DE69631972T2

DE69631972T2 - Proliferationsinhibitor von endothellzellen und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69631972T2
Application number: DE69631972T
Authority: DE
Inventors: Yihai Cao; Judah Moses FOLKMAN; S. Michael O'REILLY; Donald J. Davidson
Original assignee: Abbott Laboratories; Childrens Medical Center Corp
Current assignee: THE CHILDERN'S MEDICAL CENTER CORP., BOSTON, MASS.; Abbott Laboratories
Priority date: 1995-12-13
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2016-12-14
Also published as: KR19990072126A; CA2240296A1; PL188719B1; HUP9900979A3; AU1687097A; BR9612115A; NO321775B1; KR100477280B1; PT869970E; HK1017692A1; CZ182898A3; NO982715L; NO982715D0; NZ330537A; US20010016644A1; JP2002502359A; ATE262537T1; EP0869970B1; PL327200A1; ES2217340T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Endothelialzellproliferations-Inhibitor. Der Inhibitor ist in der Lage, Angiogenese-bezogene Krankheiten zu hemmen und angiogene Prozesse zu regulieren.
Hintergrund der Erfindung
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "Angiogenese" die Bildung neuer Blutgefäße in ein Gewebe oder Organ hinein und schließt die Endothelialzellproliferation ein. Unter normalen physiologischen Bedingungen machen Menschen oder Tiere Angiogenese nur in sehr speziellen eingeschränkten Situationen durch. Zum Beispiel wird Angiogenese normalerweise bei Wundheilung, fötaler und embryonaler Entwicklung sowie Bildung des Gelbkörpers, der Gebärmutterschleimhaut und der Plazenta beobachtet. Der Ausdruck "Endothelium" bedeutet eine dünne Schicht von flachen Endothelialzellen, die seröse Hohlräume, Lymphgefäße und Blutgefäße auskleiden.
Sowohl für die kontrollierte als auch für die unkontrollierte Angiogenese wird angenommen, dass sie auf eine ähnliche Art und Weise fortschreiten. Endothelialzellen und Perizyten, die von einer Basalmembran umgeben sind, bilden kapillare Blutgefäße. Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basalmembran durch Enzyme, die durch Endothelialzellen und Leukozyten freigesetzt werden. Die Endothelialzellen, welche das Lumen von Blutgefäßen auskleiden, durchdringen dann die Basalmembran. Angiogene Stimulanzien veranlassen die Endothelialzellen, durch die erodierte Basalmembran hindurch zu wandern. Die wandernden Zellen bilden einen "Spross" weg von dem Elternblutgefäß, wo die Endothelialzellen eine Mitose durchmachen und sich stark vermehren. Die Endothelialsprossen verschmelzen miteinander, um Kapillarschleifen zu formen, die das neue Blutgefäß bilden.
Eine anhaltende unregulierte Angiogenese kommt in einer Vielzahl von Krankheitszuständen, bei Tumormetastase und abnormalem Wachstum durch Endothelialzellen vor und unterstützt die pathologische Schädigung, die bei diesen Erkrankungen zu sehen ist. Die unterschiedlichen pathologischen Krankheitszustände, in welchen unregulierte Angiogenese vorhanden ist, sind zusammengefasst worden als angiogen abhängige oder angiogen assoziierte Krankheiten.
Die Hypothese, dass das Tumorwachstum Angiogeneseabhängig ist, wurde zuerst 1971 vorgeschlagen (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications, N. Engl. Jour. Med. 285: 1182–1186, 1971). In ihren einfachsten Ausdrücken stellt die Publikation fest: "Sobald eine 'Tumorannahme' vorgekommen ist, muss jede Zunahme der Tumorzellpopulation durch eine Zunahme neuer Kapillaren eingeleitet werden, die auf dem Tumor zusammenlaufen." Unter 'Tumorannahme' wird gegenwärtig verstanden, dass damit eine prävaskuläre Phase des Tumorwachstums angezeigt wird, in welcher eine Population von Tumorzellen, die wenige Kubikmillimeter Volumen besetzt und nicht einige Millionen Zellen übersteigt, auf vorhandenen Wirtsmikrogefäßen überleben kann. Eine Ausbreitung des Tumorvolumens über diese Phase hinaus erfordert die Induktion von neuen kapillaren Blutgefäßen. Zum Beispiel würden Lungenmikrometastasen in der frühen prävaskulären Phase bei Mäusen nicht detektierbar sein, außer durch Hochleistungsmikroskopie an histologischen Abschnitten.
Beispiele für den indirekten Beweis, welcher dieses Konzept unterstützt, schließen folgende ein:

(1) Die Wachstumsgeschwindigkeit von Tumoren, die in subkutane transparente Kammern in Mäusen implantiert worden sind, ist langsam und linear vor der Neovaskularisation, und schnell und nahezu exponentiell nach Neovaskularisation (Algire G. H., et al., Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6: 73–85, 1945).
(2) Tumoren, die in isolierten durchbluteten Organen gewachsen sind, wo sich Blutgefäße nicht stark vermehren, sind begrenzt auf 1–2 mm³, breiten sich aber schnell auf über das 1000fache dieses Volumens aus, wenn sie in Mäuse transplantiert werden und neovaskularisiert werden (Folkman J., et al., Tumor behavior in isoliated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164: 491–502, 1966).
(3) Tumorwachstum in der avaskulären Kornea schreitet langsam und mit einer linearen Geschwindigkeit fort, schaltet aber um auf exponentielles Wachstum nach Neovaskularisation (Gimbrone, M. A., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52: 41–427, 1974).
(4) Tumoren, die in dem wässerigen Fluid der Vorderkammer des Kaninchenauges suspendiert sind, bleiben lebensfähig, avaskulär und in der Größe beschränkt auf < 1 mm³. Sobald sie auf das Gefäßbett der Iris implantiert sind, werden sie neovaskularisiert und wachsen schnell, wobei sie das 16.000fache ihres ursprünglichen Volumens innerhalb von 2 Wochen erreichen (Gimbrone M. A. Jr., et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136: 261–276).
(5) Wenn Tumoren auf das Kükenembryo-Chorioallantois implantiert werden, wachsen sie langsam während einer avaskulären Phase von > 72 Stunden, überschreiten jedoch nicht einen mittleren Durchmesser von 0,93 + 0,29 mm. Schnelle Tumorexpansion ereignet sich innerhalb von 24 Stunden nach dem Einsetzen der Neovaskularisation, und an Tag 7 erreichen diese vaskularisierten Tumoren einen mittleren Durchmesser von 8,0 + 2,5 mm (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35: 347–356, 1977).
(6) Gefäßzylinder von Metastasen in der Kaninchenleber zeigen Heterogenität bei der Größe der Metastasen, zeigen aber einen relativ gleichmäßigen Cutoff-Punkt für die Größe, bei welcher Vaskularisation vorhanden ist. Tumoren sind allgemein avaskulär bis zu 1 mm Durchmesser, werden aber neovaskularisiert jenseits dieses Durchmessers (Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68: 334–340 (1970).
(7) Bei transgenen Mäusen, welche Karzinome in den Betazellen der Langerhans-Inseln (der Bauchspeicheldrüse) entwickeln, sind die prävaskulären hyperplastischen Inseln in der Größe auf < 1 mm beschränkt. Bei einem Alter von 6–7 Wochen werden 4–10% der Inseln neovaskularisiert, und aus diesen Inseln gehen große vaskularisierte Tumoren von mehr als dem 1000fachen des Volumens der prävaskulären Inseln hervor (Folkman J., et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339: 58–61, 1989).
(8) Ein spezifischer Antikörper gegen VEGF (vaskulärer Endothelialwachstumsfaktor) verringert die Mikrogefäßdichte und verursacht eine "signifikante oder dramatische" Hemmung des Wachstums von drei menschlichen Tumoren, welche auf VEGF als ihrem einzigen Vermittler von Angiogenese angewiesen sind (in nackten Mäusen). Der Antikörper hemmt nicht das Wachstum der Tumorzellen in vitro (Kim K. J., et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis supresses tumor growth in vivo. Nature 362: 841–844, 1993).
(9) Anti-bFGF-monoklonaler Antikörper verursacht eine 70% Hemmung des Wachstums eines Maustumors, welcher von der Sekretion von bFGF als seinem einzigen Vermittler von Angiogenese abhängig ist. Der Antikörper hemmt nicht das Wachstum der Tumorzellen in vitro (Hori A., et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizating monoclonal antibody against human basic fibroplast growth factor. Cancer Research, 51: 6180–6184, 1991).
(10) Intraperitoneale Injektion von bFGF steigert das Wachstum eines primären Tumors und seiner Metastasen, indem das Wachstum von kapillaren Endothelialzellen in dem Tumor stimuliert wird. Den Tumorzellen selbst mangelt es an Rezeptoren für bFGF, und bFGF ist kein Mitogen für die Tumorzellen in vitro (Gross J. L., et al., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31: 79, 1990).
