CZ298612B6 - Inhibitor proliferace endothelových bunek a jeho použití - Google Patents

Abstract

Zpusob inhibice proliferace endothelových bunek in vitro, pri nemž se na endothelovou bunku pusobí efektivním množstvím proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu, použití uvedeného proteinu pro výrobu léciva a príslušné farmaceutické kompozice.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových inhibitorů proliferace endothelových buněk. Inhibitor je schopen inhibovat choroby související s angiogenesí a modulovat angiogenní pochody. Kromě toho se předložený vynález týká diagnostických testů a souprav pro stanovování množství inhibitoru choroby související s angiogenesí a modulovat angiogenní pochody. Kromě toho se předložený vynález týká diagnostických testů a souprav pro stanovování množství inhibitoru ve vzorcích biologických tekutin, histochemických souprav k lokalizaci inhibitoru, DNA sekvencí kódujících inhibitor a molekulových zkoušek k monitorování biosyntézy a degradace inhibitoru, protilátek, které jsou pro inhibitor specifické, vývoje peptidických agonistů a antagonistů pro receptor inhibitoru, agonistů a antagonistů protilátky specifické pro receptor inhibitoru a cytotoxických činidel, vázaných na inhibitor.

Tento vynález mohl být vytvořen s vládní podporou grantu P01-CA45548 National Institutes of Health. Vláda Spojených států může na tento vynález uplatňovat určitá práva.

Dosavadní stav techniky

Termínem „angiogenese“, jak se zde používá, se rozumí vytváření nových krevních cév ve tkáni nebo v orgánu a zahrnuje proliferaci endothelových buněk. U lidí a zvířat za normálních fyziologických podmínek dochází k angikogenesi jen ve velmi specificky omezených případech. Angiogenese je na příklad obvykle pozorována při hojení ran, při vývoji plodu a embrya a při tvorbě žlutého tělíska, děložní sliznice a placenty. Termínem „endothel“ se rozumí tenká vrstva plochých epithelových buněk, která vystýlá serózní dutiny, lymfatické cévy a krevní cévy.

Má se za to, že jak kontrolovaná, tak nekontrolovaná angiogenese probíhají podobným způsobem. Endothelové buňky a pericyty obklopené základovou membránou tvoří kapilární krevní cévy. Angiogenese začíná erosí základové membrány enzymy, které uvolňují endothelové buňky a leukocyty. Endothelové buňky, které lemují průsvit krevních cév potom prostupují základovou membránou. Angiogenní stimulanty vyvolávají migraci endothelových buněk přes erodovanou základovou membránu. Migrující buňky tvoří „výhonek“ na matečné krevní cévě, kde endothelové buňky podléhají mitose a proliferují. Endothelové výhonky se navzájem spojují a vytvářejí nové krevní cévy.

K trvalé, neregulované angiogenesí dochází při mnoha nemocných stavech, metastázi nádorů a abnormálním růstu endothelových buněk a napomáhá pathologickým poškozením, ke kterým za takových podmínek dochází. Různá pathologická stadie nemoci, ve kterých dochází ke neregulo40 váné angiogenesí, byla společně zařazena jako angiogenně závislé nebo s angiogenesí související nemoci.

Hypothesa, že růst tumoru je závislý na angiogenesi, byla poprvé navržena v roce 1971. (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications:, N. Engl. Jour. Med. 285:

1182-1186, 1971). V nejjednodušší vyjádření konstatuje: „Jakmile se začíná vytvářet tumor, musí být každé zvětšení populace buněk tumotu předcházeno nárůstem nových kapilár soustřeďujících se do nádoru“. Běžně se rozumí, že vytváření tumoru indikuje prevaskulámí fázi růstu tumoru, v níž populace nádorových buněk zaujímá objem několika krychlových milimetrů a nepřekračujíc několik milionů buněk, může přežít na existujících hostitelských mikrocévách.

Expanse objemu tumoru na tuto fázi vyžaduje vznik nových kapilárních krevních cév. Plicní mikrometastázy v časné prevaskulámí fázi u myší mohou být na příklad nezjistitelné, pokud se nepoužije vysokorozlišovací mikroskopie na histologických řezech.

Příklady nepřímých důkazů, které podporují tuto představu, zahrnují:

-1 CZ 298612 B6 (1) Rychlost růstu tumoru implantovaného do subkutánních transparentních dutin myší je před neovaskularisací pomalá a lineární a rychlá a téměř exponenciální po neovaskularisaci. (Algine GH a další, Vascular reactions of normál and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normál and neoplastic transplants. J. Nati. Cancer Inst. 6:73-75, 1994).

(2) Tumory vyrostlé v isolovaných promytých orgánech, kde krevní cévy nepodléhají proliferaci, jsou omezeny na 1 až 2 mm³, avšak rychle expandují na >1000 větší objem, pokud jsou transplatovány do myší a dojde u nich k neovaskularisaci. (Folkman J. a další, Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth and metastasis of bipsy materiál in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals ofSurgery 164:491-502, 1966).

(3) Růst tumoru v avaskulámí rohovce probíhá pomalu a lineární rychlostí, ale po neovaskularisaci nastává růst exponenciální. (Gimbrone M. A., Jr. a další, Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit comea. J. Nati. Cancer Institute 52:41-427, 1974).

(4) Tumory suspendované ve vodné kapalině přední komory králičího oka zůstávají životaschopné, avaskulámí a co do velikosti omezené na <1 mm³. Jakmile jsou implantovány do cévního lůžka duhovky, nastává neovaskularisace a rychle rostou, dosahujíce šestnáctitisící násobek svého původního objemu během dvou týdnů. (Gimbrone M. A., Jr. a další, Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularisation, J. Exp. Med. 136:261-276).

(5) Když se tumory implantují do chorioallantoické membrány kuřecího embrya, během avaskulámí fáze > 72 hodin rostou pomalu, ale nepřekročí střední průměr 0,93 + 0,29 mm. K rychlé expansi tumoru dochází během 24 hodin po náběhu neovaskularisace a v sedmém dni dosahují tyto vaskularisované tumory střední průměr 8,0 + 2,5 mm. (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1997).

(6) Vaskulámí tvoření metastáz v králičích játrech se projevuje různorodostí v rozměrech metastáz, ale vykazuje poměrně jednotnou hranici velikosti při níž vaskularisace nastupuje. Nádory jsou obvykle avaskulámí až do průměru 1 mm, avšak za tímto průměrem dochází k neovaskularisaci. (Lien W. a další, The blood supply of experimental liver metastases. II. A. microcirculary study of normál and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970).

(7) U transgenních myší, u kterých se karcinomy vyvíjejí v ostrůvcích pankreatu, jsou prevaskulámí hyperplastické ostrůvky omezeny na velikost <1 mm. Ve stáří 6 až 7 týdnů nastává neovaskularisace 4 až 10 % ostrůvků a z těchto ostrůvků vznikají velké vaskularisované tumory s více než tisícinásobně větším objemem než měly ostrůvky prevaskulámí. (Folkman J. a další, Industion of angiogenesis during the transition from hyperplasie to neoplasia. Nátuře 339-58-61, 1989).

(8) Specifická protilátka proti VEGF (vaskulámí endothelální růstový faktor) snižuje hustotu mikrocév a způsobuje „význačnou nebo dramatickou“ inhibici růstu tří lidských nádorů, které jsou odkázány na VEGF jako jediného prostředníka angiogenese (u holých myší). Protilátka neinhibuje růst nádorových buněk in vitro. (Kim K.J. a další, Inhibition of vascular endothelial growth factor-induces angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nátuře 362:841-844, 1993).

(9) Anti-bFGF monoklonální protilátka působí u myší 70% inhibici růstu tumoru, která je závislá na sekreci bFGF jako jejího jediného prostředníka angiogenese. Protilátka neinhibuje růst nádorových buněk in vitro. (Hoři A. a další, Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroplast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991).

-2CZ 298612 B6 (10) Intraperitonální injekce bFGF zvětšuje růst primárního tumoru a jeho metastáz stimulací růstu kapilárních endothelových buněk v tumoru. Nádorovým buňkám samotným chybí receptory pro bFGF a bFGF není mitogenem pro nádorové buňky in vitro. (Gross J.L. a další, Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proč. Amer. Assoc. Canc. Des. 31:79, 1990).

(11) Specifický inhibitor angiogenese (AGM - 1470) inhibují růst tumoru a metastáz in vivo, avšak je mnohem méně účinný při inhibici proliferace nádorových buněk in vitro. Inhibuje maximálně poloviční proliferaci vaskulámích endothelových buněk při o 4 řady nižší koncentraci než je inhibována proliferace nádorových buněk. (Ingber D. a další, Angioinhibins: Synthetic analogues of humagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nátuře, 48:555-557, 1990). Existují i nepřímé klinické důkazy, že růst tumoru je závislý na angiogenesi.

(12) Lidské retinoblastomy, jež jsou metastatické do sklivce, se vyvíjejí do avaskulámích sferoidů, které jsou omezeny na méně než 1 mm³ navzdory skutečnosti, že jsou schopné růstu a inkorporují ³H-thymidin (když jsou vyňaty z enukleovaného oka a analyzovány in vitro).

