TW202142687A

TW202142687A - 一種溶瘤病毒疫苗及其與免疫細胞聯合治療腫瘤的藥物

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Publication number: TW202142687A
Application number: TW110117112A
Authority: TW
Inventors: 周國慶; 楊何; 張凡; 張蘇宏
Original assignee: 大陸商上海榮瑞醫藥科技有限公司
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-11-16
Also published as: EP4141111A4; US20230256079A1; EP4141111A1; JP7468958B2; WO2021228105A1; CA3178631A1; JP2023524915A; CN111286493A; AU2021271961B2; KR20230002564A; CN111286493B; AU2021271961A1

Abstract

本申請關於一種溶瘤病毒減毒株、溶瘤病毒疫苗及其與免疫細胞聯合治療腫瘤的藥物。本申請藉由對VSV野生型病毒基質蛋白M進行定點突變，提供一種新的溶瘤病毒減毒株。本申請在所述溶瘤病毒減毒株的基礎上，還提供一種可應用在腫瘤治療中的疫苗。所述疫苗治癒率高、生物安全性高。本申請在所述疫苗的基礎上，還將疫苗與免疫細胞聯合應用，提供一種可高效治療多類腫瘤的藥物。

Description

一種溶瘤病毒疫苗及其與免疫細胞聯合治療腫瘤的藥物

本申請關於生物醫藥領域，尤係關於一種溶瘤病毒疫苗及其與免疫細胞聯合治療腫瘤的藥物。

根據國家癌症中心2019年1月發佈的全國癌症統計資料顯示：2015年惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。平均每天超過1萬人被確診為癌症，每分鐘有7.5個人被確診為癌症。肝癌、結直腸癌、女性乳腺癌等實體瘤依然是我國主要的惡性腫瘤。惡性腫瘤(癌症)已經成為嚴重威脅中國人群健康的主要公共衛生問題之一。儘管目前癌症治療在手術、化療、放療及分子靶向治療等多學科綜合治療方面取得很大進展，但腫瘤的復發和轉移迄今仍缺乏有效治療手段。因此，新型治療手段，即腫瘤免疫治療逐漸受到人們的關注。

2003年，Giedlin MA提出水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)可以作為治療腫瘤的溶瘤病毒。其原理是它不能與正常細胞中內源性的IFN-β相互作用，只能選擇性地在腫瘤細胞中擴增、生長。2009年，加拿大麥克馬斯特大學研究表明：VSV可以作為新的腫瘤疫苗載體促進免疫應答。近年來，VSV的相關研究已越來越受到研究者們的重視。從安全的角度而言，VSV對人類相對安全，目前未見VSV感染人類的案例。

VSV是一種原型非節段負鏈RNA病毒，其大小11kb基因組編碼5種蛋白：核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶蛋白(L)。VSV可表達包括低密度脂蛋白受體、磷脂醯絲胺酸、唾液糖脂和硫酸類肝素在內的多種細胞表面分子，並可藉由此類分子附著細胞表面。具有複製及跨突觸速度快，外源基因表達量超高的特點。與目前正在研發的其他溶瘤細胞病毒平臺相比，VSV基因組小，容易操作；複製時間更短；有獨立的細胞週期；在廣泛的細胞系中可快速增長，且具有較高效價，允許大規模生產；宿主細胞的細胞質複製無轉化風險。這種溶瘤病毒不會集成到DNA中，並且經過減毒後可以避免野生型病毒引起的神經系統炎症。因此，VSV在腫瘤免疫治療上具有很大的潛力。

在腫瘤模式動物中，研究發現VSV能顯著消除腦部腫瘤，對乳腺癌和骨肉瘤也有明顯的抑制作用。研究者藉由對VSV對肝癌的抗腫瘤功能及毒副作用的研究發現肝癌荷瘤小鼠的生存期顯著增加，且並未產生明顯的毒副作用。經VSV-GP處理後前列腺癌小鼠的皮下腫瘤及骨轉移瘤明顯減小；減小黑色素瘤荷瘤小鼠的原位腫瘤及肺轉移瘤也得到顯著改善。M51R VSV可直接誘導結直腸癌細胞的凋亡。同時，VSV也可藉由調控固有免疫或者獲得性免疫進一步影響腫瘤的發展。M51R VSV降低結直腸癌組織中的免疫抑制細胞MDSC、巨噬細胞的浸潤，增加CD4⁺T細胞的浸潤，從而減少惡性腹水的形成。VSV能夠誘導CD8特異性T細胞的免疫應答，降低其它免疫抑制細胞的作用，從而增強腫瘤疫苗的療效。以上研究可見VSV具有較強的抗腫瘤作用，並具有很好的安全性。

目前的研究表明，單獨使用VSV進行腫瘤免疫治療時，治療反應率存在一定的瓶頸，這主要與其特異性不足及腫瘤內微環境的抑制作用有關。因此，關於VSV與其他治療的聯合應用也越來越多。在乳頭瘤小鼠模型的研究中發現，VSV聯合腫瘤疫苗明顯提高了抗腫瘤效應。來自明尼蘇達大學醫學院的Manish R.Patel等人發表了使用JAK/STAT抑制劑(Ruxolitinib)聯合VSV-IFNβ對肺癌進行治療，結果顯示，Ruxolitinib聯合VSV-IFNβ取得了較好的溶瘤治療效果。多種細胞因子武裝的溶瘤病毒也被用於與CAR-T細胞療法聯合；在異種移植瘤模型中，這種聯合策略增強了抗腫瘤活性。

T細胞受體基因工程改造的T細胞(T cell receptor gene engineered T cells,TCR-T)療法是以修飾T細胞為基礎的，應用於惡性腫瘤的過繼細胞免疫治療，TCR介導T細胞識別MHC分子遞呈的抗原，從而使得抗原特異性的T細胞對腫瘤靶細胞發揮免疫效應。現有研究使得聯合使用VSV和TCR-T治療腫瘤成為可能。VSV可藉由在腫瘤細胞內的選擇性複製從而溶解腫瘤細胞，而溶解的腫瘤細胞會誘導腫瘤特異性免疫應答，促進T細胞的活化、擴增、募集，活化的T細胞又可在腫瘤內藉由調控免疫抑制等方式殺傷腫瘤細胞。兩者聯合使用，理論上可以發揮優於單獨使用VSV療法或TCR-T療法的效果。

但在聯合使用VSV和TCR-T進行腫瘤免疫治療時，仍然至少存在如下問題：(1)直接將VSV野生株或減毒株與TCR-T聯合使用，治癒率不高，與單獨使用一種療法相比，效果提升不明顯；(2)野生型VSV仍然存在一定的安全風險，目前已知對齧齒類動物具有較強的神經毒性，為臨床使用考慮，需要對其進行基因修飾，以進一步降低致病風險；(3)隨機進行基因修飾，可能導致溶瘤效果不佳，也可能無法成功包裝，根本無法製備出重組病毒。

