화학요법제 또는 면역요법제를 포함한다. 본 발명에서, 상기 추가적인 항암 바이러스는 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 수포성구내염바이러스, 홍역바이러스 또는 이의 어느 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 화학요법제는 5-플루오로우라실, 미토마이신, 메토트렉세이트, 하이트록시우레아, 사이클로포스파미드, 다카바진, 미토산트론, 안트라사이클린 (예를 들어, 에피루비신 또는 독소루비신), 에토포시드, 백금 화합물 (예를 들어, 카보플라틴 또는 시스플라틴), 탁세인 (예를 들어, 파클리탁셀 또는 탁소텔), 또는 이의 어느 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역요법제는 면역 관문 억제제 (예를 들어, PD-L1/PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제), 종양-특이적 표적 항체 (예를 들어, 리툭시맙 또는 허셉틴) 또는 이의 어느 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형은 상기 대상체 체중의 1 내지 1Х1015 pfu/kg의 임의의 양으로 투여될 수 있다, 예를 들어, 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형은 대상체 체중의 적어도 1Х103 pfu/kg, 적어도 1Х104 pfu/kg, 1Х105 pfu/kg, 1Х106 pfu/kg, 적어도 1Х107 pfu/kg, 적어도 1Х108 pfu/kg, 적어도 1Х109 pfu/kg, 적어도 1Х1010 pfu/kg, 적어도 1Х1011 pfu/kg, 또는 적어도 1Х1012 pfu/kg의 양으로 투여된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 분리된 핵산 분자는 대상체 체중의 3Х1010 to 3Х1014 바이러스 게놈 카피/kg의 임의의 양으로 투여될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명된 EV-D68 및/또는 이의 변이형 또는 상기 분리된 핵산 분자는 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일에 1회 또는 1주에 1회 투여될 수 있고, 선택적으로 상기 투여 요법은 매주 또는 매월 적절하게 반복될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 추가적인 요법을 투여하는 단계를 더 포함한다. 이 추가적인 요법은 수술, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 유전자 요법과 같은 종양에 대해 알려진 임의의 요법일 수 있다. 이 추가적인 요법은 상기에서 설명된 방법의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 대상체는 인간과 같은 포유류이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약학적 조성물(pharmaceutical composition)
세 번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 또는 두 번째 측면에서 정의된 EV-D68 및/또는 이의 변이형, 또는 첫 번째 또는 두 번째 측면에서 정의된 분리된 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 첫 번째 또는 두 번째 측면에서 정의된 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형은 조합하여 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형의 단위 용량, 예를 들어 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형의 적어도 1Х102 pfu, 적어도 1Х103 pfu, 적어도 1Х104 pfu, 1Х105 pfu, 1Х106 pfu, 적어도 1Х107 pfu, 적어도 1Х108 pfu, 적어도 1Х109 pfu, 적어도 1Х1010 pfu, 적어도 1Х1011 pfu, 적어도 1Х1012 pfu, 적어도 1Х1013 pfu, 적어도 1Х1014 pfu, 또는 적어도 1Х1016 pfu를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 EV-D68 및/또는 이의 변이형의 1Х102 pfu 내지 1Х1017 pfu를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 첫 번째 측면 또는 두 번째 측면에서 정의된 분리된 핵산 분자를 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 조합하여 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 상기 분리된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 분리된 핵산 분자의 단위 용량, 예를 들어 상기 분리된 핵산 분자의 3Х1010 내지 3Х1014 바이러스 게놈 카피를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 의료 분야에 알려진 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 현탁액, 유제, 용액, 겔, 캡슐, 분말, 과립, 엘릭시르, 로렌지, 좌제, 또는 주사제 (주사 용액, 동결건조된 분말 포함) 등의 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약제는 주사 용액 또는 동결건조된 분말이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 안정제를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물 선택적으로 추가적인 약제 활성제를 더 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 추가적인 약제 활성제는 추가적인 항암 바이러스, 화학요법제 또는 면역요법제와 같이 항종양 활성을 갖는 약제이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 대상체에서 종양을 치료하기 위해 사용된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 대상체는 인간과 같은 포유류이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
변형된 EV-D68(변이 EV-D68)
네 번째 측면에서, 본 발명은 야생형 EV-D68과 비교하여 게놈에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 변이 EV-D68을 제공한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 12에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 1에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 야생형 EV-D68과 비교하여, 상기 변이 EV-D68은 하기에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 변형을 갖는다:
(1) 비번역 부위 (예를 들어, 5'UTR 또는 3'UTR)의 하나 또는 그 이상의 돌연변이;
(2) 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산의 삽입;
(3) 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자의 결실 또는 돌연변이; 및
(4) 상기 세 가지 항목의 조합.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 상기 5' 비번역 부위 (5'UTR)의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 5'UTR 서열 전체 또는 그 일부의 치환을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 상기 5'UTR의 내부 리보솜 유입점 서열은 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열과 같은 외인성 IRES 서열로 대체된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열은 서열번호 2에 개시된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 외인성 핵산을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF, 바람직하게는 인간 GM-CSF), 또는 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv)를 인코딩한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 상기 5'UTR 및 VP4 유전자 사이에 삽입되거나, VP1 유전자 및 2A 유전자 사이에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 마이크로RNA (예를 들어, miR-133 또는 miR-206)를 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 마이크로RNA의 타겟 서열은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 3' 비번역 부위 (3'UTR)에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 하나 또는 그 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4)의 상기에서 설명된 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 miR-133 및/또는 miR-206의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-133의 타겟 서열은 서열번호 3에 개시된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-206의 타겟 서열은 서열번호 4에 개시된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 적어도 하나의 상기에서 설명된 외인성 핵산의 삽입 및/또는 적어도 하나의 상기에서 설명된 비번역 부위의 돌연변이를 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
본 발명에서, 상기 변이 EV-D68은 역유전학 기술에 의해 수득될 수 있고, 상기 역유전학 기술은 당업계, 예를 들어, Yang LS, Li SX, Liu YJ, et al Virus Res, 2015, 210: 165-168; Hou WH, Yang LS, Li SX, et al. Virus Res, 2015, 205: 41-44에 공지되어 있으며; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 전형적으로 야생형 EV-D68의 cDNA을 변형 (예를 들어, 외인성 핵산의 삽입, 내인성 유전자의 결실 또는 돌연변이, 또는 비-번역 부위에서의 돌연변이)시킴으로써 수득된다.
본 발명에서, 상기 변이 EV-D68은 대상체에서 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위하여 전처리될 수 있으며, 상기 전처리는 리피도좀 또는 미셀에 EV-D68을 패키징하고, 및/또는 숙주에서 바이러스에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역을 감소시키기 위하여 바이러스의 캡시드 단백질을 제거하기 위한 프로테아제 (예를 들어, 키모트립신 또는 트립신)를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 변이 EV-D68은 종양 세포에서 적응을 위해 연속적으로 계대될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양 세포는 당업계에 공지된 종양 세포주 또는 종양 세포 균주일 수 있고, 또는 외과적 절제 또는 종양을 갖는 객체 (예를 들어, 대상체)로부터의 임상적 분리에 의해 얻은 종양 세포일 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 종양을 갖는 객체 (예를 들어, 대상체)로부터 얻은 종양 세포에서 적응을 위해 연속적으로 계대될 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양 세포는 외과적 절제 또는 종양을 갖는 객체 (예를 들어, 대상체)로부터의 임상적 분리에 의해 얻는다. 특정 바람직한 구체예에서, 적응을 위한 연속 계대 방법은 다음 단계로 이루어진 복수 (예를 들어, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20)의 사이클을 포함한다: 1) 바이러스로 타겟 종양 세포를 감염시키는 단계; 2) 상청액에서 바이러스를 수득하는 단계; 및 3) 수득된 바이러스로 새로운 타겟 종양 세포를 재감염시키는 단계.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 대상체에서 종양을 치료하기 위해 사용되거나, 또는 대상체에서 종양을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 사용된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 대상체는 인간과 같은 포유류이다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 변이 EV-D68은 야생형 EV-D68와 비교하여 상기 5'UTR에서 인간 라이노바이러스 2 (HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열로 대체된 내부 리보솜 유입점 서열을 갖는다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 외인성 핵산을 더 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF, 바람직하게는 인간 GM-CSF), 또는 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv)를 인코딩한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 상기 5'UTR 및 VP4 유전자 사이에 삽입되거나, VP1 유전자 및 2A 유전자 사이에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 마이크로RNA의 타겟 서열 (예를 들어, miR-133 또는 miR-206)을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 마이크로RNA의 타겟 서열은 상기 변이 EV-D68의 게놈의 3' 비번역 부위 (3'UTR)에 삽입된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 하나 또는 그 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4)의 상기에서 설명된 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 외인성 핵산은 miR-133 및/또는 miR-206의 타겟 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-133의 타겟 서열은 서열번호 3에 개시된다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 miR-206의 타겟 서열은 서열번호 4에 개시된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 적어도 하나의 상기에서 설명된 외인성 핵산의 삽입을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 변이 EV-D68은 대상체에서 종양을 치료하기 위해 사용된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 위암, 자궁내막암, 자궁경부암, 및 갑상선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 하기에서 선택되는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:
(1) 상기 네 번째 측면에 따른 상기 변이 EV-D68의 상기 게놈 서열 또는 cDNA 서열; 및
(2) 상기 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 변이 EV-D68의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열로 이루어진다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 변이 EV-D68의 게놈 서열을 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 RNA이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 12-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열 또는 cDNA 서열, 또는 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 EV-D68 또는 이의 변이형의 cDNA 서열, 또는 the cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 1, 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 변이 EV-D68의 게놈 서열의 상보적 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 서열은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다:
(1) 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(2) 서열번호 13-16 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 상기에서 설명된 변이 EV-D68의 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 서열은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다:
(1) 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(2) 서열번호 8-11 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 13에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)이다.
본 발명에서, 상기 분리된 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 전달될 수 있고, 예를 들어, 나출된 핵산 분자 (예를 들어, 나출된 RNA)가 직접 주사될 수 있거나, 또는 비-바이러스성 전달 시스템이 사용될 수 있다. 상기 비-바이러스성 전달 시스템은 "Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55." 및 "Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."에 상세히 설명된 물질을 포함하여, 당업계에 잘 알려진 다양한 물질로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이는 리포좀, 무기 나노입자 (금 나노입자와 같은), 폴리머 (PEG와 같은), 등과 같은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 대상체에서 종양을 치료하기 위해 사용되거나, 또는 대상체에서 종양을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 사용된다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 구체예에서, 상기 대상체는 인간과 같은 포유류이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기 네 번째 측면에 따른 상기 변이 EV-D68을 포함하는 약학적 조성물, 또는 상기 다섯 번째 측면에 따른 상기 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 다섯 번째 측면에 따른 상기 변이 EV-D68의 사용, 또는 다섯 번째 측면에 따른 대상체에서 종양의 치료 또는 대상체에서 종양의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 상기 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 네 번째 측면에 따른 유효량의 변이 EV-D68을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양 치료 방법, 또는 다섯 번째 측면에 따른 상기 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
용어의 정의
본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 있어 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본 발명에 사용된 세포 배양, 생화학, 세포 생물학, 핵산 화학 등의 실험실 절차는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 단계이다. 한편, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 용어의 정의 및 설명이 아래에 제공된다.
본 발명에서 사용된, 용어 "엔테로바이러스 D68 (EV-D68)"은 피코르나바이러스 과의 엔테로바이러스 속의 엔테로바이러스 D의 한 종류를 의미하며, 이의 게놈은 5' 비-코딩 부위 (5'UTR), 개방형 해독틀(open reading frame; ORF), 3' 비-코딩 부위 (3'UTR), 및 폴리(A) 꼬리로 이루어진 단일 가닥 양의 방향 RNA이다; 여기서 ORF는 전구체 폴리단백질을 인코딩하며, 이는 프로테아제에 의해 가수분해 및 절단되어 구조 단백질 VP1 내지 VP4 및 비-구조 단백질 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D를 생성할 수 있다. 본 발명을 보다 명확하게 설명하기 위해, 상기 단백질에 해당하는 상기 EV-D68 게놈의 상기 핵산 서열을 각각 VP1 유전자, VP2 유전자, VP3 유전자, VP4 유전자, 2A 유전자, 2B 유전자, 2C 유전자, 3A 유전자, 3B 유전자, 3C 유전자, 및 3D 유전자라고 한다. 본 발명에서, 상기 "엔테로바이러스 D68 (EV-D68)"라는 표현은 야생형 EV-D68을 의미하며, 이는 본질적으로 공급원으로부터 분리될 수 있고 의도적으로 인공적으로 변형되지 않았으며, 이의 예는 프로토타입 균주 AY426531 (CA62-1) 및 AY426488 (CA62-3), 및 다양한 임상 분리체 (예를 들어, 본 발명의 실시예 1에 설명된 임상 분리체)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 야생형 EV-D68의 상기 게놈 서열 또는 cDNA 서열은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고 다양한 공개 데이터베이스 (예를 들어, GenBank 데이터베이스, 수탁번호 KM881710)에서 찾을 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 바이러스의 "변이형(modified form)"은 야생형 바이러스의 원하는 활성 (예를 들어, 항암 활성)을 유지하는 야생형 바이러스를 변형시켜 얻은 변형된 바이러스를 의미한다. 본 발명에서, EV-D68의 "변이형"은 변이 EV-D68 바이러스, 야생형 EV-D68과 비교하여 EV-D68의 항암 활성을 유지하면서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 게놈 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된, 용어 "항암 바이러스(oncolytic virus)"는 종양 세포를 감염시켜 종양 세포에서 복제함으로써 종양 세포의 사멸, 용해 또는 종양 세포의 성장을 방해할 수 있는 바이러스를 의미한다. 바람직하게는, 상기 바이러스는 비-종양 세포에 대한 독성 효과를 최소화한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "종양-특이적(tumor-specific)"은 종양 세포 내에서 생물학적 기능 또는 활성을 선택적으로 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에서, 용어 "종양 특이성(tumor specificity)"이 바이러스의 사멸 선택성(killing selectivity)을 설명하기 위해 사용될 때, 이는 바이러스가 비-종양 세포를 사멸 또는 실질적으로 사멸시키지 않으면서 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있거나, 또는 바이러스는 비-종양 세포를 사멸시키는 것보다 종양 세포를 사멸시키는 데 더욱 효과적임을 의미한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "항암 활성(oncolytic activity)"은 주로 종양 사멸 활성을 포함한다. 바이러스의 항암 활성을 기술할 때, 상기 바이러스의 항암 활성은 전형적으로 바이러스의 종양 세포 감염 능력, 종양 세포 감염 능력, 및/또는 종양 세포 사멸 능력과 같은 지표에 의해 측정될 수 있다. 상기 바이러스의 항암 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포를 감염시키는 바이러스의 능력은 주어진 백분율 (예를 들어, 세포의 50%)의 종양 세포를 감염시키는 데 필요한 바이러스 용량(viral dose)을 측정하여 평가될 수 있고; 종양 세포 복제 능력은 종양 세포에서 바이러스의 성장을 측정하여 평가될 수 있고; 종양 세포 사멸 능력은 세포변성 효과를 모니터링하거나 종양 세포 활성을 측정하여 평가될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "EV-D68의 cDNA 서열"은 바이러스 게놈 RNA 서열의 DNA 형태를 의미하며, 이는 RNA 서열의 리보뉴클레오타이드가 상응하는 데옥시리보뉴클레오타이드에 의해 대체, 예를 들어, 우라실 리보뉴클레오타이드 (UMP)가 티민 데옥시리보뉴클레오타이드 (dTMP)로 대체된다는 점에서만 RNA 서열과 상이하다.
