CN111494414A - 一种用于癌症的联合免疫治疗的药物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种用于癌症的联合免疫治疗的药物组合及其应用，该药物组合，包含有效治疗剂量的含CD8+T细胞群的过继性细胞治疗剂和有效治疗剂量的复制型溶瘤病毒疫苗，所述过继性细胞治疗剂和所述复制型溶瘤病毒疫苗顺序使用，其中CD8+T细胞群中至少50％的CD8+T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性。其应用包括肿瘤抗原特异性CD8+T细胞过继性细胞治疗剂给药和靶向相同抗原的溶瘤痘苗病毒给药。

Description

一种用于癌症的联合免疫治疗的药物组合及其应用

技术领域

本发明涉及癌症治疗技术领域，尤其涉及癌症的联合免疫治疗技术领域。

背景技术

癌症和常规的癌症治疗剂目前在情绪/身体痛苦、失去生命和增加医疗保健成本方面带来了显著的社会经济负担。常规的疗法显示一些有益的临床效果但是具有经常会降低患者的生活质量的有害的副作用。需要具有更少且更低的有害副作用的更有效的癌症疗法。

充分理解的是，恶性肿瘤(neoplastic malignancy)可以由免疫系统有效地消除，并且免疫疗法代表对癌症有前景的替代治疗方式。

例如对于肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的T细胞等免疫细胞具有破坏肿瘤的潜力。作为自然肿瘤细胞更新的结果或者通过给予治疗性疫苗，可以在癌症患者中诱导这样的细胞。不幸的是，一旦浸润至肿瘤中，这些细胞通常被证明是无效的，并且它们经常显示功能障碍的表型并且由于肿瘤诱导的局部免疫抑制而导致缺乏对于减少或破坏肿瘤必要的溶细胞功能。因此，免疫抑制的肿瘤环境仍然是显著的障碍，其会减弱由常规的癌症免疫治疗剂诱导的应答。

基于目前检查点抑制剂的疗法已经用于减轻对肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的抑制性信号传导并且激活内源性抗肿瘤应答。检查点抑制剂已经在临床试验中显示出疗效，但是未在所有经治疗的受试者中观察到应答。检查点抑制剂疗法依赖于预先存在的TAA特异性T细胞的活化，但是在一些患者中，没有足够的预先存在的TAA特异性T细胞以在治疗诱导的再活化之后引起完全的肿瘤消退(tumor regression)。

临床证据已经显示过继性T细胞疗法（T细胞免疫疗法）在例如B细胞淋巴瘤等非实体癌症中的良好的抗肿瘤疗效。事实上，已经显示人乳头瘤病毒反应性T细胞的输注也可以诱导HPV阳性转移性宫颈癌的消退。已经将该策略扩展至靶向非病毒肿瘤相关抗原，但是仍然需要改进从而增强肿瘤浸润和实体瘤的消退。

研究涉及T细胞免疫疗法的工作已经显示，T细胞免疫疗法的治疗潜力需要转移的细胞以足够的量和长期持久性浸润肿瘤从而杀灭所有恶性细胞。临床证据表明，可以通过具有维持复制能力的微分化表型的高剂量的过继转移细胞(数十亿)来实现这些需要。 然而，这些双重目标冲突；产生高剂量的T细胞需要大量的体外扩增，其也导致T细胞的终末分化和复制性衰老。实际上，常规的T细胞免疫疗法疗法使用终末分化效应T细胞并且需要对患者进行在先的放射治疗或化学治疗从而耗竭淋巴细胞群并且允许需要输注的数十亿的细胞的更好的植入。此外，常规的T细胞免疫治疗需要IL2的额外治疗来维持输注的细胞的持久性和活化。

最近的研究已经显示，低分化细胞，如中央型记忆T细胞，在植入的细胞的持久性和临床结果方面在T细胞免疫疗法中显示较好的成功。已经公开了用于从PBMC样品生产TAA特异性中央型记忆T细胞培养物的方法，但是该方案需要临床级细胞分选仪，对于富集抗原特异性细胞，所述方案是劳动密集型且资源密集型的。

发明内容

本发明旨在提供一种用于癌症联合免疫治疗的药物组合及其应用。

本发明的目的之一在于提供一种用于癌症联合免疫治疗的药物组合，包含有效治疗剂量的含CD8⁺T细胞群的过继性细胞治疗剂和有效治疗剂量的复制型溶瘤病毒疫苗，所述过继性细胞治疗剂和所述复制型溶瘤病毒疫苗顺序使用，其中CD8⁺T细胞群中至少50％的CD8⁺T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群中60％~70％的CD8⁺T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群是通过在肿瘤抗原、抗原呈递细胞（APC）和IL-21存在下体外培养具有组织相容性表型的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）产生的。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群是通过在包括IL21与IL15的组合物存在下体外培养肿瘤浸润淋巴细胞（TILS）或外周血单核细胞（PBMC）产生的产生的。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群是通过在包括IL21与IL15，但不包含IL2的组合物存在下体外培养肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）产生的产生的。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群是通过在雷帕霉素存在下体外培养肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）产生的产生的。

进一步地，其中CD8⁺T 细胞群是通过用重组T细胞受体（TCR）转导的外周血单核细胞（PBMC）或对肿瘤抗原特异性的嵌合抗原T细胞受体（CAR）并离体培养转导的外周血单核细胞（PBMC）来产生。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群是通过体外培养CD25耗尽的外周血单核细胞（PBMC）产生。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群的体外培养的IL21和IL15的浓度均为5 ~15ng / ml。

进一步地，其中所述CD8⁺T细胞群通过体外培养后并体外活化一周。

进一步地，其中CD8⁺T细胞群通过将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）体外培养之后并在包含抗CD3和抗CD28抗体以及IL2的培养物中进行离体扩增至少一至四周。

进一步地，其中所述复制型溶瘤病毒是表达肿瘤抗原的溶瘤弹状病毒或溶瘤痘苗病毒。

进一步地，其中所述复制型溶瘤病毒是野生型的或重组减毒的溶瘤痘苗病毒。

进一步地，其中溶瘤痘苗病毒是Wyeth，Western Reserve或Copenhagen菌株，具有胸苷激酶缺失和/或痘苗生长VGF基因缺失。

进一步地，所述药物组合中的药物活性物质通过药学上可接受的载体以介质和药剂形式给药。

本发明的另一目的在于提供一种上述药物组合在癌症的联合免疫治疗中的应用，采用上述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合对癌症进行联合免疫治疗，癌症的肿瘤抗原选自甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），CA 125，Her2，多巴色素互变异构酶（DCT），GP100，Melan-A / MART-1，MAGE蛋白，BAGE蛋白，GAGE蛋白，NY-ESO1，WT-1，酪氨酸酶，SSX2，细胞周期蛋-A1，KIF20A，MUC5AC，Meloe，Lengsin，激肽释放酶4，IGF2B3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，HPV-E6和HPV-E7。

进一步地，包括：过继性细胞治疗剂给药：离体培养肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）而产生CD8⁺T细胞，扩增培养物中的CD8⁺T细胞群，其中CD8⁺T细胞群中至少50％的CD8⁺T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性，将CD8⁺T细胞群向受试者过继细胞转移；和复制型溶瘤牛痘病毒疫苗给药：将表达相同的肿瘤抗原的复制型溶瘤病毒给予至受试者，从而诱导癌症破坏和消除。

进一步地，在过继性细胞治疗剂给药1小时至约72小时后，进行复制型溶瘤牛痘病毒疫苗给药，其中复制型溶瘤病毒牛痘疫苗通过血管内，肿瘤内或肌肉内或腹膜内给药。

进一步地，其中所述受试者在接受T细胞免疫疗法之前不需要将自体淋巴细胞清除。

进一步地，其中所述受试者在接受T细胞免疫疗法之前不需要将IL-2给予至受试者。

有益效果：本发明通过继性细胞治疗剂和溶瘤病毒的联合免疫治疗的组合可以绕开预处理淋巴细胞清除或淋巴细胞消减，而且淋巴细胞清除/淋巴细胞消减会对疗法的整体效力有害。将用于产生抗原特异性中央型记忆T细胞的大的离体扩增的方法、和用于从针对表达抗原的肿瘤细胞的抗原特异性中央型记忆T细胞引起侵袭性的细胞反应的体内方法结合起来，构成了不需要使用细胞分选仪或耗竭受试者本身的内源性T细胞群的用于癌症的治疗的自适应细胞疗法。

