CN113244411B

CN113244411B - 一种基因修饰的溶瘤病毒诱导ctl细胞方法及其在肿瘤治疗的用途

Info

Publication number: CN113244411B
Application number: CN202110706975.6A
Authority: CN
Inventors: 亓爱杰; 李少波; 韦素碧
Original assignee: Nuosa Union Beijing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Nuosa Union Beijing Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113244411A

Abstract

本发明涉及一种基因修饰的溶瘤病毒诱导CTL细胞方法及其在肿瘤治疗的用途。本发明通过制备表达IL‑24的溶瘤病毒以及特异性针对PD‑1的单克隆抗体。将所述溶瘤病毒与单克隆抗体一起使用可以有效的用于鼻咽癌的治疗。通过组合使用可以发现，所述的溶瘤病毒与单克隆抗体一起使用具有协同的治疗效果，具有极好的应用前景。

Description

一种基因修饰的溶瘤病毒诱导CTL细胞方法及其在肿瘤治疗的用途

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的，涉及一种基因修饰的溶瘤病毒诱导CTL细胞方法及其在肿瘤治疗的用途。

背景技术

溶瘤病毒是一类天然的或经过基因改造的病毒，可以选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终裂解肿瘤细胞，同时会大量释放肿瘤抗原，改善肿瘤微环境。

溶瘤病毒通过直接的溶瘤作用和诱导机体的免疫活性发挥抗肿瘤作用,由于缺乏在正常细胞中复制的必要条件,溶瘤病毒能靶向性地在肿瘤细胞内复制增殖,最终导致肿瘤细胞裂解和死亡,而对健康细胞无影响。因此,溶瘤病毒具有良好的安全性,同时,具有可长效表达抗肿瘤的外源基因的优点。目前常见的溶瘤病毒包括Ad、单纯疱疹病毒1型(herpessimplexvirustype-1,HSV-1)、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus,NDV)、麻疹病毒(measlesvirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、细小病毒(parvoviridae)、呼肠孤病毒(reoviruses)和VV等。

已有研究表明，瘤细胞本身缺乏共刺激分子等多种因素严重影响瘤抗原特异性CTL的诱导产生以及相应的杀伤活性。通过在溶瘤病毒基因组中插入具有表达肿瘤杀伤活性产物的基因，如免疫激活基因、药物前体转化酶基因、抗肿瘤血管生成基因、凋亡诱导基因等，溶瘤病毒可以直接充当目的基因的运载工具，使目的基因在肿瘤细胞内随病毒的复制而持续表达，进一步增强溶瘤病毒的杀伤活性。

在溶瘤病毒基因组中插入表达免疫炎性介质的基因，使肿瘤微环境中局部免疫炎性介质异常增高，从而激活机体抗肿瘤免疫反应，增强溶瘤病毒的抗肿瘤效应。目前已有多种免疫激活基因应用于溶瘤病毒的基因重组，如粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL-2、IL-12、IL-15、IL-18)、干扰素(IFN-α、IFN-β)等。也有研究设计出能同时表达IL-12和IL-18的重组腺病毒RdB／IL-12／IL-18，IL-12通过激活NK细胞与细胞毒性T细胞激发机体抗肿瘤免疫反应，IL-18则能增强NK细胞毒性作用与促进T细胞分化。在小鼠黑素瘤移植动物模型中，经RdB／IL-12／IL-18局部注射后的瘤体内检测到IL-12、IL-18、IFN-γ、GM—CSF浓度明显升高，并且在肿瘤组织切片中，观察到大量NK细胞、CIM和CD8T细胞浸润以及肿瘤组织的广泛坏死，进一步证明了IL-12和IL-18联合作用对于肿瘤细胞的强大的杀伤活性。同样的结果也在小鼠结肠癌动物模型中得到验证，与对照组相比，表达GM-CSF的基因重组麻疹病毒MV—GMCSF能够显著延缓小鼠结肠癌的进展并延长小鼠中位生存期。

近年来，溶瘤病毒相关研究取得了巨大进展，引起了广泛关注。但是严格来说，上市并获得认可的产品只有一款2015年FDA批准的安进公司的T-vec（Imlygic），用于黑色素瘤患者的局部治疗，是首个获得FDA批准的溶瘤病毒治疗药物。2016年又分别在欧洲和加拿大获批上市。在国内， 2005年CFDA批准了三维生物的安柯瑞（H101）上市，但由于当时国内临床试验标准不完善、审批政策较为宽松以及产品专利之争等多方面因素的叠加，这款产品临床疗效至今还未得到国际认可。此外，国内目前有多家公司正在进行溶瘤病毒的开发，并取得了较大的进展，2020年就有多家公司向药监局提交了溶瘤病毒的临床申请。而同时肿瘤免疫疗法逐渐在向联合疗法倾斜，而临床证据表明，溶瘤病毒可以加强肿瘤对免疫调节检查点抑制剂、CAR-T细胞等免疫治疗方法的反应率，是联合治疗策略中的理想对象。使得溶瘤病毒成为肿瘤免疫研究中的热门方向。