본 발명에서 사용된, 용어 "외인성 핵산(exogenous nucleic acid)"은 원래의 서열과 다른 인공적으로 도입된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 외인성 핵산은 바이러스 게놈에서 발견되지 않는 임의의 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 본 발명에서, 외인성 핵산은 최대 1500, 예를 들어 최대 1200, 및 최대 1000 뉴클레오타이드로 구성되는 것이 특히 바람직하다. 일부 경우에, 바람직하게는, 상기 외인성 핵산은 사이토 카인, 또는 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드와 같은 항종양 사멸 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩하거나; 또는, 상기 외인성 핵산은 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함한다. 본 발명에서, 상기 마이크로RNA는 종양 세포에서의 발현 수준이 정상 세포에서의 발현 수준보다 현저히 낮고/거나 명백한 조직 특이성을 갖는 마이크로RNA인 것이 바람직하다. 마이크로RNA의 예는 간 조직에서 특이적으로 발현되는 miR-122, miR-192, miR-483 등; 심장에서 특이적으로 발현되는 miR-1, miR-133a/b, miR-208 등; 신장 조직에서 특이적으로 발현되는 miR-192, miR-196a/b, miR-204, miR-215 등; 근육 조직에서 특이적으로 발현되는 miR-133a/b, miR-206 등; 뇌 조직에서 특이적으로 발현되는 miR-124a, miR-125a/b, miR-128a/b, miR-138 등; 및 간 종양 조직에서 저-발현되는 miR-34, miR-122a, miR-26a; 신장 종양 조직에서 저-발현되는 miR-34; 방광 종양 조직에서 저-발현되는 miR-143, miR-133a/b; 폐 종양 조직에서 저-발현되는 miR-Let-7, miR-29; 등 (예를 들어, Ruiz AJ 및 Russell S J. MicroRNAs and oncolytic viruses. [J]. Curr Opin Virol, 2015, 13: 40-48; 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 변이 EV-D68이 상기에서 설명된 마이크로RNA의 타겟 서열을 포함하는 경우, 이는 마이크로RNA가 고도로 발현되거나 특이적으로 발현되는 세포/조직에서 마이크로RNA에 의해 조절되어 상기 항암 바이러스의 복제가 약화되고 그 사멸 활성을 잃게 되며, 상기 항암 바이러스는 마이크로RNA가 저-발현되거나 심지어 발현되지 않는 종양 세포/조직에서는 정상적으로 복제되어 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "사이토카인(cytokine)"은 당업자에게 잘 알려진 의미를 갖는다. 그러나, 본 발명에서, 본 발명의 상기 항암 바이러스가 종양 치료에 사용될 때, 상기 사이토카인은 종양 치료에 사용될 수 있는 사이토카인인 것이 특히 바람직하다. 사이토카인의 예는 인터류킨 (예를 들어, IL-2, IL-12, 및 IL-15), 인터페론 (예를 들어, IFNα, IFNβ, IFNγ), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNFα), 및 콜로니-자극 인자 (예를 들어, GM-CSF), 및 이의 임의의 조합 (예를 들어, Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J]. Oncotarget, 2015, 6 (23): 19346-19347 참조)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된, 용어 "항종양 단백질 또는 폴리펩타이드(antitumor protein or polypeptide)"는 항종양(antineoplastic) 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미하며, 하기 내용을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: (1) 세포 증식을 억제하거나 아포토시스를 유도할 수 있는, 세포에 독성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드로, 예를 들어 티미딘 키나아제 TK(thymidine kinase TK; TK/GCV), TRAIL, 및 FasL (예를 들어, Candolfi M, King GD, Muhammad AG, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM) [J]. FASEB J, 2008, 22: 1077.13 참조)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다; (2) 면역요법 효과를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드로, 예를 들어 항-CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4), 항-PD-1(programmed death receptor 1), 및 항-PDL-1(programmed death ligand 1)에 대한 scFv(single chain antibody)(예를 들어, Nolan E, Savas P, Policheni AN, et al. Combined immune checkpoint blockade as a therapeutic strategy for BRCA1-mutated breast cancer [J]. Science Trans Med, 2017, 9: eaal 4922; which is incorporated herein by reference in its entirety 참조)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다; (3) 종양 혈관형성을 억제하는 단백질 또는 폴리펩타이드로, 예를 들어 항-VEGF(vascular endothelial growth factor)에 대한 scFv, VEGF-유래 폴리펩타이드 (예를 들어, D(LPR), KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK, 등) 및 ATN-161 (예를 들어, Rosca EV, Koskimaki JE, Rivera CG, et al. anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12 (8): 1101-1116; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된, 용어 "scFv"는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄(chain)를 의미하며, 상기 VL 및 VH는 링커(linker)로 연결될 수 있다 (예를 들어, Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); 및 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, No. Volume 113, edited by Roseburg 및 Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참조). 이러한 scFv 분자는 일반적인 구조: NH2-VL-linker-VH-COOH 또는 NH2-VH-linker-VL-COOH를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "동일성(identity)"은 두(two) 폴리펩타이드 사이 또는 두 핵산 사이의 일치 정도를 의미한다. 비교를 위한 두 서열이 특정 부위에서 동일한 모노머 서브-유닛의 염기 또는 아미노산을 갖는 경우 (예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각이 특정 부위에서 아데닌을 갖거나, 또는 두 단백질/폴리펩타이드 각각이 특정 부위에서 리신을 갖는 경우), 상기 두 분자는 그 부위에서 동일하다. 상기 두 서열 사이의 동일성 백분율은 비교(comparison) x 100의 부위의 총 수에 대하여 두 서열에 의해 공유된 동일한 부위의 수의 함수이다. 예를 들어, 만약 두 서열의 10 부위 중 6 부위가 일치하는 경우, 이 두 서열은 60%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 동일성을 공유한다 (6 부위 중 3 부위가 일치). 일반적으로, 두 서열의 비교는 최대 동일성을 생성하는 방식으로 수행된다. 이러한 정렬은 예를 들어 Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)의 방법에 기초한 Align 프로그램 (DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율 또한 12 갭 길이 패널티, 4 갭 패널티를 갖는 PAM120 중량 잔기 테이블을 사용하여 ALIGN 프로그램 (version 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 길이 중량을 갖는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "벡터(vector)"는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클(vehicle)을 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 가능하게 할 때, 상기 벡터는 발현 벡터를 의미한다. 벡터는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection)에 의해 숙주 세포에 삽입될 수 있으므로, 벡터에 의해 운반되는 유전적 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 상기 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 플라스미드(plasmids); 파지미드(phagemids); 코스미드(cosmids); 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체(artificial chromosomes); -파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지(bacteriophages) 및 동물 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 (단순포진바이러스와 같은), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스, 및 파포바바이러스 (SV40과 같은)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 발현을 조절하는 다양한 요소, 예들 들어 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 요소, 및 리포터 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 벡터는 복제 개시 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site; IRES)"은 5' 캡 구조를 필요로하지 않고 번역을 개시할 수 있는 메신저 RNA (mRNA)에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. IRES는 일반적으로 상기 5' 비번역 부위 (5'UTR)에 위치할 수 있으나, 상기 mRNA의 다른 곳에도 위치할 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "인간 라이노바이러스 2 (HRV2)"는 피코르나바이러스 과의 바이러스를 의미하며, 이의 게놈 또는 cDNA 서열은 당업계에 널리 공지되어 있고 다양한 공개 데이터베이스 (예를 들어, GenBank 데이터베이스, 수탁번호 X02316.1)에서 찾을 수 있다.
본 발명에서 사용된, "EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열을 포함하는 핵산 분자" 또는 "EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열을 포함하는 핵산 분자"라는 표현은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미이며, 즉 핵산 분자가 DNA인 경우, 핵산 분자는 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열을 포함하고; 핵산 분자가 RNA인 경우, 핵산 분자는 EV-D68 또는 이의 변이형의 게놈 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"는 당업계에서 잘 알려진 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조) 약리학적 및/또는 생리학적으로 대상체 및 활성 성분과 양립 가능한 담체 및/또는 부형제를 의미하며, pH 조절제, 계면활성제, 이온 강도 증가제, 삼투압 유지제, 흡수 지연제, 희석제, 보조제, 보존제, 안정제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, pH 조절제는 인산완충생리식염수를 초함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 계면활성제는 Tween-80과 같은 양이온성, 음이온성 또는 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이온 강도 증가제는 염화나트륨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 삼투압 유지제는 당, NaCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 흡수 지연제는 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 희석제는 물, 친수성 버퍼 (완충 식염수와 같은), 알코올 및 폴리올 (글리세롤과 같은) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보조제는 알루미늄 보조제 (수산화 알루미늄과 같은), 프로이드 보조제 (완전한 프로이드 보조제와 같은) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보존제는 티메로살, 2-페녹시에탄올, 파라벤, 트리클로로-t-뷰탄올, 페놀, 소르브산 등 다양한 항균제 및 항진균제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 안정제는 당업자에게 있어 일반적으로 이해되는 의미를 가지며, 이는 약물에서 활성 성분의 원하는 활성 (항암 활성과 같은)을 안정화시킬 수 있고, 글루타민산나트륨, 젤라틴, SPGA, 당 (예를 들어, 솔비톨, 만니톨, 녹말, 수크로스, 락토오스, 덱스트란, 또는 글루코스), 아미노산 (예를 들어, 글루탐산, 글리신), 단백질 (예를 들어, 건조 유청, 알부민, 또는 카세인) 또는 이의 분해산물 (예를 들어, 락트알부인 가수분해물)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된, 용어 "치료하는(treating)"은 질병 (예를 들어, 종양)을 치료하거나 또는 큐어링(curing)하는 것, 질병 (예를 들어, 종양)의 증상의 시작(발병)을 지연시키거나, 및/또는 질병 (예를 들어, 종양)의 발달을 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "유효량(effective amount)"은 의도된 목적을 효과적으로 달성할 수 있는 양을 의미한다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 질병 (예를 들어, 종양)을 치료하거나 큐어링하고, 질병 (예를 들어, 종양)의 증상의 시작(발병)을 지연시키고, 및/또는 질병 (예를 들어, 종양)의 발달을 지연시키는데 효과적이고 충분한 양일 수 있다. 이러한 유효량은 당업자 또는 의사에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 의도된 목적 (치료와 같은), 일반적인 건강 상태, 나이, 성별, 대상체의 체중, 중증도 합병증, 치료될 질환의 투여 경로와 관련될 수 있다. 이러한 유효량은 당업자의 능력에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "대상체(subject)"는 인간과 같은, 영장류와 같은 포유류를 의미한다. 특정 구체예에서, 상기 대상체 (예를 들어, 인간)는 종양을 갖거나, 또는 종양을 가질 위험이 있다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명의 기술적 해결은 적어도 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다:
본 발명자들은 엔테로바이러스 D68 (EV-D68)이 광범위한 종양-사멸 활성을 갖는다는 것을 처음으로 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 광범위한 종양-사멸 활성 및 높은 종양 특이성을 갖고, 특히 조혈계 종양 (림프종 또는 백혈병과 같은)에 대한 매우 높은 사멸 효과를 가짐으로써, 종양의 치료를 위해 단독으로 사용될 수 있고, 전통적인 종양 치료의 보충 방법으로 사용될 수 있으며, 또는 다른 치료 방법이 없는 치료 방법으로서도 사용될 수 있는 EV-D68-기반 항암 바이러스를 더 제공한다.
본 발명의 EV-D68 또는 이의 변이형은 정상 세포에 거의 영향을 미치지 않고, 대상체 (예를 들어, 인간)에서 바이러스에 대한 면역원성 반응을 유도하지 않으므로, 대상체 (예를 들어, 인간)에 안전하게 투여될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 상기 EV-D68 또는 이의 변이형은 큰 임상적 가치를 갖는다.
본 발명의 구체예는 도면 및 실시예를 참조하여 아래에서 상세하게 설명될 것이다. 그러나, 당업자는 하기 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라, 본 발명을 설명하기 위해 사용된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 양태는 다음의 상세한 설명 및 바람직한 실시예로부터 당업자에 명백할 것이다.
도 1은 실시예 2에 따른 인간 제대정맥 내피세포주 HUVEC, 인간 식도암 세포주 TE-1, 인간 갑상선암 세포주 SW-579 및 TT에 대한 야생형 EV-D68의 인 비트로 사멸 테스트 현미경 사진으로, MOCK는 바이러스에 감염되지 않은 세포를 나타낸다. 상기 결과는 EV-D68이 감염다중도(multiplicity of infection; MOI) 10의 감염 72시간 후, 인간 종양 세포주 TE-1, SW-579, 및 TT에 대한 상당한 항암 효과를 나타내었으나, 인간 정상 세포 HUVEC에 대해서는 효과를 나타내지 않은 것을 보여준다.
도 2는 실시예 2에 따른 인간 간암 세포주 HepG2, SMMC7721, BEL7404, BEL7402, 및 Huh7, 인간 자궁경부암 세포주 Hela 및 Caski, 인간 폐암 세포주 NCI-H1299 및 A549, 인간 포피 섬유아세포 세포주 HFF-1, 인간 배아 신장 세포주 HEK-293, 및 분화된 인간 간 전구세포주 HepaRG에 대한 야생형 EV-D68의 인 비트로 사멸 테스트 크리스탈 바이올렛 염색 사진으로, MOCK는 바이러스에 감염되지 않은 세포를 나타낸다. 상기 결과는 EV-D68이 감염다중도 10, 1, 및 0.1의 감염 72시간 후, 인간 종양 세포주 HepG2, SMMC7721, BEL7404, BEL7402, Huh7, Hela, Caski, NCI-H1299 및 A549에 대한 상당한 항암 효과를 나타내었으나, 인간 정상 세포 HFF-1, HEK-293 및 분화된 HepaRG에 대해서는 효과를 나타내지 않은 것을 보여준다.
도 3은 실시예 2에 따른 인 비트로 전사 방법에 의해 수득된 동일 집단(batch)의 야생형 EV-D68 바이러스 게놈 RNA 4종 샘플의 전기영동 사진이다.
도 4는 실시예 2에 따른 인간 자궁경부암 세포주 Hela에 대한 야생형 EV-D68의 사멸 효과이다. 상기 결과는 Hela 세포가 EV-D68 게놈 RNA로 형질감염된 24 시간 후 명백한 CPE를 나타냈고, 48 시간 내게 거의 모든 세포가 용해되었음을 보여준다.
도 5A 내지 5C는 실시예 3에 따른 인간 자궁경부암 세포주 Hela (A), 인간 신경교종 세포주 U118-MG (B), 및 인간 림프종 세포주 Raji (C)에 대한 야생형 EV-D68의 인 비보 항종양 실험 결과이다. 상기 결과는, 챌린지(challenge) 실험 그룹에서, EV-D68의 종양 덩어리 당 106 TCID50가 매 3일마다 종양 내 주사되었음을 보여준다. 총 5회 처리 후, SCID 마우스에서 Hela, U118-MG, 또는 Raji 세포의 피하 접종에 의해 형성된 종양의 성장이 현저히 느려지다 중단되었으며, 심지어 종양이 용해되거나 사라졌다. 반면, 항암 바이러스가 처리되지 않은 상기 음성 그룹 (CTRL)의 종양은 정상 성장을 유지하였고, 그들의 종양 부피는 챌린지 그룹의 종양 부피보다 유의하게 더 컸다.
도 6은 실시예 4에 따른 BALB/c 마우스에서의 EV-D68-WT의 독성 검출 결과이다. 도 6A는 복강 내 주사에 의해 상이한 용량 (103, 104, 105, 106, 및 107 TCID50/마우스)의 EV-D68로 챌린지 후의 1일령 BALB/c 마우스의 생존율 및 건강 점수를 나타내고; 도 6B는 복강 내 주사에 의해 극 고용량 (107 TCID50/마우스)으로 챌린지된 상이한 연령 (1일령, 2일령, 3일령, 7일령 및 14일령)의 BALB/c 마우스의 생존율 및 건강 점수를 나타낸다. BALB/c 마우스에 대한 EV-D68의 전체 독성은 비교적 약하였고, 단지 고용량만이 1일령 내지 3일령 BALB/c 마우스의 사망을 야기하고, 4- 또는 그 이상 일령 BALB/c 마우스에는 영향을 미치지 않아, 인 비보에서 양호한 안전성을 나타냄을 보여준다.
[서열 정보]
본 발명과 관련된 서열의 일부 정보는 하기 표 1에 제공된다.
표 1: 서열 설명
서열번호 설명
1 야생형 EV-D68 (EV-D68-WT)의 cDNA 서열
2 인간 라이노바이러스 2 (HRV2) 내부 리보솜 유입점의 RNA 서열
3 miR-133 타겟 서열의 RNA 서열
4 miR-206 타겟 서열의 RNA 서열
5 miR-133 타겟 서열 및 miR-206 타겟 서열의 텐덤 서열의 RNA 서열
6 인간 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF) 유전자의 DNA 서열
7 항-PD-1 scFv (anti-human programmed death receptor 1 single chain antibody)의 DNA 서열
8 EV-D68 (EV-D68-HRV2) 변이형의 cDNA 서열
9 EV-D68 (EV-D68-miR133&206T) 변이형의 cDNA 서열
10 EV-D68 (EV-D68-GM-CSF) 변이형의 cDNA 서열
11 EV-D68 (EV-D68-anti-PD1) 변이형의 cDNA 서열
12 야생형 EV-D68 (EV-D68-WT)의 게놈 서열
13 EV-D68 (EV-D68-HRV2) 변이형의 게놈 서열
14 EV-D68 (EV-D68-miR133 & 206T) 변이형의 게놈 서열
15 EV-D68 (EV-D68-GM-CSF) 변이형의 게놈 서열
16 EV-D68 (EV-D68-anti-PD1) 변이형의 게놈 서열
17 miR-133 타겟 서열의 DNA 서열
18 miR-206 타겟 서열의 DNA 서열
19 miR-133 타겟 서열 및 miR-206 타겟 서열의 텐덤 서열의 DNA 서열
20 인간 라이노바이러스 2 (HRV2) 내부 리보솜 유입점 서열의 DNA 서열
본 발명은 (본 발명을 제한하기보다) 본 발명을 예시하고자 하는 하기 실시예를 참조하여 설명된다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 분자 생물학 실험 방법 및 면역분석은 실질적으로 "J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995"에 기재된 방법을 참조하여 수행되었으며; 제한 효소는 제조사가 권장하는 조건 하에서 사용되었다. 실시예에서 특정 조건을 나타내지 않은 경우, 통상적인 조건 또는 제조사가 권장하는 조건이 사용되었다. 사용된 시약 또는 기기의 제조사가 특정되지 않은 경우, 모두 시판되는 기존 제품이다. 당업자는 실시예가 실험예로서 본 발명을 설명하지만, 본 발명에 의해 청구된 보호범위를 제한하려는 것은 아님을 이해할 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
실시예 1: EV-D68 및 이의 변이형의 획득(Obtainment) 및 제조(preparation)
1.1 환자 임상 샘플로부터 엔테로바이러스 EV-D68의 분리
(1) 환자의 인후 면봉(throat swab)은 시아먼 시 질병 통제 및 예방 센터(Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City, China)로부터 얻었다; 아프리카 초록 원숭이(African green monkey) 신장 세포 (Vero cells; ATCC® Number: CCL-81TM)는 시아먼 대학(Xiamen University, China)의 국립 감염병 진단(법) 및 백신 개발 협회(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases)에서 관리되었고, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 MEM 배지에서 배양되었다.