因此，提供一種安全性良好、治癒率高的VSV重組病毒，並將其與TCR-T及其他免疫細胞作為藥物聯合使用，對腫瘤基因治療領域具有重要的科研價值和應用意義。

本發明的目的是提供一種溶瘤病毒疫苗及其與免疫細胞聯合治療腫瘤的藥物。

為實現上述發明目的，本發明所採用的技術方案是：一株溶瘤病毒減毒株，其基質蛋白(M)的基因序列如SEQ ID NO 3所示。

相應地，一株溶瘤病毒減毒株，該減毒株以VSV MuddSummer亞型株為基礎，至少進行如下定點基因突變後獲得：第51位甲硫胺酸(M)突變為精胺酸(R)；第111位亮胺酸(L)編碼鹼基敲除；第221位纈胺酸(V)突變為苯丙胺酸(F)；第226位絲胺酸(S)突變為精胺酸(R)。

相應地，該溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用。

較佳地，該溶瘤病毒減毒株在製備藥物或疫苗中的應用。

相應地，一種溶瘤病毒疫苗，在該減毒株中插入抗原後製備得到。

相應地，一種溶瘤病毒疫苗，在該減毒株中插入腫瘤抗原後製備得到。

較佳地，該抗原為NY-ESO-1、gp33、gp100、TX103、Mucin-1、WT-1、MART-1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART-1、col6A3、酪胺酸酶、T抗原、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴色素互變異構酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪胺酸酶、SSX2、細胞週期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽釋放酶4、IGF2B3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3及其他腫瘤抗原中的任意一種。

相應地，該溶瘤病毒疫苗在製備腫瘤免疫治療藥物中的應用。

較佳地，該藥物同時包括該溶瘤病毒疫苗和免疫細胞，該免疫細胞為T細胞、NK細胞、巨噬細胞(macrophage)或其他免疫細胞。

較佳地，該免疫細胞為T細胞時，該T細胞為TCR-T細胞、CAR-T細胞、γ/δ-T細胞中的任意一種；該T細胞為TCR-T細胞時，該TCR-T細胞為經慢病毒轉染的TCR-T細胞，或從血液中分離出的TCR-T細胞；該免疫細胞為NK細胞時，該NK細胞為CAR-NK中的任意一種；該免疫細胞為巨噬細胞(macrophage)時，該巨噬細胞(macrophage)為CAR-M細胞中的任意一種。

較佳地，該腫瘤或癌症為頭頸部癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、神經母細胞瘤、滑膜肉瘤、圓細胞型脂肪肉瘤中的任意一種。

本發明具有以下有益效果：本發明藉由對VSV野生型病毒的基質蛋白M進行定點突變，提供一種全新的溶瘤病毒減毒株，該減毒株可單獨作為藥物治療腫瘤，安全性與治癒率均優於野生型病毒及其它減毒株。該減毒株還可作為載體(骨架)，與抗原或細胞因子等連接，從而將抗原或細胞因子等物質定點輸送到所需位置，成為疫苗或藥物；具體連接的抗原或細胞因子種類可根據實際需要治療的腫瘤或其它疾病種類而定，適應性強。本發明在該溶瘤病毒減毒株的基礎上，藉由在減毒株內插入外源基因NY-ESO-1，還提供一種可應用在腫瘤治療中的疫苗。該疫苗治癒率高，且生物安全性高。本發明在該疫苗的基礎上，還將疫苗與TCR-T細胞聯合應用，提供一種可高效治療多類腫瘤的藥物；在小鼠的肺癌模型上，治癒率可達到驚人的95%。

一方面，本申請提供溶瘤病毒減毒株，其特徵在於：與VSV MuddSummer亞型株相比，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M基因經過改造，該改造包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造還包含胺基酸位點第51位甲硫胺酸突變為精胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第51位甲硫胺酸突變為精胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造還包含第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造還包含第226位絲胺酸突變為精胺酸的胺基酸突變。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第226位絲胺酸突變為精胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除、第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為第51位甲硫胺酸突變為精胺酸；第111位亮胺酸編碼鹼基敲；第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M具有下組中任一種胺基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。

另一方面，本申請還提供該溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用的特徵在於：該溶瘤病毒減毒株在製備藥物或疫苗中的應用。

另一方面，本申請提供一種溶瘤病毒疫苗，其特徵在於：在該溶瘤病毒減毒株中插入抗原後製備得到。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒疫苗的特徵在於：該抗原為特異性腫瘤抗原。

在某些實施方式中，該溶瘤病毒疫苗的特徵在於：該抗原為NY-ESO-1、gp33、gp100、TX103、Mucin-1、WT-1、MART-1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART-1、col6A3、酪胺酸酶、T抗原、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴色素互變異構酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪胺酸酶、SSX2、細胞週期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽釋放酶4、IGF2B3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3中的任意一種。

另一方面，本申請還提供該溶瘤病毒疫苗製備的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物。

在某些實施方式中，該抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物同時包括該溶瘤病毒疫苗和免疫細胞。

在某些實施方式中，該抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物的特徵在於：該免疫細胞為T細胞、NK細胞、巨噬細胞、DC細胞、TIL細胞中的任意一種：該免疫細胞為T細胞時，該T細胞為TCR-T細胞、CAR-T細胞、γ/δ-T細胞、基因編輯的T細胞中的任意一種；該T細胞為TCR-T細胞時，該TCR-T細胞為經慢病毒或mRNA技術轉染的TCR-T細胞，從血液中分離出的TCR-T細胞，或任意一種技術得到的TCR-T；該免疫細胞為NK細胞時，該NK細胞為NK或CAR-NK中的任意一種；該免疫細胞為巨噬細胞時，該巨噬細胞為巨噬細胞或CAR-M細胞中的任意一種。

在某些實施方式中，該抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物的特徵在於：該腫瘤或癌症為頭頸部癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、神經母細胞瘤、滑膜肉瘤、圓細胞型脂肪肉瘤中的任意一種。

本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所請發明的精神和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。

本申請所請發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所請發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：