(13) Karcinom ovaria metastázuje do peritonální membrány jako drobná avaskulámí bílá zrnka (1 až 3 mm³). Tyto implantáty zřídka vyrostou větší pokud u jednoho nebo více z nich nedojde k neovaskularisaci.

(14) Intenzita neovaskularisace při rakovině prsu (Weidner N. a další, Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma, N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991, a Weidner N. a další, Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J. Nati. Cancer Inst. 84:1875-1887,1992) a při rakovině prostaty (Weidner N., Carroll P.R., Flax J., Blumenfeld W., Folkman J., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostatě carcinoma, American Journal of Pathology, 143(2): 401—409, (1993) vysoce koreluje s risikem budoucí metastáze.

(15) Metastáze kožního melanomu je před neovaskularisaci vzácná. Počátek neovaskularisace vede ke zvětšení tloušťky postiženého místa a zvýšenému risiku metastáze. (Srivastava A. a další, The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0,76-4,0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. pathol.\33·. 419-423, 1988).

(16) Při rakovině močového měchýře je hladina angiogenního peptidu bFGF v moči citlivějším indikátorem stavu a rozsahu nemoci než je cytologie. (Nguyen M. a další, Elevated levels of an angiogenic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer petients. J. Nati. Cancer Inst. 85:241-242, 1993).

Je tudíž jasné, že angiogenese hraje významnou roli při metastázi rakoviny. Jestliže by tato angiogenní aktivita mohla být potlačena nebo eliminována, anebo jiným způsobem kontrolována a modulována, potom by tumor, i když bude přítomen, nerostl. Prevence angiogenese ve stadiu nemoci může odvrátit poškození způsobené invasí nového mikrovaskulámího systému. Terapie zaměřené na ovládání angiogenních procesů mohou vést k odstranění nebo zmírnění těchto chorob.

Co je zapotřebí, je tedy komposice a metoda, které mohou inhibovat proliferaci endothelových buněk jako je nežádoucí růst krevních cév, zvláště do tumorů. Potřebná je také metoda pro detekci, měření a lokalizaci komposice. Komposice by měla být schopna překonat aktivitu endogenních růstových faktorů v premetastatických tumorech, zabránit tvorbě kapilár v tumorech a takto inhibovat růst nádorů. Komposice, fragmenty komposice a protilátky specifické pro komposici by měly být rovněž schopny modulovat tvorbu kapilár v jiných angiogenních pochodech jako je hojení ran a reprodukce. Komposice a metoda pro inhibici angiogenese mají být nejlépe netoxické a mít málo vedlejších účinků. Potřebný je rovněž metoda pro detekci, měření a lokalisaci vazebných míst pro komposici právě tak, jako míst pro biosyntézu kompozice. Kompo-3CZ 298612 B6 sice a fragmenty komposice by měly být schopny konjugovat s jinými molekulami pro účely jak radioaktivního, tak neradioaktivního značení.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje metody využití isolované kringle 5 oblasti plasminogenu pro inhibici aktivity endothelové proliferace. Isolovaný peptidový fragment kringle 5, který má inhibiční aktivitu, obsahuje přibližně osmdesát (80) aminokyselin v sekvenci:

CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP WCYTTNPRKLYDYCDVPQ SEQ ID NO:1

kde C = Cys	Y = Tyr	D = Asp
M = Met	R = Arg	W = Trp
F = Phe	T = Thr	H = His
G = Gly	V = Val	S = Ser
N = Asn	P = Pro	I = Ile
K = Lys	Q = Gin	A = Ala
E = Glu	L = Leu

Peptid proliferace endothelových buněk podle předkládaného vynálezu odpovídá peptidovému fragmentu generovanému z lidského plasminogenu, začínajícímu přibližně u aminokyseliny 462 lidského plasminogenu a obsahujícímu přibližně 80 aminokyselin. Předkládaný vynález zahrnuje také diagnostické a terapeutické metody zjišťování přítomnosti nebo nepřítomnosti inhibujícího peptidu v tělních tekutinách a způsoby podávání peptidu nebo peptid specificky vázajících protilátek pacientovi, který potřebuje terapeuticky efektivní množství takových sloučenin, aby se regulovala proliferace endothelových buněk. Vedle toho může být inhibující peptid použit ve spojení s kulturami in vitro proliferujících endothelových buněk pro testování sloučenin, které zmírňují inhibiční efekt peptidu tj. pro vyhledávání růstových faktorů nebo jiných sloučenin schopných překonat nebo změnit inhibici proliferace endothelových buněk.

Předmětem vynálezu je způsob inhibice proliferace endothelových buněk in vitro, který spočívá v tom, že se do endothelové buňky aplikuje efektivní množství proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu.

Předkládaný vynález zahrnuje proteinový inhibitor proliferace indothelových buněk, charakterizovaný jako sekvence přibližně 80 aminokyselin pocházející z lidského plasminogenu jako kringle 5. Sekvence aminokyselin v inhibitoru se může mezi jednotlivými species mírně lišit. Je třeba mít za to, že počet aminokyselin v molekule aktivního inhibitoru se může měnit, a že na všechny blízko homologické sekvence aminokyselin s inhibiční endothelovou aktivitou je třeba nahlížet jako na spadající do rozsahu předkládaného vynálezu.

Předmětem vynálezu je rovněž použití proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu, pro výrobu léčiva pro ošetřování angiogenesí zprostředkované choroby. U isolovaného proteinu je žádoucí čistota nejméně kolem 80 %, více žádaná je čistota kolem nejméně 90 %, zvláště nejméně kolem 95 %. Předkládaný vynález je použitelný zejména pro léčení nebo pro potlačování růstu tumorů. Lidem nebo zvířatům s prevaskularisovanými metastazovanými tumory pomáhá podávání inhibitoru zamezit růst nebo expansi takových tumorů.

-4CZ 298612 B6

Předkládaný vynález zejména pak zahrnuje komposice, které obsahují proliferaci endothelových buněk inhibující množství proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu, a farmaceuticky přijatelný nosič. Isolovaný kringle 5 fragment peptidu, který má inhibitomí aktivitu, obsahuje sekvenci přibližně osmdesáti (80) aminokyselin:

CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWTkAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP WCYTTNPRKLYDYCDVPQ SEQ ID NO:1

kde C - Cys	Y = Tyr	D =	Asp
M = Met	R = Arg	w =	Trp
F = Phe	T = Thr	H =	His
G = Gly	V = Val	S =	Ser
N - Asn	P = Pro	I =	Ile
K = Lys	Q = Gin	A =	Ala
E = Glu	L - Leu

Inhibitor lze isolovat z plasminogenů jako je lidský plasminogen, nebo může být syntetizován chemickými nebo biologickými postupy (např. kulturou buněk, rekombinantní genovou expresí, syntézou peptidu a in vitro enzymovou katalýzou plasminogenu nebo plasminu poskytující aktivní inhibitor). Rekombinantní techniky zahrnují genovou amplifikací ze zdrojů DNA pomocí řetěio zové reakce polymerázy (PCR) a genovou amplifikací ze zdrojů RNA při použití reversní transkriptázy/PCR). Předkládaný vynález zahrnuje také komposici obsahující vektor obsahující sekvenci DNA, kódující inhibitor proliferace endothelových buněk, přičemž vektor, pokud je v buňce přítomen, má schopnost exprimovat inhibitor, dále komposici zahrnující vektor obsahující buňku, přičemž vektor obsahuje sekvenci DNA, která kóduje inhibitor nebo jeho fragmenty či analogy, a v níž vektor, pokud je v buňce přítomen, je schopen exprimovat inhibitor. Vynález je možno použít pro metodu spočívající na implantování buňky obsahující vektor do lidského nebo zvířecího jedince, přičemž vektor obsahuje inhibitor kódující sekvenci DNA a kde vektor, pokud je v buňce přítomen, je schopen exprimovat inhibitor.

Termínem „značně podobný“ nebo „v podstatě homologický“ pokud je používán ve vztahu k aminokyselinám inhibitoru a sekvencím nukleové kyseliny, se míní sekvence aminokyselin, která má inhibiční aktivitu pro proliferaci endothelových buněk, která má molekulární hmotnost kolem 14 kD, která má také vysoký stupeň sekvenční homologie s proteinem, který má zde publikovanou specifickou sekvenci N-koncových aminokyselin anebo sekvenci nukleové kyseli25 ny, která kóduje inhibitor proliferace endothelových buněk o molekulární hmotnosti kolem 14 kD a má vysoký stupeň homologie s aminokyselinou mající zde publikovanou, specifickou sekvenci N-koncové aminokyseliny.

Vysoký stupeň homologie představuje nejméně přibližně 80 % homologie aminokyselin, žádoucí je nejméně přibližně 90 % homologie aminokyselin a lépe je nejméně přibližně 95 % homologie aminokyselin. Termínem „endothelová inhibiční aktivita“, jak je zde používán, se rozumí schopnost molekuly inhibovat obecně angiogenesi a například inhibovat růst hovězích kapilárních endothelových buněk v kultuře za přítomnosti růstového faktoru fibroblastu.