(2) 샘플 처리: 환자의 인후 면봉은 샘플 보존 용액에서 충분히 교반하여 면봉에 부착된 바이러스 및 바이러스-포함 세포를 세척한 다음, 샘플 보존 용액을 4000 rpm 및 4 ℃에서 30분 동안 고속 원심분리하였다;
(3) 접종(Inoculation) 및 관찰(observation):
A) Vero 세포는 1 Х 105 세포/웰로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 성장 배지 (10% 소태아혈청, 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 MEM 배지)를 흡인(aspirated)하고, 1 mL의 유지 배지 (2% 송아지태아혈청(fetal calf serum), 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 MEM 배지)를 각 웰에 첨가하였다. 음성 대조군 웰을 제외한 각 웰에 50 μL의 샘플 상청액을 접종하고, 37 ℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 배양하였다.
B) 세포를 1주일 동안 매일 현미경으로 관찰하였고, 접종된 웰에서의 특정 세포변성 효과의 발생을 기록하였다.
C) 7일 이내에 접종된 웰의 세포에 엔테로바이러스-특이적 세포변성 효과가 나타난 경우, 세포 및 상청액을 수집하여 -80 ℃에서 동결시켰으며; 7일 이후에 CPE가 나타나지 않은 경우, 세포를 블라인드(blind) 계대배양 시켰다.
D) 6 블라인드 계대배양 내에 CPE가 나타난 경우, 세포 및 상청액을 수집하여 -80 ℃에서 동결시켰으며; 6 블라인드 계대배양 이후에 CPE가 나타나지 않은 경우, 세포를 음성(negative)으로 결정하였다.
(4) 바이러스의 분리(Isolation) 및 클로닝(cloning):
임상 샘플로부터 분리된 바이러스를 동정하기 위하여 RT-PCR (Piralla et al., J Clin Microbiol 2015, 53 (5): 1725-1726) 및 특정 항체에 기반한 ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 방법 (Yang et al., Clin Vaccine Immunol 2014, 21 (3): 312 -320; Hou et al., J Virol Methods 2015, 215-216: 56-60)이 사용되었고, EV-D68 양성 배양물(positive cultures)을 선택하여 적어도 3회 이상의 클로닝 실험을 수행하였다. 각각의 실험에서 제한 희석법(limiting dilution method)에 의해 수득된 바이러스 클론 또한 RT-PCR 및 ELISPOT에 의하여 동정되었고, 다음 라운드 클로닝을 위하여 EV-D68 양성 클론을 선택하였다. 강력한 성장 생존력을 갖는 단일 EV-D68 균주를 항암 바이러스 균주 후보군으로 선택하였다.
1.2 감염성 클로닝 및 역유전학 기술에 의해 수득한 엔테로바이러스 EV-D68 및 이의 변이형의 구조 균주(Rescued strain)
본 실시예에서는 역유전학 기술을 통하여 본 발명의 EV-D68 및 이의 변이형을 어떻게 수득할 수 있는지 보여주기 위하여 야생형 EV-D68 (서열번호 1)를 예로 사용하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다.
(1) 바이러스성 감염성 클론의 구축: 야생형 엔테로바이러스 EV-D68 (EV-D68-WT)의 cDNA 서열은 서열번호 1에 개시되어 있고, 이의 게놈 RNA 서열은 서열번호 12에 개시되어 있다; 엔테로바이러스 EV-D68의 cDNA 서열 (서열번호 1)에 기반한 유전자 삽입 또는 대체(replacement)는 하기와 같이 수행되었다:
변이형 1: 야생형 EV-D68의 내부 리보솜 유입점 서열은 서열번호 13에 개시된 게놈 RNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 (EV-D68-HRV2)의 cDNA 서열 (서열번호 8)을 수득하기 위하여, 인간 라이노바이러스 2 (서열번호 20에 개시된 DNA 서열을 포함함)의 내부 리보솜 유입점 서열로 대체되었다;
변이형 2: miR-133 타겟 서열 (서열번호 17에 개시된 DNA 서열을 포함함) 및 miR-206 타겟 서열 (서열번호 18에 개시된 DNA 서열을 포함함)의 텐덤 서열 (서열번호 19에 개시된 DNA 서열을 포함함)은 서열번호 14에 개시된 게놈 RNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 (EV-D68-miR133&206T)의 cDNA 서열 (서열번호 9)을 수득하기 위하여, 야생형 EV-D68의 cDNA (서열번호 1)의 3' 비번역 부위의 7293-7294 bp 사이에 삽입되었다;
변이형 3: 인간 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 유전자 (서열번호 6)는 서열번호 15에 개시된 게놈 RNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 (EV-D68-GM-CSF)의 cDNA 서열 (서열번호 10)을 수득하기 위하여, 야생형 EV-D68의 cDNA (서열번호 1)의 VP1 유전자 및 2A 유전자 사이에 삽입되었다;
변이형 4: 항-PD-1 scFv (single chain antibody against human programmed death receptor 1)을 인코딩하는 서열 (서열번호 7)은 서열번호 16에 개시된 게놈 RNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 (EV-D68-anti-PD-1)의 cDNA 서열 (서열번호 11)을 수득하기 위하여, 야생형 EV-D68의 cDNA (서열번호 1)의 VP1 유전자 및 2A 유전자 사이에 삽입되었다.
그 다음, 상기 5종 항암 바이러스의 cDNA 서열들 (서열번호 1, 8-11)을 유전자 합성 회사 (Shanghai Biotech Engineering Co., Ltd.)로 보내 전체 유전자를 합성하고, 엔테로바이러스 EV-D68 또는 이의 변이형 (다시 말해, EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 및 EV-D68-anti-PD-1)의 감염성 클로닝 플라스미드를 수득하기 위하여 pSVA 플라스미드 (Hou et al. Virus Res 2015, 205: 41-44; Yang et al., Virus Res 2015, 210: 165-168)에 결찰(ligate)하였다.
(2) 플라스미드 미니-키트 및 E coli. DH5α 수용성 세포(competent cells)는 Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.에서 구입하였다; Hela 세포 (ATCC® Number: CCL-2TM) 및 인간 횡문근육종 세포 (RD cells; ATCC® Number: CCL-136TM)는 시아먼 대학의 국립 감염병 진단(법) 및 백신 개발 협회에서 관리되었고, 10% 소태아혈청, 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 및 MEM 배지에서 각각 배양되었다; 형질감염 시약인 리포펙타민2000 및 Opti-MEM은 Thermo Fisher Scientific Company로부터 구입하였다.
(3) 상기 5종 항암 바이러스의 cDNA 서열들을 함유하는 감염성 클로닝 플라스미드를 E coli DH5α 수용성 세포로 형질전환 시키고, 클론 성장 후 단클론성 균주를 골라내어 진탕(shaken)시킨 다음, 플라스미드 미니-키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 서열 분석을 위하여 상기 회사 (Shanghai Biotech Engineering Co., Ltd.)로 보냈다.
(4) 바이러스를 구조하기 위하여, 정확한 서열을 갖는 감염성 클로닝 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드 pAR3126을 세포에 공동 형질감염(co-transfected)시켰다 (Hou et al. Virus Res 2015, 205: 41-44; Yang et al. Virus Res 2015, 210: 165-168). 형질전환 시약의 지시에 따라 Hela 세포를 먼저 형질전환시켰다; 그 다음 현미경으로 관찰하였다. Hela 세포에 CPE가 나타났을 때, 세포 및 상청액을 수거하고, RD 세포를 접종한 후 계대배양하여 항암 바이러스의 후보 균주를 수득하였다.
실시예 2: EV-D68 및 이의 변이의 인 비트로( In vitro ) 항종양 실험
2.1 사용된 바이러스 및 세포주
(1) 바이러스: 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제공된 EV-D68-WT (서열번호 12), EV-D68-HRV2 (서열번호 13), EV-D68-miR133&206T (서열번호 14), EV-D68-GM-CSF (서열번호 15) 및 EV-D68-anti-PD-1 (서열번호 16)을 사용하였다.
(2) 세포주: 인간 횡문근육종 세포(human rhabdomyosarcoma cell) RD (ATCC® Number: CCL-136TM); 인간 자궁경부암 세포주(human cervical cancer cell lines) Hela (ATCC® Number: CCL-2TM), SiHa (ATCC® Number: HTB-35TM), Caski (ATCC® Number: CRL-1550TM) 및 C-33A (ATCC® Number: HTB-31TM); 인간 난소암 세포주(human ovarian cancer cell lines) SKOV-3/TR (SKOV-3의 약물-저항 균주), SKOV-3 (ATCC® Number: HTB-77TM) 및 Caov3 (ATCC® Number: HTB-75TM); 인간 자궁내막암 세포주(human endometrial cancer cell lines) Hec-1-A (ATCC® Number: HTB-112TM), Hec-1-B (ATCC® Number: HTB-113TM) 및 Ishikawa (ECACC No. 99040201); 인간 폐암 세포주(human lung cancer cell lines) SPC-A-1 (CCTCC Deposit Number: GDC050), NCI-H1299 (ATCC® Number: CRL-5803TM), NCI-H1417 (ATCC® Number: CRL-5869TM), NCI-H1703 (ATCC® Number: CRL-5889TM), NCI-H1975 (ATCC® Number: CRL-5908TM), A549 (ATCC® Number: CCL-185TM), NCI-H661 (ATCC® Number: HTB-183TM), EBC-1 (Thermo Fisher Scientific, Catalog #: 11875101), 및 DMS114 (ATCC® Number: CRL-2066TM); 인간 간암 세포주(human liver cancer cell lines) MHCC97H (Institute of Liver Cancer, Fudan University), C3A (ATCC® Number: CRL-10741TM), Hep3B (ATCC® Number: HB-8064TM), HepG2 (ATCC® Number: HB-8065TM), SMMC7721 (Basic Medical Cell Center of the Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, number: 3111C0001CCC000087), BEL7402 (CCTCC Deposit Number: GDC035), BEL7404 (Cell Resource Center, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, number: 3131C0001000700064), Huh7 (CCTCC Deposit Number: GDC134), PLC/PRF/5 (ATCC® Number: CRL-8024TM) 및 SK-Hep-1 (ATCC® Number: HTB-52TM); 인간 신장암 세포주(human kidney cancer cell lines) A-498 (ATCC® Number: HTB-44TM), 786-O (ATCC® Number: CRL-1932TM) 및 Caki-1 (ATCC® Number: HTB-46TM); 인간 신경모세포종 세포주(human neuroblastoma cell lines) SH-SY5Y (ATCC® Number: CRL-2266TM) 및 SK-N-BE (2) (ATCC® Number: CRL-2271TM); 인간 신경교종 세포주(human glioma cell lines) U87-MG (ATCC® Number: HTB-14TM) 및 U118-MG (ATCC® Number: HTB-15TM); 인간 유방암 세포주(human breast cancer cell lines) MCF-7 (ATCC® Number: HTB-22TM), BcaP37 (CCTCC Deposit Number: GDC206), BT-474 (ATCC® Number: HTB-20TM), MDA-MB-231 (ATCC® Number: CRM-HTB-26TM) 및 MDA-MB-453 (ATCC® Number: HTB-131TM); 인간 흑색종 세포주(human melanoma cell lines) A-375 (ATCC® Number: CRL-1619TM), SK-MEL-1 (ATCC® Number: HTB-67TM) 및 MeWo (ATCC® Number: HTB-65TM); 인간 전립선암 세포주(human prostate cancer cell lines) PC-3 (ATCC® Number: CRL-1435TM), LNCap (ATCC® Number: CRL-1740TM) 및 DU145 (ATCC® Number: HTB-81TM); 인간 방광암 세포주(human bladder cancer cell lines) J82 (ATCC® Number: HTB-1TM) 및 5637 (ATCC® Number: HTB-9TM); 인간 췌장암 세포주(human pancreatic cancer cell lines) Capan-2 (ATCC® Number: HTB-80TM), HPAF-2 (ATCC® Number: CRL-1997TM), 및 PANC-1 (ATCC® Number: CRL-1469TM); 인간 위암 세포주(human gastric cancer cell lines) AGS (ATCC® Number: CRL-1739TM), SGC7901 (CCTCC Deposit Number: GDC150), BGC823 (CCTCC Deposit Number: GDC151), 및 NCI-N87 (ATCC® Number: CRL-5822TM); 인간 대장암 세포주(human colorectal cancer cell lines) DLD-1 (ATCC® Number: CCL-221TM), SW1116 (ATCC® Number: CCL-233TM), SW480 (ATCC® Number: CCL-228TM), HCT-116 (ATCC® Number: CCL-247TM) 및 HT-29 (ATCC® Number: HTB-38TM); 인간 식도암 세포주(human esophageal cancer cell line) TE-1 (Cell Resource Center, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, No. 3131C0001000700089); 인간 갑상선암(human thyroid cancer) 세포주 SW-579 (ATCC® Number: HTB-107TM) 및 TT (ATCC® Number: CRL-1803TM); 인간 후두암(human laryngeal cancer) 세포주 Hep-2 (ATCC® Number: CCL-23TM); 골육종(osteosarcoma) 143B (ATCC® Number: CRL-8303TM) 및 U2OS (ATCC® Number: HTB-96TM); 인간 림프종 및 백혈병 세포주(human lymphoma 및 leukemia cell lines) K562 (ATCC® Number: CCL-243TM), U937 (ATCC® Number: CRL-1593.2TM), THP-1 (ATCC® Number: TIB-202TM), Raji (ATCC® Number: CCL-86TM), Daudi (ATCC® Number: CCL-213TM), Jurkat (ATCC® Number: TIB-152TM) 및 MT-4 (obtained from the National Institutes of Health, USA); 인간 정상 세포주(human normal cell lines): 인간 배아 폐 섬유아세포 세포주(human embryo lung fibroblast cell line) MRC-5 (ATCC® Number: CCL-171TM), 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney cell line) HEK-293 (ATCC® Number: CRL-1573TM), 인간 포피 섬유아세포 세포주(human foreskin fibroblast cell line) HFF-1 (ATCC® Number: SCRC-1041TM), 인간 피부 케라틴세포 세포주(human skin keratinocyte cell line) HaCat (CCTCC Deposit Number: GDC106), 인간 전립선 기질 세포주(human prostate stromal cell line) WPMY-1 (ATCC® Number: CRL-2854TM), 인간 제대정맥 내피세포주(human umbilical vein endothelial cell line) HUVEC (Thermo Fisher Scientific, Catalog #: C01510C), 및 분화된 인간 간 전구세포주(differentiated human liver progenitor cell line) HepaRG (with characteristics of primary hepatocytes; Thermo Fisher Scientific, Catalog #: HPRGC10). 상기 세포는 시아먼 대학의 국립 감염병 진단(법) 및 백신 개발 협회에서 관리되었다. HepaRG 세포는 WME 배지 (1.5% DMSO가 첨가된)에서 배양되었고, AGS 및 TT는 F-12K 배지에서 배양되었고, SW-579는 L-15 배지에서 배양되었고, SH-SY5Y 및 SK-N-BE (2)는 DMEM:F12 (1:1) 배지에서 배양되었고, RD, C-33A, EBC-1, J82, SK-Hep-1, SK-MEL-1 및 DU145는 MEM 배지에서 배양되었고, K562, U937, THP-1, Raji, Daudi, Jurkat, MT-4, 5637, 786-O, TE-1, Caski, NCI-H1417, NCI-H1703, NCI-H1975, NCI-H661, SGC7901, BGC823, DLD-1, SW1116, Hep-2, 및 LNCap는 RPMI-1640 배지에서 배양되었고, 다른 세포들은 DMEM 배지에서 배양되었다. 상기 언급된 모든 배지에는 10% 소태아혈청, 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충되었다. 상기 모든 세포는 표준 조건인 37 ℃, 5% CO2에서 배양되었다.
2.2 바이러스 배양
RD 세포를 10 cm 세포 배양 플레이트에 균일하게 접종하고, 10% 소태아혈청, 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEM 배지에서, 37 ℃, 5% CO2, 및 포화 습도 조건으로 배양하였다. 세포 밀집도(cell confluence)가 90% 이상 도달했을 때, 세포 배양 배지를 무-혈청 MEM 배지로 교체한 후, 각 플레이트에 EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 또는 EV-D68-anti-PD-1의 107 TCID50을 접종하고, 배양 환경을 33 ℃, 5% CO2, 및 포화 습도 조건으로 변경하였다. 24 시간 후, EV-D68 또는 이의 변이형은 RD 세포에서 증식되어 세포에서 CPE를 유발하였다. 세포의 90% 이상이 수축 및 둥글게되고, 거칠기가 증가하며, 분리 및 용해될 때, 세포 및 이의 배양 상청액을 수거하였다. 3회 동결-해동 후, 배양 상청액을 수거하고 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 4000 rpm, 10분, 4 ℃ 조건으로 원심분리하였다. 끝으로, 상청액을 0.22 μm 일회용 필터 (Millipore Company)로 여과하여 세포 찌꺼기와 같은 불순물을 제거하였다.