圖1A-1B為各減毒株在體外的LLC細胞和MEF細胞內複製能力示意圖；

圖2A-2B為各減毒株對體外的LLC細胞和Hela細胞殺傷能力示意圖；

圖3為各減毒株對體外的MEF細胞殺傷能力示意圖；

圖4A-4B為各減毒株對體外LLC細胞和MEF細胞內IFN-β表達水準影響示意圖；

圖5為溶瘤病毒疫苗構建示意圖；

圖6為各減毒株對小鼠體內非小細胞肺癌(移植瘤)體積大小影響示意圖；

圖7為各疫苗對小鼠體內非小細胞肺癌(移植瘤)體積大小影響示意圖；

圖8為實驗終點時，各減毒株和疫苗處理下小鼠體內非小細胞肺癌(移植瘤)體積大小示意圖；

圖9為各減毒株和疫苗對小鼠體內非小細胞肺癌細胞轉移情況影響示意圖；

圖10為各疫苗對小鼠體內纖維肉瘤(移植瘤)體積大小影響示意圖；

圖11為實驗終點時，各疫苗處理下小鼠體內纖維肉瘤(移植瘤)體積大小示意圖；

圖12為各疫苗對小鼠體內黑色素瘤(移植瘤)體積大小影響示意圖；

圖13為實驗終點時，各疫苗處理下小鼠體內黑色素瘤(移植瘤)體積大小示意圖；

圖14為不同劑量的JBS004對小鼠體內非小細胞肺癌(移植瘤)體積大小影響示意圖；

圖15為實驗終點時，不同劑量的JBS004處理下小鼠體內非小細胞肺癌(移植瘤)體積大小示意圖；

圖16為不同劑量的JBS004對小鼠體內非小細胞肺癌細胞轉移情況影響示意圖；

圖17為不同劑量的JBS004對肺癌小鼠的體重影響示意圖；

圖18為不同劑量的JBS004對肺癌小鼠的體溫影響示意圖；

圖19為PCR檢測方法定量標準曲線；

圖20為LLC移植瘤模型中，不同時間點時腫瘤內JBS004的核酸拷貝數示意圖；

圖21為不同時間點時不同劑量的JBS004對健康雌性小鼠體溫影響示意圖；

圖22為不同時間點時不同劑量的JBS004對健康雄性小鼠體溫影響示意圖；

圖23為不同時間點時不同劑量的JBS004對健康雌性小鼠體重影響示意圖；

圖24為不同時間點時不同劑量的JBS004對健康雄性小鼠體重影響示意圖；

圖25為各疫苗單獨治療或與JBS-NY TCR-T聯合治療時，對肺癌(移植瘤)體積大小影響示意圖；

圖26為實驗終點時，各疫苗單獨治療或與JBS-NY TCR-T聯合治療時肺癌(移植瘤)體積大小示意圖；

圖27為各疫苗單獨治療或與JBS-NY TCR-T聯合治療對肺癌細胞轉移情況影響示意圖。

以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。

術語定義

在本申請中，術語“經改造的”通常指藉由人工手段對天然存在的生物體/分子的結構和/或性能加以改變。改變的方式可以是，例如對該分子進行修飾、突變、合成和/或插入外源分子等。“經改造的”可以區別於天然存在的。例如：如果細胞或生物體經操作使得其基因資訊改變(例如引入先前不存在的新基因材料，例如藉由轉型、匹配、體細胞雜交、轉染、轉導或其它機制，或改變或移除先前存在的基因材料，例如藉由取代或缺失突變)，那麼其被視為“經改造的”。例如：經改造的溶瘤病毒可以是對編碼溶瘤病毒蛋白的基因進行突變，也可以是在溶瘤病毒的基因中插入外源基因，也可以是對溶瘤病毒蛋白的胺基酸進行突變。

在本申請中，術語“基質蛋白M”可以與“M蛋白”互換使用，通常指水皰性口炎病毒基質蛋白。基質蛋白M是VSV重要的毒力因子，也是水皰性口炎病毒中已知可干擾小鼠天然免疫應答的蛋白。術語“基質蛋白M”還包括其同源物，直系同源物、變體、功能活性片段等。例如，野生型水皰性口炎病毒MuddSummer亞型印第安那株的基質蛋白M可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。

在本申請中，蛋白突變位點的表述通常由“胺基酸+胺基酸位數+(突變後的胺基酸)”來表述。在本申請中，該突變可以包括但不限於胺基酸的增加、替換、缺失和/或刪除。例如，術語“M51R”通常指第51位甲硫胺酸M突變為精胺酸R。

在本申請中，術語“突變”通常是指改變野生型分子的核苷酸或胺基酸序列。DNA中的突變可以改變密碼子，從而導致胺基酸序列中的變化。核苷酸變化可以包括核苷酸的置換、缺失、插入、對核酸序列的可變剪接和/或截短。胺基酸變化可以包括胺基酸的置換、刪除、缺失、插入、添加、截短、或蛋白質的加工或切割。

在本申請中，術語“腫瘤”通常是指任何新的病理性的組織增生。腫瘤可能是良性的，也可能是惡性的。在本申請中，該腫瘤可以是實體瘤和/或血液瘤。

在本申請中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。

發明詳述

1．一種溶瘤病毒減毒株，其特徵在於：對該溶瘤病毒的基質蛋白M進行改造，改造後的基質蛋白M的基因序列如SEQ ID NO 3所示。

2.一種溶瘤病毒減毒株，其特徵在於：該減毒株以VSV MuddSummer亞型株為基礎，至少對VSV MuddSummer亞型株的M蛋白基因進行如下定點基因突變後獲得：第51位甲硫胺酸突變為精胺酸；第111位亮胺酸編碼鹼基敲除；第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸；第226位絲胺酸突變為精胺酸。

3.實施方案1或2該溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用。

4.根據實施方案3該溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用，其特徵在於：該溶瘤病毒減毒株在製備藥物或疫苗中的應用。

5.一種溶瘤病毒疫苗，其特徵在於：在實施方案1或2該減毒株中插入抗原後製備得到。

6.根據實施方案5該溶瘤病毒疫苗，其特徵在於：該抗原為特異性腫瘤抗原。

7.根據實施方案6該溶瘤病毒疫苗，其特徵在於：該抗原為NY-ESO-1、gp33、gp100、TX103、Mucin-1、WT-1、MART-1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART-1、col6A3、酪胺酸酶、T抗原、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴色素互變異構酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪胺酸酶、SSX2、細胞週期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽釋放酶4、IGF2B3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3中的任意一種。

8.實施方案5~7任意一項該溶瘤病毒疫苗製備的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物。

9.根據實施方案8該溶瘤病毒疫苗的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物，其特徵在於：該藥物同時包括該溶瘤病毒疫苗和免疫細胞。

10.根據實施方案9該溶瘤病毒疫苗製備的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物，其特徵在於：該免疫細胞為T細胞、NK細胞、巨噬細胞中的任意一種；