附图说明

通过对以下列出的它们各自的附图的以下描述更深入地示出本发明的实施方案。

图1是不同给药时间下的CD8⁺T和CD62L⁺T细胞的增加表达图(A)；离体培养中不同给药时间下CD8⁺T细胞数量(B)。用IL15、IL21在离体培养的P14或24H9R CD8⁺T细胞的中央型记忆表型(CD44⁺和CD62L⁺)的获取。示出了在开始后的指定日CD44在来自P14小鼠(上图)或24H9R小鼠(下图)的CD8⁺T和CD62L⁺T细胞上的增加的表达(A)。示出了在离体培养的过程中观察到的增加的细胞数量(B)。

图2是P14 Tcm T联合疗法试验数据图，其中IL15，TL21不同给药的体外培养扩增倍数（A）、不同给药的CD62L平均荧光强度（B）、不同给药的CD44L平均荧光强度（C）、联合疗法的肿瘤体积-给药时间图（D-G）、不同给药的干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(H)和联合疗法的生存率图（I）。在离体培养期间需要IL15、IL21的组合使用，从而产生在联合疗法中具有最佳抗肿瘤效果的Tcm细胞。示出了在使用指定的IL15、IL21的组合离体培养7天之后的扩增倍数(fold expansion)(A)以及P14 CD8⁺T细胞的CD62L(B)和CD44(C)表达水平。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3。示出了用Vaccinia-gp33处理的小鼠在输注用指定的IL15、IL21的组合培养的P14细胞之后的肿瘤体积结果(D-G)。在感染后5天、12天和21天的应答表示为外周循环中的在用gp3333-41肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(H)。示出了图D-G中的将肿瘤大小维持在低于1000mm3(肿瘤终点截止值)的小鼠的百分比(I)。

图3是24H9R Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-hDCT联合疗法的试验数据图；其中联合疗法等不同给药的肿瘤体积-给药时间图（3A）；联合疗法等不同给药产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%-给药时间图（3B）。24H9R Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-hDCT联合疗法诱导强烈的抗原特异性T细胞应答和B16F10肿瘤的消退。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3(A)。在感染后5天、12天和21天的应答表示为外周循环中的在用DCT180-188肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(B)。

图4是DUC18 Tcm联合疗法等不用给药的试验数据图；其中DUC18 Tcm联合疗法等不用给药的肿瘤体积-给药时间图（4A）；DUC18 Tcm联合疗法等不同给药产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%（4B）；以及肿瘤体积-给药时间图（4C）。DUC18 Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-Erk9M联合疗法诱导强烈的抗原特异性T细胞应答和CMS5肿瘤的消退。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3(A)。在感染后5天、12天和21天的应答表示为外周循环中的在用Erk9M136-144肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(B)。之前使用Tcm+Vaccinia-Erk9M疗法治愈并且被CMS5细胞再次攻击的小鼠的肿瘤体积使用卡尺来测量并且在攻击后的各指定日表示为mm3(C)。

图5是P14 Tcm T联合疗法等不同给药的试验数据图；其中P14 Tcm T联合疗法等不同给药的肿瘤体积-给药时间图（5A）；P14 Tcm T联合疗法等不同给药后产生γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的百分比-给药时间图（5B）。P14 Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-gp33联合疗法诱导强烈的抗原特异性T细胞应答和B16-gp33肿瘤的消退。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3。示出了Vaccinia-gp33、Vaccinia-gp33和MRB-gp33注射的结果(A)。在感染后5天和12天的应答表示为外周循环中的在用gp3333-41肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(B)。

图6是不同给药途径的P14 Tcm T细胞免疫疗法+溶瘤病毒联合疗法的肿瘤体积-给药时间图。当通过IV、IT、IP和IM注射途径给予病毒时，P14 Tcm T细胞免疫疗法+溶瘤病毒的肿瘤消退疗效增强。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3。

图7是P14 Tcm T联合疗法产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞百分比-给药时间图；其中P14 Tcm T+VSV-gp33联合疗法产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞百分比-给药时间图（7A）；P14Tcm+Vaccinia-gp33联合疗法产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞百分比-给药时间图（7B）。当通过IV、IT、IP和IM注射给予时由P14 Tcm T细胞免疫疗法+溶瘤病毒诱导的抗原特异性CD8⁺T细胞应答的水平。示出在感染后5天和12天的应答，表示为外周循环中的在用gp3333-41肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%。

具体实施方式

图1：用IL15、IL21在离体培养的P14或24H9R CD8⁺T细胞的中央型记忆表型(CD44⁺和CD62L⁺)的获取。示出了在开始后的指定日CD44在来自P14小鼠(上图)或24H9R小鼠(下图)的CD8⁺T和CD62L⁺T细胞上的增加的表达(A)。示出了在离体培养的过程中观察到的增加的细胞数量(B)。

图2：在离体培养期间需要IL15、IL21的组合使用，从而产生在联合疗法中具有最佳抗肿瘤效果的Tcm细胞。示出了在使用指定的IL15、IL21的组合离体培养7天之后的扩增倍数(fold expansion)(A)以及P14 CD8⁺T细胞的CD62L(B)和CD44(C)表达水平。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3。示出了用Vaccinia-gp33处理的小鼠在输注用指定的IL15、IL21的组合培养的P14细胞之后的肿瘤体积结果(D-G)。在感染后5天、12天和21天的应答表示为外周循环中的在用gp3333-41肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(H)。示出了图D-G中的将肿瘤大小维持在低于1000mm3(肿瘤终点截止值)的小鼠的百分比(I)。

图3：24H9R Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-hDCT联合疗法诱导强烈的抗原特异性T细胞应答和B16F10肿瘤的消退。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3(A)。在感染后5天、12天和21天的应答表示为外周循环中的在用DCT180-188肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(B)。

图4：DUC18 Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-Erk9M联合疗法诱导强烈的抗原特异性T细胞应答和CMS5肿瘤的消退。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3(A)。在感染后5天、12天和21天的应答表示为外周循环中的在用Erk9M136-144肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(B)。之前使用Tcm+Vaccinia-Erk9M疗法治愈并且被CMS5细胞再次攻击的小鼠的肿瘤体积使用卡尺来测量并且在攻击后的各指定日表示为mm3(C)。

图5：P14 Tcm T细胞免疫疗法+Vaccinia-gp33联合疗法诱导强烈的抗原特异性T细胞应答和B16-gp33肿瘤的消退。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3。示出了Vaccinia-gp33、Vaccinia-gp33和MRB-gp33注射的结果(A)。在感染后5天和12天的应答表示为外周循环中的在用gp3333-41肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%(B)。

图6：当通过IV、IT、IP和IM注射途径给予病毒时，P14 Tcm T细胞免疫疗法+溶瘤病毒的肿瘤消退疗效增强。在0dpi表示溶瘤病毒注射的当天的情况下，在感染后的各指定日(dpi)，肿瘤体积使用卡尺来测量并且表示为mm3。

图7：当通过IV、IT、IP和IM注射给予时由P14 Tcm T细胞免疫疗法+溶瘤病毒诱导的抗原特异性CD8⁺T细胞应答的水平。示出在感染后5天和12天的应答，表示为外周循环中的在用gp3333-41肽刺激时产生干扰素γ(IFNγ)的CD8⁺T细胞的%。

具体实施方式本发明结合说明书附图和具体实施例对本发明的用于癌症联合免疫治疗的药物组合及其应用进行详细说明。除非另有说明，否则本部分和其他部分中描述的术语、材料、步骤和方法的定义和实施方案旨在应用于本文所述的本申请的所有实施方案和方面，如本领域技术人员将理解的那样。

本文中所述的方法对于在哺乳动物中治疗癌症是有用的。如本文中使用的术语“癌症”涵盖任何癌症，包括但不限于，黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(carcinoma)、脑癌(例如胶质瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、结肠癌(colon cancer)、结直肠癌(colorectal cancer)、膀胱癌、前列腺癌和白血病。在一些方面，癌症为实体瘤。在其它方面，癌症是转移性的。

如本文中使用的，术语“哺乳动物”是指人类以及非人类哺乳动物，并且术语“过继细胞转移”意在涵盖通过从外周血液或肿瘤组织样品提取的淋巴细胞的离体培养生产的细胞产物的输注。