但是目前，在国内提供的溶瘤病毒产品特别是修饰的溶瘤病毒产品与免疫检查点抑制剂联合使用的方案也比较少。

发明内容

一方面，本发明的目的是提供用于改善癌症治疗的手段。

根据本发明，这是通过权利要求中所限定的主题来实现的。

本发明提供了一种药物组合物，其包含(a)溶瘤病毒和(b)PD-1抑制剂。本发明还提供了所述药物组合物用于治疗癌症的用途。

本发明的药物组合物可以包括本发明的溶瘤病毒，包括药学上允许的成分，缓冲液，赋形剂，佐剂，防腐剂，填料，稳定剂，增稠剂以及通常用于制剂化的其他成分。另外，在某些情况下，除本发明的溶瘤病毒外，还可以包括其他对治疗有效的肿瘤溶解性病毒和/或治疗有效的药物，例如抗癌剂，辅助成分（例如，免疫检查点抑制剂，如CTLA-4 blockers，以及免疫激活剂，如GM-CSF）。

优选地，在所述药物组合物中，溶瘤病毒和检查点抑制剂以有效剂量存在，并与药学上可接受的载体结合。

更进一步的，所述溶瘤病毒为表达IL-24的转基因溶瘤病毒。

更进一步的，所述转基因溶瘤病毒为表达IL-24的pAdxsi腺病毒。

更进一步的，所述溶瘤病毒为pAd-HS4-AFP-E1A-IL-24病毒质粒，所述质粒是本领域技术人员通过常规的构建方法或者全基因合成的方式即可，只要所述病毒能够表达IL-24即可。

更进一步的，本发明还提供一种特异性的PD-1单克隆抗体，所述单克隆抗体是通过PD-1蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤筛选技术获得的特异性结合PD-1的单克隆抗体。所述单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示，所述单克隆抗体与PD-1蛋白的结合常数为5.9nM具有较好的结合效果，并且特异性较好，不与其他蛋白反应。

轻链可变区（SEQ ID NO：1）

DIVITQSPALMAASPGEKVTITCTCYSDEGYHNCNWYQQKSGISPKPWIYLPEFYQCGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCINLILGCERFGAGTKLELK

重链可变区（SEQ ID NO：2）

EVQLEESGTELARPGASVKLSCKASGYIFSFWALGWIKQRPGQGLEWIGNFTTQAVERTKHDFQFGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGGAKRCLNWGLGTTLAVSS。

注意，在本公开中，特别是在权利要求书和/或段落中，术语“包括”，“包含”，“包含”等可以具有在美国专利法规中赋予它的含义；例如，它们可以意味着“包括”，“包括”，“包括”等；而术语“基本上由…组成”和“基本上由…组成”具有美国专利法规中对它们的定义，例如，它们允许没有明确列举的元素，但是排除了在现有技术中发现的或者影响本发明的基本特征或新特征的元素。

在一些实施方案中，溶瘤病毒衍生自痘病毒科。在一些实施方案中，溶瘤病毒衍生自弦状病毒亚科或虫媒病毒亚科。

在一些实施方案中，溶瘤病毒来自腺病毒。或者其他的可用的溶瘤病毒。

在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是肉瘤或癌。

在一些实施例中，实体瘤为鼻咽癌，粘液肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，弦瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤， Ewing's肿瘤，平滑肌瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，膀胱癌，髓性癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilm氏瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形胶质细胞瘤，成髓细胞瘤，颅咽管瘤，附睾瘤，松质瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤，神经胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。

在一些实施方案中，溶瘤病毒与PD-1抗体一起施用。在一些实施例中，该方法包括给予溶瘤病毒和PD-1抑制剂至少1天，至少2天，至少3天，至少1周，至少2周，至少3周，至少4周，至少1个月，至少3个月，至少6个月或至少1年。在一些实施方案中，该方法包括每周两次，每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次或每两个月一次给予受试者溶瘤病毒，核质转运抑制剂或两者。在一些实施方案中，溶瘤病毒局部给予待治疗的癌症组织。在一些实施方案中，溶瘤病毒通过瘤内注射给药。在一些实施方案中，溶瘤病毒对组织的多重感染（MoI）为约0.01至约10。在一些实施方案中，溶瘤病毒对组织的多重感染(MOI)为约0.05至约5。