Předkládaný vynález je použitelný pro detekci inhibitoru v tělních tekutinách a tkáních za účelem diagnosy nebo prognosy chorob jako je rakovina. Může být rovněž použit k detekci vazebných míst a receptorů v buňkách a tkáních. Je použitelný také k léčení nebo prevenci angiogenních chorob a procesů, které představují arthritis a tumory, stimulace produkce inhibitoru, a/nebo podávání isolovaného inhibitoru nebo žádaného vyčištěného inhibitoru, nebo inhibitomího ago-5CZ 298612 B6 nisty nebo antagonisty, a/nebo specifická antiséra inhibitoru nebo antiséra podávaná pacientovi proti specifickým antisérům inhibitoru, avšak nejsou omezeny jen na ně. Další léčebné postupy představují podávání inhibitoru, jeho biologicky aktivních fragmentů, analogů inhibitoru, specifických antisér inhibitoru nebo agonistů a antagonistů receptoru inhibitoru spojených s cytotoxickými činidly.

Pasivní protilátková terapie užívající protilátky, které specificky vážou inhibitor, může být používána pro modulování angiogenně podmíněných procesů jako je reprodukce, vývoj a hojení poranění a obnova tkání. Mimo to antiséra zaměřená na Fab oblasti specifických protilátek inhibitoru mohou být podávána ke blokování schopnosti antisér specifických pro endogenní inhibitor, inhibitor vázat.

Předkládaný vynález je použitelný také pro genovou terapii, čímž se reguluje u pacienta gen kódující inhibitor. Různé metody přenosu nebo dodání DNA do buněk pro expresi proteinu produkovaného genem, jinak označované jako genová terapie, jsou popsány v Gene Transfer into Mammalian Somatis Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4): 335-356 (1992), na které se takto odkazuje. Genová terapie představuje inkorporaci sekvencí DNA do somatických buněk nebo zárodečných buněk k použití v buď ex vivo nebo in vivo terapii. Genová terapie slouží k náhradě genů, zvýšení normální nebo abnormální funkce genů a kboji proti infekčním chorobám a jiným pathologickým procesům.

Strategie pro ošetřování těchto medicínských problémů genovou terapií se skládají z terapeutických strategií jako je identifikace vadného genu a poté přidání funkčního genu buď k náhradě funkce vadného genu nebo pro zvýšení funkce málo funkčního genu; nebo se skládají z profylaktických strategií jako je přidání genu pro produkt proteinu, kteiý upraví stav, nebo který učiní tkáň nebo orgán citlivější pro léčebný režim. Jako příklad profylaktické strategie může být do pacienta umístěna sekvence nukleové kyseliny kódující inhibitor a tím zamezen výskyt angiogenese nebo může být vložen gen, který činí buď tumoru citlivější vůči radiaci a ozařování tumoru by způsobilo zvýšené usmrcování buněk tumoru.

Pro přenos DNA inhibitoru nebo sekvencí regulujících inhibitor existují různé postupy. Jako metoda genové terapie se rovněž předpokládá transfekce sekvencí jiného promotoru než toho, který se normálně nalézá specificky spojený s inhibitorem, nebo další sekvence, které by zvyšovaly produkci proteinu inhibitoru. Příklad této technologie se nalézá v Transkaryotic Therapies, lne., z Cambridge, Massachusetts, kde se užívá homologní rekombinace ke vložení „genetického spínače“, který v buňkách spouští erythropoetinový gen. Viz Genetic Engineering News, April 15, 1994. Takové „genetické spínače“ mohou být využívány k aktivaci inhibitoru (nebo receptoru inhibitoru) v buňkách, u kterých normálně k expresi inhibitoru (nebo receptoru pro inhibitor) nedochází.

Metody genového přenosu pro genovou terapii spadají do tří širokých kategorií: fysikální (např. elektroporace, přímý genový přenos a bombardování částic), chemické (nosiče založené na lipidech nebo jiné nevirové vektory) nebo biologické (z viru derivovaný vektor a absorpce receptoru). Mohou být na příklad použity nevirové vektory, které obsahují liposomy pokryté DNA. Takové komplexy liposom/DNA mohou být intravenosně přímo pacientovi injikovány. Má se za to, že komplexy liposom/DNA se koncentrují v játrech, kde předávají DNA makrofágům a Kupfferovým buňkám. Tyto buňky mají dlouhou životnost a tím poskytují dlouhodobou expresi dodané DNA. Mimo to genové vektory nebo „nahou“ DNA lze přímo injikovat do požadovaného orgánu, tkáně nebo tumoru pro cílené dodání terapeutické DNA.

Metodologie genové terapie mohou být popisovány také z hlediska nasazení. Základní cesty podávání genů představuje genový přenos ex vivo, genový přenos in vivo a genový přenos in vitro. Při genovém přenosu ex vivo jsou buňky odebrány pacientovi a pěstovány v buněčné kultuře. DNA se trasfikuje do buněk, počet transfíkovaných buněk se zmnoží a potom se provede jejich reimplantace pacientovi. Při genovém přenosu in vitro jsou transformované buňky

-6CZ 298612 B6 pěstovány v kultuře, jako je tkáňová kultura a nikoliv jednotlivé buňky jednotlivého pacienta. Tyto „laboratorní buňky“ se transfikují, transfikované buňky se vytřídí a zmnoží buď pro implantaci pacienta, nebo pro jiná použití.

Genový přenos in vivo představuje zavedení DNA do pacientových buněk, při čemž tyto buňky zůstávají uvnitř pacientova těla. Metody zahrnují užití virově zprostředkovaného genového přenosu při použití neinfekčního viru k dodání genu pacientovi nebo injikování „nahé“ DNA do dané oblasti u pacienta a DNA je přijímána určitým procentním podílem buněk, v kterém je genově produkovaný protein exprimován. Kromě toho může být pro inserci DNA inhibitoru proliferace endothelových buněk nebo sekvencí regulujících inhibitor in vitro použito i jiných zde popsaných metod, jako je použito „genového děla“.

Chemické metody genové terapie mohou k dopravení DNA přes membránu buňky obsahovat sloučeninu na bázi lipidů, nikoliv nezbytně liposom. Lipofektiny nebo cytofektiny, jež se jako na bázi lipidů positivně nabité ionty vážou na negativně nabitou DNA, vytvářejí komplex, který může proniknout membránou buňky a poskytnout DNA do vnitřku buňky. Jiná chemická metoda využívá endocytosu na bázi receptoru, která představuje vázání specifického ligandu na receptor na povrchu buňky, obaluje jej a transportuje přes membránu buňky. Ligand se váže na DNA a celý komplex je transportován do buňky. Genový komplex ligandu je injektován do krevního oběhu a potom budou cílové buňky s receptorem specificky vázat ligand a transportovat komplex ligand-DNA do buňky.

Mnohé metodologie genové terapie využívají ke vkládání genů do buněk virových vektorů. Alterované vektory retrovirů byly na příklad použity při ex vivo metodou zavádění genů do periferálních a tumor infiltrujících lymfocytů, hepatocytů, epidermálních buněk, myocytů nebo jiných somatických buněk. Tyto alterované buňky se potom zavádějí do pacienta, aby se z vložené DNA získal produkt genu.

Virové vektory byly také využity pro vkládání genů do buněk při postupech in vivo. Pro směrování tkáňové specifické exprese cizích genů mohou být využity cis-působící regulační elementy nebo promotory, o kterých se ví, že jsou pro tkáň specifické. Toho může být alternativně dosaženo pomocí dodávání DNA nebo virových vektorů in šitu do specifických anatomických oblasti in vivo. Genový přenos do krevních cév in vivo byl například dosažen in vitro implantací transdukovaných endothelových buněk do zvolených míst na stěnách arterií. Virus infikoval obklopující buňky, u kterých došlo také k expresi produktu genu. Virový vektor může být dodáván přímo do místa in vivo na příklad katetrem, takže se infikují virem je určité oblasti a zajistí se dlouhodobá, místně specifická exprese genu. Genový transfer in vivo pomocí vektoru retrovirů byl také demonstrován na tkáni prsu a jatemí tkáni injekcí alterovaného viru do krevních cév vedoucích k orgánům.

Virové vektory, které byly použity v postupech genové terapie, zahrnují, avšak neomezují se na ně, retroviry, jiné RNA viry jako je virus dětské obrny nebo Sindbis virus, adenovirus, adenoasociovaný virus, herpes viry, SV 40, viry kravských neštovic a další DNA viry. Replikačně defektivní, retrovirové vektory z myší, jsou nejčastěji užívány vektory genového přenosu. Retroviry myší leukemie jsou složeny z jediného vlákna RNA komplexovaného s proteinem buněčného jádra a enzymy polymerázy (pol), obaleného proteinovým jádrem (gag) a obklopeného glykoproteinovou obálkou (env), která určuje rozsah uhostění. Genomová struktura retrovirů zahrnuje gag, pol a env geny vymezené 5 a 3 dlouhými terminálními repeticemi (LTR). Retrovirové vektorové systémy využívají skutečnost, že minimální vektor obsahující 5 a 3 LTF a signál pro sbalování jsou dostatečné, aby došlo ke sdružování vektoru, infekci a integraci do cílových buněk způsobující, že virové strukturální proteiny jsou dodávány in trans v obalové buněčné linii. Základní výhody retrovirových vektorů pro genový přenos zahrnují účinnou infekci a expresi genu u většiny typů buněk, přesnou integraci jediné terapie vektoru do cílové buňky chromosomální DNA a snadnou manipulaci s retrovirovým genomem.