在理解本申请的范围时，如本文所使用的术语“包含”及其衍生词旨在是开放式术语，其指定存在所述特征，元素，组分，组，整数和/或步骤，但不排除存在其他未说明的功能、元素、组分、组、整数和/或步骤。前述内容也适用于具有相似含义的词语，例如术语“包括”、“具有”及其衍生词。本文使用的术语“由......组成”及其衍生词旨在是封闭式术语，其指定存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤，但排除存在其他未说明的特征的存在、元素、组分、组、整数和/或步骤。如本文所用的，术语“基本上由......组成”旨在指定存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤以及不会实质上影响特征、元素、组分、组、整数和/或步骤的基本和新颖特征的那些。

应理解，“组合疗法”或“联合治疗”设想将根据本文所述的T细胞免疫疗法方法产生的肿瘤抗原特异性中枢记忆T细胞群和表达一种或多种相同肿瘤抗原的复制性溶瘤病毒顺序给予受试者。根据本文所述的T细胞免疫疗法方法产生的记忆T细胞群和表达相同肿瘤抗原的溶瘤病毒在允许治疗剂显示合作作用(例如协同作用)的时间间隔内给予。在优选的实施方案中，记忆T细胞群和溶瘤病毒在1至72小时内(例如在1、2、3、6、12、24、48或72小时内)或在4、5、6或7天内给予，或在彼此的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天内给予。

本文使用的诸如“基本上”、“约”和“近似”的程度术语意为修饰术语的合理偏差量，其使得结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包括偏离修饰的术语的至少±5%，如果该偏差不会否定其修饰的词的含义的话。

如在本申请中所使用的，单数形式“一个/种(a, an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非内容另有明确说明。例如，包括“一个T细胞”的实施方案应理解为呈现具有一种用某种物质或两种以上其他物质的某些方面。

在包含“另一”或“第二”组分(例如另一或第二细胞因子)的实施方案中，如本文所用的第二组分在化学上不同于其他组分或第一组分。“第三”组分与其他组分、第一组分和第二组分不同，并且进一步列举的或“另一”组分类似地不同。

本文所用的术语“和/或”是指所列出的项单独或组合地存在或使用。实际上，该术语意为使用或存在所列项目中的“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。

如图1-7所示，本发明提供了用于在哺乳动物(例如人类)中治疗癌症的联合免疫治疗的药物组合组合物及其应用。具体地，该联合免疫治疗方法包括：过继细胞转移和随后的溶瘤病毒的给予。在数个实施方案中，提供了用于在有需要的受试者中治疗癌症的联合疗法，所述联合疗法包括：(i)肿瘤抗原特异性中央型记忆T(Tcm)细胞向受试者的过继细胞转移，接着是(ii)使受试者接种表达由过继细胞转移(T细胞免疫疗法)T细胞靶向的相同的抗原的重组溶瘤痘苗病毒疫苗，从而诱导癌症破坏和消除。在优选的实施方案中，对T细胞免疫疗法 T细胞进行遗传修饰从而表达特异于肿瘤抗原的一种或多种重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原T细胞受体 (CAR)。在一些实施方案中，T细胞免疫疗法的T细胞源自需要治疗的受试者的自体T细胞。优选地，联合疗法不包括其中使受试者免疫耗竭的步骤。

在一个实施方案中，提供了用于产生肿瘤抗原特异性中央型记忆CD8+T细胞的方法，所述方法包括：离体细胞培养的步骤，所述步骤包括在存在肿瘤抗原、例如树突细胞等抗原呈递细胞、IL21、IL15的情况下并且优选在不存在IL2的情况下从PBMC或TIL培养淋巴细胞。优选地，在培养之前从PBMC除去CD25⁺细胞(调节T细胞以及活化的T细胞和B细胞)。肿瘤抗原可以例如为肿瘤相关抗原(TAA)，其为在哺乳动物中引起免疫应答的在肿瘤细胞中产生的物质。在一些实施方案中，肿瘤抗原为自体抗原。在其它实施方案中，肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原，其对于肿瘤是独特的并且在正常细胞中不表达或者在正常细胞中以非常低的量表达(例如新抗原)。

在相关的实施方案中，肿瘤抗原为与正常细胞相比在癌症细胞中具有更高的表达的组织特异性肿瘤抗原，其非限制性实例包括酪氨酸酶、MART-1、gp100、TRP-1/gp75和TRP-2蛋白。在其它实施方案中，肿瘤抗原为肿瘤特异性的且共同的抗原，其在癌症和睾丸中表达但是在其它正常组织中不表达或者以非常小的量表达(癌-睾丸抗原或CT抗原)，其非限制性实例包括BAGE、CAMEL、MAGE-A1和NY-ESO-1。在其它实施方案中，肿瘤抗原为肿瘤特异性的且独特的抗原(新抗原)，其仅在肿瘤细胞中表达，其非限制性实例包括CDK4、连环蛋白、半胱氨酸蛋白酶-8、MUM-1、MUM-2、MUM-3、MART-2、OS-9、p14ARF、GAS7、GAPDH、SIRT2、GPNMB、SNRP116、RBAF600、SNRPD1、PRDX5、CLPP、PPP1R3B、EF2、T细胞免疫疗法N4、ME1、NF-YC、HLA-A2、HSP70-2和KIAA1440。在其它实施方案中，肿瘤抗原为与正常细胞相比在癌症细胞中过表达的过表达肿瘤抗原。肿瘤相关抗原的实例包括：癌胚抗原(oncofetalantigen)，如甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)；表面糖蛋白，如CA 125；癌基因，如Her2；黑素瘤相关抗原，如多巴色素互变异构酶(DCT)、GP100和MART1；癌-睾丸抗原，如MAGE蛋白和NY-ESO1；病毒癌基因，如HPV E6和E7；通常限于胚胎或胚外组织的在肿瘤中异位表达的蛋白，如PLAC1。如本领域技术人员将理解的，可以使用本方法基于要治疗的癌症的种类来选择抗原，这是因为一种或多种抗原可能特别适用于某些癌症的治疗。例如，对于黑素瘤的治疗，可以使用例如DCT等黑素瘤相关抗原。

在一些优选的实施方案中，为了产生肿瘤抗原(例如TAA)特异性CD8⁺T细胞，本方法包括如下步骤，在所述步骤中，对离体培养的细胞(例如，从受试者获得的自体PBMC或具有与受试者组织相容的表型的PBMC进行遗传修饰从而表达一种或多种重组TCR或CAR以赋予肿瘤抗原特异性。在存在肿瘤抗原、例如树突细胞等抗原呈递细胞、IL21、IL15的情况下，离体培养转导的细胞。CAR为由具有抗原识别部分的抗体衍生的细胞外单链可变片段(scFv)和细胞内T细胞激活结构域形成的融合蛋白。重组TCR包含α链和β链并且例如可以识别HLA-A2/肽复合物。可以用携带支持所选择的TCR/CAR的表达的转基因盒的例如慢病毒或逆转录病毒载体等载体转导细胞。将转基因导入至载体中的方法对于本领域技术人员是公知的。通常，对载体进行修饰从而表达TCR/CAR。在这一点上，使用已经确立的重组技术将编码所选择的TCR/CAR的核酸序列并入至所选择的载体中。在一些实施方案中，TCR或CAR对于MART-1、gp100、NY-ESO-1、或MAGE家族的成员(例如MAGE-A3)是特异性的。有利地，通过本文中所述的方法产生的肿瘤抗原(例如TAA)特异性CD8⁺T细胞在扩增(例如使用抗CD3抗体和抗CD28抗体以及任选IL2的快速扩增)之前不需要使用四聚体标记和临床级分选仪的进一步富集。因此，在优选的实施方案中，提供了用于过继细胞转移的方法，所述方法包括：(i)在存在加载有肿瘤抗原的抗原呈递细胞(APC，例如自体树突细胞)、IL21、IL15的情况下并且优选在不存在IL2的情况下培养从患有癌症的受试者获得的PBMC或TIL，从而产生富含肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞的细胞群，(ii) 使用抗CD3抗体和抗CD28抗体以及任选IL2扩增肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞，和(iii)将细胞重新导入至受试者，其中所述方法不包括在步骤(i)与(ii)之间进行富集T细胞如分选四聚体+细胞的步骤。