2.3 바이러스 역가(titer) 측정
RD 세포를 104 세포/웰의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 부착된 후, 상기 실시예 2.2에서 수득한 바이러스 용액을 무-혈청 MEM 배지로 첫 10-배 희석으로부터 10-배 희석하였다. 바이러스 희석액 50 μl를 세포가 있는 웰에 첨가하였다. 7일 후, CPE가 나타난 웰을 모니터링하여 기록한 후, Karber 방법을 사용하여 계산하였다. 계산식은 다음과 같다: lgTCID50 = L - D (S - 0.5)(L: 가장 높은 희석의 로그, D: 희석의 로그 사이의 차이, S: 양성 웰의 비율의 합). 이와 같이 계산된 TCID50의 단위는 TCID50/50μl이며, TCID50/ml로 변환되어야 한다.
2.4 바이러스의 인 비트로( In vitro ) 항종양 실험
인간 종양 세포 및 정상 세포는 104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 부착된 후, 각 웰의 배지를 상응하는 세포 배지(무혈청)로 교체하고, 0.1, 1, 10 또는 100의 감염다중도(MOI)로 바이러스를 접종하였다. 이어서, 현미경으로 세포의 CPE를 매일 모니터링하였다.
도 1은 바이러스에 감염되지 않은 (음성 대조군 그룹, Mock), 또는 72 시간 동안 MOI = 10의 EV-D68-WT으로 처리된 인간 제대정맥 내피세포주 HUVEC, 인간 식도암 세포주 TE-1, 인간 갑상선암 세포주 SW-579 및 TT의 현미경 사진을 나타낸다. 상기 결과는 감염다중도(MOI) 10의 감염 72시간 후, 바이러스-감염 그룹에서는 종양 세포의 수에 있어 현저한 수축 및 용해 등의 상당한 감소가 검출되었으나; MOCK 그룹의 비-종양 세포와 비교하여, 바이러스에 감염된 비-종양 세포는 세포 형태에 있어 거의 변화를 나타내지 않은 것을 보여준다. 상기 결과는 EV-D68이 인간 종양 세포주 TE-1, SW-579 및 TT에 대한 상당한 항암 효과를 나타내었으나, 비-종양 세포 HUVEC에 대해서는 효과를 나타내지 않은 것을 증명한다.
바이러스 감염 및 배양 72 시간 후, Cell Counting Kit-8 (CCK-8 kit; Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.) 및 크리스탈 바이올렛 염색 방법 (부착성 세포 한정)을 사용하여 세포 생존율(survival rate)을 측정하였으며, 구체적인 방법은 하기에 나타내었다:
(1) CCK8 방법에 의해 관찰된 세포 생존율
부착성 세포의 경우, 96-웰 세포 배양 플레이트의 원래 배지를 제거하고; 현탁 세포의 경우, 96-웰 세포 배양 플레이트의 원래 배지를 원심분리 후 조심스럽게 제거하고; 100 μl의 신선한 무-혈청 배지를 각 웰에 첨가하였다. 10 μl의 CCK-8 용액을 세포가 접종된 각 웰에 첨가하고, 음성 대조군으로서 동량의 CCK-8 용액을 블랭크 배양 배지에 첨가한 후, 0.5-3시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃로 배양하였다. 흡광도는 각 0.5, 1, 2, 3 시간에 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 측정하였고, 흡광도가 적절한 범위 내에 있는 시점이 세포 생존율에 대한 기준으로 선택되었다. 각 종류의 세포에 대한 EV-D68-WT의 CCK-8 테스트 결과는 표 2에 나타내었고, 여기서 "-"는 바이러스 처리 후의 세포 생존율이 MOCK 그룹과 크게 다르지 않았음을 나타내고; "+"는 바이러스 처리 후, 세포 수가 감소되고 생존율은 여전히 50%를 넘지만, MOCK 그룹의 생존율과는 크게 달라졌음을 나타내고; "++"는 바이러스 처리 후의 세포 생존율이 50% 아래이고, MOCK 그룹의 생존율과도 크게 달라졌음을 나타낸다.
세포 생존율의 계산:
(2) 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 관찰된 세포 생존율 (부착성 세포 한정)
세포를 3일 동안 바이러스로 감염시킨 후, 96-웰 세포 배양 플레이트의 세포 상청액을 버리고, 100 μl의 메탄올을 각 웰에 첨가하고, 15분 동안 어두운 상태로 고정시켰다. 크리스탈 바이올렛 분말 (Shanghai Biotech Biotechnology Co., Ltd.)을 칭량하고, 2% (w/v) 크리스탈 바이올렛 메탄올 용액으로 제형화한 후, 4 ℃에서 저장하였다. 2% 크리스탈 바이올렛 메탄올 용액의 적정량을 취하여 PBS 용액으로 제형화하여 0.2% 크리스탈 바이올렛 working 용액을 제조하였다. 15분 동안 고정시킨 후, 96-웰 세포 배양 배지에서 메탄올 고정 용액을 제거하고, 100μl의 크리스탈 바이올렛 working 용액을 플레이트에 첨가한 후 30분 동안 염색을 수행하였다. 크리스탈 바이올렛 염색 용액을 버리고, 과량의 염색 용액이 세척될 때까지 PBS 용액으로 3-5회 세척하고, 공기-건조를 수행하였다. ImmunSpot @ S5 UV Analyzer (Cellular Technology Limited, USA)를 사용하여 촬영하였다. 도 2는 대조군 (MOCK) 및 실험군 (72 시간 동안 각 0.1, 1, 및 10의 MOI의 EV-D68-WT로 감염된)에 대한 인간 간암 세포주 HepG2, SMMC7721, BEL7404, BEL7402, 및 Huh7, 인간 자궁경부암 세포주 Hela 및 Caski, 인간 폐암 세포주 NCI-H1299 및 A549, 인간 포피 섬유아세포 세포주 HFF-1, 인간 배아 신장 세포주 HEK-293, 및 분화된 인간 간 전구세포주 HepaRG의 크리스탈 바이올렛 염색 결과를 나타낸다. 결과에서 보여주듯이, 10, 1, 및 0.1의 MOI로 감염된 72 시간 후, 실험군의 종양 세포는 바이러스의 첨가가 없는 대조군 (MOCK)과 비교하여 상당히 감소되었다; 비-종양 세포의 수는 유의한 변화를 나타내지 않았다. 상기 결과는 EV-D68-WT가 인간 종양 세포주 HepG2, SMMC7721, BEL7404, BEL7402, Huh7, Hela, Caski, NCI-H1299 및 A549에 대한 상당한 항암 효과를 나타내었으나, 비-종양 세포주 HFF-1, HEK-293 및 분화된 HepaRG에 대해서는 효과를 나타내지 않은 것을 보여준다.
표 2: 야생형 엔테로바이러스 EV-D68의 인 비트로 항종양 실험의 결과
MOI

세포주		 0.1 1 10 100
RD ++ ++ ++ ++
Hela ++ ++ ++ ++
SiHa - - ++ ++
Caski - + ++ ++
C-33A - ++ ++ ++
SKOV-3/TR - - - +
SKOV-3 - - ++ ++
Caov3 + ++ ++ ++
Hec-1-A - - - ++
Hec-1-B - + ++ ++
Ishikawa - - ++ ++
SPC-A-1 - + ++ ++
NCI-H1299 - ++ ++ ++
NCI-H1417 - - - +
NCI-H1703 - - - +
NCI-H1975 - ++ ++ ++
A549 + ++ ++ ++
NCI-H661 - - + ++
EBC-1 - - + ++
DMS114 ++ ++ ++ ++
MHCC97H + ++ ++ ++
C3A ++ ++ ++ ++
Hep3B - + + ++
HepG2 - ++ ++ ++
SMMC7721 + ++ ++ ++
BEL7402 ++ ++ ++ ++
BEL7404 + ++ ++ ++
Huh7 ++ ++ ++ ++
PLC/PRF/5 - + ++ ++
SK-Hep-1 - - + ++
A-498 + ++ ++ ++
786-O - - + ++
Caki-1 ++ ++ ++ ++
SH-SY5Y - + ++ ++
SK-N-BE(2) - - - +
U87-MG + ++ ++ ++
U118-MG ++ ++ ++ ++
MCF-7 - - - +
BcaP37 - ++ ++ ++
BT-474 - - - +
MDA-MB-231 ++ ++ ++ ++
MDA-MB-453 - - + ++
A-375 - + ++ ++
SK-MEL-1 + ++ ++ ++
MeWo - + ++ ++
PC-3 ++ ++ ++ ++
LNCap - + ++ ++
DU145 ++ ++ ++ ++
J82 - + ++ ++
5637 - - - +
Capan-2 - - + ++
HPAF-2 - + + ++
PANC-1 - ++ ++ ++
AGS - - + ++
SGC7901 - - - +
BGC823 - + + ++
NCI-N87 - + ++ ++
DLD-1 - - - +
SW1116 + + ++ ++
SW480 - + ++ ++
HCT-116 - - + ++
HT-29 + ++ ++ ++
TE-1 - + ++ ++
SW-579 - - ++ ++
TT - - ++ ++
Hep-2 - + ++ ++
143B - - - +
U2OS + + ++ ++
K562 - + + ++
U937 - - + ++
THP-1 + ++ ++ ++
Raji ++ ++ ++ ++
Daudi ++ ++ ++ ++
Jurkat ++ ++ ++ ++
MT-4 ++ ++ ++ ++
MRC-5 - - + ++
HEK-293 - - - -
HFF-1 - - + +
HaCat - - - -
WPMY-1 - - - -
HUVEC - - - -
HepaRG - - - +
참고: "-"는 바이러스 처리 그룹 및 MOCK 그룹 간의 세포 생존율이 크게 다르지 않았음을 나타내고; "+"는 바이러스 처리 후, 세포 수가 감소되고 생존율은 여전히 50%를 넘지만, MOCK 그룹의 생존율과는 크게 달라졌음을 나타내고; "++"는 바이러스 처리 후의 세포 생존율이 50% 아래이고, MOCK 그룹의 생존율과도 크게 달라졌음을 나타낸다.
야생형 엔테로바이러스 EV-D68은 테스트된 종양 세포에 대한 사멸 효과를 가지며, 따라서 광범위한 항-종양 활성을 가짐을 표 2로부터 알 수 있다. 특히, 상기 바이러스는 간암 세포주, 신경교종 세포주, 전립선암 세포주, 백혈병 및 림프종 세포주에 대한 유의한 사멸 효과를 가졌다. 반면, 바이러스는 높은 MOI에서 인간 배아 폐 섬유아세포 세포주 MRC-5에 유의하게 독성이 있다는 것을 제외하고, 테스트된 비-종양 세포주에 대해 독성이 거의 없거나 전혀 없었다.
게다가, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 및 EV-D68-anti-PD-1의 인 비트로 항종양 실험은 상기 4종 변이 EV-D68이 테스트된 종양 세포에 대한 야생형 엔테로바이러스 EV-D68의 광범위한 사멸 효과를 유지하고, 인간 간세포암종 세포주, 전립선암 세포주, 백혈병 및 림프종 세포주의 테스트된 종양 세포에 대한 상기 유의한 사멸 효과를 상당히 유지함을 보여준다. 상기 자궁경부암 세포주 Hela, 신경교종 세포주 U118-MG, 간암 세포주 Huh7, 전립선암 세포주 PC-3, 및 림프종 세포주 Raji에 대한 상기 4종 변이 EV-D68의 항암 효과의 CCK-8 테스트 결과는 표 3에 나타내었다.
표 3: EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 및 EV-D68-anti-PD-1의 인 비트로 항종양 실험의 결과
MOI

세포주		 0.1 1 10 100
EV-D68-HRV2 Hela + + ++ ++
U118-MG + ++ ++ ++
Huh7 ++ ++ ++ ++
PC-3 ++ ++ ++ ++
Raji - + + ++
EV-D68-miR133&206T Hela ++ ++ ++ ++
U118-MG ++ ++ ++ ++
Huh7 ++ ++ ++ ++
PC-3 ++ ++ ++ ++
Raji ++ ++ ++ ++
EV-D68-GM-CSF Hela ++ ++ ++ ++
U118-MG ++ ++ ++ ++
Huh7 ++ ++ ++ ++
PC-3 ++ ++ ++ ++
Raji ++ ++ ++ ++
EV-D68-anti-PD-1 Hela ++ ++ ++ ++
U118-MG ++ ++ ++ ++
Huh7 ++ ++ ++ ++
PC-3 ++ ++ ++ ++
Raji ++ ++ ++ ++
참고: "-"는 바이러스 처리 그룹 및 MOCK 그룹 간의 세포 생존율이 크게 다르지 않았음을 나타내고; "+"는 바이러스 처리 후, 세포 수가 감소되고 생존율은 여전히 50%를 넘지만, MOCK 그룹의 생존율과는 크게 달라졌음을 나타내고; "++"는 바이러스 처리 후의 세포 생존율이 50% 아래이고, MOCK 그룹의 생존율과도 크게 달라졌음을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 예상치 않게 EV-D68-HRV2이 EV-D68-WT와 비교하여 일부 종양에 대한 현저히 개선된 사멸 활성을 나타내는 것을 발견하였으며, 상기 인간 위암 세포주 AGS, 인간 자궁내막암 세포주 HEC-1-A 및 Ishikawa, 인간 자궁경부암 세포주 C-33A, 및 인간 갑상선암 세포주 SW579의 상기 항암 활성의 상기 CCK-8 테스트 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4: 일부 종양 세포에 대한 EV-D68-WT 및 EV-D68-HRV2의 인 비트로 항암(oncolytic) 실험 결과의 비교
MOI

세포주		 0.01 0.1 1 10
EV-D68-WT
 AGS - - - +
HEC-1-A - - - -
Ishikawa - - - ++
C-33A - - ++ ++
SW579 - - - ++
EV-D68-HRV2 AGS ++ ++ ++ ++
HEC-1-A - + ++ ++
Ishikawa ++ ++ ++ ++
C-33A ++ ++ ++ ++
SW579 ++ ++ ++ ++
참고: "-"는 바이러스 처리 그룹 및 MOCK 그룹 간의 세포 생존율이 크게 다르지 않았음을 나타내고; "+"는 바이러스 처리 후, 세포 수가 감소되고 생존율은 여전히 50%를 넘지만, MOCK 그룹의 생존율과는 크게 달라졌음을 나타내고; "++"는 바이러스 처리 후의 세포 생존율이 50% 아래이고, MOCK 그룹의 생존율과도 크게 달라졌음을 나타낸다.
2.5 적응(adaptation)을 위한 EV-D68의 연속 계대(serial passaging)
본 실시예에서는, EV-D68이 특정 유형의 종양세포에서의 적응을 위하여 연속적으로 계대되어 종양 세포에 대한 사멸 활성이 향상된 바이러스 균주를 수득하였다.
야생형 엔테로바이러스 EV-D68은 EV-D68의 상기 항암 활성이 그다지 중요하지 않은 인간 자궁경부암 세포주 SiHa, 인간 난소암 세포주 SKOV-3, 인간 간암 세포주 SK-hep-1, 인간 췌장암 세포주 Capan-2, 인간 위암 세포주 AGS 또는 인간 대장암 세포주 HCT-116에서의 적응을 위하여 연속적으로 계대되었으며, 구체적인 방법은 하기에 나타내었다:
상기 종양 세포의 한 종류 10 cm 세포 배양 플레이트에 균일하게 접종하고, 10% 소태아혈청 및 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 상응하는 세포 배양 배지에서, 37 ℃, 5% CO2, 및 포화 습도 조건으로 배양하였다. 세포 밀집도가 90% 이상 도달했을 때, 세포 배양 배지를 무-혈청 세포 배양 배지로 교체한 후, 각 플레이트에 EV-D68의 107 TCID50을 접종하고, 배양 환경을 33 ℃, 5% CO2, 및 포화 습도 조건으로 변경하였다. 종양 세포에서 EV-D68이 증식되어 세포에서 CPE를 유발했을 때 (최대 3일 동안 감염 후), 세포 및 이의 배양 상청액을 수거하였다. 3회 동결-해동 후, 4 ℃, 4000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 상청액을 취하여 세포 밀집도가 90% 이상 도달한 새로운 종양 세포에 첨가하여 1회 바이러스 계대를 완료하였다. 계대를 10회 이상 반복하고, 각 계대마다 RD 세포에서 바이러스 역가 검출을 위하여 바이러스 용액 일부를 취하였으며, 구체적인 방법은 실시예 2.3을 참고하였다. 일반적으로, 바이러스 복제 능력은 세대에 따라 증가하며, 비교적 높은 감염성 역가에 도달하고 바이러스 복제가 종양 세포에서 안정되었을 때, 종양 세포에 대한 EV-D68의 적응된 균주를 수득하였다.
