KR20160137946A

KR20160137946A - 면역 세포 자극성 수용체 작용제(들)를 발현하는 아데노바이러스

Info

Publication number: KR20160137946A
Application number: KR1020167016399A
Authority: KR
Inventors: 프랭크 튜파로; 후안 푸에요-마르가레또; 칸델라 고메즈-만자노; 카를로스 콘래드; 더블유.케이. 알프레드 융; 홍 지앙
Original assignee: 디엔에이트릭스, 인코포레이티드; 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2016-12-02
Also published as: EP3071697A1; AU2014352749A1; CN106029889A; US20210301264A1; CA2931322A1; US20160289645A1; DK3071697T3; EP3071697A4; JP2020048582A; JP2016540505A; JP2021137029A; US20190093085A1; CN114317461A; EP3653714A1; SG10201907841UA; WO2015077624A1; EP3071697B1; ES2765489T3

Abstract

일부 실시예는 아데노바이러스성 암 치료 효과의 향상을 포함한다.

Description

면역 세포 자극성 수용체 작용제(들)를 발현하는 아데노바이러스{Adenovirus expressing immune cell stimulatory receptor agonist(s)}

I. 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 종양 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, OX40 리간드(OX40L) 등의 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 유전자가 변형된 복제성 온콜리틱(oncolytic) 바이러스에 관한 것이다.

II . 관련 기술에 대한 설명

암은 전 세계적으로 인간에서 질병률 및 사망률의 주요 원인 중 하나로 남아있다. 수술, 화학 요법 및 방사선이 암 치료에 대해 일부 성공적으로 이용되었지만, 새로운 전략이 요구된다. 정상 세포보다 종양 세포에 복제한 바이러스는 온콜리틱 작용제로서의 가능성을 보여주고 있다. 아데노바이러스를 이용하는 유전자 도입 및 종양 용해의 실현 가능성은 잘 확립되어있다.

추가적인 항암 치료제에 대한 요구가 남아있다.

개요

본 발명은 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 신규 복제 능력 온콜리틱 바이러스, 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스를 포함하는 약학적 조성물 및 다양한 암을 치료하는 그들의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스이다. 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 첫 번째 복제 주기에서 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 제공하며, 종양 항원을 인식하는 림프구를 활성화시키고 종양 주변의 면역 억제 환경을 반전시킴으로써 영구 반응기 항종양 면역 반응을 야기 시킨다. 특정 양상에서, 암을 가진 대상체에게 아데노바이러스와 같은 복제 능력 온콜리틱 바이러스의 투여는 조작되지 않은 바이러스(즉, 면역 자극성 수용체 작용제를 발현하진 않은)와 별도로 투여되는 경우 면역 세표 자극성 수용체 작용제와 비교하여 향상된 심지어 상승적인 항종양 면역력을 제공한다. 관련 양상에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스의 항종양 효과는 심지어 바이러스의 청소 후까지 지속되고, 심지어 하나 이상의 비-감염된 종양까지 확장된다.

특정 양상에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 바이러스 게놈의 비-필수 영역 내로 혼입된 이종성 핵산에서 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하며, 당해 이종성 핵산은 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스이고, 면역 세포 자극성 수용체 작용제의 발현은 E3 프로모터와 같은 내인성 아데노바이러스 프로모터 또는 주요 후기 프로모터와 같은 후기 아데노바이러스 프로모터의 제어하에 있다. 다른 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스이며, 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 핵산은 시토메갈로바이러스 프로모터(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터), 라우스 육종 바이러스(RSV)(예를 들어, RSV 프로모터) 또는 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터)으로 부터의 인핸서, 프로모터 및/또는 리더 서열과 같은 비-아데노바이러스 전사 및/또는 번역 조절 서열(즉, 동작 가능하게 연결)의 제어하에 있다. 구조체의 “이종성” 영역은 사실상 큰 분자와 관련하여 발견되지 않는 더 큰 핵산 분자 내에서 핵산의 식별 가능한 부분이다.

여러 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 CD28, OX40(CD134), 글루코코티코이드-유도된 TNF-수용체(GITR), CD137(4-1BB), 및 헤르페스 바이러스 엔트리 메디에이터 A(HVEM)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현한다. OX40, GITR, CD137 및 HVEM은 T 세포 활성 시 유도가능하게 발현되는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 패밀리의 일원이기 때문에 활성화된 이펙터 T 세포 및 메모리 T 세포에서 부자극을 유발한다. CD28을 통한 자극은 수지상 세포와 대식세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포(APCs)에 의해 유도되어야 한다; OX40 및 CD137과 같은 TNFR 가족 구성원을 통한 부자극은 주변의 비조혈 세포에 각각의 리간드의 발현에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스이다.

CD28은 가장 두드러진 부자극 수용체이고 T 세포 상에 구조적으로 발현되고, 증식, 이펙터 기능과 분화를 위해 나이브 T 세포를 자극하는 데 중요한 역할을 한다. 일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)는 인간 CD80(B7.1), GenBank 수탁번호 NM_005191(mRNA) 및 NP_005182(단백질) 또는 CD86(B7.2), GenBank 수탁번호 NM_175862(mRNA) 및 Swiss-Prot 데이터베이스의 수탁번호 P42081과 같은 CD28 작용제 중 하나의 작용제를 발현한다.

GITR는 조절 T 세포와 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 높은 수준에서 구성적으로 발현된다. 그것의 수용체 GITR 리간드(GITRL)에 의해 GITR의 참여는 조절 T 세포와 공동 활성화 이펙터 T 세포의 억제 효과를 저해하는 것으로 나타났다. 일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)는 인간 GITRL, NCBI 데이터베이스 Entrez 유전자 ID:8995와 같은 GITR의 작용제를 발현한다.

4-1BB(CD37)은 활성화 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 표면, 내추럴 킬러 세포, 단핵구 및 휴식 수지상 세포에 발현된다. 그의 리간드를 가지는 4-1BB 즉, 4-1BB 리간드(4-1BBL)의 참여는 T 세포 생존 및 장기 면역학적 메모리의 설립에 중요한 역할을 하고 IL-2, IFN-g 및 TNF-a와 같은 타입1 사이토카인을 선택적으로 촉진한다. 일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)는 인간 4-1BBL와 같은 4-1BB의 작용제를 발현하고, 그것의 전체 아미노산 서열은 Swiss-Prot 데이터베이스의 수탁번호 P41273하에서 찾아질 수 있다.

HVEM은 말초 혈액 T 세포, B 세포 및 단핵구에서 발현된다. 수용체 LIGHT를 가지는 HVEM의 참여는 T- 및 B-세포 활성화를 부자극하며, 세포 사멸 유전자를 상향 조절하고, 사이토카인 생성, 특히 IFN-γ 및 TNFα의 생성을 유도한다. 일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)는 인간 림포톡신-유사(LIGHT)와 같은 HVEM의 작용제를 발현하고, 그것의 전체 아미노산 서열은 Swiss-Prot 데이터베이스의 수탁번호 043557하에서 찾아질 수 있다.

바람직한 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 OX40 작용제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함한다. OX40 작용제는 종양 또는 아데노바이러스 항원에 의해 준비 자극 도중 또는 직후 XO40 수용체, 예컨대 활성화된 T 세포와 상호 작용하여 그 결과 종양에 대한 강화되고 장기적인 면역 반응을 나타낸다. 바람직하게는, OX-40 작용제는 숙주 세포(예컨대, 종양 세포)의 표면상에 발현되고, 복제 능력 온콜리틱 바이러스에 의한 세포의 감염이 뒤따른다. 바람직한 일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 OX40 작용제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 아데노바이러스이다.

더욱 바람직한 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는, US 특허번호 7,959,925에 기술된 것과 같은, 그리고 그 내용이 이곳에 참조로서 포함된 OX40 리간드(OX40L 또는 gp34) 또는 OX40L의 OX40 수용체 결합 단편 또는 OX40L 융합 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함한다. 특히 바람직한 일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 OX40L을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 아데노바이러스이다. 또한, gp34로 알려져 있고 다른 TNF 수퍼 패밀리 멤버와 같은 OX40L은 활성화된 B 세포, T 세포, 수지상 세포 및 내피 세포의 표면에 동종 삼량체로서 존재한다. OX40에 OX40L(CD134)의 결합은 초기 CD28 매개성 T 세포 반응을 지속시키고, T 세포 분화 및 생존을 모두 촉진한다. 특히, 내추럴 리간드 OX40L 또는 다른 OX40 작용제에 의한 OX40의 참여는 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 증대시킬 수 있는 주요 신호를 제공하는 것으로 나타났다. 또한, OX40 신호는 조절 T 세포 분화 및 억제 기능을 제어한다. 중요한 것은, 많은 연구는 각각 항종양 면역력을 향상시키거나 자가 면역 질환을 개선하는 OX40-특이성 작용제의 능력을 강조했다. 이러한 연구에 기초하여, OX40- 및 OX40L-특이성 시약의 개발은 임상 사용을 추구하고 있다. 지난 10년 동안 연구는 OX40 작용제는 면역원성 종양을 이용한 임상 전 모델에서 항종양 면역성을 증진시킨다는 것을 입증했다; 그러나, 열약한 면역원성 종양의 치료는 덜 성공했다. OX40 신호와 프라임 종양 특이성 T 세포를 조합하는 전략은 치료적인 항-종양 면역 반응을 생성하고 유지할 수 있다. 인간 OX40L의 아미노산 서열은 GenBank 수탁번호 NP_003317.1에 기술되어 있다. 인간 OX40L을 인코딩하는 전체 cDNA는 NCBI 레퍼런스 서열: NM_003326.3에 있다. 추가적인 OX40L 서열은 예를 들어, SwissProt 수탁번호 P23510에 추가로 개시되어있다. 인간 OX40L은 마우스 상대와 46% 아미노산 서열 동일성을 공유한다.

복제 가능 온콜리틱 아데노바이러스에 의해 발현될 수 있는 다른 OX40 작용제는 US 특허번호 6,312,700, 7,504,101, 7,291,331, 및 7,807,156에 기술된 것과 같은, 이들의 각각의 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 포함된, OX40에 대한 항체를 포함한다. OX40 항체의 특정한 비-제한적인 예로는 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131, 112Z5, mAb 315, mAb 131, mAb 2G2, IF7, ACT35, mAb L106 및 mAb OX86을 포함한다. OX40 기타 작용제는 참조로서 본 명세서에 전체적인 내용이 포함된 미국 특허 출원 공보 번호 US20060281072에 기재된 것들을 포함한다.

면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 DNA는 예를 들어, 온콜리틱 바이러스가 복제 능력이 남아있는 한 온콜리틱 바이러스의 임의의 비-필수 영역에 삽입될 수 있다. 일 실시예에서, 온콜리틱 바이러스는, 인코드된 단백질의 발현이 아데노바이러스 주요 후기 프로모터에 의해 구동하는 아데노바이러스 섬유 유전자의 하류에 삽입된 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 서열을 포함하는 이종성 핵산을 갖는 아데노바이러스이다. 바람직한 실시예에서, 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 서열을 포함하는 이종성 핵산은 복제 능력 아데노바이러스 백본의 E3 영역에 삽입된다. E3 영역은 바이러스 복제에 대해 비-필수적이다; 그러나, E3 단백질은 숙주 면역 반응을 조절하는 역할을 한다. 복제 능력 아데노바이러스는 전체 또는 부분 E3 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복제 능력 아데노바이러스는 E3 영역의 한 개, 두 개, 세 개 이상의 오픈 리딩 프레임(ORFs)의 결실 및 그 자리에 삽입된 이종성 핵산을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, gpl9k 및 6.7K 유전자가 삭제되고 이종성 핵산은 삭제된 E3 영역 gpl9k/6.7K로 삽입된다. 관련된 실시예에서, Bett 외, J. Virol 67(10):5911-5922(1993)에 기재된 바와 같이, 참고로 그 내용이 본 명세서에 포함된, 78.3에 BglII 제한 효소 위치와 아데노바이러스 타입5 게놈의 85.8 염색체 지도 단위 사이의 영역은 삭제될 수 있고, 이종성 핵산은 삭제된 E3 영역에 삽입될 수 있다. 관련 양상에서, 전체 E3 영역은 복제 능력 아데노바이러스 백본에서 삭제되고, 이종 핵산은 전체 E3 결실을 포함하는 위치에 삽입된다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명은 부분적으로 또는 완전히 삭제된 E3 영역 대신에 삽입된 이종성 핵산을 포함하는 Delta-24 또는 Delta-24-RGD 아데노바이러스를 제공하며, 상기 이종성 핵산은 OX40 작용제, 바락직하게는 OX40L을 인코딩하는 서열을 포함하고, 상기 OX40 작용제의 발현은 CMV 프로모터와 같은 비-아데노바이러스 프로모터의 제어하에 있다.