(11) Ein spezifischer Angiogenese-Inhibitor (AGM-1470) hemmt das Tumorwachstum und Metastasen in vivo, ist aber viel weniger aktiv beim Hemmen der Tumorzellproliferation in vitro. Er hemmt vaskuläre Endothelialzellproliferation halbmaximal bei einer um 4 log niedrigeren Konzentration, als er Tumorzellproliferation hemmt (Ingber D., et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48: 555–557, 1990). Es gibt auch einen indirekten klinischen Beweis, dass Tumorwachstum Angiogenese-abhängig ist.
(12) Menschliche Retinoblastome, die für den Glaskörper metastatisch sind, entwickeln sich in avaskuläre Sphäroiden hinein, welche beschränkt sind auf weniger als 1 mm³, ungeachtet der Tatsache, dass sie lebensfähig sind und ³H-Thymidin einlagern (wenn sie aus einem entkernten Auge entnommen und in vitro analysiert werden).
(13) Ein Karzinom des Eierstocks metastatisiert zu der Peritonealmembran als dünne avaskuläre weiße Samen (1–3 mm³). Diese Implantate werden kaum größer, bis eines oder mehrere von ihnen neovaskularisiert werden.
(14) Die Intensität der Neovaskularisation bei Brustkrebs (Weidner N., et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324: 1–8, 1991, und Weidner N., et al., Tumor angionesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J. Natl. Cancer Inst. 84: 1875–1887, 1992) und bei Prostatakrebs (Weidner N., Carroll P. R., Flax J., Blumenfeld W., Folkman J., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143 (2): 401–409, 1993) korreliert stark mit dem Risiko zukünftiger Metastase.
(15) Eine Metastasierung aus menschlichem kutanen Melanom ist selten vor der Neovaskularisation. Das Einsetzen der Neovaskularisation führt zu zunehmender Dicke der Läsion und einem zunehmenden Risiko für Metastase (Srivastava A., et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76–4.0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133: 419–423, 1988).
(16) Bei Blasenkrebs ist der Harnspiegel eines angiogenen Peptids, bFGF, ein empfindlicherer Indikator für den Zustand und das Ausmaß der Krankheit als die Zytologie (Nguyen M., et al., Elevated levels of an angiogenec peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85: 241–242, 1993).

Somit ist offensichtlich, dass die Angiogenese eine wesentliche Rolle bei der Metastasierung eines Krebses spielt. Wenn diese angiogene Aktivität unterdrückt oder beseitigt werden könnte oder anderweitig kontrolliert und reguliert werden könnte, dann würde der Tumor, obwohl er vorhanden ist, nicht wachsen. In diesem Krankheitszustand könnte eine Prävention von Agiogenese die Schädigung abwehren, die durch das Eindringen des neuen mikrovaskulären Systems hervorgerufen würde. Therapien, die auf die Kontrolle der angiogenen Prozesse gerichtet sind, könnten zu der Abschaffung oder Abschwächung dieser Krankheiten führen.
Was deshalb benötigt wird ist eine Zusammensetzung und eine therapeutische Verwendung, welche die Endothelialzellproliferation wie zum Beispiel das unerwünschte Wachstum von Blutgefäßen, insbesondere in Tumore hinein, hemmt.
Die Zusammensetzung sollte in der Lage sein, die Aktivität endogener Wachstumsfaktoren in prämetastatischen Tumoren zu überwinden und die Bildung der Kapillaren in den Tumoren zu verhindern, wodurch das Wachstum der Tumoren gehemmt würde. Die Zusammensetzung sollte außerdem in der Lage sein, die Bildung von Kapillaren in anderen angiogenen Prozessen wie Wundheilung und Reproduktion zu regulieren. Die Zusammensetzung und therapeutische Verwendung zum Hemmen der Angiogenese sollte vorzugsweise nicht toxisch sein und wenige Nebenwirkungen hervorrufen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der isolierten Kringle-5-Region von Plasminogen für die Herstellung eines Medikamentes, um die Aktivität der Endothelialzellproliferation zu hemmen. Das isolierte Kringle-5-Peptidfragment mit hemmender Aktivität umfasst eine Sequenz von ungefähr achtzig (80) Aminosäuren:
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worin
Das Endothelialzellproliferations-hemmende Peptid entspricht einem Peptidfragment, das aus menschlichem Plasminogen erzeugt wird, beginnend bei Aminosäure 462 des menschlichen Plasminogens, und das sich über 80 Aminosäuren erstreckt.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die therapeutische Verabreichung des Peptids an Patienten, die therapeutisch wirksame Mengen von solchen Verbindungen benötigen, um die Endothelialzellproliferation zu regulieren.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die einen Endothelialzellproliferations-Inhibitor umfasst, der ein 80-Aminosäure-Peptidfragment von menschlichem Plasminogen umfasst, das der Kringle-5-Region, beginnend bei Aminosäure 462 von menschlichem Plasminogen, entspricht.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine therapeutische Verwendung bereitzustellen zur Behandlung von Krankheiten und Prozessen, die durch Endothelialzellproliferation, insbesondere Angiogenese, vermittelt werden.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine therapeutische Verwendung und eine Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten und Prozessen bereitzustellen, die durch Angiogenese vermittelt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hämangiom, feste Tumoren, Leukämie, Metastasen, Teleangiektasie, Schuppenflechte, Sklerodermie, eiterbildendes Granulom, myokardiale Angiogenese, Plaque-Neovaskularisation, koronare Kollaterale, zerebrale Kollaterale, arteriovenöse Fehlfunktionen, ischämische Extremitäten-Angiogenese, Hornhauterkrankungen, Rubeosis, neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, Arthritis, diabetische Neovaskularisation, Makuladegenerierung, Wundheilung, peptischer Ulkus, Helicobacter-bezogene Krankheiten, Frakturen, Keloide, Vaskulogenese, Hämatopoese, Ovulation, Menstruation, Plazentabildung, und Katzenkratzkrankheit.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Unterdrückung des Wachstums eines Krebses bereitzustellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Medikament für die Therapie von Krebs bereitzustellen, das minimale Nebenwirkungen hat.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich werden nach einer Durchsicht der folgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der angehängten Ansprüche.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Hemmung der Endothelialzellproliferation als prozentuale Änderung der Zellzahl als eine Funktion der Konzentration des isolierten Kringle-5-Peptidfragmentes von menschlichem Plasminogen, die zu den Zellen hinzugegeben wurde.
2 zeigt eine Gelelektrophoreseanalyse von einer Zubereitung eines Kringle-5-Peptidfragments, das aus menschlichem Plasminogen isoliert wurde. Spur 1 ist isoliertes Kringle 5; Spur 2 sind Molekulargewichtsmarker.
3 zeigt eine Aminosäurezusammensetzung von Kringle-Regionen 1, 2, 3, 4 und 5 von menschlichem Plasminogen.
4 zeigt die Anti-Endothelialzellproliferationsaktivität von Kringle 5 von menschlichem Plasminogen, mit und ohne Aminocarbonsäure (AMCHA), was demonstriert, dass die Lysinbindungsstellen nicht verantwortlich sind für die Anti-Endothelialzellproliferationsaktivität von Kringle 5.
5 zeigt die hemmende Wirkung von rekombinantem Kringle 5 auf die Rinder-Endothelialzellproliferation.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen und therapeutische Verwendungen bereitgestellt, die wirksam sind zur Hemmung der Endothelialzellproliferation, zur Regulierung der Angiogenese und zur Hemmung unerwünschter Angiogenese, insbesondere der Angiogenese, die mit Tumorwachstum zusammenhängt. Die vorliegende Erfindung schließt einen Protein-Endothelialzellproliferations-Inhibitor ein, der gekennzeichnet ist durch eine Sequenz von ungefähr 80 Aminosäuren, ableitbar von menschlichem Plasminogen als Kringle 5. Die Aminosäuresequenz des Inhibitors kann zwischen Spezies leicht variieren.
Die vorliegende Erfindung stellt therapeutische Verwendungen und Zusammensetzungen bereit zur Behandlung von Krankheiten und Prozessen, die durch unerwünschte und unkontrollierte Endothelialzellproliferation, wie Angiogenese, vermittelt werden, indem einem Menschen oder Tier mit unerwünschter Endothelialzellproliferation eine Zusammensetzung verabreicht wird, die Kringle 5 von menschlichem Plasminogen umfasst, das in der Lage ist, die Endothelialzellproliferation in in vitro-Assays zu hemmen. Wünschenswerterweise ist das isolierte Protein mindestens ungefähr 80% rein, noch besser mindestens ungefähr 90% rein, am besten mindestens ungefähr 95% rein. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumoren oder zur Unterdrückung des Wachstums von Tumoren. Eine Verabreichung dieses Medikamentes an einen Menschen oder ein Tier mit prävaskularisierten metastatisierten Tumoren hilft, das Wachstum oder die Ausbreitung solcher Tumoren zu verhindern.
Noch weiter wird der Inhibitor kombiniert mit pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln und wahlweise mit Verbindungen mit verzögerter Freisetzung oder Zusammensetzungen, wie biologisch abbaubare Polymere und Matrizen, um therapeutische Zusammensetzungen zu bilden.