이어서, 실시예 2.4에서 설명된 인 비트로 항종양 실험 방법에 의해, 인간 종양 세포 SiHa, SKOV-3, SK-hep-1, Capan-2, AGS, 또는 HCT-116을 104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 부착된 후, 각 웰의 배지를 상응하는 세포 배지(무혈청)로 교체하고, 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션 후, 0.1, 1, 10, 및 100의 MOI로 상기 종류의 세포 각각에 적응된 연속 계대 EV-D68 바이러스 균주 (각각의 바이러스 역가는 RD 세포에서 측정됨)를 접종하였다. 이어서, 상기 세포의 CPE를 현미경으로 매일 모니터링하고, 바이러스의 감염 및 배양 72시간 후 세포 생존율을 CCK-8 방법을 사용하여 측정하였다.
상기 결과는 표 5에 나타내었으며, EV-D68이 좋지 않은(poor) 항암 효과를 나타내는 특정 종류의 종양 세포에서의 상기 야생형 엔테로바이러스 EV-D68의 연속 계대 후, 종양 세포에 대한 이의 사멸 활성이 현저하게 향상되었고, 이는 연속 계대 방법이 종양 세포에 대한 항암 활성이 향상된 EV-D68 적응 균주를 수득하기 위하여 사용될 수 있음을 나타낸다.
표 5: 종양 세포에서 적응을 위한 연속 배양 후, 종양 세포에 대한 EV-D68의 인 비트로 사멸 실험의 결과

세포주		 0.1 1 10 100
SiHa + ++ ++ ++
SKOV-3 - ++ ++ ++
SK-hep-1 - ++ ++ ++
Capan-2 - + ++ ++
AGS + + ++ ++
HCT-116 - + ++ ++
참고: "-"는 바이러스 처리 그룹 및 MOCK 그룹 간의 세포 생존율이 크게 다르지 않았음을 나타내고; "+"는 바이러스 처리 후, 세포 수가 감소되고 생존율은 여전히 50%를 넘지만, MOCK 그룹의 생존율과는 크게 달라졌음을 나타내고; "++"는 바이러스 처리 후의 세포 생존율이 50% 아래이고, MOCK 그룹의 생존율과도 크게 달라졌음을 나타낸다.
2.6 EV-D68의 게놈 RNA의 항암 효과의 평가
본 실시예에서는, EV-D68의 상기 정제된 게놈 RNA를 특정 종류의 종양 세포로 형질감염시켜 종양 세포를 사멸시킴으로써 다량의 감염성 생(live) 바이러스가 생산될 수 있다.
바이러스 게놈 RNA는 인 비트로 전사에 의해 처음 수득되었으며, 이러한 방법은 예를 들어, Hadac E M, Kelly E J 및 Russell S J. Mol Ther, 2011, 19(6): 1041-1047에서 찾을 수 있다. 구체적으로, 실시예 1에서 수득된 야생형 EV-D68의 감염성 클로닝 플라스미드를 선형화하고, 선형화된 플라스미드를 인 비트로 전사를 위항 주형 가닥으로 하여 MEGAscriptTM T7 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, AM1333)를 사용하여 다량의 바이러스 RNA를 생산하였다. 수득된 바이러스 RNA는 다음 사용을 위하여 MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit (Thermo Fisher Scientific, AM1908)를 이용하여 정제되었다. 상기 4종 평행 샘플의 RNA 전기영동도는 도 3에 나타내었다.
이어서, 상기 실시예 2.4에서 설명된 인 비트로 항종양 실험 방법에 따라, 인간 자궁경부암 종양 세포주 Hela를 105 세포/웰로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 부착된 후, 각 웰의 배지를 상응하는 세포 배지(무혈청)로 교체하고, 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. Hela 세포는 형질감염 시약인 리포펙타민2000 (Thermo Fisher Scientific, 11668019)을 사용하여 1 μg/웰로 정제된 바이러스로 형질감염시키고, 음성 대조군 그룹은 관련 없는 RNA 핵산 분자로 형질감염시켰다. 이어서, 현미경으로 상기 세포의 CPE를 매일 모니터링하였다.
상기 결과는 EV-D68의 게놈 RNA로 형질감염된 Hela 세포에서, 형질감염 약 8시간 후에 CPE가 나타나기 시작한 후, 상기 세포변성이 점차 증가함을 보여준다. 48 시간 후, CCK8 방법을 이용하여 생존율을 측정하였으며, 상기 Hela 세포는 거의 사멸하거나 용해되었다. 감염 0, 24 및 48 시간 후의 Hela 세포의 현미경 사진을 도 4에 나타내었다. 배양 상청액을 새로운 Hela 세포에 접종하자 CPE가 빠르게 생성되었다. 상기 결과는 상기 EV-D68의 핵산의 직접 투여는 또한 우수한 사멸 활성을 가지며 종양을 치료하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 엔테로바이러스 EV-D68 및 이의 변이형의 인 비보( In vivo ) 항종양 실험
3.1 바이러스, 세포주 및 실험 동물
(1) 바이러스: 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제공된 EV-D68-WT (서열번호 12), EV-D68-HRV2 (서열번호 13), EV-D68-miR133&206T (서열번호 14), EV-D68-GM-CSF (서열번호 15) 및 EV-D68-anti-PD-1 (서열번호 16)을 사용하였다. 바이러스 배양 및 바이러스 역가 측정 방법은 각각 실시예 2.2 및 2.3에서 확인할 수 있다.
(2) 세포주: 인간 자궁경부암 세포주 Hela (ATCC® Number: CCL-2TM), 신경교종 세포주 U118-MG (ATCC® Number: HTB-15TM), 및 림프종 세포주 Raji (ATCC® Number: CCL-86TM). Raji가 RPMI-1640 배지에서 배양된 것을 제외하고, Hela 및 U118-MG는 DMEM 배지에서 배양되었다. 상기 언급된 모든 배지에는 10% 소태아혈청, 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충되었다. 상기 모든 세포는 표준 조건인 37 ℃, 5% CO2에서 배양되었다.
(3) 실험 동물: 6-8주령 암컷 C.B17 SCID 마우스는 Shanghai Slark Experimental Animal Co., Ltd.로부터 입수하였고; 마우스는 시아먼 대학의 실험 동물 센터 및 윤리 위원회(Experimental Animal Center and Ethics Committee)로부터 승인된 프로토콜에 따라, SPF 조건에서 길렀다.
3.2 바이러스의 인 비보( In vivo ) 항종양 실험
SCID 마우스에서 피하 종양 형성을 위해 사용된 종양 세포는 0.01% 트립신으로 분해하고, 10% 소태아혈청을 함유하는 세포 배양 배지를 사용하여 단일-세포 현탁액에 재현탁시켰다. 현탁액의 세포 밀도를 카운트하였다. 세포를 1000 g에서 3 분 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 상기 세포를 약 106-107 세포/100 μl PBS의 농도가 되도록 적절한 부피의 PBS로 재현탁시켰다. 시린지를 이용하여 상기 종양 세포를 106-107 세포/100 μl PBS/부위로 SCID 마우스의 등에 피하접종하였다. 약 14-21일 후 상기 종양 세포가 SCID 마우스의 피부 아래에서 약 100 mm3의 종양 덩어리로 자랐을 때, 상기 종양-영향(bearing) SCID 마우스를 각 그룹 당 4 마우스 (n = 4)씩 무작위로 실험 그룹 (EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 또는 EV-D68-anti-PD-1를 투여한) 및 음성 대조군 그룹으로 나누었다. 106 TCID50/100μl 무-혈청 배지/종양 덩어리 또는 동량의 무-혈청 배지에서의 항암 바이러스 (EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 또는 EV-D68-anti-PD-1)를 2일마다 종양 내 주사하여 총 5회 처리하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼(vernier caliper)로 측정하여 2일마다 기록하였고, 종양 크기를 계산하는 방법은 하기와 같다:
종양 크기 (mm3) = 종양 길이 값 Х (종양 너비 값)2 / 2.
상기 3종 종양의 EV-D68-WT 처리 결과는 도 5A-5C에 나타내었다. 상기 결과는 EV-D68-WT의 챌린지 후, 상기 테스트된 Hela (A), U118-MG (B) 및 Raji (C)의 3종 종양의 성장이 서서히 느려지다 중단되었으며, 심지어 종양이 용해되거나 사라졌고; 대조적으로, 상기 음성 그룹 (CTRL)의 종양은 정상 성장을 유지하였고, 그들의 종양 크기는 실험 그룹의 종양 크기보다 유의하게 더 큰 것을 것을 보여준다.
표 6은 상기 Raji 종양 모델을 EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 또는 EV-D68-anti-PD-1로 10일 동안 처리한 후 얻은 결과를 보여준다. 상기 결과는 항암 바이러스로 처리되지 않은 상기 음성 대조군 그룹과 비교하여, EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF, 및 EV-D68-anti-PD로 처리한 후 상기 종양 부피가 유의하게 감소된 것을 보여주며, 4종 항암 바이러스 EV-D68-WT, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 및 EV-D68-anti-PD-1로 처리한 후 종양 부피의 상기와 같은 유사한 감소가 검출되었다. 상기 결과는 모든 EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 및 EV-D68-anti-PD-1이 인 비보에서 현저하고 유리한 항종양 활성을 보임을 나타낸다.
표 6: 인간 림프종 세포주 Raji에 대한 EV-D68-WT, EV-D68-HRV2, EV-D68-miR133&206T, EV-D68-GM-CSF 및 EV-D68-anti-PD-1의 인 비보 항-종양 실험의 결과
항암 바이러스 처리 10일 후의 Raji에 대한 인 비보 항암 효과
EV-D68-WT ++
EV-D68-HRV2 +
EV-D68-miR133&206T ++
EV-D68-GM-CSF ++
EV-D68-anti-PD-1 ++
참고: "+"는 바이러스 처리 후, 종양 부피가 감소되고 종양 부피가 음성 대조군 그룹의 50%를 넘지만, 음성 대조군 그룹의 종양 부피와는 크게 달라졌음을 나타내고; "++"는 바이러스 처리 후의 종양 부피가 음성 대조군 그룹의 50% 아래로 감소되고, 음성 대조군 그룹의 종양 부피와도 크게 달라졌음을 나타낸다.
실시예 4: 항암 바이러스의 안전성(Safety) 평가
4.1 사용된 바이러스 및 실험 동물
(1) 바이러스: 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제공된 EV-D68-WT (서열번호 12)를 사용하였다. 바이러스 배양 및 바이러스 역가 측정 방법은 각각 실시예 2.2 및 2.3을 참고하였다.
(2) 실험 동물: 임신한 BALB/c 마우스는 Shanghai Slark Experimental Animal Co., Ltd.로부터 입수하였고; 마우스는 시아먼 대학의 실험 동물 센터 및 윤리 위원회로부터 승인된 프로토콜에 따라, 청정 상태(clean conditions)에서 길렀으며, 임신한 BALB/c 마우스로부터 생산된 1일령(day-old), 2일령, 3일령, 7일령 및 14일령 마우스가 EV-D68의 인 비보 독성(virulence) 평가에 사용되었다.
4.2 마우스에서 바이러스의 안전성 평가
(1) 복강 내 주사에 의해 EV-D68-WT로 챌린지하기 위하여 1일령 BALB/c 새끼 마우스가 선택되었으며, 챌린지 역가 용량은 103, 104, 105, 106, 또는 107 TCID50/마우스였다. 상이한 용량으로 챌린지된 BALB/c 마우스의 생존율 및 건강 점수(health scores)가 매일 기록되었고, 상기 건강 점수는 평가 기준은 다음과 같다: 사망하였거나 사망 중인 경우 5점; 심각한 사지 마비를 나타내는 경우 4점; 사지의 약화 또는 경미한 기형을 나타내는 경우 3점; wasting을 나타내는 경우 2점; 무기력, 털세움(piloereaction), 및 떨림을 나타내는 경우 1점; 및 건강한 경우 0점.
그 결과는 도 6A에 나타내었다. 챌린지 후 20일 내에, 극 고-용량 107 TCID50로 처리된 그룹의 모든 마우스는 1주일 내에 병에 걸리고 사망하였다; 고-용량 106 TCID50로 처리된 그룹의 마우스의 80%는 결과적으로 생존하였고 단지 소수의 마우스만이 병에 걸리고 사망하였다; 또한, 다른 용량으로 처리된 챌린지 그룹의 마우스는 병적 상태(morbidity) 및 사망이 발생하지 않았다.
(2) 1일령, 2일령, 3일령, 7일령 및 14일령 BALB/c 마우스에 극 고용량 107 TCID50/마우스의 EV-D68-WT를 주사하고, 상이한 연령의 BALB/c의 생존율 및 건강 점수가 매일 기록하였으며, 상기 건강 점수는 평가 기준은 상기와 같다.
그 결과는 도 6B에 나타내었다. 챌린지 후 20일 내에, 1일령 마우스는 모두 1주 내에 사망하였다; 2일령 마우스는 EV-D68 독성에 어느 정도 저항하였고, 결국 70%의 생존율을 나타냈지만, 비교적 높은 발병률 및 비교적 심각한 증상을 나타냈다; 3일령 마우스는 이미 EV-D68에 취약하지 않았고, 90%의 생존율을 나타냈으며, 낮은 질병 발생률 및 경미한 증상을 나타냈다; 4 또는 그 이상 일령 마우스는 고용량의 EV-D68에 대해 완전히 내성을 보였으며, 병적 상태 및 사망이 발생하지 않았다.
상기 결과는 EV-D68-WT가 마우스에 독성을 덜 나타내고, 극 고용량 107 TCID50/마우스에서 1 내지 3일령 BALB/c 마우스에 대해서만 치명적이며, 4 또는 그 이상 일령 마우스에 대해서는 효과가 없어, 인 비보에서 양호한 안전성을 나타냄을 보여준다.
본 발명의 특정 구체예가 상세하게 설명되었지만, 당업자는 공개된 모든 교시에 따라 다양한 수정 및 변경이 상세하게 이루어질 수 있고, 이러한 변경은 모두 본 발명의 보호범위 내에 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 청구 범위 및 그의 등가물에 의해 주어진다.