특정 실시예들은 상술한 바와 같은 하나 이상의 면역 세표 자극성 수용체 작용제를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스) 또는 복제 능력 온콜리틱 바이러스를 포함하는 약학 조성물을 종양에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 특정 양상에서, 상기 방법은 Delta-24 아데노바이러스 백본의 비-필수 영역에 삽입된 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 Delta-24 아데노바이러스를 종양에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시예에서, E3 영역의 일부 또는 Delta-24 아데노바이러스 게놈의 E3 영역의 모두가 삭제되고 이종성 핵산으로 대체된다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명은, 면역 세포 자극성 수용체(예를 들어, OX40L)를 아데노바이러스 백본의 비-필수 영역(예를 들어, 삭제된 E3 영역) 내로 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 Delta-24-RGD 아데노바이러스를 대상체에 투여함으로써, 인간 대상체에서 암(예를 들어, 신경교종)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 인간 대상체는 Th1 인터류킨 패턴을 나타낸다. 다른 실시예에서, 인간 대상체는 Th2 인터류킨 패턴을 나타낸다. 대상체가 약 20 미만, 약 15 미만, 또는 약 10 미만의 IL-12/IL-4 비율을 갖는 경우, 대상체는 Th2 인터류킨 패턴을 나타내는 것으로 결정된다. Th1 인터류킨 패턴을 나타내는 대상체는 일반적으로 20보다 큰 IL-12/IL-4 비율을 나타내며 일부 경우에서 50, 100 및 심지어 300보다 큰 IL-12/IL-4 비율을 나타낸다. IL-12/IL-4 비율은 대상체로부터 샘플(예를 들어, 혈액 또는 혈청 샘플)을 얻고, 이 샘플을 IL-12/IL-4에 대한 항체와 접촉시키고, 이 샘플에서 IL-12 및 IL-4의 양을 그들 각각의 항원에 항체의 결합의 양의 함수로서 결정함으로써(예를 들어, ELISA에 의해), 대상체에서 결정될 수 있다.

관련 실시예에서, 하나 이상 Th1 자극제는 대상체의 암(예를 들어, 교아 세포종)을 치료하기 위해 상기한 바와 같은 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스와 공동 투입된다. 일부 실시예에서, 대상체는 20 미만(즉, Th2 인터류킨 패턴을 나타낸다)의 IL-12/IL-4 비율을 갖는다. 다른 실시예에서, 대상체는 20 보다 큰 IL-12/IL-4 비율(즉, Th1 인터류킨 패턴을 나타낸다)을 갖는다. Th1 자극제는, 제한 없이, (i) IL-12p70, IL-2 및 IFN-γ 등과 같은 Th1 사이토 카인 (ii) REVLIMID(레날리도미드)와 같은 Th1 사이토 카인의 생산을 증가시키는 증가제 (iii) 조절 T 세포를 억제하는 억제제(예를 들어, 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타자비시클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카르복사미드), 시클로포스파미드((RS)-N,N-비스(2-클로로에틸)-1,3,2-옥사자포스피난-2-아민2-옥시드), 로무스틴(CCNU;N-(2-클로로에틸)-N'-시클로헥실-N-니트로소우레아), 비스-클로로에틸니트로소우레아(BCNU), 멜팔란 염산염(4-[비스(클로로에틸)아미노]페닐알라닌), 부설판(부탄-1,4-디일 디메탄술폰산), 메클로레타민(니트로겐 머스타드), 클로람부실, 이포스파미드, 스트렙토조신, 다카르바진(DTIC), 티오테파, 알트레타민(헥사메틸메라민), 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥사라플라틴) 및 (ⅳ) 세포 매개성 면역 반응을 자극하는 자극제(예를 들면, 이필리무맵(Ipilimumab), 트레멜리무맵(Tremelimumab), MDX-1106, MK-3475, AMP-224, 필딜리주맵(Pidilizumab), 및 MDX-1105)을 포함한다. 본 발명의 복제 능력 온콜리틱 바이러스와 공동 투여를 위한 Th1 자극제로는 IFN-γ(바람직하게는 재조합) 및 테모졸로미드를 포함한다. 본 발명의 복제 능력 온콜리틱 바이러스 및 Th1 자극제는 암을 치료하기 위해 암을 갖은 대상체에게 별도로, 동시에 또는 연속하여 투여될 수 있다. 일 실시예에서, Th1 자극제는 대상체에게 투여한 후 복제 능력 온콜리틱 바이러스가 투여된다. 다른 관련 실시예에서, (i) Th1 자극제 및 (ii) 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스, 각각은 다른 것과 결합하여 대상체의 암을 치료하는데 효과적인 양을 갖는 것을 포함하는 조성물 또는 키트가 제공된다. 바람직한 실시예에서, 조성물 또는 키트는 (i) 재조합 IFN-γ, 테모졸로미드, CCNU, BCNU, 멜팔란 염산염 및 부설판으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 Th1 자극제 및 (ii) OX40 작용제(예를 들어, OX40L)를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스(예를 들어, Delta-24 또는 Delta-24-RGD)를 포함한다.

특정 실시예에서, PD-L1 또는 PD-1 길항제를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)가 제공된다. 일부 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 것 외에 PD-L1 또는 PD-1 길항제를 발현한다. 다른 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 PD-L1 또는 PD-1 길항제를 발현하지만, 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하지 않는다. PD-L1은 항종양 T 세포의 음성 조절기로 확인되었고, 인간 암의 50% 이하로 발현된다. 활성화된 이펙터 T 세포에 종양 세포의 PD-L1의 결합은 결과적으로 종양 세포를 죽이는 데 필요한 세포 독성의 매개체의 생성을 차례차례 차단하는 PI3 키나아제 신호 전달 캐스케이드의 활성을 일으킨다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, PD-L1 또는 PD-1 길항제는 PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 방해하는 분자이다. 하나의 양상에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스 게놈의 비-필수 영역에 삽입된 PD-L1 또는 PD-1 길항제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 아데노바이러스이다. 관련 양상에서, 이종성 핵산은 MPDL3280A와 같은 항-PD-L1 항체, 또는 니볼루맵(nivolumab) 또는 람브롤리주맵(lambrolizumab)과 같은 항-PD-1 항체를 인코드한다. 다른 실시예에서, 이종성 핵산은 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0217401, 20110195068 및 20120251537, 및 미국 특허 번호 8,217,149에 기재된, 각각의 내용이 본 명세서에 참조로 포함된 것과 같은, PD-L1 또는 PD-1 길항제를 인코드한다. 특정 실시예에서, 인간의 암을 치료하는 방법(예를 들어, 신경교종)은 PD-L1 및/또는 PD-1 길항제를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것이 제공된다. 바람직한 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 PD-L1 및/또는 PD-1 길항제를 발현하는 아데노바이러스이다. 바람직한 일 실시예에서, 아데노바이러스는 Delta-24 또는 Delta-24-RGD 아데노바이러스이다.

특정 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는, 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 것 외에, 또한 그 표면상에 하나 이상의 종양 항원을 발현한다. 특정 양상에서, 1, 2, 3, 4 또는 5 항원은, 예를 들면, 아데노바이러스 표면 단백질을 인코딩하는 분리된 유전자 내로 각각의 항원을 인코딩하는 핵산을 삽입함으로써, 바이러스의 표면에서 발현된다. 바람직한 실시예에서, 종양 관련 항원(들)은 EGFRvIII(표피 성장 인자 수용체 변이체 III) 및/또는 NY-ESO-1(뉴욕 식도 편평 세포 암종 1)이다. 종양 항원은 캡시드 또는 섬유의 일부로서 발현될 수 있거나, 또는 아데노바이러스의 감염 및 복제 중에 외인성 단백질의 표현(presentation)을 증가시키기 위해 LC3과 같은 자식(自食) 작용 관련 단백질에 연결된 외인성 단백질로서 제조될 수 있다. 여러 항원을 표적화 하는 것은 일관되고 효과적인 면역 반응을 생성하는 데 도움이 될 것이다.

종양 관련 항원(TAA)은 신경교종과 같은 뇌암 환자에서 발생하는 것으로 확인된 종양 관련 항원을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 이의 대표적인 예들로 AIM2(absent in 흑색종 2), BMI1 (BMI1 폴리콤 링 핑거 종양 유전자), COX-2(시클로옥시게나아제-2), TRP-1(티로신 관련 단백질 2) TRP-2(티로신 관련 단백질 2), GP100(당단백질 100), EGFRvIII(표피 성장 인자 수용체 변이체 III), EZH2(제스트 동족체 2의 인핸서), LICAM(인간 L1 세포 접착 분자), 리빈, 리빈β, MRP-3(다중 약물 저항 단백질 3), 네스틴, OLIG2(희소 돌기 아교 세포 전사 인자), SOX2(SRY 관련 HMG-박스 2), ART1(T 세포 1에 의해 확인된 항원), ART4(T 세포 4에 의해 확인된 항원), SART1(T 세포 1에 의해 확인된 편평 세포 암종 항원), SART2, SART3, B-사이클린, b-카테닌, Gli1(신경교종 관련 종양 유전자 동종체 1), Cav-1(카베올린-1), 카텝신 B, CD74(분화 클러스터 74), E-카데린(상피 칼슘 의존적 접착), EphA2/Eck(EPH 수용체 A2/상피 키나아제), Fra-1/Fosl 1(fos 관련 항원 1), GAGE-1(G 항원 1), 강글리오시드/GD2, GnT-V, β1, 6-N(아세틸글루코사민 전이효소-V), Her2/neu(인간 표피 성장 인자 수용체 2), Ki67(항체 Ki67의 핵 증식-연관 항원), Ku70/80(인간 Ku 헤테로디머 단백질 서브 유닛), IL-13Ra2 (인터류킨-13 수용체 서브 유닛 알파-2), MAGE-A는(흑색종 관련 항원 1), MAGE-A3(흑색종 관련 항원 3), NY-ESO-1(뉴욕 식도 편평 세포 암종 1), MART-1(T 세포에 의해 확인된 흑색종 항원), PROX1(프로스페로 호메오박스 단백질 1), PSCA(전립선 줄기 세포 항원), SOX10(SRY 관련 HMG 박스-10), SOX11, 서비빈, UPAR(우로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자 수용체, 및 WT-1(Wilms' 종양 단백질 1)을 포함한다. 복제 능력 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)는 전체 길이의 종양 관련 항원 또는 그의 면역원성 펩티드를 발현할 수 있다.

하나의 양상에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는, 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 것 외에, 또한 EGFRvIII 또는 그 표면에 그의 면역원성 펩티드를 발현한다. EGFRvIII의 서열은 미국 특허 번호 6,455,498에 기재되어 있고, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 면역원성 EGFRvIII 펩티드는 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0155282에 기재된, 특히 단락 [0362] 및 표 4.1-4.3에 기재된 것을 포함한다. 바람직하게는, 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스이고 EGFRvIII 또는 그의 면역원성 펩티드는 섬유 단백질을 인코딩하는 유전자로, 바람직하게는 H1 루프에 삽입된다. EGFRvIII을 인코딩하는 핵산 또는 그의 면역원성 펩티드는 임의의 아데노바이러스의 하나 이상의 표면 단백질을 인코딩하는 유전자에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “면역원성 EGFRvIII 펩티드”는 적당한 길이의 펩티드 예컨대 적어도 10 또는 12 아미노산 및 15, 20, 25 또는 30 아미노산 또는 해당 EGFRvIII 단백질, 바람직하게는 인간의 EGFRvIII의 돌연변이 스플라이스 접합부에 걸친 그 이상까지의 펩티드를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 아데노바이러스 표면 단백질에 삽입된 핵산은 서열 EKKGNYVV로 이루어진, 실질적으로 이루어진, 또는 포함하는 8-20 아미노산 펩티드를 인코딩한다. 특히 바람직한 실시예에서, EGFRvIII 면역원성 펩티드는 LEEKKGNYVVT(SEQ ID NO:4)이고, 섬유 단백질, 바람직하게는 H1 루프을 인코딩하는 유전자에 삽입된다. 다른 실시예에서, 전체 EGFRvIII 세포 외 영역을 인코딩하는 핵산은 아데노바이러스의 표면 단백질을 인코딩하는 유전자에 삽입된다.

관련 양상에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는, 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 것 외에, 또한 NY-ESO-1(GenBank U87459.1) 또는 그의 면역원성 펩티드(예를 들어, SLLMWITQCFLPVF)를 그 표면에서 발현한다. 바람직하게는, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 아데노바이러스이며 NY-ESO-1 또는 그 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 표면 단백질을 인코딩하는 유전자에 삽입됨으로써, 아데노바이러스는 NY-ESO-1 또는 그의 면역원성 펩티드를 포함하는 키메라 표면 단백질을 발현한다. 하나의 양상에서, NY-ESO-1 또는 그의 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산은 아데노바이러스의 헥손을 인코딩하는 유전자의 초가변영역 5에 삽입된다.