Ausdrücklicher schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und therapeutische Verwendungen ein für die Detektion und Behandlung von Krankheiten und Prozessen, die durch Endothelialzellproliferation wie Angiogenese vermittelt werden oder damit assoziiert sind. Das isolierte Kringle-5-Peptidfragment mit hemmender Aktivität umfasst eine Sequenz von ungefähr achtzig (80) Aminosäuren:
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worin
Der Inhibitor kann aus Plasminogenen wie menschlichem Plasminogen isoliert werden, oder synthetisiert werden durch chemische oder biologische Verfahren (z. B. Zellkultur, rekombinante Genexpression, Peptidsynthese und enzymatische in vitro-Katalyse von Plasminogen oder Plasmin, um einen aktiven Inhibitor zu ergeben). Rekombinante Verfahren schließen die Genamplifikation von DNA-Quellen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Genamplifikation von RNA-Quellen unter Verwendung reverser Transkriptase/PCR ein.
Eine Zusammensetzung, die einen Vektor umfasst, der eine DNA-Sequenz enthält, kann den Endothelialzellproliferations-Inhibitor kodieren, wobei der Vektor in der Lage ist, den Inhibitor zu exprimieren, wenn er in einer Zelle vorhanden ist, eine Zusammensetzung, die eine Zelle umfasst, die einen Vektor enthält, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die den Inhibitor oder Fragmente oder Analoga davon codiert, und wobei der Vektor in der Lage ist, den Inhibitor zu exprimieren, wenn er in der Zelle vorhanden ist.
Der Ausdruck "im Wesentlichen ähnlich" oder "im Wesentlichen homolog" bedeutet, wenn er in Bezug auf die Inhibitor-Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, eine Aminosäuresequenz mit Endothelialzellproliferationshemmender Aktivität und mit einem Molekulargewicht von ungefähr, welche außerdem einen hohen Grad an Sequenzhomologie zu dem Protein besitzt, das die spezielle, hierin offenbarte N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, oder eine Nukleinsäuresequenz, die einen Endothelialzellproliferations-Inhibitor codiert, mit einem Molekulargewicht von ungefähr und einem hohen Grad an Homologie zu dem Protein, das die spezielle, hierin offenbarte N-terminale Aminosäuresequenz aufweist.
Ein hoher Grad an Homologie bedeutet mindestens ungefähr 80% Aminosäurehomologie, wünschenswerterweise mindestens ungefähr 90% Aminosäurehomologie und noch besser mindestens ungefähr 95% Aminosäurehomologie. Der Ausdruck "Endothelialzellhemmende Aktivität", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit eines Moleküls, die Angiogenese generell zu hemmen, und zum Beispiel das Wachstum von kapillaren Rinder-Endothelialzellen in Kultur in der Anwesenheit von Fibroblastwachstumsfaktor zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung eines isolierten Inhibitors oder wünschenswerterweise gereinigten Inhibitors ein für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention angiogener Krankheiten und Prozesse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Arthritis und Tumoren.
In der Gentherapie wird das Gen, das den Inhibitor codiert, in einem Patienten reguliert. Verschiedene Verfahren zum Überführen oder Übergeben von DNA an Zellen zur Expression des Genproduktproteins, im übrigen als Gentherapie bezeichnet, sind offenbart in Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4): 335–356 (1992), das hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Gentherapie umfasst die Einlagerung von DNA-Sequenzen in somatische Zellen oder Keimbahnzellen für die Verwendung entweder in einer ex vivo- oder einer in vivo-Therapie. Die Gentherapie funktioniert, um Gene zu ersetzen, um eine normale oder anormale Genfunktion zu verbessern, und um infektiöse Erkrankungen und andere pathologische Zustände zu bekämpfen.
Strategien zur Behandlung dieser medizinischen Probleme mit Gentherapie schließen therapeutische Strategien ein wie zum Beispiel Identifizieren des defekten Gens und dann Hinzufügen eines funktionellen Gens, entweder um die Funktion des defekten Gens zu ersetzen oder um ein schwach funktionierendes Gen zu verbessern; oder prophylaktische Strategien wie das Hinzufügen eines Gens für das Produktprotein, das den Zustand behandeln wird, oder das das Gewebe oder das Organ empfänglicher für ein Therapieschema machen wird. Als ein Beispiel für eine prophylaktische Strategie kann eine Nukleinsäuresequenz, die den Inhibitor codiert, in einen Patienten eingepflanzt werden und kann folglich das Vorkommen von Angiogenese verhindern; oder ein Gen, das Tumorzellen empfänglicher für die Bestrahlung macht, könnte eingesetzt werden, und dann würde eine Bestrahlung des Tumors ein erhöhtes Abtöten der Tumorzellen verursachen.
Viele Protokolle zum Überführen von Inhibitor-DNA oder Inhibitor-Regulationssequenzen werden in dieser Erfindung vorgestellt. Die Transfektion von Promotersequenzen, andere als die, die normalerweise spezifisch mit dem Inhibitor assoziiert gefunden werden, oder anderen Sequenzen, welche die Produktion des Inhibitor-Proteins erhöhen würden, werden ebenfalls als Verfahren der Gentherapie vorgestellt. Ein Beispiel für diese Technologie ist zu finden in Transkaryotic Therapies, Inc., von Cambridge, Massachusetts, wo homologe Rekombination verwendet wird, um einen "genetischen Schalter" einsetzen, der ein Erythropoietin-Gen in Zellen einschaltet. Siehe Genetic Engineering News, 15. April 1994. Solche "genetischen Schalter" könnten verwendet werden, um den Inhibitor (oder den Hemmerrezeptor) in Zellen zu aktivieren, die den Inhibitor (oder den Rezeptor für den Inhibitor) normalerweise nicht exprimieren.
Gentransferverfahren für die Gentherapie fallen in drei breite Kategorien: physikalisch (z. B. Elektroporation, direkter Gentransfer und Gentransfer mithilfe der Partikelkanone), chemisch (Lipid-basierte Träger oder andere Nicht-Virus-Vektoren) und biologisch (Virus-abgeleiteter Vektor und Rezeptoraufnahme). Zum Beispiel können Nicht-Virus-Vektoren verwendet werden, welche Liposome einschließen, die mit DNA beschichtet sind. Solche Liposom/DNA-Komplexe können direkt intravenös in den Patienten injiziert werden. Es wird angenommen, dass die Liposom/DNA-Komplexe in der Leber angereichert werden, wo sie die DNA an Makrophagen und Kupffer-Zellen übergeben. Diese Zellen sind langlebig und stellen folglich eine langfristige Expression der übergebenen DNA bereit. Zusätzlich können Vektoren oder die "nackte" DNA des Gens direkt in das gewünschte Organ, Gewebe oder den gewünschten Tumor injiziert werden für eine gezielte Übergabe der therapeutischen DNA.
Gentherapie-Methodiken können außerdem durch die Abgabestelle beschrieben werden. Grundlegende Wege zur Übergabe von Genen schließen den ex vivo-Gentransfer, den in vivo-Gentransfer und den in vitro-Gentransfer ein. Bei dem ex vivo-Gentransfer werden dem Patienten Zellen entnommen und in einer Zellkultur aufgezogen. Die DNA wird in die Zellen hinein transfiziert, die transfizierten Zellen werden in der Zahl expandiert und dann wieder in den Patienten implantiert. Beim in vitro-Gentransfer sind die transformierten Zellen Zellen, die in Kultur aufgezogen wurden, wie zum Beispiel Gewebekulturzellen, und keine bestimmten Zellen von einem bestimmten Patienten. Die "Laborzellen" werden transfiziert, die transfizierten Zellen werden selektiert und für jede Implantation in einen Patienten oder für andere Verwendungen expandiert.
Der In vivo-Gentransfer schließt das Einführen von DNA in die Zellen des Patienten ein, wenn die Zellen innerhalb des Patienten sind. Verfahren schließen die Verwendung von Virusvermitteltem Gentransfer unter Verwendung eines nicht infektiösen Virus ein, um das Gen in den Patienten einzuführen, oder das Injizieren von nackter DNA in eine Stelle in dem Patienten hinein, und die DNA wird von einem prozentualen Anteil der Zellen aufgenommen, in welchen das Genproduktprotein exprimiert wird. Zusätzlich können die anderen hierin beschriebenen Verfahren, wie die Verwendung einer "Genkanone", zur in vitro-Insertion von Endothelialzellproliferations-Inhibitor-DNA oder Inhibitor-Regulationssequenzen verwendet werden.
Chemische Verfahren der Gentherapie können eine Lipidbasierte Verbindung einschließen, nicht notwendigerweise ein Liposom, um die DNA durch die Zellmembran zu befördern. Lipofektine oder Zytofektine, Lipid-basierte positive Ionen, die an negativ geladene DNA binden, bilden einen Komplex, der die Zellmembran durchqueren kann, und liefern die DNA in das Innere der Zelle. Ein anderes chemisches Verfahren nutzt Rezeptorbasierte Endozytose, welche das Binden eines spezifischen Liganden an einen Zelloberflächenrezeptor und Umhüllen und Transportieren dieses Liganden durch die Zellmembran umfasst. Der Ligand bindet an die DNA und der gesamte Komplex wird in die Zelle transportiert. Der Ligand-Gen-Komplex wird in den Blutstrom injiziert, und dann werden Zielzellen, die den Rezeptor aufweisen, den Liganden spezifisch binden und den Ligand-DNA-Komplex in die Zelle hinein transportieren.