<110> XIAMEN UNIVERSITY YANG SHENG TANG COMPANY, LTD. <120> A VIRUS FOR TREATMENT OF TUMOR <130> PI200005CN <150> CN 201710600732.8 <151> 2017-07-21 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA sequence of wild type EV-D68 (EV-D68-WT) <400> 1 taatacgact cactataggt taaaacagcc ttggggttgt tcccactcca agggcccacg 60 tggcggctag tactctggta cttcggtacc tttgtacgcc tgttttatct cccttcccaa 120 tgtaacttag aagttcttaa atcaatgctc aataggtggg gcgcaaacca gcgctctcat 180 gagcaagcac tcctgtctcc ccggtgaggt tgtataaact gttcccacgg ttgaaaacaa 240 cctatccgtt atccgctata gtacttcgag aaacctagta ccacctttgg attgttgacg 300 cgttgcgctc agcacactaa cccgtgtgta gcttgggtcg atgagtctgg acatacctca 360 ctggcgacag tggtccaggc tgcgttggcg gcctactcat ggtgaaagcc atgagacgct 420 agacatgaac aaggtgtgaa gagtctattg agctactata gagtcctccg gcccctgaat 480 gcggctaatc ctaaccatgg agcaagtgct cacaggccag tgagttgctt gtcgtaatgc 540 gcaagtccgt ggcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttcacttttt acttttatga 600 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<223> RNA sequence of the target sequence of miR-206 <400> 4 ccacacacuu ccuuacauuc ca 22 <210> 5 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA sequence of tandem sequence of miR-133 target sequence and miR-206 target sequence <400> 5 acagcugguu gaaggggacc aacgauacag cugguugaag gggaccaaac cgguccacac 60 acuuccuuac auuccaucac ccacacacuu ccuuacauuc ca 102 <210> 6 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of GM-CSF gene <400> 6 atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60 cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120 cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180 tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240 cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300 tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360 gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420 ccagtccagg agtga 435 <210> 7 <211> 795 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gaaatctcct agtgctgagg catgtggcta cagtgataga 960 gtattacagc tcaaattagg aaattcagct attgtcaccc aggaagcagc gaactactgc 1020 tgcgcttatg gtgaatggcc caattactta ccagaccatg aagcagtagc cattgataaa 1080 cctacacaac cagaaactgc tacagataga ttctacactt tgaaatcagt caaatgggaa 1140 actggaagca caggatggtg gtggaaacta cccgatgcac tgaataatat aggcatgttt 1200 ggacagaatg tgcagcatca ctacctatat agatctggtt tcttgattca tgtgcagtgt 1260 aatgccacaa aattccatca aggtgcctta ttagtggtag caattccaga acatcagagg 1320 ggagcgcaca acaccaacac tagcccaggg tttgatgata taatgaaagg tgaagaagga 1380 gggaccttca atcatccata tgtccttgat gatggaacat cattggcttg tgcgacgata 1440 tttccacatc agtggataaa tctgagaacc aacaattcag caacaattgt tcttccctgg 1500 atgaatgctg ctccaatgga tttcccactt agacataatc agtggacgct agcaataata 1560 ccagtggtgc cattaggtac gcgtacaaca tcaagtatgg tcccaataac agtttcaatc 1620 gctccaatgt gttgtgagtt taatggactt agacacgcca ttactcaagg tgtcccaaca 1680 taccttttac caggctcggg acaattccta acaactgatg atcatagctc tgcaccagct 1740 ctcccgtgtt tcaacccaac 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caaaagauga uuucucccuc 2340 agauuaauga gagacagccc ugacauugga caacuagacc auuuacaugc agcagaggca 2400 gccuaccaga ucgagagcau caucaaaaca gcgaccgaca cugugaaaag ugagauuaau 2460 gcugaacuug gugugguccc uagcuuaaau gcaguugaaa caggugcaac uucuaacacu 2520 gaaccagaag aagccauaca aacucgcaca gugauaaauc agcacggugu auccgagacu 2580 cuaguggaga auuuucucag uagagcagcu uugguaucaa agagaaguuu ugaauacaaa 2640 gaucauacuu cgucugcagc acaagcagac aagaacuuuu ucaaauggac aauuaacacc 2700 agauccuuug uacaguuaag aagaaaauua gaauuauuca cauaccuuag auuugaugcu 2760 gagaucacua uacucacaac uguagcagug aaugguagug guaauaauac auacgugggu 2820 cuuccugacu ugacacucca agcaauguuu guacccacug gugcucuuac cccagaaaaa 2880 caggacucau uccacuggca gucaggcagu aaugcuagug uauucuuuaa aaucuccgac 2940 cccccagcca gaauaaccau accuuuuaug ugcauuaacu cagcauacuc aguuuuuuau 3000 gauggcuuug ccggauuuga gaaaaacggu cuguauggaa uaaauccagc ugacacuauu 3060 gguaacuuau guguuagaau agugaaugaa caccaaccag uugguuucac agugaccguu 3120 aggguuuaca ugaagccuaa acacauaaaa gcaugggcac cacgaccacc acgaacuuug 3180 ccauauauga guauugcaaa ugcaaauuac aaagguaaag aaagagcacc aaaugcgcuc 3240 aaugcuauaa uuggcaauag agacaguguc aaaaccaugc cucauaauau agugaacacu 3300 gguccaggcu ucggaggagu uuuuguaggg ucuuucaaaa uaaucaacua ucacuuggcc 3360 acuacagaag agagacaguc agcuaucuau guggauuggc aaucagacgu cuugguuacc 3420 cccauugcug cucauggaag gcaccaaaua gcaagaugca agugcaacac agggguuuac 3480 uauuguaggc acaaaaacag aaguuacccg auuugcuuug aaggcccagg gauucaaugg 3540 auugaacaaa augaauauua cccagcaagg uaccagacca auguacuauu ggcaguuggu 3600 ccugcggaag caggagauug cggugguuua cuaguuuguc cacauggggu aaucggucuu 3660 cuuacagcag gagggggugg aauuguagcu uucacugaua ucaggaauuu gcuaugguua 3720 gauacugaug cuauggaaca aggcauuacu gauuauauuc aaaaucuugg uaaugccuuu 3780 ggagcaggau uuacagaaac aaucucuaau aaagccaagg aagugcaaga uaugcuaauu 3840 ggagagaguu cacuauuaga aaaauuguua aaagcucuaa ucaaaaucau aucagcauua 3900 guaauuguaa ucagaaacuc agaagauuua gucacaguca cagccacacu agcauuguug 3960 ggaugccaug auucaccaug gagcuacuug aaacagaagg uauguucaua cuuagguauu 4020 ccuuauguac cuagacaggg ugaaucgugg cuuaagaaau ucacagaggc augcaaugcu 4080 cuuagagguc uggauuggcu aucgcaaaag auagauaaau ucaucaacug gcuuaaaacc 4140 aaaauauuac cagaagcuag ggagaaauau gaauuugugc aaaggcucaa acaguuaccg 4200 gugauagaaa accaaguuag uacaaucgag cauagcugcc caacaacaga acaacaacag 4260 gccuuauuca acaacgucca auacuauuca cacuacugua gaaaguacgc accacuuuac 4320 gcaguggaag caaagagggu aguagcucuu gaaaagaaaa uaaacaacua cauccaguuc 4380 aaguccaaau cucgcauuga accgguuugu uuaauaauac auggcucucc aggaacuggc 4440 aagucagugg cuucaaauuu aauugccagg gcuaucacag agaaauuggg gggggacauu 4500 uauuccuugc cuccagaccc uaaauauuuu gauggauaca aacagcaaac agugguccuc 4560 auggaugauu uaaugcaaaa uccagauggg aaugacauau cuauguucug ccaaaugguc 4620 uccacuguag auuucauacc cccaauggcu aguuuggagg aaaaaggaac ucuauacacc 4680 aguccauuuu uaauagcuac uaccaaugcu ggcucaauac augcaccaac uguaucagac 4740 ucaaaggcuu ugucacgcag auuuaaauuu gacguggaca uugaagucac agauucauac 4800 aaggacucaa auaaauugga uaugucaagg gcagucgaga 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caaaauuccc aaauauguau 5700 aucccaguug gacaagucac caauuauggc uucuugaacc uaggugguac accgacgcac 5760 cgcauuuuaa uguauaacuu cccaacaaga gcuggccagu gugguggugu ggugacaacu 5820 acagguaagg ugauaggaau acauguaggu ggaaauggag cucaaggauu ugcagcaaug 5880 cuacuacacu cuuacuuuuc cgauacacaa ggugagauag uuaguaguga aaagaguggg 5940 gugugcauua acgcaccggc aaagacuaaa cuccaaccua guguuuucca ucaaguuuuu 6000 gaagguucaa aggaaccagc aguucucaau ccaaaagauc cuaggcuuaa aacagauuuc 6060 gaggaggcca uuuucucaaa guacacaggu aacaaaauua uguuaaugga ugaguacaug 6120 gaagaggcag uggaucauua uguggggugu uuagaaccau uagacaucag uguggauccc 6180 auaccccugg aaagugccau guauggaaug gauggccuug aggcauuaga cuuaacuacc 6240 agugcaggau ucccuuacuu acuacaaggg aagaagaaaa gggauauauu uaauagacau 6300 acuagagaca ccagugaaau gacaaaaaug uuagagaaau auggaguuga ccuaccuuuu 6360 guaaccuuug uaaaagauga gcuuagauca agagaaaaag uugaaaaagg gaaaucacgc 6420 cugauugagg ccaguuccuu gaaugacuca guugcuauga gaguugccuu uggaaaccuu 6480 uacgccacau uucacaacaa uccagguaca gcaacuggua 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ugcaaaggcu caaacaguua ccggugauag aaaaccaagu 4140 uaguacaauc gagcauagcu gcccaacaac agaacaacaa caggccuuau ucaacaacgu 4200 ccaauacuau ucacacuacu guagaaagua cgcaccacuu uacgcagugg aagcaaagag 4260 gguaguagcu cuugaaaaga aaauaaacaa cuacauccag uucaagucca aaucucgcau 4320 ugaaccgguu uguuuaauaa uacauggcuc uccaggaacu ggcaagucag uggcuucaaa 4380 uuuaauugcc agggcuauca cagagaaauu ggggggggac auuuauuccu ugccuccaga 4440 cccuaaauau uuugauggau acaaacagca aacagugguc cucauggaug auuuaaugca 4500 aaauccagau gggaaugaca uaucuauguu cugccaaaug gucuccacug uagauuucau 4560 acccccaaug gcuaguuugg aggaaaaagg aacucuauac accaguccau uuuuaauagc 4620 uacuaccaau gcuggcucaa uacaugcacc aacuguauca gacucaaagg cuuugucacg 4680 cagauuuaaa uuugacgugg acauugaagu cacagauuca uacaaggacu caaauaaauu 4740 ggauauguca agggcagucg agaugugcaa accagauggc ugugccccca ccaauuacaa 4800 aagaugcugc ccauugaucu guggaaaggc uauccaauuc agagaucgca gaacuaaugc 4860 aagauccacu auugauaugc uaguaacuga uauuauaaag gaauauagaa ccagaaacag 4920 uacacaggau aagcuggaag 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uggcggcuag uacucuggua cuucgguacc uuuguacgcc uguuuuaucu cccuucccaa 120 uguaacuuag aaguucuuaa aucaaugcuc aauagguggg gcgcaaacca gcgcucucau 180 gagcaagcac uccugucucc ccggugaggu uguauaaacu guucccacgg uugaaaacaa 240 ccuauccguu auccgcuaua guacuucgag aaaccuagua ccaccuuugg auuguugacg 300 cguugcgcuc agcacacuaa cccgugugua gcuugggucg augagucugg acauaccuca 360 cuggcgacag ugguccaggc ugcguuggcg gccuacucau ggugaaagcc augagacgcu 420 agacaugaac aaggugugaa gagucuauug agcuacuaua gaguccuccg gccccugaau 480 gcggcuaauc cuaaccaugg agcaagugcu cacaggccag ugaguugcuu gucguaaugc 540 gcaaguccgu ggcggaaccg acuacuuugg guguccgugu uucacuuuuu acuuuuauga 600 cugcuuaugg ugacaauuug auauuguuac cauuuagcuu gucaaaucaa uugcaaaaga 660 uccuaaaucu uauuuaucaa cuugcaucuu gauaacuuua auuugaaaau uuuaacaaug 720 ggagcucagg uuacuagaca acaaacuggc acucaugaaa augccaacau ugccacaaau 780 ggaucucaua ucacauacaa ucagauaaac uuuuacaagg auagcuaugc ggcuucagcc 840 agcaagcagg auuuuucaca ggacccauca aaauucacug aaccaguagu ggaagguuua 900 aaagcagggg cgccaguuuu gaaaucuccu agugcugagg cauguggcua cagugauaga 960 guauuacagc ucaaauuagg aaauucagcu auugucaccc aggaagcagc gaacuacugc 1020 ugcgcuuaug gugaauggcc caauuacuua ccagaccaug aagcaguagc cauugauaaa 1080 ccuacacaac cagaaacugc uacagauaga uucuacacuu ugaaaucagu caaaugggaa 1140 acuggaagca caggauggug guggaaacua cccgaugcac ugaauaauau aggcauguuu 1200 ggacagaaug ugcagcauca cuaccuauau agaucugguu ucuugauuca ugugcagugu 1260 aaugccacaa aauuccauca aggugccuua uuagugguag caauuccaga acaucagagg 1320 ggagcgcaca acaccaacac uagcccaggg uuugaugaua uaaugaaagg ugaagaagga 1380 gggaccuuca aucauccaua uguccuugau gauggaacau cauuggcuug ugcgacgaua 1440 uuuccacauc aguggauaaa ucugagaacc aacaauucag caacaauugu ucuucccugg 1500 augaaugcug cuccaaugga uuucccacuu agacauaauc aguggacgcu agcaauaaua 1560 ccaguggugc cauuagguac gcguacaaca ucaaguaugg ucccaauaac aguuucaauc 1620 gcuccaaugu guugugaguu uaauggacuu agacacgcca uuacucaagg ugucccaaca 1680 uaccuuuuac caggcucggg acaauuccua acaacugaug aucauagcuc ugcaccagcu 1740 cucccguguu ucaacccaac uccagaaaug cauaucccag ggcagguccg uaacaugcua 1800 gaaguggucc aaguggaauc aaugauggag auuaauaaca cagaaagugc aguuggcaug 1860 gagcgucuua agguugauau aucagcauug acagaugucg aucaauuguu auucaacauu 1920 ccacuggaca uacaguugga ugggccacuu agaaacacuu ugguaggaaa cauaucuaga 1980 uauuacacuc auuggucugg aucccuagaa augacguuua uguuuugugg cagcuucaug 2040 gcaacgggaa aauuaauccu gugcuauacu ccuccaggug gaucaugccc gacaaccaga 2100 gagaccgcca uguuagguac acauauuguu ugggauuuug gauuacaauc uaguguaacc 2160 cugauaauac cuuggauuag uggaucccac uacaggaugu uuaauaauga ugcuaaguca 2220 acuaaugcca acguuggcua ugucacuugu uuuaugcaga ccaaucugau aguccccagu 2280 gaauccucug acacguguuc cuugauaggg uucauagcag caaaagauga uuucucccuc 2340 agauuaauga gagacagccc ugacauugga caacuagacc auuuacaugc agcagaggca 2400 gccuaccaga ucgagagcau caucaaaaca gcgaccgaca cugugaaaag ugagauuaau 2460 gcugaacuug gugugguccc uagcuuaaau gcaguugaaa caggugcaac uucuaacacu 2520 gaaccagaag aagccauaca aacucgcaca gugauaaauc agcacggugu auccgagacu 2580 cuaguggaga auuuucucag uagagcagcu uugguaucaa agagaaguuu ugaauacaaa 2640 gaucauacuu cgucugcagc acaagcagac aagaacuuuu ucaaauggac aauuaacacc 2700 agauccuuug uacaguuaag aagaaaauua gaauuauuca cauaccuuag auuugaugcu 2760 gagaucacua uacucacaac uguagcagug aaugguagug guaauaauac auacgugggu 2820 cuuccugacu ugacacucca agcaauguuu guacccacug gugcucuuac cccagaaaaa 2880 caggacucau uccacuggca gucaggcagu aaugcuagug uauucuuuaa aaucuccgac 2940 cccccagcca gaauaaccau accuuuuaug ugcauuaacu cagcauacuc aguuuuuuau 3000 gauggcuuug ccggauuuga gaaaaacggu cuguauggaa uaaauccagc ugacacuauu 3060 gguaacuuau guguuagaau agugaaugaa caccaaccag uugguuucac agugaccguu 3120 aggguuuaca ugaagccuaa acacauaaaa gcaugggcac cacgaccacc acgaacuuug 3180 ccauauauga guauugcaaa ugcaaauuac aaagguaaag aaagagcacc aaaugcgcuc 3240 aaugcuauaa uuggcaauag agacaguguc aaaaccaugc cucauaauau agugaacacu 3300 gguccaggcu ucggaggagu uuuuguaggg ucuuucaaaa uaaucaacua ucacuuggcc 3360 acuacagaag agagacaguc agcuaucuau guggauuggc aaucagacgu cuugguuacc 3420 cccauugcug cucauggaag gcaccaaaua gcaagaugca agugcaacac agggguuuac 3480 uauuguaggc acaaaaacag aaguuacccg auuugcuuug aaggcccagg gauucaaugg 3540 auugaacaaa augaauauua cccagcaagg uaccagacca auguacuauu ggcaguuggu 3600 ccugcggaag caggagauug cggugguuua cuaguuuguc cacauggggu aaucggucuu 3660 cuuacagcag gagggggugg aauuguagcu uucacugaua ucaggaauuu gcuaugguua 3720 gauacugaug cuauggaaca aggcauuacu gauuauauuc aaaaucuugg