CN105658790A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

描述了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒，该试剂盒包括第一病毒，所述第一病毒表达MAGEA3、人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白、前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原或癌睾丸抗原1，或它们的变体作为抗原蛋白，并且所述第一病毒被配制成在哺乳动物中产生对上述蛋白或其变体的免疫力。该试剂盒还包括编码相同抗原或相同抗原的变体的马拉巴MG1病毒。该马拉巴MG1病毒被配置成诱导哺乳动物中的免疫应答。该第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。

Description

疫苗组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年2月21日提交的美国临时专利申请第61/767,776号的优先权，并将其结合于本文作为参考。
技术领域
本文披露内容涉及用于诱导免疫应答的溶瘤病毒。
背景技术
溶瘤病毒(OVs)特异性感染恶性细胞、在恶性细胞中复制并杀死恶性细胞，以使得正常组织不被感染。若干种OV已达到了针对多种肿瘤治疗的临床评价的高级阶段(RussellSJ.等人,(2012)NatBiotechnol30:658-670)。一旦获得批准，这样的病毒试剂就能够替代标准癌症治疗或与其组合并提供减少的毒性和改善的治疗效力。
除了水疱性口腔炎病毒(VSV)之外(StojdlDF.等人,(2000)NatMed6:821-825；StojdlDF.等人,(2003)CancerCell4:263-275)，最近已经描述了显示出溶瘤细胞活性的其他弹状病毒(BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449；MahoneyDJ.等人,(2011)CancerCell20:443-456)。除了它们之外，非-VSV马拉巴病毒在体外显示出最广泛趋癌性(oncotropism)(WO2009/016433)。对在正常细胞中具有改进的肿瘤选择性和毒性减少的突变马拉巴病毒进行工程化改造。减毒株为含有G蛋白(Q242R)和M蛋白(L123W)突变的双重突变体株。在体内，这种减毒株被称作MG1或马拉巴MG1，证明了在小鼠中异种移植物和同基因肿瘤模型中的强抗肿瘤活性，其比减毒VSV、VSVAM51具有更好的治疗效力(WO2011/070440)。
在过去数年间积累的数据已经揭示了溶瘤病毒的抗肿瘤活性不仅取决于其直接溶瘤作用，而且还取决于其刺激抗肿瘤免疫力的能力(BridleBW.等人,(2010)MolTher184:4269-4275)。这种免疫介导的肿瘤控制似乎在OV治疗的总体效力方面起到了决定性作用。事实上，肿瘤特异性适应性免疫细胞能够追踪(patrol)该组织并破坏被OV遗漏的肿瘤细胞。而且，其记忆间隔(memorycompartment)能够防止肿瘤复发。
已经开发了多种策略来改善OV-诱导的抗肿瘤免疫力(PolJ.等人,(2012)病毒AdaptationandTreatment4:1-21)。一些小组已对表达免疫刺激的细胞因子的OV进行了基因改造。表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单纯疱疹病毒和牛痘病毒已分别达到针对癌症治疗的III和MB期临床评价，而表达IFN-β的VSV刚刚进入I期。
另一种策略被定义为溶瘤细胞疫苗，其由表达来自OV的肿瘤抗原组成(RussellSJ.等人,(2012)NatBiotechnol30:658-670)。之前，已经证明了VSV也能够被用作癌症疫苗载体(BridleBW.等人,(2010)MolTher184:4269-4275)。当应用于设置为用于治疗鼠黑素瘤模型的异种免疫加强时，VSV-人多巴色素互变异构酶(hDCT)溶瘤疫苗不仅诱导对于DCT的肿瘤特异性免疫力增加，而且还伴随抗病毒适应性免疫力下降。因此，随着中期和长期存活的增加，治疗效力得到了明显改善(WO2010/105347)。尽管在利用hDCT作为肿瘤相关抗原时显示VSV是有效的，但并不能预测什么样的抗原相关的抗原在异种免疫加强设定中是有效的。
提供一种能够用于激活患者的免疫系统以杀死肿瘤细胞并且对正常组织具有减小的毒性的疫苗载体是合乎需要的，例如通过针对肿瘤上的抗原相关的抗原激活抗体和/或淋巴细胞。如果这样的疫苗载体既显示出溶瘤细胞活性又显示出加强适应性细胞免疫力，则是合乎需要的。
发明内容
下述总结意在向读者介绍本文中描述的一项或多项发明，而不是意在限定它们中的任一项。
本文披露内容的目的在于消除或缓解之前的抗癌疫苗的至少一种缺点。
本文的作者已经出人意料地确定了MAGEA3、人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白、前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原和癌睾丸抗原1能够用于致力于在哺乳动物中诱导免疫应答的异种免疫加强(heterologousprime-boost)中。这些结果是无法预料的且不可预期的，因为并不是所有的抗原相关的抗原都能够经由异种免疫加强来诱导免疫应答。例如，本文的作者还确定了胎盘特异性蛋白1(PLAC-1)和Epstein-Barr核抗原1能够经由异种免疫加强刺激免疫应答。
在第一方面，本文提供了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒。该试剂盒包括：第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在哺乳动物中产生对该蛋白或其变体的免疫力。该试剂盒还包括编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:1的蛋白或其变体的马拉巴MG1病毒，该马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；该第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。由第一病毒表达的抗原蛋白和由马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白可以是完全相同的。
第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者可以被配制成用于作为分离的病毒施用。
马拉巴MG1病毒可以包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式。该马拉巴MG1病毒可以包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因。
第一病毒可以包括包含SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的转基因，或可以包括包含SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式，这取决于该第一病毒为正义RNA病毒、DNA病毒还是反义RNA病毒。
这两种病毒可以能够表达包含SEQIDNO:1序列的蛋白的不同变体。由第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者表达的包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白的变体可以包括由FLWGPRALV、KVAELVHFL、EGDCAPEEK、KKLLTQHFVQENYLEY、RKVAELVHFLLLKYR和KKLLTQHFVQENYLEY组成的组中的至少一个肿瘤相关的表位，并且与SEQIDNO:1具有至少70％同一性。优选地，该变体与SEQIDNO:1具有至少80％同一性。更优选地，该变体与SEQIDNO:1具有至少90％同一性。甚至更优选地，该变体与SEQIDNO:1具有至少95％同一性。
由第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者表达的包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白的变体可以具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。编码该变体的核苷酸序列可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列。
马拉巴MG1病毒可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。第一病毒可以包括包含SEQIDNO:5的核苷酸序列的转基因，或可以包括包含SEQIDNO:5的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式，这取决于该第一病毒为正义RNA病毒、DNA病毒还是反义RNA病毒。
如果第一病毒为反义RNA病毒，则马拉巴MG1病毒或第一病毒中的一个可以包括SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，而马拉巴MG1病毒和第一病毒中的另一个可以包括SEQIDNO:5的反向互补和RNA形式。
如果第一病毒为正义RNA病毒或DNA病毒，则马拉巴MG1病毒可以包括SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，且第一病毒可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列。可替代地，马拉巴MG1病毒可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，且第一病毒可以包括SEQIDNO:2或3的核苷酸序列。
马拉巴MG1病毒或第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:1或4的序列的蛋白，而马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含其他序列的蛋白。
该第一病毒可以是腺病毒。
根据另一个方面，提供了分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其具有编码包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白或其变体的基因组。
包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白的变体可以具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。
该基因组可以包括SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
该基因组可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列反向互补和RNA形式。
该基因组可以包括SEQIDNO:6的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
在另一个方面，本文提供了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒。该试剂盒包括：第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在该哺乳动物中产生对该蛋白或其变体的免疫力。该试剂盒还包括编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:7的蛋白或其变体的马拉巴MG1病毒，该马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；该第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。由该第一病毒表达的抗原蛋白和由该马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白可以完全相同。
第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者可以被配制成用于作为分离的病毒施用。
如果该第一病毒为反义RNA病毒，则马拉巴MG1病毒、第一病毒或二者可以包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因。如果该第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒，则第一病毒可以包包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的密码子优化的转基因。
由第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者表达的包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的蛋白的变体可以包括至少一种肿瘤相关的表位并且与SEQIDNO:7具有至少70％同一性，优选地，该变体与SEQIDNO:7具有至少80％同一性。更优选地，该变体与SEQIDNO:7具有至少90％同一性。甚至更优选地，该变体与SEQIDNO:7具有至少95％同一性。
马拉巴MG1病毒或所述第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:7的序列的蛋白，而所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含SEQIDNO:7的序列的蛋白的变体。这两种病毒能够表达包含SEQIDNO:7的序列的蛋白的不同变体。
该第一病毒可以是慢病毒。
根据另一个方面，提供了具有编码包含SEQIDNO:7的氨基酸序列或其变体的蛋白的基因组的分离的马拉巴MG1病毒颗粒。
该基因组可以包括SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
该基因组可以包括这样的核苷酸序列，其是SEQIDNO:9的反向互补和RNA形式。
在另一个方面，本文提供了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒。该试剂盒包括：第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在哺乳动物中产生对该蛋白或其变体的免疫力。该试剂盒还包括编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:10的蛋白或其变体的马拉巴MG1病毒，该马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；该第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。由第一病毒表达的抗原蛋白和由马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白可以是完全相同的。