在优选的实施方案中，将来自PBMC或TIL的淋巴细胞在存在肿瘤抗原、例如树突细胞等抗原呈递细胞、IL21、IL15的情况下和优选在不存在IL2的情况下离体培养约1周至约4周，例如约1周、约2周、约3周、约4周、或其间的任意范围，接着可以在存在IL21、IL15的情况下、在不存在肿瘤抗原和抗原呈递细胞的情况下离体培养约1周至约2周、约1周、或约2周。在特别优选的实施方案中，将来自PBMC的淋巴细胞在存在加载有肿瘤抗原肽的树突细胞、IL21、IL15的情况下离体培养约2周，并且在存在IL21、IL15的情况下和在不存在加载有肿瘤抗原肽的树突细胞的情况下离体培养约1周。有利地，可以将根据本文中所述的方法产生的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞导入至哺乳动物中而不需要淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)并且不需要将IL-2给予至受试者。因此，在一些实施方案中，提供了用于过继细胞转移的方法，所述方法包括：(i)在存在肿瘤抗原、例如树突细胞等抗原呈递细胞、IL21、IL15的情况下离体培养来自PBMC或TIL的淋巴细胞，和(ii)将所得肿瘤抗原(例如TAA)特异性CD8⁺T细胞给予至哺乳动物而不通过化学治疗或放射学手段破坏哺乳动物中的现有的淋巴细胞(淋巴细胞耗竭或淋巴细胞消融(lymphoablation))并且不将IL-2给予至受试者。

根据本文中所述的联合疗法，在肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞的过继转移之后将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至受试者。肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞的过继转移可以通过任意合适的方法来完成。

在一些实施方案中，联合疗法包括：(i)在存在加载有肿瘤抗原肽的抗原呈递细胞(APC)和IL21的情况下离体培养来自患有肿瘤的受试者的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、扩增培养物中的细胞、并且将它们重新导入至受试者中，和(ii)将表达相同的肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至受试者。

在其它实施方案中，联合疗法包括：(i)在存在加载有肿瘤抗原肽的APC、IL21、IL15的情况下离体培养来自患有肿瘤的受试者的TIL、扩增培养物中的细胞、并且将它们重新导入至受试者中，和(ii)将表达相同的肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至受试者。

在其它实施方案中，联合疗法包括：(i)在存在加载有肿瘤抗原肽的APC和IL21的情况下离体培养来自受试者的PBMC、扩增培养物中的细胞、并且将它们重新导入至受试者中，和(ii)将表达相同的肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至受试者。

在其它实施方案中，联合疗法包括：(i)在存在加载有肿瘤抗原肽的APC、IL21、IL15的情况下离体培养来自受试者的PBMC、扩增培养物中的细胞、并且将它们重新导入至受试者中，和(ii)将表达相同的肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至受试者。

在相关的实施方案中，在离体培养之前，用特异于肿瘤抗原的重组TCR或CAR转导PBMC。

在一些实施方案中，在转移肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞之后约8至72小时，将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至哺乳动物。在优选的实施方案中，在转移肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞之后约12至48小时、约20至28小时、或约24小时，将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒给予至受试者。

可以根据本文中所述的联合疗法给予表达肿瘤抗原的任意具有复制能力的溶瘤病毒。在一些实施方案中，复制型溶瘤病毒为例如水疱性口炎病毒（VSV）或马拉巴病毒(Maraba，MRB)等弹状病毒或溶瘤痘苗病毒，其优选包含一种或多种遗传修饰从而增加病毒对癌症细胞的选择性。

可以通过多个途径中的一种或多种来给予复制型溶瘤痘苗病毒疫苗。在一些实施方案中，复制型溶瘤病毒为痘病毒并且通过静脉内途径给予至哺乳动物。在其它实施方案中，复制型溶瘤病毒为减毒溶瘤痘苗病毒并且通过静脉内(IV)、肌内(IM)、腹腔内(IP)或瘤内(IT)给予至哺乳动物。如本领域技术人员将理解的，复制型溶瘤病毒(例如溶瘤痘苗病毒)将以例如盐水或其它药学上合适的缓冲液等作为介质给药。

T细胞：在一些实施方案中，本文所述的组合疗法利用根据本文所述方法产生的肿瘤抗原特异性中枢记忆T细胞的过继转移。因此，令人惊讶地发现，在存在APC，肿瘤抗原和包含IL21、IL15组成的组合物的情况下培养T细胞(例如未分化T细胞)导致肿瘤抗原特异性T细胞群，其与单独的IL21、IL15或纳巴霉素相比，基本上富含显示中央型记忆表型的T细胞，所述T细胞可以离体扩增并引入患者，然后给予患者表达相同抗原的溶瘤病毒以协同治疗癌症，而不需要昂贵的细胞分选技术，也不需要在引入T细胞之前对患者施用淋巴细胞清除(lymphodepletion)方案，并且不需要给予患者IL2。在一些实施方案中，IL21和IL15以约1ng/ml至约20ng/ml、优选约10ng/ml的浓度存在。例如，APC可以是自体树突细胞，其可以通过用GM-CSF(例如约800U/ml)和IL-4(例如约500U/ml)培养粘附的PBMC约5天从而将它们分化为树突状细胞来获得。可以通过在第5天添加TNFα(例如约10ng/ml)、IL-1β(例如约2ng/ml)、IL-6(例如约1000U/ml)、PGE-2(例如约1000ng/ml) 、IL-4(例如约500U/ml)和GM-CSF(例如约800U/ml)来刺激所得的树突细胞，并接着培养2天。在第7天，可以将树突细胞用40μg/ml的肽肿瘤抗原刺激2小时，并根据本文所述的方法来用刺激装载肿瘤抗原肽的APC。

在一些实施方案中，在存在APC、肿瘤抗原和IL21、IL15和纳巴霉素的情况下培养幼稚T细胞导致肿瘤抗原特异性T细胞群，其中的至少50%、至少60%、至少70% 、至少80%或更多显示中央型记忆表型。在一个实施方案中，根据本文描述的T细胞免疫疗法方法获得的中枢记忆T细胞显示CD44⁺ CD62L⁺ CD127⁺表型。

根据本文所述的T细胞免疫疗法方法使用的T细胞可以从血液、淋巴组织(例如脾)或肿瘤(例如肿瘤浸润淋巴细胞)获得。在一些实施方案中，根据本文所述的T细胞免疫疗法方法使用的T细胞由PBMC产生，所述PBMC具有与待治疗的癌症的受试者组织相容的表型。在相关的实施方案中，PBMC对于患有待治疗的癌症的受试者是自体的。

在一个优选的实施方案中，用于根据本发明的过继细胞转移的CD8⁺人T细胞群通过如下获得：在IL21、IL15和纳巴霉素(一种由癌症和抗原呈递细胞表达的肿瘤抗原)存在下培养从人癌症受试者获得的PBMC(例如1至4周，优选约3周)，用抗CD3和抗CD28抗体以及任选的IL2扩增CD8⁺人T细胞群，并将细胞重新引入患者体内，然后(例如，间隔24小时后)给予工程化以表达编码相同肿瘤抗原的转基因的复制性溶瘤病毒。

在相关实施方案中，用于根据本发明的过继细胞转移的CD8⁺人T细胞群通过如下获得：将对人受试者中癌症表达的肿瘤抗原特异性的重组TCR或CAR转导至从受试者获得的PBMC中，在IL21、IL15以及纳巴霉素、抗原呈递细胞和肿瘤抗原的存在下培养遗传修饰的细胞(例如约1至4周，优选约3周)，用抗CD3和抗CD28抗体以及任选的IL2扩增CD8⁺人T细胞群，并将细胞重新引入患者体内，然后(例如，间隔24小时后)给予工程化以表达编码相同肿瘤抗原的转基因的复制性溶瘤病毒(例如溶瘤痘苗病毒)。

在另一实施方案中，用于根据本发明的过继细胞转移的CD8⁺人T细胞群通过如下获得：在IL21、IL15存在下培养从人类癌症受试者获得的肿瘤浸润淋巴细胞(例如1至4周，优选约3周)，用抗CD3和抗CD28抗体以及任选的IL2扩增CD8⁺人T细胞群，并将细胞重新引入患者体内，随后(例如，间隔24小时后)给予工程化以表达编码相同肿瘤抗原的转基因的复制性溶瘤病毒(例如溶瘤痘苗病毒)。

溶瘤病毒：根据本发明的表达肿瘤抗原的具有复制能力的(replication-competent)溶瘤病毒包括任何天然存在的(例如来自“野生来源(field source)”)或修饰的具有复制能力的溶瘤病毒。除了表达肿瘤抗原之外，可以例如修饰溶瘤病毒从而增加病毒对癌细胞的选择性。