-7CZ 298612 B6

Adenovir se skládá z lineární, dvouvláknové DNA komplexované s proteiny jádra, obklopené kapsidovými proteiny. Pokroky v molekulární virologii přinesly schopnost využívat biologii těchto organismů, aby se vytvořily vektory schopné přenést nové genetické sekvence do cílových buněk in vivo. Vektory založené na adenovirech budou dávat vysoké hladiny peptidů produkova5 ných expresí genů. Adenovirové vektory vykazují vysoké účinnosti infektivity i při nízkých titrech viru. Kromě toho je virus plně infektivní jako buňky prostý virion, takže nejsou nutné injekce produkčních buněčných linií. Jiná potenciální výhoda adenovirových vektorů je schopnost dosáhnout dlouhodobé exprese heterologických genů in vivo.

Mechanické metody dodávání DNA zahrnují fusogenní lipidové měchýřky jako jsou liposomy nebo jiné měchýřky pro fusi s membránou, lipidové částice DNA inkorporující kationidní lipid jako je lipofektin, polylysinem zprostředkovaný přenos DNA, přímou injekci DNA jako je mikroinjekce DNA do zárodečných nebo somatických buněk, pneumaticky dodávané částice potažené DNA, jako jsou částečky zlata používané v „genovém děle“ a anorganické chemické přístupy jako je transfekce kalcium fosfátem. Jinou metodou genové terapie prostřednictvím ligandu je komplexace DNA specifickými ligandy za vzniku konjugátů ligand-DNA, aby se DNA nasměrovala do specifické buňky nebo tkáně.

Bylo zjištěno, že injektování plasmidu DNA do svalových buněk poskytuje vysoké procento buněk, které se transfektují a udržují expresi signálních genů. DNA plasmidy může nebo nemusí se integrovat s genomem buněk. Pokud transfikovaná DNA neintegruje, umožnila by přenesení a expresi genů produkujících proteiny v terminálně diferencovaných, neproliferativních tkáních po prodlouženou dobu bez obavy, že dojde k mutačním insercím, delecím nebo změnám buněčného nebo mitochondriálního genomu. Dlouhodobý, ne však nezbytně permanentní transfer terapeutic25 kých genů do specifických buněk může umožňovat léčení při genetických chorobách a být užíván při profylaxi. DNA může být periodicky reinjektována, aby se udržela hladina genového produktu bez mutací probíhajících v genomech recipientních buněk. Pokud se exogenní DNA neintegrují, může být umožněna přítomnost několika různých útvarů exogenní DNA v jedné buňce se všemi útvary exprimujícími různé produkty genů.

Metody genového přenosu prostřednictvím částic byly nejprve použity při transformaci rostlinných tkání. V zařízení pro bombardování částicemi čili v „genovém děle“ se vytváří hnací síla pro akceleraci částic o vysoké hustotě (jako je zlato nebo wolfram), obalených DNA, na vysokou rychlost, která umožňuje průnik cílovými orgány, tkáněmi nebo buňkami. Bombardování části35 cemi může být používáno v systémech in vitro nebo při ex vivo či in vivo technikách zavádění DNA do buněk, tkání nebo orgánů.

Elektroporace užívá pro genový transfer elektrický proud, aby se buňky nebo tkáně staly citlivé pro genový transfer prostřednictvím elektroporace. Pro zvýšení permeability membrány takovým způsobem, aby molekuly DNA mohly proniknout do buněk, se používá krátký elektrický impuls při dané síle pole. Tato technika může být použita v systémech in vitro, nebo při ex vivo či in vivo technikách pro zavádění DNA do buněk, tkání nebo orgánů.

K transfekci cizí DNA do buněk může být využit genový přenos in vivo prostřednictvím nosiče.

Komplex nosič-DNA může být běžným způsobem zaveden do tělní tekutiny nebo krevního oběhu a potom být specificky nasměrován v těle do cílového orgánu nebo tkáně. Mohou být použity jak liposomy, tak polykationty jako polylysin, lipofektiny nebo cytofektiny. Mohou být vyvinuty liposomy, které jsou specifické pro buňky nebo specifické pro orgány a tak cizí DNA nesená liposomem bude cílovými buňkami vstřebána. Injekce imunoliposomů, které jsou zacílenými buňkami vstřebána. Injekce imunoliposomů, které jsou zacíleny na specifický receptor určitých buněk, může být užívána jako vhodná metoda inserce DNA do buněk nesoucích receptor. Jiný použitý systém nosiče je systém konjugátu asialoglykoprotein/polylysin pro vnesení DNA k hepatocytům při genovém transferu in vivo.

-8CZ 298612 B6

Transfekovaná DNA může být také komplexována s jinými druhy nosičů tak, že DNA je vnesena do cílové buňky a potom se usadí v cytoplasmě nebo v nukleoplasmě. DNA může být sdružována s nosičem z jaderných proteinů ve specificky vytvořených měchýřkových komplexech a vnášena přímo do jádra.

Genová regulace inhibitoru podle předkládaného vynálezu může být uskutečněna podáváním sloučenin, které se vážou ke genu pro inhibitor, nebo kontrolují oblasti spojené s genem nebo jemu odpovídajícím přepisem RNA, aby se modifikoval stupeň transkripce nebo translace. Kromě toho buňky transfekované sekvencí DNA kódující inhibitor mohou být podávány pacientovi, aby poskytly zdroj inhibitoru in vivo. Buňky mohou být transfekovány na příklad s vektorem, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, jež kóduje inhibitor.

Zde používaným termínem „vektor“ je míněn nosič, který může obsahovat nebo se sdružovat se specifickými sekvencemi nukleové kyseliny a jehož funkcí je transportovat do buňky specifické sekvence nukleové kyseliny. Příklady vektorů představují plasmidy a přenosné mikroorganismy jako viry, nebo nevirové vektory jako konjugáty ligand-DNA, liposomy, komplexy lipid-DNA. Může být žádoucí, že molekula rekombinantní DNA, obsahující DNA sekvencí inhibitoru proliferace endothelových buněk, je operativně připojena k sekvenci kontroly exprese, aby vznikl expresivní vektor schopný exprese inhibitoru. Transfekované buňky mohou pocházet z normální tkáně pacienta, z chorobné pacientovy tkáně nebo to mohou být buňky, které pacientovi nepatří.

Buňky z pacientova tumoru mohou být na příklad transfekovány s vektorem schopným exprese proteinu inhibitoru podle předkládaného vynálezu a znovu zavedeny do pacienta. Transfekované tumorové buňky produkují v pacientovi hladiny inhibitoru, které růst tumoru inhibují. Pacienty mohou být jedinci lidští nebo zvířecí. Inhibitor DNA může být mimo to injikován pacientovi přímo bez pomoci nosiče. Inhibitor DNA může být injikován zejména do kůže, svalu nebo kive.

Exprese inhibitoru může pokračovat po dlouhou dobu anebo může být inhibitor DNA podáván periodicky, aby se v buňce, tkáni nebo orgánu či biologické tekutině udržovala požadovaná hladina inhibičního proteinu.

Třebaže, nechtíce se vázat následující hypotézou, se má za to, že stává-li se tumor angiogenním, uvolňuje jeden nebo více angiogenních peptidů (např. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF atd.), které působí lokálně, jejich terčem je endothel v sousedství primárního tumoru ze směru extra35 vaskulámího a necirkulují (nebo cirkulují s krátkým poločasem). Tyto angiogenní peptidy musí být produkovány v množství dostatečném, aby se u primárního tumoru překonalo působení inhibitoru endothelových buněk (inhibitorů angiogenese) pokračovat v expansi populace jeho buněk. Jakmile již takový primární tumor narůstá, trvale uvolňuje do oběhu inhibitory endothelových buněk. Podle této hypotézy působí tyto inhibitory na dálku ve vzdálenosti od primárního tumoru, jejich terčem je kapilární endothel metastáze u intravaskulámího směru a pokračují v cirkulaci. Takže již v době, kdy vzdálená metastáze může začínat iniciaci angiogenese, může být přicházejícím inhibitorem inhibován kapilární endothel v jejím sousedství.

Produkce inhibitoru proliferace endothelových buněk podle předkládaného vynálezu se uskuteč45 ňuje pomocí podobných technik. Může být provedena technikou rekombinantní DNA zahrnující (1) stupeň identifikace a čistění inhibitoru jak je zde popsáno a znázorněno na obrázcích, (2) stupeň určující N-koncovou sekvenci aminokyselin vyčištěného inhibitoru, (3) stupeň syntetického generování primerů 5 a 3 DNA oligonukleotidu pro sekvenci inhibitoru, (4) stupeň amplifikace inhibitoru genové sekvence pomocí polymerázy, (5) stupeň inserce amplifikované sekven50 ce do příslušného vektoru jako expresivního vektoru, (6) stupeň inserce genu obsahujícího vektor do mikroorganismu nebo jiného expresního systému, schopného exprimovat gen inhibitoru a (7) stupeň isolace rekombinačně produkovaného inhibitoru. Vhodnými vektory jsou expresivní vektory virové, bakteriální a eukaryotické (jako kvasinky). Shora zmíněné techniky jsou podrobněji popsány v laboratorních manuálech jako je „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, druhé vydání, od Sambrooka a spol., Cold Spring Harbor Press, 1989, který je zde ocitován.