Viele Gentherapie-Methodiken verwenden virale Vektoren, um Gene in Zellen einzusetzen. Zum Beispiel sind veränderte Retrovirusvektoren in ex vivo-Verfahren verwendet worden, um Gene in periphere und Tumor-infiltrierende Lymphozyten, Hepatozyten, Epidermiszellen, Myozyten oder andere somatische Zellen einzuführen. Diese veränderten Zellen werden dann in den Patienten eingeführt, um das Genprodukt von der eingesetzten DNA bereitzustellen.
Virale Vektoren sind außerdem verwendet worden, um Gene in Zellen unter Verwendung von in vivo-Protokollen einzusetzen. Um eine Gewebe-spezifische Expression von Fremdgenen zu lenken, können cis-agierende Regulationselemente oder Promotoren, für die bekannt ist, dass sie Gewebe-spezifisch sind, verwendet werden. Alternativ kann dies erreicht werden unter Verwendung von in situ-Übergabe von DNA oder virale Vektoren an spezifische anatomische Stellen in vivo. Zum Beispiel wurde Gentransfer zu Blutgefäßen in vivo erreicht durch Implantieren von in vitro-transduzierten Endothelialzellen in ausgewählte Stellen auf Arterienwänden. Das Virus infizierte umgebende Zellen, welche ebenfalls das Genprodukt exprimierten. Ein Virusvektor kann direkt an die in vivo-Stelle übergeben werden, zum Beispiel durch einen Katheter, wodurch ermöglicht wird, dass nur bestimmte Bereiche durch das Virus infiziert werden, und langfristige ortsspezifische Genexpression bereitgestellt wird. In vivo-Gentransfer unter Verwendung von Retrovirusvektoren ist außerdem in Brustgeweben und Lebergeweben gezeigt worden durch Injektion des geänderten Virus in Blutgefäße, die zu den Organen führen.
Virale Vektoren, die für Gentherapieprotokolle verwendet worden sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Retroviren, andere RNA-Viren wie Poliovirus oder Sindbis-Virus, Adenovirus, Adeno-assoziierter Virus, Herpesvirus, SV 40, Vakziniavirus und andere DNA-Viren. Replikations-defekte murine Retrovirusvektoren sind die am weitesten genutzten Gentransfervektoren. Murine Leukämieretroviren sind zusammengesetzt aus einer einzelsträngigen RNA, die mit einem Zellkernprotein und Polymerase(pol)enzymen einen Komplex bildet, eingeschlossen durch einen Proteinkern (gag) und umgeben von einer Glykoproteinhülle (env), die den Wirtsbereich bestimmt. Die genomische Struktur von Retroviren umfasst die gag-, pol- und env-Gene, eingeschlossen durch die 5'- und 3'-langen terminalen Redundanzen (LTR). Retrovirusvektorsysteme nutzen die Tatsache aus, dass ein Mindestvektor, der die 5'- und 3'-LTRs enthält, und das Verpackungssignal ausreichend sind, um Vektorverpackung, -infektion und -integration in Zielzellen zu ermöglichen, vorausgesetzt, dass die Virusstrukturproteine in die Verpackungszelllinie in trans geliefert werden. Grundlegende Vorteile von Retrovirusvektoren für den Gentransfer umfassen wirksame Infektion und Genexpression in den meisten Zelltypen, genaue Einzelkopievektorintegration in Zielzell-chromosomale DNA und Leichtigkeit der Handhabung des Retrovirusgenoms.
Das Adenovirus ist zusammengesetzt aus linearer doppelsträngiger DNA, die mit Kernproteinen einen Komplex bildet und mit Kapsidproteinen umgeben ist. Fortschritte in der Molekularvirologie haben zu der Fähigkeit geführt, die Biologie dieser Organismen auszunutzen, um Vektoren zu erzeugen, die in der Lage sind, neuartige Gensequenzen in Zielzellen hinein in vivo zu transduzieren. Adenovirus-basierte Vektoren werden Genproduktpeptide bei hohen Pegeln exprimieren. Adenovirusvektoren haben hohe Wirksamkeiten der Infektiosität, selbst bei niedrigen Titern des Virus. Zusätzlich ist das Virus völlig infektiös als ein zellfreies Virion, so dass eine Injektion von Produzentenzelllinien nicht notwendig ist. Ein anderer möglicher Vorteil von Adenovirusvektoren ist die Fähigkeit, Langzeitexpression von heterologen Genen in vivo zu erreichen.
Mechanische Verfahren der DNA-Zuführung schließen fusogene Lipidvesikel ein wie zum Beispiel Liposome oder andere Vesikel zur Membranfusion, Lipidpartikel von DNA-einlagerndem kationischen Lipid wie zum Beispiel Lipofektin, Polylysinvermittelte Überführung von DNA, direkte Injektion von DNA wie Mikroinjektion von DNA in Keimzellen oder somatische Zellen hinein, pneumatisch übergebene DNA-beschichtete Partikel wie die Goldpartikel, die in einer "Genkanone" verwendet werden, und anorganische chemische Ansätze wie Calciumphosphattransfektion. Ein anderes Verfahren, Ligand-vermittelte Gentherapie, umfasst Komplexbildung der DNA mit spezifischen Liganden, um Ligand-DNA-Konjugate zu formen, um die DNA zu einer speziellen Zelle oder einem speziellen Gewebe zu lenken.
Es wurde herausgefunden, dass das Injizieren von Plasmid- DNA in Muskelzellen hinein hohe Prozentanteile der Zellen ergibt, die transfiziert sind und die eine anhaltende Expression von Markergenen aufweisen. Die DNA des Plasmids kann sich in das Genom der Zellen eingliedern oder auch nicht. Nicht-Eingliederung der transfizierten DNA würde die Transfektion und Expression von Genproduktproteinen in terminal differenzierte, nicht wuchernde Gewebe für einen verlängerten Zeitraum ermöglichen, ohne Angst vor Insertionen, Deletionen oder Veränderungen in dem zellulären oder mitochondrialen Genom durch Mutation. Langfristige, aber nicht notwendigerweise permanente, Überführung von therapeutischen Genen in spezifische Zellen kann Behandlungen für genetische Krankheiten oder für eine prophylaktische Verwendung bereitstellen. Die DNA könnte periodisch reinjiziert werden, um den Genproduktspiegel zu erhalten, ohne dass Mutationen in den Genomen der aufnehmenden Zellen vorkommen würden. Nicht-Eingliederung von exogenen DNRs kann die Anwesenheit von mehreren unterschiedlichen exogenen DNA-Konstrukten innerhalb einer Zelle ermöglichen, wobei alle der Konstrukte verschiedene Genprodukte exprimieren.
Partikel-vermittelte Gentranferverfahren wurden zuerst beim Transformieren von Pflanzengewebe verwendet. Mit einer Partikelbeschussvorrichtung oder einer "Genkanone" wird eine Antriebskraft erzeugt, um DNA-beschichtete hochdichte Partikel (wie Gold oder Wolfram) auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, die das Durchdringen der Zielorgane, Zielgewebe oder Zielzellen ermöglicht. Partikelbeschuss kann in in vitro-Systemen verwendet werden, oder mit ex vivo- oder in vivo-Techniken, um DNA in Zellen, Gewebe oder Organe einzuführen.
Die Elektroporation für den Gentransfer nutzt einen elektrischen Strom, um Zellen oder Gewebe empfänglich für Elektroporation-vermittelten Gentransfer zu machen. Ein kurzer elektrischer Impuls mit einer gegebenen Feldstärke wird verwendet, um die Durchlässigkeit einer Membran so zu erhöhen, dass DNA-Moleküle in die Zellen eindringen können. Diese Technik kann in in vitro-Systemen verwendet werden, oder mit ex vivo- oder in vivo-Techniken, um DNA in Zellen, Gewebe oder Organe einzuführen.
Träger-vermittelter Gentransfer in vivo kann verwendet werden, um Fremd-DNA in Zellen hinein zu transfizieren. Der Träger-DNA-Komplex kann herkömmlich in Körperfluide oder in den Blutstrom eingeführt werden und dann ortsspezifisch zu dem Zielorgan oder dem Zielgewebe in dem Körper gelenkt werden. Sowohl Liposome als auch Polykationen wie Polylysin, Lipofektine oder Zytofektine können verwendet werden. Liposome können entwickelt werden, welche zellspezifisch oder organspezifisch sind, und folglich wird die Fremd-DNA, die durch das Liposom getragen wird, durch die Zielzellen aufgenommen werden. Injektion von Immunoliposomen, die auf einen speziellen Rezeptor auf bestimmten Zellen zielen, können als ein herkömmliches Verfahren zum Einführen der DNA in die Zellen hinein, die den Rezeptor tragen, verwendet werden. Ein anderes Trägersystem, das verwendet worden ist, ist das Asialoglykoprotein/Polylysin-Konjugatsystem zum Befördern von DNA zu Leberzellen für in vivo-Gentransfer.