아데노바이러스 유전자에 종양 항원을 인코딩하는 핵산의 삽입은 바이러스가 종양 항원을 그 표면에서 발현하도록“인프렘”이 완료되어야 한다.

특정 측면은 다른 접근법의 환자 회복의 제한 인자인 종양의 완전 절제가 필요하지 않다. 또한, 현재의 방법 및 조성물의 특정 양상은 면역계의 메모리를 생산하여 종양 재발의 개연성을 예방 또는 감소시키는 가능성이 있다.

용어 “복제 능력”은 특정 세포 또는 조직에서 바이러스 복제에 필요한 임의의 유전자 기능이 결핍되지 않은 임의의 바이러스 벡터를 의미한다. 벡터는 복제 및 패키지될 수 있어야 하지만, 특정 세포 또는 조직에만 조건부로 복제할 수 도 있다. 본 발명의 복제 능력 아데노바이러스 벡터는, 본 명세서에 기재된 바와 같이 특정 종양 질환 세포 유형에서 효율적으로 복제할 수 있는 그들의 능력을 유지하면서, 정상 세포에서 복제할 수 있는 그들의 능력을 감소 또는 제거하기 위해 조작된다. 통상적으로, 복제 능력 아데노바이러스는 아데노바이러스가 복제 및 요소가 트랜스에 공급될 필요 없이 패키지될 수 있는 E1, E2 및 E4영역을 충분히 포함한다.

용어 “치료상의 혜택” 또는 “치료”는 대상체 상태의 의학적 치료에 대한 대상체의 복지를 촉진 또는 향상시키는 어떤 것을 의미하며, 전암, 암 및 과증식 질환의 치료를 포함한다. 이것의 완전하지 않은 예제의 목록은 대상체의 수명을 임의의 기간까지 연장, 질병의 종양 성장의 감소 또는 지연, 과증식의 감소, 종양 성장의 감소, 전이의 지연, 암세포 또는 종양 세포 증식률의 감소, 및 대상체의 상태에 기여할 수 있는 대상체의 통증의 감소를 포함하다.

“T 조절 세포”또는 “조절 T 세포”는 T 세포 반응을 억제할 수 있는 세포를 의미한다. 조절 T 세포는 T 세포 활성화에 상향 조절되지 않고 활성화된 이펙터 세포로부터 조절 T 세포를 판별하지 않는 전사 인자 Foxp3을 발현한다. 조절 T 세포는 세포 표면 마커 CD25, CD45RB, CTLA4, 및 GITR에 의해 확인된다. 조절 T 세포의 성장은 골수 억제 세포 활성에 의해 유발된다. 몇몇 조절 T 세포 서브 세트는 자가 면역 및 만성 염증성 반응을 억제시키며 담암생체의 면역관용을 유지시키는 능력을 갖는 것으로 확인되어 왔다. 이들 서브 세트는 T 조절 유형 1(TrI) 세포를 분비하는 인터류킨 10-(IL-10-), T 도움 유형 3(Th3) 세포를 분비하는 변형 성장 인자-β-(TGF-β-), 그리고 “네추널”CD4+/CD25+Tregs(TM)(Fehervari 및 Sakaguchi. J. Clin. Invest. 2004, 1 14:1209-1217; Chen 등 Science. 1994, 265: 1237-1240; Groux 등 Nature 1997, 389 : 737-742)을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “작용제”, 예를 들어, OX40 작용제는, 그 대상, 예를 들어, OX40의 생물학적 활성을 향상시키는 분자이다. 특정 양상에서, 예를 들어, 항-OX40 항체 또는 OX40 리간드 조성물을 포함하는 OX40 작용제는 실질적으로 OX40의 생물학적 활성을 향상시킨다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%로 향상된다. 특정 양상에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 OX40 작용제는 OX40 결합 분자, 예를 들어, 결합 폴리펩티드, 항-OX40 항체, OX40L 또는 이들 분자의 단편 또는 유도체를 포함한다.

본 발명의 다른 실시예는 본 명세서 전체에 걸쳐 논의된다. 본 발명의 일 양상에 대하여 논의된 임의의 실시예는 본 발명의 다른 양상뿐만 아니라 그 반대로도 적용된다. 본 명세서에 기재된 각 실시예는 본 발명의 모든 양상에 적용 가능한 본 발명의 실시예로 이해된다. 본 명세서에 논의된 임의의 실시예는, 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물 및 그 반대에 대하여, 구현될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물 및 키트는 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.

청구항 및/또는 명세서에서 용어“포함하는”과 함께 사용된 경우의 단어 “한” 또는 “하나”의 사용은 “하나”를 의미하지만, 이는 또한 “하나 이상,”, “적어도 하나,” 및 “하나 또는 하나보다 많은”의 의미와 일치한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 용어“약”은 하나의 값이 이값을 결정하기 위해 사용되는 디바이스 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.

청구항에서 용어“또는”의 사용은, 본 명세서는 단지 선택 가능한 것 및 “및/또는”을 참조하는 정의를 지원하지만, 선택 가능한 것 또는 선택 가능한 것이 상호 배타적인 것이라는 것을 참조하는 것으로 명시적으로 지칭하지 않는 이상 “및/또는”을 의미하는 것으로 사용된다.

본 명세서 및 청구항(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 “포함하는”(및 “포함” 및 “포함하는”과 같은 포함하는의 임의의 형태), “갖는”(갖는 임의의 형태에서 사용되는 바와 같이 “갖는다” 및 “가진다”와 같은 갖는의 임의 형태), “포함하는”(및 “포함” 및 “포함하는”과 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 “포함하는”(및 “포함” 및 “포함하는”과 같은 포함하는의 임의의 형태)는 포괄적이고 제약을 두지 않으며 추가의, 언급되지 않은 요소 또는 방법 스텝들을 배제하지 않는다.

다른 목적, 특징 및 본 발명의 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정은 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해 질 것이기 때문에, 본 발명의 특정 실시예를 나타내면서, 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시적으로 주어진 것임이 이해되어야 한다.

도면의 간단한 설명
도 1은, 면역 세포 자극성 수용체 작용제 OX40L을 발현하는 신규한 아데노바이러스의 구성. Delta-24-RGD-OX40L의 유전적 구조가 도시되어있다. 요약하면, 약 2.7Kb는 Delta-24-RGD의 비-필수 E3 영역, 78.3에서 85.8까지의 염색체 지도 단위, 에서 삭제되었고 고유 제한 효소 위치가 소개되었다. CMV 프로모터에 의해 구동된 쥐 OX40L cDNA를 위한 발현 카셋은 고유 제한 위치를 이용하여 아데노바이러스 게놈의 삭제된 E3 영역에 삽입되었다. 다른 구조에서, 쥐 OX40L을 인코딩하는 cDNA는 아데노마이러스 게놈의 섬유 유전자의 하류에 삽입되고 OX40L의 발현은 내인성 아데노바이러스 후기 프로모터에 의해 구동되었다.
도 2는, 쥐 신경교종 GL261 세포에서 Delta-24-RGD-OX40L(도면에서 D24-RGDOX로 참조되는)에 의해 쥐 OX4L(mOX40L)의 발현. GL261 세포를 50pfu/세포로 표시된 바이러스에 감염시켰다. 48시간 후, 세포를 α-mOX40L 항체(1:100 희석)로 염색하였다. 세포막 무결성을 에티듐 호모디머-1 스테이닝(8μM)으로 모니터링 하였다. 염색된 세포를 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 오른쪽 아래 모서리에 있는 숫자는 mOX40L을 발현하는 세포의 비율을 나타낸다.
도 3은, 쥐 흑색종 B16 세포에 D24-RGDOX에 의한 쥐 OX40L(mOX40L)의 발현. 방법은 도 2에서 기술한 바와 같은 방법과 동일하다.
도 4는, 이종 이식 세포에 D24-RGDOX에 의한 쥐 OX40L(mOX40L)의 생체 내 발현. GL261-EGFP 세포(5×10⁴세포)를 C57BL/6 쥐들의 두개골 내에 주입하고 12일 후에 D24-RGDOX 또는 D24-RGD(5×10⁷pfu)를 종양 내 주사하였다. 주입 3일 후, 종양을 수집 및 해리하였고, 세포를 쥐 단일 클론 α-mOX40L 항체(1:40 희석)로 염색하였다. 염색된 세포를 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 상부 오른쪽 모서리에 있는 숫자는 mOX40L을 발현하는 종양 세포의 백분율을 나타낸다.
도 5는, U-87 MG 또는 GL261 세포에서 D24-RGD와 D24-RGDOX의 복제. 세포를 10pfu/세포로 바이러스에 감염시켰다. 감염 48시간 후, 전염성 바이러스 자손은 역가되었고 최종 바이러스 역가는 pfu/㎖로 결정했다.
도 6은, D24-RGD와 D24-RGDOX은 HMGB1의 방출을 유도한다. GL261 세포를 200pfu/세포로 표시된 바이러스에 감염시켰다. 24시간 후, FBS의 농도가 10%에서 2%로 저하되었다. 배양 배지(M) 및 전체 세포 용해물(W)을 지정된 시점에서 수집하고, HSP90 및 HMGB1 발현 수준을 면역블로팅법으로 분석하였다. 배지에서 HMGB1의 상대적 수준을 패널의 맨 아래에 표시했다.
도 7a-c는, D24-RGDOX 항-신경교종 면역성을 향상시킨다. 도 7a: GL261 세포를 C57BL/6 쥐의 뇌에 이식하였다. 동물은 무작위로 그룹(n=10)으로 분리하여 PBS, D24-RGDOX(5×10⁷pfu), D24-RGD(5×10⁷pfu), OX86(하나-쥐 OX40 항체)(25㎍), 또는 OX86와 함께 D24-RGD(5×10⁷pfu+25㎍ 각각)으로 (종양 내 주사로) 처리하였다. 질병의 일반화 또는 국소 증후군을 나타내는 동물은 안락사 되었다. 도 7b: 느린 성장 속도가 특징인 GL261의 선택된 클론으로부터의 세포를 C57BL/6 쥐의 뇌에 이식했다. 생존 연구는 콘트롤(PBS) 또는 D24-RGDOX로 치료 후 시행했다. 도 7c: 도 7a에서와 유사한 실험을 면역 결핍 쥐 모델에서 실시했다. 이 모델에서, D24-RGDOX는 두개 신경교종을 갖은 쥐의 생존을 증가시키지 않았다.
도 8은, D24-RGDOX 처리는 결과적으로 D24-RGD보다 종양 베드에 면역 세포의 높은 원기 회복을 일으킨다. PBS, D24-RGD 또는 D24-RGDOX를 GL261 세포 두개 내 이식 후 종양 내 투여하였다. 실험 14일째, 뇌를 수거하고 분석하였다. 새로운 종양-함유 반구로부터 백혈구를 분리하여 유동 세포 분석법으로 분석하였다. P 값을 표시하였다(스튜던트의 T-TEST, 양면).
도 9는, D24-RGDOX는 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 종양을 도 8에서와 같이 설정하였다. D24-RGD 또는 D24-RGDOX(5×10⁷pfu)를 종양 이식 후 6, 8, 10일에 종양 내로 주입하였다. 종양 이식 후 14일째에, 쥐 비장(그룹 5 쥐)과 뇌 침윤 백혈구(BILs)에서 비장 세포를 분리하였다. 1% 파라포름알데히드로 미리 고정된 2×10⁴ 표적 세포(MBC(쥐 뇌세포), GL261-OVA, GL261-OVA+D24RGD 또는 GL261-OVA+RGDOX)를 웰당 5×10⁴BILs 또는 5×10⁵ 비장 세포로 40시간 배양시키고 상청액의 IFN-γ의 농도를 표준 ELISA로 평가했다.
도 10a-b는, 뇌 침윤 백혈구와 비장 세포의 활성화. 도 10a: 뇌 침윤 백혈구를, 종양 이식 및 도 9에 기재된 바와 같은 MBCs와 공동 배양한 후 21일째에 각 치료 그룹의 쥐로부터 분리하였다. 도 10b: 비장 세포를, 종양 이식 및 도 9에 기재된 바와 같은 지적된 표적 세포와 공동 배양한 후 21일째에 각 치료 그룹의 쥐로부터 분리하였다. 40시간 후, 상청액의 IFN-γ의 농도를 표준 ELISA로 평가했다.
도 11은, Delta-24-RGD-OX40L(도면에서 Delta-RGDOX-24로서 참조되는)로 감염 후 감염된 숙주 세포의 OX40L의 발현을 보여주는 그래프. 헬라(인간 자궁 경부 상피 선암종) 세포를 도 1에 따라 구성된, Delta-24-RGD-OX40L로 50pfu/세포의 감염다중도(m.o.i.)로 감염시켰다. 간단히, 바이러스 원종을 지시된 m.o.i.로 희석시키고, 세포 단층(0.5mL/60mm 접시 또는 5mL/100mm 접시)에 첨가시켜 37℃로 매 5분 간단히 휘저으면서 30분간 배양시켰다. 그 후, 배양 배지의 필요한 양을 첨가하고, 세포를 소정 시간 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 바이러스 감염 후 48시간에, 세포를 mOX40L에 대한 항체로 염색하여 mOX40L을 발현하는 세포의 백분율을 염색 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 죽은 세포를 EthD-1 스테이닝(FL3-H)을 사용하여 제외시켰다. mOX40L 양성 세포를 오른쪽 아래 사분면에 도시했다. 이미지는 Delta-24-RGD-OX40L에 감염된 세포가 OX40L을 발현하는 것을 보여준다.
도 12는, Delta-24-RGD-OX40L(도면에서 Delta-24-RGDOX로 참조되는)로 치료 후 쥐 신경교종 모델의 향상된 생존을 나타내는 그래프. 데이터는 전체 생존의 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve)으로서 표시됐다. Fueyo 외, J. Natl. Cancer Inst., 95:652-660(2003)에 기재된 바와 같이, 간단히, GL261 세포(5×10⁴)를 C57BL/6 쥐의 뇌에 이식하였다. 종양 세포 이식 후 3, 6 및 8일에, 쥐를 무작위로 그룹(n=10)으로 분리하고, (1) Delta-24-RGD(10⁸pfu/투여량), (2) Delta-24-RGDOX(10⁸pfu/투여량), (3) OX40L 항체(25㎍/투여량), (4) OX40L 항체와 함께 Delta-24-RGD(10⁸pfu/투여량+25mg/투여량 각각) 또는 (5) 모의 치료인 PBS를 함유하는 용액 10μL를 종양 내로 주입하였다. 질병의 일반화 또는 국소 증후군을 나타내는 동물은 안락사 되었다. Delta-24-RGD-OX40L(Delta-24-RGDOX)로 처리된 쥐의 100%가 20일 후 질환이 없는 상태였던 반면에, PBS(콘트롤)로 처리한 모든 쥐와 Delta-24-RGD로 처리한 모든 쥐는 17일까지 안락사 되었다. OX-40L로 처리한 쥐의 50%는 20일 후 질환이 없는 상태이었다. 중요한 것은, Delta-24RGD-OX40L로 처리된 쥐는 Delta-24-RGD와 OX40L 항체로 별도의 치료를 받은 그룹에 비해 향상된 생존을 나타낸 것이다.
도 13은, Delta-24-RGD-OX40L(도면에서 Delta-RGDOX-24로서 참조되는)로 치료 후 쥐 신경교종 모델에서 향상된 TH1 반응을 나타내는 그래프. GL261 세포를 C57BL/6 쥐의 뇌에 이식하였다. 쥐를 Delta-24-GFP 또는 Delta-24-RGD-OX40L의 종양 내 주사로 처리하였다(종양 세포 이식 후 7, 9, 11일). 14 일째에, 쥐 비장 세포를 그룹당 3-5 쥐로부터 수집하고, 야생형 쥐 배아 섬유 아세포(wtMEF), GL261 또는 Delta-24-RGD-감염된 GL261 세포로 40시간 배양시켰다. 비장 세포 활성화의 지표로서, 비장 세포에 의해 분비된 IFN-γ의 농도를 ELISA로 측정하였다. 하단 패널은, 상이한 스케일 범위를 이용하여, 실험의 처음 두 그룹의 상단 패널에 도시된 유사한 결과를 나타낸다. 이 데이터는 Delta-24-RGD-OX40L로 치료가 쥐 모델에서 종양의 TH1 면역 반응을 향상시킨다는 것을 입증한다. 또한, 이 데이터는 항-아데노바이러스 면역성을 개시하는 것 외에, Delta-24-RGD_OX40L로 치료된 신경교종을 갖은 쥐가 감염과 감염되지 않은 종양 세포에 대해 특정 세포 반응을 발달시킨다는 것을 입증한다. 따라서, Delta-24-RGDOX에 의한 감염은 감염되지 않은 경우에도 암세포에 대한 항-종양 면역 반응의 발생을 주도하고, 종양 세포의 소수를 감염시킴으로써 Delta-24-RGDOX가 잠재적으로 종양을 박멸할 수 있는 면역 반응을 유도할 것이라는 것을 시사한다.