-9CZ 298612 B6

Ještě dalším způsobem produkování inhibitoru nebo jeho biologicky aktivních fragmentů je syntéza peptidů. Sekvence aminokyselin inhibitoru může být na příklad určena metodami automatisovaného sekvenování peptidu. Jakmile je isolován gen nebo sekvence DNA, která kóduje, inhibitor na příklad shora popsanými metodami, může být sekvence DNA stanovena alternativně pomocí v oboru běžně známých manuálních nebo automatisovaných sekvenčních metod. Sekvence nukleové kyseliny pak poskytuje informaci týkající se pořadí aminokyselin.

Jakmile je zajištěno pořadí aminokyselin v peptidu, mohou být peptidové fragmenty syntetizová10 ny v oboru běžně známými technikami, jaké jsou na příklad popsány v „Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach“, E. Atherton a R.C. Sheppard, IRL, Press, Oxford, England. Mohou se syntetizovat rozmanité fragmenty a následně se spolu spojují za vzniku fragmentů větších. Tyto syntetické peptidy fragmenty lze také připravit substitucemi aminokyselin na specifickém místě, aby se otestovala agonistní nebo antagonistní aktivita in vitro a in vivo.

Peptidové fragmenty, které mají vysokou vazebnou afinitu ke tkáním, mohou být použity na afinitních kolonách k isolaci receptorů vázajících inhibitor.

Inhibitor je účinný při ošetřování chorob nebo procesů jako je angiogenese, které se dějí prostřednictvím nebo zahrnují proliferaci endothelových buněk. Předkládaný vynález obsahuje způsob ošetřování angiogenesí zprostředkované choroby účinným množstvím inhibitoru nebo jeho biologicky aktivního fragmentu anebo kombinací fragmentů inhibitoru, které mají společně anti-angiogenní aktivitu, nebo agonisty a antagonisty inhibitoru. Angiogenesí zprostředkované choroby představují tvrdé tumory, v krvi vznikající tumory jako leukemie, tumorové metastáze, benigní tumory, na příklad hemangiomy, akustické neuromy, neurofibrimy, trachomy a pyogenní granulomy, reumatoidní arthritis, psoriasis, oční angiogenní choroby na příklad diabetická retinopathie, retinopathie nedonošenců, makulámí degenerace, odmítání rohovkových štěpů, neovaskulámí gluakom, retrolentální fibroplasie, rubeosa, Oslerův-Webberův syndrom, myokardiální angiogenese, neovaskularisace plátů, telangiektasie, hemofilické klouby, angiofibrom a granulace ran, avšak neomezují se jen na ně.

Inhibitor je užitečný při léčení nemocí nadbytečné nebo abnormální stimulace endothelových buněk. Tyto choroby představují intestinální adhese, atherosklerosa, skleroderma a hypertrofické jizvy tj. keloidy, ale nejsou omezeny jen na ně. Inhibitor může být použit jako činidlo regulace porodnosti prevencí vaskularisace nutné pro implantaci embrya. Inhibitor je užitečný při ošetřo35 vání chorob, u nichž je angiogenese pathologickým důsledkem, jako je nemoc kočičího poškrábání (Rochele minalia quintosa) a vředy (Heliobacter pylorí).

Syntetické peptidové fragmenty inhibitoru mají rozličné použití. Peptid, který se váže na receptor schopný vázat inhibitor s vysokou specifickou a aviditou se radioaktivně labeluje a používá pro visualisaci a kvantifikaci vazebných míst pomocí autoradiografických a na membránu se vázajících technik.

Labelování inhibitoru nebo jeho peptidových fragmentů pomocí isotopů s krátkou životností umožňuje vedle toho visualisaci vazebných míst receptoru in vivo pomocí tomografie positro45 nové emise nebo jiných moderních radiografických technik, za účelem lokalisace tumoru s vazebnými místy inhibitoru.

Cytotoxická činidla jako ricin se spojují s inhibitorem nebo jeho vysoce afinitními peptidovými fragmenty, poskytující takto nástroj pro destrukci buněk, které inhibitor vážou. Tyto buňky lze nalézt na mnoha místech mezi něž patří mikrometastázy a primární tumory, avšak není to omezeno jen na tyto. Infuse peptidů spojených s cytotoxickými činidly se provádí způsobem který je určen k maximalisaci podání do požadovaného místa. Podávání může být na příklad provedeno kanylou do cév zásobujících cílové místo nebo přímo do cílového místa. Taková činidla mohou být také podávána kontrolovaným způsobem přes osmotické čerpadlo spojené s kanylou pro infusi. Kombinace antagonistů inhibitoru může být ke zvýšení vaskularisace tkáně

-10CZ 298612 B6 aplikována spolu se stimulátory angiogenese. Tento terapeutický režim poskytuje efektivní prostředek pro destrukci metastatického karcinomu.

Inhibitor může být používán v kombinaci s jinými komposicemi a postupy léčení chorob. Tumor může být na příklad obvyklým způsobem ošetřen chirurgicky, ozařováním nebo chemoterapií v kombinaci s inhibitorem a potom může být inhibitor následně podán pacientovi, aby se rozšířil klidový stav mikrometastáz a stabilisoval a inhiboval růst jakéhokoliv residuálního primárního tumoru. Kromě toho se inhibitor, jeho fragmenty, pro inhibitor specifická antisera, agoniisti a antagonisti receptoru inhibitoru anebo jejich kombinace, kombinují pro vytvoření terapeutických komposicí s farmaceuticky přijatelnými excipienty a popřípadě s matricí pro trvalé uvolňování, jako jsou biodegradabilní polymery.

Matrice pro trvalé uvolňování, jak je zde uváděny je matrice vytvořená z materiálů, zpravidla polymerů, které jsou degradabilní enzymatickou, nebo kyselou či zásaditou hydrolýzou anebo rozpouštěním. Jakmile se matrice dostane do těla, působí na ni enzymy a tělní tekutiny. Matrice pro trvalé uvolňování se výhodně volí mezi biokompatabilními materiály jako jsou liposomy, polylaktidy (polykyselina mléčná), polyglykolidy (polymery kyseliny glykolové), kopolymery laktidů a glykolidů (kopolymery kyseliny mléčné a glykolové), polyanhydridy, poly(ortho)estery, polypeptidy, hyaluronová kyselina, kolagen, chondritin sulfát, karboxylové kyseliny, mastné kyseliny, fosfolipidy, polysacharidy, nukleové kyseliny, polymemí aminokyseliny, aminokyseliny jako fenylalanin, tyrosin, isoleucin, polynukleotidy, polyvinylpropylen, polyvinylpyrrolidon a silikon. Preferovanou biodegradabilní matricí je některá buď z polylaktidů, polyglykolidů, nebo kopolymerů laktidů a glykolidů (kopolymerů kyseliny mléčné a glykolové).

Angiogenesi modulující terapeutické komposice podle předkládaného vynálezu mohou být tuhé, kapalné nebo ve formě aerosolů a mohou být podávány některým ze známých způsobů aplikace. Příkladem tuhých terapeutických komposic jsou pilulky, krémy a implatovatelné dávkovači přípravky. Pilulky lze podávat orálně, terapeutické krémy mohou být aplikovány místně. Implantovatelné dávkovači přípravky mohou být aplikovány lokálně, na příklad v místě tumoru anebo ty, které mohou být implantovány pro systémové uvolňování terapeutické komposice modulující angiogenesi, na příklad subkutánně. Příklady kapalných komposicí představují formulace adaptované pro injekci subkutánní, intravenosní, intraarteriální a formulace pro aplikaci místní nebo nitrooční. Mezi příklady aerosolových formulací patří inhalaění přípravky pro aplikaci do plic.

Inhibiční protein podle předkládaného vynálezu může být také použit pro generování protilátek, které jsou specifické pro inhibitor a jeho receptor. Protilátky mohou být buď polyklonálními protilátkami, nebo monoklonálními protilátkami. Tyto protilátky, které se specificky vážou na inhibitor nebo receptory inhibitoru, mohou být využity v diagnostických metodách a soupravách, které jsou dobře známé prodetegování nebo kvantifikování hladin inhibitoru nebo hladin receptorů inhibitoru v tělní tekutině nebo tkáni praktikům orientovaným v oboru. Výsledky těchto testů mohou být využity k diagnostikování nebo predikování výskytu nebo opětovného výskytu tumoru a jiných angiogenně zprostředkovaných chorob.