根据本发明的具有复制能力的溶瘤病毒包括但不限于，是以下科的成员的溶瘤病毒：肌尾噬菌体科(my溶瘤病毒iridae)、长尾噬菌体科(siph溶瘤病毒iridae)、短尾噬菌体科(podpviridae)、复层噬菌体科(teciviridae)、覆盖噬菌体科(cortic溶瘤病毒iridae)、芽生噬菌体科(plasmaviridae)、脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)、微小纺锤形噬菌体科(fusell溶瘤病毒iridae)、痘病毒科(poxyiridae)、虹彩病毒科(irid溶瘤病毒iridae)、藻类DNA病毒科(phycodnaviridae)、杆状病毒科(bacul溶瘤病毒iridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、腺病毒科(adn溶瘤病毒iridae)、乳多空病毒科(pap溶瘤病毒aviridae)、多分体DNA病毒科(polydnaviridae)、丝状噬菌体科(in溶瘤病毒iridae)、微小噬菌体科(micr溶瘤病毒iridae)、双生病毒科(geminiviridae)、圆环病毒科(circ溶瘤病毒iridae)、细小病毒科(parv溶瘤病毒iridae)、嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)、逆转录病毒科(retr溶瘤病毒iridae)、囊状噬菌体科(cyct溶瘤病毒iridae)、呼肠孤病毒科(re溶瘤病毒iridae)、双RNA病毒科(birnaviridae)、副粘液病毒科(paramyx溶瘤病毒iridae)、弹状病毒科(rhabd溶瘤病毒iridae)、丝状病毒科(fil溶瘤病毒iridae)、正粘液病毒科(orthomyx溶瘤病毒iridae)、布尼安病毒科(bunyaviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、光滑噬菌体科(leviviridae)、小RNA病毒科(picornaviridae)、伴生病毒科(sequiviridae)、豇豆花叶病毒科(com溶瘤病毒iridae)、马铃薯Y病毒科(potyviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、星状病毒科(astr溶瘤病毒iridae)、野田病毒科(nodaviridae)、四病毒科(tetraviridae)、番茄丛矮病毒科(tombusviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(glaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)和杆状RNA病毒科(barnaviridae)。

用于本发明实践的具有复制能力的溶瘤病毒的具体实例包括腺病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、新城疫病毒(NDV)、多瘤病毒、溶瘤痘苗病毒(Vaccinia)、单纯疱疹病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)和细小病毒。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的表达肿瘤抗原的具有复制能力的溶瘤病毒是溶瘤痘苗病毒。

本发明的表达肿瘤抗原的复制性溶瘤弹状病毒可以在根据本文所述的方法的T细胞免疫疗法治疗后以10、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或更多病毒颗粒(vp)或噬斑形成单位(pfu)中的一种或多种剂量全身地给予受试者，优选通过血管内(静脉内和/或动脉内)给药，所述给药包括注射和灌注等。在优选的实施方案中，在根据本文所述的方法的T细胞免疫疗法治疗后将表达肿瘤抗原的溶瘤弹状病毒血管内以105-1014pfu、106-1012pfu、108-1014pfu或108-1012pfu中的一种或多种剂量给予受试者。

在一些优选的实施方案中，本发明的表达肿瘤抗原的具有复制能力的溶瘤病毒是溶瘤痘苗病毒。

在优选的实施方案中，本发明的表达肿瘤抗原的复制性溶瘤痘苗病毒是Copenhagen、Western Reserve、Lister或Wyeth株。Western Reserve牛痘株的基因组已完成测序(序列号AY243312)。

表达肿瘤抗原的复制性溶瘤痘苗病毒可以工程化以缺乏一种或多种功能基因，从而增加病毒的癌症选择性。在一些优选的实施方案中，溶瘤痘苗病毒工程化以缺乏胸苷激酶(TK)活性。在另一方面，溶瘤痘苗病毒可工程化以缺乏溶瘤痘苗病毒生长因子 (VGF)。在另一方面，溶瘤痘苗病毒可工程化以缺乏VFG和TK活性。在其他方面，溶瘤痘苗病毒可工程化以缺乏涉及逃避宿主干扰素(IFN)反应的一种或多种基因例如E3L、K3L、B18R、或B8R。在一些优选的实施方案中，复制性溶瘤痘苗病毒为Western Reserve、Copenhagen、Lister或Wyeth株并且缺乏功能TK基因。在其他实施方案中，溶瘤痘苗病毒为Western Reserve、Copenhagen、Lister或Wyeth株，其缺乏功能B18R和/或B8R基因。

本发明的表达肿瘤抗原的复制性溶瘤痘苗病毒可局部或全身地给予受试者，例如通过瘤内、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、颅内、皮下或鼻内给药，在根据本文所述的方法的T细胞免疫疗法治疗后，以一个或多个剂量的1 x 105噬斑形成单位(pfu)、 5 x105pfu、至少 1 x 106pfu、5 x 106或约5 x 106pfu、1 x 107、至少 1 x 107pfu、1 x 108或约1 x 108pfu、至少 1 x 108pfu、约或至少 5 x 108pfu、1 x 109或至少 1 x 109pfu、5x 109或至少 5 x 109pfu、1 x 1010pfu或至少 1 x 1010pfu、5 x 1010或至少 5 x1010pfu、1 x 1011或至少 1 x1011、1 x 1012或至少 1 x 1012、1 x 1013或至少1 x1013pfu。例如，病毒可以以约107-1013pfu之间、约108-1013pfu、约109-1012pfu之间、约108-1012之间、或约109和1010的剂量给予。

预期表达肿瘤抗原的溶瘤病毒的单剂量是指在0.1、0.5、1、2、5、10、15、20或24小时期间给予受试者或肿瘤的量，包括期间所有的值。剂量可以随时间推移或通过单次注射来扩散。通常，将多剂量给予相同的一般靶区域，例如在肿瘤附近、或者在静脉内给药的情况下受试者的血流或淋巴系统中的特定进入点。在某些方面，病毒剂量通过注射装置递送，所述注射装置包括在单个针中提供多个端口的针或连接到注射器的多个分叉，或其组合。可以给予单剂量的溶瘤病毒，或者可以在包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12以上周的治疗期内给予多剂量。例如，溶瘤病毒可以每隔一天、每周、每隔一周、每隔三周施用一次，持续1、2、3、4、5、6以上个月。

如本领域技术人员所理解的，表达肿瘤抗原的溶瘤病毒通常作为药物组合物的一部分与药学上可接受的载体(例如盐水或其他合适的缓冲液)一起给予。如本文所用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、运载体(vehicle)、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗液和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、和胶体等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入组合物中。

肿瘤抗原：本发明的溶瘤病毒表达由本文所述的T细胞免疫疗法方法产生的T细胞靶向的相同抗原。可由溶瘤病毒表达的合适抗原包括但不限于癌胚抗原，例如甲胎蛋白(ALF)和癌胚抗原(CEA)，表面糖蛋白(例如CA 125)，癌基因例如Her2，黑素瘤相关抗原例如多巴色素互变异构酶(DCT)，GP100和MART-1，癌-睾丸抗原例如MAGE蛋白和NY-ESO-1，病毒癌基因如HPV E6和E7，以及在通常限于胚胎或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质例如PLAC1或肿瘤相关抗原的变体。肿瘤相关抗原的“变体”是指如下蛋白质：(a)包括来自肿瘤相关抗原蛋白的至少一种肿瘤相关抗原表位，和(b)与肿瘤相关的抗原蛋白至少70%、优选至少80%、更优选至少90%或至少95%相同。Van der Bruggen P, Stroobant V, VigneronN, Van den Eynde B在"Database of T cell-defined human tumor antigens: the2013 update." Cancer Immun 2013 13:15中提供了总结公认的抗原表位的数据库，其可在www.cancerimmunity.org/peptide在线获取。

在一些实施方案中，溶瘤病毒表达MAGEA3、人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白、前列腺蛋白的人六跨膜上皮抗原、或癌睾丸抗原。

在其他实施方案中，本发明提供识别肿瘤抗原的方法，其包括在包含IL21、IL15和纳巴霉素或基本上由IL21、IL15组成的组合物存在下，用从受试者分离的肿瘤材料共培养PBMC和抗原呈递细胞(如树突状细胞)；从培养物中分离T细胞群；克隆来自T细胞群的单个T细胞；和表征T细胞克隆的抗原特异性。在一些实施方案中，肿瘤材料包含总RNA、裂解的肿瘤细胞或凋亡小体。本文所述的T细胞免疫疗法方法可用于产生对通过该方法识别的抗原特异的中枢记忆T细胞群，并与经过工程改造以表达相同抗原的溶瘤病毒组合以提供协同癌症治疗。