기술

본 발명의 방법 및 조성물은, 변형되지 않은 온콜리틱 바이러스(즉, 면역 세포 자극 수용체 작용제를 인코딩하는 이종성 핵산을 함유하지 않는 유전적으로 유사하거나 동일한 온콜리틱 바이러스) 및 별도로 투여될 때 면역 세포 자극성 수용체 작용제와 비교하여 향상되고 심지어 상승적인 항-종양 효과를 보이는 면역 세포 자극성 수용체를 인코딩하는 이질성 핵산을 포함하는 온콜리틱 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스)의 구조 및 확인을 포함한다.

I. 복제 능력 온콜리틱 바이러스

본 발명에 따른 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 자연적으로(예를 들어, "필드 소스"에서 발생) 또는 변형된 복제 능력 온콜리틱 바이러스를 포함한다. 온콜리틱 바이러스는, 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체를 발현하는 것 외에, 예를 들면, 암세포에 대한 바이러스의 선택력을 증가시키기 위해 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 복제 능력 온콜리틱 바이러스는, 미오바이러스과(myoviridae), 시포바이러스과(siphoviridae), 포드프바이러스과(podpviridae), 테시바리러스과(teciviridae), 코르티바이러스과(corticoviridae, plasmaviridae, 리포트릭스바이러스과(lipothrixviridae), 퓨셀로바이러스과(fuselloviridae), 폭스바리러스과(poxyiridae), 이리도바이러스과(iridoviridae), 피코드나바이러스과(phycodnaviridae), 바큘로바이러스과(baculoviridae), 헤르페스바이러스과(herpesviridae), 아데노바이러스과(adnoviridae), 파포바바이러스과(papovaviridae), 폴리드나바이러스과(polydnaviridae), 이노바이러스과(inoviridae), 미크로바이러스과(microviridae), 제미니바이러스과(geminiviridae), 시르코바이러스과(circoviridae), 파르보바이러스과(parvoviridae), 헤파드바이러스과(hepadnaviridae), 레트로바이러스과(retroviridae), 식토바이러스과(cyctoviridae), 레오바이러스과(reoviridae), 비르나바이러스과(birnaviridae), 파라미소바이러스과(paramyxoviridae), 라브도바이러스과(rhabdoviridae), 필로바이러스과(filoviridae), 오르쏘믹소바이러스과(orthomixoviridae), 뷰니아바이러스과(bunyaviridae), 아레나바이러스과(arenaviridae), 레비바이러스과(leviviridae), 피코르나바이러스과(picornaviridae), 세큐이바이러스과(sequiviridae), 코모바이러스과(comoviridae), 포티바이러스과(potyviridae), 칼리시바이러스과(caliciviridae), 아스크로바이러스과(astroviridae), 노다바이러스과(nodaviridae), 테트라바이러스과(tetraviridae), 톰뷰스바이러스과(tombusviridae), 코로나바이러스과(coronaviridae), 글라비바이러스과(glaviviridae), 토가바이러스과(togaviridae) 및 바르나바이러스과(barnaviridae)의 가족의 구성원인 온콜리틱 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시에 사용하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스의 특정예로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 랩도바이러스, 뉴캐슬 질병 바이러스((NDV), 폴리오마 바이러스, 백시니아 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키 바이러스 및 파보바이러스를 포함한다.

일 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 임의로 암세포 선택력을 증가시키기 위해 변형된 소포성 구내염 바이러스(VSV) 및 마라바 계통(Maraba strain)으로부터 선택된 랩도바이러스이다. 이러한 변형 예는, 숙주 IFN 반응에 민감한 바이러스를 제공하는 기질(M) 유전자의 돌연변이를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

다른 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 임의로 암세포 선택력을 증가시키기 위해 변형된, 비제한적인 예로 웨스턴 리저브, 와이어스, 코펜하겐 계통을 포함하는 백시니아 바이러스이다. 이러한 변형은 비-기능적 티미딘 키나아제 유전자, 비-기능적 백시니아 성장 인자 유전자, 및 비-기능적 타입1 인터페론 결합 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

또 다른 양상에서, 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스(HSV)(HSV-1 또는 HSV1716와 같은) 및 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV) 바이러스로부터 선택된다.

아데노바이러스는 특히 바람직한 복제 능력 온콜리틱 바이러스이다.

아데노바이러스(Ad)가 인간을 감염시키는 큰(~36Kb) DNA 바이러스이지만, 이는 넓은 숙주 범위를 표시합니다. 물리적으로, 아데노바이러스는 이중 가닥 선형 DNA 게놈을 함유하는 20면체 바이러스이다. 인간 아데노바이러스의 혈청형이 약 50개가 있으며, 분자, 면역학적 및 기능적 기준에 따라 여섯 패밀리로 분할되어있다. 성년까지, 거의 모든 인간은, 일반적인 아데노바이러스 혈청형으로 감염되어왔으며, 주요 영향은 감기 같은 증상이다.

숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA가 에피좀으로 유지되는 결과를 일으켜 통합 벡터와 관련된 잠재적인 유전자 독성을 감소시킨다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정적이며, 어떠한 게놈 재배열도 광범위하게 증폭한 후 검출되지 않았다. 아데노바이러스는 그들의 세포 주기 단계에 관계없이 거의 대부분의 상피 세포를 감염시킬 수 있다. 지금까지, 아데노바이러스 감염은 인간의 급성 호흡기 질환과 같은 가벼운 질병에만 링크된 것으로 나타났다.

57 인간 아데노바이러스 혈청형(HAdV-1 내지 57) 중 어느 하나의 구성원은 본 발명에 따른 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함 할 수 있다. 인간 Ad5는 유전학적 및 생화학적으로 잘 특징이 되어있다(GenBank M73260; AC_000008). 따라서, 바람직한 실시예에서, 온콜리틱 아데노바이러스는 복제 능력 Ad5 또는 Ad5 성분을 포함하는 혼성체 혈청형이다. 아데노바이러스는 다양한 형태의 계통일 수도 있지만, 바람직하게는, 예를 들어, 종양 세포에서 복제할 수 있는 바이러스의 능력에 영향을 주지 않고 정상적인 휴지(休止) 세포 내에서 복제할 수 있는 바이러스의 능력을 감쇠함으로써, 종양 선택력을 향상하기 위해 유전학적으로 변형된다. 본 발명에 의해 포함된 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스의 비제한적인 예는 Delta-24, Delta-24-RGD, ICOVIR-5, 6-ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAd1, H101 및 AD5/3-D24-GMCSF을 포함한다. Onyx-015는 암세포 선택력을 향상시키는 E1B-55K 및 E3B 영역에서 결실을 갖는 바이러스 혈청형 Ad5 및 Ad2의 혼성체이다. H101은 Onyx-015의 변형된 버전이다. ICOVIR-5 및 ICOVIR-7은 E1A의 Rb-결합 위치 결실 및 E2F 프로모터에 의해 E1A 프로모터의 교체를 포함한다. ColoAd1는 키메라 Add11p/ Ad3 혈청형이다. AD5/3-D24-GMCSF(CGTG-102)은 GM-CSF(Ad5 캡시드 단백질 노브는 혈청형 3으로부터 노브 도메인으로 대체된다)를 인코딩하는 혈청형 5/3 캡시드 변형 아데노바이러스다.

하나의 특히 바람직한 실시예에서, 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스는 Delta-24 또는 Delta-24-RGD이다. Delta-24는 미국 특허 출원 공개 번호 20030138405, 및 20060147420에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. Delta-24 아데노바이러스는 아데노바이러스 타입 5(AD-5)로부터 파생되며 인코드된 E1A 단백질(Fueyo J 등, Oncogene, 19:2-12(2000))의 아미노산 122-129에 대응하는 결합 Rb 단백질(뉴클레오티드 923-946)을 담당하는 영역을 포함하는 E1A 유전자의 CR2부분 내의 24-염기쌍 결실을 포함한다. Delta-RGD-24는 섬유 노브 단백질(Pasqualini R. 외, Nat Biotechnol, 15:542-546 (1997))의 H1 루프 내로 RGD-4C서열(αvβ3 및 αvβ5 인테그린에 강하게 결합하는)의 삽입을 추가로 포함. E1A 결실은 암세포에 대한 바이러스의 선택력을 증가시킨다; RGD-4C서열은 신경교종에서 바이러스의 감염력을 증가시킨다.