Inhibitor může být rovněž využit k vyvíjení diagnostické metody a souprav pro detekci a kvantifikování protilátek schopných vázat inhibitor. Tyto soupravy umožňují detekci cirkulujících, pro inhibitor specifických protilátek. U pacientů, kteří mají takoví cirkulující antiinhibitomí protilátky, se mohou s větší pravděpodobností vyvinout četné tumory a karcinomy a mohou s větší pravděpodobností mít opětovný výskyt rakoviny po ošetřeních nebo periodách poklesu. Fab fragmenty těchto protilátek mohou být využity jak antigeny pro generování antiinhibitorspecifického séra Fab-fragmentu, které může být užito k neutralisaci antiinhibitomích protilátek. Taková metoda redukuje odstranění cirkulujícího inhibitoru pomocí antiinhibitomích protilátek a tím efektivní zvýšení hladin cirkulujícího inhibitoru.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je způsob blokování účinku přebytku endogenního inhibitoru. Toho může být dosaženo pasivním imunisováním člověka nebo zvířete protilátkami

-11 CZ 298612 B6 specifickými pro inhibitor, který je v systému nežádoucí. Toto ošetření může být důležité při léčení abnormální ovulace, menstruace, tvořený placenty a vaskulogenese. Poskytuje to užitečný nástroj ke zjištění efektů odstranění inhibitoru na metastatické procesy. Fab fragment inhibitomě specifických protilátek obsahuje vazebné místo pro inhibitor. Tento fragment se isoluje z inhibitomě specifických protilátek za použití technik, které jsou odborníkům známé. Fab fragmenty inhibitor-specifického séra se používají jako antigeny vyvolávající produkci séra anti-Fab fragmentu. Infuse tohoto antiséra proti Fab fragmentům specifickým pro inhibitor zabraňuje, aby se inhibitor vázal na protilátky inhibitoru. Terapeutický užitek se získává neutralisací endogenních anti-inhibitomích protilátek pomocí blokování vazby inhibitoru na Fab fragmenty antiinhibitoru. Čistý efekt tohoto ošetření je usnadnění schopnosti endogenně cirkulujícího inhibitoru dosáhnout cílové buňky a tím snížit rozrůstání metastáz.

Je třeba chápat, že předkládaný vynález je myšlen tak, že zahrnuje jakékoliv deriváty inhibitoru, které mají inhibitomí aktivitu na proliferaci endothelové buňky. Předkládaný vynález zahrnuje celistvý inhibiční protein, deriváty inhibičního proteinu a biologicky aktivní fragmenty inhibičního proteinu. Tyto obsahují proteiny s inhibitomí aktivitou, která mají substituce aminokyselin nebo mají cukry nebo jiné molekuly vázané na funkční skupiny aminokyselin. Předkládaný vynález zahrnuje také geny, které kódují inhibitor a receptor inhibitoru, i proteiny, které jsou těmito geny exprimovány.

Shora popsané proteiny a proteinové fragmenty s inhibitomí aktivitou mohou být poskytovány jako isolované a v podstatě vyčištěné proteiny a proteinové fragmenty ve farmaceuticky přijatelných formulacích při použití formulačních způsobů, které jsou odborníkům zběhlým v oboru známy. Tyto formulace mohou být aplikovány standardními způsoby. Kombinace obyčejně mohou být aplikovány topicky, transdermálně, intraperitonálně, intrakraniálně, intracerebroventrikulámě, intracerebrálně, intravaginálně, intrauterálně, orálně, rektálně nebo parenterálně (např. intravenosně, intraspinálně, subkutánně nebo intramuskulámě). Inhibitor může být mimo to začleněn do biodegradabilních polymerů umožňujících trvalé uvolňování sloučeniny. Polymery se implantují do blízkosti místa, kde se požaduje podávání léku, na příklad na místo tumoru nebo se implantuje tak, že se inhibitor pomalu systematicky uvolňuje. K zajištění kontrolovaného podávání vysokých koncentrací inhibitoru kanylou na požadované místo, jako přímo do rostoucí metastázy nebo do vaskulámího přívodu k takovému tumoru, se může použít i osmotické miniěerpadlo. Biodegradabilní polymery a jejich použití jsou na příklad podrobně podány v Brém a spol. J. Neurosurg. 74:441-446 (1991), což je zde citováno ve své celistvosti.

Dávkování inhibitoru podle předkládaného vynálezu bude záviset na chorobném stavu nebo na podmínkách ošetřování a jiných klinických faktorech jako je hmotnost a stav člověka či zvířete a způsob aplikace sloučeniny. Při léčbě lidí nebo zvířat může být podáváno přibližně 0,5 mg/kg až 500 mg/kg. V závislosti na poloviční životnosti inhibitoru v jednotlivém zvířeti nebo člověku může být inhibitor podáván mezi několikrát za den až do jedenkrát za týden. Rozumí se, že předkládaný vynález má aplikaci jak v humánní, tak ve veterinární medicíně. Metody podle předloženého vynálezu jsou předpokládány pro jednotlivou stejně jako pro opakovanou aplikaci, prováděnou současně nebo po delší dobu.

Formulace inhibitoru zahrnují ty, které jsou vhodné pro aplikaci orální, rektální, ofitalmickou (včetně intravitrální nebo intrakamerální), nasální, topickou (včetně ústní a sublingvální), intrauterální, vaginální nebo parenterální (včetně subkutánní, intraperitonální, intramuskulámí, intravenosní, intradermální, intrakraniální, intratracheální a epidurální). Formulace inhibitoru mohou být výhodně presentovány ve formě jednotek dávky a mohou být připraveny konvenčními farmaceutickými technikami. Takové techniky představují sdružování aktivní ingredience a farmaceutického nosiče(ů) nebo excipientu(ů). Obecně mohou být formulace připraveny stejnoměrným a důkladným promísením aktivní ingredience s kapalným nosičem nebo jemně rozetřeným pevným nosičem nebo s oběma a potom, pokud je to nutné, zformováním produktu.

- 12CZ 298612 B6

Formulace vhodné pro parentrální aplikaci představují vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxadanty, pufry, bakteriostatické přípravky a soluty, které činí formulaci isotonickou s krví zamýšleného příjemce a dále vhodné i nevodné sterilní suspense, které obsahují suspendující a zahušťovací činidla. Formulace mohou být presentovány v nádobkách pro jednotkovou dávku nebo pro opakované dávkování, na příklad zatavených ampulích a fiolách a mohou být skladovány ve vymrazením vysušené (lyofilisované) podobě, vyžadují bezprostředně před použitím pouze přidání sterilního kapalného nosiče, na příklad vody pro injekce. Podle receptu se injekční roztoky a suspenze mohou připravovat ze sterilních prášků, granulí a tablet dříve popsaného druhu.

Preferované formulace jednotkových dávek jsou ty, které z podávané ingredience obsahují denní dávku nebo jednotku, denní subdávku nebo její příslušnou část. Je třeba chápat, že kromě shora zvlášť zmiňovaných ingrediencí, formulace podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jiná, v oboru běžná činidla, která přicházejí v úvahu s ohledem na typ formulace. Podle volby mohou být inkorporována, nebo jiným způsobem s inhibitorem proteinu kombinována, cytotixická činidla nebo jejich biologicky funkční peptidové fragmenty, aby se pacientovi poskytla zdvojená terapie.

Angiogenesi inhibující peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány standardními mikrochemickými přístupy a v čistotě ověřené HPLC a hmotnostní spektrofotometrií.

Metody peptidové syntézy, čistění pomocí HPLC a hmotnostní spektrofotometrii jsou odborníkům v těchto oborech dobře známé. Peptidy inhibitoru a peptidy receptorů inhibitoru jsou produkovány rovněž v rekombinantních expresivních systémech E. coli nebo kvasinek a čistí se sloupcovou chromatografií.

Různé peptidové fragmenty celé molekuly inhibitoru mohou být syntetizovány pro použití při více aplikacích zahrnujících, ale ne následující se neomezujících: Používají se jako antigeny pro rozvíjení specifického antiséra, jako agonisti a antagonisti aktivní na vazebných místech inhibitoru, jako peptidy, které se mají vázat anebo být použity v kombinaci s cytotoxickými činidly pro cílené usmrcování buněk, které vážou inhibitor. Sekvence aminokyselin, které obsahují tyto peptidy, se vybírají na základě jejich posice na vnějších oblastech molekuly a jsou dosažitelné pro vazbu na antisérum. Aminové a karboxylové zakončení inhibitoru, stejně jako střední část molekuly jsou mezi fragmenty, které mají být syntetizovány, representovány odděleně.

Tyto peptidové sekvence se porovnávají se známými sekvencemi a využívá se při tom databázi proteinových sekvencí jako GenBank, Brookhaven Prosein, SWISS-PROT a PIR pro stanovení potenciálních sekvenčních homologií. Tato informace usnadňuje eliminaci sekvencí, které vykazují vysoký stupeň sekvenční homologie vůči ostatním molekulám, zvyšujíce takto možnost vysoké specificity ve vyvíjení antisér, agonistů a antagonistů inhibitoru.

Inhibitor a od inhibitoru odvozené peptidy mohou být spojovány s jinými molekulami pomocí standardních metod. Aminové i karboxylové zakončení inhibitoru obsahuje tyrosinové a lysiriové zbytky a mnoha technikami se značkují isotopicky i neisotopicky, na příklad radioaktivním labelováním pomocí běžných technik (tyrosinové zbytky - chloraminem T, jodogenem, laktoperoxidázou; lysinové zbytky - Boltonovým-Hunterovým činidlem). Tyto techniky spojování jsou dobře známé odborníkům zběhlým v oboru. Alternativně se tyrosin nebo lysin přidává ke frag45 mentům, které tyto zbytky nemají, aby se usnadnilo značkování reaktivních amino- a hydroxyskupin peptidu. Technika spojování se volí podle funkčních skupin, které jsou k disposici na aminokyselinách, včetně skupiny aminové, sulfhydrylové, karboxylové, amidové, fenolické a imidazolové, avšak neomezují se to jen na ně. Různá činidla, která se používají k provádění tohoto spojování, mezi jiným zahrnují glutaraldehyd, diazotovaný benzidin, karbodiimid a p-benzochinon.