uaaugccuuu 3780 ggagcaggau uuacagaaac aaucucuaau aaagccaagg aagugcaaga uaugcuaauu 3840 ggagagaguu cacuauuaga aaaauuguua aaagcucuaa ucaaaaucau aucagcauua 3900 guaauuguaa ucagaaacuc agaagauuua gucacaguca cagccacacu agcauuguug 3960 ggaugccaug auucaccaug gagcuacuug aaacagaagg uauguucaua cuuagguauu 4020 ccuuauguac cuagacaggg ugaaucgugg cuuaagaaau ucacagaggc augcaaugcu 4080 cuuagagguc uggauuggcu aucgcaaaag auagauaaau ucaucaacug gcuuaaaacc 4140 aaaauauuac cagaagcuag ggagaaauau gaauuugugc aaaggcucaa acaguuaccg 4200 gugauagaaa accaaguuag uacaaucgag cauagcugcc caacaacaga acaacaacag 4260 gccuuauuca acaacgucca auacuauuca cacuacugua gaaaguacgc accacuuuac 4320 gcaguggaag caaagagggu aguagcucuu gaaaagaaaa uaaacaacua cauccaguuc 4380 aaguccaaau cucgcauuga accgguuugu uuaauaauac auggcucucc aggaacuggc 4440 aagucagugg cuucaaauuu aauugccagg gcuaucacag agaaauuggg gggggacauu 4500 uauuccuugc cuccagaccc uaaauauuuu gauggauaca aacagcaaac agugguccuc 4560 auggaugauu uaaugcaaaa uccagauggg aaugacauau cuauguucug ccaaaugguc 4620 uccacuguag auuucauacc cccaauggcu aguuuggagg aaaaaggaac ucuauacacc 4680 aguccauuuu uaauagcuac uaccaaugcu ggcucaauac augcaccaac uguaucagac 4740 ucaaaggcuu ugucacgcag auuuaaauuu gacguggaca uugaagucac agauucauac 4800 aaggacucaa auaaauugga uaugucaagg gcagucgaga ugugcaaacc agauggcugu 4860 gcccccacca auuacaaaag augcugccca uugaucugug gaaaggcuau ccaauucaga 4920 gaucgcagaa cuaaugcaag auccacuauu gauaugcuag uaacugauau uauaaaggaa 4980 uauagaacca gaaacaguac acaggauaag cuggaagcuc uguuucaggg gccuccacag 5040 uuuaaagaga ucaaaauuuc agucacccca gauacaccag cuccugaugc uauaaaugac 5100 cuucuuaggu caguggauuc ucaagaaguu agggauuauu gccaaaagaa aggauggauu 5160 guaguacacc caucaaauga gcuaauagua gaaaaacaca uuaguagagc uuuuauuacu 5220 cuacaagcca uugccaccuu uguaucaaua gcugguguag uuuauguuau auacaaacuu 5280 uuugcuggca uucagggucc auacacagga auccccaauc cuaaaccuaa aguacccucu 5340 cucagaacag cuaaagugca aggaccaggg uucgauuuug cacaagccau aaugaagaaa 5400 aauaccguca uugcaaggac ugaaaagggu gaguucacca ugcugggugu auaugauagg 5460 guagcgguca uccccacaca cgcaucuguu ggagaaacca uuuacauuaa ugauguagag 5520 acuaaaguuu uagaugcgug ugcacuuaga gacuugacug auacaaacuu agagauaacc 5580 auagucaaau uagaccguaa ucaaaaauuu agagauauca gacauuuucu gcccagauau 5640 gaggaugauu acaaugacgc ugugcuuagc guacauacau caaaauuccc aaauauguau 5700 aucccaguug gacaagucac caauuauggc uucuugaacc uaggugguac accgacgcac 5760 cgcauuuuaa uguauaacuu cccaacaaga gcuggccagu gugguggugu ggugacaacu 5820 acagguaagg ugauaggaau acauguaggu ggaaauggag cucaaggauu ugcagcaaug 5880 cuacuacacu cuuacuuuuc cgauacacaa ggugagauag uuaguaguga aaagaguggg 5940 gugugcauua acgcaccggc aaagacuaaa cuccaaccua guguuuucca ucaaguuuuu 6000 gaagguucaa aggaaccagc aguucucaau ccaaaagauc cuaggcuuaa aacagauuuc 6060 gaggaggcca uuuucucaaa guacacaggu aacaaaauua uguuaaugga ugaguacaug 6120 gaagaggcag uggaucauua uguggggugu uuagaaccau uagacaucag uguggauccc 6180 auaccccugg aaagugccau guauggaaug gauggccuug aggcauuaga cuuaacuacc 6240 agugcaggau ucccuuacuu acuacaaggg aagaagaaaa gggauauauu uaauagacau 6300 acuagagaca ccagugaaau gacaaaaaug uuagagaaau auggaguuga ccuaccuuuu 6360 guaaccuuug uaaaagauga gcuuagauca agagaaaaag uugaaaaagg gaaaucacgc 6420 cugauugagg ccaguuccuu gaaugacuca guugcuauga gaguugccuu uggaaaccuu 6480 uacgccacau uucacaacaa uccagguaca gcaacuggua gugcaguugg uugugaucca 6540 gauauauuuu ggucaaaaau cccuauuuug uuagauggag aaaucuuugc uuuugacuac 6600 acugguuaug augcuaguuu gucaccagug ugguuugccu gcuuaaagaa aguucuaauu 6660 aaguuagguu acacacauca aacgucuuuu auagauuauu ugugucauuc aguacauuua 6720 uauaaggaca aaaaauacau aguuaauggu ggaaugcccu cugguucuuc aggcaccagc 6780 auauucaaca cuaugaucaa caauauaauc auaagaacuu uauuaauuag gguuuacaaa 6840 ggcauagacc uggaccaguu caaaaugauu gccuaugggg augauguuau ugcuagcuac 6900 ccacauaaga uugauccagg uuugcuggca gaagcaggua aacaguaugg auuaguaaug 6960 acgccagcag acaaaggaac caguuuuauu gacacaaauu gggaaaaugu aacuuucuua 7020 aaaagauauu ucagagcaga ugaucaauac cccuuucuca uacauccagu gaugccaaug 7080 aaagagauac augaaucuau uagauggacu aaagauccca gaaacacaca ggaucauguu 7140 aggucuuugu gcuaccucgc auggcauaau ggagaggagg cuuauaauga auuuugcaga 7200 aaaaucagaa gugugccugu gggaagagca uugacacuac cugcauacuc uagucuuaga 7260 cggaaauggu uagauucguu cuagacaacu cuaacagcug guugaagggg accaacgaua 7320 cagcugguug aaggggacca aaccggucca cacacuuccu uacauuccau cacccacaca 7380 cuuccuuaca uuccaauuga aacccaaguu auaguuacuu ucauuuagag guaaauuuug 7440 gucacuuggg ggccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ucgac 7485 <210> 15 <211> 7860 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genomic sequence of EV-D68-GM-CSF <400> 15 uaauacgacu cacuauaggu uaaaacagcc uugggguugu ucccacucca 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aaagcagggg cgccaguuuu gaaaucuccu agugcugagg cauguggcua cagugauaga 960 guauuacagc ucaaauuagg aaauucagcu auugucaccc aggaagcagc gaacuacugc 1020 ugcgcuuaug gugaauggcc caauuacuua ccagaccaug aagcaguagc cauugauaaa 1080 ccuacacaac cagaaacugc uacagauaga uucuacacuu ugaaaucagu caaaugggaa 1140 acuggaagca caggauggug guggaaacua cccgaugcac ugaauaauau aggcauguuu 1200 ggacagaaug ugcagcauca cuaccuauau agaucugguu ucuugauuca ugugcagugu 1260 aaugccacaa aauuccauca aggugccuua uuagugguag caauuccaga acaucagagg 1320 ggagcgcaca acaccaacac uagcccaggg uuugaugaua uaaugaaagg ugaagaagga 1380 gggaccuuca aucauccaua uguccuugau gauggaacau cauuggcuug ugcgacgaua 1440 uuuccacauc aguggauaaa ucugagaacc aacaauucag caacaauugu ucuucccugg 1500 augaaugcug cuccaaugga uuucccacuu agacauaauc aguggacgcu agcaauaaua 1560 ccaguggugc cauuagguac gcguacaaca ucaaguaugg ucccaauaac aguuucaauc 1620 gcuccaaugu guugugaguu uaauggacuu agacacgcca uuacucaagg ugucccaaca 1680 uaccuuuuac caggcucggg acaauuccua acaacugaug aucauagcuc ugcaccagcu 1740 cucccguguu ucaacccaac uccagaaaug cauaucccag ggcagguccg uaacaugcua 1800 gaaguggucc aaguggaauc aaugauggag auuaauaaca cagaaagugc aguuggcaug 1860 gagcgucuua agguugauau aucagcauug acagaugucg aucaauuguu auucaacauu 1920 ccacuggaca uacaguugga ugggccacuu agaaacacuu ugguaggaaa cauaucuaga 1980 uauuacacuc auuggucugg aucccuagaa augacguuua uguuuugugg cagcuucaug 2040 gcaacgggaa aauuaauccu gugcuauacu ccuccaggug gaucaugccc gacaaccaga 2100 gagaccgcca uguuagguac acauauuguu ugggauuuug gauuacaauc uaguguaacc 2160 cugauaauac cuuggauuag uggaucccac uacaggaugu uuaauaauga ugcuaaguca 2220 acuaaugcca acguuggcua ugucacuugu uuuaugcaga ccaaucugau aguccccagu 2280 gaauccucug acacguguuc cuugauaggg uucauagcag caaaagauga uuucucccuc 2340 agauuaauga gagacagccc ugacauugga caacuagacc auuuacaugc agcagaggca 2400 gccuaccaga ucgagagcau caucaaaaca gcgaccgaca cugugaaaag ugagauuaau 2460 gcugaacuug gugugguccc uagcuuaaau gcaguugaaa caggugcaac uucuaacacu 2520 gaaccagaag aagccauaca aacucgcaca gugauaaauc agcacggugu auccgagacu 2580 cuaguggaga auuuucucag uagagcagcu uugguaucaa agagaaguuu ugaauacaaa 2640 gaucauacuu cgucugcagc acaagcagac aagaacuuuu ucaaauggac aauuaacacc 2700 agauccuuug uacaguuaag aagaaaauua gaauuauuca cauaccuuag auuugaugcu 2760 gagaucacua uacucacaac uguagcagug aaugguagug guaauaauac auacgugggu 2820 cuuccugacu ugacacucca agcaauguuu guacccacug gugcucuuac cccagaaaaa 2880 caggacucau uccacuggca gucaggcagu aaugcuagug uauucuuuaa aaucuccgac 2940 cccccagcca gaauaaccau accuuuuaug ugcauuaacu cagcauacuc aguuuuuuau 3000 gauggcuuug ccggauuuga gaaaaacggu cuguauggaa uaaauccagc ugacacuauu 3060 gguaacuuau guguuagaau agugaaugaa caccaaccag uugguuucac agugaccguu 3120 aggguuuaca ugaagccuaa acacauaaaa gcaugggcac cacgaccacc acgaacuuug 3180 ccauauauga guauugcaaa ugcaaauuac aaagguaaag aaagagcacc aaaugcgcuc 3240 aaugcuauaa uuggcaauag agacaguguc aaaaccaugc cucauaauau agugaacacu 3300 gguccaggcu ucuggcugca gagccugcug cucuugggca cuguggccug cagcaucucu 3360 gcacccgccc gcucgcccag ccccagcacg cagcccuggg agcaugugaa ugccauccag 3420 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acuguagauu ucauaccccc aauggcuagu uuggaggaaa aaggaacucu auacaccagu 5160 ccauuuuuaa uagcuacuac caaugcuggc ucaauacaug caccaacugu aucagacuca 5220 aaggcuuugu cacgcagauu uaaauuugac guggacauug aagucacaga uucauacaag 5280 gacucaaaua aauuggauau gucaagggca gucgagaugu gcaaaccaga uggcugugcc 5340 cccaccaauu acaaaagaug cugcccauug aucuguggaa aggcuaucca auucagagau 5400 cgcagaacua augcaagauc cacuauugau augcuaguaa cugauauuau aaaggaauau 5460 agaaccagaa acaguacaca ggauaagcug gaagcucugu uucaggggcc uccacaguuu 5520 aaagagauca aaauuucagu caccccagau acaccagcuc cugaugcuau aaaugaccuu 5580 cuuaggucag uggauucuca agaaguuagg gauuauugcc aaaagaaagg auggauugua 5640 guacacccau caaaugagcu aauaguagaa aaacacauua guagagcuuu uauuacucua 5700 caagccauug ccaccuuugu aucaauagcu gguguaguuu auguuauaua caaacuuuuu 5760 gcuggcauuc aggguccaua cacaggaauc cccaauccua aaccuaaagu acccucucuc 5820 agaacagcua aagugcaagg accaggguuc gauuuugcac aagccauaau gaagaaaaau 5880 accgucauug caaggacuga aaagggugag uucaccaugc uggguguaua ugauagggua 5940 gcggucaucc ccacacacgc aucuguugga gaaaccauuu acauuaauga uguagagacu 6000 aaaguuuuag augcgugugc acuuagagac uugacugaua caaacuuaga gauaaccaua 6060 gucaaauuag accguaauca aaaauuuaga gauaucagac auuuucugcc cagauaugag 6120 gaugauuaca augacgcugu gcuuagcgua cauacaucaa aauucccaaa uauguauauc 6180 ccaguuggac aagucaccaa uuauggcuuc uugaaccuag gugguacacc gacgcaccgc 6240 auuuuaaugu auaacuuccc aacaagagcu ggccagugug gugguguggu gacaacuaca 6300 gguaagguga uaggaauaca uguaggugga aauggagcuc aaggauuugc agcaaugcua 6360 cuacacucuu acuuuuccga uacacaaggu gagauaguua guagugaaaa gaguggggug 6420 ugcauuaacg caccggcaaa gacuaaacuc caaccuagug uuuuccauca aguuuuugaa 6480 gguucaaagg aaccagcagu ucucaaucca aaagauccua ggcuuaaaac agauuucgag 6540 gaggccauuu ucucaaagua cacagguaac aaaauuaugu uaauggauga guacauggaa 6600 gaggcagugg aucauuaugu gggguguuua gaaccauuag acaucagugu ggaucccaua 6660 ccccuggaaa gugccaugua uggaauggau ggccuugagg cauuagacuu aacuaccagu 6720 gcaggauucc cuuacuuacu acaagggaag aagaaaaggg auauauuuaa uagacauacu 6780 agagacacca gugaaaugac aaaaauguua gagaaauaug gaguugaccu accuuuugua 6840 accuuuguaa aagaugagcu uagaucaaga gaaaaaguug aaaaagggaa aucacgccug 6900 auugaggcca guuccuugaa ugacucaguu gcuaugagag uugccuuugg aaaccuuuac 6960 gccacauuuc acaacaaucc agguacagca acugguagug caguugguug ugauccagau 7020 auauuuuggu caaaaauccc uauuuuguua gauggagaaa ucuuugcuuu ugacuacacu 7080 gguuaugaug cuaguuuguc accagugugg uuugccugcu uaaagaaagu ucuaauuaag 7140 uuagguuaca cacaucaaac gucuuuuaua gauuauuugu gucauucagu acauuuauau 7200 aaggacaaaa aauacauagu uaauggugga augcccucug guucuucagg caccagcaua 7260 uucaacacua ugaucaacaa uauaaucaua agaacuuuau uaauuagggu uuacaaaggc 7320 auagaccugg accaguucaa aaugauugcc uauggggaug auguuauugc uagcuaccca 7380 cauaagauug auccagguuu gcuggcagaa gcagguaaac aguauggauu aguaaugacg 7440 ccagcagaca aaggaaccag uuuuauugac acaaauuggg aaaauguaac uuucuuaaaa 7500 agauauuuca gagcagauga ucaauacccc uuucucauac auccagugau gccaaugaaa 7560 gagauacaug aaucuauuag auggacuaaa gaucccagaa acacacagga ucauguuagg 7620 ucuuugugcu accucgcaug gcauaaugga gaggaggcuu auaaugaauu uugcagaaaa 7680 aucagaagug ugccuguggg aagagcauug acacuaccug cauacucuag ucuuagacgg 7740 aaaugguuag auucguucua gacaacucua auugaaaccc aaguuauagu uacuuucauu 7800 uagagguaaa uuuuggucac uugggggcca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagucgac 7860 7860 <210> 16 <211> 8226 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genomic sequence of EV-D68-Anti-PD1 <400> 16 uaauacgacu cacuauaggu uaaaacagcc uugggguugu ucccacucca agggcccacg 60 uggcggcuag uacucuggua cuucgguacc uuuguacgcc uguuuuaucu cccuucccaa 120 uguaacuuag aaguucuuaa aucaaugcuc aauagguggg gcgcaaacca gcgcucucau 180 gagcaagcac uccugucucc ccggugaggu uguauaaacu guucccacgg uugaaaacaa 240 ccuauccguu auccgcuaua guacuucgag aaaccuagua ccaccuuugg auuguugacg 300 cguugcgcuc agcacacuaa cccgugugua gcuugggucg augagucugg acauaccuca 360 cuggcgacag ugguccaggc ugcguuggcg gccuacucau ggugaaagcc augagacgcu 420 agacaugaac aaggugugaa gagucuauug agcuacuaua gaguccuccg gccccugaau 480 gcggcuaauc cuaaccaugg agcaagugcu cacaggccag ugaguugcuu gucguaaugc 540 gcaaguccgu ggcggaaccg acuacuuugg guguccgugu uucacuuuuu acuuuuauga 600 cugcuuaugg ugacaauuug auauuguuac cauuuagcuu gucaaaucaa uugcaaaaga 660 uccuaaaucu uauuuaucaa cuugcaucuu gauaacuuua auuugaaaau uuuaacaaug 720 ggagcucagg uuacuagaca acaaacuggc acucaugaaa augccaacau ugccacaaau 780 ggaucucaua ucacauacaa ucagauaaac uuuuacaagg auagcuaugc ggcuucagcc 840 agcaagcagg auuuuucaca ggacccauca aaauucacug aaccaguagu ggaagguuua 900 aaagcagggg cgccaguuuu gaaaucuccu agugcugagg cauguggcua cagugauaga 960 guauuacagc ucaaauuagg aaauucagcu auugucaccc aggaagcagc gaacuacugc 1020 ugcgcuuaug gugaauggcc caauuacuua ccagaccaug aagcaguagc cauugauaaa 1080 ccuacacaac cagaaacugc uacagauaga uucuacacuu ugaaaucagu caaaugggaa 1140 acuggaagca caggauggug guggaaacua cccgaugcac ugaauaauau aggcauguuu 1200 ggacagaaug