有益效果

本发明通过制备表达IL-24的溶瘤病毒以及特异性针对PD-1的单克隆抗体。将所述溶瘤病毒与单克隆抗体一起使用可以有效的用于鼻咽癌的治疗。通过组合使用可以发现，所述的溶瘤病毒与单克隆抗体一起使用具有协同的治疗效果，具有极好的应用前景。

附图说明

图1 PD-1抗体与溶瘤病毒组合使用效果图

具体实施方式

以下将给出实施例并进一步说明本发明，但本实施例仅是本发明实施例的示例，并不限定本发明的范围。

实施例1 转基因溶瘤病毒的制备

含HS-4-AFP-E1A-PolyA的质粒购买自上海三维生物技术有限公司。pShuttle-Basic-EGFP重组穿梭载体和pAdxsi重组腺病毒骨架载体购自诺赛基因组研究中心有限公司。

按照“携带IL-24基因的溶瘤腺病毒抑制原发性肝癌肺转移的作用研究，陈漪,复旦大学博士论文，2009年度”中的构建方法，从质粒HS4-AFP-E1A-PolyA扩增得到目的基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体上,得到HS4-AFP-E1A-PolyA-T克隆载体,扩增IL-24基因,连接到pShuttle-Basic-EGFP载体上替换EGFP,得到pShuttle-Basic-IL-24.再从HS4-AFP-E1A-PolyA-T克隆载体上切下HS4-AFP-E1A-PolyA的片段,连接到pShuttle-Basic-IL-24载体上,得到pShuttle-Basic-IL-24-AFP-E1A,并将其转移到pAdxsi重组腺病毒骨架载体上,得到pAd-HS4-AFP-E1A-IL-24病毒质粒,经酶切鉴定构建正确。

重组腺病毒的包装及纯化：Lipofectamine 2000脂质体转染293细胞，获取病毒，-80℃保存。(3)腺病毒扩增、纯化：常规氯化铯梯度离心法纯化，效价测定用TCID50。扩增后的病毒经TCID50方法测定，滴度均为2.1×10¹¹PFU／ml。

实施例2 PD-1抑制剂的制备

免疫原为PD-1重组蛋白（P1210，欧凯生物）。通用的方法免疫小鼠。简要地，取出适量的福氏佐剂到1.5mlEP管中，振荡器混匀。用PBS配制抗原蛋白溶液。按照需要量混匀佐剂和蛋白抗原溶液，通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液，而后进行动物注射。根据血清效价测定结果，首次免疫后通常需要进行3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠行腹腔注射终免后进行细胞融合。细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)处于对数生长期。处死免疫后小鼠无菌环境取脾，使用PEG化学融合脾B淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞。融合后的细胞铺板96孔细胞培养板，通常7到10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以ELISA方法用人PD-1-his蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简述如下，用50ul2ug/ml的人PD-1-his抗原的PBS溶液包被酶标板，4度过夜。而后PBST洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的PBST溶液置于37度封闭3小时。再次洗板，加入50μl/孔的杂交瘤上清,37度孵育40分钟，而后洗板5次。以100μl/孔加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗,37度孵育40分钟，而后洗板5次,拍干。添加100μl/孔的TMB显色底物,室温显色20分钟，而后用2M的硫酸溶液终止,测定450纳米处各孔的吸光值。挑出ELISA显色阳性的杂交瘤孔细胞，转移到24孔板中，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异识别PD-1抗原且能阻断PD-1结合的杂交瘤，通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株3F2。

经序列鉴定，所述单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：1所示，所述单克隆抗体与PD-1蛋白的结合常数为5.9nM具有较好的结合效果，并且特异性较好，不与其他蛋白反应。

轻链可变区（SEQ ID NO：1）

重链可变区（SEQ ID NO：2）

实施例3 转基因溶瘤病毒瘤苗对CTL细胞的影响

选实施例1制备的高滴度病毒感染人鼻咽癌细胞CNE2,同时转染空病毒作对照。G418(250μg/ml)筛选2周获阳性克隆。经PCR检测证实IL24基因已整合到CEN2细胞中。双抗体夹心ELISA检测IL24转染阳性细胞，检测的细胞量为10⁶个。结果如下表1所示。