Die transfizierte DNA kann auch mit anderen Arten von Trägern in einen Komplex überführt werden, so dass die DNA zu der aufnehmenden Zelle befördert wird und dann in dem Zytoplasma oder in dem Nukleoplasma ansässig ist. DNA kann an Trägerkernproteine in speziell gestalteten Vesikelkomplexen gekoppelt werden und direkt in den Kern befördert werden.
Eine Genregulation des Inhibitors der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden durch Verabreichen von Verbindungen, die an das Gen für den Inhibitor binden, oder an Kontrollregionen, die mit dem Gen assoziiert sind, oder an sein entsprechendes RNA-Transkript, um die Geschwindigkeit der Transskription oder Translation zu modifizieren. Zusätzlich können Zellen, die mit einer DNA-Sequenz transfiziert sind, die den Inhibitor codiert, an einen Patienten verabreicht werden, um eine in vivo-Quelle für den Inhibitor bereitzustellen. Zum Beispiel können Zellen transfiziert werden mit einem Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die den Inhibitor codiert.
Der Ausdruck "Vektor", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Träger, der spezielle Nukleinsäuresequenzen enthalten oder damit assoziiert sein kann, welcher funktioniert, um die speziellen Nukleinsäuresequenzen in eine Zelle hinein zu transportieren. Beispiele für Vektoren umfassen Plasmide und infektiöse Mikroorganismen wie Viren, oder Nichtvirusvektoren wie Ligand-DNA-Konjugate, Liposome, Lipid-DNA-Komplexe. Es kann wünschenswert sein, dass ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Endothelialzellproliferations-Inhibitor-DNA-Sequenz umfasst, operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, um einen Expressionsvektor zu bilden, der in der Lage ist, den Inhibitor zu exprimieren. Die transfizierten Zellen können Zellen sein, die abgeleitet sind von dem normalen Gewebe des Patienten, dem erkrankten Gewebe des Patienten, oder es können Nicht-Patienten-Zellen sein.
Zum Beispiel können Tumorzellen, die von einem Patienten entnommen worden sind, mit einem Vektor transfiziert werden, der in der Lage ist, das Hemmerprotein der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, und wieder in den Patienten eingeführt werden. Die transfizierten Tumorzellen produzieren Pegel von Hemmern in dem Patienten, die das Wachstum des Tumors hemmen. Patienten können Menschen oder nichtmenschliche Tiere sein. Zusätzlich kann die Inhibitor-DNA direkt, ohne die Hilfe eines Trägers, in einen Patienten injiziert werden. Insbesondere kann Inhibitor-DNA in Haut, Muskel oder Blut injiziert werden.
Die Inhibitor-Expression kann für einen längeren Zeitraum andauern, oder Inhibitor-DNA kann periodisch verabreicht werden, um einen gewünschten Pegel des Inhibitor-Proteins in der Zelle, dem Gewebe oder Organ oder dem biologischen Fluid aufrechtzuerhalten.
Obwohl nicht erwünscht ist, durch die folgende Hypothese gebunden zu sein, wird angenommen, dass wenn ein Tumor angingen wird, er ein oder mehrere angiogene Peptide (z. B. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF usw.) freisetzt, welche lokal agieren, auf Endothel in der Nachbarschaft eines Primärtumors aus einer extravaskulären Richtung zielen, und nicht zirkulieren (oder mit einer kurzen Halbwertzeit zirkulieren). Diese angiogenen Peptide müssen in einer Menge produziert werden, die ausreichend ist, um die Aktion des Endothelialzell-Inhibitors (Inhibitor der Angiogenese) zu überwinden, damit ein Primärtumor seine Population weiter expandieren kann. Sobald ein solcher Primärtumor gut wachsend ist, macht er weiter damit, Endothelialzell-Inhibitor in den Blutkreislauf freizusetzen. Gemäß dieser Hypothese agieren diese Inhibitor von Fern in einem Abstand von dem Primärtumor, zielen auf kapillares Endothelium einer Metastase aus einer intravaskulären Richtung und fahren fort, zu zirkulieren. Somit könnte gerade zu der Zeit, wenn eine entfernte Metastase beginnen könnte, Angiogenese zu initiieren, das kapillare Endothelium in seiner Nachbarschaft durch hereinkommenden Inhibitor gehemmt werden.
Die Produktion des Endothelialzellproliferations-Inhibitors kann erreicht werden durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken einschließlich der Schritte (1) Identifizieren und Reinigen des Inhibitors, wie hier beschrieben und durch die Figuren veranschaulicht, (2) Bestimmen der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Inhibitors, (3) synthetisches Generieren von 5'- und 3'-DNA-Oligonucleotid-Primern für die Hemmersequenz, (4) Amplifizieren der Hemmergensequenz unter Verwendung von Polymerase, (5) Einsetzen der amplifizierten Sequenz in einen geeigneten Vektor wie einen Expressionsvektor, (6) Einsetzen des Gen-haltigen Vektors in einen Mikroorganismus oder ein anderes Expressionssystem, das in der Lage ist, das Hemmergen zu exprimieren, und (7) Isolieren des rekombinant produzierten Inhibitors. Geeignete Vektoren schließen virale, bakterielle und eukaryotische (wie Hefe) Expressionsvektoren ein. Die obigen Techniken sind vollständiger beschrieben in Laborhandbüchern wie "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe durch Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989, dessen technischen Bestandteile hier durch Literaturhinweis eingefügt sind.
Noch ein anderes Verfahren zur Herstellung des Inhibitors oder biologisch aktiver Fragmente davon ist durch Peptidsynthese. Die Aminosäuresequenz des Inhibitors kann zum Beispiel durch automatisierte Peptidsequenzierverfahren bestimmt werden. Alternativ kann, sobald das Gen oder die DNA-Sequenz, welches oder welche den Inhibitor codiert, isoliert ist, zum Beispiel nach den oben beschriebenen Verfahren, die DNA-Sequenz bestimmt werden unter Verwendung von manuellen oder automatisierten Sequenzierverfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Die Nukleinsäuresequenz wiederum stellt Informationen bezüglich der Aminosäuresequenz bereit.
Sobald die Aminosäuresequenz des Peptids bekannt ist, können Peptidfragmente synthetisiert werden durch Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie beispielhaft dargestellt durch "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton und R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford, England. Vielfache Fragmente können synthetisiert werden, welche im Wesentlichen miteinander verknüpft werden, um größere Fragmente zu bilden. Diese synthetischen Peptidfragmente können außerdem mit Aminosäuresubstitutionen an speziellen Stellen hergestellt werden, um auf agonistische und antagonistische Aktivität in vitro und in vivo zu testen. Peptidfragmente, die Hochaffinitätsbindung zu Geweben besitzen, können verwendet werden, um Rezeptoren, die den Inhibitor binden, auf Affinitätssäulen zu isolieren.
Der Inhibitor ist wirksam bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krankheiten oder Prozessen wie Angiogenese, die durch Endothelialzellproliferation vermittelt sind oder worin diese verwickelt ist. Die vorliegende Erfindung schließt die Herstellung eines Medikamentes ein zur Behandlung einer Angiogenese-vermittelten Krankheit unter Verwendung einer wirksamen Menge des Inhibitors, oder eines biologisch aktiven Fragmentes davon, oder Kombinationen von Hemmerfragmenten, die gemeinsam anti-angiogene Aktivität besitzen, oder Inhibitor-Agonisten und -Antagonisten. Die Angiogenese-vermittelten Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, feste Tumoren; Blut-geborene Tumoren wie Leukämie; Tumor-Metastase; gutartige Tumoren, zum Beispiel hämangiome, Akustikusneurinome, Neurofibrome, Trachome und eiterbildende Granulome; rhematoide Arthritis; Schuppenflechte; okuläre angiogene Krankheiten, zum Beispiel diabetische Retinopathie, Retinopathie von unreifen Frühgeborenen, Makuladegeneration, Hornhauttransplantat-Abstoßung, neovasluläres Glaukom, retrolentale Fibroplasie, Rubeosis; Osler-Webber-Syndrom; myokardiale Angiogenese; Plaque- Neovaskularisation; Teleangiektasie; Hämophilengelenke; Angiofibrome; und Wundgranulation.
Der Inhibitor ist nützlich bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krankheiten mit übermäßiger oder anomaler Stimulation der Endothelialzellen. Diese Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Darmverwachsungen, Atherosklerose, Sklerodermie und hypertrophe Narbengewebe, d. h. Wulstnarben. Der Inhibitor kann als ein Geburtskontrollmittel verwendet werden, indem die Vaskularisation verhindert wird, die für die Embryoimplantation erforderlich ist. Der Inhibitor ist nützlich bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krankheiten, die Angiogenese als eine pathologische Konsequenz haben, wie Katzenkratzkrankheit (Rochele minalia quintosa) und Geschwüre (Helicobacter pylori).
Die synthetischen Peptidfragmente des Inhibitors haben eine Vielfalt von Verwendungen. Das Peptid, das an den Rezeptor bindet, der in der Lage ist, den Inhibitor mit hoher Spezifität und Begierde zu binden, wird radioaktiv markiert und eingesetzt zur Visualisierung und Quantifizierung von Bindungsstellen unter Verwendung von autoradiographischen und Membranbindungstechniken.