癌症：根据本文所述的组合来治疗的癌症包括但不限于，白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成髓细胞早幼粒细胞白血病、髓单核细胞单核细胞红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病(heavy chain disease)、实体瘤、肉瘤、以及癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维耳姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内赘生物、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌和非鳞状非小细胞肺癌)) 、黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌；呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌。在一些优选的实施方案中、待治疗的癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、转移性结肠直肠癌、激素敏感或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。

在一个方面中，用所述组合治疗的受试者是患有癌症的人，所述癌症对于用一种或多种化学治疗剂的治疗是难以治疗的和/或对于用一种或多种抗体的治疗是难以治疗的。

以下实施例说明了本发明的范围。该实施例的具体要素仅用于描述目的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员可以在本发明范围内开发出等同的方法和使用的类似材料。

细胞系：将所有细胞维持在37 °C、含5% CO2的潮湿环境中。将B16F10和B16gp33细胞(其是工程化为表达对应于LCMV gp33表位的微基因的B16F10细胞)维持在含有10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、5ml丙酮酸钠、5ml非必需氨基酸、5ml维生素溶液、55μM 2-巯基乙醇、100U/mL青霉素和100ng/mL链霉素的MEM/F11中。用800µg/ml G418维持gp33 微基因的表达。所有细胞培养试剂都来自Invitrogen (Invitrogen, Grand Island, NY)。CMS5细胞维持在含有10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100ng/mL链霉素的DMEM中。

实验动物：C57BL/6和BALB/c小鼠购自北京维通利华，并饲养在特定的无病原体的设备中。DUC18小鼠，工程化为表达对于同基因CMS5纤维肉瘤排斥抗原突变的Erk9M具特异性的T细胞受体的转基因小鼠(136–144)，由Lyse Norian (University of Iowa, Iowa)惠赠。24H9R小鼠，荷有识别DCT/TRP-2180–188的H-2Kb–限制性表位的TCR转基因的转基因小鼠品系。P14小鼠，携带有gp33肽的TCR的转基因小鼠品系(B6.Cg-Tcratm1Mom Tg(TcrLCMV)327Sdz)。

肿瘤动物模型：6至8周龄的BALB/c、C57BL/6或RIPgp小鼠用2×105 B16-gp33或B16F10细胞或106 CMS5细胞皮内攻击。在肿瘤移植后5至7天(当肿瘤达到~5mm直径时)给予T细胞免疫疗法和随后的溶瘤病毒接种。每日监测肿瘤生长并每隔一天用卡尺测量。肿瘤体积以宽×长×深计算。肿瘤重点定义为在至少二维上>10mm或在一维上 >20mm。如有需要，使用Contour下一代血糖仪(Ascensia Diabetes)监测血糖水平。显示>14mmol/L血糖的动物视为患糖尿病的。

病毒：Vacccinia-gp33载体是重组溶瘤痘苗病毒和VSV-gp33是重组水泡性口炎病毒，其表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的显性CD8⁺和CD4⁺ T-细胞表位(分别为LCMV-gp33-41和LCMV-gp61-80)。MRB-GP为假型重组马拉巴病毒，其初始糖蛋白被LCMV的糖蛋白遗传替换。Vaccinia-hDCT和MRB-hDCT分别为重组水泡性口炎病毒和马拉巴病毒，其表达全长人多巴色素互变异构酶(DCT)。Vaccinia-hDCT为重组的、胸苷激酶和牛痘生长因子双删除的溶瘤痘苗病毒，其工程化为表达hDCT。Ad-hDCT为复制缺陷型腺病毒(E1/E3删除)，其基于编码全长人黑色素瘤抗原DCT的人血清型5。Vaccinia-Erk9M和MRB-Erk9M分别为重组水泡性口炎病毒和马拉巴病毒，其表达针对在CMS5细胞系中表达的ERK的突变体的显性CD8⁺T细胞表位。修饰VSV-gp33和VSV-hDCT，如前所述地通过删除基质蛋白M的51位的甲硫氨酸残基来消除它们抑制I型IFN反应的能力。MRB-hDCT和MRB-Erk9M也被修饰，如前所述地通过基质中的残基和糖蛋白中的残基的突变来消除它们抑制I型IFN反应的能力。

抗原肽：LCMV-GP的H-2Db-限制肽(gp33-41; KAVYNFATM (SEQ ID NO. 1))、DCT的H-2Kb-限制肽(DCT180–188 SVYDFFVWL (SEQ ID NO. 2))、和突变体ERK的H-2Kd-限制肽(Erk9M136–144; QYIHSANVL (SEQ ID NO. 3))购自Biomer Technology (Pleasanton,California)。将各肽溶解在蒸馏水中并保存在−20 °C。

离体Tcm培养和T细胞免疫疗法的给药方案：通过常规方法从TCR转基因小鼠中分离脾细胞。将脾细胞(含有大量 APC) 以3百万/mL的密度接种在RPMI培养基中，所述RPMI培养基补充有10% 胎牛血清 (FBS)、2mM L-谷氨酰胺、55μM 2- 巯基乙醇、100U/mL 青霉素、100ng/mL 链霉素、10ng/mL IL21、10ng/mL IL15、20ng/mL雷帕霉素和0.1µg/mL同源抗原肽。初始接种后四天，使用初始培养基和无肽的补充剂将培养物扩大5倍体积。3天后收集细胞，洗涤并悬浮于PBS中用于注射。小鼠用200µL PBS中的106 Tcm细胞静脉注射(IV)，24小时后，用200µL的PBS (除非另有说明)中的2×108 pfu的VSV-gp33、Vaccinia-DCT和MRB-DCT、1×108 pfu的Vaccinia-gp33和Vaccinia-DCT、5×108 pfu的VSV-erk9m和MRB-erk9m静脉注射。进行淋巴细胞清除处理，其表示在Tcm细胞输注前3天经由IP注射20mg/kg环磷酰胺(CPX)。

表面标志物的流式染色：收集离体培养的细胞、沉淀并用Fc阻断处理。然后针对CD8、CD44、CD62L和CD127的表面表达来染色细胞。数据使用含有FACSDiva软件的LSRFortessa (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada)获取并用FlowJo软件(TreeStar, Ashland, OR)分析。

抗原特异性T细胞反应的检测：从眶周窦血样获得外周血单核细胞。用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。37 °C下用gp33肽(1μg/mL)刺激单核细胞5小时并在温育后4小时内添加布雷菲德菌素A (Golgi Plug，1μg/mL；BD Biosciences) 。细胞用Fc阻断处理并针对CD8的表面表达进行染色。随后将细胞固定、透性化 (Cytofix/Cytoperm, BD Biosciences)并针染色细胞内干扰素-γ。数据使用含有FACSDiva软件的LSRFortessa (BD Biosciences)获取并用FlowJo软件(Tree Star, Ashland, OR)分析。

实施例1：中央型记忆表型TAA特异性CD8⁺T细胞的离体培养诱导试验。

基于离体的T细胞培养通常利用通过共享的γ链传递信号的细胞因子(IL2Rγ或CD132)。共享的γ链家族细胞因子包括，但不限于IL2、IL15和IL21 -。CD132主要在淋巴细胞上表达并通过该受体的信号传导来驱动CD8+T细胞和其它淋巴细胞亚型的增殖和成熟。已知IL2诱导CD8⁺T细胞的快速增殖和效应分化，而IL15和IL21已知驱动较缓的稳态增殖并使CD8⁺T细胞偏向中央型记忆分化状态。因此，我们在我们的离体培养体系中利用了IL15和IL21补充剂。另外，在方案中还采用了雷帕霉素，一种常用的mTOR抑制剂。已显示在病毒疫苗体系中mTOR通路的调节支持T细胞的存活并诱导记忆T细胞分化。用雷帕霉素的短期体外处理可增加记忆T细胞分化并增强疫苗诱导的T细胞的抗肿瘤效力。因此，我们的T细胞培养方案中IL15、IL21的组合允许T细胞的扩增以及中央型记忆表型和功能性的获得。