第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者被配制成用于作为分离的病毒施用。
如果第一病毒为反义RNA病毒，则马拉巴MG1病毒、第一病毒或二者可以包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因。如果第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒，则该第一病毒可以包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的密码子优化的转基因。
由第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者表达的包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的蛋白的变体可以包括至少一种肿瘤相关的表位并且与SEQIDNO:10具有至少70％同一性，优选地，该变体与SEQIDNO:10具有至少80％同一性。更优选地，该变体与SEQIDNO:10具有至少90％同一性。甚至更优选地，该变体与SEQIDNO:10具有至少95％同一性。
马拉巴MG1病毒或第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:10的序列的蛋白，而马拉巴MG1病毒和第一病毒中的另一个能够表达包含SEQIDNO:10的序列的蛋白的变体。这两种病毒能够表达包含SEQIDNO:10的序列的蛋白的不同变体。
该第一病毒可以是慢病毒。
根据另一个方面，提供了具有编码包含SEQIDNO:10的氨基酸序列或其变体的蛋白的基因组的分离的马拉巴MG1病毒颗粒。
该基因组可以包括SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
该基因组可以包括这样的核苷酸序列，其是SEQIDNO:12的反向互补和RNA形式。
在另一个方面，本文提供了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒。该试剂盒包括：第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在哺乳动物中产生对该蛋白或其变体的免疫力。该试剂盒还包括编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:13的蛋白或其变体的马拉巴MG1病毒，该马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；该第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。由该第一病毒表达的抗原蛋白和由该马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白可以完全相同。
第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者可以被配制成用于作为分离的病毒施用。
如果第一病毒为反义RNA病毒，则马拉巴MG1病毒、第一病毒或二者可以包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因。如果第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒，则第一病毒可以包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的密码子优化的转基因。
由第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者表达的包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的蛋白的变体可以包括至少一种肿瘤相关的表位并且与SEQIDNO:13具有至少70％同一性，优选地，该变体与SEQIDNO:13具有至少80％同一性。更优选地，该变体与SEQIDNO:13具有至少90％同一性。甚至更优选地，该变体与SEQIDNO:13具有至少95％同一性。
马拉巴MG1病毒或所述第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:13的序列的蛋白，而所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含SEQIDNO:13的序列的蛋白的变体。这两种病毒能够表达包含SEQIDNO:13的序列的蛋白的不同变体。
该第一病毒可以是慢病毒。
根据另一个方面，提供了具有编码包含SEQIDNO:13的氨基酸序列或其变体的蛋白的基因组的分离的马拉巴MG1病毒颗粒。
该基因组可以包括SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
该基因组可以包括这样的核苷酸序列，其是SEQIDNO:15的反向互补和RNA形式。
对于本领域普通技术人员而言，在结合附图阅读以下具体实施方式的描述之后，本文披露内容的其他方面和特征将变得显而易见。
附图说明
现在将参照以下附图仅以举例说明的方式来描述本文的实施方式。
图1A示出了在给予MG1-hDCT的荷瘤小鼠中CD8+或CD4+T-细胞应答。
图1B示出了在转移性肺癌小鼠模型中仅作为初免载体(primingvector)施用的MG1-hDCT的治疗效力。
图2示出了在用Ad-hDCT作为初免载体以及用马拉巴MG1-hDCT或VSV-hDCT作为加强免疫载体(boostingvector)的在C57/BI6小鼠中初免-加强免疫(prime-boostvaccination)的免疫应答的比较。
图3示出了在仅以Ad-空白或Ad-hDCT作为初免载体之后或在用Ad-hDCT作为初免载体并且用马拉巴MG1GFP或马拉巴MG1-hDCT作为加强免疫载体进行初免-加强免疫之后，转移性肺癌小鼠模型中的T-细胞应答。
图4示出了在仅以Ad-空白或Ad-hDCT作为初免载体之后或在用Ad-hDCT作为初免载体并且用马拉巴MG1GFP或马拉巴MG1-hDCT作为加强免疫载体进行初免-加强免疫之后，转移性肺癌小鼠模型中的存活曲线。
图5示出了在以Ad-空白或Ad-hDCT作为初免载体之后或在用Ad-hDCT作为初免载体并且用马拉巴MG1-hDCT作为加强免疫载体进行初免-加强免疫之后，转移性脑癌小鼠模型中的存活曲线。
图6为在灵长动物毒性/免疫原性研究中利用的初免载体Ad-MAGEA3、加强免疫载体马拉巴MG1-MAGEA3和初免-加强策略的图示。
图7示出了在给予Ad-MAGEA3作为初免载体以及高或低剂量的MG1-MAGEA3作为加强免疫载体的灵长动物中的平均T-细胞应答。该T-细胞应答是在加强免疫载体之后的5天、13天和84天确定的。
图8示出了在加强免疫载体之后的5天，在给予Ad-MAGEA3作为初免载体以及MG1-MAGEA3作为加强免疫载体的单只灵长动物中的T-细胞应答。该T-细胞应答相关于用于刺激应答的MAGEA3肽池被分层。
图9示出了在仅以Ad-hDCT对Ad-hDCT+环磷酰胺作为初免载体之后或在用Ad-hDCT对Ad-hDCT+环磷酰胺作为初免载体并且用VSV-hDCT作为加强免疫载体进行初免-加强免疫之后，转移性肺癌小鼠模型中的存活曲线。
具体实施方式
本文披露内容提供了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒。该试剂盒包括表达作为抗原蛋白的MAGEA3、人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白、前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原或癌睾丸抗原1或其变体并且被配制成在哺乳动物中产生对所述蛋白或其变体的免疫力的第一病毒。该试剂盒还包括编码相同抗原或相同抗原的变体的马拉巴MG1病毒，该马拉巴MG1病毒被配制成在哺乳动物中诱导免疫应答。该第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异，以使得其在异种免疫加强免疫中起到“初免”的作用。
初免:加强免疫能够以非匹配的疫苗递送方法而利用相同抗原的给予(以'异种'初免-加强的形式)；或以匹配的疫苗递送方法给予(以'同种'初免-加强的形式)。当利用载体化的疫苗平台作为同种免疫会导致再次应答中载体和转基因的应答的加强时，异种免疫加强方法是优选的。相对而言，异种系统关注抗原上的再次应答(即，加强的应答)，其作为对于第一和第二载体响应是初次应答，而且因此不太强。
在本文的披露内容中，第一病毒和马拉巴MG1病毒以异种免疫加强形式使用。
上文中列出的抗原蛋白是已通过在胸腺中进行负选择的经过严密控制的过程耐受(KruisbeekAM和AmsenD,(1996)CurrOpinImmunol8:233-244；StockingerB(1999)AdvImmunol71:229-265)或外周耐受的免疫系统的自身-抗原。为这些抗原蛋白以及任意其他自身抗原开发疫苗的主要挑战在于，诱导选择性针对癌细胞的强免疫应答。尽管已经发现了大量的抗原相关的抗原肽，但本文的作者已确定的是，不可能预测哪些抗原肽能够被成功用于开发疫苗。
黑素瘤抗原，家族A,3(MAGEA3)是一种"癌睾丸抗原"。在DePlaen等人,Immunogenetics40:360-369(1994)中讨论了编码肿瘤特异性抗原的MAGE家族的基因，MAGEA3在大量的肿瘤中被表达，包括黑素瘤、结肠直肠癌和肺癌。本文的作者使用这种蛋白作为第一病毒和马拉巴MG1病毒中的抗原蛋白。作者还使用MAGEA3蛋白的变体作为第一病毒和马拉巴MG1病毒中的抗原蛋白。
人乳头瘤病毒(HPV)原癌蛋白E6/E7在子宫颈癌中被组成性表达(ZurHausen,H(1996)BiochemBiophysActa1288:F55-F78)。而且，16型和18型HPV是75％导致子宫颈癌的原因(WalboomersJM(1999)JPathol189:12-19)。本文的作者使用了16型和18型HPV的E6/E7原癌蛋白的融合蛋白作为抗原蛋白。利用共表达作为融合蛋白的16/18型HPVE6/E7的核苷酸序列来表达该融合蛋白，其发生突变以除去致癌潜能。本文的作者使用该融合蛋白作为第一病毒和马拉巴MG1病毒中的抗原蛋白。
前列腺的6次跨膜上皮抗原(huSTEAP)最近被鉴定为显示出在前列腺癌中过表达并且在多个癌细胞系中被上调的蛋白，包括胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血症和尤文氏肉瘤(HubertRS等人,(1999)ProcNatlAcadSci96:14523-14528)。STEAP基因编码具有侧接有亲水性氨基和羧基末端结构域的六个潜在跨膜区的蛋白。本文作者使用该蛋白作为第一病毒和马拉巴MG1病毒中的抗原蛋白。
癌睾丸抗原1(NYESO1)是一种在正常成人组织(例如睾丸和卵巢)和多种癌症中表达的癌症/睾丸抗原(NicholaouT等人,(2006)ImmunolCellBiol84:303-317)。癌症/睾丸抗原是一组独特的抗原，其对于正常成人中的睾丸生殖细胞具有受限的表达，但却在多种实体肿瘤中异常表达，包括软组织肉瘤、黑素瘤和上皮癌。本文作者使用这种蛋白作为第一病毒和马拉巴MG1病毒中的抗原蛋白。
相对于MAGEA3、HPVE6/E7融合蛋白、huSTEAP和NYES01蛋白在异种免疫加强疫苗中作为抗原蛋白的成功使用，本文的作者确定了Epstein-Barr核抗原1(EBDNA1,SEQIDNO:16,由SEQIDNO:17编码)不能产生相似的免疫应答。EBDNA1是与一种Epstein-Barr病毒(EBV)相关的多官能病毒蛋白(SibilleH等人,(2003)ProcNatlAcadSci100:10989-10994)，并且在EBV-相关肿瘤中一致地表达(YoungLS等人,(2004)NatureReviews-Cancer4:757-768)。EBNA1具有甘氨酸-丙氨酸重复序列，其将该蛋白分隔成氨基端和羧基端结构域(YoungLS(2004)NatureReviews-Cancer4:757-768)。该序列还使得该蛋白稳定化，防止蛋白酶体破坏，以及削弱抗原加工和1类MHC-限制性抗原呈递。这从而抑制了CD8-限制性细胞毒性T细胞针对病毒感染细胞的应答(LevitskayaJ等人,(1995)Nature375:685-688)。
胎盘特异性蛋白1(PLAC-1)是在异种免疫加强疫苗中不能产生免疫应答的肿瘤相关的抗原蛋白的另一个实例。
在本文披露内容的上下文中，肿瘤相关的抗原蛋白的"变体"是指(a)包括至少一个来自肿瘤相关的抗原蛋白的肿瘤相关的抗原表位，以及(b)与该肿瘤相关的抗原蛋白具有至少70％同一性的蛋白。优选地，该与肿瘤相关的抗原蛋白具有至少80％同一性。更优选地，该与肿瘤相关的抗原蛋白具有至少90％同一性。甚至更优选地，该与肿瘤相关的抗原蛋白具有至少95％同一性。具有较高序列同一性的变体以类似于该野生型抗原蛋白的三维形式存在该表位的可能性增加。
通常，可通过将整个抗原蛋白破坏成重叠系列的肽或通过产生随机肽的文库并通过刺激来自利用肽池以蛋白靶标免疫的动物的PBMCs或脾细胞以寻找T细胞应答来鉴定肿瘤相关的抗原表位。具有应答的池鉴定为作为潜在抗原表位的肽。Morris,GE在EncyclopediaofLifeSciences,2007,第1-3页(doi:10.1002/9780470015902.a0002624.pub2)中讨论了该方法。
VanderBruggenP,StroobantV,VigneronN,VandenEyndeB在"DatabaseofTcell-definedhumantumorantigens:the2013update."CancerImmun201313:15以及在<http://www.cancerimmunity.org/peptide/>中提供了总结了被广泛接受的抗原表位的数据库。
已针对MAGEA3鉴定了肿瘤相关的抗原表位。因此，MAGEA3蛋白的变体可以是，例如，包括选自由EVDPIGHLY、FLWGPRALV、KVAELVHFL、TFPDLESEF、VAELVHFLL、MEVDPIGHLY、EVDPIGHLY、REPVTKAEML、AELVHFLLL、MEVDPIGHLY、WQYFFPVIF、EGDCAPEEK、KKLLTQHFVQENYLEY、RKVAELVHFLLLKYR、KKLLTQHFVQENYLEY、ACYEFLWGPRALVETS、RKVAELVHFLLLKYR、VIFSKASSSLQL、VIFSKASSSLQL,VFGIELMEVDPIGHL、GDNQIMPKAGLLIIV、TSYVKVLHHMVKISG、RKVAELVHFLLLKYRA、和FLLLKYRAREPVTKAE组成的组中的至少一个肿瘤相关的抗原表位的抗原蛋白；并且与该MAGEA3蛋白具有至少70％同一性。