Zytotoxische Wirkstoffe wie Ricin werden an den Inhibitor und Peptidfragmente davon mit hoher Affinität, gebunden, wodurch ein Werkzeug bereitgestellt wird zur Zerstörung von Zellen, die den Inhibitor binden. Diese Zellen können an vielen Stellen gefunden werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mikrometastasen und Primärtumoren. Peptide, die an zytotoxische Mittel gebunden sind, werden auf eine Art und Weise infundiert, die ausgelegt ist, um die Übergabe an die gewünschte Stelle zu maximieren. Zum Beispiel kann die Übergabe vollbracht werden durch eine Kanüle in Gefäße hinein, die den Zielort versorgen, oder direkt in das Ziel hinein. Solche Wirkstoffe werden außerdem auf eine kontrollierte Art und Weise durch osmotische Pumpen abgegeben, die an Infusionskanülen gekoppelt sind. Eine Kombination von Inhibitor-Antagonisten kann mit Stimulatoren der Angiogenese zusammen angewendet werden, um die Vaskularisation von Gewebe zu erhöhen. Dieses Therapieschema stellt ein wirksames Mittel zum Zerstören von metastatischem Krebs bereit.
Der Inhibitor kann in Kombination mit anderen Zusammensetzungen und Verfahren für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Tumor herkömmlich durch Operation, Bestrahlung oder Chemotherapie, kombiniert mit diesem Medikament, behandelt werden, und dann kann dieses Medikament nachfolgend an den Patienten verabreicht werden, um den Ruhezustand von Mikrometastasen auszudehnen und das Wachstum von allen übrigen Primärtumoren zu stabilisieren und zu hemmen. Zusätzlich werden der Inhibitor, Fragmente davon, Inhibitorspezifische Antiseren, Inhibitor-Rezeptoragonisten und -antagonisten, oder Kombinationen davon kombiniert mit pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln und wahlweise verzögert freisetzender Matrix, wie biologisch abbaubare Polymere, um therapeutische Zusammensetzungen zu formen.
Eine verzögert freisetzende Matrix, wie sie hier verwendet wird, ist eine Matrix aus Materialien, normalerweise Polymeren, welche durch enzymatische oder saure/basische Hydrolyse oder durch Auflösung zersetzbar ist. Sobald die Matrix in den Körper eingesetzt ist, wird darauf durch Enzyme und Körperfluide eingewirkt. Die verzögert freisetzende Matrix ist wünschenswerterweise aus biokompatiblen Materialien gewählt, wie Liposome, Polylactide (Polymilchsäure), Polyglykolid (Polymer von Glykolsäure), Polylactid-Co-Glykolid (Co-Polymere von Milchsäure und Glykolsäure), Polyanhydride, Poly(ortho)erster, Polypeptide, Hyaluronsäure, Kollagen, Chondroitinsulfat, Carbonsäuren, Fettsäuren, Phospholipiden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Polyaminosäuren, Aminosäuren wie Phenylalanin, Tyrosin, Isoleucin, Polynucleotide, Polyvinylpropylen, Polyvinylpyrrolidon und Silikon. Eine bevorzugte biologisch abbaubare Matrix ist eine Matrix aus einem der Stoffe Polylactid, Polyglykolid oder Polylactid-Co-Glykolid (Co-Polymere von Milchsäure und Glykolsäure).
Die Angiogenese-regulierende therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Aerosol sein und kann auf jedem bekannten Weg der Verabreichung verabreicht werden. Beispiele für feste therapeutische Zusammensetzungen umfassen Pillen, Cremes und implantierbare Dosiereinheiten. Die Pillen können oral verabreicht werden, die therapeutischen Cremes können topisch verabreicht werden. Die implementierten Dosierungseinheiten können lokal verabreicht werden, zum Beispiel an einer Tumorstelle, oder sie können implantiert werden für eine systemische Freisetzung der therapeutischen Angiogenese-regulierenden Zusammensetzung, zum Beispiel subkutan. Beispiele für flüssige Zusammensetzungen umfassen Formulierungen, die angepasst sind zur subkutanen, intravenösen, intraarteriellen Injektion, und Formulierungen zur topischen und intraokularen Verabreichung. Beispiele für Aerosolformulierungen umfassen Inhalationsmittelformulierungen zur Verabreichung in die Lungen.
Die vorliegende Erfindung schließt Proteine mit Inhibitor-Wirksamkeit ein, die Aminosäuresubstitutionen aufweisen oder bei denen Zucker oder andere Moleküle an funktionelle Aminosäuregruppen angelagert sind.
Die Proteine mit der oben beschriebenen Inhibitor-Aktivität können als isolierte und im Wesentlichen gereinigte Proteine in pharmazeutisch verträglichen Formulierungen bereitgestellt werden unter Verwendung von Formulierungsverfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Diese Formulierungen können auf Standardwegen verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Kombinationen auf dem topischen, transdermalen, intraperitonealen, intrakraniellen, intrazerebroventrikulären, intrazerebralen, intravaginalen, intrauterinen, oralen, rektalen oder parenteralen (z. B. intravenösen, intraspinalen, subkutanen oder intramuskulären) Weg verabreicht werden. Zusätzlich kann der Inhibitor in biologisch abbaubare Polymere eingelagert werden, um verzögerte Freisetzung der Verbindung zu ermöglichen, wobei die Polymere in der Nähe des Orts implantiert werden, wo die Arzneistoffabgabe erwünscht ist, zum Beispiel an der Stelle eines Tumors, oder so implantiert werden, dass der Inhibitor langsam systemisch freigesetzt wird. Osmotische Minipumpen können außerdem verwendet werden, um eine kontrollierte Abgabe von hohen Konzentrationen des Inhibitors durch Kanülen an dem interessierenden Ort bereitzustellen, wie direkt in ein metastatisches Wachstum in die vaskuläre Versorgung zu diesem Tumor. Die biologisch abbaubaren Polymere und deren Verwendung sind zum Beispiel ausführlich beschrieben in Brem et al., J. Neurosurg. 74: 441–446 (1991), dessen technischen Tatbestände in ihrer Vollständigkeit hier durch Literaturhinweis eingefügt sind.
Die Dosierung des Inhibitors der vorliegenden Erfindung wird abhängig sein von dem Krankheitszustand oder der Krankheit und anderen klinischen Faktoren wie Gewicht und körperliche Verfassung des Menschen oder Tieres und dem Weg der Verabreichung des Medikamentes. Zur Behandlung von Menschen oder Tieren können zwischen ungefähr 0,5 mg/Kilogramm und 500 mg/Kilogramm des Inhibitors verwendet werden. Abhängig von der Halbwertzeit des Inhibitors in einem einzelnen Tier oder Menschen kann der Inhibitor zwischen mehrmals täglich und einmal wöchentlich verwendet werden. Es sollte verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung sowohl für die humane als auch für die veterinäre Verwendung Anwendung findet. Die therapeutischen Verwendungen der vorliegenden Erfindung ziehen Einzel- sowie Mehrfachverabreichungen, entweder gleichzeitig oder über einen ausgedehnten Zeitraum, in Betracht.
Die Inhibitor-Formulierungen umfassen solche, die geeignet sind zur oralen, rektalen, ophthalmischen (einschließlich intravitrealen oder intercameralen), nasalen, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), intrauterinen, vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intraperitonealen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen, intrakraniellen, intratrachealen und epiduralen) Verabreichung. Die Inhibitor-Formulierungen können zweckdienlich in Einheitsdosierungsform präsentiert werden und können durch herkömmliche pharmazeutische Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren schließen den Schritt ein, den aktiven Bestandteil und die pharmazeutischen Träger oder Bindemittel in Assoziation zu bringen. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der aktive Bestandteil gleichmäßig und innig in Assoziation gebracht wird mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem, und dann das Produkt nötigenfalls geformt wird.
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, schließen wässerige und nicht wässerige sterile Injektionslösungen ein, welche Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen; und wässerige und nicht wässerige sterile Suspensionen, welche Suspensionsmittel und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitdosis- oder Mehrfachdosisbehältern präsentiert werden, zum Beispiel dichte Ampullen und Glasfläschchen, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, wobei sie nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, zum Beispiel Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung benötigen. Improvisierte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der Art, die zuvor beschrieben wurden, hergestellt werden.
Bevorzugte Dosiereinheits-Formulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Teildosis, oder einen geeigneten Anteil davon, des verabreichten Bestandteils enthalten. Es sollte verstanden werden, dass zusätzlich zu den Bestandteilen, die im einzelnen oben genannt sind, die Formulierungen der vorliegenden Erfindung andere auf dem Gebiet herkömmliche Mittel enthalten können, wobei die Art der in Frage kommenden Formulierung in Betracht gezogen wird. Wahlweise können zytotoxische Mittel eingelagert oder sonst wie mit Inhibitor-Proteinen, oder biologisch funktionellen Peptidfragmenten davon, kombiniert werden, um dem Patienten duale Therapie bereitzustellen.