为了建立Tcm培养物，从P14或24H9R小鼠提取脾细胞并在0.1µg/mL的gp33 或DCT肽、20ng/mL的雷帕霉素和各自10ng/mL的IL15和IL21的存在下培养7天。在开始后3天，用补充有雷帕霉素和各自10ng/mL的IL15和IL21但没有肽的标准T细胞培养基(含L-谷氨酰胺、抗生素和β巯基乙醇的RPMI培养基)将培养体积扩大五倍。培养之前，P14 CD8 T细胞(图1A，第0天)为CD44阴性的但对于 CD62L是阳性的，这是典型的初始T细胞表型。离体培养7天后收集时(图1A，第7天)，细胞仍展现高水平表达CD44和CD62L二者的中央型记忆表型。除了获得Tcm表型以外，培养的细胞显示强有力的增殖，其中基于由细胞计数计算的总细胞产率，P14和24H9R系培养物均在7天中扩增约20倍(图1B)。与IL-15组合的肿瘤抗原刺激驱动T细胞的增殖；IL-21在诱导中央型记忆分化并控制T细胞的增殖以使它们不变为效应T细胞。

实施例2：IL21、IL15的特定组合对于在联合疗法中具有最佳抗肿瘤作用的抗原特异性中央型记忆CD8⁺T细胞的指导分化是必须的。

IL15和IL21的特定组合对于本文所述的在联合疗法中具有最佳抗肿瘤作用的抗原特异性中央型记忆CD8⁺T细胞的离体培养、扩增和分化是必须的。每个和所有这些组分对于产生这样的Tcm细胞都是必须的，且在没有这些组分中的一个或多个的情况下所产生的细胞在体内输注和溶瘤病毒接种后具有次佳的T细胞扩增和/或降低抗肿瘤作用。

IL15在驱动CD8⁺T细胞扩增和中央型记忆分化的培养方案中是必须的。与完全组合中生长的细胞(图2A中的IL15/IL21/Rapa)相比，在没有IL15的情况下培养的细胞显示离体培养物的扩增受损和细胞产率减少(图2A中的L21/Rapa)。另外，如此培养的细胞展现了改变的偏向初始的表型(图2C中降低的CD44水平)，而不是中央型记忆表型- 如图2B和2C中的在完全组合中生长的细胞所例示的。在输注和VSV-gp33刺激时，在没有IL15的情况下生长的细胞产生大小略微减少的抗原特异性CD8⁺T细胞反应(图2H)并且不能完全消退肿瘤或延长存活(图2E和I)。

IL21在将培养的细胞编程为具有最佳抗原特异性细胞溶解功能的良好品质的中央型记忆表型中起到不可或缺的作用。在没有IL21的情况下培养的细胞(IL15/Rapa)具有CD62L (图2B)和CD44 (图2C)的正常表达水平，具有与完全组合培养的细胞可比的离体增殖。在用VSV-gp33输注和刺激后，在没有IL21的情况下生长的细胞产生了具有大小与完全组合培养的细胞可比的体内反应。尽管如此，与完全组合生长的细胞相比，利用在没有IL21的情况下生长的细胞处理的小鼠的肿瘤消退(图2F)和存活(图2I)较差。

雷帕霉素发挥对抗原特异性CD8+T细胞的增殖的抑制功能，这并不干扰Tcm表型的获得。相反，雷帕霉素在本文所述的培养法中的作用是在溶瘤病毒刺激后增强细胞溶解功能和抗肿瘤作用。与完全组合中生长的细胞相比，在没有雷帕霉素的情况下所产生的细胞显示相当的离体增殖(图2A中的IL15/Il21组)但显示改变的中央型记忆T细胞标记蛋白CD62L和CD44的表达(分别为图2A和B)。这些细胞中的减少的CD62L表达表明它们还未获得真正的中央型记忆分化状态。的确，在没有雷帕霉素的情况下生长的细胞显示在溶瘤病毒刺激后五天同样能够有效增强的体内增殖(图2H)，抗原特异性CD8 T细胞的水平降到与完全组合中生长的细胞可比的水平。总之，这些结果表明在没有雷帕霉素的存在下生长的细胞采用效应型记忆表型且在VSV-gp33刺激后更容易受到体内传递的死亡信号的影响。最后，这些细胞的抗肿瘤效力受损，显示缺少完全肿瘤消退(图2G)，导致减少的存活(图2I)。

实施例3：离体培养的记忆T细胞的转移需要溶瘤痘苗病毒溶瘤痘苗病毒疫苗加强以获得抗肿瘤活性 试验。

中央型记忆CD8 T细胞存在于淋巴结中并保持无活性直至通过其同源肽呈递而被刺激。在抗原特异性刺激时，Tcm细胞迅速分裂并分化成效应细胞，从而产生强有力的全身细胞溶解反应。通过过继转移至表达由转移细胞靶向的抗原的荷瘤小鼠，接着用表达相同抗原的溶瘤病毒活化，来试验Tcm细胞产生的离体培养物的抗原特异性细胞溶解功能。我们试验了三种TCR转基因小鼠品系 (24H9R、DUC18和P14小鼠)，它们靶向在常用的肿瘤细胞系模型上表达的、代表真正的自身抗原、新抗原和病毒抗原(分别是B16F10细胞中的DCT、DUC18中的Erk9M、和B16-gp33细胞)的抗原。培养的Tcm细胞过继转移至表达T细胞的抗原性靶标的荷瘤小鼠。Tcm细胞单独的转移无法诱导显著的全身抗原特异性反应且并不显示任何抗肿瘤效果 (图3、4和5中的Tcm组)。这是Tcm细胞的预料之内的特性，这是因为它们被隔离至淋巴器官，在此它们遇到最低水平的肽。由于抗原呈递是T细胞活化和效应反应发展的先决条件，我们组合了我们的Tcm细胞免疫疗法和表达同源肽的溶瘤病毒载体。我们选择使用水泡性口炎病毒、马拉巴病毒和溶瘤痘苗病毒，这是因为它们为溶瘤病毒且过去已用作疫苗载体。这些病毒具有强效的溶瘤活性，意味着它们优先感染和溶解癌细胞，这样它们可以协同地增强CD8介导的肿瘤破坏。将转基因盒包含在与转移的T细胞的肽特异性相关的这些病毒载体中，产生溶瘤病毒疫苗并允许肽向淋巴结的递送以及之前给予的T细胞免疫疗法细胞的活化。当与VSV、MRB (图3A、4A和5A)和Vaccinia接种(图3A和5A)组合时， T细胞免疫疗法诱导快速且完全的肿瘤消退。由联合疗法诱导的CD8+T细胞反应在 VSV和马拉巴感染后5天(图3B、4B和5B)和Vaccinia感染12天(图3B和5B)时明显具有约10至30%的IFNγ+CD8 T细胞的平均峰值反应。需要溶瘤病毒疫苗和T细胞免疫疗法的组合，这是因为单独的VSV-gp33和Vaccinia-gp33接种不能诱导gp33模型中的完全肿瘤消退(图5A)，尽管诱导了对gp33肽的显著反应 (图5B)。观察到肿瘤生长的延迟，但最终肿瘤战胜了由溶瘤病毒疫苗征收的免疫攻击和生长抑制。这很可能是由于肿瘤的免疫抑制影响造成被单独的溶瘤病毒疫苗诱导的gp33-特异性细胞产生机能障碍。这些数据表明组合Tcm T细胞免疫疗法和溶瘤病毒疫苗疗法诱导完全免疫介导的肿瘤消退，这是单独的治疗所不能实现的。

非溶瘤腺病毒疫苗载体 (图3中的Ad-hDCT)与 Tcm细胞免疫疗法的组合使用未能控制肿瘤生长 (图3A)，尽管减少了转移的Tcm细胞的明显扩增和活化，其中感染后的12天峰值反应为约10% IFNγ+ CD8 T细胞 (图3B)。这表明溶瘤病毒载体 (如VSV、MRB和Vaccinia)在理想情况下适于T细胞免疫疗法 Tcm的活化并且是该联合疗法中完全肿瘤反应所必须的。

联合疗法的抗肿瘤特性不仅能够完全消退肿瘤而且还持续至少60天并抑制随后的抗原匹配的肿瘤细胞的移植和生长。BALB/c小鼠之前通过用DUC18 Tcm和VSV-Erk9M联合治疗60天而治疗并治愈CMS5肿瘤，然后用皮内注射CMS5肿瘤细胞来再激发。在初始对照小鼠中观察到快速的肿瘤生长但在之前治愈的小鼠中未观察到(图4C)，表明由联合疗法诱导的反应持续并抑制任何表达靶抗原的新肿瘤细胞的生长。