Inhibiční peptidy se pro rozlišené aplikace chemicky spojují s isotopy, enzymy, proteinovými nosiči, cytotoxickými činidly, fluorescenčními molekulami, chemiluminiscenČními, bioluminescenčními a jinými sloučeninami. Účinnost spojovací reakce se určuje za použití různých technik

-13CZ 298612 B6 vhodných pro specifickou reakci. Radioaktivní značkování peptidu inhibitoru pomocí ’²⁵I se na příklad provádí chloraminem T aNa¹²⁵I o vysoké specifické aktivitě. Reakce se zakončuje metabisulfitem sodným a směs se odsoluje na jednoúčelových kolonách. Labelovaný peptid se eluuje ze sloupce a sbírají se frakce. Z každé frakce se odbírají alikvotní podíly a gamma počítačem se měří radioaktivita. Tímto způsobem se od značkovaného inhibičního peptidu oddělí nezreagovaný Na¹²⁵I. Peptidové frakce s nejvyšší specifickou radioaktivitou se uchovávají pro následující použití jako je analýza schopnosti vazby na antiséra inhibitoru.

Jinou aplikací spojování peptidu je produkce polyklonálního antiséra. Tak se například peptidy inhibitoru, které obsahují lysinové zbytky, jsou pomocí glutaraldehydu spojovány s vyčištěným albuminem hovězího séra. Účinnost reakce se určí měřením inkorporace radioaktivně označeného peptidu. Nezreagovaný glutaraldehyld a peptid se oddělí dialýzou. Konjugát se uchovává pro další použití.

Může být připraveno pro inhibitor specifické antisérum, analogy inhibitoru, peptidové fragmenty inhibitoru a receptor inhibitoru. Po syntéze a vyčištění peptidu mohou být za použití technik známých odborníkům zběhlým v oboru, vypěstována jak monoklonální, tak polyklonální antiséra. Polyklonální antiséra mohou být pěstována na příklad u králíků, ovcí, koz nebo jiných zvířat. Inhibiční peptidy, konjugované s molekulou nosiče jako je albumin hovězího séra, nebo samotný inhibitor se kombinuje s adjuvantní směsí, emulsifikují se a subkutánně se injektují na četná místa na zádech, na krku, na bocích a někdy do chodidel. Opakované injekce se dávají v pravidelných intervalech, jako každé dva až čtyři týdny. Vzorky krve se získávají odběrem ze žil, na příklad z okrajových žil ušního lalůčku po dilataci, zhruba 7 až 10 dní po každé injekci. Krevní vzorky se nechají srazit přes noc při 4 °C a odstřeďují se 30 minut při zhruba 2400 X g a při 4 °C. Sérum se oddělí, připraví se z něho alikvotní podíly a uchovávají se pro bezprostřední použití při 4 °C a pro následnou analýzu při -20 až -90 °C.

Všechny vzorky séra z přípravy polyklonálního antiséra nebo vzorky prostředí z produkce monoklonálního antiséra se analýzují pro stanovení titru protilátek. Titr se stanovuje několika způsoby, na příklad tečkováním a analýzou hustoty a také srážením radioaktivně značených komplexů protilátek peptidů za použití proteinu A, sekundárního antiséra, studeného ethanolu nebo dextranu na aktivním uhlí, následovaným měřením aktivity gemma počítačem. Antiséra s nejvyšším titrem se rovněž čistí na afinitních kolonách, které jsou komerčně dostupné. Inhibiční peptidy se spojují s gelem v afinitní koloně. Vzorky antiséra procházejí kolonou a protilátky inhibitoru zůstávají vázány v koloně. Následně se tyto protilátky vymývají, shromažďují a zhodnotí stanovením titru a specificity.

Pro inhibitor specifická antiséra s nejvyšším titrem se testují pro stanovení následujících údajů: a) optimálního ředění antiséra pro nejvyšší specifickou vazbu na antigen a nejnižší vazbu nespecifickou, b) schopnost vázat rostoucí množství inhibičního peptidu ve standardní křivce substituce, c) potenciální křížové reaktivity s příbuznými peptidy a proteiny příbuzných species, d) schopnosti detegovat peptidy inhibitoru v extraktech plasmy, moči, tkání a v kultivačních médiích buněk.

Soupravy pro měření inhibitoru a receptorů inhibitoru jsou rovněž považovány za součást předkládaného vynálezu. Antiséra, která mají nejvyšší titr i specificitu a mohou detegovat peptidy inhibitoru v extraktech plasmy, moči, tkání a v kultivačních médiích buněk, jsou dále zkoumána, aby zdokonalovala snadnost použití souprav pro rychlé, spolehlivé a specifické změření a lokalisaci inhibitoru. Tyto soupravy pro analýzy, které nejsou omezeny jen na následující techniky, obsahují kompetitivní a nekompetitivní assaye, radiační imunoanalýzu, bioluminescenční a chemiluminiscenční analýzu, fluorometrické analýzy, sendvičové analýzy, imunoradiometrieké analýzy, tečkovací techniky, enzymové analýzy včetně ELISA, destičky pro mikrotitraci, pásky potažené protilátky nebo namáčení tyčinky pro rychlé monitorování moči nebo krve a pro imunocytochemii. Pro každou soupravu se stanovuje rozsah, citlivost, přesnost, spolehlivost, specifická

-14CZ 298612 B6 a reprodukovatelnost analýzy. Odchylka v rámci jedné analýzy a mezi analýzami se stanovuje v bodech 20 %, 50 % a 80 % na standardní křivce substituce nebo aktivity.

Jedním z příkladů analytické soupravy užívané běžně ve výzkumu i v klinické praxi je souprava pro radioimunoanalýzu (RIA). Inhibitorová RIA je popsána níže. Po úspěšné jodaci radioaktivním jodem a vyčistění inhibitoru nebo inhibičního peptidu se přidá antisérum s nejvyšším titrem v několika ředěních ve vhodném systému pufru, ke zkumavkám obsahujícím relativně konstantní množství radioaktivity jako 10 000 cpm. Jiné zkumavky obsahují pufr nebo sérum před imunisací, aby se stanovila nespecifická vazba. Po inkubaci při 4 °C po 24 hodin se přidá protein A, zkumavky se protřepou, inkubují 90 minut při teplotě místnosti a centrifugují zhruba při 2000 až 2500 X g při 4 °C, aby se vysrážely komplexy protilátek vázaných na labelovaný antigen. Supernatant se odsaje a radioaktivita pelet spočítá pomocí gamma počítače. Roztok antiséra, které váže přibližně 10 až 40 % labelovaného peptidu po odečtení nespecifické vazby, se charakterisuje dále.

Potom se stanoví rozmezí ředění (přibližně 0,1 pg až 10 ng) peptidu inhibitoru použitého pro vypěstování antiséra přidáním známého množství peptidu do zkumavek, které obsahují radiačně labelovaný peptid a antisérum. Po dodatečné inkubační periodě, na příklad po 24 až 48 hodinách, se přidá protein A, zkumavky se centrifugují, odtáhne se supematant a odečte se radioaktivita pelet. Substituce vazby radiačně labelovaného inhibičního peptidu nelabelovaným inhibičním peptidem (standard) poskytuje standardní křivku. Pro charakterisaci specificity antiséra inhibitoru se do zkušebních zkumavek přidávají různé koncentrace jiných fragmentů inhibičního peptidu, inhibitoru z různých species a homologické peptidy.

Připravují se extrakty různých tkání, včetně, ale ne jenom, primárních a sekundárních tumorů,

Lewisova plicního karcinomu, kultur buněk produkujících inhibitor, placenty, dělohy a jiných tkání jako mozku, jater a střev. Po lyofilisaci nebo „Speed Vac“ tkáňových extraktů se přidá testový pufr a do RIA nádobek se umístí různé alikvotní podíly. Extrakty buněk produkujících inhibitor tvoří substituční křivky, které jsou paralelní ke standardní křivce, zatímco extrakty tkání, které neprodukují inhibitor, nesubstituují radioaktivně značený inhibitor v inhibitoru. Kro30 mě toho extrakty moči, plasmy a cerebrospinální tekutiny živočichů s Lewisovým plicním karcinomem se přidávají do zkušebních zkumavek ve zvýšených množstvích. Paralelní substituční křivky indikují užitečnost testu inhibice pro změření inhibitoru v tkáních a tělesných tekutinách.

Extrakty tkání, které obsahují inhibitor, se navíc charakterisují tím, že se alikvotní podíly podrobí reversně fázové HPLC. Frakce eluátu se shromažďují, vysuší ve „Speed Vac“, rekonstituují v RIA pufru a analyzují v inhibiční RIA. Maximální množství inhibitomí imunoreaktivity se nalézá ve frakcích odpovídajících eluční posici inhibitoru.

Souprava pro analýzu poskytuje instrukce, antisérum, inhibitor nebo inhibiční peptid a možno i radiačně labelovaný inhibitor a/nebo činidla pro srážení vázaných komplexů inhibitor-protilátka inhibitoru. Souprava je užitečná pro měření inhibitoru v biologických tekutinách a extraktech tkání zvířat a lidí majících i nemající tumory.