对于肿瘤相关的抗原蛋白的变体而言，包括具有高等位基因频率的抗原表位是合乎需要的，例如群的频率大于40％。因此，MAGEA3变体的优选实例可以包括包含选自由FLWGPRALV、KVAELVHFL、EGDCAPEEK、KKLLTQHFVQENYLEY、RKVAELVHFLLLKYR和KKLLTQHFVQENYLEY组成的组中的至少一个抗原表位的蛋白；并且其与MAGEA3蛋白具有至少70％同一性。
由第一病毒表达的抗原不需要与由马拉巴MG1病毒表达的抗原具有精确相同的序列。由马拉巴MG1表达的抗原仅必需针对由第一病毒表达的抗原诱导重叠免疫应答。例如，第一病毒可以表达MAGEA3而马拉巴MG病毒可以表达MAGEA3变体，或反之亦然。由于MAGEA3和MAGEA3的变体均诱导重叠免疫应答(因为其均具有至少一个完全相同的抗原相关的抗原序列)，因此第一病毒起到初次免疫的作用而马拉巴MG1病毒起到加强免疫的作用。当施用马拉巴MG1病毒时，在哺乳动物中产生的针对第一抗原的免疫应答导致主要针对MAGEA3或MAGEA3变体的免疫应答就足够了。
在本文披露的上下文中，应该理解，所有关于或指代'由病毒表达的蛋白'的讨论更加准确地是指由病毒感染的细胞表达的蛋白，因为病毒本身并不能表达蛋白。类似地，所有关于或指代'表达蛋白的病毒'或'能够表达蛋白的病毒'的讨论更加准确地是指包括对于被感染了病毒的细胞所要表达的蛋白所必需的遗传信息的病毒。
试剂盒可另外地包括免疫增强化合物，例如环磷酰胺(CPA)，其使得针对通过适用第一病毒在哺乳动物中产生的肿瘤相关的抗原蛋白的初次免疫应答增加。环磷酰胺是一种化疗剂，其会导致针对肿瘤相关的抗原蛋白的免疫应答增加。在协同鼠黑素瘤肿瘤模型中，在施用初免载体之前施用CPA使存活显著增加，而在施用加强免疫载体之前施用CPA则不行。
本文中披露的治疗方法组合了：(1)病毒疫苗,和(2)马拉巴MG1病毒作为溶瘤细胞病毒疫苗，二者均表达MAGEA3、人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白、前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原或癌睾丸抗原1，或其变体。用溶瘤疫苗加强免疫会导致由于该溶瘤病毒而使肿瘤减积以及由于病毒疫苗而使动物中的肿瘤特异性CTL(细胞毒性T-淋巴细胞)的数目大量增加。亦即，相比于无肿瘤动物，这种方法在荷瘤动物中精确地产生的较大的抗-肿瘤应答，因为溶瘤细胞病毒的复制在荷瘤动物被扩增，因而当与无肿瘤动物中的溶瘤细胞病毒复制和抗原-特异性肿瘤渗透淋巴细胞(TILs)的相关数量相比时，这导致抗原-特异性肿瘤渗透淋巴细胞(TILs)的数目增加。
这些基因的表达产物被加工成肽，该肽又在细胞表面上表达。这能够导致肿瘤细胞通过特异性的CTL被溶解。对于外来抗原的T细胞应答包括细胞溶解T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。CD8+细胞毒性或细胞溶解T细胞(CTLs)是这样的T细胞，当被激活时，其使得由I类HLA分子呈递的适当抗原溶解。CD4+T辅助性细胞是分泌细胞因子以刺激巨噬细胞和产生抗原的B细胞的T细胞，其通过在其表面上的II型HLA分子呈递适当的抗原。
蛋白"MAGEA3"也可以被称作"MAGE-A3"并且代表黑素瘤-相关抗原3。根据本文披露的该抗原性MAGEA3蛋白是包括SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白。该氨基酸序列可由SEQIDNO:2的核苷酸序列编码。可替代地，该氨基酸序列可由包括SEQIDNO:3的核苷酸序列的密码子优化的转基因编码。表达SEQIDNO:1的蛋白的反义RNA病毒可以包括SEQIDNO:2或3的多核苷酸的反向互补和RNA形式。表达SEQIDNO:1的蛋白的正义RNA病毒或DNA病毒可以包括SEQIDNO:2或3的序列。
根据本文披露的抗原性MAGEA3变体蛋白的实例为包括SEQIDNO:4的氨基酸序列的蛋白。该氨基酸序列可由SEQIDNO:5的核苷酸序列编码。表达SEQIDNO:4的蛋白的反义RNA病毒可以包括包括SEQIDNO:5的反向互补和RNA形式的序列的RNA多核苷酸。表达SEQIDNO:4的蛋白的DNA病毒或RNA病毒可以包括SEQIDNO:5的序列。
这样的反义RNA病毒的一个实例是包括SEQIDNO:6的反向互补和RNA形式的马拉巴病毒。
根据本文披露的抗原蛋白"E6/Ε7融合蛋白"或"人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白"是包括SEQIDNO:7的氨基酸序列的大蛋白。该氨基酸序列可由SEQIDNO:8的核苷酸序列编码。表达SEQIDNO:7的蛋白的反义RNA病毒可以包括SEQIDNO:8的多核苷酸的反向互补和RNA形式。表达SEQIDNO:7的蛋白的DNA病毒或正义RNA病毒可以包括SEQIDNO:8的多核苷酸。这样的反义RNA病毒的一个实例是包括SEQIDNO:9的反向互补和RNA形式的马拉巴病毒。
根据本文披露的蛋白"huSTEAP"或"前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原"是包括SEQIDNO:10的氨基酸序列的蛋白。该氨基酸序列可以由SEQIDNO:11的核苷酸序列编码。表达SEQIDNO:10的蛋白的反义RNA病毒可以包括SEQIDNO:11的多核苷酸的反向互补和RNA形式。表达SEQIDNO:10的蛋白的DNA病毒或RNA病毒可以包括SEQIDNO:11的序列。这样的反义RNA病毒的一个实例是包括SEQIDNO:12的反向互补和RNA形式的马拉巴病毒。
根据本文披露的蛋白"NYES01"或"人癌睾丸抗原1"是包括SEQIDNO:13的氨基酸序列的蛋白。该氨基酸序列可由于SEQIDNO:14的核苷酸序列编码。表达SEQIDNO:13的蛋白的反义RNA病毒可以包括SEQIDNO:14的多核苷酸的反向互补和RNA形式。表达SEQIDNO:13的蛋白的DNA病毒或RNA病毒可以包括SEQIDNO:14的序列。这样的反义RNA病毒的一个实例是包括SEQIDNO:15的反向互补和RNA形式的马拉巴病毒。
上文所述的序列示于附录A。
术语"哺乳动物"是指人和非人哺乳动物。在本文中施用的术语"癌症"包括表达在所关注的病毒中使用的肿瘤相关的抗原蛋白(即：MAGEA3、人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白、前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原、或癌睾丸抗原1)的任何癌症。
例如，当考虑使用MAGEA3作为抗原蛋白时，术语"癌症"包括表达MAGEA3作为抗原的任何癌症。这样的癌症的实例包括，但不限于，黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌和膀胱癌。
当考虑E6/E7融合蛋白作为抗原蛋白时，术语"癌症"包括表达E6和E7蛋白作为抗原蛋白的任何癌症。这样的癌症的实例包括，但不限于，子宫颈癌。
第一病毒、马拉巴MG1病毒或二者可以独立地向哺乳动物静脉内、肌肉内、腹膜内或鼻内施用。在施用病毒之后，在免疫应答间隔内(例如在大约4天内)哺乳动物产生免疫应答，并延续达数月、数年或可能终生。
第一病毒可以是在向患者施用该第一病毒之后诱导针对肿瘤相关的抗原蛋白或其变体的免疫应答的任何病毒。根据本文披露可以施用的病毒包括，例如：腺病毒(Ad)、痘病毒、逆转录酶病毒和α病毒。痘病毒的一个实例是牛痘病毒。逆转录酶病毒的一个实例是慢病毒。α病毒的一个实例是塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)。
为了确定对于肿瘤相关的抗原蛋白或其变体的免疫应答，利用第一病毒和马拉巴MG1病毒的免疫可以利用已被广泛接受的技术来进行。本领域技术人员将会理解，产产生免疫应答所诉的病毒的量随多种因素而变化，包括，例如，所选择的抗原、用于递送抗原的病毒载体、以及待治疗的哺乳动物，例如物种、年龄、体型等。在这方面，例如，向小鼠肌肉内施用至少约107PFU的腺病毒载体足以产生免疫应答。向人施用相应的量足以产生免疫应答。
在适合的免疫应答间隔内，一旦通过施用第一病毒在哺乳动物中产生了免疫应答，就以适合用于溶瘤细胞病毒治疗的量施用编码肿瘤相关的抗原蛋白或其变体的马拉巴MG1病毒。适合的免疫应答间隔可以是，例如，至少约24小时，优选至少约2-4天或更长，例如至少约1周或至少约2周。适合用于溶瘤细胞病毒治疗的马拉巴MG1病毒的量随待治疗的哺乳动物而不同，这是本领域技术人员知晓的。例如，向小鼠IV施用的108PFU的编码MAGEA3的马拉巴MG1病毒足以用于溶瘤细胞治疗。向人施用相应的量足以产生免疫应答。
编码肿瘤相关的抗原蛋白或其变体的马拉巴MG1病毒可以利用标准重组技术通过将编码肿瘤相关的抗原蛋白或其变体的转基因的反向互补序列结合到马拉巴MG1病毒中类制备。例如，可将该转基因的反向互补序列结合到马拉巴MG1病毒的基因组中，或可替代地，可利用结合转基因的质粒将其结合到病毒中。该编码肿瘤的转基因可以是密码子优化的转基因。
实施例
溶瘤细胞马拉巴MG1是一种强效的溶瘤疫苗平台。尽管针对黑素瘤-相关抗原不能产生可检测的初步应答，但马拉巴MG1-疫苗显示出先于肿瘤特异性CD4+和CD8+T-细胞免疫力存在的加强免疫的能力。当应用于同基因鼠黑素瘤肿瘤模型的治疗中时，马拉巴-MG1-介导的回溯免疫(recallimmunization)导致在超过20％的所治疗动物中具有完全缓解的中值生存。
在灵长动物毒性研究中，用Ad-MAGEA3进行初次免疫，之后用马拉巴-MG1-MAGEA3进行加强免疫的异种免疫加强免疫导致了T-细胞应答，其相当于在同基因鼠肿瘤模型中获得的应答，这表明在远系繁殖灵长动物群体中，初免-加强溶瘤疫苗策略得到了相当于其中肿瘤能够异种移植的动物模型的免疫应答并且达到了显著延长的存活。
本文的作者还确定了具有序列SEQIDNOs:7、10或13的蛋白能够用于在具有用马拉巴MG1异种免疫加强免疫的患者中刺激免疫应答。相对而言，本文的作者确定了分别施用表达EBDNA-蛋白或胎盘特异性蛋白1(PLAC-1)的第一病毒，接着施用表达EBDNA-1蛋白或PLAC-1的马拉巴-MG1不能刺激免疫应答。
实施例1：MG1-hDCT是弱初免载体和强加强免疫载体：
基于人血清型5，Ad-空白和Ad-hDCT是复制缺陷型腺病毒(E1/E3-缺失)(LaneC.等人,(2004)CancerResearch64:1509-1514；NgP.等人,(2001)MolTher3:809-815)。该复制缺陷型腺病毒载体被工程化改造为表达hDCT转基因，其编码与抗原DCT(多巴色素互变异构酶)相关的全长人黑素瘤，而Ad-空白则不具有转基因。所得的腺病毒载体被称为"Ad-hDCT"。
马拉巴病毒的MG1变体被工程化改造为表达黑素瘤-相关抗原hDCT转基因的人类形式。所得的MG1病毒载体被称为"MG1-hDCT"或"马拉巴MG1-hDCT"。利用相似惯例命名其他病毒载体。
通过在G和L病毒基因之间插入转基因来产生重组马拉巴和VSV。VSV-hDCT来源于VSV的野生型Indiana菌株(BridleBW.等人(2009)17:1814-1821；LawsonND.等人,(1995)ProcNatlAcadSciUSA92:4477-4481)。MG1-GFP(绿色荧光蛋白被用作对照非-免疫原性转基因插入)和MG1-hDCT来源于马拉巴病毒的减毒株MG1。在进行体内研究之前，通过对来自在在α-MEM中培养的感染的Vero细胞的裂解液进行蛋白质印迹来确认病毒的DCT(和GFP)表达，该α-MEM含有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素(均来自Invitrogen,GrandIsland,NY)。
最初评价施用MG1-hDCT作为单一疗法的治疗效力。为了产生肺转移，对C57BI/6小鼠(研究开始时8-10周龄)静脉注射200μl盐水中的2.5×105B16-F10细胞(表达鼠DCT抗原的鼠黑素瘤细胞)。全身注射溶瘤疫苗5或14天之后并在第19天在血液中测量针对该黑素瘤抗原DCT的T-细胞应答。以高剂量(109pfui.v在200μlPBS中)。全身施用该病毒。通过分离PBMCs或脾细胞并且分别用对应于DCT的MHC-I或MHC-II限制性免疫显性表位的SVYDFFVWL(SVY)或KFFHRTCKCTGNFA(KFF)肽刺激它们来测量T-细胞应答。在通过流式细胞术针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)之后检测应答T-细胞。
如图1A和图1B中所示，MG1-hDCt不能使DCT-特异性CD8+或CD4+在荷瘤小鼠中引起T-细胞应答(图1A)。单独施用的MG1-hDCT疫苗不能改善肿瘤发作。事实上，肿瘤激发后治疗14天的小鼠以相似于未治疗小鼠的时间表达到了的终点：在20天后(对于Ad-空白白对照组)对比在21天后(对于Ad-空白+MG1-hDCT)组(图1B)。而且，即使是早在肿瘤异种移植后的第5天用MG1-hDCT对小鼠进行治疗也没有延长其存活(MG1-hDCT组，图1B)。因此结论是，不仅MG1-hDCT不能诱导抗-DCT免疫力，而且其溶瘤细胞活性也不能带来治疗益处。这些结果证明了MG1-hDCT不能针对肿瘤抗原DCT引起显著T-细胞应答，因此其是弱初免载体。
先前已经报道过溶瘤细胞VSV载体起到已存在的免疫力的强力加强剂(potentbooster)的作用(BridleBW.等人,(2010)MolTher84:4269-4275；WO2010/105347)。在本文中，检验了马拉巴MG1病毒作为加强疫苗的能力。腺病毒载体被用作初免载体并且以2×108pfu(50μlPBS(含1×108pfu)/条腿)的总剂量肌肉内(i.m.)施用。为了进行腺病毒注射，在含有5％吸入异氟烷的密封室内对小鼠进行麻醉。利用Ad-hDCT作为初免载体，评价MG1-hDCT作为已经存在的DCT-特异性应答的加强剂。为了评价马拉巴病毒作为加强免疫载体，对多种施用途径进行了评价。施用在小鼠谱系中很好地耐受的1×109pfu病毒的溶瘤细胞剂量，并且选择在Ad引发后间隔12天，因为这是在该肿瘤模型中可行的最长间隔。当通过静脉(i.v.)、鼻内(i.n.)和肌肉内(i.m.)途径施用这种剂量的MG1-马拉巴-hDCT时，i.v.途径被证明比其他途径好得多，如通过针对IFN-γ的ICS在外周CD8+T-细胞中测量的：28.33％±3.82(i.v.)对比4.73％±1.52(i.n.)对比13.84％±1.88(i.m.)。在马拉巴施用5天后测量该应答，与MG1-hDCT-介导的加强应答的峰值一致。在静脉内加强免疫的动物中，相比于仅进行初免的动物，在施用两种疫苗载体的小鼠中，在脾中测量到3倍增加的显著比例的DCT-特异性CD8+T-细胞：3.45％±0.45(在Ad-hDCT组中)相比11.02％±2.14(在Ad-hDCT+MG1-hDCT免疫的动物)(p＝0.0085**)。尽管Ad-hDCT在血液中不能诱导可检测的DCT-特异性CD4+T-细胞群和在脾细胞中勉强可检测的细胞群，但MG1马拉巴-hDCT加强剂能够产生明显的全身性CD4+T-细胞应答，不仅是在施用i.v.(0.30％±0.11)时。该应答在脾中也是可检测的，0.14％±0.03的与DCTKFF肽暴露反应的脾脏CD4+T-细胞。类似于VSV，由MG1马拉巴病毒引起的最大免疫加强是通过i.v.施用达到的。因此结论是，以109pfu的剂量全身递送马拉巴-作为载体的疫苗显然能够提供抗原-特异性CD8+和CD4+T-细胞群的有效加强。出于这个原因，该途径和剂量在最后的体内试验中被用于马拉巴MG1施用。