該免疫細胞為T細胞時，該T細胞為TCR-T細胞、CAR-T細胞、γ/δ-T細胞中的任意一種；該T細胞為TCR-T細胞時，該TCR-T細胞為經慢病毒或mRNA技術轉染的TCR-T細胞，或從血液中分離出的TCR-T細胞；該免疫細胞為NK細胞時，該NK細胞為CAR-NK中的任意一種；該免疫細胞為巨噬細胞時，該巨噬細胞為CAR-M細胞中的任意一種。

11.根據實施方案9或10該溶瘤病毒疫苗製備的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物，其特徵在於：該腫瘤或癌症為頭頸部癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、神經母細胞瘤、滑膜肉瘤、圓細胞型脂肪肉瘤中的任意一種。

一、本發明提供一種全新的精確改造溶瘤病毒製備的溶瘤病毒減毒株。該溶瘤病毒為水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)，具體選自水皰性口炎病毒印第安那株，VSV MuddSummer亞型株，其M蛋白基因序列如SEQ ID NO 1所示，M蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO 2所示。本發明對該水皰性口炎病毒進行了如下修飾，以獲得溶瘤病毒減毒株：對該水皰性口炎病毒的M蛋白基因進行了定點基因突變，獲得減毒株。該突變的位點包括：(1)第51位甲硫胺酸(M)突變為精胺酸(R)；(2)第111位亮胺酸(L)編碼鹼基敲除；(3)第221位纈胺酸(V)突變為苯丙胺酸(F)；(4)第226位絲胺酸(S)突變為精胺酸(R)。將完成突變後的水皰性口炎病毒編號為：JBS003；命名為：XN2-M51R-△L111-V221F-S226R；其M蛋白的基因序列為SEQ ID NO 3所示，M蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO 4所示。

與野生型VSV及其它已知的VSV減毒株相比，該JBS003的安全性更高，可作為抗原、細胞因子等物質的載體(骨架)，與抗原、細胞因子等結合後，作為疫苗或藥物進行使用。同時，JBS003也可不與其它物質結合，直接作為溶瘤病毒應用在腫瘤免疫治療中，其效果也比野生型VSV及其它VSV減毒株的治療效果更佳。

二、本發明在溶瘤病毒減毒株的基礎上，提供一種溶瘤病毒疫苗。如上所述，本發明提供的減毒株可以與抗原結合構成疫苗。本發明在JBS003的G蛋白和L蛋白間插入可表達NY-ESO-1的基因，構建了一種溶瘤病毒疫苗，編號為：JBS004。

NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)屬於腫瘤-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen,CTA)家族，在睪丸、卵巢及多種腫瘤組織中表達，而在其他正常組織中不表達，是目前已知發現的免疫原性最強的腫瘤特異性抗原。NY-ESO-1在不同腫瘤組織中表達豐度不同，蛋白表達最高的是黏液樣圓細胞型脂肪肉瘤(89%~100%)、神經母細胞瘤(82%)、滑膜肉瘤(90%)、黑色素瘤(46%)、卵巢癌(43%)。NY-ESO-1抗原具有免疫原性和安全性，是一種用於免疫治療的臨床優勢抗原。目前，復發、轉移性的頭頸部鱗癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、神經母細胞瘤等仍無法得到有效治療。引入NY-ESO-1後構建的JBS004溶瘤病毒疫苗能高效誘導機體在外周淋巴系統和腫瘤組織中特異性抗腫瘤免疫反應。試驗表明，在抗腫瘤免疫治療、尤其是針對上述癌症和腫瘤的治療中，溶瘤病毒疫苗的免疫原性、有效性、靶向性、安全性和耐受性優勢明顯。

三、本發明在該溶瘤病毒疫苗的基礎上，還提供一種可針對性治療腫瘤的藥物。該藥物包括該溶瘤病毒或溶瘤病毒疫苗。使用方法為：將該 JBS003溶瘤病毒或JBS004溶瘤病毒疫苗進行瘤內注射或者靜脈注射。採取少量多次的方法進行注射。

為提高治癒率，較佳的方案為：該藥物還包括TCR-T細胞。該TCR-T細胞為轉染了NY-ESO-1受體的T淋巴細胞，具體製備方法為：(1)從NCG-HLA-A2.1/Gpt人源化小鼠外周血中分離T淋巴細胞；(2)人工合成目的基因NY-ESO-1受體序列並進行基因測序，將其與慢病毒載體進行重組，獲得NY-ESO-1受體重組慢病毒；(3)利用該NY-ESO-1受體重組慢病毒對T淋巴細胞進行轉染，從而獲得轉染了NY-ESO-1受體的T淋巴細胞，命名為：JBS-NY TCR-T。將構建好的JBS-NY TCR-T細胞在體外進行擴增，藉由Western Blot方法對JBS-NY TCR-T細胞中的NY-ESO-1表達量進行檢測，確定構建成功。

溶瘤病毒或溶瘤病毒疫苗和JBS-NY TCR-T聯合使用的方法為：先靜脈注射1次JBS-NY TCR-T，隨後少量多次瘤內注射或靜脈注射溶瘤病毒或溶瘤病毒疫苗。

一方面，本申請提供一種溶瘤病毒減毒株，其特徵在於：與VSV MuddSummer亞型株相比，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M基因經過改造。在某些實施方案中，該VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，該VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M包含如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造可以包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M與VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M相比，第111位亮胺酸編碼鹼基敲除。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造還可以包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第51位甲硫胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M與VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M相比，第111位亮胺酸編碼鹼基敲除且第51位甲硫胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造可以包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M與VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M相比，第111位亮胺酸編碼鹼基敲除且第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造可以包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第226位絲胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M與VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M相比，第111位亮胺酸編碼鹼基敲除且第226位絲胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造可以包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除，第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M與VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M相比，第111位亮胺酸編碼鹼基敲除，第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造可以包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除，第51位甲硫胺酸突變為精胺酸，第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M與VSV MuddSummer亞型株的基質蛋白M相比，第111位亮胺酸編碼鹼基敲除，第51位甲硫胺酸突變為精胺酸，第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。在某些實施方案中，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

另一方面，本申請還提供核酸分子，其能編碼該溶瘤病毒的基質蛋白M。例如，編碼該溶瘤病毒的基質蛋白M的核酸序列可以如SEQ ID NO：3所示。

在本申請中，該溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用可以包括該溶瘤病毒減毒株在製備藥物或疫苗中的應用。

另一方面，本申請還提供溶瘤病毒疫苗，該溶瘤病毒疫苗可以在該溶瘤病毒減毒株中插入抗原後製備得到。例如，可以在該溶瘤病毒減毒株中插入特異性腫瘤抗原得到該溶瘤病毒疫苗。在本申請中，該抗原可以選自以下任意一種：NY-ESO-1、gp33、gp100、TX103、Mucin-1、WT-1、MART-1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART-1、col6A3、酪胺酸酶、T抗原、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴色素互變異構酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪胺酸酶、SSX2、細胞週期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽釋放酶4、IGF2B3和磷脂醯肌醇蛋白聚糖3。例如，在本申請中，將構建的溶瘤病毒減毒株作為載體，引入NY-ESO-1，獲得該溶瘤病毒疫苗。