온콜리틱 아데노바이러스는 세포 사멸을 유도하며, 인접 세포를 감염시켜, 정지되지 않은 경우, 종양의 전체 파괴로 이어질 수 있는 파동 치료(treatment wave)를 발생시키는 새로운 아데노바이러스 자손을 방출하기 위해 종양 내에 주입된다. Delta-24의 중대한 항-종양 효과는 세포 배양 시스템 및 악성 신경교종 이종 이식 모델에서 나타났다. Delta-24-RGD은 단계 1 임상 시험에서 놀라운 항암 효과를 보였고 현재 추가 임상 시험의 대상이 되었다. 종양 세포의 용해가 Delta-24-RGD 온콜리틱 아데노바이러스로 추천된 주 항암 메커니즘이지만, 재발성 신경교종을 갖는 환자에서 단계 1 임상 시험으로부터의 데이터 및 또 다른 관찰은 직접적인 온콜리틱 효과가 항-종양 면역 반응의 아데노바이러스 매개 트리거에 의해 향상될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, Delta-24-RGD로 치료된 환자의 약 10%는, 특정한 경우에 매우 방대한 면역 세포에 의한 종양의 침윤을 보였다. 치료받은 이들 중 소규모의 소수집단을 나타내는 이들의 경우에, 최적의 항-종양 반응과 상호 연관을 나타내는 Th1-지배적인 면역 반응은 관찰되었다. 현재의 발명의 양상은 대부분의 환자에서 이 항-종양 효능을 향상시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스는 (1) 아데노바이러스 및 종양 항원 모두에 대해 Th1 면역 반응을 향상 및 (2) 종양의 면역 억제 환경을 역전하여 이 항-종양 효능을 달성하도록 설계된다. 본 발명의 온콜리틱 아데노바이러스의 투여는 바이러스 감염 또는 감염되지 않은 암세포를 인식하여 림프구의 집단의 활성을 유도하고, 이에 따라 심지어 바이러스가 박멸 후에도 지속하는 향상되고 장기간의 항종양 효과를 제공한다. 또한, OX40과 같은 면역 세포 자극성 수용체의 활성화는 종양의 면역 억제 환경을 유지하는 역할을 하는 T 조절 세포의 수와 활성 상태의 감소를 이끈다. 본 발명의 온콜리틱 아데노바이러스는 종양 위치에 작용제를 국소화하여 이에 의해 작용제의 전신 투여에 수반하는 원하지 않는 부작용을 감소시킴으로써, 별도로 아데노바이러스 및 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 투여하는 것에 비해 상당한 이점을 제공한다.

아데노바이러스의 감염 사이클은 2단계로 일어난다: 아데노바이러스 게놈의 복제 개시를 선행하며, 조절 단백질 및 바이러스 DNA의 복제와 전사에 관여하는 단백질의 생성을 허용하는 초기 단계, 및 구조 단백질의 합성을 유도하는 후기 단계. 초기 유전자는, 아데노바이러스 게놈에 분산되어 E1 내지 E4로 지정된(E는 “초기”를 의미) 4개 영역에 분포된다. 초기 영역은 적어도 여섯 전사 단위를 포함하며, 각각은 자체 프로모터를 가지고 있다. 초기 유전자의 발현은 자체 조절되고, 일부 유전자는 다른 유전자 전에 발현된다. 3개 영역, E1, E2와 E4는 바이러스의 복제에 필수적이다. 따라서, 아데노바이러스가 이들 기능 중 하나에 결함이 있는 경우, 이 단백질은 트랜스에 공급되어져야만 하거나, 또는 바이러스는 복제할 수 없다.

초기 E1 영역은 아데노바이러스 게놈의 5' 말단에 위치하며, 바이러스 전사 단위, ELA와 E1B를 포함한다. 이 영역은 초기 바이러스 사이클에 아주 조기에 참여하고 아데노바이러스의 거의 모든 다른 유전자의 발현에 필수적인 단백질을 인코드한다. 특히, E1A 전사 단위는 E1B, E2A, E2B, E3, E4 영역 및 후기 유전자의 프로모터로부터 전사를 유도하는, 다른 바이러스 유전자의 전사를 전사 촉진하는 단백질에 대해 코드한다. 전형적으로, 외인성 서열은 E3 영역의 모든 장소 또는 부분적으로 통합된다.

아데노바이러스는 세포 표면 수용체를 통해 허용하는 숙주 세포로 진입하고, 그 후 내재화된다. 복제주기의 처음 단계에 필요한 특정 바이러스 단백질과 관련된 바이러스 DNA는 전사가 개시될 때, 감염된 세포의 핵에 들어간다. 아데노바이러스 DNA의 복제는 감염된 세포의 핵에서 일어나며 세포 복제를 필요로 하지 않는다. 새로운 바이러스 입자 또는 비리온은 그들이 감염된 세포에서 방출된 후에 모이고, 기타 허용 세포를 감염시킬 수 있다.

아데노바이러스는 매력적인 전달 시스템이다. 본 발명의 실시예는 배치 당 1×10¹⁶ 바이러스 입자의 평균 수율로 현탁 세포 프로세스를 이용할 수 있다. 이 프로세스는 단백질, 혈청, 및 광범위한 예방 및 치료 백신 제품에 적합하게 제작된 동물 유래의 성분에 자유롭거나 본질적으로 자유로울 수 있다.

여러 가지 요인은 뇌종양의 치료에 온콜리틱 아데노바이러스의 사용을 선호한다. 우선, 신경교종은 통상적으로 국소화되기 때문에, 따라서 효율적인 로컬 접근법은 질환을 치료하기에 충분해야만 한다. 둘째, 신경교종은 다른 유전적 이상을 발현하는 세포의 여러 개체군에 잠복하고 있다. 따라서, 암세포에 대한 단일 유전자의 전사에 민감한 종양의 스펙트럼이 제한될 수 있다. 셋째, 복제 능력 아데노바이러스는 G0에 저지된 암세포를 감염 및 파괴할 수 있다. 신경교종은 언제나 비순환 세포를 포함하기 때문에, 이 속성은 중요하다. 마지막으로, 망막아종 종양 억제 유전자 기능의 손실이 종양의 다양한 형태의 원인과 연관되어 있어 신경교종의 치료에 제한되지 않지만, p16-Rb 경로는 대다수의 신경교종에서 비정상적이므로, 이들 종양의 치료를 위한 특히 유효한 Delta-24 아데노바이러스를 제조한다.

조건적으로 복제성(특정 조건하에서 복제 능력)이 되도록 아데노바이러스가 돌연변이 된 경우, 도움 세포는 바이러스 복제를 위해 요구될 수 있다. 필요한 경우, 도움 세포계는 인간 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 다른 인간 배아 중간엽 또는 상피 세포와 같은 인간 세포로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 도움 세포는 인간 아데노바이러스에 대해 허용된 다른 포유동물 종의 세포로부터 유도될 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어 베로 세포 또는 다른 원숭이 배아 중간엽 또는 상피 세포를 포함한다. 특정 양상에서, 도움 세포계는 293이다. 숙주를 배양시키는 다양한 방법은, 예를 들어 Racher 외, 1995, 기술 분야에서 찾을 수 있다.

특정 양상에서, 온콜리틱 아데노바이러스는 돌연변이 Rb 경로를 갖는 세포의 복제 능력이다. 형질감염 후, 아데노바이러스 플라크는 아가로스를 입힌 세포로부터 분리되고, 바이러스 입자는 분석을 위해 확장된다. 상세한 프로토콜에 대해 당업자는 Graham and Prevac, 1991에 거론된다.

아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 대안적인 기술은 세균 인공 염색체(BAC) 시스템, 상보 아데노바이러스 서열을 함유하는 두개의 플라스미드를 이용한 recA+ 세균 계통의 생체 내 세균 재조합, 및 효모 인공 염색체(YAC) 시스템(본 명세서에 참고로 포함된, PCT 공보 95/27071 및 96/33280)을 포함한다.

아데노바이러스는 성장 및 조작이 용이하고 생체 외 및 생체 내에서 넓은 숙주 범위를 나타낸다. 바이러스의 이 그룹은 높은 역가(예를 들어, ml 당 10⁹ 플라크 형성 단위(pfu) 보다 큰)에서 얻어질 수 있으며, 그들은 고도로 감염성이다. 아데노바이러스의 생활주기는 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 요구하지 않는다.

본 명세서에 기재된 온콜리틱 아데노바이러스의 변형은 암을 치료하는 온콜리틱 아데노바이러스의 능력을 향상시키기 위해 이루어질 수 있다. 온콜리틱 아데노바이러스의 이러한 변형은 Jiang 외(Curr Gene Ther. 2009 Oct 9(5): 422-427)에 의해 기재되었으며, 또한 미국 특허 출원 번호 20060147420을 참조하기 바라며, 이들의 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.

여러 종양 유형에서 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체(CAR)의 낮은 수준의 존재 또는 부존재는 온콜리틱 아데노바이러스의 효능을 제한할 수 있다. 다양한 펩티드 모티프 예를 들어, RGD 모티브(RGD 서열이 세포 표면 인테그린의 정상 리간드를 모방), 태트(Tat) 모티브, 폴리리신 모티브, NGR 모티브, CTT 모티브, CNGRL 모티브, CPRECES 모티브 또는 스트렙-태그 모티브(Rouslahti and Rajotte, 2000)는 섬유 노브에 첨가될 수 있다. 모티브는 아데노바이러스 섬유 단백질의 HI 루프 내에 삽입될 수 있다. CAR 독립 표적 세포 감염은 캡시드를 변형시키는 것을 허용한다. 이것은 높은 복제, 보다 효율적으로 감염, 및 종양 세포의 증가된 세포 용해(Suzuki 외, 2001, 본 명세서에 참고로 포함된)를 허용한다. 또한 EGFR 또는 uPR과 같은 특정 인간 신경교종 수용체를 결합하는 펩티드 서열은 첨가될 수 있다. 암세포의 표면에서 배타적으로 또는 우선적으로 발견된 EGFRvIII와 같은 특정 수용체는 아데노바이러스 결합 및 감염의 대상으로 사용될 수 있다.

II . 발현 카셋

본 발명의 특정 실시예에서, 본 명세서에 개진된 방법은 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이 핵산은 “발현 카셋”에 구성된다. 용어 “발현 카셋”은 서열을 인코딩하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 산물을 위해 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 구조의 임의의 유형을 포함하는 것을 의미한다.

프로모터 및 인핸서-발현 카셋이 전사의 발현을 가져오기 위해서는, 유전자를 인코딩하는 핵산은 프로모터의 전사 제어하에 있을 것이다. “프로모터”는 전사 개시 및 속도를 제어하는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 어구“동작 가능하게 위치된”,“동작 가능하게 연결된”,“제어하”및“전사 제어하”는 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하는 핵산 서열과 관련하여 프로모터가 정확한 기능 위치 및/또는 방향에 있는 것을 의미한다. 프로모터는, 핵산 서열의 전사 활성에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 참조하는“인핸서”와 함께 사용될 수 있거나 또는 없을 수 있다.

대상체의 세포에서 활성화될 것으로 당업자에게 공지된 임의의 프로모터는 본 발명의 방법 및 조성물에 적용할 수 있는 프로모터로 생각된다. 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에 적용할 수 있는 프로모터의 다양한 유형에 익숙할 것이다. 특정 실시예에서, 예를 들면, 프로모터는 구성적 프로모터, 유도적 프로모터, 또는 억제적 프로모터이다. 또한, 프로모터는 조직 선택적 프로모터가 될 수 있다. 본 명세서에서 조직 선택적 프로모터는 다른 조직 유형에 비해 특정 유형의 조직에서 상대적으로 더 활성적인 프로모터를 참조하는 것으로 된다. 프로모터의 예는 CMV 프로모터를 포함한다.

프로모터는 세포에서 활동적인 하나일 것이며 프로모터에 의한 발현은 결과적으로 피사체의 면역 시스템에 대해 항원 결정기의 표현(presentation)을 일으킨다. 예를 들어, 세포가 상피 세포인 경우, 실시예에서 사용된 프로모터는 특정 세포 유형에서 활성을 갖는 하나가 될 것이다.

코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치된 5'-비-코딩 서열을 분리하여 얻어질 수 있으므로, 프로모터는 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 하나일 수 있다. 이러한 프로모터는 “내인성.”으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열과 자연적으로 연관되고, 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 하나 일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점들은, 보통 자연 환경의 핵산 서열과 관련되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 얻어질 것이다. 또한, 재조합 또는 이종성 인핸서는 보통 자연 환경의 핵산 서열과 관련되지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 임의의 다른 원핵, 바이러스, 또는 진핵 세포에서 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 “자연적으로 발생하는”것이 아닌, 즉, 다른 전사 조절 영역의 서로 다른 요소를 포함하는 프로모터 또는 인핸서, 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 합성적으로 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열의 제조뿐만 아니라, 서열은 PCR™(미국 특허 번호 4,683,202 및 5,928,906을 참조, 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다)을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

물론, 세포 유형, 세포 기관, 및 발현을 위해 선택된 미생물에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 이용하는 것은 중요하다. 일반적으로 분자 생물학의 당업자는 프로모터, 인핸서, 및 단백질 발현을 위한 세포 유형 조합의 사용을 이해한다, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된, Sambrook 외(2001)를 참조하라. 프로모터는 이종 또는 내인성 수 있다.