Angiogenese-hemmende Peptide der vorliegenden Erfindung können in einer mikrochemischen Standardanlage synthetisiert und auf Reinheit mit HPLC und Massenspektrophotometrie geprüft werden. Verfahren zur Peptidsynthese, HPLC-Reinigung und Massenspektrophotometrie sind dem Fachmann für gewöhnlich bekannt. Inhibitor-Peptide und Inhibitor-Rezeptoren-Peptide werden ebenfalls in rekombinanten E. coli- oder Hefe-Expressionssystemen produziert und durch Säulenchromatographie gereinigt.
Unterschiedliche Peptidfragmente der intakten Inhibitor-Moleküle können synthetisiert werden zur Verwendung in mehreren Anwendungen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die folgenden: als Antigene für die Entwicklung spezifischer Antiseren, als Agonisten und Antagonisten, die an Inhibitor-Bindungsstellen aktiv sind, als Peptide, die an zytotoxische Mittel zu binden sind oder in Kombination mit diesen zu verwenden sind, zum gezielten Töten von Zellen, die den Inhibitor binden. Die Aminosäuresequenzen, die diese Peptide umfassen, werden gewählt auf der Basis ihrer Position auf den Außenregionen des Moleküls und sind zugänglich zum Binden an Antiseren. Die Amino- und Carboxyltermini des Inhibitors sowie die Mittelregion des Moleküls werden unter den Fragmenten, die zu synthetisieren sind, getrennt dargestellt.
Diese Peptidsequenzen werden verglichen mit bekannten Sequenzen unter Verwendung von Proteinsequenzdatenbanken wie GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT und PIR, um mögliche Sequenzhomologien zu bestimmen. Diese Informationen erleichtern die Beseitigung von Sequenzen, die einen hohen Grad an Sequenzhomologie zu anderen Molekülen aufweisen, wodurch das Potential für hohe Spezifität bei der Entwicklung von Antiseren, Agonisten und Antagonisten zu dem Inhibitor gesteigert wird.
Inhibitor- und Inhibitor-abgeleitete Peptide können an andere Moleküle gekoppelt werden unter Verwendung von Standardverfahren. Die Amino- und Carboxyltermini des Inhibitors enthalten beide Tyrosin- und Lysinreste und werden isotopisch und nichtisotopisch durch viele Verfahren markiert, zum Beispiel radioaktive Markierung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (Tyrosinreste-Chloramin T, Iodogen, Laktoperoxidase; Lysinreste-Bolton-Hunter-Reagens). Diese Koppelverfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Alternativ wird Tyrosin oder Lysin zu den Fragmenten hinzugegeben, die diese Reste nicht aufweisen, um die Markierung von reaktiven Amino- und Hydroxylgruppen auf dem Peptid zu erleichtern. Das Koppelverfahren wird auf der Basis der funktionellen Gruppen gewählt, die auf den Aminosäuren verfügbar sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Amino, Sulfhydryl, Carboxyl, Amid, Phenol und Imidazol. Verschiedene Reagenzien, die verwendet werden, um diese Kopplungen zu bewirken, schließen unter anderen Glutaraldehyd, diazotisiertes Benzidin, Carbodiimid und p-Benzochinon ein.
Inhibitor-Peptide werden chemisch gekoppelt an Isotope, Enzyme, Trägerproteine, zytotoxische Mittel, fluoreszierende Moleküle, chemilumineszente, biolumineszente und andere Verbindungen für eine Vielfalt von Anwendungen. Die Wirksamkeit der Kopplungsreaktion wird bestimmt unter Verwendung unterschiedlicher Verfahren, die für die spezielle Reaktion geeignet sind. Zum Beispiel wird die radioaktive Markierung eines Inhibitor-Peptids mit ¹²⁵I erreicht unter Verwendung von Chloramin T und Na¹²⁵I von hoher spezifischer Aktivität. Die Reaktion wird mit Natriummetabisulfit beendet und die Mischung wird auf Wegwerfsäulen entsalzt. Das markierte Peptid wird von der Säule eluiert und Fraktionen werden gesammelt. Aliquote werden von jeder Fraktion entnommen und radioaktiv in einem Gammazähler gemessen. Auf diese Weise wird das nicht umgesetzte Na¹²⁵I von dem markierten Inhibitor-Peptid getrennt. Die Peptidfraktionen mit der höchsten spezifischen Radioaktivität werden für eine nachfolgende Verwendung wie Analyse der Fähigkeit, an Inhibitor-Antiseren zu binden, aufbewahrt.
Eine andere Anwendung der Peptidkonjugation ist für die Produktion von polyklonalen Antiseren. Zum Beispiel werden Inhibitor-Peptide, die Lysinreste enthalten, an gereinigtes Rinderserumalbumin unter Verwendung von Glutaraldehyd gebunden. Die Wirksamkeit der Reaktion wird bestimmt durch Messen der Einlagerung von radioaktiv markiertem Peptid. Nicht umgesetztes Glutaraldehyd und Peptid werden durch Dialyse abgetrennt. Das Konjugat wird für eine spätere Verwendung aufbewahrt.
Antiseren, die spezifisch sind für den Inhibitor, Inhibitor-Analoga, Peptidfragmente des Inhibitors und den Inhibitor-Rezeptor, können erzeugt werden. Nach der Peptidsynthese und Reinigung werden sowohl monoklonale als auch polyklonale Antiseren aufgezogen unter Verwendung etablierter Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel können polyklonale Antiseren aufgezogen werden in Kaninchen, Schafen, Ziegen oder anderen Tieren. Inhibitor-Peptide, die an ein Trägermolekül wie Rinderserumalbumin konjugiert sind, oder der Inhibitor selbst werden mit einer Adjuvansmischung kombiniert, emulgiert und an vielfachen Stellen auf Rücken, Nacken, Flanken und manchmal in die Fußballen subkutan injiziert. Auffrischinjektionen werden in regelmäßigen Intervallen wie alle 2 bis 4 Wochen vorgenommen. Blutproben werden erhalten durch Venenpunktion, zum Beispiel unter Verwendung der Marginalohrvenen nach Erweiterung, ungefähr 7 bis 10 Tage nach jeder Injektion. Die Blutproben werden über Nacht bei 4°C gerinnen gelassen und werden bei ungefähr 2400 g bei 4°C etwa 30 Minuten lang zentrifugiert. Das Serum wird entfernt, in Aliquote aufgeteilt und bei 4°C für die unmittelbare Verwendung oder bei –20 bis –90°C für spätere Analyse aufbewahrt.
Alle Serumproben aus der Erzeugung von polyklonalen Antiseren oder Medienproben aus der Produktion von monoklonalen Antiseren werden zur Bestimmung des Antikörpertiters analysiert. Der Titer wird durch mehrere Mittel festgestellt, zum Beispiel unter Verwendung von Dot-Blots und Dichteanalysen, und außerdem durch Ausfällen der radioaktiv markierten Peptid-Antikörper-Komplexe unter Verwendung von Protein A, sekundären Antiseren, kaltem Ethanol oder Aktivkohle-Dextran, gefolgt von einer Aktivitätsmessung mit einem Gammazähler. Die Antiseren mit dem höchsten Titer werden außerdem auf Affinitätssäulen gereinigt, die kommerziell erhältlich sind. Inhibitor-Peptide werden an das Gel in der Affinitätssäule gekoppelt. Antiserumproben werden durch die Säule hindurchgelassen und Anti-Inhibitor-Antikörper bleiben auf der Säule gebunden. Diese Antikörper werden anschließend eluiert, gesammelt und bewertet zur Bestimmung des Titers und der Spezifität.
Die Inhibitor-spezifischen Antiseren mit dem höchsten Titer werden getestet, um das folgende festzustellen: a) die optimale Antiserumverdünnung für die höchste spezifische Bindung des Antigens und die niedrigste unspezifische Bindung, b) die Fähigkeit, zunehmende Mengen an Inhibitor-Peptid in einer Standardverdrängungskurve zu binden, c) mögliche Kreuzreaktivität mit verwandten Peptiden und Proteinen von verwandten Spezies, d) Fähigkeit, Inhibitor-Peptide in Extrakten von Plasma, Harn, Geweben und in Zellkulturmedien zu detektieren.
Kits zur Messung des Inhibitors und des Inhibitor-Rezeptors sind ebenfalls möglich.
Antiseren, die den höchsten Titer und die höchste Spezifität besitzen und Inhibitor-Peptide in Extrakten von Plasma, Harn, Geweben und in Zellkulturmedien detektieren können, werden weiter untersucht, um leicht zu verwendende Kits zu bilden zur schnellen, zuverlässigen, empfindlichen und spezifischen Messung und Lokalisierung von Inhibitor. Diese Asaykits umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden Techniken: kompetitive und nicht kompetitive Assays, Radioimmunoassay, Biolumineszenz- und Chemilumineszenzassays, fluorometrische Assays, Sandwich-Assays, immunoradiometrische Assays, Dot-Blots, Enzym-verknüpfte Assays einschließlich ELISA, Mikrotiterplatten, Antikörper-beschichtete Streifen oder Tauchstreifen zur schnellen Überwachung von Harn oder Blut, und Immunozytochemie. Für jedes Kit werden der Bereich, die Sensitivität, die Präzision, die Zuverlässigkeit, die Spezifität und die Reproduzierbarkeit des Assays festgestellt. Die Innerassay- und Zwischenassayvariation wird bei 20%-, 50%- und 80%-Punkten auf den Standardkurven der Verdrängung oder Aktivität festgestellt.