表1 IL-24的分泌量

类型	分泌量
		IL24阳性	945.3±23.4pg/24h

从表1的结果可以看出，转基因的IL24分泌量为945.3±23.4pg/24h,，对照的细胞IL24分泌量较低，说明转基因成功。

以丝裂霉素C(40μg·10⁶细胞/ml,37℃,1h)处理的野生型肿瘤细胞、空载体及IL24基因转染瘤细胞为刺激细胞(5×10⁵),与健康供血者外周血单个核细胞(PBMC,10⁷)混合培养,37℃,5%CO₂孵育1周后收集反应细胞重新刺激,于2×10⁶反应细胞中分别加入刺激细胞(2×10⁵),自身饲养细胞(经丝裂霉素C处理的PBMC,10⁵),再培养1周后收集反应细胞,用4h ⁵¹Cr释放试验检测CTL杀伤活性。结果如表2所示。

表2 CTL杀伤活性结果

类型	杀伤活性（%）
		丝裂霉素处理的野生型肿瘤细胞	12.3±1.9
空病毒肿瘤细胞	12.6±1.8
		转IL-24病毒的肿瘤细胞	76.5±2.3

从表2可以看出，IL-24基因修饰瘤苗能够诱导强烈的CTL反应，其杀伤力高达（76.5±2.3）%，具有较好的效果。

实施例4 溶瘤病毒抑制肿瘤效果验证

Balb-c裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心，雌性，4周龄，体质量15-20g。常规培养人鼻咽癌细胞CNE2，将其大量扩增，取对数生长期细胞，消化后收集并制成单细胞悬液，备用。对实验动物进行剪耳标记，记录实验动物体质量。将0.3%戊巴比妥钠按30~40mg/kg的剂量腹腔注射麻醉实验动物。于裸鼠双侧胁肋部皮下均注射CNE2细胞悬液100μl，每只裸鼠每侧注射细胞量1×10⁶个。动物分组及处理：裸鼠随机分为3组：溶瘤病毒处理组和溶瘤病毒+PD-1单抗处理组以及对照组，每组10只。自肿瘤注射入实验动物体内4d后，开始用游标卡尺测量皮下肿瘤大小，当病毒组处理侧肿瘤长至5mm（约第8天）时，进行瘤内注射病毒治疗。病毒组处理每周两次注射实施例1的病毒5×10⁵/μl 50μl，共注射4周，对照组每周两次注射磷酸缓冲盐溶液100μl，共注射4周。溶瘤病毒+PD-1单抗处理组每周两次注射实施例1的病毒5×10⁵/μl 50μl以及PD-1单抗1mg/kg，共注射4周。肿瘤大小测量：每次接种后测量肿瘤最大长径（a）值和最大宽径（b）值，根据公式（V=a×b2/2）计算肿瘤体积V，绘制肿瘤体积生长曲线。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，添加了溶瘤病毒后，可以有效的抑制肿瘤的生长，特别是在3周后还能有效的缩小肿瘤体积。而添加了PD-1抗体与溶瘤病毒一起使用后，能够更加显著的缩短肿瘤体积，在第4周，肿瘤体积只有80mm³左右，具有显著的抑制效果。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110> 诺赛联合（北京）生物医学科技有限公司

<120> 一种基因修饰的溶瘤病毒诱导CTL细胞方法及其在肿瘤治疗的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Thr Cys Tyr Ser Asp Glu Gly Tyr His

20 25 30

Asn Cys Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Leu Pro Glu Phe Tyr Gln Cys Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ile Asn Leu Ile Leu Gly Cys

85 90 95

Glu Arg Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Phe Trp

20 25 30

Ala Leu Gly Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Phe Thr Thr Gln Ala Val Glu Arg Thr Lys His Asp Phe Gln

50 55 60

Phe Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Ala Lys Arg Cys Leu Asn Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

Claims

1.一种用于治疗鼻咽癌的药物组合物，其特征在于所述组合物由溶瘤病毒和PD-1单克隆抗体组成；其中，溶瘤病毒为特异性表达IL-24的pAdxsi腺病毒；所述单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括药学上允许的成分。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有缓冲液和/或赋形剂。

4.溶瘤病毒和PD-1单克隆抗体在制备用于治疗鼻咽癌的药物组合物中的用途，其中，溶瘤病毒为特异性表达IL-24的pAdxsi腺病毒；所述单克隆抗体的轻链可变区如SEQ IDNO：1所示，重链可变区如SEQ ID NO：2所示。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物组合物包括药学上允许的成分。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物组合物含有缓冲液和/或赋形剂。