在本申請中，還提供該溶瘤病毒疫苗的製備方法，該方法包括：構建溶瘤病毒減毒株質粒，人工合成帶限制性酶切位元點的連結序列，利用生物學技術和基因重組技術，將其插入溶瘤病毒減毒株的G蛋白和L蛋白之間的非編碼區，插入外源基因，獲得攜帶外源基因的減毒株重組質粒，藉由疫苗拯救步驟構建該溶瘤病毒疫苗。

在本申請中，該抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物同時包括該溶瘤病毒疫苗和免疫細胞。在本申請中，該免疫細胞可以包括T細胞、NK細胞、巨噬細胞、DC細胞、TIL細胞中的任意一種：該免疫細胞為T細胞時，該T細胞可以包括TCR-T細胞、CAR-T細胞、γ/δ-T細胞、基因編輯的T細胞中的任意一種；該T細胞為TCR-T細胞時，該TCR-T細胞可以包括經慢病毒或mRNA技術轉染的TCR-T細胞，或從血液中分離出的TCR-T細胞，或任意一種技術得到的TCR-T細胞；該免疫細胞為NK細胞時，該NK細胞可以包括NK或CAR-NK中的任意一種；該免疫細胞為巨噬細胞時，該巨噬細胞可以包括巨噬細胞或CAR-M細胞中的任意一種。在本申請中，該腫瘤或癌症可以包括頭頸部癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、神經母細胞瘤、滑膜肉瘤和/或圓細胞型脂肪肉瘤。在本申請中，該藥物還可以包含任選地藥學上可接受的載劑。

不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請發明的各個技術方案，而不用於限制本申請發明的範圍。

實施例

實施例1

1、按表1的方式，對該水皰性口炎病毒印第安那株進行定點突變，獲得7組突變後的減毒株。未進行基因突變的組別編號為：JBS000，作為對照。

表1各組突變情況展示表

減毒株的具體構建方法為本領域的常規技術，簡述如下：

(1)構建質粒。以pVSV-XN2質粒為範本，利用PCR方法引入如表1該不同的突變位點。將質粒與各突變位點的引子共同進行PCR，再將 PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，隨後藉由凝膠回收試劑盒進行割膠回收，獲得M基質蛋白不同突變的質粒。

(2)病毒拯救。按MOI=5，用表達T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感染接種BHK-21細胞，感染1h後，使用DPBS緩衝液漂洗一次BHK-21細胞。隨後製備質粒轉染預混液，具體包括：pBS-N、pBS-P、pBS-L、步驟(1)製備的突變質粒。其中pBS-N、pBS-P、pBS-L分別指選殖了VSV N、VSV P、VSV L蛋白基因的表達質粒，分別表達病毒挽救所需的N、P、和L蛋白。按lipofectamine 2000使用說明書所述的方法進行質粒轉染，4h後更換新鮮的含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，48h後吸取上清，用0.22μm的濾膜濾去除痘病毒。將濾液加入到新鮮的BHK-21細胞中；每天觀察細胞病變情況，待細胞出現病變情況時收取上清，經RTPCR鑒定確認成功後，用病毒空斑實驗純化病毒。即獲得減毒株。

(3)M蛋白基因測序。利用Trizol試劑盒抽提病毒基因組RNA，用隨機引子進行逆轉錄反應，用針對M蛋白基因序列設計的引子對逆轉錄出來的cDNA進行PCR。引子序列為：5'-AAAAAAGTAACAGATATCAC-3'(SEQ ID NO：5)；5'-ACATTTTTCCAGTTTCCTTTTTGG-3'(SEQ ID NO：6)。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳後回收，並送往測序公司進行測序。

2、不同減毒株對細胞的體外侵染能力展示。分別在MEF細胞(人的成纖維細胞)培養液、LLC細胞(鼠源非小細胞肺癌細胞)培養液中，分別加入JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS008、JBS009、JBS010、JBS014各200pfu，檢測各組減毒株產生的半數組織培養感染劑量(Tissue culture infective dose,TCID50)。具體測試方法為：

(1)在6孔培養盤中每孔加入細胞懸液3mL，使細胞量達到4×10⁵個/孔，共6個孔，37℃、5%CO₂條件下培養16h。

(2)在各孔中分別加入病毒JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS008、JBS009、JBS010、JBS014各200pfu，設正常細胞對照2個孔。在24h時，取細胞上清100μL。

(3)在96孔培養盤中，每孔加入Vero細胞懸液100μL，使細胞量達到1×10⁴個/mL，37℃、5%CO₂條件下培養16h。

(4)在1.5mL EP管中將步驟(2)中收穫的上清作連續10倍的稀釋，10^-1~10^-11，共11個效價。

(5)將稀釋好的上清接種到步驟(3)的96孔培養盤中，每一稀釋度接種一列(共8孔)，每孔接種100μL。設正常細胞對照組一列。

(6)48h後觀察每孔細胞螢光情況，有螢光標記為此孔被感染。

(7)按Karber法計算TCID50。

結果如圖1A和圖1B所示。構建的各溶瘤病毒減毒株在體外肺癌細胞(LLC)中的複製擴增能力比在正常的成纖維細胞(MEF)內各溶瘤病毒減毒株的複製擴增能力強，其中JBS003在體外肺癌細胞(LLC)中的複製擴增能力較強，感染24h後產生的病毒粒子數接近野生型病毒。而在正常的成纖維細胞(MEF)內各溶瘤病毒減毒株的複製感染能力均有所下降。因此：JBS003載體對腫瘤細胞具有較強的特異性侵染能力。

3、不同減毒株對細胞的體外殺傷能力展示。使用等量各減毒株分別體外感染不同細胞，24h後MTT法檢測細胞活力。具體方法如下：

(1)在96孔培養盤中每孔加入細胞懸液100μL，使細胞量達到1×10⁴個/孔，37℃，5%CO₂條件下培養16h。測試的細胞種類為：LLC、MEF、Hela(人腫瘤細胞)。

(2)分別將JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS008、JBS009、JBS010、JBS014稀釋到MOI(multiplicity of infection，感染複數)分別為0.001、0.01、0.1、1.0，每一稀釋梯度接種4個孔，每孔接種100μL，在37℃，5%CO₂條件下培養40h。