관심 있는 핵산의 발현을 제어하는데 이용되는 특정 프로모터는, 충분한 수준으로 표적 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 한, 중요한 것으로 생각되지 않는다. 따라서, 인간 세포가 표적이 된 경우, 인간 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 제어하 및 인접한 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 말하면, 이러한 프로모터는 인간 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.

다양한 실시예에서, 인간 시토메갈로바이러스(CMV) 전초기유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 긴 말단 리피트는 사용될 수 있다. 발현 수준이 면역 반응을 생성시키기에 충분함이 제공된다면, 폴리뉴클레오티드의 발현을 달성하기 위해 당업자에 공지된 다른 바이러스 또는 포유류 세포 또는 세균 파지 프로모터의 사용은 물론 고려된다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 프로모터/요소들의 추가적인 예는, 모든 가능한 프로모터 및 인핸서 요소를 망라하도록 의도되지는 않고, 단지 그들의 예시인 다음을 포함한다: 면역 글로불린 중연쇄; 면역 글로불린 경쇄; T 세포 수용체; HLA DQα및/또는 DQβ; β 인터페론; 인터류킨-2; 인터류킨-2 수용체; MHC 클래스 II; MHC 클래스 II HLA-DRα; β-액틴; 근육 크레아틴 키나아제(MCK); 프리알부민(트렌스티테틴); 엘라스타아제 I; 메탈로티오네인(MTII); 콜라게나아제; 알부민; α-태아단백질; t-글로빈; β-글로빈; c-fos; c-HA-ras; 인슐린; 신경 세포 접착 분자(NCAM); α1-항트립신; H2B(TH2B) 히스톤; 마우스 및/또는 I형 콜라겐; 포도당-조절 단백질(GRP94 및 GRP78); 쥐 성장 호르몬; 인간 혈청 아밀로이드 A(SAA); 트로포닌 I(TN I); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 듀켄씨근이영양증; SV40; 폴리오마; 레트로바이러스; 유두종 바이러스; B형 간염 바이러스; 인간 면역 결핍 바이러스; 거대 세포 바이러스(CMV); 및 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스.

인핸서는 원래 DNA의 같은 분자에서 먼 위치에 있는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적 요소로 검출되었다. 인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 차이는 작동에 있다. 전체 인핸서 영역은 먼 거리에서 전사를 촉진할 수 있어야한다; 이 프로모터 영역 또는 그것의 구성 요소에 해당할 필요는 없다. 한편, 프로모터는 특정 위치 및 특정 방향에서 RNA 합성을 직접적으로 개시하는 하나 이상의 요소를 가져야하는 반면, 인핸서는 이들 특이성이 부족하다. 프로모터 및 인핸서는 종종 중복하고 연속적이며, 종종 매우 유사한 모듈 조직을 가지고 있는 것으로 보이고 있다. 게다가, 프로모터/인핸서 조합(진핵 프로모터 데이터베이스 EPDB에 따라)은 유전자의 발현을 구동하는데 또한 사용될 수 있다. 특정 생리적 신호에 응답하여 조절되는 프로모터의 추가적인 선택은 구성체의 유도성 발현을 허용할 수 있다. 예를 들어, 인간의 PAI-1 프로모터의 제어하에 폴리뉴클레오티드로서의 발현은 종양 괴사 인자에 의해 유도된다. 특정 자극에 응답하여 활성화될 수 있는 핵산 서열의 영역인 유도 요소의 예로는(요소/유도 물질): MT II/포르볼 에스테르(TFA) 또는 중금속; MMTV(쥐 유방 종양 바이러스)/글루코코티코이드; β-인터페론/폴리(rI)x 또는 폴리(rc); 아데노바이러스 5 E2/E1A; 콜라게나아제/포르볼 에스테르(TPA); 스트로멜리신/포르볼 에스테르(TPA); SV40/포르볼 에스테르(TPA); 쥐 MX 유전자/인터페론, 뉴캐슬 질병 바이러스; GRP78 유전자/A23187; α-2-마크로글로불린/IL-6; 비멘틴/혈청; MHC 클래스 I 유전자 H-2κb/인터페론; HSP70/E1A, SV40 Large T 항원; 프롤리페린/포르볼 에스테르-TPA; 종양 괴사 인자/PMA; 및 갑상선 자극 호르몬 유전자/갑상선 호르몬을 포함한다.

개시 신호는 - 또한, 특정 개시 신호는 서열을 코딩하는 효율적인 번역을 위해 요구될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 조절 신호가 제공될 필요가 있다. 당업자라면 용이하게 이를 판단하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다.

IRES - 본 발명의 특정 실시예에서, 내부 리보솜 유입점(IRES) 요소는 다중유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화 캡 종속 번역의 리보솜 스캔 모델을 무시하고 내부 위치에서 번역을 시작할 수 있다. 피코르나바이러스 패밀리(소아마비 및 뇌 심근염)의 두 구성원으로부터 IRES 요소뿐만 아니라 포유류 메시지로부터의 IRES가 기재되어 있다. IRES 요소는 이종성 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 여러 오픈 리딩 프레임은 함께 전사될 수 있으며, 폴리시스트론 메시지를 생성하는 IRES에 의해 각각 분리될 수 있다(미국 특허 번호 5,925,565 및 5,935,819을 참조).

다중 클로닝 부위 - 발현 카셋은 여러 제한 효소 부위를 포함하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 그들 중 어떤 것은 벡터를 소화하는 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다

폴리아데닐화 신호 - 발현에서, 보통 하나는 전사체의 적절한 폴리아데닐화 결과를 가져오는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 신호의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 것으로 생각되지 않고/않거나 이러한 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 실시예는 편리하고/하거나 여러 표적 세포에서 잘 작동하는 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 또한, 전사 종결 부위는 발현 카셋의 요소로서도 고려된다. 이러한 요소는 메시지의 수준을 향상 및/또는 다른 서열에 카셋을 통해 읽기를 최소화하는 역할을 할 수 있다.

다른 발현 카셋 구성 - 본 발명의 특정 실시예에서, 아데노바이러스 벡터에 의해 감염된 세포는 발현 벡터에 리포터 유전자를 포함하여 시험관 내에서 식별될 수 있다. 일반적으로, 선택 리포터는 선택할 수 있는 속성을 부여하는 것이다. 양성 선택 리포터는 리포터 유전자의 존재가 그의 선택을 허용하는 것인 반면, 음성 선택 리포터는 리포터 유전자의 존재가 그의 선택을 방지하는 것이다. 양성 선별 마커의 예는 약물 저항 마커(네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀)이다. 리포터의 다른 유형은 GFP와 같은 스크린 리포터를 포함한다.

본 발명의 실시예는 종양 관련 항원을 코딩하는 이종성 핵산 세그먼트를 포함하는 아데노바이러스 핵산의 제조에 현재 아데노바이러스 플랫폼 기술을 사용할 수 있다. 아데노바이러스 백신 구조의 양상들은 아데노바이러스 벡터로 유전 물질을 삽입하고, 특성화를 통해 확인하고, 핵산, 바이러스 및 바이러스 생성물을 서열화하는 것을 포함한다. 그 후, 아데노바이러스 백신은 확장성을 평가하기 위한 연구의 일련의 타당성 검사를 통해 넣는다.

III . 암

본 발명의 방법은 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 암 유형의 구체적인 예는 신경교종, 흑색종, 전이, 선암종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 대장암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 “신경교종”은 뇌 또는 척수의 신경교에서 발생하는 종양을 말한다. 신경교종은 같은 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포와 같은 아교 세포 유형에서 파생된다, 따라서 신경교종은 성상 세포종 및 희소 돌기 아교 세포종뿐만 아니라 악성 신경교종, 아교 모세포종, 및 뇌교종을 포함한다. 성상 세포종과 뇌교종은 어린이와 성인 모두에서 뇌와 척수의 모든 영역에서 발생할 수 있다. 희소 돌기 아교종은 일반적으로 성인의 대뇌 반구에서 발생한다. 신경교종은 소아과에서 뇌종양의 75%와 성인의 뇌종양의 45%를 차지한다. 기타 뇌종양은 수막종, 뇌교종, 송과체 부위 종양, 맥락막망 종양, 신경상피 종양, 배아 종양, 주변 신경출아(neuroblastic) 종양, 뇌신경의 종양, 조혈 시스템의 종양, 생식 세포 종양, 및 스텔라(stellar) 영역의 종양이다. 본 발명의 방법은 뇌의 모든 암을 치료할 수 있다.

용어 흑색종은 흑색종, 전이성 흑색종, 메라닌 세포 또는 신경 세포 관련 메라닌 세포 중 하나에서 유래되는 흑색종, 흑색암종, 흑색상피종, 흑색 육종, 제자리 흑색종, 표면 확산 흑색종, 결절성 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 선단(acral) 죽은깨 흑색종, 침습성 흑색종 또는 가족성 비정형 검은점 및 흑색종(FAM-M) 증후군을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 포유동물에서 이러한 흑색종은 염색체 이상, 퇴행성 성장과 발달 장애, 분열제, 자외선(UV), 바이러스성 감염, 유전자의 부적절한 조직 발현, 유전자의 발현에서 변화, 및 세포에서 표현, 또는 발암제에 의해 발생될 수 있다. 전술의 암들은 본 발명의 방법에 의해 평가되거나 처리될 수 있다. 암의 경우, 암과 관련된 항원(예를 들어, 종양 관련 항원(TAA))을 인코딩하는 유전자는 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체 작용제 분자를 인코딩하는 핵산과 함께 재조합 바이러스 게놈 또는 그의 일부에 포함될 수 있다. 암과 관련된 항원은 암세포의 표면에 발현될 수 있고, 분비될 수 있으며, 또는 내부 항원일 수 있다.

IV . 약학적 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 임의의 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 조성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 백신 조성물은 적어도 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 대상체에서 항-종양 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명에 따라, 하나 이상의 면역 세포 자극성 수용체 작용제를 발현하는 아데노바이러스 및 선택적으로 항원과 관련된 하나 이상의 종양은 치료 또는 예방적 목적에 대한 면역 반응을 유도하는 대상에게 투여된다. 따라서, 특정 실시예에서, 발현 구조는 이러한 목적에 적합한 조성물로 제형화된다. 어구“약학적” 또는“약학적으로 허용되는”은 인간 또는 동물에게 투여할 때 부작용, 알레르기 또는 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 본 명세서에 사용된 “약학적으로 허용 가능한 담체”는 임의의 모든 용매, 담체, 분산 매질, 피막제, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 본 발명의 발현 구조체와 호환되지 않는 경우를 제외하고, 치료적 조성물에서의 이것의 사용은 고려된다. 또한, 보충 활성 성분은 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 보충 활성 성분은 추가 면역제일 수 있다.

주사 사용에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 그 형태는 멸균되어야하고, 용이한 주사성이 존재하는 정도까지 유동적이어야 한다. 그것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물, 및 식물성 기름을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 필요한 경우, 다양한 항균제 및 항진균제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 파라벤, 클로로 부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용할 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 예컨대, 스테아린산 알루미늄 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 사용에 의해 대략 야기될 수 있다.

멸균 주사 용액은 필요에 따라, 상기 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적합한 용매 중에서 필요량의 화합물을 혼합함으로써 제조되고, 이어 여과 살균된다. 일반적으로 분산액은 기본 분산액 매질 및 상기 열거한 것들에서 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 매개물 내로 다양한 멸균 활성 성분을 혼합함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 먼저 그것의 무균 필터링된 용액으로부터 임의의 바람직한 성분의 분말을 추가한 활성 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이 있다.

제조시, 용액은 투여 제형과 호환되는 방식 및 치료 또는 예방적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 수용액의 비경구 투여에 대해, 용액은 필요한 경우에 적절하게 완충되어야하며, 액체는 먼저 제공된 등장제를 염분 또는 포도당으로 희석한다. 이러한 특정 수용액은 혈관 및 종양 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 용액 매질은 본 명세서의 개시 내용으로부터 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

투여량의 일부 변화는 치료를 받는 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생될 것이다. 투여를 담당하는 사람은 임의의 상황에서 개별 대상에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다. 또한, 인체 투여를 위해, 제제는 FDA에 의해 요구되는 무균성, 발열성, 일반 안전 및 순도 기준을 충족해야 한다.