为了示出马拉巴MG1-hDCT相比于VSV-hDCT是更加强效的加强免疫载体，用Ad-hDCT(包括Ad-BHG作为缺少转基因的对照载体)对C57/BI6小鼠进行初免，并且然后在14天后用静脉剂量的VSV-hDCT或马拉巴-hDCT加强免疫。在加强免疫载体后的第5天在外周血中测量CD8+T细胞应答的免疫分析。在相同剂量下，由马拉巴免疫诱导的应答是VSV诱导的应答的3-8倍(图2)。
实施例2：癌症鼠模型中的MG1-hDCT疫苗策略
随后研究了MG1-hDCT作为加强免疫载体施用的治疗效力。在B16-F10异种移植后的五天在动物中产生肺转移，动物接受Ad-hDCT初免疫苗并且在9天后通过单独i.v.剂量的MG1马拉巴-hDCT作为溶瘤细胞加强剂疫苗。Ad-hDCT初免-MG1-hDCT加强免疫产生了非常强的DCT-特异性CD8+T-细胞应答(平均％IFN-v+CD8+T-细胞＝27.54±2.17,图3)，其是非加强小鼠的14倍(1.95％±0.29在Ad-hDCT组中，以及1.91％±0.59在Ad-hDCT+MG1-GFP组中，图3)。类似地，在MG1-hDCT加强的动物中测量了DCT-特异性CD4+T-细胞应答，而在仅进行初免的小鼠中则极少地检测到(平均％IFN-y+CD4+T-细胞＝0.25％±0.06在Ad-hDCT+MG1-hDCT组中，对比<0.05％在Ad-hDCT和Ad-hDCT+MG1-GFP组中，图3)。
观察治疗结果，相比于未治疗小鼠，Ad-hDCT免疫能够延长10天的中值存活期期：31天(Ad-hDCT治疗)对比20.5天(Ad-空白组)(图4)。Ad-hDCT治疗后进行MG1马拉巴-GFP溶瘤细胞治疗并不能改善存活(27.5天中值存活期，对于Ad-hDCT+MG1-GFP组，图4)。然而，用马拉巴MG1-DCT疫苗加强抗肿瘤免疫力显著改善了肿瘤结果，相比于仅用Ad-hDCT初免的动物，其中值存活期延长了20天。(51天，对于Ad-hDCT+MG1-hDCT组，图4)。更重要的是，溶瘤细胞MG1-hDCT加强剂治疗导致了23.3％的长期存活(图4)。
为了表征肿瘤特异性CD4+和CD8+T-细胞应答在治疗效力方面的各自贡献，每一种T-细胞小室被选择性耗尽(数据未示出)。在加强的时候CD8+T-细胞群的耗尽消除了MG1-hDCT施用的治疗益处。相对而言，CD4+T-细胞耗尽显现出并不显著影响治疗效力，这表明CD8+T细胞的马拉巴免疫加强是CD4+依赖性的。尽管承认CD8+T-细胞在对照肿瘤生长中的关键作用，但这些结果示出了用马拉巴疫苗加强肿瘤-特异性CD8+T-细胞是改善癌症治疗的强有力方式。
最后，还在非常具有挑战性的转移性黑素瘤脑癌的颅内B16-F10模型中评价了涉及马拉巴疫苗的初免-加强策略的效力。Ad-hDCT-介导的免疫治疗显著改善了黑素瘤脑转移-荷瘤小鼠的存活，其中值存活期从Ad-空白对照的15天延长至Ad-hDCT组的25.5(图5)。如先前所报道的，这样的治疗效力证明了肿瘤特异性效应子T-细胞跨越血脑屏障并渗透肿瘤床的能力(BridleBW.等人,(2010)MolTher184:4269-4275)。另外施用马拉巴MG1-hDCT溶瘤细胞加强剂进一步改善了肿瘤转归(tumoroutcome)，其中接受治疗的动物的值存活期达到42天并且观察到21.4％的治愈率(Ad-hDCT+MG1-hDCT组，图5)。
实施例3：诱导抗mPLAC1T细胞应答的疫苗策略的失败：
利用hDCT作为抗原相关的抗原，尽管马拉巴MG1和VSV能够起到加强免疫载体的作用，但并不是所有的抗原相关的抗原都能够用于异种免疫加强疫苗策略中。本文的作者利用huAd5-mPLAC1作为初免载体以及利用VSV-mPLAC1作为加强免疫载体测试了异种免疫加强疫苗策略。
PLAC1是一种最近描述的在胎盘中表达的抗原相关的抗原，但其也已被报道在若干种肿瘤细胞系中和患者乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌和结肠癌的肿瘤中(Silva,WA等人,(2007)CancerImmun7:18)。
Ad-mPLAC1是人血清型5的复制缺陷型腺病毒(E1/E3-缺失)(LaneC.等人,(2004)CancerResearch64:1509-1514；NgP.等人,(2001)MolTher3:809-815)。该复制缺陷型腺病毒载体被工程化改造为表达mPLACI转基因，其编码全长鼠抗原PLAC1(胎盘-特异性1)，所得的腺病毒载体被称为"Ad-mPLAd"或"huAd5-mPLACr"。
VSV病毒被工程化改造为表达黑素瘤-相关抗原mPLACI转基因的人类形式。所得的VSV病毒载体被称为"VSV-mPLACI"。通过在G和L病毒基因之间插入转基因来产生重组VSV。VSV-mPLAC1来源于VSV的野生型Indiana株(BridleBW.等人(2009)17:1814-1821；LawsonND.等人,(1995)ProcNatlAcadSciUSA92:4477-4481)。
用Ad-mPLAC1(2×109PFUIM注射)对C57BI/6小鼠进行初免，然后在14天后用单一i.v.剂量的VSV-mPLAC1(2×109PFU)对其进行加强免疫。通过分离脾细胞并用单独的15mmer肽来测量T-细胞应答，该肽形成重叠PLAC1肽文库持续总共6小时并向该刺激中加入添加golgiplug1小时。在刺激之后，针对CD4、CD8和IFNy对脾细胞进行染色并在FACSCanto和FlowJo上进行分析。在通过流式细胞术针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)之后，检测响应T-细胞。在CD8或CD4T细胞中，mPLAC1肽均不能刺激IFN-γ产生。
实施例4：具有MAGEA3或其变体的溶瘤疫苗载体的构建：
Ad-MAGEA3是基于人血清型5的复制缺陷型腺病毒(E1/E3-缺失)(LaneC.等人,(2004)CancerResearch64:1509-1514；NgP.等人,(2001)MolTher3:809-815)，其含有全长人MAGEA3基因。已经开发了马拉巴MG1-hMAGEA3，并且其含有插入到马拉巴病毒的MG1双重突变体的G和L病毒基因之间的密码子优化的全长人MAGEA3基因(BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449)。MAGEA3序列(NCBIGeneID:4102http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4102)对于在哺乳动物细胞中表达以及之后用FLAG标签在3'端并用Mlul限制性位点在3'和5'端合成是密码子优化的。在Mlul位点(位于G和L基因之间)处将该序列连接到穿梭载体pMRB-MG1/pNF，其从G开始到L基因的末端含有部分的马拉巴-MG1基因组，分别侧接有Kpnl和Nhel位点。然后从pMRB-MG1/pNF除去从Kpnl至Nhel的整个区域(现在在G和L之间含有MAGEA3Flag)并且利用Kpnl和Nhel位点再连接回pMRB-G1基因组质粒。然后拯救马拉巴-MG1-MAGEA3Flag并进行蚀斑纯化。这在图6中示出。
由腺病毒表达的全长人MAGEA3蛋白可以包括SEQIDNO:1的氨基酸序列。该腺病毒可以包括SEQIDNO:2的核苷酸序列。可替代地，氨基酸序列可由包括SEQIDNO:3的核苷酸序列的密码子优化的转基因编码。因此，该腺病毒可以包括SEQIDNO:3的密码子优化的核苷酸序列。
马拉巴MG1病毒可以包括SEQIDNO:2的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。可替代地，该氨基酸序列可由包括SEQIDNO:3的核苷酸序列的密码子优化的转基因编码。因此，该马拉巴MG1病毒可以包括SEQIDNO:3的密码子优化的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
MAGEA3的异种变体是包括SEQIDNO:4的氨基酸序列蛋白。这种氨基酸序列可由SEQIDNO:5的核苷酸序列编码。腺病毒可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列。马拉巴MG1病毒可以包括SEQIDNO:5的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
表达SEQIDNO:4的蛋白的反义RNA病毒(例如马拉巴病毒)可以包括包含SEQIDNO:6的反向互补和RNA形式的序列的RNA多核苷酸。
实施例5：健康灵长动物中的MG1-MAGEA3疫苗免疫应答：
健康食蟹猴用于研究，该研究被设计为收集毒性和免疫原性数据以用于开发潜在的人用MG1-MAGEA3溶瘤疫苗。使用食蟹猴使得鉴定与在人类中使用时所期望的在数量和质量上相似的应答的可能性最大。在开始研究之前，从动物到达时起使灵长动物适应环境4-6周，直至接受血管介入端口移植手术(vascularaccessportimplantationsurgery)时为止。在最少2-3周后，用非复制腺病毒Ad-MAGEA3初免载体对动物进行免疫，通过缓慢IM注射向每条腿注射0.5ml/剂量，总共1×1010pfu。对于Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3初免加强研究，Ad-MAGEA3初免发生在MG1-MAGEA3加强的2周(-14天)或4周(-28天)之前。因此，Ad-MAGEA3施用发生在第14天或第28天，而MG1-MAGEA3加强发生在第0天和第3天。Ad-MAGEA3剂量水平的基础理论来自于文献，并且来自于先前试验，该试验证明了在猕猴(和人中)1×1010pfu的剂量是安全剂量而没有观察到毒性(Bett等人，Vaccine,2010)。对于2周加强组中的动物，在试验的第0天和第3天(Ad-MAGEA3之后的14天和17天)以1×1010的低剂量或以1×1011的高剂量i.v.注射MG1-MAGEA3病毒。对于4周加强组中的动物，在试验的第0天和第3天(Ad-MAGEA3之后的28天和31天)以1×1010的低剂量或以1×1011的高剂量i.v.注射MG1-MAGEA3病毒。通过血管介入端口在30分钟内将加强病毒浸于30ml无菌缓冲盐水中(pH7.5)。MG1-MAGEA3低剂量水平的基本原理来自于先前的临床研究，其证明了鼠最大耐受剂量为1×109。相对体表面积扩大至猕猴规模相当于3.5×1010总pfu。MG1-MAGEA3高剂量水平的基本原理来自于中试非人灵长动物(NHP)毒性研究，其中在2×1011pfu的剂量水平下没有观察到毒性。初免加强研究中的动物早期(第14天)或晚期(第84天)被处死。对于Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3初免加强研究，在5个离散的时间点从所有动物取得血液样品。对于2周异种免疫加强组中的动物，在任何免疫之前并且在第-14天(基线)之前，和试验第5、13、和84天收集血液样品。对于4周异种免疫加强组中的动物，在任何免疫之前并且在第-28天(基线)之前，和试验第5、13、和84天收集血液样品。
为了评价灵长动物中对用Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3进行的异种免疫加强的免疫应答，用一组10个10hMAGE-A3肽将外周血单核细胞(PBMCs)培养4小时(至少3小时在布雷非德菌素A的存在下)以用于T-细胞(再)刺激(或剩余未刺激的以用于背景的评价)。肽来源于重叠肽文库，其87个肽中(每个15-mer)将整个hMAGE-A3抗原从N-末端转化为C-末端。在刺激之后，用荧光抗-CD8和抗CD-4抗体对T细胞进行染色25分钟。在该表面染色之后，对细胞进行透化处理并用BDCytofix/Cytoperm固定20分钟。然后，通过用荧光抗-IFNy和抗-TNFa抗体染色25分钟寻找细胞因子表达来检测hMAGE-A3-特异性T-细胞。在BDCanto流式细胞仪上进行细胞分析。
图7示出了在Ad-MAGEA3初免之后给予高剂量和低剂量MG1-MAGEA3作为加强免疫载体之后的猴子的平均CD8+T-细胞免疫应答。在低剂量MG1-MAGEA3动物中，在加强免疫后的5天存在显著增加的CD8+T-细胞应答，其随时间而减弱，而在高剂量的MG1-MAGEA3动物中，在加强免疫后的5天存在类似显著增加的CD8+T-细胞应答，其随时间以高水平持续。图8示出了研究中所有动物在用MG1-MAGEA3加强免疫后的5天表现出显著增加的CD8+T-细胞应答，这与高剂量或低剂量无关。在灵长动物中的这些峰值T-细胞应答证明了在远交群中初免-加强溶瘤疫苗策略得到了相当于其中肿瘤能够异种移植的动物模型中的免疫应答，并且获得了显著延长的生存期。
实施例6：表达人乳头瘤病毒E6/E7融合蛋白的慢病毒初免载体和溶瘤疫苗载体的构建和免疫测定：
HPV转基因HPV血清型16全长野生型E6(gi/4927720/gb/AAD33252.1/AF125673_1E6人乳突淋瘤病毒16型)和E7(gi/4927721/gb/AAD33253.1/AF125673_2E7人乳突淋瘤病毒16型)序列与HPV血清型18全长野生型E6(gi/137758/sp/P06463.1/VE6_HPV18RecName:Full＝ProteinE6)和E7(gi/137792/sp/P06788.2/VE7_HPV18RecName:Full＝ProteinE7)序列的融合体，这全部4个核苷酸序列中均具有针对Rb或p53结合的锌指结构缺失(除去该蛋白的致癌潜能)。所得的融合蛋白具有柔性甘氨酸接头+AAY序列(其起到蛋白酶体切割位点的作用以确保每一抗原被蛋白水解降解为用于抗原呈递正常产生的肽)。这种密码子优化的融合核苷酸序列产生了527个氨基酸的HPV16/18E6/E7融合蛋白(SEQIDNO:7)。
利用pDY.EG.WS慢病毒载体来制备表达人乳头瘤病毒E6/E7融合体转基因的慢病毒。利用含有EcoRI限制性位点的引物(正向引物ACTGGAATTCATGCATCAGAAGCGAACTGC,SEQIDNO:18)和含有BamHI限制性位点的引物(反向引物ACTGGGATCCTCACTGCTGGGAGGCACAC,SEQIDNO:19)对该经修饰的HPV转基因进行PCR扩增。该HPV转基因PCR产物经琼脂糖凝胶纯化。在EcoRI和BamHI位点处切割pDY.EG.WS慢病毒载体以除去eGFP，经琼脂糖凝胶纯化，并利用CIAP(InvitrogenCatalogue18009-019)进行脱磷酸化。然后使切割载体再经历琼脂糖凝胶纯化。然后利用T4DNA连接酶(Invitrogen)将该HPV转基因PCR产物连接至EcoRI/BamHI切割载体。利用感受态细胞使该连接反应经历转化，并且使来自阳性菌落的质粒DNA经历mini-prep扩增。然后使表达经修饰的HPV转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体经历maxi-prep扩增。在三个质粒中的每一个转染6.4μg之后，在293T细胞上拯救表达人乳头瘤病毒E6/E7融合体转基因的慢病毒：表达经修饰的HPV转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体、包装pCMV-8.84质粒和被膜pMD2G质粒。在16℃收集病毒上清，并通过0.45μΜ过滤器进行过滤然后以50,000xg离心120分钟。将表达人乳头瘤病毒E6/E7融合体转基因的慢病毒重悬于PBS中，并在-80℃下储存。