(3)棄去96孔培養盤中的上清，加入新鮮的DMED培養基，再加入5mg/mL的MTT溶液，20μL/孔。在37℃，5%CO₂條件下培養4h。

(4)將96孔盤離心，設置轉速2500g/min，室溫離心5分鐘。隨後使用1mL一次性無菌注射器，輕輕吸掉上清。

(5)再向每孔中加入DMSO，100μL/孔，37℃放置10分鐘。

(6)使用多功能酶標儀，震盪2分鐘，在570nm波長下，測定各孔的OD值。

結果如圖2A、圖2B、和圖3所示。結果表明各溶瘤病毒減毒株都展現了良好的腫瘤細胞殺傷的能力，除JBS000外，均對MEF細胞無顯著的殺傷。即，體外狀態下，除JBS000外，各減毒株均對腫瘤細胞具有特異性殺傷，對正常細胞無顯著影響。

4、不同減毒株在細胞內清除難易度測試。以IFN-β指標進行測試。按上述步驟3的步驟(1)、(2)培養細胞並加入減毒株。隨後破碎各組細胞，用TRIzol(Invitrogen)從各細胞中提取總RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser(Takara)反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，並用 LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche)染料進行染色，在LightCycler 480定量PCR儀上檢測各個基因的Ct值。用△△Ct法計算目的基因IFN-β、VSV-G相對表達量。結果如圖4A和4B所示。在LLC細胞系中，除JBS000外，所有減毒株均可引起IFN-β表達水準的提高，其中JBS003載體的調節能力最低；而在MEF細胞中，所有病毒均可上調IFN-β的表達水準，其中JBS003的水準最高，為野生型病毒載體(JBS000)的3倍。即：JBS003在腫瘤細胞中難以被清除，而在正常細胞中則容易被清除。

實施例2 溶瘤病毒疫苗的構建及效果展示

1、在實施例一製備的各減毒株及野生型病毒的基礎上，插入NY-ESO-1基因，構建獲得溶瘤病毒疫苗，構建示意圖如圖5所示。各組插入片段情況如表2所示。

表2各組插入片段情況展示表

該JBS004-JBS007、JBS011-JBS013、JBS015的具體製備方法為本領域的常規技術，簡述如下。需要說明的是，下述記載並非限定JBS004-JBS007、JBS011-JBS013、JBS015只能按照如下方法進行，而是給出示例。

(1)減毒株質粒構建。人工合成帶限制性酶切位點Xho I和Mlu I的連結序列，利用生物學技術和基因重組技術，將其插入實施例一製備的各減毒株的G蛋白和L蛋白之間的非編碼區，獲得各減毒株質粒。

(2)外源基因插入。將各減毒株質粒用Xho I和Mlu I進行雙酶切，隨後插入NY-ESO-1外源基因，獲得攜帶NY-ESO-1的減毒株重組質粒。

(3)疫苗拯救。參照實施例一中“病毒拯救”的方法對各減毒株重組質粒所對應的疫苗進行拯救，從而構建各溶瘤病毒疫苗。

2、治療LLC-NY-ESO-1非小細胞肺癌(移植瘤)效果展示。

選擇差異不顯著的136隻C57BL/6小鼠，分別皮下接種2×10⁵個LLC細胞(小鼠肺癌細胞)。接種第9天，待移植瘤體積長至100mm³左右時，將所有小鼠分為17組(n=8)：對照組(PBS組)瘤內注射50μL PBS，其餘16組為治療組，分別進行瘤內接種JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004、JBS005、JBS006、JBS007、JBS008、JBS009、JBS010、JBS011、JBS012、JBS013、JBS014、JBS015，每2天給藥1次，共給藥3次，單次接種量均為10⁷pfu/隻。自開始給藥至實驗終點，每2天記錄一次移植瘤體積，體積(mm³)=(長徑×短徑²)/2。檢測癌細胞的轉移比例，檢測方法為：LLC細胞帶有紅色螢光蛋白，在綠色螢光顯微鏡下會呈現黃色螢光；當癌細胞轉移至肺組織後，將肺組織置於顯微鏡下，拍攝螢光圖片，藉由Image J分析圖片灰度值，從而分析肺癌細胞的比例，即得癌細胞的轉移比例。

腫瘤體積變化情況如圖6~8所示。結果顯示：各治療組均對移植瘤有一定的抑制作用。其中JBS003組有1隻被完全治癒。JBS004對移植瘤的治癒率達37.5%。癌細胞轉移情況如圖9所示。從圖6~9可以看出：移植瘤體積大小與肺部轉移多少存在一定的相關性。JBS003對肺轉移灶的治療要優於JBS000、JBS001組；JBS004抑制或防止肺癌細胞轉移的能力優於其他組。

3、治療MCA-205-NY-ESO-1纖維肉瘤(移植瘤)的效果展示。

按“治療LLC-NY-ESO-1非小細胞肺癌移植瘤”的方法對小鼠進行處理，皮下接種10⁶個MCA-205-NY-ESO-1纖維肉瘤細胞，待移植瘤體積長至100mm³左右時進行處理。同樣以瘤內注射50μL PBS作為對照組，治療組中，分別進行瘤內接種JBS004、JBS005、JBS006、JBS007、JBS011、JBS012、JBS013、JBS015，每組6隻動物，每2天給藥1次，共給藥3次，單次接種量均為10⁸pfu/隻。自開始給藥至實驗終點，每2天記錄一次移植瘤體積。結果如圖10、11所示。結果顯示：各治療組都能夠在一定程度上減少腫瘤體積。經JBS004治療後，其中2隻小鼠的移植瘤完全消除(占33.33%)，剩餘小鼠的腫瘤體積也得到很好地控制，與其餘組別差異顯著。JBS004治療纖維肉瘤的總反應率為100%。

4、治療B16-F10-NY-ESO-1黑色素瘤(移植瘤)的效果展示。

按上述移植瘤試驗的處理方法對小鼠進行處理，皮下接種2×10⁶個B16-F10-NY-ESO-1黑色素瘤細胞，待移植瘤體積長至100mm³左右時進行處理。同樣以瘤內注射50μL PBS作為對照組，治療組中，分別進行瘤內接種 JBS004、JBS005、JBS006、JBS007、JBS011、JBS012、JBS013、JBS015，每組6隻動物，每2天給藥1次，共給藥3次，單次接種量均為10⁸pfu/隻。自開始給藥至實驗終點，每2天記錄一次移植瘤體積。結果如圖12、13所示。結果顯示：各治療組對黑色素瘤均有一定的治療作用，JBS004組效果尤佳。