实施例4：溶瘤病毒介导的P14 Tcm活化的注射途径依赖性试验。

在理想的情况下，溶瘤病毒疫苗载体同时引起经由直接病毒感染的肿瘤减瘤并刺激TAA特异性细胞溶解T细胞。因此，由于要实现这两个目标疫苗必须有效地扩散至肿瘤和淋巴器官，病毒注射的途径为设计溶瘤病毒疫苗免疫疗法时的重要考量。另外，必须考虑病毒的安全性、病毒的天然趋性及其注射后复制和扩散的能力。因此，我们试验了我们的联合疗法在通过不同途径给予溶瘤病毒疫苗时消除肿瘤的能力。C57BL/6小鼠在皮内移植1×105 B16-gp33细胞后7天用1×106 P14 Tcm细胞注射，接着在24小时后用2×108 pfuVaccinia-gp33或7.5×107 pfu Vaccinia-gp33静脉(IV)、腹膜内(IP)、瘤内(IT)或肌内(IM)注射。监测肿瘤体积并以mm3示于图5中。当IV给予时棒状病毒载体 (VSVgp33)仅被诱导有效的肿瘤消退且在通过其它途径给予时仅显示部分肿瘤消退 (图6，图中左栏)。针对所使用的所有注射途径测量特异性效应T细胞反应的诱导，且如在肿瘤消退中观察到的，只有IV注射途径导致P14 Tcm + VSV-gp33处理的小鼠中的显著反应(图7A)。相反，基于疫苗的溶瘤接种显示更多的灵活性。不管在P14 Tcm + Vaccinia-gp33联合疗法的背景下溶瘤痘苗病毒疫苗以何种途径给予，都观察到肿瘤的完全消退而没有复发(图6，图中右栏)并诱导显著的gp33-特异性CD8+T细胞反应(图7B)。因此，在我们的联合疗法中的VSV给予在IV给予时产生有效的肿瘤根除反应，而Vaccinia给予是灵活的且在IV、IT、IP和IM给予时导致有效的治疗结果。

出乎意料的是，BALB/c-NRG小鼠表现略微不同。在此情况下，DUC18 Tcm T细胞免疫疗法和溶瘤病毒 Maraba-Erk9M处理的相同组合仅产生瞬时肿瘤消退且在2-3周后肿瘤复发。在不受理论约束下，这可能表明内源T细胞需要与转移的(T细胞免疫疗法)T细胞配合用于完全肿瘤根除，或者通过包括靶向其他肿瘤抗原的内源性T细胞的表位扩散来介导抗原缺失变体的排斥。

进一步试验了化学诱导的淋巴细胞清除预处理对Tcm细胞免疫疗法, C57BL/6小鼠的后果。将荷有B16-gp33肿瘤的小鼠在有或没有通过CPX处理诱导的在先淋巴细胞清除下用P14 Tcm + Vaccinia-gp33处理。在没有CPX预处理的情况下用P14 Tcm + Vaccinia-gp33处理的小鼠显示在感染后12天的完全肿瘤消退和~12% IFNγ+ CD8 T细胞反应的峰值反应。相反，用低剂量(50mg/kg)和高剂量(150mg/kg) CPX处理的小鼠，不能完全消退肿瘤，因此，化学淋巴细胞清除并未增强由联合疗法诱导的抗肿瘤作用。的确，CPX处理似乎对由Tcm细胞免疫疗法与溶瘤病毒联合疗法诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应的抗肿瘤活性具有不利影响。

这些结果不仅证实了本文所述的T细胞免疫疗法联合溶瘤病毒治疗的组合可以绕开预处理淋巴细胞清除或淋巴细胞消减，而且淋巴细胞清除/淋巴细胞消减会对疗法的整体效力有害。

本发明的不同实施方案通过上述实施例示出。本领域技术人员可以开发出上述方法的替代方案，这些替代方案在本发明和所限定的权利要求的范围内。

所有出版物，专利和专利申请均以其全部内容通过参考引入本文，其引入程度与如同每个单独的出版物、专利或专利申请以其全部内容通过参考引入而被具体和单独地指出一样。在本申请中的术语在通过引用引入本文的文件中被不同地定义的情况下，本文所提供的定义用作该术语的定义。

Claims (18)

1.一种用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，包含有效治疗剂量的含CD8⁺T细胞群的过继性细胞治疗剂和有效治疗剂量的复制型溶瘤病毒疫苗，所述过继性细胞治疗剂和所述复制型溶瘤病毒疫苗顺序使用，其中CD8⁺T细胞群中至少50％的CD8⁺T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性。

2.根据权利要求1所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群中60％~70％的CD8⁺T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性。

3.根据权利要求1的癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群是通过在肿瘤抗原、抗原呈递细胞（APC）和IL-21存在下体外培养具有组织相容性表型的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）产生的。

4.根据权利要求3的癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群是通过在包括IL21与IL15的组合物存在下体外培养肿瘤浸润淋巴细胞（TILS）或外周血单核细胞（PBMC）产生的。

5.根据权利要求4的癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群是通过在包括IL21与IL15，但不包含IL2的组合物存在下体外培养肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）产生的。

6.根据权利要求3所述的用于治疗癌症的联合免疫治疗组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群是通过在雷帕霉素存在下体外培养肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）产生的。

7.根据权利要求1所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群是通过用重组T细胞受体（TCR）转导的外周血单核细胞（PBMC）或对肿瘤抗原特异性的嵌合抗原T细胞受体（CAR）并离体培养转导的外周血单核细胞（PBMC）来产生。

8.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的联合免疫治疗组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群是通过体外培养CD25耗尽的外周血单核细胞（PBMC）产生。

9.根据权利要求4中任一项所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群的体外培养的IL21和IL15的浓度均为5 ~15ng / ml。

10.根据权利要求1所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中所述CD8⁺T细胞群通过体外培养后并体外活化一周。

11.根据权利要求1所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中CD8⁺T细胞群通过将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）体外培养之后并在包含抗CD3和抗CD28抗体以及IL2的培养物中进行离体扩增至少一至四周。

12.根据权利要求1中所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中所述复制型溶瘤病毒是表达肿瘤抗原的溶瘤弹状病毒或溶瘤痘苗病毒。

13.根据权利要求1中所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中所述复制型溶瘤病毒是野生型的或重组减毒的溶瘤痘苗病毒。

14.根据权利要求13的所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，其特征在于，其中溶瘤痘苗病毒是Wyeth，Western Reserve或Copenhagen菌株，具有胸苷激酶缺失和/或痘苗生长VGF基因缺失。

15.根据权利要求1-14任一所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合，所述药物组合中的药物活性物质通过药学上可接受的载体以介质和药剂形式给药。

16.根据权利要求15所述的药物组合在癌症的联合免疫治疗中的应用，采用权利要求1-15任一所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合对癌症进行联合免疫治疗，癌症的肿瘤抗原选自甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），CA 125，Her2，多巴色素互变异构酶（DCT），GP100， Melan-A / MART-1，MAGE蛋白，BAGE蛋白，GAGE蛋白，NY-ESO1，WT-1，酪氨酸酶，SSX2，细胞周期蛋-A1，KIF20A，MUC5AC，Meloe，Lengsin，激肽释放酶4，IGF2B3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，HPV-E6和HPV-E7。

17.根据权利要求16所述的的药物组合在癌症的联合免疫治疗中的应用，，包括：过继性细胞治疗剂给药：离体培养肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMC）而产生CD8⁺T细胞，扩增培养物中的CD8⁺T细胞群，其中CD8⁺T细胞群中至少50％的CD8⁺T细胞显示中央型记忆表型并且对癌症表达的肿瘤抗原具有特异性，将CD8⁺T细胞群向受试者过继细胞转移；和复制型溶瘤牛痘病毒疫苗给药：将表达相同的肿瘤抗原的复制型溶瘤病毒给予至受试者，从而诱导癌症破坏和消除。

18.根据权利要求16所述的所述的用于癌症的联合免疫治疗的药物组合在癌症的联合免疫治疗中的应用，其特征在于，在过继性细胞治疗剂给药1小时至约72小时后，进行复制型溶瘤牛痘病毒疫苗给药，其中复制型溶瘤病毒牛痘疫苗通过血管内，肿瘤内或肌肉内或腹膜内给药。

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