马拉巴MG1被工程化改造为插入到在马拉巴病毒的MG1双重突变体的G和L病毒基因之间的含有乳突淋瘤病毒E6/E7融合体转基因(BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449)。该转基因序列(SEQIDNO:8)在哺乳动物细胞中表达方面是密码子优化的。所得的含有HPVE6/E7的马拉巴通常被命名为"马拉巴-MG1-HPVE6/E7"。经修饰的马拉巴MG1骨架用于促进克隆。向马拉巴MG1基因组骨架的L基因中引入沉默突变以除去多个Mlul位点之一。在G和L之间的克隆区域处用BsiWI位点代替第二Mlul位点。对于马拉巴MG1基因组骨架的这些修饰使得能够获得比Brun等人的沦为中所描述的更好的定向克隆系统，因为其避免了使用穿梭质粒pMRB-MG1/pNF。在其Mlul位点和BsiWI位点处将该HPVE6/E7融合的转基因序列连接于经修饰的马拉巴MG1基因组骨架(在G和L之间的克隆区处)。然后拯救马拉巴-MG1-HPVE6/E7(如先前在Brun等人,(2010)MolTher18:1440-1449)中所描述的，蚀斑纯化一次，并经历opti-prep纯化)。马拉巴-MG1-HPVE6/E7具有SEQIDNO:9的反向互补和RNA形式的基因组序列。
通常，在第0天通过施用初免载体(慢病毒-HPVE6/E7+polyI:C作为佐剂)并且在第14天通过施用1e9PFU的加强免疫载体(马拉巴-MG1-HPVE6/E7)对动物进行免疫。用编码GFP的病毒载体代替HPVE6/E7转基因作为对照非-免疫原性转基因插入对对照动物进行初免-加强。在第14天进行初次应答的分析，并在第19天进行加强应答的分析。每一慢病毒-HPVE6/E7制备是通过向初免病毒加入作为佐剂的250ugpolyI:C进行的，并且然后针对每一病毒将5只动物分开。用异氟烷麻醉小鼠并将30uL的慢病毒-HPVE6/E7/polyI:C注射到其每一后足垫中。将剩余的病毒皮下注射到左侧腹股沟淋巴结附近。初免14天后，收集血液并通过流式细胞术进行分析。然后用静脉内施用1×109PFUMG1-HPVE6/E7对小鼠进行加强免疫。加强免疫5天后，采血并通过流式细胞术进行评价。
如下进行免疫分析：利用肝素化红细胞压积毛细管经由眼眶采血(retro-orbitalbleeding)收集血液并将血液收集到肝素中。然后用ACK裂解缓冲液裂解血红细胞并将所得的PBMC用于针对肿瘤抗原的免疫应答分析。在不存在肽的条件下培养PBMC或用2ug/mL肽(RAHYNIVTF)刺激PBMC总共5小时并向该刺激中加入添加golgiplug1小时。在刺激之后，针对CD4、CD8和IFNy对PBMC进行染色并在FACSCanto和FlowJo上进行分析。在通过流式细胞术针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)之后，检测响应T-细胞。将来自未刺激的PBMC的值看作背景，并将其从由经刺激的PBMC获得的值扣除。数据代表平均+/-SEM。表1中证明了HPVE6/E7肽能够在CD8细胞中刺激IFN-γ产生，这表明存在免疫应答。
表1.对HPVE6/E7初免-加强的免疫应答
实施例7：表达癌睾丸抗原1的慢病毒初免载体和溶瘤疫苗载体的构建和免疫测定：
NYES01转基因为密码子优化的全长野生型序列(SEQIDNO:14)以用于在人和小鼠中表达以产生180个氨基酸蛋白(SEQIDNO:13)。
利用pDY.EG.WS慢病毒载体来制备表达癌睾丸抗原1转基因的慢病毒。利用含有BamHI限制性位点(正向引物ACTGGGATCCATGCAGGCCGAGGGCAGAG,SEQIDNO:20)和BamHI限制性位点(反向引物ACTGGGATCCTCATCTTCTCTGGCCGCTGG,SEQIDNO:21)的引物来PCR扩增该NYES01转基因。该NYES01转基因PCR产物经琼脂糖凝胶纯化。在BamHI位点处理切割该pDY.EG.WS慢病毒载体以除去eGFP，经琼脂糖凝胶纯化，并利用CIAP(InvitrogenCatalogue18009-019)进行脱磷酸化。然后使切割载体再经历琼脂糖凝胶纯化。然后利用T4DNA连接酶(Invitrogen)将该NYES01转基因PCR产物连接至BamHI切割载体。利用感受态细胞使该连接反应经历转化，并且使来自阳性菌落的质粒DNA经历mini-prep扩增。然后使表达经修饰的HPV转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体经历maxi-prep扩增。在三个质粒中的每一个转染6.4μg之后，在293T细胞上拯救表达NYES01转基因的慢病毒：表达NYES01转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体、包装pCMV-8.84质粒和被膜pMD2G质粒。在16℃收集病毒上清，并通过0.45μΜ过滤器进行过滤然后以50,000xg离心120分钟。将表达NYES01转基因的慢病毒重悬于PBS中，并在-80℃下储存。
马拉巴MG1被工程化改造为含有插入到马拉巴病毒的MG1双重突变体的G和L病毒基因之间的癌睾丸抗原1转基因(BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449)。该转基因序列对于在哺乳动物细胞中的表达是密码子优化的。所得的含有NYES01蛋白的马拉巴MG1被命名为"马拉巴-MG1-NYES01"或"MG1-NYES01"。
在其Mlul位点(G和L基因之间)处将该NYES01转基因连接于穿梭载体pMRB-MG1/pNF，其从G开始到L基因的末端含有部分的马拉巴-MG1基因组，分别侧接有Kpnl和Nhel位点。然后从pMRB-MG1/pNF除去从Kpnl至Nhel的整个区域(现在含有插入到G和L之间的NYES01转基因)并且利用Kpnl和Nhel位点再连接回pMRB-MG1基因组质粒。然后拯救马拉巴-MG1-NYES01(如BrunJ.等人先前所述的,(2010)MolTher18:1440-1449)。该马拉巴-MG1-NYES01被蚀斑纯化3次，并经由蔗糖缓冲纯化进行纯化。该马拉巴-MG1-NYES01病毒具有SEQIDNO:15的反向互补和RNA形式的基因组序列。
通常，在第0天通过施用初免载体(慢病毒-NYESOI+polyI:C作为佐剂)并且在第14天通过施用1e9PFU的加强免疫载体(马拉巴-MG1-NYES01)对动物进行免疫。用编码GFP的病毒载体代替NYES01转基因作为对照非-免疫原性转基因插入对对照动物进行初免-加强。在第14天和第19天进行初次应答的分析。每一慢病毒-NYESOI制备是通过向初免病毒加入作为佐剂的250ugpolyI:C进行的，并且然后针对每一病毒将5只动物分开。用异氟烷麻醉小鼠并将30uL的慢病毒-NYESOI/polyI:C注射到其每一后足垫中。将剩余的病毒皮下注射到左侧腹股沟淋巴结附近。初免14天后，收集血液并通过流式细胞术进行分析。然后用静脉内施用1×109PFUMG1-NYESO1对小鼠进行加强免疫。加强免疫5天后，采血并通过流式细胞术进行评价。
如下进行免疫分析：利用肝素化红细胞压积毛细管经由眼眶采血(retro-orbitalbleeding)收集血液并将血液收集到肝素中。然后用ACK裂解缓冲液裂解血红细胞并将所得的PBMC用于针对肿瘤抗原的免疫应答分析。在不存在肽的条件下培养PBMC或用2ug/mL肽(RGPESRLL)刺激PBMC总共5小时并向该刺激中加入添加golgiplug1小时。在刺激之后，针对CD4、CD8和IFNy对PBMC进行染色并在FACSCanto和FlowJo上进行分析。在通过流式细胞术针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)之后，检测响应T-细胞。将来自未刺激的PBMC的值看作背景，并将其从由经刺激的PBMC获得的值扣除。数据代表平均+/-SEM。表2中证明了NYESO1肽能够在CD8细胞中刺激IFN-γ产生，这表明存在免疫应答。
表2.对NYES01初免-加强的免疫应答
实施例8：表达前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原的慢病毒初免载体和溶瘤疫苗载体的构建和免疫测定：
huSTEAP转基因是密码子优化的全长野生型序列(SEQIDNO:11)以用于在人和小鼠中表达以产生341个氨基酸的蛋白(SEQIDNO:10)。
利用pDY.EG.WS慢病毒载体来制备表达前列腺蛋白的人6次跨膜上皮抗原的慢病毒。利用含有EcoRI限制性位点的引物(正向引物ACTGGAATTCATGGAATCACGGAAGGACATC,SEQIDNO:22)和BamHI限制性位点(反向引物ACTGGGATCCTTAAAGCTTCAGCTGGCTACAG,SEQIDNO:23)对该huSTEAP转基因进行PCR扩增。该huSTEAP转基因PCR产物经琼脂糖凝胶纯化。在EcoRI和BamHI位点处切割pDY.EG.WS慢病毒载体以除去eGFP，经琼脂糖凝胶纯化，并利用CIAP(InvitrogenCatalogue18009-019)进行脱磷酸化。然后使切割载体再经历琼脂糖凝胶纯化。然后利用T4DNA连接酶(Invitrogen)将该huSTEAP转基因PCR产物连接至EcoRI/BamHI切割载体。利用感受态细胞使该连接反应经历转化，并且使来自阳性菌落的质粒DNA经历mini-prep扩增。然后使表达经修饰的huSTEAP转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体经历maxi-prep扩增。在三个质粒中的每一个转染6.4μg之后，在293T细胞上拯救表达huSTEAP转基因的慢病毒：表达经修饰的huSTEAP转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体、包装pCMV-8.84质粒和被膜pMD2G质粒。在16℃收集病毒上清，并通过0.45μΜ过滤器进行过滤然后以50,000xg离心120分钟。将表达huSTEAP转基因的慢病毒重悬于PBS中，并在-80℃下储存。
马拉巴MG1被工程化改造为插入到在马拉巴病毒的MG1双重突变体的G和L病毒基因之间的含有前列腺的人6次跨膜上皮抗原转基因(BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449)。该转基因序列在哺乳动物细胞中表达方面是密码子优化的。所得的含有huSTEAP蛋白的马拉巴通常被命名为"马拉巴-MG1-huSTEAP"或"MG1-huSTEAP"。经修饰的马拉巴MG1骨架用于促进克隆。向马拉巴MG1基因组骨架的L基因中引入沉默突变以除去多个Mlul位点之一。在G和L之间的克隆区域处用BsiWI位点代替第二Mlul位点。对于马拉巴MG1基因组骨架的这些修饰使得能够获得比Brun等人的论文中所描述的更好的定向克隆系统，因为其避免了使用穿梭质粒pMRB-MG1/pNF。在其Mlul位点和BsiWI位点处将该huSTEAP转基因序列连接于经修饰的马拉巴MG1基因组骨架(在G和L之间的克隆区处)。然后拯救马拉巴-MG1-huSTEAP(如先前在Brun等人,(2010)MolTher18:1440-1449)中所描述的，蚀斑纯化一次，并经历opti-prep纯化。马拉巴-MG1-huSTEAP具有SEQIDNO:12的反向互补和RNA形式的基因组序列。
通常，在第0天通过施用初免载体(慢病毒-huSTEAP+polyI:C作为佐剂)并且在第14天通过施用1e9PFU的加强免疫载体(马拉巴-MG1-huSTEAP)对动物进行免疫。用编码GFP的病毒载体代替huSTEAP转基因作为对照非-免疫原性转基因插入对对照动物进行初免-加强。在第14天和第19天进行初次应答的分析。每一慢病毒-huSTEAP群制备是通过向初免病毒加入作为佐剂的250ugpolyI:C进行的，并且然后针对每一病毒将5只动物分开。用异氟烷麻醉小鼠并将30uL的慢病毒-huSTEAP/polyI:C注射到其每一后足垫中。将剩余的病毒皮下注射到左侧腹股沟淋巴结附近。初免14天后，收集血液并通过流式细胞术进行分析。然后用静脉内施用1×109PFUMG1-huSTEAP对小鼠进行加强免疫。加强免疫5天后，采血并通过流式细胞术进行评价。
如下进行免疫分析：利用肝素化红细胞压积毛细管经由眼眶采血收集血液并将血液收集到肝素中。然后用ACK裂解缓冲液裂解血红细胞并将所得的PBMC用于针对肿瘤抗原的免疫应答分析。在不存在肽的条件下培养PBMC或用2ug/mL肽(RSRYKLL)刺激PBMC总共5小时并向该刺激中加入添加golgiplug1小时。在刺激之后，针对CD4、CD8和IFNy对PBMC进行染色并在FACSCanto和FlowJo上进行分析。在通过流式细胞术针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)之后，检测响应T-细胞。将来自未刺激的PBMC的值看作背景，并将其从由经刺激的PBMC获得的值扣除。数据代表平均+/-SEM。表3中证明了huSTEAP肽能够在CD8细胞中刺激IFN-γ产生，这表明存在免疫应答。
表3.对huSTEAP初免-加强的免疫应答
实施例9：表达Epstein-Barr核抗原1的慢病毒初免载体和溶瘤疫苗载体的构建和免疫测定：
EBDNA1转基因是全长野生型EBDNA1(http://www.ncbi.nlm.nih.ov/protein/Q1HVF7.1)的部分核苷酸序列，其具有产生甘氨酸-丙氨酸重复序列缺失(其将蛋白分隔成氨基端和羧基端结构域)。该序列似乎使蛋白稳定化，防止蛋白酶体破坏，以及削弱抗原加工和1类MHC-限制性抗原提呈(LevitskayaJ等人,(1995)Nature375:685-688)。该截短的EBDNA1核苷酸序列(SEQIDNO:17)是密码子优化的以用于在人和小鼠中表达以产生238个氨基酸的蛋白(SEQIDNO:16)。
利用pDY.EG.WS慢病毒载体来制备表达Epstein-Barr核抗原1蛋白的慢病毒。利用含有EcoRI限制性位点的引物(正向引物ACTGGAATTCATGCCAGTCGGCCAGGCTG,SEQIDNO:24)和BamHI限制性位点(反向引物ACTGGGATCCTTATTCCTGCCCCTCTTCTCC,SEQIDNO:25)对经修饰的EBDNA1转基因进行PCR扩增。EBDNA1转基因PCR产物经历琼脂糖凝胶纯化。在EcoRI和BamHI位点处切割pDY.EG.WS慢病毒载体以除去eGFP，经琼脂糖凝胶纯化，并利用CIAP(InvitrogenCatalogue18009-019)进行脱磷酸化。然后使切割载体再经历琼脂糖凝胶纯化。然后利用T4DNA连接酶(Invitrogen)将该EBDNA1转基因PCR产物连接至EcoRI/BamHI切割载体。利用感受态细胞使该连接反应经历转化，并且使来自阳性菌落的质粒DNA经历mini-prep扩增。然后使表达经修饰的EBDNA1转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体经历maxi-prep扩增。在三个质粒中的每一个转染6.4μg之后，在293T细胞上拯救表达EBDNA1转基因的慢病毒：表达EBDNA1转基因的pDY.EG.WS慢病毒载体、包装pCMV-8.84质粒和被膜pMD2G质粒，在293T细胞上拯救表达EBDNA1转基因的慢病毒。在16℃收集病毒上清，并通过0.45μΜ过滤器进行过滤然后以50,000xg离心120分钟。将表达EBDNA1转基因的慢病毒重悬于PBS中，并在-80℃下储存。