5、不同劑量的JBS004的效果展示。

選擇6~8週齡，體重在18g左右的C57BL/6小鼠，分別皮下接種2×10⁵個LLC細胞(小鼠肺癌細胞)。接種第9天，待移植瘤體積長至100mm³左右時，將所有小鼠分為5組，每組6隻動物：對照組(PBS組)瘤內注射50μL PBS，其餘4組為治療組，分別進行瘤內接種10⁶pfu/隻、10⁷pfu/隻、10⁸pfu/隻、10⁹pfu/隻JBS004，每2天給藥1次，共給藥3次。自開始給藥至實驗終點，每2天記錄一次移植瘤體積，結果如圖14、15所示。並於實驗結束時，對安樂死的小鼠進行剖檢，取小鼠肺組織，檢測癌細胞的轉移比例，結果如圖16所示。結果顯示：不同劑量的JBS004均對肺癌小鼠有一定治療效果，其中10⁸pfu/隻劑量水準下，治癒率達33.33%，有效控制率達33.33%，未發現肺部癌細胞轉移率為66.67%，顯著優於其他劑量組。

另外，如圖17、18所示，在整個實驗過程中，小鼠體溫、體重均維持在正常範圍內，未出現體溫、體重異常情況，說明不同劑量JBS004對肺癌小鼠的體溫、體重無顯著影響。就體重而言，PBS組中小鼠體重穩步增長，其餘治療組的小鼠出現增長遲緩的情況，其原因應該與移植瘤的減小有關，實驗終點時，各組小鼠的體重無顯著差異。證明JBS004安全性良好。

實施例3 JBS004的藥物代謝動力學及急性毒性實驗結果展示

1、藥物代謝動力學實驗。選擇C57BL/6小鼠，皮下接種2×10⁵個LLC細胞，接種9天左右後，移植瘤體積長至100mm³左右，建立LLC移植瘤模型。單次瘤內注射10⁸pfu/隻的JBS004，分別於0min(+15min)、6h、12h、48h、96h、120h及14天進行腫瘤組織採樣(重複3份)，用全自動研磨儀進行組織破碎，藉由Trizol提取腫瘤組織的總RNA，最終利用定量PCR(螢光探針法)進行病毒核酸拷貝數的分析。結果如圖19、20所示。結果顯示：感染6h腫瘤內的病毒量到達峰值，較初始計量，約複製了500倍；感染48h後，病毒量開始低於初始注射量；14天後，未檢測到病毒核酸拷貝數。因此，JBS004可快速、高效在腫瘤內進行複製；14天後，並未檢測到JBS004，證明其不會在體內長時間蓄積，造成潛在的後續損傷，安全性良好。

2、急性毒性實驗。選擇40隻C57BL/6小鼠，雌雄各半。分為3個給藥組，單次肌肉注射給予供JBS004溶液，各組給藥量分別為：10³pfu/隻、10⁶pfu/隻、10⁹pfu/隻。空白對照組單次給予溶媒對照(單次肌肉注射PBS)，給藥體積均為100μL。動物給藥日定為該組動物觀察的第1天。動物在給藥後觀察14天，於給藥後第15天解剖。

實驗過程中，每2天記錄一次小鼠的體溫和體重，結果如圖21~24所示。給藥前及給藥後的30min、1h、2h、4h及10h對小鼠進行詳細籠邊觀察，後續實驗中每天至少進行一次籠邊觀察。實驗結束時，取小鼠外周血用於血液學和血液生化的檢測(血糖、肌酐、尿素氮、血尿素氮/肌酐、磷離子、鈣離子、總蛋白、白蛋白、球蛋白等)，並剖檢採集主要臟器，包括心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸/卵巢進行組織稱重，計算臟器係數。受篇幅限制，此處未體現血液學和血液生化學檢測的全部指標資料。檢測結果表明：未見小鼠異常死亡的情況，未出現與JBS004相關的臨床症狀。注射不同劑量的JBS004對小鼠臟器重量無顯著影響；對小鼠血液學和血液生化指標無顯著影響。本實驗條件下，最大耐受劑量(MTD)至少為10⁹pfu/隻。故上述最佳劑量(10⁸pfu/隻)在安全劑量內。

實施例4 JBS-NY TCR-T的構建

JBS-NY TCR-T為利用NY-ESO-1受體重組慢病毒對T淋巴細胞進行轉染後獲得的T細胞，具體構建方法為本領域的常規技術，簡述如下：

(1)根據已公佈的NY-ESO-1的受體基因序列人工合成NY-ESO-1受體基因。

(2)構建重組慢病毒載體。PCR擴增NY-ESO-1 TCR基因片段，引子為：ESO TCR-F1：5’-GGAATTCATGGAGACCCTCT-3’(SEQ ID NO：12)；

ESO TCR-R1：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTAGCCTCTGGAA-3’(SEQ ID NO：13)。

以已選殖的ESO TCR cDNA作為範本進行PCR體外擴增，PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃、30s，55℃、30s，72℃、45s，35個循環後72℃延伸5min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增的特異性片段(1824bp)。用EcoR I和Not I分別雙酶切PCR產物及pCL20c-MSCV-GFP質粒，玻璃奶凝膠回收酶切產物。將兩種酶切產物用T4 DNA連接酶連接，16℃過夜。然後將連接產物轉化感受態DH5α菌，培養擴增後用B型小提質粒試劑盒提取質粒。

(3)pCL20c-MSCV-ESO TCR重組慢病毒載體的鑒定。pCL20c-MSCV-ESO TCR質粒經EcoR I和Not I雙酶切、PCR後送往測序。

(4)pCL20c-MSCV-ESO TCR重組慢病毒的包裝。將T293細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中、在95%濕度、5% CO₂、37℃孵箱中常規培養，每週傳代3~4次。轉染前1d，將5×10⁶~6×10⁶個T293細胞種於D=10cm的細胞培養皿中。轉染前2h，換10mL新鮮10% DMEM培養基。

轉染前1h開始配置轉染液，轉染液由A液和B液組成。A液：pCL20c-HIV-gp質粒6μg、pCAG4-RTR2質粒2μg、CAG-VSV-G質粒2μg、pCL20c-MSCV-ESOTCR質粒10μg、50μL2.5mol/L的CaCl₂，用去離子水補至500μL體積，輕彈混勻，室溫放置5min。B液：2×HBSS(280mmol/L的NaCl、50mmol/L HEPES、1.5mmol/L Na₂HPO₄，pH=7.02)500μL。將A液滴入B液中，邊加邊震盪，室溫放置20min，即得轉染液。從孵箱內取出培養皿，將其向身體傾斜15°，將轉染液小心滴加在培養皿的低位一側，邊加邊左右搖動混勻，孵箱中培養16h或過夜。隨後換10mL新鮮生長培養基。轉染48h後收集上清，-80℃保存。取出包裝上清100mL，室溫融化，2000×g離心30min，收集上清，用0.45μm的PVDF膜過濾，12000×g超速離心3h，加入1mL無血清的DMEM，重新懸浮病毒沉澱，100μL/管分裝，-80℃保存。