Jiná souprava se používá pro lokalisaci inhibitoru v tkáních a buňkách. Tato souprava pro imunohistochemii inhibitoru poskytuje instrukce, antisérum inhibitoru a možno i blokovací sérum a sekundární antisérum vázané na fluorescenční molekulu jako isothiokyanát fluoresdceinu nebo na některá další činidla používaná k visualisaci primárního antiséra. Imunohistochemické techniky jsou dobře známy odborníkům orientovaným v oboru. Tato souprava pro imunohistochemii inhibitoru odvolují lokalisaci inhibitoru v tkáňových řezech a pěstovaných buňkách při použití mikroskopie světelné i elektronové. Je používána jak pro výzkumné, tak i pro klinické účely. Aby se zjistila místa produkce inhibitoru, jsou na příklad tumory podrobeny biopsii nebo shromážděny na úseku tkání nařezány mikrofonem. Taková informace je užitečná pro diagnostické a možné terapeutické účely při detekci a léčení karcinomu. Jiná metoda pro visualisaci míst syntézy inhibitoru představuje radiční labelisace nukleových kyselin pro užití k hybdirisaci in šitu

- 15 CZ 298612 B6 na zkouškách pro mediátorovou RNA. Podobně může být pomocí imunohistochemických technik lokalisován, visualisován a kvantifikován receptor inhibitoru.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 zobrazuje inhibici proliferace endothelových buněk jako procentovou změnu v počtu buněk v závislosti na koncentraci isolovaného kringle 5 peptidového fragmentu lidského plasminogenu přidávaného k buňkám.

Obrázek 2 ukazuje analytické výsledky gelové elektroforesy preparace peptidového fragmentu kringle 5 isolovaného z lidského plasminogenu. Sloupec 1 je isolovaný kringle 5; sloupec 2 vyznačuje údaje o molekulové hmotnosti.

Obrázek 3 ukazuje okruh aminokyselin v kringle-oblasti 1, 2, 3, 4, a 5 lidského plasminogenu (SEQ ID NOS-.2-6).

Obrázek 4 znázorňuje aktivitu lidského plasminogenu kringle 5 proti proliferaci endothelových buněk ve spojení a bez spojení s aminokarboxylovou kyselinou (AMCHA) a ukazuje, že vazebná místa lysinu nebyla zodpovědná za aktivitu kringle 5 proti proliferaci endothelových buněk.

Obrázek 5 ukazuje inhibiční efekt rekombinantního kringle 5 na proliferaci hovězích endothelových buněk.

Předkládaný vynález je kromě toho ilustrován následujícími příklady, které nejsou žádným způsobem sestaveny tak, že by měly tvořit omezení jeho rozsahu. Je naopak jasné, že mohou být východiskem pro různá další provedení, modifikace a jejich obdoby, které po přečtení zde uvedeného popisu, mohou napadnout odborníky orientované v oboru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Demonstrace inhibitomí aktivity proliferace endothelových buněk pro kringle 5 z lidského plasminogenu

Zdroj: lidský plasminogen byl štěpen příslušnými enzymy, aby poskytl fragment kringle 5. Peptidový fragment byl isolován a vyčištěn standardními metodami pro čistění proteinu a peptidu, odborníkům v oboru dobře známými. Čistota isolovaného kringle 5 je znázorněna na obrázku 2, který ukazuje výsledky průběhu preparace gelovou elektroforesou.

Analýza: Inhibitomí aktivita endothelových buněk byla analyzována pomocí syntézy DNA (inkorporace [methyl-³H] thymidinu) v hovězích kapilárních endothelových buňkách. Kapilární endothelové buňky byly získány z hovězích nadledvinek a pěstovány na želatinou potažených mikrotitračních destičkách se 48 jímkami.

Ke kultivovaným buňkám byla přidána různá množství isolovaného kringle 5 a určila se změna počtu buněk. Procentická změna počtu buněk se vynesena jako funkce množství kringle 5 přidaného ke kultuře a jejím výsledkem je graf na obrázku 1.

Obrázek 3 ukazuje srovnání podobných sekvencí 80 aminokyselin pocházejících z kringle oblastí

1, 2, 3, 4 a 5 lidského plasminogenu.

-16CZ 298612 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (47)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob inhibice proliferace endothelových buněk in vitro, vyznačující se tím,

   5 že se na endothelovou buňku působí efektivním množstvím proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije protein obsahující 80 aminokyselin.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije protein mající molekulovou hmotnost 14 000.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije protein, který má 15 sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly lidského plasminogenu.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije protein mající sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 1.

   20
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije protein mající sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 6.
7. 7. Použití proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu, pro výrobu léčiva pro ošetřování angiogenesí zprostředkované choroby.
8. 8. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde protein obsahuje 80 aminokyselin.
9. 9. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde protein má molekulovou hmotnost 14 000.

   30
10. 10. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde plasminogenem je lidský plasminogen.
11. 11. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde protein má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 1.

    35
12. 12. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde protein má sekvenci aminokyselin

    SEQ ID NO: 6.
13. 13. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde protein má schopnost inhibovat proliferaci endothelových buněk.
14. 14. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva upraveného po podávání člověku.
15. 15. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde angiogenesí zprostředkovaná choroba je rakovina.

    45
16. 16. Použití podle nároku 15 pro výrobu léčiva, kde rakovinou je pevný tumor.
17. 17. Použití podle nároku 7 pro výrobu léčiva, kde léčivo inhibuje u subjektu proliferaci endothelových buněk.

    50
18. 18. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde protein obsahuje 80 aminokyselin.
19. 19. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde protein má molekulovou hmotnost 14 000.
20. 20. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde plasminogenem je lidský plasminogen.

    - 17CZ 298612 B6
21. 21. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde protein má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 1.
22. 22. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde protein má sekvenci aminokyselin 5 SEQ ID NO: 6.
23. 23. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde jedincem je člověk.
24. 24. Použití podle nároku 17 pro výrobu léčiva, kde jedinec má angiogenesí zprostředkovanou ío chorobu.
25. 25. Použití podle nároku 24 pro výrobu léčiva, kde angiogenesí zprostředkovanou chorobou je rakovina.

    15
26. 26. Použití podle nároku 25 pro výrobu léčiva, kde rakovinou je pevný tumor.
27. 27. Farmaceutická komposice, vyznačující se tím, že obsahuje proliferaci endothelových buněk inhibující množství proteinu, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly plasminogenu, a farmaceuticky přijatelný nosič.
28. 28. Kompozice podle nároku 27, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje protein obsahující 80 aminokyselin.
29. 29. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že obsahuje protein mající 25 molekulovou hmotnost 14 000.
30. 30. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že obsahuje protein, který má sekvenci aminokyselin peptidu kringle 5 z molekuly lidského plasminogenu.

    30
31. 31. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že obsahuje protein mající sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 1.
32. 32. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že obsahuje protein mající sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 6.
33. 33. Kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že protein má antiangiogenní aktivitu.
34. 34. Kompozice podle nároku 33, vyznačující se tím, že protein je odvozen od my40 šího plasminogenu, lidského plasminogenu, plasminogenu Rhesus, prasečího plasminogenu nebo hovězího plasminogenu.
35. 35. Kompozice podle nároku 34, vyznačující se tím, že protein je odvozen od lidského plasminogenu.
36. 36. Kompozice podle nároku 33, vyznačující se tím, že protein má antiangiogenní aktivitu in vivo.
37. 37. Kompozice podle nároku 33, vyznačující se tím, že protein má antiangiogenní 50 aktivitu in vitro.
38. 38. Kompozice podle nároku 33, vyznačující se tím, že protein je schopen inhibice onemocnění závislého na angiogenesí.

    -18CZ 298612 B6
39. 39. Kompozice podle nároku 33, vy z n a č uj í c í se tím, že protein je schopen inhibice růstu nádoru.
40. 40. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje nukleovou kyselinu 5 kódující aminokyselinovou sekvenci peptidu kringle 5 proteinu podle nároku 33.
41. 41. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, že nukleová kyselina je odvozena od myšího plasminogenu, lidského plasminogenu, plasminogenu Rhesus, prasečího plasminogenu nebo hovězího plasminogenu.
42. 42. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, zena od lidského plasminogenu.

    že nukleová kyselina je odvo15
43. 43. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, ní aktivitu in vivo.

    že protein 5 má antiangiogen20
44. 44. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, aktivitu in vitro.
45. 45. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, onemocnění závislého na angiogenesi.
46. 46. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, růstu nádoru.

    že protein má antiangiogenní že protein je schopen inhibice že protein je schopen inhibice
47. 47. Kompozice podle nároku 40, vyznačující se tím, že dále zahrnuje vektor schopný, je-li přítomen v hostitelské buňce, exprimovat peptid kringle 5.

    3 sekvence

    5 výkresů

    -19CZ 298612 B6

    065483-0636 sequence listing_ST25 SEQUENCE LISTING <110> THE CHILDRENS MEDICAL CENTER CORPORATION <120> ENDOTHELIAL CELL PROLIFERATION INHIBITOR AND METHOD OF USE <130> Dykema 065483-0636/Abbott 6997.CZ.O1/RRG P/US-216/802/PCT/CZ <150> PC/US96/20447 <151> 1996-12-13 <150> US 08/763528 <151> 1996-12-12 <150> US 60/008519 <151> 1995-12-13 <160> 6 <170> Patentln versi on 3.4 <210> 1