将马拉巴MG1工程化改造以含有在马拉巴病毒的MG1双重突变体的G和L病毒基因之间插入的Epstein-Barr核抗原1转基因(BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449)。该转基因序列针对在哺乳动物细胞中表达是密码子优化的。所得的含有EBVDNA1的马拉巴MG1被称作"马拉巴-MG1-EBVDNA1"或"MG1-EDVDNA1"。经修饰的马拉巴MG1骨架被用于促进克隆。将沉默突变引入到马拉巴MG1基因组骨架的L基因中，以除去Mlul位点之一。在G和L之间的克隆区域处用BsiWI位点代替第二Mlul位点。对马拉巴MG1基因组骨架的这些修饰使得能够获得相比于Brun等人论文中所述的更加直接的克隆体系，因为其避免使用穿梭质粒pMRB-MG1/pNF。在Mlul和BsiWI位点处(在G和L之间的克隆区域处)将EBDNA1转基因序列连接到经修饰的马拉巴MG1基因组骨架中。然后拯救马拉巴-MG1-EBDNA1转基因(如BrunJ.等人,(2010)MolTher18:1440-1449之前所述的)，蚀斑纯化一次，并经历opti-prep纯化。
通常，在第0天通过给予初免载体(慢病毒-EBDNAI+polyI:C作为佐剂)，并且在第14天通过给予1e9PFU的加强免疫载体(马拉巴-MG1-EBDNA1)对动物进行免疫。用编码GFP的病毒载体代替TAA转基因作为对照非-免疫原性转基因插入对对照动物进行初免-加强。在第14天和第19天进行初次应答的分析。每一慢病毒-EBDNAI群制备是通过向初免病毒加入作为佐剂的250ugpolyI:C进行的，并且然后针对每一病毒将5只动物分开。用异氟烷麻醉小鼠并将30uL的慢病毒-EBDNAI/polyI:C注射到其每一后足垫中。将剩余的病毒皮下注射到左侧腹股沟淋巴结附近。初免14天后，收集血液并通过流式细胞术进行分析。然后用静脉内施用1×109PFUMG1-EBVDNA1对小鼠进行加强免疫。加强免疫5天后，采血并通过流式细胞术进行评价。
如下进行免疫分析：利用肝素化红细胞压积毛细管经由眼眶采血收集血液并将血液收集到肝素中。然后用ACK裂解缓冲液裂解血红细胞并将所得的PBMC用于针对肿瘤抗原的免疫应答分析。在不存在肽的条件下培养PBMC或用2ug/mL肽(VYGGSKTSL)刺激PBMC总共5小时并向该刺激中加入添加golgiplug1小时。在刺激之后，针对CD4、CD8和IFNy对PBMC进行染色并在FACSCanto和FlowJo上进行分析。在通过流式细胞术针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)之后，检测响应T-细胞。将来自未刺激的PBMC的值看作背景，并将其从由经刺激的PBMC获得的值扣除。数据代表平均+/-SEM。表4中证明了EBVDNA1肽能够在CD8细胞中刺激IFN-γ产生，这表明存在免疫应答。
表4.对EBVDNA1初免-加强的免疫应答
实施例10：环磷酰胺对腺病毒-OV疫苗初免-加强策略的影响：
环磷酰胺(CPA)是用于治疗多种类型癌症的化疗剂。对于有效的化疗，需要高剂量的这种药物。高剂量的CPA被认为会导致免疫抑制，而低剂量的该药物能够导致针对多种抗原的增强免疫应答。出人意料的是，在本文披露的异种免疫加强策略中，CPA仅在通过第一病毒技能型的免疫系统的初免之前施用时会导致免疫应答增加。
为了产生肺转移，在第0天向C57BI/6小鼠(在研究开始时8-10周龄)i.v.注射施用EBVDNA1盐水中的2.5×105B16-F10细胞(表达鼠DCT抗原的鼠黑素瘤细胞)。在B16-F10异种移植五天后，小鼠接受Ad-hDCT初免疫苗(2×108pfu在200μlPBS中，i.m.)并且在接下来的14天后接受单次i.v.剂量的VSV-hDCT(2×109pfu在200μlPBS中，i.v.)作为溶瘤细胞加强剂疫苗。另外，小鼠在初免之前那天(-1)和/或加强免疫之前的第13天接受运载体或CPA(1mg/20g小鼠，i.p.)。在图9中能够看出在初免载体之前给予CAP显著增加生存期，而在加强免疫载体之前施用CPA则不会延长生存期(数据未示出)。
在前文的说明中，出于解释说明的目的，列出了大量的细节以提供实施例的全面理解。上述实施例仅仅是意在举例说明。本领域技术人员能够对特定的实施例进行改变、修改和变化，而不会背离本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
附录A–蛋白质和核苷酸序列
野生型人MAGEA3的全长蛋白质序列(SEQIDNO:1)：
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE＊
编码全长野生型人MAGEA3的DNA序列(SEQIDNO:2)：
ATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAGCACTGCAAGCCTGAAGAAGGCCTTGAGGCCCGAGGAGAGGCCCTGGGCCTGGTGGGTGCGCAGGCTCCTGCTACTGAGGAGCAGGAGGCTGCCTCCTCCTCTTCTACTCTAGTTGAAGTCACCCTGGGGGAGGTGCCTGCTGCCGAGTCACCAGATCCTCCCCAGAGTCCTCAGGGAGCCTCCAGCCTCCCCACTACCATGAACTACCCTCTCTGGAGCCAATCCTATGAGGACTCCAGCAACCAAGAAGAGGAGGGGCCAAGCACCTTCCCTGACCTGGAGTCCGAGTTCCAAGCAGCACTCAGTAGGAAGGTGGCCGAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCTGGGGAGTGTCGTCGGAAATTGGCAGTATTTCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTCCAGTTCCTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGCCACTTGTACATCTTTGCCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGTGACAATCAGATCATGCCCAAGGCAGGCCTCCTGATAATCGTCCTGGCCATAATCGCAAGAGAGGGCGACTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTGTGTTAGAGGTGTTTGAGGGGAGGGAAGACAGTATCTTGGGGGATCCCAAGAAGCTGCTCACCCAACATTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTCCCCGGCAGTGATCCTGCATGTTATGAATTCCTGTGGGGTCCAAGGGCCCTCGTTGAAACCAGCTATGTGAAAGTCCTGCACCATATGGTAAAGATCAGTGGAGGACCTCACATTTCCTACCCACCCCTGCATGAGTGGGTTTTGAGAGAGGGGGAAGAGTGA
编码全长野生型人MAGEA3蛋白的密码子优化的DNA序列(SEQIDNO:3)：
ATGCCCCTGGAGCAGCGGTCTCAGCATTGCAAGCCAGAGGAGGGCCTCGAGGCGAGGGGCGAGGCCCTCGGCTTGGTGGGGGCGCAGGCTCCTGCAACCGAGGAGCAAGAGGCCGCATCCAGTTCCTCTACCCTGGTTGAGGTGACCTTGGGTGAGGTGCCCGCCGCGGAGAGCCCCGACCCGCCTCAAAGCCCCCAGGGTGCCAGCTCCCTGCCCACAACAATGAACTACCCACTCTGGAGTCAGTCTTACGAGGACAGTAGTAACCAAGAGGAGGAGGGACCCTCCACATTCCCAGACCTGGAGTCTGAATTCCAGGCAGCATTGTCTAGAAAAGTGGCCGAATTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTATCGCGCCCGCGAGCCAGTCACAAAAGCTGAAATGCTGGGTTCTGTCGTGGGAAATTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCAGTAAAGCGTCCAGCTCCTTGCAGCTGGTCTTTGGTATCGAGCTGATGGAGGTGGATCCCATCGGCCATCTGTATATCTTTGCCACATGCCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCAAAAGCTGGCCTGCTGATCATCGTTCTGGCTATCATCGCTAGAGAAGGAGATTGCGCCCCTGAAGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTCCTGGAAGTCTTTGAGGGTCGTGAAGACAGCATTCTCGGGGATCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAGAACTATCTGGAGTACCGCCAGGTTCCCGGCAGCGACCCCGCTTGCTACGAGTTCCTGTGGGGCCCCAGGGCCCTGGTCGAGACATCCTACGTGAAGGTCCTGCACCATATGGTTAAAATCAGCGGCGGCCCCCATATCTCTTATCCGCCGCTCCACGAGTGGGTGCTCCGGGAGGGAGAGGAG
全长野生型人MAGEA3的变体的蛋白质序列(SEQIDNO:4)：
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEVVVLREGEEDYKDDDDK*
编码全长野生型人MAGEA3的变体的DNA序列(SEQIDNO:5)：
ATGCCCCTGGAACAGCGGAGCCAGCACTGCAAGCCCGAGGAAGGCCTGGAAGCCAGAGGCGAAGCCCTGGGACTGGTGGGAGCCCAGGCCCCTGCCACAGAAGAACAGGAAGCCGCCAGCAGCAGCTCCACCCTGGTGGAAGTGACCCTGGGCGAAGTGCCTGCCGCCGAGAGCCCTGATCCCCCTCAGTCTCCTCAGGGCGCCAGCAGCCTGCCCACCACCATGAACTACCCCCTGTGGTCCCAGAGCTACGAGCACAGCAGCAACCAGGAAGAGGAAGGCCCCAGCACCTTCCCCGACCTGGAAAGCGAGTTCCAGGCCGCCCTGAGCCGGAAGGTGGCAGAGCTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTACAGAGCCCGCGAGCCCGTGACCAAGGCCGAGATGCTGGGCAGCGTGGTGGGAAACTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCTCCAAGGCCAGCAGCTCCCTGCAGCTGGTGTTCGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGCCACCTGTACATCTTCGCCACCTGTCTGGGCCTGAGCTACGACGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCCAAGGCCGGCCTGCTGATCATCGTGCTGGCCATCATTGCCCGCGAGGGCGACTGCGCCCCTGAGGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTGCTGGAAGTGTTCGAGGGCAGAGAGGACAGCATCCTGGGCGACCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAATACCGCCAGGTGCCCGGCAGCGACCCCGCCTGTTACGAGTTCCTGTGGGGCCCCAGGGCTCTGGTGGAAACCAGCTACGTGAAGGTGCTGCACCACATGGTGAAAATCAGCGGCGGACCCCACATCAGCTACCCCCCACTGCACGAGTGGGTGCTGAGAGAGGGCGAAGAGGACTACAAGGACGACGACGACAAATGA
HPVE6/E7融合蛋白的蛋白质序列(SEQIDNO:7)：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQ*
HPVE6/E7融合蛋白的DNA序列(SEQIDNO:8)：
ATGCATCAGAAGCGAACTGCTATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCGGCCACGCAAACTGCCTCAGCTGTGCACCGAACTGCAGACAACTATCCACGACATCATTCTGGAATGCGTGTACTGTAAGCAGCAGCTGCTGAGGAGAGAGGTCTATGACTTCGCTTTTCGCGATCTGTGCATCGTGTACCGAGACGGAAACCCATATGCAGTCGATAAGCTGAAGTTCTACAGCAAGATCTCCGAATACAGGCATTACTGTTACAGCGTGTACGGGACCACACTGGAGCAGCAGTATAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGAATTAATCAGAAGCCCCTGTGCCCTGAGGAAAAACAGAGGCACCTGGATAAGAAACAGAGATTTCATAACATCCGAGGACGATGGACCGGGCGGTGCATGTCCTGCTGTAGAAGCTCCCGGACTCGACGAGAGACCCAGCTGGGCGGAGGAGGAGGAGCAGCTTACATGGCACGATTCGAGGACCCTACCCGAAGGCCATATAAGCTGCCCGACCTGTGCACAGAACTGAATACTTCTCTGCAGGACATCGAGATTACATGCGTGTACTGTAAAACCGTCCTGGAGCTGACAGAAGTGTTCGAGTTTGCTTTCAAGGACCTGTTTGTGGTCTACCGGGATTCAATCCCTCACGCAGCCCATAAAATCGACTTCTACAGCAGGATCAGGGAACTGCGCCACTACTCCGACAGCGTGTACGGGGATACACTGGAGAAGCTGACAAACACTGGCCTGTACAATCTGCTGATCCGACTGCGACAGAAGCCACTGAACCCAGCCGAAAAACTGAGACACCTGAACGAGAAGAGACGGTTTCACAATATTGCAGGCCATTATAGGGGACAGTGCCATAGTTGCTGTAATCGAGCCAGGCAGGAAAGACTGCAGCGCCGAAGGGAGACTCAAGTCGGCGGAGGAGGAGGAGCTGCATACATGCACGGCGACACCCCCACACTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAGCCTGAGACTACCGACCTGTACCAGCTGAACGATTCTAGTGAGGAAGAGGACGAAATCGACGGACCAGCAGGACAGGCAGAGCCTGACCGGGCCCACTATAATATTGTGACATTCTGCTGTAAGTGCGATTCTACTCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGTACTCATGTCGACATCCGCACCCTGGAGGATCTGCTGATGGGGACTCTGGGCATCGTCCCAATTTGTAGCCAGAAACCAGGCGGCGGCGGCGGAGCAGCTTACATGCACGGACCCAAGGGTACCCTGCAGGACATCGTGCTGCATCTGGAACCTCAGAATGAGATTCCAGTCGACCTGCTGCAGCTGAGTGATTCAGAAGAGGAAAACGACGAGATCGACGGCGTGAATCACCAGCATCTGCCTGCTAGACGGGCAGAGCCACAGCGACACACAATGCTGTGCATGTGCTGTAAGTGTGAAGCCAGGATCAAGCTGGTGGTCGAGTCAAGCGCCGACGATCTGCGCGCCTTCCAGCAGCTGTTCCTGAATACTCTGTCATTTGTCCCTTGGTGTGCCTCCCAGCAGTGA
huSTEAP蛋白的蛋白质序列(SEQIDNO:10)：
MESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSELQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPMVSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTKYKKFPHWLDKWMLTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSLSYPMRRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVVVRMEIYVSLGIVGLAILALLAVTSIPSVSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFLPIVVLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQLKL＊
huSTEAP蛋白的DNA序列(SEQIDNO:11)：
ATGGAATCACGGAAGGACATCACTAATCAGGAGGAACTGTGGAAAATGAAGCCAAGAAGGAATCTGGAAGAGGACGACTATCTGCACAAGGACACCGGCGAAACAAGTATGCTGAAACGACCAGTGCTGCTGCACCTGCATCAGACTGCTCACGCAGACGAGTTTGATTGCCCCTCTGAACTGCAGCACACCCAGGAGCTGTTCCCACAGTGGCATGTGCCCATCAAGATTGCCGCTATCATTGCTTCACTGACATTTCTGTACACTCTGCTGAGAGAAGTGATCCACCCCCTGGCCACCAGCCATCAGCAGTACTTCTATAAGATCCCTATCCTGGTCATCAACAAGGTCCTGCGAATGGTGAGCATCACACTGCTGGCCCTGGTCTACCTGCCTGGAGTGATCGCAGCCATTGTCCAGCTGCACAATGGGACAAAGTATAAGAAATTTCCACATTGGCTGGATAAGTGGATGCTGACTAGGAAACAGTTCGGACTGCTGTCCTTCTTTTTCGCCGTGCTGCACGCTATCTACAGCCTGTCCTATCCCATGAGGAGGAGCTACCGGTATAAGCTGCTGAACTGGGCTTACCAGCAGGTGCAGCAGAACAAGGAGGACGCATGGATTGAACATGACGTGTGGCGCATGGAAATCTACGTGAGCCTGGGCATTGTCGGACTGGCCATCCTGGCTCTGCTGGCAGTGACCAGTATCCCTTCTGTCAGTGACTCACTGACATGGAGAGAGTTTCACTACATTCAGAGCAAGCTGGGGATCGTGTCCCTGCTGCTGGGCACCATCCATGCACTGATTTTTGCCTGGAACAAGTGGATCGATATCAAGCAGTTCGTGTGGTATACTCCCCCTACCTTTATGATTGCCGTCTTCCTGCCCATCGTGGTCCTGATCTTCAAGTCCATCCTGTTCCTGCCTTGTCTGCGGAAGAAAATCCTGAAAATTCGGCACGGATGGGAGGATGTCACCAAAATCAATAAGACTGAAATCTGTAGCCAGCTGAAGCTTTAA
NYESQ1MAR蛋白的蛋白质序列(SEQIDNO:13)：
MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR*
NYES01MAR的DNA序列(SEQIDNO:14)：
ATGCAGGCCGACGGCAGAGGCACAGGCGGATCTACAGGCGACGCCGATGGCCCTGGCGGCCCTGGAATTCCTGACGGACCTGGCGGCAATGCCGGCGGACCCGGAGAAGCTGGCGCCACAGGCGGAAGAGGACCTAGAGGCGCTGGCGCCGCTAGAGCTTCTGGACCAGGCGGAGGCGCCCCTAGAGGACCTCATGGCGGAGCCGCCTCCGGCCTGAACGGCTGTTGCAGATGTGGAGCCAGAGGCCCCGAGAGCCGGCTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCCTTCGCCACCCCCATGGAAGCCGAGCTGGCCAGACGGTCCCTGGCCCAGGATGCTCCTCCTCTGCCTGTGCCCGGCGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCCGGCTGACTGCCGCCGACCACAGACAGCTCCAGCTGTCTATCAGCTCCTGCCTGCAGCAGCTGAGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTCCTGGCTCAGCCCCCCAGCGGCCAGAGAAGATGA
EBDNA1的蛋白质序列(SEQIDNO:16)：
MPVGQADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNQKFENIADGLRTLLARCHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGISLAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFIVFLQTHIFAEGLKDAIKDLVMPKPAPTCNIKATVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE*
EBDNA1的DNA序列(SEQIDNO:17)：
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Claims (65)

1.用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在所述哺乳动物中产生对所述蛋白或其变体的免疫力；以及
马拉巴MG1病毒，其编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:1的蛋白或其变体，所述马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；
所述第一病毒与所述马拉巴MG1病毒免疫原性相异。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，由所述第一病毒表达的抗原蛋白和由所述马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白完全相同。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者被配制成用于作为分离的病毒施用。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中，
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式；
所述第一病毒为负链RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式；
所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因；或
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式，并且
a)所述第一病毒为负链RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式，或
b)所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:2的核苷酸序列的转基因。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中，
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式；
所述第一病毒为负链RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式；或
所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的转基因；或
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式，且
a)所述第一病毒为负链RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的转基因的反向互补和RNA形式，或
b)所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的转基因。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中，由所述第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者表达的所述蛋白的变体包括选自由FLWGPRALV、KVAELVHFL、EGDCAPEEK、KKLLTQHFVQENYLEY、RKVAELVHFLLLKYR和KKLLTQHFVQENYLEY组成的组中的至少一种肿瘤相关的表位，并且与SEQIDNO:1具有至少70％同一性。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:1具有至少80％同一性。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:1具有至少90％同一性。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:1具有至少95％同一性。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，由所述第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者表达的所述蛋白的变体具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。
11.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述蛋白的变体由SEQIDNO:5的核苷酸序列编码。
12.根据权利要求1-3和6-11中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒表达包含SEQIDNO:1的序列的蛋白的不同变体。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，
所述马拉巴MG1病毒包括SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，而所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括SEQIDNO:5的反向互补和RNA形式；
所述马拉巴MG1病毒包括SEQIDNO:5的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，而所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括SEQIDNO:2或3的反向互补和RNA形式；
所述马拉巴MG1病毒包括SEQIDNO:2或3的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，而所述第一病毒为DNA或RNA病毒并且包括SEQIDNO:5的序列；或
所述马拉巴MG1病毒包括SEQIDNO:5的核苷酸序列的反向互补和RNA形式，而所述第一病毒为DNA或RNA病毒并且包括SEQIDNO:2或3的序列。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒或所述第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:1或4的序列的蛋白，而所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含其他序列的蛋白。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一病毒为腺病毒。
16.分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其具有编码包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其变体的蛋白的基因组。
17.根据权利要求16所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的所述蛋白的变体的具有选自由FLWGPRALV、KVAELVHFL、EGDCAPEEK、KKLLTQHFVQENYLEY、RKVAELVHFLLLKYR和KKLLTQHFVQENYLEY组成的组中的至少一个肿瘤相关的表位，并且与SEQIDNO:1具有至少70％同一性。