Ein Beispiel für ein Assaykit, das für gewöhnlich in der Forschung und in der Klinik verwendet wird, ist ein Radioimmunoassay(RIA)-Kit. Ein Inhibitor-RIA wird unten veranschaulicht. Nach erfolgreicher radioaktiver Iodierung und Reinigung des Inhibitors oder eines Inhibitor-Peptids wird das Antiserum, das den höchsten Titer besitzt, in mehreren Verdünnungen zu Röhrchen hinzugegeben, die eine relativ konstante Menge an Radioaktivität, z. B. 10.000 cpm, in einem geeigneten Puffersystem enthalten. Andere Röhrchen enthalten Puffer oder Präimmunserum, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Nach Inkubation bei 4°C für 24 Stunden wird Protein A hinzugegeben und die Röhrchen werden verwirbelt, bei Raumtemperatur 90 Minuten lang inkubiert und bei ungefähr 2000–2500 g bei 4°C zentrifugiert, um die Komplexe von Antikörper, der an markiertes Antigen gebunden ist, auszufällen. Der Überstand wird durch Ansaugen entfernt und die Radioaktivität in den Pellets in einem Gammazähler gezählt. Die Antiserumverdünnung, die ungefähr 10% bis 40% des markierten Peptids nach Subtraktion der unspezifischen Bindung bindet, wird weiterhin charakterisiert.
Als nächstes wird ein Verdünnungsbereich (ungefähr 0,1 pg bis 10 ng) des Inhibitor-Peptids, das zur Entwicklung des Antiserums verwendet wurde, bewertet, indem bekannte Mengen des Peptids zu Röhrchen hinzugegeben werden, die radioaktiv markiertes Peptid und Antiserum enthalten. Nach einer zusätzlichen Inkubationsperiode, zum Beispiel 24 bis 48 Stunden, wird Protein A hinzugegeben und die Röhrchen werden zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und die Radioaktivität in dem Pellet gezählt. Die Verdrängung der Bindung von radioaktiv markiertem Inhibitor-Peptid durch das unmarkierte Inhibitor-Peptid (Standard) liefert eine Standardkurve. Mehrere Konzentrationen von anderen Inhibitor-Peptidfragmenten, Inhibitor von unterschiedlichen Spezies und homologe Peptide werden zu den Assayröhrchen hinzugegeben, um die Spezifität des Inhibitor-Antiserums zu charakterisieren.
Extrakte von verschiedenen Geweben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf primäre und sekundäre Tumoren, Lewis-Lungenkarzinom, Kulturen von Inhibitor-produzierenden Zellen, Plazenta, Uterus, und anderen Geweben wie Gehirn, Leber und Darm werden präpariert. Nach Lyophilisierung der Gewebeextrakte oder Behandlung in Speed Vac wird Assaypuffer hinzugegeben und unterschiedliche Aliquote werden in die RIA-Röhrchen gebracht. Extrakte von Inhibitor-produzierenden Zellen produzieren Verdrängungskurven, die parallel zu der Standardkurve sind, während Extrakte von Geweben, die keinen Inhibitor produzieren, radioaktiv markierten Inhibitor nicht aus dem Inhibitor verdrängen. Zusätzlich werden Extrakte von Harn, Plasma und Zerebrospinalflüssigkeit von Tieren mit Lewis-Lungenkarzinom zu den Assayröhrchen in zunehmenden Mengen hinzugegeben. Parallele Verdrängungskurven zeigen die Nützlichkeit des Hemmerassays an, um den Inhibitor in Geweben und Körperfluiden zu messen.
Gewebeextrakte, die Inhibitor enthalten, werden zusätzlich charakterisiert, indem Aliquote einer Umkehrphasen-HPLC unterworfen werden. Eluierte Fraktionen werden gesammelt, in Speed Vac getrocknet, in RIA-Puffer zur ursprünglichen Konzentration gelöst und in dem Inhibitor-RIA analysiert. Die maximale Menge der Inhibitor-Immunoreaktivität befindet sich in den Fraktionen entsprechend der Elutionsposition des Inhibitors.
Der Assay-Kit stellt Anweisungen, Antiserum, Inhibitor oder Inhibitor-Peptid und möglicherweise radioaktiv markierten Inhibitor und/oder Reagenzien zur Ausfällung von gebundenen Inhibitor-Inhibitor-Antikörper-Komplexen bereit. Der Kit ist nützlich für die Messung von Inhibitor in biologischen Fluiden und Gewebeextrakten von Tieren und Menschen mit und ohne Tumoren.
Ein anderer Kit wird verwendet zur Lokalisierung von Inhibitor in Geweben und Zellen. Dieses Inhibitor-Immunohistochemie-Kit stellt Anweisungen, Inhibitor-Antiserum und möglicherweise Blockierserum und sekundäres Antiserum bereit, das an ein fluoreszierendes Molekül wie Fluoresceinisothiocyanat gebunden ist, oder an irgendein anderes Reagenz gebunden ist, das verwendet wird, um das primäre Antiserum zu visualisieren. Immunohistochemietechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Dieses Inhibitor-Immunohistochemie-Kit erlaubt die Lokalisierung von Inhibitor in Gewebeabschnitten und kultivierten Zellen unter Verwendung von sowohl Licht- als auch Elektronenmikroskopie. Es wird verwendet sowohl für Forschungs- als auch für klinische Zwecke. Zum Beispiel werden Tumoren biopsiert oder gesammelt und Gewebeabschnitte mit einem Mikrotom geschnitten, um Stellen der Hemmerproduktion zu untersuchen. Solche Informationen sind nützlich für diagnostische und möglicherweise therapeutische Zwecke bei der Detektion und Behandlung von Krebs. Ein anderes Verfahren zur Visualisierung von Orten der Hemmerbiosynthese schließt radioaktive Markierung von Nukleinsäuren ein zur Verwendung in in situ-Hybridisierung zur Untersuchung auf Inhibitor-Messenger-RNA. Ähnlich kann der Inhibitor-Rezeptor mit Immunohistochemieverfahren lokalisiert, visualisiert und quantifiziert werden.
Diese Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die folgenden Beispiele.
Beispiel 1
DEMONSTRATION DER ENDOTHELIALZELLPROLIFERATIONS-INHIBITOR-AKTIVITÄT VON KRINGLE 5 DES MENSCHLICHEN PLASMINOGENS
Quelle: Menschliches Plasminogen wird mit geeigneten Enzymen verdaut, um ein Kringle-5-Fragment zu ergeben. Das Peptidfragment wird isoliert und gereinigt durch Standardverfahren der Protein- und Peptidreinigung, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Reinheit von isoliertem Kringle 5 wird in 2 gezeigt, wobei die Ergebnisse für die Durchführung einer Gelelektrophorese des Peptidpräparats gezeigt werden.
Assay: Die Endothelialzell-hemmende Aktivität wurde untersucht durch Hemmung der DNA-Synthese ([Methyl-H³]-Thymidin-Einlagerung) in kapillare Rinderendothelialzellen. Kapillare Endothelialzellen wurden aus Rindernebennieren präpariert und auf Gelatine-beschichteten 48-Vertiefungs-Mikrotiterplatten aufgezogen.
Verschiedene Mengen von isoliertem Kringle 5 werden zu den kultivierten Zellen hinzugegeben und die Änderung der Zahl der Zellen wird bestimmt. Die prozentuale Änderung der Zellzahl wird als eine Funktion der Menge von Kringle 5, die zu den Kulturen hinzugegeben wurde, aufgezeichnet, um das Diagramm von 1 zu ergeben.
3 zeigt einen Vergleich von ähnlichen Sequenzen mit 80 Aminosäuren, die von den Kringle-Regionen 1, 2, 3, 4 und 5 von menschlichen Plasminogen abgeleitet sind.
SEQUENZLISTE

Claims

Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Endothelialzellproliferations-hemmende Menge eines Proteins, das eine Aminosäuresequenz von einem isolierten Kringle 5 Peptid eines Plasminogenmoleküls hat, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Protein 80 Aminosäuren umfaßt.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Protein ein Molekulargewicht von 14 kD hat.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Plasminogen menschliches Plasminogen ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Protein eine Aminosäuresequenz von Sequenzidentifikationsnr. 1 hat.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Protein eine Aminossäuresequenz von Sequenzidentifikationsnr. 6 hat.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Protein die Fähigkeit hat, die Endothelialzellproliferation zu hemmen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, für die Verwendung als ein Medikament.
Verwendung eines Proteins, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Endothelialzellproliferation in einem Individuum.
Verwendung eines Proteins, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, das eine Angiogenese-vermittelte Krankheit hat.
Die Verwendung gemäß Ansprüchen 9 oder 10, worin das Individuum ein Mensch ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 10, worin die Angiogenese-vermittelte Krankheit Krebs ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 12, worin die Angiogenese-vermittelte Krankheit ein fester Tumor ist.
Ein Verfahren zur Hemmung der Endothelialzellproliferation in vitro, das das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Proteins, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, an eine Endothelialzelle umfaßt.