(5)外周血中T細胞分離。從NCG-HLA-A2.1/Gpt人源化小鼠外周血中分離T淋巴細胞，加入細胞分離液，1500g/min離心15min，取第二層環狀乳白色淋巴細胞層，加入細胞洗滌液5mL，充分混勻後，1800g/min離心20分鐘，棄去上清後，將沉澱的淋巴細胞重新懸浮。

(6)重組慢病毒與T細胞共轉染。將重新懸浮的淋巴細胞調整為2×10⁵個/mL，加入6μg/mL的polybrene和適量10⁴pfu病毒，重複混勻，37℃孵育，繼續培養3~4天後，即可獲得JBS-NY TCR-T。

實施例5 溶瘤病毒疫苗與JBS-NY TCR-T聯合使用的效果展示

選擇6-8週齡，體重18-20g的NCG-HLA-A2.1/Gpt人源化小鼠，分別皮下接種2×10⁵個非小細胞肺癌A549細胞，相同、適宜條件下培養至移植瘤體積為100mm³左右時，開始處理。各組處理條件如表3所示。表3中，JBS NY TCR-T細胞的接種量為10⁶個，採取單次靜脈注射的方式進行。如果聯合使用JBS-NY TCR-T細胞和溶瘤病毒疫苗，則在靜脈注射JBS-NY TCR-T細胞後24h瘤內注射對應溶瘤病毒疫苗。每2天注射1次溶瘤病毒疫苗，共給藥3次，單次接種量均為10⁸pfu/隻。

表3各組處理情況展示表

自開始給藥至實驗終點，每2天記錄一次移植瘤體積。結果如圖25、26所示。並檢測各組肺癌細胞轉移的情況，結果如圖27所示。結果顯示：除對照組外，各組均對移植瘤體積有一定的抑制作用，並且從圖中可驚喜地發現，JBS004聯合JBS-NY TCR-T後治療效果提升顯著，從原本25%治癒率提升至92%~95%的治癒率，顯示了聯合治療的優勢；對抑制肺癌細胞的轉移也體現了優越的效果。

前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方式的範圍內。

<110> 上海榮瑞醫藥科技有限公司(Joint Biosciences(SH)Ltd.)

<120> 一種溶瘤病毒疫苗及其與免疫細胞聯合治療腫瘤的藥物

<130> 0190-PA-007TW

<150> 202010394768.7

<151> 2020-05-12

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 水皰性口炎病毒印第安那株(VSV MuddSummer)

<400> 1

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 水皰性口炎病毒印第安那株(VSV MuddSummer)

<400> 2

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(M51R,△L111,V221F,S226R)

<400> 3

<210> 4

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(M51R,△L111,V221F,S226R)(PRT)

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引子1

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引子2

<400> 6

<210> 7

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(△L111)

<400> 7

<210> 8

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(△L111,M51R)

<400> 8

<210> 9

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(△L111,V221F)

<400> 9

<210> 10

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(△L111,S226R)

<400> 10

<210> 11

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基質蛋白M(△L111,V221F,S226R)

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引子3

<400> 12

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引子4

<400> 13

Claims

一種溶瘤病毒減毒株，其特徵在於：與VSV MuddSummer亞型株相比，該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M經過改造，該改造包含胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除。
如請求項1所述的溶瘤病毒減毒株，其中該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除。
如請求項1或2所述的溶瘤病毒減毒株，其中該基質蛋白M的改造還包含胺基酸位點第51位甲硫胺酸突變為精胺酸。
如請求項3所述的溶瘤病毒減毒株，其中該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第51位甲硫胺酸突變為精胺酸。
如請求項1至4中任一項所述的溶瘤病毒減毒株，其中該基質蛋白M的改造還包含第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸。
如請求項5所述的溶瘤病毒減毒株，其中該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸。
如請求項1至6中任一項所述的溶瘤病毒減毒株，其中該基質蛋白M的改造還包含胺基酸位點第226位絲胺酸突變為精胺酸的胺基酸突變。
如請求項7所述的溶瘤病毒減毒株，其中該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除和第226位絲胺酸突變為精胺酸。
如請求項7所述的溶瘤病毒減毒株，其中該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為胺基酸位點第111位亮胺酸編碼鹼基敲除、第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。
如請求項9所述的溶瘤病毒減毒株，其中該溶瘤病毒減毒株的基質蛋白M的改造為第51位甲硫胺酸突變為精胺酸；第111位亮胺酸編碼鹼基敲除；第221位纈胺酸突變為苯丙胺酸和第226位絲胺酸突變為精胺酸。
如請求項1至10中任一項所述的溶瘤病毒減毒株，其中該基質蛋白M具有下組中任一種胺基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
一種如請求項1至11中任一項所述的溶瘤病毒減毒株作為載體在醫藥領域中的應用。
如請求項12所述的應用，其中該溶瘤病毒減毒株在製備藥物或疫苗中的應用。
一種溶瘤病毒疫苗，其特徵在於：在如請求項1至11中任一項所述的溶瘤病毒減毒株中插入抗原後製備得到。
如請求項14所述的溶瘤病毒疫苗，其中該抗原為特異性腫瘤抗原。
如請求項14或15所述的溶瘤病毒疫苗，其中該抗原為NY-ESO-1、gp33、gp100、TX103、Mucin-1、WT-1、MART-1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART-1、col6A3、酪胺酸酶、T抗原、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴色素互變異構酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪胺酸酶、SSX2、細胞週期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽釋放酶4、IGF2B3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3中的任意一種。
一種如請求項14至16中任一項所述溶瘤病毒疫苗製備的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物。
如請求項17所述的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物，其中該藥物同時包括該溶瘤病毒疫苗和免疫細胞。
如請求項17或18所述的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物，其中該免疫細胞為T細胞、NK細胞、巨噬細胞、DC細胞、TIL細胞中的任意一種：該免疫細胞為T細胞時，該T細胞為TCR-T細胞、CAR-T細胞、γ/δ-T、基因編輯的T細胞中的任意一種；該T細胞為TCR-T細胞時，該TCR-T細胞為經慢病毒或mRNA技術轉染的TCR-T細胞，或從血液中分離出的TCR-T細胞，或任意一種技術得到的TCR-T細胞；該免疫細胞為NK細胞時，該NK細胞為NK細胞或CAR-NK中的任意一種；該免疫細胞為巨噬細胞時，該巨噬細胞為巨噬細胞或CAR-M細胞中的任意一種。
如請求項17至19中任一項所述的抗腫瘤藥物或治療癌症的藥物，其中該腫瘤或癌症為頭頸部癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、神經母細胞瘤、滑膜肉瘤、圓細胞型脂肪肉瘤中的任意一種。