투여량 - 치료적 또는 예방적 제제의 유효량은 예를 들어, 종양에 대한 면역 반응의 자극과 같은 의도된 목표에 근거하여 결정된다. 당업자는 생체 내 및 생체 외 상황에서 유전자 전달을 적용하는 방법을 잘 알고 있다. 바이러스 벡터에 대해, 일반적으로 바이러스 벡터 균체(stock)를 준비한다. 바이러스의 종류와 달성하고자하는 역가에 따라, 적어도 약, 많아도 약, 또는 약 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹ 1×10¹⁰, 1×10¹¹ 또는 1×10¹² 전염성 입자, 또는 이 사이의 임의의 값 또는 범위로 대상체에 전달할 것이다. 다른 양상에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 단일 투여 또는 다중 투여로 투여될 수 있다. 바이러스는 1×10⁵ 플라크 형성 단위(PFU), 5×10⁵PFU, 적어도 1×10⁶ PFU, 5×10⁶ 또는 약 5×10⁶PFU, 1×10⁷, 적어도 1×10⁷PFU, 1×10⁸ 또는 약 1×10⁸ PFU, 적어도 1×10⁸ PFU, 약 또는 적어도 5×10⁸ PFU, 1×10⁹ 또는 적어도 1×10⁹ PFU, 5×10⁹ 또는 적어도 5×10⁹ PFU, 1×10¹⁰PFU 또는 적어도 1×10¹⁰PFU, 5×10¹⁰PFU 또는 적어도 5×10¹⁰PFU, 1×10¹¹ 또는 적어도 1×10¹¹, 1×10¹²또는 적어도 1×10¹², 1×10¹³또는 적어도 1×10¹³PFU의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 약 10⁷-10¹³ PFU 사이, 약 10⁸-10¹³ PFU 사이, 약 10⁹-10¹² PFU 사이, 또는 약 10⁸-10¹² PFU 사이의 투여량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 국소적 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 본 발명에 따른 온콜리틱 바이러스는 혈관 내(동맥 내 또는 정맥 내), 종양 내, 근육 내, 피부 내, 복강 내, 피하, 경구, 비경구, 비강, 기관 내, 경피, 척수 내, 또는 두개골 내에 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 종양 내 또는 혈관 내 투여된다.

또한, 본 발명에 따른 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 세포 담체로 투여될 수 있다. 이러한 관점에서, 신경 및 중간엽 줄기 세포는 높은 이동성 전위를 갖고 여전히 종양 조직에 국한되어 있다. 성인 중간엽 세포의 서브 집단(골수는 종양 침윤 세포 또는 BM-TICs을 파생한다)은 신경교종에 주입에 따라, 종양 전체를 침윤시키는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 온콜리틱 바이러스는 바이러스-생성 신경 또는 중간엽 줄기 세포(예를 들어, BM-TIC) 담체에 투여될 수 있다(예를 들어, 종양에 캐리어 세포의 주사에 의해).

치료 및 투여 횟수에 따른 투여되는 양은, 치료될 대상체, 대상체의 상태 및 원하는 보호에 따른다. 또한, 치료 조성물의 정확한 양은 의사의 판단에 따르며 각 개인에 대해 고유하다.

실시예

다음의 실시예 뿐만 아니라 도면은 본 발명의 바람직한 실시예를 보여주기 위해 포함된다. 이는 실시예 또는 도면에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것임을 본 기술 분야의 당업자에 의해 이해되어야하며, 따라서, 그 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 본 개시의 관점에서, 많은 변경이 개시된 특정 실시예에서 이루어지고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 같거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해해야한다.

실시예 1- Delta -24 RGDOX 의 구조 및 특성

CMV 프로모터를 갖는 쥐 OX40L 발현 카셋은 인간의 아데노바이러스 타입 5 게놈의 E3영역을 대체했다. Rb는 단백질 결합을 담당하는 E1A 유전자(인코드된 E1A 단백질의 아미노산 122-129에 해당)의 CR2 부분 안에서 24-bp 서열을 삭제했다. 서열을 코딩하는 RGD-4C 모티브를 섬유 단백질의 HI-루프에 삽입했다. 도 1을 참조하라.

GL261(쥐 신경교종)에 D24-RGDOX에 의한 쥐 OX40L(mOX40L) 및 쥐 흑색종 B16 세포의 발현을 평가하였다. GL261 또는 B16 세포를 50pfu/세포로 D24-RGDOX로서 감염시켰다. 48시간 후에, 세포를 α-mOX40L 항체(1:100 희석)(eBioscience, San Diego, CA)로 염색시킨 후 FITC 표지된 이차 항체를 염소 항-쥐 IG(1:100 희석)(Santa Cruz Biotechnology)로 염색시켰다. 세포막 무결성을 에티듐 호모디머-1 스테이닝(8μM)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 모니터링 하였다. 염색된 세포를 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 도 2 및 도 3의 우측 하단 모서리에 있는 숫자는 mOX40L을 발현하는 GL261 및 흑색종 B16 세포의 비율을 나타낸다. D24-RGDOX는 GL261 세포와 흑색종 B16 세포 모두에서 효율적으로 OX40L을 발현했다.

GL261-EGFP(GL261를 발현하는 향상된 녹색 형광 단백질) 종양 세포에서 mOX40L의 발현을 평가하였다. GL261-EGFP 세포(5×10⁴ 세포)를 C57BL/6 쥐의 두개골 내에 주입하였다. 12일 후, D24-RGDOX을 종양 내에 주입하였다(5×10⁷pfu). 주입 후 3일에 종양을 수집하고 ACCUMAX 세포 분리 수용액(EMD Millipore, Billerica, MA)으로 해리하였다. 그 다음 세포를 쥐 단일 클론 α-mOX40L APC 항체(1:40)(eBioscience)로 염색하였다. 염색된 세포를 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 종양 세포는 EGFP 양성으로 게이팅하였다. 도 4의 상단 오른쪽 코너의 숫자는 mOX40L을 발현하는 종양 세포의 백분율을 나타낸다. 이러한 생체 데이터는 D24-RGDOX를 주입한 후 72시간에 이종 이식 세포의 약 9%에서 OX40L의 발현을 보여준다.

U87 MG(상피 형태를 갖는 인간의 1차 교아세포종 세포계; American Type Culture Collection, Manassa, VA)에서 D24-RGD 및 D24-RGDOX의 복제 또는 GL261 세포를 시험하였다. 세포를 5×10⁴ 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 접종하고 10pfu/세포의 바이러스로 감염시켰다. 감염 후 48시간에, 전염성 바이러스 자손을 제조업체의 지시에 따라 ADENO-X Rapid Tilter Kit(Clontech, Mountaind View, CA)를 사용하여 역가시켰다. 최종 바이러스 역가를 pfu/㎖로 결정하여, 3번의 독립적인 측정의 평균±SD로서 도 5에 표시하였다. 두 바이러스의 복제를 스튜던트 T-테스트(양면)을 사용하여 비교하였다. 두 바이러스는 GL261 세포에서 매우 열약하게 복제하는 반면, D24-RGDOX는 인간의 신경교종 U-87mg 세포에서 그의 부모 바이러스 D24-RGD와 같이 효율적으로 복제하는 것으로 나타났다. 따라서, 쥐 신경교종 모델로서 본 명세서에 기재된 항종양 효과는 인간에서 기대되는 바이러스(OX40L을 발현하는) 항종양 효과를 대표하는 데에는 상당히 불충분하다.

HSP90 및 HMGB1 분비를 유도하는 D-24-RGD 및 D24-RGDOX의 능력을 평가하였다. GL261 세포를 200pfu/세포의 바이러스로 감염시켰다. 24시간 후, FBS의 농도를 10%에서 2%로 변경했다. 배양 배지(M) 및 전체 세포 용해물(W)을 도 6에서 지시된 시점에서 수집하였다. 배양 배지를 단백질 농축기(9K MWCO, Thermo Scientific)로 10배 농축시켰다. 이어서 HSP90 및 HMGB1 발현 수준을 면역블로팅법으로 분석하였다. 간단히, 전체 세포 용해물 또는 40㎕/레인 농축된 매체로부터 동일 량의 단백질을 4-20% 구배 황산 도데실 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분리하여, 전기영동적으로 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰고, 막을 토끼 다클론 항-HSP90 및 항-HMGB1(1:1000 희석)(Cell Signaling Technology, Bevery, MA), 염소 다클론 항-액틴(1:1000 희석)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)으로 탐침하였다. 단백질-항체 복합체를 향상된 화학 발광 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, CA)를 사용하여 시각화 하였다. 액틴을 전체 세포 용해물에 대한 로딩 콘트롤로 사용하였다. 도 6의 하단의 수치는 매체에서 분비되는 상대적인 HMGB1 수준을 나타낸다. GL261 세포에서 바이러스의 낮은 복제 효율성에도 불구하고, 두 바이러스는 ATP 및 HMGB1의 방출을 유도하였고, 이것은 면역 세포 사멸 동안 염증과 면역을 유발시키는 내인성 손상 관련 분자 패턴(DAMP) 분자의 프로토 타입이다.

실시예 2 - D24 - RGDOX 에 의해 유도된 향상된 치료효과

신경교종 암 모델의 생존에서 D24-RGDOX의 효과를 별도로 또는 함께 투여된 D24-RG 및 OX86(OX40 작용제)의 효과와 비교하여 평가하였다. GL261 세포(5×10⁴ 세포)를 C57BL/6 쥐와 무흉선 쥐의 두개골 내에 주입하였다. D24-RGDOX 또는 D24-RGD(5×10⁷pfu) 및/또는 α-쥐 OX40 항체 OX86(MDACC의 Monoclonal Antibody Core Facility에서 제공하는, 25㎍)를 종양 이식(바이러스는 GL261 세포에서 바이러스의 낮은 복제를 부분적으로 보상하도록 세 번 주사하였다) 후 3, 6, 8일에 종양 내 주사하였다. PBS를 음성 제어로 사용하였다. 치료 그룹(PBS; D24-RGD; OX86; OX86+D24RGD; D24-RGDOX; 각 그룹에서 n=10) 사이에서 생존을 로그 순위 테스트(양면)를 사용하여 비교하였다. 도 7a 및 도 7b는 각각 C57BL/6에서 표시된 치료 그룹(n=10, 각 그룹) 또는 무흉선 쥐의 생존율의 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier Curves)을 나타낸다. 이 동물의 생존 연구는, D24-RGD 자체는 각각 주사(p=0.08)에 대한 5×10⁷ pfu/쥐의 바이러스 투여에 아무런 영향을 나타내지 않는 반면, OX86과 D24-RGD의 조합은 쥐의 생존을 크게 연장시킨다(평균 생존 24일 대 17일, p=0.0002)는 것을 나타낸다. 중요한 것은, D24-RGDOX는 D24-RGD에 비해 28.5일(p<0.0001)까지 평균 생존 시간을 더 연장했다. 쥐의 장기 생존은, 치료 효과가 면역 결핍 GL261-무흉선 쥐 신경교종 모델(p>0.3)(도 7b)에서 관찰되지 않았기 때문에, 바이러스 및 항체에 의해 유발된 항-신경교종 면역성에 주로 기인된다.

D24-RGDOX에 의해 유도된 면역 반응을 조사하고 유동 세포 분석법 분석을 사용하여 RGD-D24의 면역 반응과 비교하였다. GL261 세포(5×10⁴ 세포)를 C57BL/6 쥐의 두개골 내에 주입하였다. 바이러스(5×10⁷pfu)를 종양 이식 후 6, 8 및 10일에 종양 내로 주입하였다. 14일에, 뇌 침윤 백혈구(그룹 9 쥐로부터)를 퍼콜(GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) 구배 원심 분리로서 미엘린 잔해로부터 먼저 분리하고, 유동 세포 분석법 분석용으로 직접 사용하였다. 사용되는 항체는 다음과 같다: 항-쥐 CD45-APC EFLUOR 780(1:200 희석), 항-쥐 CD3 FITC(1:200 희석), 항-쥐 CD8a PerCP-Cyanine5.5(1:80 희석)(eBioscience), BRILLIANT VIOLET 650 항-쥐 CD4 항체(1:100 희석)(BioLegend, San Diego, CA). 데이터를 세 번 측정의 평균+SD로서 도 8에 도시하였다. 치료 그룹 간의 세포 수는 스튜던트 T-테스트(양면)를 사용하여 비교하였다. 데이터는, D24-RGDOX는, 종양 위치(p<0.001)에 T 림프구(CD45+CD3+), T 도움 세포(CD45+CD3+CD4+), 세포 독성 T 세포(CD45+CD3+CD8+) 침윤을 유도하는 D24-RGD보다 효율적임을 나타낸다.