18.根据权利要求17所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述变体与SEQIDNO:1具有至少80％同一性。
19.根据权利要求17所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述变体与SEQIDNO:1具有至少90％同一性。
20.根据权利要求17所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述变体与SEQIDNO:1具有至少95％同一性。
21.根据权利要求16所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的所述蛋白的变体具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。
22.根据权利要求16所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:2、3或5的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
23.根据权利要求16所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:6的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
24.用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在所述哺乳动物中产生对所述蛋白或其变体的免疫力；以及
马拉巴MG1病毒，其编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:7的蛋白或其变体，所述马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；
所述第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，由所述第一病毒表达的抗原蛋白和由所述马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白完全相同。
26.根据权利要求24或25所述的试剂盒，其中，所述第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者被配制成用于作为分离的病毒施用。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的试剂盒，其中
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因；
所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因；
所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的密码子优化的转基因；或
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因，且
a)所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因，或
b)所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:8的核苷酸序列的密码子优化的转基因。
28.根据权利要求24至26中任一项所述的试剂盒，其中，由第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者表达的所述蛋白的变体包括SEQIDNO:7的至少一种肿瘤相关的表位并且与SEQIDNO:7具有至少70％同一性。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:7具有至少80％同一性。
30.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:7具有至少90％同一性。
31.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:7具有至少95％同一性。
32.根据权利要求24至26和权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒或所述第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:7的序列的蛋白，而所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含SEQIDNO:7的序列的蛋白的变体。
33.根据权利要求24至26和权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒能够表达包含SEQIDNO:7的序列的蛋白的不同变体。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一病毒为慢病毒。
35.分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其具有编码包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的蛋白或其变体的基因组。
36.根据权利要求35所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:8的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
37.根据权利要求35所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:9的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
38.用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在所述哺乳动物中产生对所述蛋白或其变体的免疫力；以及
马拉巴MG1病毒，其编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:10的蛋白或其变体，所述马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；
所述第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中，由所述第一病毒表达的抗原蛋白和由所述马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白完全相同。
40.根据权利要求38或39所述的试剂盒，其中，所述第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者被配制成用于作为分离的病毒施用。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的试剂盒，其中
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因；
所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因；
所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的密码子优化的转基因；或
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因，且
a)所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因，或
b)所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:11的核苷酸序列的密码子优化的转基因。
42.根据权利要求38至40中任一项所述的试剂盒，其中，由第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者表达的所述蛋白质变体包括SEQIDNO:10的至少一种肿瘤相关的表位并且与SEQIDNO:10具有至少70％同一性。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:10具有至少80％同一性。
44.根据权利要求42所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:10具有至少90％同一性。
45.根据权利要求42所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:10具有至少95％同一性。
46.根据权利要求38至40或权利要求42至45中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒或所述第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:10的序列的蛋白，而所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含SEQIDNO:10的序列的蛋白的变体。
47.根据权利要求38至40和权利要求42至45中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒能够表达包含SEQIDNO:10的序列的蛋白的不同变体。
48.根据权利要求38至47中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一病毒为慢病毒。
49.分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其具有编码包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的蛋白或其变体的基因组。
50.根据权利要求49所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:11的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
51.根据权利要求49所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:12的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
52.用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一病毒，其表达作为抗原蛋白的包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的蛋白或其变体，并且被配制成在所述哺乳动物中产生对所述蛋白或其变体的免疫力；以及
马拉巴MG1病毒，其编码作为抗原蛋白的包含氨基酸序列SEQIDNO:13的蛋白或其变体，所述马拉巴MG1病毒被配制成在所述哺乳动物中诱导免疫应答；
所述第一病毒与该马拉巴MG1病毒免疫原性相异。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中，由所述第一病毒表达的抗原蛋白和由所述马拉巴MG1病毒表达的抗原蛋白完全相同。
54.根据权利要求52或53所述的试剂盒，其中，所述第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者被配制成用于作为分离的病毒施用。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的试剂盒，其中
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因；
所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因；
所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的密码子优化的转基因；或
所述马拉巴MG1病毒包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因，且
a)所述第一病毒为反义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式的密码子优化的转基因，或
b)所述第一病毒为DNA病毒或正义RNA病毒并且包括包含SEQIDNO:14的核苷酸序列的密码子优化的转基因。
56.根据权利要求52至54中任一项所述的试剂盒，其中，由第一病毒、所述马拉巴MG1病毒，或二者表达的所述蛋白质变体包括SEQIDNO:13的至少一种肿瘤相关的表位并且与SEQIDNO:13具有至少70％同一性。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:13具有至少80％同一性。
58.根据权利要求56所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:13具有至少90％同一性。
59.根据权利要求56所述的试剂盒，其中，所述变体与SEQIDNO:13具有至少95％同一性。
60.根据权利要求52至54和权利要求56至59中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒或所述第一病毒之一能够表达包含SEQIDNO:13的序列的蛋白，而所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒中的另一个能够表达包含SEQIDNO:13的序列的蛋白的变体。
61.根据权利要求52至54和权利要求56至59中任一项所述的试剂盒，其中，所述马拉巴MG1病毒和所述第一病毒能够表达包含SEQIDNO:13的序列的蛋白的不同变体。
62.根据权利要求52至61中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一病毒为慢病毒。
63.分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其具有编码包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的蛋白或其变体的基因组。
64.根据权利要求63所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:14的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
65.根据权利要求63所述的分离的马拉巴MG1病毒颗粒，其中，所述基因组包括SEQIDNO:15的核苷酸序列的反向互补和RNA形式。
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