ugcagcauca cuaccuauau agaucugguu ucuugauuca ugugcagugu 1260 aaugccacaa aauuccauca aggugccuua uuagugguag caauuccaga acaucagagg 1320 ggagcgcaca acaccaacac uagcccaggg uuugaugaua uaaugaaagg ugaagaagga 1380 gggaccuuca aucauccaua uguccuugau gauggaacau cauuggcuug ugcgacgaua 1440 uuuccacauc aguggauaaa ucugagaacc aacaauucag caacaauugu ucuucccugg 1500 augaaugcug cuccaaugga uuucccacuu agacauaauc aguggacgcu agcaauaaua 1560 ccaguggugc cauuagguac gcguacaaca ucaaguaugg ucccaauaac aguuucaauc 1620 gcuccaaugu guugugaguu uaauggacuu agacacgcca uuacucaagg ugucccaaca 1680 uaccuuuuac caggcucggg acaauuccua acaacugaug aucauagcuc ugcaccagcu 1740 cucccguguu ucaacccaac uccagaaaug cauaucccag ggcagguccg uaacaugcua 1800 gaaguggucc aaguggaauc aaugauggag auuaauaaca cagaaagugc aguuggcaug 1860 gagcgucuua agguugauau aucagcauug acagaugucg aucaauuguu auucaacauu 1920 ccacuggaca uacaguugga ugggccacuu agaaacacuu ugguaggaaa cauaucuaga 1980 uauuacacuc auuggucugg aucccuagaa augacguuua uguuuugugg cagcuucaug 2040 gcaacgggaa aauuaauccu gugcuauacu ccuccaggug gaucaugccc gacaaccaga 2100 gagaccgcca uguuagguac acauauuguu ugggauuuug gauuacaauc uaguguaacc 2160 cugauaauac cuuggauuag uggaucccac uacaggaugu uuaauaauga ugcuaaguca 2220 acuaaugcca acguuggcua ugucacuugu uuuaugcaga ccaaucugau aguccccagu 2280 gaauccucug acacguguuc cuugauaggg uucauagcag caaaagauga uuucucccuc 2340 agauuaauga gagacagccc ugacauugga caacuagacc auuuacaugc agcagaggca 2400 gccuaccaga ucgagagcau caucaaaaca gcgaccgaca cugugaaaag ugagauuaau 2460 gcugaacuug gugugguccc uagcuuaaau gcaguugaaa caggugcaac uucuaacacu 2520 gaaccagaag aagccauaca aacucgcaca gugauaaauc agcacggugu auccgagacu 2580 cuaguggaga auuuucucag uagagcagcu uugguaucaa agagaaguuu ugaauacaaa 2640 gaucauacuu cgucugcagc acaagcagac aagaacuuuu ucaaauggac aauuaacacc 2700 agauccuuug uacaguuaag aagaaaauua gaauuauuca cauaccuuag auuugaugcu 2760 gagaucacua uacucacaac uguagcagug aaugguagug guaauaauac auacgugggu 2820 cuuccugacu ugacacucca agcaauguuu guacccacug gugcucuuac cccagaaaaa 2880 caggacucau uccacuggca gucaggcagu aaugcuagug uauucuuuaa aaucuccgac 2940 cccccagcca gaauaaccau accuuuuaug ugcauuaacu cagcauacuc aguuuuuuau 3000 gauggcuuug ccggauuuga gaaaaacggu cuguauggaa uaaauccagc ugacacuauu 3060 gguaacuuau guguuagaau agugaaugaa caccaaccag uugguuucac agugaccguu 3120 aggguuuaca ugaagccuaa acacauaaaa gcaugggcac cacgaccacc acgaacuuug 3180 ccauauauga guauugcaaa ugcaaauuac aaagguaaag aaagagcacc aaaugcgcuc 3240 aaugcuauaa uuggcaauag agacaguguc aaaaccaugc cucauaauau agugaacacu 3300 gguccaggcu ucaugaagca ccugugguuc uuccugcugc ugguggccgc uccuaggugg 3360 gugcuguccc aggugcagcu ggugcagagc ggcguggagg ugaagaagcc cggcgcuucc 3420 gugaaggugu ccugcaaggc cuccggcuac accuucacca acuacuacau guacugggug 3480 aggcaggccc cuggacaggg acuggagugg augggcggca ucaacccuuc caacggcggc 3540 accaacuuca acgagaaguu caagaaccgg gugacccuga ccaccgacuc cuccaccacc 3600 accgccuaca uggagcugaa gucccugcag uuugacgaca ccgccgugua cuacugcgcc 3660 aggagggacu accgguucga caugggcuuc gacuacuggg gccagggcac aaccgugacc 3720 guguccagcg gagguggcgg aucuggaggg ggugguagcg guggaggcgg gagugagauc 3780 gugcugaccc aguccccugc uacacugucc cugucccccg gcgagagggc uacacugagc 3840 ugcagggccu ccaagggcgu guccaccucc ggcuacuccu accugcacug guaccagcag 3900 aagccuggac aggcucccag gcugcugauc uaccuggccu ccuaccugga guccggcgug 3960 ccugcuaggu uuuccggcag cggcagcggc accgauuuca cccugaccau cuccucccug 4020 gagcccgagg acuucgccgu guacuacugc cagcacucca gggaucugcc ucugaccuuc 4080 ggcggcggca ccaaggugga gaucaagagu gucaaaacca ugccucauaa uauagugaac 4140 acugguccag gcuucggagg aguuuuugua gggucuuuca aaauaaucaa cuaucacuug 4200 gccacuacag aagagagaca gucagcuauc uauguggauu ggcaaucaga cgucuugguu 4260 acccccauug cugcucaugg aaggcaccaa auagcaagau gcaagugcaa cacagggguu 4320 uacuauugua ggcacaaaaa cagaaguuac ccgauuugcu uugaaggccc agggauucaa 4380 uggauugaac aaaaugaaua uuacccagca agguaccaga ccaauguacu auuggcaguu 4440 gguccugcgg aagcaggaga uugcgguggu uuacuaguuu guccacaugg gguaaucggu 4500 cuucuuacag caggaggggg uggaauugua gcuuucacug auaucaggaa uuugcuaugg 4560 uuagauacug augcuaugga acaaggcauu acugauuaua uucaaaaucu ugguaaugcc 4620 uuuggagcag gauuuacaga aacaaucucu aauaaagcca aggaagugca agauaugcua 4680 auuggagaga guucacuauu agaaaaauug uuaaaagcuc uaaucaaaau cauaucagca 4740 uuaguaauug uaaucagaaa cucagaagau uuagucacag ucacagccac acuagcauug 4800 uugggaugcc augauucacc auggagcuac uugaaacaga agguauguuc auacuuaggu 4860 auuccuuaug uaccuagaca gggugaaucg uggcuuaaga aauucacaga ggcaugcaau 4920 gcucuuagag gucuggauug gcuaucgcaa aagauagaua aauucaucaa cuggcuuaaa 4980 accaaaauau uaccagaagc uagggagaaa uaugaauuug ugcaaaggcu caaacaguua 5040 ccggugauag aaaaccaagu uaguacaauc gagcauagcu gcccaacaac agaacaacaa 5100 caggccuuau ucaacaacgu ccaauacuau ucacacuacu guagaaagua cgcaccacuu 5160 uacgcagugg aagcaaagag gguaguagcu cuugaaaaga aaauaaacaa cuacauccag 5220 uucaagucca aaucucgcau ugaaccgguu uguuuaauaa uacauggcuc uccaggaacu 5280 ggcaagucag uggcuucaaa uuuaauugcc agggcuauca cagagaaauu ggggggggac 5340 auuuauuccu ugccuccaga cccuaaauau uuugauggau acaaacagca aacagugguc 5400 cucauggaug auuuaaugca aaauccagau gggaaugaca uaucuauguu cugccaaaug 5460 gucuccacug uagauuucau acccccaaug gcuaguuugg aggaaaaagg aacucuauac 5520 accaguccau uuuuaauagc uacuaccaau gcuggcucaa uacaugcacc aacuguauca 5580 gacucaaagg cuuugucacg cagauuuaaa uuugacgugg acauugaagu cacagauuca 5640 uacaaggacu caaauaaauu ggauauguca agggcagucg agaugugcaa accagauggc 5700 ugugccccca ccaauuacaa aagaugcugc ccauugaucu guggaaaggc uauccaauuc 5760 agagaucgca gaacuaaugc aagauccacu auugauaugc uaguaacuga uauuauaaag 5820 gaauauagaa ccagaaacag uacacaggau aagcuggaag cucuguuuca ggggccucca 5880 caguuuaaag agaucaaaau uucagucacc ccagauacac cagcuccuga ugcuauaaau 5940 gaccuucuua ggucagugga uucucaagaa guuagggauu auugccaaaa gaaaggaugg 6000 auuguaguac acccaucaaa ugagcuaaua guagaaaaac acauuaguag agcuuuuauu 6060 acucuacaag ccauugccac cuuuguauca auagcuggug uaguuuaugu uauauacaaa 6120 cuuuuugcug gcauucaggg uccauacaca ggaaucccca auccuaaacc uaaaguaccc 6180 ucucucagaa cagcuaaagu gcaaggacca ggguucgauu uugcacaagc cauaaugaag 6240 aaaaauaccg ucauugcaag gacugaaaag ggugaguuca ccaugcuggg uguauaugau 6300 aggguagcgg ucauccccac acacgcaucu guuggagaaa ccauuuacau uaaugaugua 6360 gagacuaaag uuuuagaugc gugugcacuu agagacuuga cugauacaaa cuuagagaua 6420 accauaguca aauuagaccg uaaucaaaaa uuuagagaua ucagacauuu ucugcccaga 6480 uaugaggaug auuacaauga cgcugugcuu agcguacaua caucaaaauu cccaaauaug 6540 uauaucccag uuggacaagu caccaauuau ggcuucuuga accuaggugg uacaccgacg 6600 caccgcauuu uaauguauaa cuucccaaca agagcuggcc aguguggugg uguggugaca 6660 acuacaggua aggugauagg aauacaugua gguggaaaug gagcucaagg auuugcagca 6720 augcuacuac acucuuacuu uuccgauaca caaggugaga uaguuaguag ugaaaagagu 6780 ggggugugca uuaacgcacc ggcaaagacu aaacuccaac cuaguguuuu ccaucaaguu 6840 uuugaagguu caaaggaacc agcaguucuc aauccaaaag auccuaggcu uaaaacagau 6900 uucgaggagg ccauuuucuc aaaguacaca gguaacaaaa uuauguuaau ggaugaguac 6960 auggaagagg caguggauca uuaugugggg uguuuagaac cauuagacau caguguggau 7020 cccauacccc uggaaagugc cauguaugga auggauggcc uugaggcauu agacuuaacu 7080 accagugcag gauucccuua cuuacuacaa gggaagaaga aaagggauau auuuaauaga 7140 cauacuagag acaccaguga aaugacaaaa auguuagaga aauauggagu ugaccuaccu 7200 uuuguaaccu uuguaaaaga ugagcuuaga ucaagagaaa aaguugaaaa agggaaauca 7260 cgccugauug aggccaguuc cuugaaugac ucaguugcua ugagaguugc cuuuggaaac 7320 cuuuacgcca cauuucacaa caauccaggu acagcaacug guagugcagu ugguugugau 7380 ccagauauau uuuggucaaa aaucccuauu uuguuagaug gagaaaucuu ugcuuuugac 7440 uacacugguu augaugcuag uuugucacca gugugguuug ccugcuuaaa gaaaguucua 7500 auuaaguuag guuacacaca ucaaacgucu uuuauagauu auuuguguca uucaguacau 7560 uuauauaagg acaaaaaaua cauaguuaau gguggaaugc ccucugguuc uucaggcacc 7620 agcauauuca acacuaugau caacaauaua aucauaagaa cuuuauuaau uaggguuuac 7680 aaaggcauag accuggacca guucaaaaug auugccuaug gggaugaugu uauugcuagc 7740 uacccacaua agauugaucc agguuugcug gcagaagcag guaaacagua uggauuagua 7800 augacgccag cagacaaagg aaccaguuuu auugacacaa auugggaaaa uguaacuuuc 7860 uuaaaaagau auuucagagc agaugaucaa uaccccuuuc ucauacaucc agugaugcca 7920 augaaagaga uacaugaauc uauuagaugg acuaaagauc ccagaaacac acaggaucau 7980 guuaggucuu ugugcuaccu cgcauggcau aauggagagg aggcuuauaa ugaauuuugc 8040 agaaaaauca gaagugugcc ugugggaaga gcauugacac uaccugcaua cucuagucuu 8100 agacggaaau gguuagauuc guucuagaca acucuaauug aaacccaagu uauaguuacu 8160 uucauuuaga gguaaauuuu ggucacuugg gggccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8220 gucgac 8226 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of miR-133 target sequence <400> 17 acagctggtt gaaggggacc aa 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of miR-206 target sequence <400> 18 ccacacactt ccttacattc ca 22 <210> 19 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of tandem sequence of miR-133 target sequence and miR-206 target sequence <400> 19 acagctggtt gaaggggacc aacgatacag ctggttgaag gggaccaaac cggtccacac 60 acttccttac attccatcac ccacacactt ccttacattc ca 102 <210> 20 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the internal ribosome entry site sequence of HRV2 <400> 20 aacttagaag tttttcacaa agaccaatag ccggtaatca gccagattac tgaaggtcaa 60 gcacttctgt ttccccggtc aatgttgata tgctccaaca gggcaaaaac aactgcgatc 120 gttaaccgca aagcgcctac gcaaagctta gtagcatctt tgaaatcgtt tggctggtcg 180 atccgccatt tcccctggta gacctggcag atgaggctag aaatacccca ctggcgacag 240 tgttctagcc tgcgtggctg cctgcacacc ctatgggtgt gaagccaaac aatggacaag 300 gtgtgaagag ccccgtgtgc tcgctttgag tcctccggcc cctgaatgtg gctaacctta 360 accctgcagc tagagcacgt aacccaatgt gtatctagtc gtaatgagca attgcgggat 420 gggaccaact actttgggtg tccgtgtttc actttttcct ttatatttgc ttatggtgac 480 aatatataca atatatatat tggcacc 507

Claims (22)

  1. 엔테로바이러스(Enterovirus) D68(EV-D68) 또는 변이 EV-D68, 또는 분리된 핵산 분자를 포함하는 대상체의 종양 치료용 약제학적 조성물:
    상기 핵산 분자는 하기에서 선택되는 서열을 포함한다;
    (1) 상기 EV-D68 또는 변이 EV-D68의 게놈(genomic) 서열 또는 cDNA 서열; 및
    (2) 상기 게놈 서열 또는 cDNA 서열의 상보적 서열(complementary);
    상기 EV-D68는 야생형 EV-D68이고, 상기 변이 EV-D68의 게놈은 야생형 EV-D68의 게놈과 비교하여 하기 (i) 및 (ii)에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 변형(modifications)을 갖는다:
    (i) 5' 비번역 부위(5'UTR)의 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site; IRES) 서열의 외인성 IRES 서열로의 치환(substitution); 및
    (ii) 사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열, 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 마이크로RNA(microRNA)의 타겟 서열에서 선택되는 외인성 핵산의 삽입;
    및 상기 야생형 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 상기 야생형 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 외인성 IRES 서열은 인간 라이노바이러스 2(HRV2)의 내부 리보솜 유입점 서열인 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 하기의 특징 중 하나 또는 그 이상을 갖는, 약제학적 조성물:
    (1) 상기 사이토카인은 GM-CSF이며;
    (2) 상기 항종양 단백질 또는 폴리펩타이드는 PD-1 또는 PD-L1에 대한 scFv이고;
    (3) 상기 마이크로RNA는 miR-133 또는 miR-206에서 선택된다.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 EV-D68은 하기의 특징 중 하나를 갖는 것인, 약제학적 조성물:
    (1) 상기 변이 EV-D68의 게놈 서열은 서열번호 13-16 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이고; 및
    (2) 상기 변이 EV-D68의 cDNA 서열은 서열번호 8-11 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이다.
  5. 제 1 항에 있어서, 하기의 특징 중 하나를 갖는, 약제학적 조성물:
    (1) 상기 분리된 핵산 분자는 EV-D68 또는 변이 EV-D68의 게놈 서열로 이루어지거나; 또는
    (2) 상기 분리된 핵산 분자는 EV-D68 또는 변이 EV-D68의 cDNA 서열, 또는 상기 cDNA 서열의 상보적 서열을 포함하는 벡터이다.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 12-16 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지거나, 또는 서열번호 1, 8-11 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 벡터인 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 항종양 활성을 갖는 추가적인 약제 활성제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 추가적인 약제 활성제는 추가적인 항암 바이러스, 화학요법제 또는 면역요법제에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 추가적인 약제 활성제는 하기의 하나 또는 그 이상의 특징을 갖는 것인, 약제학적 조성물:
    (1) 상기 추가적인 항암 바이러스는 헤르페스바이러스(herpesvirus), 아데노바이러스(adenovirus), 파르보바이러스(parvovirus), 레오바이러스(reovirus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus), 수포성구내염바이러스(vesicular stomatitis virus), 홍역바이러스(measles virus) 또는 이의 어느 조합으로부터 선택되고;
    (2) 상기 화학요법제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 미토마이신(mitomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 미토산트론(mitoxantrone), 안트라사이클린(anthracyclines), 에토포시드(etoposide), 백금 화합물(platinum compounds), 탁세인(taxanes), 또는 이의 어느 조합으로부터 선택되며;
    (3) 상기 면역요법제는 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitors), 종양-특이적 표적 항체 또는 이의 어느 조합으로부터 선택된다.
  10. 제 1 항에 있어서, 하기의 특징 중 적어도 하나를 갖는, 약제학적 조성물:
    (1) 상기 종양은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 간암, 신장암, 신경모세포종, 신경교종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 갑상선암, 후두암, 골육종, 조혈계 종양으로부터 선택되고;
    (2) 상기 대상체는 인간이다.
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