항-종양 면역 반응에서 D24-RGDOX의 효과를 평가하고, D24-RGD의 효과와 비교하였다. GL261 세포(5×10⁴ 세포)를 C57BL/6 쥐의 두개골 내에 주입하였다. 바이러스(5×10⁷ pfu)를 종양 이식 후 6, 8, 10일에 종양 내 주입하였다. 종양 이식 후 14일에, 각 치료의 쥐 비장(그룹 5 쥐)에서 비장 세포를 분리하였다. 뇌 림프구 분리(종양을 갖는 그룹 5 반구에서)를 위해, 상기한 바와 같이 먼저 뇌 침윤 백혈구를 미엘린 잔해로부터 분리하였다. 그런 다음, 뇌 림프구를 LYMPHOLYTE-M(Cedarlane, Burlington, NC)에 구배 원심 분리기로 분리하였다. 비장 세포를 활성화하기 위해, 1% 파라포름알데히드(PFA)로 전고정된 2×10⁴ 표적 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 웰당 5×10⁵ 뇌 침윤 림프구 또는 비장 세포와 함께 40시간 동안 배양시켰다. 상청액에서 IFN-γ의 농도를 표준 ELISA 분석(쥐 IFN-gamma DuoSet, R&D systems)으로 평가하였다. 데이터를 세 번 측정의 평균+SD로서 도 9에 도시하였다. 도 10a 및 도 10b는, 뇌 침윤 림프구를 종양 이식 후 21일에 각각의 처리 그룹에서 쥐로부터 분리하여 상기에 기재된 바와 같은 MBCs와 함께 공동 배양시키고(도 10a), 비장 세포를 종양 이식 후 21일에 각각의 처리 그룹에서 쥐로부터 분리하여 상기 기재된 바와 같은 지정된 표적 세포와 함께 공동 배양 시키는(도 10b) 별도의 실험을 나타낸다. 각 경우에, 상청액에서 IFN-γ의 농도는 표준 ELISA 분석(쥐 IFN-gamma DuoSet, R&D systems)으로 40시간 후에 측정하였다. 데이터를 세 번 측정의 평균+SD로서 도 10a와 도 10b에 도시하였다. 치료 그룹 간의 활동을 스튜던트 T-테스트(양면)를 사용하여 비교하였다. 이러한 데이터는, D24-RGDOX가 D24-RGD 또는 D24-RGD-EGFP(P, 0.05)보다 감염되지 않은 또는 바이러스에 감염된 종양 세포에 대한 면역 세포(비장 세포 및 뇌 침윤 림프구(BILs))에 상당히 더 강한 활성을 유도하는 것을 나타낸다. D24-RGDOX 감염된 종양 세포는 D24-RGD(p<0.002)로 감염된 종양 세포보다 BILs에서 더 강한 활성을 유발하며, 이것은 D24-RGDOX에 의한 OX40L의 발현은 면역 세포를 자극하는 종양 세포의 능력을 증가시킨다는 것을 나타낸다. D24-RGDOX는 쥐 뇌세포(MBCs) 일차 배양에 대해 다른 그룹(p=0.01)보다 강한 면역 반응을 야기하지만, 여전히 MBCs(p>0.005)보다 종양 세포에 대한 상당히 높은 활성을 유도한다. 그러나, 다른 7일(D24-RGD의 1.6배) 후 약해지기 때문에, MBC(D24-RGD의 15.6배)에 대해 D24-RGDOX에 의해 유도된 BILs의 이런 증가 반응은 급성이었다. D24-RGDOX에 의해 유도된 MBCs에 대한 BIL의 활동의 급성 수준은 7일 후에 약 4배 감소하였다. 또한, 종양 세포에 대한 증가된 반응은 비장에서 다른 7일 후까지 지속되는 반면, D24-RGDOX 의해 유도된 MBCs에 대한 증가된 반응은 비장 세포(p=0.2)에서 관찰되지 않았다. D24-RGDOX 치료 그룹 및 비장 세포에서 다른 그룹사이의 활성 차이는 7일 이전보다 훨씬 더 컸다.

본 발명자들은, 최초로, 면역 능력 쥐 모델에서 신경교종을 치료하기 위해 후기 부자극 OX40L/OX40 경로를 타겟팅하여 온콜리틱 아데노바이러스 D24-RGD를 결합했다. D24-RGDOX는 그의 부모 바이러스 D24-RGD보다 항-신경교종 면역성을 유도하는 탁월한 능력을 나타낸다. D24-RGD의 암 선택 특성으로 인해, OX40L은 암세포에 우선적으로 발현되어야 한다. 또한, CTLA4를 결합하는 CD28 리간드와는 달리, OX40 리간드는 선택적 OX40를 결합한다. 따라서, OX40L은 종양 관련 바이러스 항원을 인식하는 TCR로 T 림프구에 OX40을 자극하여, 결과적으로 종양 특이적 T 세포 개체군의 팽창을 일으킨다. 따라서, CTLA-4 및 PD-1에 대한 길항제 항체 또는 세계적으로 면역 세포를 활성화하는 면역 조절제를 발현하는 온콜리틱 바이러스의 사용은 OX40 작용제 항체와 다르며, D24-RGDOX에 의해 발현된 OX40L에 의한 T 세포의 조절은 종양 특이 T 세포에 더 제한된다. 따라서, D24-RGDOX는 이러한 치료법과 관련된 전신 독성을 야기할 가능성이 적다. 본 예시에 기초하여, 완전 반응을 갖는 인간 암 환자의 비율은 D24-RGDOX로 상당히 증가 될것으로 예상된다. 또한, 임상 반응의 지속 기간은 OX40L/OX40 경로에 의해 자극된 향상된 면역 메모리 때문에 D24-RGDOX에 의해 증가할 것으로 예상된다.

SEQUENCE LISTING <110> DNATRIX, INC. The Board of Regents, The University of Texas System Tufaro, Frank Fueyo-Margareto, Juan Gomez-Manzano, Candelaria Conrad, Charles Yung, Alfred W.K. Jiang, Hong <120> Adenovirus Expressing Immune Cell Stimulatory Receptor Agonist(s) <130> 011863-5005 WO <140> PCT/US2014/066920 <141> 2014-11-21 <150> US 61/907,860 <151> 2013-11-22 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe 1 5 10

Claims

아데노바이러스 게놈의 비-필수 영역에 삽입된 이종성 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 전사 조절 요소에 활동적으로 연쇄된 OX40(CD134) 작용제를 인코딩하는 서열을 포함하는 복제 능력 온콜리틱(oncolytic) 바이러스.
제 1항에 있어서,
상기 복제 능력 온콜리틱 바이러스는 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스인 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 2항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 E3 유전자 영역의 일부 또는 모두의 결실을 포함하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 3항에 있어서,
상기 이종 핵산은 상기 아데노바이러스의 E3 결실된 유전자 영역에 삽입되는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OX40 작용제는 OX40 리간드(OX40L)(gp36)인 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 5항에 있어서,
OX40L을 인코딩하는 상기 핵산은 GenBank 수탁번호 NP_003317.1에 제시된 아미노산 서열 또는 그것에 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코드하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 6항에 있어서,
OX40L을 인코딩하는 상기 핵산은 NCBI 참조 서열: NM_003326.3의 핵산 서열 또는 그것에 95% 이상 동일한 서열을 갖는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 타입 5 또는 인간 아데노바이러스 타입 5 성분을 포함하는 혼성체인 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 8항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 Delta-24 또는 Delta-24-RGD인 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 1 항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAd1, H101 및 AD5/3-D24-GMCSF로부터 선택되는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아데노바이러스 게놈은 종양 항원을 인코딩하는 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 포함함으로써, 상기 아데노바이러스는 그 표면에 상기 종양 항원(들)을 발현하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 11항에 있어서,
상기 종양 항원은 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, 티로시나제, midkin, BAGE, CASP-8, β-카테닌, CA-125, CDK-1 ESO-1, gp75, gplOO, MART-1, MUC-1, MUM-1, p53, PAP, PSA, PSMA, ras, trp-1, HER-2, TRP-1 TRP-2, IL13Ralpha, IL13Ralpha2, AIM-2, AIM-3, NY-ESO-1, C9orfl 12, SART1, SART2, SART3, BRAP, RTN4, GLEA2, TNKS2, KIAA0376, ING4, HSPH1, C13orf24, RBPSUH, C6orfl53, NKTR, NSEP1, U2AF1L, CYNL2, TPR, SOX2, GOLGA, BMI1, COX-2, EGFRvIII, EZH2, LICAM, Livin, Livin, MRP-3, 네스틴, OLIG2, ART1, ART4, B-사이클린, Gli1, Cav-1, 카텝신 B, CD74, E-카데린, EphA2/Eck, Fra-1/Fosl 1, GAGE-1, 강글리오시드/GD2, GnT-V, β1, 6-Ν, Ki67, Ku70/80, PROX1, PSCA, SOX10, SOX11, 서비빈, UPAR 및 WT-1 또는 이의 면역원성 펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 12항에 있어서,
상기 이종성 핵산은 상기 아데노바이러스의 헥손 유전자의 초가변영역 5에 삽입 또는 아데노바이러스 섬유 유전자의 HI 루프 영역 내에 삽입되는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
제 12항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 EGFRvIII을 인코딩하는 이종성 핵산 또는 상기 아데노바이러스의 섬유 유전자의 HI 루프 영역 내에 삽입된 그의 면역원성 펩티드 및/또는 NY-ESO-1을 인코딩하는 이종성 핵산 또는 상기 아데노바이러스의 헥손 유전자의 초가변영역 5에 삽입된 그의 면역원성 펩티드를 포함하는 복제 능력 온콜리틱 바이러스.
청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 15항에 있어서,
IL-12p70, IL-2, IFN-γ, 레날리도미드, 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타자비시클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카르복사미드), 시클로포스파미드((RS)-N,N-비스(2-클로로에틸)-1,3,2-옥사자포스피난-2-아민2-옥시드), 로무스틴(CCNU;N-(2-클로로에틸)-N'-시클로헥실-N-니트로소우레아), 비스-클로로에틸니트로소우레아(BCNU), 멜팔란 염산염(4-[비스(클로로에틸)아미노]페닐알라닌), 부설판(부탄-1,4-디일 디메탄술폰산), 메클로레타민(니트로겐 머스타드), 클로람부실, 이포스파미드, 스트렙토조신, 다카르바진(DTIC), 티오테파, 알트레타민(헥사메틸메라민), 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥사라플라틴, 이필리무맵(Ipilimumab), 트레멜리무맵(Tremelimumab), MDX-1106, MK-3475, AMP-224, 필딜리주맵(Pidilizumab), 및 MDX-1105로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 Th1 자극제를 포함하는 약학적 조성물.
제 16항에 있어서,
상기 Th1 자극제는 IFN-γ 또는 테모졸로미드인, 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스 또는 청구항 15 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제 18항에 있어서,
상기 환자는 일차 또는 전이성 뇌종양, 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 대장암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암으로부터 선택된 암을 갖는, 방법.
제 19항에 있어서,
상기 환자는 낮은 수준 또는 높은 수준 신경교종을 갖는, 방법
제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 종양 내, 혈관 내, 또는 신경 세포 혹은 중간엽 줄기 세포 담체 내에 투여되는, 방법.
제 21항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 종양 내 투여되는, 방법.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 10⁸-10¹³ 플라크 형성 단위(pfu)의 투여량으로 한 번 또는 여러 번 투여되는, 방법
제 22항 또는 제 23항에 있어서,
상기 아데노바이러스의 유효량을 종양 덩이 또는 혈관계 내로의 주입을 포함하는, 방법.
제 24항에 있어서,
상기 주입에 의해 종양 성장이 주입된 종양 및 적어도 한 번의 비-주입된 종양 모두에서 감소되는, 방법.
제 18항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 환자는 IL-12 대 IL-4의 비가 20 미만을 나타내는, 방법.
(i) 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스 또는 청구항 15에 따른 조성물과 (ii) Th1 자극제의 효과적인 결합 량을 이를 필요로 하는 환자에게 혼합 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제 27항에 있어서,
상기 Th1 자극제는 IL-12p70, IL-2, IFN-γ, 레날리도미드, 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타자비시클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카르복사미드), 시클로포스파미드((RS)-N,N-비스(2-클로로에틸)-1,3,2-옥사자포스피난-2-아민2-옥시드), 로무스틴(CCNU;N-(2-클로로에틸)-N'-시클로헥실-N-니트로소우레아), 비스-클로로에틸니트로소우레아(BCNU), 멜팔란 염산염(4-[비스(클로로에틸)아미노]페닐알라닌), 부설판(부탄-1,4-디일 디메탄술폰산), 메클로레타민(니트로겐 머스타드), 클로람부실, 이포스파미드, 스트렙토조신, 다카르바진(DTIC), 티오테파, 알트레타민(헥사메틸메라민), 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥사라플라틴, 이필리무맵(Ipilimumab), 트레멜리무맵(Tremelimumab), MDX-1106, MK-3475, AMP-224, 필딜리주맵(Pidilizumab), 및 MDX-1105로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제 28항에 있어서,
상기 Th1 자극제는 IFN-γ 또는 테모졸로미드인, 방법.
제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Th1 자극제는 복제 능력 온콜리틱 아데노바이러스 이전에 투여되는, 방법.
제 27항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
아데노바이러스는 Delta-24 또는 Delta-24-RGD 이며 OX40 작용제는 OX40 리간드(OX40L)(gp36)인, 방법.
제 18항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 환자는 인간인, 방법.